CN100359008C - 酶法测定病人分析物浓度用的试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法测定病人分析物浓度用的试剂，测定时对试剂中还原型辅酶的氧化速率进行测定。它包含可使所述还原型辅酶在该试剂的贮存期间连续再生的辅酶还原***来实现试剂的长期稳定。该辅酶还原***所用的酶/底物对具有完全的专一性，从而减少了酶和底物的用量，增加了试剂稳定性。该试剂为液体单试剂。本发明还公开了测定天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶和尿素的试剂。
Description
技术领域
本发明涉及酶法测定病人分析物浓度用的试剂，特别是涉及同存在于样本中的分析物浓度直接相关的反应样本中还原型辅酶氧化的定量测定方法中用的试剂。
背景技术
在临床上，应用还原型辅酶I(β-NADH)氧化成辅酶I(β-NAD+)的检测技术测定的分析物包括：天冬氨酸氨基转移酶(AST)；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、尿素(UREA)、乳酸脱氢酶(LDH-P)、α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)、氨(NH3)和二氧化碳(CO2)等。
天冬氨酸氨基转移酶(AST)广泛分布于人体，在心、肝、骨骼肌、肾和红细胞内有较高的浓度。这些组织的损伤，如心肌梗塞、病毒性肝炎，肝坏死，肝硬化和营养不良等症均会引起血清或血浆中AST水平的升高。
测定AST活性时，血清中AST催化α-酮戊二酸和L-天冬氨酸的氨基转换形成L-谷氨酸和草酰乙酸。在还原型辅酶I(β-NADH)和苹果酸脱氢酶(MDH)存在下，草酰乙酸被还原为苹果酸，而β-NADH被氧化为辅酶I(β-NAD+)，从而引起吸光度下降。这种吸光度的下降的速率与AST活性成正比，所以用分光光度法监测在340nm处β-NADH吸光度下降速率可测定AST活性
血清中存在的乳酸脱氢酶可使内源性丙酮酸转化为乳酸，同时氧化β-NADH而干扰测试，加入高浓度乳酸脱氢酶(LDH)，可在延迟期内快速消除内源性丙酮酸的干扰。
丙氨酸氨基转移酶(ALT)在肝脏中有较高的浓度，而在肾、心、骨骼肌、肺脏中则含有较少。通常ALT的升高是由某些与肝脏有关的疾病引起，包括肝硬化、肝癌，病毒性或中毒性肝炎和阻塞性黄疸等。
测定ALT活性时，血清中ALT催化α-酮戊二酸和L-丙氨酸的氨基转换形成L-谷氨酸和丙酮酸，在β-NADH和乳酸脱氢酶(LDH)存在下，丙酮酸被还原为L-乳酸，而β-NADH被氧化为β-NAD+，从而引起吸光度下降。这种吸光度的下降速率与ALT活性成正比，所以用分光光度法监测在340nm处β-NADH吸光度下降速率可测定ALT活性。
血清中内源性丙酮酸的干扰，可通过加入过量的乳酸脱氢酶(LDH)在延迟期内快速消除。
尿素(UREA)是人体内蛋白质代谢的主要产物，它构成了血液中绝大部分的非蛋白氮，尿素在肝脏内产生并通过肾脏***至尿中，各种肾病及泌尿道的梗塞均可引起血液尿素升高，因此血液尿素是肾功能的主要指标。
在测定尿素时，尿素在脲酶的催化下分解为氨和二氧化碳，氨和α-酮戊二酸在β-NADH和谷氨酸脱氢酶(GLDH)存在下形成谷氨酸，同时β-NADH被氧化成β-NAD+，从而引起吸光度的下降，在340nm处吸光度的下降速率与样品中尿素的含量成正比，所以用分光光度法监测在340nm处β-NADH吸光度下降速率可测得尿素的含量。
样品中内源性氨干扰在延迟期内即可消除。
要将AST、ALT、UREA检测试剂配制成长期稳定的液体单试剂，关键是解决工具酶和还原型辅酶I(β-NADH)的稳定性问题。因为酶是一种结构精细的蛋白质，稳定性极差，温度、pH、离子强度、杂质、金属离子、微生物等均会影响其活性。要提高酶在水溶液中的稳定性，可采用优化环境条件，加入稳定剂和防腐剂等。工具酶应选用含杂酶少、热稳定性好、pH稳定范围在测试pH范围内的酶。工具酶的用量要合适，既要保证其在液体试剂中有相当长的稳定期，又要保证测试结果准确。
保证试剂稳定性的难点主要在于还原型辅酶I(β-NADH)的稳定，还原型辅酶I(β-NADH)是AST、ALT、UREA三种试剂检测的共同指示物。为保证试剂达到应有的线性，试剂中β-NADH应保持一定的浓度，即在340nm处吸光度不能低于1.0A。但β-NADH在pH＜8.6的水溶液中是不稳定的，会自发氧化为β-NAD+，还会受到溶液中各种杂酶的催化，被氧化成β-NAD+。
为了增加β-NADH的稳定，早在上世纪70年代就有人做了大量研究工作，除了运用一般物理方法如将试剂制成冻干品或干粉，或用无水有机溶剂等增加NADH稳定性外，1977年Modrovich在他的专利(US Patent 4,394,449)中提出了用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)/葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)把β-NADH的不稳定产物β-NAD+重新逆向反应生成β-NADH，起到动态稳定β-NADH的目的。
但是由于当时的酶工程还没有发展到今天的水平，根本性的技术问题没有解决，他们只能做成双试剂，合并成液体单试剂的稳定性只有一个月至三个月。90年F.Hoffmann La RocheAG(AU-A-61906/90)运用Modrivich Ivan E的原理又做了不少工作，将不稳定产物β-NAD+重新变成β-NADH。但是，他的方法也只能配成双试剂，一旦配成单试剂，稳定性就很差。Klose等人在专利US Pantent 4,019,916中提出的类似方法的缺点是测试时间长，而且只适用于含有可被磷酸化底物的试剂***。最有代表性的、与本题关系密切的是澳大利亚J.德乔吉奥等于1996.2.26在中国申请的专利(CN 1179792A)，它运用非专一性酶/底物对，成功地将动态稳定技术运用到了AST、ALT的单试剂和UREA的双试剂中，可以将AST和ALT液体单试剂的稳定性延长到6-8月。但是在专利中规定了辅酶还原***“酶对底物具有不完全的专一性”，“酶/底物对是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶/D-葡萄糖”，虽然J.德乔吉奥在前人的基础上，又取得了新的成果。但是使用的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和D-葡萄糖量都很大，酶量为3500U/L，D-葡萄糖量为18.016g/L。这样不仅明显增加了试剂的成本，而且还有可能引入新的杂酶。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提出一种酶法测定病人分析物浓度用的试剂，其中对还原型辅酶的氧化速率进行测定。它并不明显增加试剂的成本，能够防止杂酶引入，具有较好的长期稳定性。
为此，提供了一种酶法测定病人分析物浓度用的试剂，测定时对试剂中还原型辅酶的氧化速率进行测定，所述试剂通过特定酶/底物对的辅酶还原***在该试剂贮存期间连续再生还原型辅酶的动态稳定作用实现试剂的长期稳定，所述酶和底物对中，酶对底物具有完全的专一性。
所述试剂为液体单试剂；所述辅酶还原***中酶/底物对优选用葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖。
本发明还提供了酶法测定病人的天冬氨酸氨基转移酶浓度用的试剂，测定时对试剂中还原型辅酶的氧化速率进行测定，所述试剂通过特定酶/底物对的辅酶还原***在该试剂贮存期间连续再生还原型辅酶的动态稳定作用实现试剂的长期稳定，该酶对该底物具有完全的专一性并且所述试剂为液体单试剂。所述酶/底物对优选用葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖。所述葡萄糖脱氢酶和D-葡萄糖用量分别选用2-100U/L和0.1-20mmol/L，优选用5-50U/L和1-10mmol/L。
本发明还提供了酶法测定病人的丙氨酸氨基转移酶浓度用的试剂，测定时对试剂中还原型辅酶的氧化速率进行测定，所述试剂通过特定酶/底物对的辅酶还原***在该试剂贮存期间连续再生还原型辅酶的动态稳定作用实现试剂的长期稳定，该酶对该底物具有完全的专一性并且所述试剂为液体单试剂。所述酶/底物对优选用葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖。所述葡萄糖脱氢酶和D-葡萄糖用量分别选用2-100U/L和0.1-20mmol/L，优选用2-50U/L和1-10mmol/L。
本发明还提供了酶法测定病人的血液尿素浓度用的试剂，测定时对试剂中还原型辅酶的氧化速率进行测定，所述试剂通过特定酶/底物对的辅酶还原***在该试剂贮存期间连续再生还原型辅酶的动态稳定作用实现试剂的长期稳定，该酶对该底物具有完全的专一性并且所述试剂为液体单试剂。所述酶/底物对优选用葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖。所述葡萄糖脱氢酶和D-葡萄糖用量分别选用2-100U/L和0.1-20mmol/L，优选用5-50U/L和1-10mmol/L。
在用脱氢酶/底物再生还原β-NADH***中，我们选用葡萄糖脱氢酶和它的100％专一性底物D-葡萄糖。D-葡萄糖被氧化为D-葡萄糖酸内脂，β-NAD+被还原为β-NADH。
葡萄糖脱氢酶的pH稳定范围为6-8.5，在试剂测试PH 7.5-8.2范围是稳定的。葡萄糖脱氢酶的最适pH为8.0，也在试剂测试pH7.5-8.2范围。酶催化反应速率最高，在最适pH的β-NADH还原***中，可减少脱氢酶和底物用量，防止引入新的杂酶而影响试剂稳定性，而且几乎不增加试剂成本。
β-NADH还原再生反应速率，可以用葡萄糖脱氢酶及D-葡萄糖加入量控制，一般控制再生反应速率与β-NADH自然氧化速度相当。这样，葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖的辅酶还原再生***在试剂贮存时期可连续再生β-NADH，而在试剂测试时将不会影响测试结果。
用于β-NADH还原再生***的葡萄糖脱氢酶用量选用2-100U/L，D-葡萄糖浓度选用0.1-20mmol/L，过高的葡萄糖脱氢酶和D-葡萄糖用量会使β-NADH还原再生速度过快，在试剂检测时产生负干扰。
如本说明书的开头中所述，对于用来测定病人AST含量的、本发明的试剂除葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖作为辅酶还原***外，还需要的其他物质有：苹果酸脱氢酶(MDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、还原型辅酶I(β-NADH)、L-天冬氨酸和α-酮戊二酸。
对于用来测定病人ALT含量的、本发明的试剂除葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖作为辅酶还原***外，还需要的其他物质有：乳酸脱氢酶(LDH)、还原型辅酶I(β-NADH)、L-丙氨酸和α-酮戊二酸。
对于用来测定病人UREA含量的、本发明的试剂除葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖作为辅酶还原***外，还需要的其他物质有：脲酶、谷氨酸脱氢酶(GLDH)、还原型辅酶I(β-NADH)和α-酮戊二酸。
本发明的试剂除了包括测定分析物浓度所需的辅酶还原***和其它基本底物和酶之外，还可以包括缓冲剂、防腐剂、稳定剂、螯合剂等和具有增强稳定性的功效而实质上不影响本发明的特性的其他成分。
甘油、糖和乙二醇是多羟基化合物，能与蛋白质分子形成很多氢键，并有助于形成“溶剂层”，这种酶分子周围的溶剂层与整体水相不同，它们可增加表面张力和溶液粘度。这类添加剂通过对蛋白质的有效脱水，降低蛋白质水解作用而起稳定酶的作用，因此可以用相对低分子量多元醇稳定酶。我们选用甘油或乙二醇作为酶的稳定剂，过高浓度的甘油使溶液粘度增高，不利于测试。
EDTA二钠盐与重金属离子形成配位复合物，防止重金属离子对酶活性的抑制。
微生物污染会降低酶的稳定性，加入防腐剂可抑制微生物生长。本发明中优选的防腐剂为叠氮钠。
本发明中，应用葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖稳定β-NADH的稳定化技术配制的液体单试剂AST基本上包括：
辅酶还原***(葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖)、L-天冬氨酸、α-酮戊二酸、苹果酸脱氢酶(MI)H)、乳酸脱氢酶(LDH)、还原型辅酶I(β-NADH)。
此外还优选包括：Tris-HCl缓冲液、氢氧化钾、EDTA二钠盐、甘油、叠氮钠。
其中Tris-HCl缓冲液的浓度选用20-100mmol/L；α-酮戊二酸浓度选用6-18mmol/L，α-酮戊二酸在340nm有吸收，浓度不宜太高；L-天冬氨酸浓度选用100-300mmol/L；氢氧化钾的加入是为了帮助L-天冬氨酸溶解，用量与L-天冬氨酸为等摩尔；EDTA二钠盐与金属离子形成配位复合物，防止重金属离子抑制酶的活性，浓度选用为1-10mmol/L；β-NADH的浓度选用0.1-0.3mmol/L，低于0.1mmol/L时AST测试时线性范围变小，影响测试结果，高于0.3mmol/L会使试剂空白吸光度过高；苹果酸脱氢酶用量选用100-2500U/L；乳酸脱氢酶的加入可消除样品中内源性丙酮酸的干扰，乳酸脱氢酶用量选用1000-4000U/L；葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖的加入是使β-NADH的不稳定产物β-NAD+重新再生为β-NADH，以保证试剂中β-NADH的相对稳定，葡萄糖脱氢酶用量选用2-100U/L；D-葡萄糖浓度选用0.1-20mmol/l；甘油对酶有稳定作用，用量选用1％-20％，高浓度甘油会增加溶液粘度；为防止微生物污染，试剂中加入叠氮钠作为防腐剂，用量选用0.1-1.0g/L。
依本发明配制的一种优选的AST试剂配制如下：
表1
| 原料 | 分子量 | 浓度(mmol/L) | 每升量 |
| Tris | 121.1 | 80-100 | 9.69-12.1g |
| α-酮戊二酸，Na盐(2H2O) | 226.1 | 12-15 | 2.71-3.39g |
| L-天冬氨酸 | 133.1 | 200-240 | 26.6-31.9g |
| 氢氧化钾 | 56.1 | 200-240 | 11.2-13.5g |
| D-葡萄糖 | 180.2 | 1-10 | 0.18-1.8g |
| 甘油 | 92.1 | 5％-10％ | |
| EDTA.2Na | 372.2 | 3-5 | 1.12-1.86g |
| 叠氮钠 | 65.1 | 0.3-0.5g | |
| β-NADH二钠盐 | 709.4 | 0.25-0.28 | 0.18-0.2g |
| 乳酸脱氢酶 | 1500-2000U | ||
| 苹果酸脱氢酶 | 800-1000U | ||
| 葡萄糖脱氢酶 | 5-50U | ||
| 盐酸 | 36.5 | 调pH7.8-8.1 |
本发明中，应用葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖稳定β-NADH的稳定化技术配制的液体单试剂ALT基本上包括：
辅酶还原***(葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖)、L-丙氨酸、α-酮戊二酸、乳酸脱氢酶(LDH)、还原型辅酶I(β-NADH)。
此外还优选包括：Tris-HCl缓冲液、EDTA二钠盐、甘油、叠氮钠。
其中Tris-HCl缓冲液浓度选用20-100mmol/L；α-酮戊二酸浓度选用8-18mmol/L；L-丙氨酸浓度优选用200-800mmol/L；EDTA二钠盐选用1-10mmol/L；β-NADH用量选用0.1-0.30mmol/L；乳酸脱氢酶的用量既要能保证快速消除内源性丙酮酸的干扰，还要保证催化反应的线性范围，选用1000-4000U/L；葡萄糖脱氢酶用量选用2-100U/L；D-葡萄糖浓度选用0.1-20mmol/L，甘油用量选用1％-20％，叠氮钠用量选用0.1-100g/L
依本发明配制的一种优选的ALT试剂如下：
表2
| 原料 | 分子量 | 浓度(mmol/L) | 每升量 |
| Tris | 121.1 | 80-100 | 9.69-12.1g |
| α-酮戊二酸，Na盐(2H2O) | 226.1 | 12-15 | 2.71-3.39g |
| L-丙氨酸 | 89.1 | 400-500 | 35.6-44.6g |
| D-葡萄糖 | 180.2 | 1-10 | 0.72-1.8g |
| EDTA.2钠盐 | 372.2 | 3-5 | 1.12-1.86g |
| 甘油 | 92.1 | 5％-10％ | |
| 叠氮钠 | 65.1 | 0.3-0.5g | |
| β-NADH二钠盐 | 709.4 | 0.25-0.28 | 0.18-0.2g |
| 乳酸脱氢酶 | 3000---4000U | ||
| 葡萄糖脱氢酶 | 2-50U | ||
| 盐酸 | 36.5 | 调pH7.5-7.8 |
本发明中，应用葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖稳定β-NADH的稳定化技术配制的UREA液体单试剂基本上包括：
辅酶还原***(葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖)、α-酮戊二酸、脲酶、谷氨酸脱氢酶(GLDH)、还原型辅酶I(β-NADH)。
此外还优选包括：Tris-HCl缓冲液、ADP钾盐、甘油、叠氮钠。
其中Tris-HCl缓冲液浓度选用20-150mmol/L；α-酮戊二酸浓度选用1-15mmol/L；β-NADH选用0.1-0.38mmol/L；ADP钾盐用量选用0.1-10mmol/L；脲酶要能快速催化分解尿素，用量选用2000-10000U/L；谷氨酸脱氢酶可控制反应速度，加入越多，反应速度越快，优选200-2000U/L，葡萄糖脱氢酶用量选用2-100U/L；D-葡萄糖用量选用0.1-20mmol/L；甘油用量选用1％-30％；叠氮钠用量选用0.1-1.0g/L。
依本发明配制的一种优选的UREA试剂配制如下：
表3
| 原料 | 分子量 | 浓度(mmol/L) | 每升量 |
| Tris | 121.1 | 100-120 | 12.1-14.5g |
| α-酮戊二酸，Na盐(2H2O) | 226.1 | 4-8 | 0.9-1.8g |
| 叠氮钠 | 65.0 | 0.2-0.5g | |
| D-葡萄糖 | 180.2 | 1-10 | 0.72-1.8g |
| 甘油 | 92.1 | 5％-15％ | |
| ADP.K盐 | 501.3 | 1-4 | 0.5-2.0g |
| β-NADH，钠盐 | 709.4 | 0.25-0.3 | 0.18-0.21g |
| 谷氨酸脱氢酶 | 500-1000U | ||
| 脲酶 | 5000-8000U | ||
| 葡萄糖脱氢酶 | 5-50U | ||
| 盐酸 | 36.5 | 调pH8.0-8.3 |
在以上液体单试剂中，乳酸脱氢酶应选用对丙酮酸有较高亲和力，不含或仅含微量ALT、GLDH等杂酶。苹果酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶选用在水溶液中的稳定性较好的酶。在保证线性测试范围，延迟时间、准确性和稳定性前提下，应尽量减少以上酶的用量，以便减少杂酶的干扰。
可用本发明的试剂测定的分析物除天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、尿素(UREA)外还包括：乳酸脱氢酶(LDH-P)、α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)、氨(NH3)和二氧化碳(CO2)等。
此外，用葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖也可使还原型辅酶II(β-NADPH)的不稳定产物辅酶II(β-NADP+)重新还原为β-NADPH。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：由于用于稳定试剂以抗氧化的辅酶还原***使用了高度专一性的酶/底物对，酶和底物的用量大为降低，不仅几乎不增加试剂成本，而且不会因大量稳定酶的加入而引入新的杂酶，从而提高了试剂的稳定性。
最佳实施方式
本发明的各方面详细实施情况将在优选实施例的下述描述中变得更清楚。
实施例1
如下测定依本发明配制的AST试剂(D-葡萄糖：5mmol/L，葡萄糖脱氢酶：20U/L)的稳定性：稳定化AST液体单试剂：
表4
| 原料 | 分子量 | 浓度(mmol/L) | 每升量 |
| Tris | 121.1 | 80 | 9.69g |
| α-酮戊二酸，Na盐(2H2O) | 226.1 | 12 | 2.71g |
| L-天冬氨酸 | 133.1 | 240 | 31.9g |
| 氢氧化钾 | 56.1 | 240 | 13.5g |
| D-葡萄糖 | 180.2 | 5 | 0.9g |
| 甘油 | 92.1 | 5％ | |
| EDTA.2Na | 372.2 | 5 | 1.86g |
| 叠氮钠 | 65.1 | 0.5g | |
| β-NADH二钠盐 | 709.4 | 0.27 | 0.19g |
| 乳酸脱氢酶 | 2000U | ||
| 苹果酸脱氢酶 | 900U | ||
| 葡萄糖脱氢酶 | 20U | ||
| 盐酸 | 36.5 | 调pH8.0 |
相应非稳定化AST液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖辅酶还原***，不含甘油。其它组份及其浓度与上表相同。
试剂贮存条件：2-8℃密封存放，37℃密封存放。
测试波长：340nm 测试温度：37℃
比色杯光径：10mm 样品与试剂体积比：1∶15
延迟时间：60秒 测试时间：60秒
试剂空白吸光度：反映β-NADH的含量，初始吸光度应大于1.0A
准确度：测定结果应在质控血清标示值范围内
测试线性：≥550U/L
测试结果：
1)AST液体单试剂37℃存放后空白吸光度
表5
| 37℃存放天数 | 稳定化单试剂 | 非稳定化单试剂 |
| 0 | 1.788 | 1.809 |
| 1 | 1.662 | |
| 2 | 1.538 | |
| 3 | 1.415 | 1.019 |
| 4 | 1.313 | |
| 5 | 1.188 | |
| 6 | 1.148 | |
| 7 | 1.043 |
可见，稳定化AST液体单试剂在37℃可以存放7天，非稳定化AST液体单试剂只能存放三天。稳定化单试剂中β-NADH稳定性好。
2)AST液体单试剂2-8℃存放后空白吸光度
表6
| 2-8℃存放时间 | 稳定化单试剂 | 非稳定化单试剂 |
| 0周 | 1.839 | 1.809 |
| 3周 | 1.452 | |
| 5周 | 1.319 | |
| 7周 | 1.210 | |
| 11周 | 1.023 | |
| 3个月 | 1.665 | |
| 6个月 | 1.477 | |
| 9个月 | 1.305 | |
| 12个月 | 1.102 |
2-8℃稳定化AST液体单试剂中β-NADH可以稳定12个月以上，而非稳定化AST液体单试剂中β-NADH只能稳定11周(不到三个月)。
3)稳定化AST液体单试剂2-8℃存放后线性测定
表7
| 2-8℃存放3个月线性 | ||||||
| 理论值U/L | 0 | 116 | 233 | 349 | 466 | 582 |
| 实测值U/L | 4.8 | 111 | 227 | 349 | 452 | 585 |
| 2-8℃存放6个月线性 | ||||||
| 理论值U/L | 0 | 113 | 226 | 338 | 451 | 564 |
| 实测值U/L | 5.1 | 115 | 220 | 338 | 436 | 559 |
| 2-8℃存放9个月线性 | ||||||
| 理论值U/L | 0 | 105 | 210 | 315 | 420 | 524 |
| 实测值 | 4.9 | 106 | 215 | 315 | 406 | 517 |
| 2-8℃存放13个月线性 | ||||||
| 理论值U/L | 0 | 122 | 244 | 366 | 488 | 610 |
| 实测值 | 5.5 | 124 | 247 | 366 | 473 | 582 |
稳定化AST液体单试剂在2-8℃贮存13个月，试剂线性测试结果仍然符合要求。
4)稳定化AST液体单试剂37℃存放后准确度测定
表8
| 37℃存放时间 | 血清I(U/L)靶值30(20-40) | 血清II(U/L)靶值54(41-67) | 血清III(U/L)靶值101(81-121) |
| 0天 | 28 | 54 | 98 |
| 5天 | 28 | 56 | 92 |
| 6天 | 27 | 52 | 95 |
| 7天 | 26 | 53 | 95 |
稳定化AST液体单试剂在37℃存放7天，试剂准确度测试结果全部在质控血清标示的靶值范围内。
5)稳定化AST液体单试剂2-8℃存放后准确度测定
表9
| 2-8℃存放时间 | 血清I(U/L) | 血清III(U/L) |
| 3个月 | 靶值：28(23-33)实测值：32 | 靶值：104(84-124)实测值：117 |
| 6个月 | 靶值：28(23-33)实测值：32 | 靶值：104(84-124)实测值：101 |
| 9个月 | 靶值：28(23-33)实测值：30 | 靶值：104(84-124)实测值：110 |
| 12个月 | 靶值：30(20-40)实测值：32 | 靶值：101(81-121)实测值：106 |
稳定化AST液体单试剂在2-8℃存放12个月，试剂准确度测试结果全部在质控血
清标示的靶值范围内。
上列数据显示，该AST液体单试剂2-8℃存放12个月后或37℃存放7天，试剂测试结果都是正常的。使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和D-葡萄糖作为稳定β-NADH的辅酶还原***是可行的。
实施例2
如下测定依本发明配制的AST试剂(D-葡萄糖：1mmol/L，葡萄糖脱氢酶：5U/L)的稳定性：
稳定化AST液体单试剂配方：
表10
| 原料 | 分子量 | 浓度(mmol/L) | 每升量 |
| Tris | 121.1 | 100 | 12.1g |
| α-酮戊二酸，Na盐(2H2O) | 226.1 | 15 | 3.39g |
| L-天冬氨酸 | 133.1 | 200 | 26.6g |
| 氢氧化钾 | 56.1 | 200 | 11.2g |
| D-葡萄糖 | 180.2 | 1 | 0.18g |
| 甘油 | 92.1 | 10％ | |
| EDTA.2Na | 372.2 | 3 | 1.12g |
| 叠氮钠 | 65.1 | 0.3g | |
| β-NADH二钠盐 | 709.4 | 0.25 | 0.18g |
| 乳酸脱氢酶 | 1500U | ||
| 苹果酸脱氢酶 | 800U | ||
| 葡萄糖脱氢酶 | 5U | ||
| 盐酸 | 36.5 | 调pH8.0 |
相应非稳定化AST液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖辅酶还原***，不含甘油。其它组份及其浓度与上表相同。
试剂贮存条件：2-8℃密封存放，37℃密封存放。
测试波长：340nm 测试温度：37℃
比色杯光径：10mm 样品与试剂体积比：1∶15
延迟时间：60秒 测试时间：60秒
试剂空白吸光度：反映β-NADH的含量，初始吸光度应大于1.0A
准确度：测定结果应在质控血清标示值范围内
测试线性：≥550U/L
测试结果：
1)AST液体单试剂37℃存放后空白吸光度
表11
| 37℃存放天数 | 稳定化单试剂 | 非稳定化单试剂 |
| 0 | 1.755 | 1.745 |
| 1 | 1.624 | |
| 2 | 1.490 | |
| 3 | 1.359 | 0.943 |
| 4 | 1.245 | |
| 5 | 1.110 |
2)AST液体单试剂2-8℃存放后空白吸光度
表12
| 2-8℃存放时间 | 稳定化单试剂 | 非稳定化单试剂 |
| 0周 | 1.758 | 1.751 |
| 3周 | 1.396 | |
| 5周 | 1.258 | |
| 7周 | 1.150 | |
| 11周 | 0.965 | |
| 3个月 | 1.579 | |
| 6个月 | 1.385 | |
| 9个月 | 1.208 | |
| 12个月 | 0.998 |
3)稳定化AST液体单试剂2-8℃存放后线性测定
表13
| 2-8℃存放3个月线性 | ||||||
| 理论值U/L | 31 | 125 | 250 | 374 | 499 | 624 |
| 实测值U/L | 36 | 127 | 250 | 365 | 497 | 606 |
| 2-8℃存放6个月线性 | ||||||
| 理论值U/L | 30 | 122 | 243 | 365 | 486 | 608 |
| 实测值U/L | 33 | 122 | 258 | 365 | 483 | 578 |
| 2-8℃存放9个月线性 | ||||||
| 理论值U/L | 30 | 110 | 220 | 330 | 440 | 550 |
| 实测值 | 35 | 118 | 229 | 325 | 436 | 538 |
4)稳定化AST液体单试剂37℃存放后准确度测定
表14
| 37℃存放时间 | 血清I(U/L)靶值30(20-40) | 血清II(U/L)靶值54(41-67) | 血清III(U/L)靶值101(81-121) |
| 0天 | 33 | 56 | 107 |
| 5天 | 35 | 58 | 105 |
5)稳定化AST液体单试剂2-8℃存放后准确度测定
表15
| 2-8℃存放时间 | 血清I(U/L) | 血清III(U/L) |
| 3个月 | 靶值：30(20-40)实测值：36 | 靶值：101(81-121)实测值：115 |
| 6个月 | 靶值：30(20-40)实测值：35 | 靶值：101(81-121)实测值：108 |
| 9个月 | 靶值：30(20-40)实测值：32 | 靶值：101(81-121)实测值：106 |
上列数据显示，该AST液体单试剂2-8℃存放9个月后或37℃存放5天，试剂测试结果都是正常的。使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和D-葡萄糖作为稳定β-NADH的辅酶还原***是可行的。
实施例3
如下测定依本发明配制的AST试剂(D-葡萄糖：10mmol/L，葡萄糖脱氢酶：50U/L)的稳定性：
稳定化AST液体单试剂配方：
表16
| 原料 | 分子量 | 浓度(mmol/L) | 每升量 |
| Tris | 121.1 | 90 | 10.9g |
| α-酮戊二酸，Na盐(2H2O) | 226.1 | 13 | 2.9g |
| L-天冬氨酸 | 133.1 | 220 | 29.3g |
| 氢氧化钾 | 56.1 | 220 | 12.3g |
| D-葡萄糖 | 180.2 | 10 | 1.8g |
| 甘油 | 92.1 | 7％ | |
| EDTA.2Na | 372.2 | 4 | 1.5g |
| 叠氮钠 | 65.1 | 0.4g | |
| β-NADH二钠盐 | 709.4 | 0.28 | 0.199g |
| 乳酸脱氢酶 | 1800U | ||
| 苹果酸脱氢酶 | 1000U | ||
| 葡萄糖脱氢酶 | 50U | ||
| 盐酸 | 36.5 | 调pH8.0 |
相应非稳定化AST液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖辅酶还原***，不含甘油。其它组份及其浓度与上表相同。
试剂贮存条件：2-8℃密封存放，37℃密封存放。
测试波长：340nm 测试温度：37℃
比色杯光径：10mm 样品与试剂体积比：1∶15
延迟时间：60秒 测试时间：60秒
试剂空白吸光度：反映β-NADH的含量，初始吸光度应大于1.0A
准确度：测定结果应在质控血清标示值范围内
测试线性：≥550U/L
测试结果：
1)AST液体单试剂37℃存放后空白吸光度
表17
| 37℃存放天数 | 稳定化单试剂 | 非稳定化单试剂 |
| 0 | 1.880 | 1.886 |
| 1 | 1.759 | |
| 2 | 1.640 | |
| 3 | 1.518 | 1.075 |
| 4 | 1.396 | |
| 5 | 1.285 | |
| 6 | 1.177 | |
| 7 | 1.080 |
2)AST液体单试剂2-8℃存放后空白吸光度
表18
| 2-8℃存放时间 | 稳定化单试剂 | 非稳定化单试剂 |
| 0周 | 1.878 | 1.883 |
| 3周 | 1.530 | |
| 5周 | 1.395 | |
| 7周 | 1.283 | |
| 11周 | 1.092 | |
| 3个月 | 1.720 | |
| 6个月 | 1.541 | |
| 9个月 | 1.375 | |
| 12个月 | 1.192 |
3)稳定化AST液体单试剂2-8℃存放后线性测定
表19
| 2-8℃存放3个月线性 | ||||||
| 理论值U/L | 0 | 121.7 | 244.1 | 366.0 | 488.0 | 600 |
| 实测值U/L | 4.5 | 124 | 247 | 366 | 473 | 582 |
| 2-8℃存放6个月线性 | ||||||
| 理论值U/L | 0 | 113 | 226 | 338 | 451 | 564 |
| 实测值U/L | 5.0 | 115 | 220 | 338 | 436 | 559 |
| 2-8℃存放9个月线性 | ||||||
| 理论值U/L | 0 | 121 | 222 | 315 | 419 | 548 |
| 实测值U/L | 4.6 | 115 | 220 | 315 | 420 | 535 |
| 2-8℃存放12个月线性 | ||||||
| 理论值U/L | 0 | 114 | 228 | 343 | 457 | 571 |
| 实测值U/L | 5.2 | 114 | 231 | 346 | 449 | 548 |
4)稳定化AST液体单试剂2-8℃存放后准确度测定
表20
| 2-8℃存放时间 | 血清I(U/L) | 血清III(U/L) |
| 3个月 | 靶值：28(23-33)实测值：31 | 靶值：104(84-124)实测值：105 |
| 6个月 | 靶值：28(23-33)实测值：29 | 靶值：104(84-124)实测值：96 |
| 9个月 | 靶值：28(23-33)实测值：29 | 靶值：104(84-124)实测值：100 |
| 12个月 | 靶值：28(23-33)实测值：28 | 靶值：104(84-124)实测值：105 |
5)稳定化AST液体单试剂37℃存放后准确度测定
表21
| 37℃存放时间 | 血清I(U/L)靶值30(20-40) | 血清II(U/L)靶值54(41-67) | 血清III(U/L)靶值101(81-121) |
| 0天 | 28 | 57 | 100 |
| 5天 | 30 | 58 | 105 |
| 6天 | 29 | 56 | 104 |
| 7天 | 27 | 61 | 102 |
上列数据显示，该AST液体单试剂2-8℃存放12个月后或37℃存放7天，试剂测试结果都是正常的。使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和D-葡萄糖作为稳定β-NADH的辅酶还原***是可行的。
实施例4
如下测定依本发明配制的ALT(D-葡萄糖：5mmol/L，葡萄糖脱氢酶：10U/L)试剂的稳定性：
稳定化ALT液体单试剂：
表22
| 原料 | 分子量 | 浓度(mmol/L) | 每升量 |
| Tris | 121.1 | 100 | 12.1g |
| α-酮戊二酸，Na盐(2H2O) | 226.1 | 15 | 3.39g |
| L-丙氨酸 | 89.1 | 500 | 44.6g |
| D-葡萄糖 | 180.2 | 5 | 0.9g |
| EDTA.2钠盐 | 372.2 | 5 | 1.86g |
| 甘油 | 92.1 | 5％ | |
| 叠氮钠 | 65.1 | 0.5g | |
| β-NADH二钠盐 | 709.4 | 0.27 | 0.19g |
| 乳酸脱氢酶 | 4000U | ||
| 葡萄糖脱氢酶 | 10U | ||
| 盐酸 | 36.5 | 调pH7.8 |
相应的非稳定化ALT液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖辅酶还原***，不含甘油。其它组份浓度与上表相同。
试剂贮存条件：2-8℃密封存放，37℃密封存放。
测试波长：340nm 测试温度：37℃
比色杯光径：10mm 样品与试剂体积比：1∶15
延迟时间：60秒 测试时间：60秒
试剂空白吸光度：反映β-NADH的含量，有效初始吸光度应大于1.0A
准确度：测定结果应在质控血清标示值范围内。
线性： 550 U/L
测试结果：
1)ALT液体单试剂37℃存放后空白吸光度
表23
| 37℃存放天数 | 稳定化单试剂 | 非稳定化单试剂 |
| 0 | 1.857 | 1.752 |
| 1 | 1.687 | 1.375 |
| 2 | 1.066 | |
| 3 | ||
| 4 | 1.188 | |
| 5 | 1.057 |
可见，稳定化ALT液体单试剂在37℃可以存放5天，非稳定化ALT液体单试剂只能存放2天。稳定化单试剂中β-NADH稳定性较好。
2)ALT液体单试剂2-8℃存放后空白吸光度
表24
| 2-8℃存放时间 | 稳定化单试剂 | 非稳定化单试剂 |
| 0周 | 1.902 | 1.752 |
| 3个月 | 1.688 | 1.235 |
| 4个月 | 1.041 | |
| 6个月 | 1.468 | |
| 9个月 | 1.266 | |
| 12个月 | 1.099 |
在2-8℃稳定化ALT液体单试剂中β-NADH可以稳定12个月以上，而非稳定化单试剂中β-NADH只能稳定四个月。
3)稳定化ALT液体单试剂2-8℃存放后线性测定
表25
| 2-8℃存放3个月线性 | |||||
| 理论值U/L | 4.3 | 153.4 | 302.5 | 451.5 | 600.6 |
| 实测值U/L | 4.3 | 164.0 | 315.6 | 477.6 | 600.6 |
| 2-8℃存放6个月线性 | |||||
| 理论值U/L | 8.5 | 177.0 | 345.4 | 513.9 | 682.3 |
| 实测值U/L | 8.5 | 199.1 | 367.9 | 541.4 | 682.3 |
| 2-8℃存放8个月线性 | |||||
| 理论值U/L | 6.7 | 138.1 | 269.5 | 400.9 | 532.3 |
| 实测值U/L | 6.7 | 157.8 | 293.2 | 416.5 | 532.3 |
| 2-8℃存放12个月线性 | |||||
| 理论值U/L | 5.9 | 154.1 | 302.3 | 450.5 | 598.7 |
| 实测值U/L | 5.9 | 169.3 | 323.1 | 471.2 | 598.7 |
稳定化ALT液体单试剂在2-8℃贮存12个月，试剂线性测试结果仍然符合要求。
4)稳定化ALT液体单试剂37℃存放后准确度测定
表26
| 37℃存放时间 | 血清I(U/L)靶值23(18-28) | 血清II(U/L)靶值45(35-55) | 血清III(U/L)靶值91(76-106) |
| 0天 | 24.3 | 42.8 | 84.5 |
| 3天 | 22.1 | 41.8 | 85.6 |
| 5天 | 23.8 | 41.4 | 82.0 |
稳定化ALT液体单试剂在37℃存放5天，试剂准确度测试结果全部在质控血清标示的靶值范围内。
5)稳定化ALT液体单试剂2-8℃存放后准确度测定
表27
| 2-8℃存放时间 | 血清I(U/L)靶值：24(19-29) | 血清III(U/L)靶值：92(77-107) |
| 3个月 | 实测值：20 | 实测值：82 |
| 6个月 | 实测值：24 | 实测值：78 |
| 9个月 | 实测值：23.5 | 实测值：84 |
| 12个月 | 实测值：25.5 | 实测值：88 |
稳定化ALT液体单试剂在2-8℃存放12个月，试剂准确度测试结果全部在质控血清标示的靶值范围内。
上列数据显示，该ALT液体单试剂2-8℃存放12个月后或37℃存放5天，试剂测试结果都是正常的。使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和D-葡萄糖作为稳定β-NADH的辅酶还原***是成功的。
实施例5
如下测定依本发明配制的ALT试剂(D-葡萄糖：1mmol/L，葡萄糖脱氢酶：2U/L)的稳定性：
稳定化ALT液体单试剂配方：
表28
| 原料 | 分子量 | 浓度(mmol/L) | 每升量 |
| Tris | 121.1 | 80 | 9.69g |
| α-酮戊二酸，Na盐(2H2O) | 226.1 | 12 | 2.71g |
| L-丙氨酸 | 89.1 | 400 | 35.6g |
| D-葡萄糖 | 180.2 | 1 | 0.18g |
| EDTA.2钠盐 | 372.2 | 3 | 1.12g |
| 甘油 | 92.1 | 10％ | |
| 叠氮钠 | 65.1 | 0.3g | |
| β-NADH二钠盐 | 709.4 | 0.25 | 0.177g |
| 乳酸脱氢酶 | 3000U | ||
| 葡萄糖脱氢酶 | 2U | ||
| 盐酸 | 36.5 | 调pH7.8 |
相应的非稳定化ALT液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖辅酶还原***，不含甘油。其它组份浓度与上表相同。
试剂贮存条件：2-8℃密封存放，37℃密封存放。
测试波长：340nm 测试温度：37℃
比色杯光径：10mm 样品与试剂体积比：1∶15
延迟时间：60秒 测试时间：60秒
试剂空白吸光度：反映β-NADH的含量，有效初始吸光度应大于1.0A
准确度：测定结果应在质控血清标示值范围内。
线性： 550U/L
测试结果：
1)ALT液体单试剂37℃存放后空白吸光度
表29
| 37℃存放天数 | 稳定化单试剂 | 非稳定化单试剂 |
| 0 | 1.710 | 1.705 |
| 1 | 1.525 | 1.330 |
| 2 | 1.019 | |
| 3 | ||
| 4 | 1.016 |
2)ALT液体单试剂2-8℃存放后空白吸光度
表30
| 2-8℃存放时间 | 稳定化单试剂 | 非稳定化单试剂 |
| 0周 | 1.715 | 1.713 |
| 3个月 | 1.488 | 1.195 |
| 4个月 | 1.002 | |
| 6个月 | 1.250 | |
| 9个月 | 1.031 |
3)稳定化ALT液体单试剂2-8℃存放后线性测定
表31
| 2-8℃存放3个月线性 | ||||||
| 理论值U/L | 32 | 129 | 257 | 386 | 514 | 643 |
| 实测值U/L | 30 | 128 | 257 | 376 | 507 | 629 |
| 2-8℃存放6个月线性 | ||||||
| 理论值U/L | 3.9 | 104 | 208 | 312 | 417 | 520 |
| 实测值U/L | 3.9 | 117 | 220 | 312 | 404 | 513 |
| 2-8℃存放9个月线性 | ||||||
| 理论值U/L | 4.6 | 117 | 234 | 351 | 468 | 565 |
| 实测值U/L | 4.6 | 112 | 237 | 351 | 459 | 536 |
4)稳定化ALT液体单试剂2-8℃存放后准确度测定
表32
| 2-8℃存放时间 | 血清I(U/L)靶值21(13-29) | 血清III(U/L)靶值93(73-113) |
| 3个月 | 28 | 90 |
| 6个月 | 24 | 91 |
| 9个月 | 22 | 86 |
5)稳定化ALT液体单试剂37℃存放后准确度测定
表33
| 37℃存放时间 | 血清I(U/L)靶值24(19-29) | 血清II(U/L)靶值47(37-57) | 血清III(U/L)靶值92(77-107) |
| 0天 | 22 | 51 | 90 |
| 4天 | 28 | 46 | 87 |
上列数据显示，该ALT液体单试剂2-8℃存放9个月后或37℃存放4天，试剂测试结果都是正常的。使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和D-葡萄糖作为稳定β-NADH的辅酶还原***是成功的。
实施例6
如下测定依本发明配制的ALT试剂(D-葡萄糖：10mmol/L，葡萄糖脱氢酶：50U/L)的稳定性：
稳定化ALT液体单试剂配方：
表34
| 原料 | 分子量 | 浓度(mmol/L) | 每升量 |
| Tris | 121.1 | 90 | 10.9g |
| α-酮戊二酸，Na盐(2H2O) | 226.1 | 13 | 2.94g |
| L-丙氨酸 | 89.1 | 450 | 40.1g |
| D-葡萄糖 | 180.2 | 10 | 1.8g |
| EDTA.2钠盐 | 372.2 | 4 | 1.49g |
| 甘油 | 92.1 | 7％ | |
| 叠氮钠 | 65.1 | 0.4g | |
| β-NADH二钠盐 | 709.4 | 0.28 | 0.199g |
| 乳酸脱氢酶 | 3500U | ||
| 葡萄糖脱氢酶 | 50U | ||
| 盐酸 | 36.5 | 调pH7.8 |
相应非稳定化ALT液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖辅酶还原***，不含甘油。其它组份浓度与上表相同。
试剂贮存条件：2-8℃密封存放，37℃密封存放。
测试波长：340nm 测试温度：37℃
比色杯光径：10mm 样品与试剂体积比：1∶15
延迟时间：60秒 测试时间：60秒
试剂空白吸光度：反映β-NADH的含量，有效初始吸光度应大于1.0A
准确度：测定结果应在质控血清标示值范围内。
线性：≥550U/L
测试结果：
1)ALT液体单试剂37℃存放后空白吸光度
表35
| 37℃存放天数 | 稳定化单试剂 | 非稳定化单试剂 |
| 0 | 1.881 | 1.875 |
| 1 | 1.715 | 1.493 |
| 2 | 1.154 | |
| 3 | ||
| 4 | 1.220 | |
| 5 | 1.092 |
2)ALT液体单试剂2-8℃存放后空白吸光度
表36
| 2-8℃存放时间 | 稳定化单试剂 | 非稳定单化试剂 |
| 0周 | 1.915 | 1.880 |
| 3个月 | 1.697 | 1.365 |
| 4个月 | 1.169 | |
| 6个月 | 1.478 | |
| 9个月 | 1.280 | |
| 12个月 | 1.115 |
3)稳定化ALT液体单试剂2-8℃存放后线性测定
表37
| 2-8℃存放3个月线性 | |||||||||
| 理论值U/L | 5.1 | 142 | 284 | 425 | 567 | ||||
| 实测值U/L | 5.1 | 142 | 294 | 412 | 555 | ||||
| 2-8℃存放6个月线性 | |||||||||
| 理论值U/L | 4.5 | 125 | 246 | 369 | 492 | 615 | |||
| 实测值U/L | 4.5 | 121 | 244 | 372 | 487 | 604 | |||
| 2-8℃存放9个月线性 | |||||||||
| 理论值U/L | 5.5 | 80 | 160 | 321 | 481 | 641 |
| 实测值U/L | 5.5 | 85 | 170 | 321 | 473 | 625 |
| 2-8℃存放12 个月线性 | ||||||
| 理论值U/L | 98 | 195 | 293 | 390 | 488 | 580 |
| 实测值U/L | 100 | 199 | 287 | 398 | 479 | 561 |
4)稳定化ALT液体单试剂2-8℃存放后准确度测定
表38
| 2-8℃存放时间 | 血清I(U/L)靶值21(13-29) | 血清III(U/L)靶值93(73-113) |
| 3个月 | 23 | 84 |
| 6个月 | 21 | 86 |
| 9个月 | 26 | 82 |
| 12个月 | 22 | 87 |
5)稳定化ALT液体单试剂37℃存放后准确度测定
表39
| 37℃存放时间 | 血清I(U/L)靶值24(1 9-29) | 血清II(U/L)靶值47(37-57) | 血清III(U/L)靶值92(7％107) |
| 0天 | 21 | 45 | 86 |
| 5天 | 23 | 44 | 84 |
上列数据显示，该ALT液体单试剂2-8℃存放12个月后或37℃存放5天，试剂测试结果都是正常的。使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和D-葡萄糖作为稳定β-NADH的辅酶还原***是成功的。
实施例7
如下测定依本发明配制的UREA试剂(D-葡萄糖：5mmol/L，葡萄糖脱氢酶：30U/L)的稳定性：
稳定化UREA液体单试剂：
表40
| 原料 | 分子量 | 浓度(mmol/L) | 每升量 |
| Tris | 121.1 | 100 | 12.1g |
| α-酮戊二酸，Na盐(2H2O) | 226.1 | 7 | 1.6g |
| 叠氮钠 | 65.0 | 0.3g | |
| D-葡萄糖 | 180.2 | 5 | 0.9g |
| 甘油 | 92.1 | 10％ | |
| ADP.K盐 | 501.3 | 2 | 1.0g |
| β-NADH，钠盐 | 709.4 | 0.28 | 0.2g |
| 谷氨酸脱氢酶 | 600U/L | ||
| 脲酶 | 6000U/L | ||
| 葡萄糖脱氢酶 | 30U/L | ||
| 盐酸 | 36.5 | 调pH8.1 |
相应非稳定化UREA液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖辅酶还原***，不含甘油。其它组份浓度与上表相同。
试剂贮存条件：2-8℃密封存放，37℃密封存放
测试波长：340nm 测试温度：37℃
比色杯光径：10mm 样品与试剂体积比：1∶100
延迟时间：30秒 测试时间：60-150秒
试剂空白吸光度：反映β-NADH的含量，有效初始吸光度应大于1.0A
准确度：测定结果应在标示值范围内
线性：≥50mmol/L
测试结果：
1)Urea液体单试剂37℃存放后空白吸光度
表41
| 37℃存放天数 | 稳定化单试剂 | 非稳定化单试剂 |
| 0 | 1.821 | 1.835 |
| 1 | 1.655 | 1.621 |
| 2 | 1.547 | 1.424 |
| 3 | 1.421 | 1.267 |
| 4 | 1.302 | 1.113 |
| 5 | 1.200 | 0.956 |
| 6 | 1.126 | |
| 7 | 1.051 |
可见，稳定化Urea液体单试剂在37℃可以存放7天，非稳定化BUN液体单试剂只能存放4天。稳定化单试剂中β-NADH稳定性较好。
2)Urea液体单试剂2-8℃存放后空白吸光度
表42
| 2-8℃存放时间 | 稳定化单试剂 | 非稳定化单试剂 |
| 0个月 | 1.773 | 1.835 |
| 3个月 | 1.611 | 1.519 |
| 6个月 | 1.507 | 1.271 |
| 8个月 | 1.035 | |
| 9个月 | 1.391 | |
| 12个月 | 1.226 | |
| 15个月 | 1.125 | |
| 18个月 | 1.029 |
在2-8℃稳定化Urea液体单试剂中β-NADH可以稳定18个月以上，而非稳定化Urea液体单试剂中β-NADH只能稳定8个月。
3)稳定化Urea液体单试剂2-8℃存放后线性测定
表43
| 2-8℃存放4个月线性 | |||||||||||
| 理论值(mmol/l) | 1.59 | 10.58 | 21.16 | 31.74 | 42.32 | 52.90 | |||||
| 实测值(mmol/L) | 1.92 | 11.18 | 22.21 | 31.74 | 43.69 | 52.89 | |||||
| 2-8℃存放6个月线性 | |||||||||||
| 理论值(mmol/l) | 1.68 | 14.00 | 28.00 | 42.00 | 56.00 | ||||||
| 实测值(mmol/L) | 1.82 | 14.32 | 28.09 | 41.95 | 54.26 | ||||||
| 2-8℃存放9个月线性 | |||||||||||
| 理论值(mmol/l) | 1.62 | 13.50 | 27.00 | 40.50 | 54.00 | ||||||
| 实测值(mmol/L) | 1.80 | 14.14 | 27.55 | 40.16 | 52.08 | ||||||
| 2-8℃存放12个月线性 | |||||||||||
| 理论值(mmol/l) | 1.62 | 13.50 | 27.00 | 40.50 | 54.00 |
| 实测值(mmol/L) | 1.74 | 14.07 | 27.86 | 39.67 | 51.70 |
| 2-8℃存放15个月线性 | |||||
| 理论值(mmol/l) | 1.62 | 13.50 | 27.00 | 40.50 | 54.00 |
| 实测值(mmol/L) | 1.80 | 13.39 | 27.00 | 38.12 | 50.15 |
| 2-8℃存放18个月线性 | |||||
| 理论值(mmol/l) | 1.68 | 14.00 | 28.00 | 42.00 | 56.00 |
| 实测值(mmol/L) | 1.80 | 14.59 | 28.44 | 40.61 | 53.38 |
稳定化Urea液体单试剂在2-8℃贮存18个月，试剂线性测试结果仍然符合要求。
4)稳定化Urea液体单试剂37℃存放后准确度测定
表44
| 37℃存放时间 | 血清I(mmol/L)靶值3.0(2.3-3.7) | 血清II(mmol/L)靶值10.2(8.7-11.7) | 血清III(mmol/L)靶值18.7(16.5-20.8) |
| 0天 | 3.1 | 10.4 | 18.8 |
| 5天 | 3.12 | 10.08 | 19.54 |
| 7天 | 2.97 | 10.11 | 18.77 |
稳定化Urea液体单试剂在37℃存放7天，试剂准确度测试结果全部在质控血清标示的靶值范围内。
5)稳定化Urea液体单试剂2-8℃存放后准确度测定
表45
| 2-8℃存放时间 | 血清I(mmol/L) | 血清III(mmol/L) |
| 3个月 | 靶值2.5(1.8-3.2)实测值2.76 | 靶值18.5(16.3-20.7)实测值18.06 |
| 6个月 | 靶值2.5(1.8-3.2)实测值2.52 | 靶值18.5(16.3-20.7)实测值19.40 |
| 9个月 | 靶值2.5(1.8-3.2)实测值2.72 | 靶值18.5(16.3-20.7)实测值19.05 |
| 12个月 | 靶值7.70(5.58-9.55)实测值7.86 | |
| 15个月 | 靶值3.0(2.3-3.7)实测值2.83 | 靶值18.7(16.5-20.8)实测值17.27 |
| 18个月 | 靶值3.0(2.3-3.7)实测值2.95 | 靶值18.7(16.5-20.8)实测值19.05 |
稳定化Urea液体单试剂在2-8℃存放12个月，试剂准确度测试结果全部在血清标示的靶值范围内。
上列数据显示，Urea液体单试剂2-8℃存放18个月后或37℃存放7天，试剂测试结果都是正常的。使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和D-葡萄糖作为稳定β-NADH的辅酶还原***是可行的。
实施例8
如下测定依本发明配制的UREA试剂(D-葡萄糖：1mmol/L，葡萄糖脱氢酶：5U/L)的稳定性：
稳定化UREA液体单试剂配方：
表46
| 原料 | 分子量 | 浓度(mmol/L) | 每升量 |
| Tris | 121.1 | 110 | 13.3g |
| α-酮戊二酸，Na盐(2H2O) | 226.1 | 4 | 9.04g |
| 叠氮钠 | 65.0 | 0.2g | |
| D-葡萄糖 | 180.2 | 1 | 0.18g |
| 甘油 | 92.1 | 5％ | |
| ADP.K盐 | 501.3 | 1 | 0.5g |
| β-NADH，钠盐 | 709.4 | 0.25 | 0.177g |
| 谷氨酸脱氢酶 | 500U | ||
| 脲酶 | 5000U | ||
| 葡萄糖脱氢酶 | 5U | ||
| 盐酸 | 36.5 | 调pH8.1 |
相应非稳定化UREA液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖辅酶还原***，不含甘油。其它组份浓度与上表相同。
试剂贮存条件：2-8℃密封存放，37℃密封存放
测试波长：340nm 测试温度：37℃
比色杯光径：10mm 样品与试剂体积比：1∶100
延迟时间：30秒 测试时间：60-150秒
试剂空白吸光度：反映β-NADH的含量，有效初始吸光度应大于1.0A
准确度：测定结果应在标示值范围内
线性：≥50mmol/L
1)Urea液体单试剂37℃存放后空白吸光度
表47
| 37℃存放天数 | 稳定化单试剂 | 非稳定化单试剂 |
| 0 | 1.550 | 1.557 |
| 1 | 1.379 | 1.345 |
| 2 | 1.265 | 1.144 |
| 3 | 1.130 | 0.986 |
| 4 | 1.008 |
2)Urea液体单试剂2-8℃存放后空白吸光度
表48
| 2-8℃存放时间 | 稳定化单试剂 | 非稳定化单试剂 |
| 0个月 | 1.562 | 1.555 |
| 3个月 | 1.393 | 1.240 |
| 6个月 | 1.285 | 0.996 |
| 9个月 | 1.163 | |
| 12个月 | 1.001 |
3)稳定化Urea液体单试剂2-8℃存放后线性测定
表49
| 2-8℃存放3个月线性 | |||||
| 理论值(mmol/L) | 1.70 | 12.80 | 25.60 | 38.40 | 51.20 |
| 实测值(mmol/L) | 1.80 | 13.39 | 27.00 | 38.12 | 50.15 |
| 2-8℃存放6个月线性 | |||||
| 理论值(mmol/L) | 10.50 | 21.00 | 31.50 | 42.00 | 52.50 |
| 实测值(mmol/L) | 11.36 | 22.11 | 31.75 | 41.61 | 52.29 |
| 2-8℃存放9个月线性 | |||||
| 理论值(mmol/L) | 10.50 | 21.00 | 31.50 | 42.00 | 52.50 |
| 实测值(mmol/L) | 11.12 | 21.84 | 31.61 | 41.50 | 50.18 |
| 2-8℃存放12个月线性 | |||||
| 理论值(mmol/L) | 10.22 | 20.44 | 30.66 | 40.88 | 51.10 |
| 实测值(mmol/L) | 10.80 | 20.50 | 29.77 | 39.14 | 48.75 |
4)稳定化Urea液体单试剂37℃存放后准确度测定
表50
| 37℃存放时间 | 血清I(mmol/L)靶值2.5(1.8-3.2) | 血清II(mmol/L)靶值9.0(7.5-10.5) | 血清III(mmol/L)靶值18.5(16.3-20.7) |
| 0天 | 2.67 | 9.83 | 18.14 |
| 4天 | 2.85 | 9.77 | 18.50 |
5)稳定化Urea液体单试剂2-8℃存放后准确度测定
表51
| 2-8℃存放时间 | 血清I(mmol/L)靶值2.7(2.0-3.3) | 血清III(mmol/L)靶值18.7(16.5-20.8) |
| 3个月 | 2.91 | 19.20 |
| 6个月 | 3.00 | 19.01 |
| 9个月 | 2.98 | 18.90 |
| 12个月 | 2.90 | 19.00 |
上列数据显示，该Urea液体单试剂2-8℃存放12个月后或37℃存放4天，试剂测试结果都是正常的。使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和D-葡萄糖作为稳定β-NADH的辅酶还原***是可行的。
实施例9
如下测定依本发明配制的UREA试剂(D-葡萄糖：10mmol/L，葡萄糖脱氢酶：50U/L)的稳定性：
稳定化UREA液体单试剂配方：
表52
| 原料 | 分子量 | 浓度(mmol/L) | 每升量 |
| Tris | 121.1 | 120 | 14.5g |
| α-酮戊二酸，Na盐(2H2O) | 226.1 | 8 | 2.26g |
| 叠氮钠 | 65.0 | 0.5g | |
| D-葡萄糖 | 180.2 | 10 | 1.8g |
| 甘油 | 92.1 | 15％ | |
| ADP.K盐 | 501.3 | 4 | 2g |
| β-NADH，钠盐 | 709.4 | 0.3 | 0.21g |
| 谷氨酸脱氢酶 | 1000U | ||
| 脲酶 | 8000U | ||
| 葡萄糖脱氢酶 | 50U | ||
| 盐酸 | 36.5 | 调pH8.1 |
相应非稳定化UREA液体单试剂中不含葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖辅酶还原***，不含甘油。其它组份浓度与上表相同。
试剂贮存条件：2-8℃密封存放，37℃密封存放
测试波长：340nm 测试温度：37℃
比色杯光径：10mm 样品与试剂体积比：1∶100
延迟时间：30秒 测试时间：60-150秒
试剂空白吸光度：反映β-NADH的含量，有效初始吸光度应大于1.0A
准确度：测定结果应在标示值范围内
线性：≥50mmol/L
1)UREA液体单试剂37℃存放后空白吸光度
53
| 37℃存放天数 | 稳定化单试剂 | 非稳定化单试剂 |
| 0 | 1.942 | 1.938 |
| 1 | 1.780 | 1.723 |
| 2 | 1.675 | 1.520 |
| 3 | 1.553 | 1.362 |
| 4 | 1.440 | 1.205 |
| 5 | 1.341 | 1.047 |
| 6 | 1.273 | |
| 7 | 1.205 |
2)Urea液体单试剂2-8℃存放后空白吸光度
表54
| 2-8℃存放时间 | 稳定化单试剂 | 非稳定化单试剂 |
| 0个月 | 1.933 | 1.930 |
| 3个月 | 1.770 | 1.613 |
| 6个月 | 1.669 | 1.362 |
| 8个月 | 1.124 | |
| 9个月 | 1.555 | |
| 12个月 | 1.392 | |
| 15个月 | 1.295 | |
| 18个月 | 1.203 |
3)稳定化Urea液体单试剂2-8℃存放后线性测定
表55
| 2-8℃存放3个月线性 | |||||
| 理论值(mmol/L) | 11.47 | 22.93 | 34.40 | 45.87 | 57.34 |
| 实测值(mmol/L) | 11.96 | 23.02 | 34.40 | 43.62 | 55.43 |
| 2-8℃存放6个月线性 | |||||
| 理论值(mmol/L) | 10.03 | 20.06 | 30.09 | 40.12 | 50.15 |
| 实测值(mmol/L) | 10.03 | 20.80 | 31.43 | 40.12 | 50.29 |
| 2-8℃存放9个月线性 | |||||
| 理论值(mmol/L) | 11.30 | 22.60 | 34.00 | 45.30 | 56.60 |
| 实测值(mmol/L) | 11.90 | 23.20 | 34.00 | 43.70 | 54.20 |
| 2-8℃存放12个月线性 | |||||
| 理论值(mrnol/L) | 11.66 | 23.31 | 34.97 | 46.63 | 58.29 |
| 实测值(mmol/L) | 12.07 | 24.44 | 34.97 | 46.22 | 56.96 |
| 2-8℃存放15个月线性 | |||||
| 理论值(mmol/L) | 11.00 | 21.90 | 32.90 | 43.80 | 54.80 |
| 实测值(mmol/L) | 11.80 | 22.40 | 31.70 | 43.80 | 52.30 |
| 2-8℃存放18个月线性 | |||||
| 理论值(mmol/L) | 10.27 | 20.54 | 30.80 | 41.07 | 51.34 |
| 实测值(mmol/L) | 11.09 | 21.73 | 31.95 | 41.07 | 50.81 |
4)稳定化Urea液体单试剂37℃存放后准确度测定
表56
| 37℃存放时间 | 血清I(mmol/L)靶值2.5(1.8-3.2) | 血清II(mmol/L)靶值9.0(7.5-10.5) | 血清III(mmol/L)靶值18.5(16.3-20.7) |
| 0天 | 2.64 | 9.17 | 18.64 |
| 4天 | 2.51 | 9.70 | 18.73 |
| 7天 | 2.47 | 9.64 | 19.20 |
5)稳定化Urea液体单试剂2-8℃存放后准确度测定
表57
| 2-8℃存放时间 | 血清I(mmol/L)靶值2.7(2.0-3.3) | 血清III(mmol/L)靶值18.7(16.5-20.8) |
| 3个月 | 2.77 | 18.35 |
| 6个月 | 2.80 | 18.86 |
| 9个月 | 2.90 | 18.65 |
| 12个月 | 2.92 | 18.60 |
| 15个月 | 2.98 | 19.0 |
| 18个月 | 3.00 | 18.73 |
上列数据显示，Urea液体单试剂2-8℃存放18个月后或37℃存放7天，试剂测试结果都是正常的。使用高度专一性的葡萄糖脱氢酶和D-葡萄糖作为稳定β-NADH的辅酶还原***是可行的。
工业实用性
本发明由于用于稳定试剂以抗氧化的辅酶还原***使用了高度专一性的酶/底物对，酶和底物的用量大为降低，不仅几乎不增加试剂成本，而且不会因大量稳定酶的加入而引入新的杂酶，从而提高了试剂的稳定性。
Claims (11)
1、一种酶法测定病人分析物浓度的方法，其特征在于：测定时对测定所用的试剂中还原型辅酶的氧化速率进行测定，通过葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖中的连续再生还原型辅酶的动态稳定作用来实现该试剂在2-8℃贮存期间长期稳定，所述葡萄糖脱氢酶/D-葡萄糖中，葡萄糖脱氢酶对D-葡萄糖具有完全的专一性。
2、根据权利要求1所述的酶法测定病人分析物浓度的方法，其特征在于：所述试剂为液体单试剂。
3、根据权利要求1或2所述的酶法测定病人分析物浓度的方法，其特征在于：其中所述的分析物是天冬氨酸氨基转移酶。
4、根据权利要求3所述的酶法测定病人分析物浓度的方法，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶用量为2-100U/L，所述D-葡萄糖用量为0.1-20mmol/L。
5、根据权利要求4所述的酶法测定病人分析物浓度的方法，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶用量为5-50U/L，所述D-葡萄糖用量为1-10mmol/L。
6、根据权利要求1或2所述的酶法测定病人分析物浓度的方法，其特征在于：所述分析物是丙氨酸氨基转移酶。
7、根据权利要求6所述的酶法测定病人分析物浓度的方法，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶用量为2-100U/L，所述D-葡萄糖用量为0.1-20mmol/L。
8、根据权利要求7所述的酶法测定病人分析物浓度的方法，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶用量为2-50U/L，所述D-葡萄糖用量为1-10mmol/L。
9、根据权利要求1或2所述的酶法测定病人分析物浓度的方法，其特征在于：所述分析物是血液尿素。
10、根据权利要求9所述的酶法测定病人分析物浓度的方法，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶用量为2-100U/L，所述D-葡萄糖用量为0.1-20mmol/L。
11、根据权利要求10所述的酶法测定病人分析物浓度的方法，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶用量为5-50U/L，所述D-葡萄糖用量为1-10mmol/L。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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