CN101498662A - 单胺氧化酶mao单试剂测定试剂盒 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种单试剂检测血清中单胺氧化酶MAO的诊断试剂盒。该试剂盒利用单胺氧化酶水解苄胺、丁基胺、戊基胺、β－苯乙基胺等胺类化合物产生氨，再偶联谷氨酸脱氢酶反应，将还原型辅酶反应成氧化型辅酶，通过测定340nm处吸光度的下降速度，定量反应出样本中单胺氧化酶活性的大小，另外本申请在体系中加入能缓慢生成还原型烟酰辅酶所需的酶和底物***，在试剂中形成酶－底物－辅酶的慢反应***，使得辅酶能缓慢循环补充，当浓度达到一定平衡的时候，就可以使试剂达到稳定的目的。这种单试剂的试剂盒使用方便、简洁，可以在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上快速检测，不需要特殊或者额外的仪器，其成本也低廉。

Description

单胺氧化酶MAO单试剂测定试剂盒

技术领域

本申请涉及酶法单试剂测定单胺氧化酶活性的方法及试剂盒的制法。

背景技术

单胺氧化酶(MAO)能反映纤维化的生化过程，是反映肝纤维化及肝细胞损害的重要指标，在肝硬化的诊断上越来越受到重视。

MAO是含铜的蛋白质，广泛存在于肝、肾、脑等器官的***中和细胞线粒体内，其分布肝>心>肾>脑>肺>骨骼肌，血小板和胎盘中也含有MAO，其同工酶有三种，分别为MAO—I、MAO—II和MAO—III，有两个亚单位MAO—A和MAO—B。通过同源序列分析，发现单胺氧化酶有四个高度保守的区域。在单胺氧化酶B中，这些保守区域包括：1)ADP结合位点；2)底物结合结构域；3)黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)共价结合位点；4)C端区域，主要与形成一个跨膜相关的α螺旋。

MAO是可以作用于不同单胺类化合物的水溶性酶，参与胶原成熟最后阶段的架桥形成。当纤维形成后，MAO脱离，从而导致血清中MAO活性升高。肝病患者因肝内慢性炎症性刺激而产生纤维***增生，最终导致肝纤维化。由于在此过程中胶原合成增多，所以血清中MAO活性增加与肝纤维化程度正相关。

现有的测定技术中，其测定的主要方法有：荧光法、免疫抑制法和化学分光光度法。荧光法是以β—苯乙基胺为底物来检测单胺氧化酶。免疫学方法是利用单胺氧化酶抗体与单胺氧化酶发生发应，检测生成的单胺氧化酶的同工酶。分光光度法是通过用单胺氧化酶催化胺类释放出过氧化氢去氧化10—N—甲基氨基甲酰基—3，7—二甲氨基—10—氢—吩噻嗪(MCDP)等发色剂进行测定。目前，主要以苄胺和对苯甲胺—β—偶氮萘酚作为底物。

目前市场上主要使用的测定MAO的技术是使用采用双试剂试剂盒的方法，这是因为双试剂的试剂盒通过控制酸碱度，可以增加试剂的稳定性。但是由于所采用的双试剂占用更多的试剂舱位，并且在半自动的仪器上操作繁琐，耗时长，所以限制了它们的实用性。

因此，目前还存在开发快速、操作简单、具有良好检测效果，并且可以在多种检测仪器中使用的试剂盒的需要。本专利申请提供了一种单试剂诊断MAO的试剂盒，以及配制该试剂盒的方法。本申请提供的试剂盒能广泛应用于各种检测仪器中对单胺氧化酶活性进行检测，通过在反应体系中偶联一个再生循环酶***，缓慢补充辅酶的量，从而确保了试剂的稳定性及临床测值的准确性。另外，本申请提供的单试剂占用的舱位少，操作简便，使用方便，灵敏度高，抗干扰能力强，具有测定速度快，准确度高，试剂稳定等效果。

发明内容

因此，为了克服目前在检测MAO领域中存在的如上所述的诸多问题，本中请提供一种稳定的测定血清、血浆中单胺氧化酶活性的单试剂的试剂盒。

本发明提供了一种包括50—250mM，pH7.0-10的缓冲液、5—30mM的胺类化合物、5-20mM的α—酮戊二酸、0.2—0.4mM的还原型辅酶、0.2—5Ku的谷氨酸脱氢酶的测定单胺氧化酶活性的单试剂试剂盒，其还包括由再生***酶、底物和辅酶组成的再生酶循环***。该再生酶循环***包括浓度为5—100mM的底物、10—1000u的***酶。

本申请所述的再生酶循环***的反应速率小于主反应的速率，不干扰主反应。本申请优选的再生酶循环***包括葡萄糖脱氢酶—葡萄糖—还原型辅酶或其类似物***、葡萄糖6磷酸脱氢酶—葡萄糖6磷酸—还原型辅酶或其类似物***、甘油脱氢酶—甘油—还原型辅酶或其类似物***、乳酸脱氢酶—丙酮酸—还原型辅酶或其类似物***；或者葡萄糖脱氢酶—葡萄糖—氧化型辅酶或其类似物***、葡萄糖6磷酸脱氢酶—葡萄糖6磷酸—氧化型辅酶或其类似物***、甘油脱氢酶—甘油—氧化型辅酶或其类似物***、乳酸脱氢酶—丙酮酸—氧化型辅酶或其类似物***。

本申请优选的氧化型辅酶是氧化型烟酰辅酶或其类似物，优选的还原型辅酶是氧化型烟酰辅酶或其类似物相应的还原型烟酰辅酶或其类似物。更优选的氧化型烟酰辅酶或其类似物是NAD、NADP、thio-NAD或thio-NADP，更优选的还原型烟酰辅酶或其类似物是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH。

特别地，本申请提供的试剂盒中所述的胺类化合物选自苄胺、丁基胺、戊基胺、β—苯乙基胺、酪胺或其衍生物。所述的缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷—盐酸缓冲液、三乙醇氨缓冲液、咪唑—盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、碳酸钠—碳酸氢钠缓冲液、硼酸—硼酸钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液、磷酸缓冲液或者磷酸盐缓冲液。

本申请提供的试剂盒优选地还包括0.1-3g/L的螯合剂、0.1-3g/L的防腐剂、1-30％的稳定剂、0.1—5g/L的表面活性剂、0.1—5mM的反应加速剂；所述的稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、硫基乙醇、甘露醇、乳糖、黄素腺嘌呤二核苷酸和黄素单核苷酸中的一种或几种；所述的表面活性剂是阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性表面活性剂。

另一方面，本申请提供的再生酶循环***还用于制备检测二氧化碳、腺苷脱氨酶、氨、肌酐、尿素、丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶的单试剂试剂盒中。

本申请的有益效果主要表现在：1)该方法所配制试剂为单一试剂，所以使用方便，操作简单；2)该试剂可在全自动生化分析仪上快速检测，也可在半自动或者手动仪器上使用，所以便于推广应用；3)参与偶联反应的成分都是外加的，不会引入额外的内外源物质的污染；4)本申请偶联的再生酶循环***速率要小于主反应的速率，不干扰主反应；5)本申请配制的单试剂试剂盒，稳定性好，可以长时间使用，37度稳定性实验证明一年半后空白吸光度A0≥0.8。

目前市场上存在的检测MAO的试剂盒均为双试剂的试剂盒。本申请则提供了一种为单试剂的试剂盒。

在设计本申请时需要考虑的几个问题是：

1)根据选择的底物选定单胺氧化酶测定的最适反应条件，如缓冲液的浓度，离子强度和pH等等；

2)还原型辅酶的最适稳定pH及辅酶再生循环***的慢反应pH；

3)样本中氨干扰的去除；

4)整个体系的稳定性问题；

5)兼顾上述所有条件下的反应速率问题。

在此基础上，本申请人公开了一种用于检测MAO的单试剂的试剂盒。在本申请的一个具体实施方案中，所述试剂盒主要采取以下的方法及步骤：

首先，将需要测定的样品与含有胺类化合物、α—酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、还原型辅酶及再生酶循环***的各种物质混匀，使之发生以下反应，

                  单胺氧化酶

胺类化合物+2水+氧——————→相应醛类产物+铵离子+过氧化氢+2OH

                            谷氨酸脱氢酶

铵离子+α—酮戊二酸+还原型辅酶——————→谷氨酸+氧化型辅酶+水

                       相应葡萄糖脱氢酶

氧化型辅酶+葡萄糖类底物——————→还原型辅酶+相应醛+水

然后，将反应后的混合物在全自动生化分析仪上，检测340nm处吸光度的下降速度，从而测算出单胺氧化酶的活性大小。

本申请的试剂盒还包括一种在单试剂制备中的再生酶循环***，通过在检测试剂中加入指示性辅酶的生成补充体系，利用反应的可逆性，由产物逆向生成原反应物，从而补充原反应物的量。该试剂盒通过在反应体系中偶联了一步再生酶循环***，从而从技术上确保了单试剂中各组分在制备、储存和应用过程的稳定。该再生酶循环***还可以推广应用于例如下列单试剂的研制中：二氧化碳试剂、腺苷脱氨酶试剂、氨试剂、肌酐试剂、尿素试剂、丙氨酸氨基转移酶试剂和天门冬氨酸氨基转移酶试剂。

具体的，本申请公开的单试剂的试剂盒中包括的再生酶循环***包括但不限于葡萄糖脱氢酶—葡萄糖—还原型烟酰胺酶或其类似物***、葡萄糖6磷酸脱氢酶—葡萄糖6磷酸—还原型烟酰胺酶或其类似物***、甘油脱氢酶—甘油—还原型烟酰胺酶或其类似物***、乳酸脱氢酶—丙酮酸—还原型烟酰胺酶或其类似物***；或者葡萄糖脱氢酶—葡萄糖—氧化型烟酰胺酶或其类似物***、葡萄糖6磷酸脱氢酶—葡萄糖6磷酸—氧化型烟酰胺酶或其类似物***、甘油脱氢酶—甘油—氧化型烟酰胺酶或其类似物***、乳酸脱氢酶—丙酮酸—氧化型烟酰胺酶或其类似物***。

根据本申请公开的方法，配制成的单试剂的试剂盒主要成分如下，但是本领域技术人员可以理解该试剂盒的成分并不限于下述成分，其可以包括与所述成分功能相同的其他等价试剂，也包括本领域技术人员所熟知的配制试剂盒所常用的其他成分或物质：

缓冲液                  50—250mM(pH7.0-11.0)

胺类化合物              5—30mM

α—酮戊二酸             5—20mM

还原型辅酶              0.2-0.4mM

谷氨酸脱氢酶            0.2-5ku

D-葡萄糖                5-100mM

葡萄糖脱氢酶            10—1000U

稳定剂                  1-30％

防腐剂                  0.1—3g/L

螯合剂                  0.1—3g/L

表面活性剂              0.1—5g/L

反应加速剂              0.1—5mM

配制本申请的试剂盒所选择的缓冲液的pH范围在7.0-11.0之间。所述的缓冲液可以是下列缓冲体系的任意一种：Tris—HCL缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、柠檬酸缓冲液、碳酸缓冲液、磷酸缓冲液等等。

上述提及的稳定剂可以是选自下述成分的一种或多种：乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、牛血清白蛋白、乳糖等等。

上述提及的螯合剂可以是选自下述成分的一种：EDTA，NTA，CyDTA，DTPA，EDTA-OH，TTHA，HIDA酸或者金属盐。其使用目的主要在于螯合样本中的二价金属离子，减少二价金属离子对测量的干扰。其优选的浓度范围是：0.1-3.0g/L。

上述提及表面活性剂为可以是选自下述成分的一种或多种：阳离子表面活性剂指：十六烷基三甲基溴化铵，十六烷基氯化吡啶等。阴离子表面活性剂是指：十二烷基磺酸钠，十二烷基苯磺酸钠，胆酸钠等。两性表面活性剂是指：Triton X系列，烷基、甜菜碱系列等。其优选的浓度范围是：0.1-5g/L。

木申请的一个具体实施方案中，其检测MAO的方法操作为：1)将样品(校准品作样品)加入到试剂中，使得样品与试剂的比例为1:9～1:11，混合均匀，37℃反应5分钟后，读取固定时间间隔内(例如2分钟、3分钟、5分钟)的吸光度，并计算吸光度的变化速率；根据下述公式计算MAO的活性：

ε：毫摩尔消光系数

Tv：总反应体积(mL)

Sv：样品体积(mL)

L：比色杯光径(cm)

以下将结合实施例对本发明进行详细说明，其中实施例仅仅是说明而非限定的作用，本领域技术人员完全可以在以下披露的具体实施例的技术上作出改进，但是不超过本发明权利要求的范围或者本发明精神之内所作出的改进都会落入本发明的保护范围。

具体实施方案

实施例1：试剂盒的单试剂的配制

本申请示例性的配制了3种单试剂的试剂盒，其配制原料、配制步骤以及获得的3种单试剂的成分分别为：

1)试剂的配制：

所需原料

 

名称	分子量	纯度	生产厂家
				Tris-base	121.1	99.9％	北京欣经科生物技术公司
Nacl	58.44	分析纯	北京益利精细化学品有限公司
				NaN3	65.01	99％	Merck
EDTA-2Na	372.24
				BSA		98.0％	Amresco
ADP—K	501.3
				TritonX—100	647	99.0％	北京欣经科生物技术公司
α—酮戊二酸	146.1	99.5％	北京欣经科生物技术公司
				苄胺	107.15	99.5％	acros
D—葡萄糖	180.16	99.8％	北京欣经科生物技术公司
				GLDI		237u/mg	Toyobo
NADH	709.9		roche
				GDH		72.8u/mg

2)配置方法

将各种物质在室温下在少量的去离子水中溶解，然后混匀在缓冲液中，调pH为7.0~11.0、定容体积，4—8℃放置4—7天即可使用。

3)获得的3种单试剂的试剂盒(分别命名为试剂盒I、试剂盒II和试剂盒III)的成分如下：

试剂盒I：

Tris-Hcl缓冲液          50mM

苄胺                    5mM

α—酮戊二酸             5mM

还原型辅酶                0.2mM

谷氨酸脱氢酶              0.2ku

甘露糖醇                  0.1％

D-葡萄糖                  5mM

葡萄糖脱氢酶              10U

EDTA                      1g/L

NaN3                      1g/L

ADP—K                    0.1mM

Triton x-100              1g/L

试剂盒II盒：

磷酸缓冲液                100mM

苄胺                      20mM

α—酮戊二酸               10mM

还原型辅酶                0.25mM

谷氨酸脱氢酶              275u

甘露糖醇                  0.1％

丙酮酸                    20mM

乳酸脱氢酶                70U

EDTA                      2g/L

NaN3                      2g/L

ADP—K                    1.5mM

Triton x-100              5g/L

试剂III：

双甘氨肽缓冲液             250mM

苄胺                      30mM

α—酮戊二酸               20mM

还原型辅酶                0.4mM

谷氨酸脱氢酶              5ku

甘露糖醇               0.5％

葡萄糖6磷酸            100mM

葡萄糖6磷酸脱氢酶      1000U

EDTA                   3g/L

NaN3                   3g/L

ADP—K                 5mM

Triton x-100           5g/L

实施例2：用试剂盒检测样品中MAO的方法和步骤

1)检测参数为：

温度            37℃

波长            340nm(主)&405nm(副)

比色杯光径      1.0cm

测试方法        速率法

反应方向        负反应

2)检测步骤为：

首先以水调零，进行校准；然后加入0.018ml的样本；之后加入0.18ml试剂，在37℃孵育4分钟后，测试2分钟，计算测试时间段每分钟平均吸光度的变化(ΔA/min)。理论K值为—1740。

3)血清中MAO的正常参考值：0—12U/L

实施例3：检测试剂盒I、II、III的抗干扰能力

同时对实施例1配置的3种单试剂盒，即试剂盒I、II、III的性能进行如下检测：

1、试剂盒的抗干扰实验

分别按照本领域的常规技术配置含有抗坏血酸、胆红素、Hb不同浓度的待测样品，采用试剂盒I、II、III在检测仪器中检测样品中MAO的活性，从而检测三种试剂盒对各种干扰物的抗干扰能力(每个样品一式三份，取其平均值)。检测结果(平均值)如表1所示：

表1

表1的结果表明，当抗坏血酸≤50mg/dL、胆红素≤40mg/dL或者Hb≤200mg/dL时，其不影响试剂盒I、II、III样品中MAO的检测，即所述的干扰物并不对试剂盒的检测产生干扰。

2试剂盒的抗氨干扰试验

分别按照本领域的常规技术配置含有不同浓度的氨的待测样品，采用试剂盒I、II、III在检测仪器中检测样品中MAO的活性，从而检测三种试剂盒对氨的抗干扰能力(每个样品一式三份，取其平均值)。实验结果如表2所示：

表2：

表2的结果表明当氨的干扰达到50uM时，不会影响本申请的试剂盒对MAO的检测，因此说明本申请公开的试剂盒可以抗≤50uM的氨的干扰，而对照试剂盒不抗氨干扰。

实施例4：检测试剂盒I、II、III的准确性和精密度

分别采用本领域常规的检测方法，对实施例1制备的试剂盒I、II、III的准确性和精密度进行检测。

1.准确性

对靶值为8的质控液在相同条件下，采用试剂盒I、II、III对同一质控液的MAO活性连续检测6次，将检测结果的平均值与靶值范围(4-12)进行比较，以检测所述的试剂盒的准确性。对试剂盆I、II、III的准确性的检测结果如表3所示：

表3

表3的结果表明：试剂盒I、II、III的6次检测结果的平均值在靶值范围(4-12)内，不准确度相对偏差(CV(％))不超过±5％。说明本申请公开的三种试剂盒的准确度符合诊断试剂盒的技术指标。

1.精密度

在相同条件下，采用试剂盒I、II、III对一份血清的MAO活性连续检测20次，比较每个试剂盒的变异系数，以检测所述的试剂盒的精密度。对试剂盒I、II、III的精密度的检测结果如表4所示：

表4

表4的结果表明：试剂盒I、II、III检测的同一样品的MAO活性的变异系数不超过±10％，说明本申请公开的三种试剂盒的精密度符合诊断试剂盒的技术指标。

实施例5：试剂盒I、II、III的灵敏度检测

采用本领域技术人员已知的方法，将空白液和同一份用生理盐水进行等比稀释10个梯度的样品，在检测仪器上采用试剂盒I、II、III连续对吸光度测定14次，读取每次测定原始吸光度值，然后计算出扣除空白吸光度后的各样品的吸光度的值，计算其均值，标准偏差。这里采用99.7％的可能性来计算检测低限。将每个样本的均值减去3倍的各自的标准偏差，然后与空白液的3倍的标准偏差比较，如果前者高于后者，我们就认定有99.7％的可能性出现的最小吸光度一定大于空白的吸光度，能定量的报告结果。

1)试剂盒I的测值的原始吸光度的数据(表5)

表5

2)扣除空白后的吸光度数据(表6)

表6

表5和6的结果表明，试剂盒I的生物检测限是：0.00054ΔA/u/L

2)试剂盒II的测值的原始吸光度的数据(表7)

表7

2)扣除空白后的吸光度数据(表8)

表8

表7和8的结果表明，试剂盒II的生物检测限是：0.00044ΔA/u/L

3)试剂盒III的测值的原始吸光度的数据(表9)

表9

2)扣除空白后的吸光度数据(表10)

表10

表9和10的数据表明，试剂盒III的生物检测限是：0.0010ΔA/u/L

实施例6试剂盒I、II、III的临床肝癌、肝纤维化患者测值

从医院收取已经确诊为肝癌、肝纤维化等肝病患者血清样本，在Olympus400上，用配制好的试剂盒按照常规方法检测样品的MAO活性，其结果如表11所示：

表11

表11的结果说明用本申请公开的3种试剂盒对已确诊的临床样品的MAO活性的检测结果与临床病症相符，说明本申请公开的3种试剂盒可以适用于临床对MAO活性的检测。

总之，本申请的优势在于，单试剂盒，操作简单，使用方便，可以应用于全自动和半自动等各种生化分析仪器上；通过加长反应延迟时间加速反应消除内外源氨的干扰，偶联辅酶的循环再生***，增强试剂的稳定性、准确性、抗干扰性，长时间存放之后仍可以准确测定样本中的单胺氧化酶的活性。

本领域技术人员可以理解，本申请公开的方法及由此生产的单试剂盒可以广泛应用于Hitachi、Olympus和Synchron各种全自动生化分析仪。各仪器的测定条件如下：温度37摄氏度、反应时间4分钟、测试主波长340nm、副波长405nm、测定样本与试剂盒的比例是1：10，反映方向为负反应，延迟时间为4分钟，检测时间2分钟，理论K值为—1746。根据现有技术和临床工作人员的经验，在不需要进行创造性劳动的前提下，本领域技术人员可以对各种检测仪器的最佳检测参数进行优化。对各种检测仪器的参数的优化并没有超出本申请要求保护的范围之外。

Claims (13)

1、一种测定单胺氧化酶活性的单试剂试剂盒，包括50—250mM，pH7.0-10的缓冲液、5—30mM的胺类化合物、5-20mM的α—酮戊二酸、0.2—0.4mM的还原型辅酶、0.2—5Ku的谷氨酸脱氢酶，其特征在于还包括由再生***酶、底物和辅酶组成的再生酶循环***。

2、根据权利要求1的试剂盒，其中所述的再生酶循环***包括浓度为5—100mM的底物、10—1000u的***酶。

3、根据权利要求1或2的试剂盒，其特征在于所述的再生酶循环***的反应速率小于主反应的速率，不干扰主反应。

4、根据权利要求1或2的试剂盒，其中所述的再生酶循环***包括葡萄糖脱氢酶—葡萄糖—还原型辅酶或其类似物***、葡萄糖6磷酸脱氢酶—葡萄糖6磷酸—还原型辅酶或其类似物***、甘油脱氢酶—甘油—还原型辅酶或其类似物***、乳酸脱氢酶—丙酮酸—还原型辅酶或其类似物***；或者葡萄糖脱氢酶—葡萄糖—氧化型辅酶或其类似物***、葡萄糖6磷酸脱氢酶—葡萄糖6磷酸—氧化型辅酶或其类似物***、甘油脱氢酶—甘油—氧化型辅酶或其类似物***、乳酸脱氢酶—丙酮酸—氧化型辅酶或其类似物***。

5、根据权利要求4的试剂盒，其特征在于所述的氧化型辅酶是氧化型烟酰辅酶或其类似物，还原型辅酶是氧化型烟酰辅酶或其类似物相应的还原型烟酰辅酶或其类似物。

6、根据权利要求5的试剂盒，其特征在于氧化型烟酰辅酶或其类似物是NAD、NADP、thio-NAD或thio-NADP，还原型烟酰辅酶或其类似物是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH。

7.根据权利要求6的试剂盒，其特征在于所述的还原型辅酶NADH的吸光度在0.6—2.0之间，波长340nm，光径10mm。

8、根据权利要求1或2的试剂盒，其特征在于还包括0.1-3g/L的螯合剂、0.1-3g/L的防腐剂、1-30％的稳定剂、0.1—5g/L的表面活性剂、0.1—5mM的反应加速剂。

9、根据权利要求1或2的试剂盒，其特征在于所述的胺类化合物选自苄胺、丁基胺、戊基胺、β—苯乙基胺、酪胺或其衍生物。

10、根据权利要求1或2的试剂盒，其特征在于所述的缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷—盐酸缓冲液、三乙醇氨缓冲液、咪唑—盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、碳酸钠—碳酸氢钠缓冲液、硼酸—硼酸钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液、磷酸缓冲液或者磷酸盐缓冲液。

11、根据权利要求8的试剂盒，其特征在于所是的稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、硫基乙醇、甘露醇、乳糖、黄素腺嘌呤二核苷酸和黄素单核苷酸中的一种或几种。

12、根据权利要求8的试剂盒，其特征在于所述的表面活性剂是阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性表面活性剂。

13、一种再生酶循环***可扩展用于制备检测二氧化碳、腺苷脱氨酶、氨、肌酐、尿素、丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶的单试剂试剂盒中的用途。