JPH1070991A - 腫瘍関連抗原のためのキメラ免疫グロブリン遺伝子 - Google Patents
腫瘍関連抗原のためのキメラ免疫グロブリン遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】腫瘍関連抗原に対して特異性をもち、腫瘍の治
療及び診断に有用なキメラ免疫グロブリンを提供する。 【構成】 ａ）齧歯類動物免疫グロブリン鎖の可変領域
の少なくとも機能部分をコードする第１のＤＮＡ配列
と、ｂ）ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一
部をコードする第２のＤＮＡ配列と、を結合をして成
る、１７−１Ａモノクローナル抗体によって定められる
腫瘍−関連抗原に対して特異性をもつキメラ齧歯類動物
・ヒト免疫グロブリン鎖をコードする融合遺伝子、この
遺伝子を含む宿主細胞及び上記キメラ免疫グロブリンを
製造する方法。
療及び診断に有用なキメラ免疫グロブリンを提供する。 【構成】 ａ）齧歯類動物免疫グロブリン鎖の可変領域
の少なくとも機能部分をコードする第１のＤＮＡ配列
と、ｂ）ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一
部をコードする第２のＤＮＡ配列と、を結合をして成
る、１７−１Ａモノクローナル抗体によって定められる
腫瘍−関連抗原に対して特異性をもつキメラ齧歯類動物
・ヒト免疫グロブリン鎖をコードする融合遺伝子、この
遺伝子を含む宿主細胞及び上記キメラ免疫グロブリンを
製造する方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト不変部に結合され
た腫瘍−または増殖−関連抗原に対して特異的な齧歯類
−誘導抗原結合領域から成るキメラ免疫グロブリンに関
する。
た腫瘍−または増殖−関連抗原に対して特異的な齧歯類
−誘導抗原結合領域から成るキメラ免疫グロブリンに関
する。
【０００２】
【従来技術】モノクローナル抗体は、癌の治療に使用す
るために、腫瘍と関連した抗原に対して開発された。１
つの例は、結腸直腸癌細胞および他の腫瘍細胞の表面抗
原に対して特異的なネズミモノクローナル抗体１７−１
Ａである。この抗体は結腸癌の免疫療法において使用さ
れ、そしていくつかの場合にこの治療は結腸直腸癌の部
分後退または完全後退をもたらした。
るために、腫瘍と関連した抗原に対して開発された。１
つの例は、結腸直腸癌細胞および他の腫瘍細胞の表面抗
原に対して特異的なネズミモノクローナル抗体１７−１
Ａである。この抗体は結腸癌の免疫療法において使用さ
れ、そしていくつかの場合にこの治療は結腸直腸癌の部
分後退または完全後退をもたらした。
【０００３】腫瘍関連抗原に対して開発された大部分の
モノクローナル抗体はネズミ抗体である。その主な理由
は、この動物種でのモノクローナル抗体の製造技術が十
分に開発されているからである。ヒトモノクローナル抗
体は製造するのが難しい。ネズミハイブリドーマを作る
ための標準技術（すなわち、抗原を投与して免疫化し、
その後融合用の脾細胞を採取する技術）は明らかにヒト
モノクローナル抗体を製造する際に使用できない。特定
抗原に対する抗体を生産するヒトリンパ球は自然界で抗
原にさらされたヒトから選択しうるが、ヒト細胞から作
られたハイプリドーマは往々にして不安定であり、抗体
の生産を中止してしまう。モノクローナル抗体の生産に
関するネズミ系での成功は、多くのタイプの癌抗原に対
するモノクローナル抗体の生産手段を提供する。しかし
ながら、ネズミ抗体はヒトの癌治療へのその使用を相当
に制限するい〈つかの欠点をもつている。外来タンパク
質としてのネズミ抗体はしばしば、それらの治療効力を
減少または破壊する反作用的な免疫反応を誘発させる。
さらに、ネズミ抗体は患者にアレルギー反応を引き起こ
すことがある。不幸にも、治療での再投与の必要性は、
患者におけるこれらの免疫反応の可能性を増大させるも
のである。
モノクローナル抗体はネズミ抗体である。その主な理由
は、この動物種でのモノクローナル抗体の製造技術が十
分に開発されているからである。ヒトモノクローナル抗
体は製造するのが難しい。ネズミハイブリドーマを作る
ための標準技術（すなわち、抗原を投与して免疫化し、
その後融合用の脾細胞を採取する技術）は明らかにヒト
モノクローナル抗体を製造する際に使用できない。特定
抗原に対する抗体を生産するヒトリンパ球は自然界で抗
原にさらされたヒトから選択しうるが、ヒト細胞から作
られたハイプリドーマは往々にして不安定であり、抗体
の生産を中止してしまう。モノクローナル抗体の生産に
関するネズミ系での成功は、多くのタイプの癌抗原に対
するモノクローナル抗体の生産手段を提供する。しかし
ながら、ネズミ抗体はヒトの癌治療へのその使用を相当
に制限するい〈つかの欠点をもつている。外来タンパク
質としてのネズミ抗体はしばしば、それらの治療効力を
減少または破壊する反作用的な免疫反応を誘発させる。
さらに、ネズミ抗体は患者にアレルギー反応を引き起こ
すことがある。不幸にも、治療での再投与の必要性は、
患者におけるこれらの免疫反応の可能性を増大させるも
のである。
【０００４】これらの問題を回避するために示唆された
方法は、ヒトの不変部に結合されたマウスの可変部から
成る抗体を作ることである。例えばモリソン（Ｍｏｒｒ
ｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．）ら、“キメラヒト抗体分子：ヒト
不変部ドメインをもつマウス抗原結合ドメイン”Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８
５１（１９８４）；ニユーバーガー（Ｎｅｕ−ｂｅｒｇ
ｅｒ．Ｍ．Ｓ．）およびラビツツ（Ｒａｂｂｉｔｓ，
Ｔ．Ｈ．）、“キメラ抗体の製造”ＰＣＴ出願番号ＰＣ
Ｔ／ＧＢ８５ ００３９２を参照されたい。これらのキ
メラ抗体はネズミ抗体の抗原結合特異性をもつであろう
が、それらはヒト不変部を有するので大部分はヒト抗体
であるだろう。不変部は抗体に対する免疫応答に大きく
関与するので、ヒト由来の不変部をもつキメラネズミ／
ヒト抗体はヒトにおいて抗ネズミ免疫応答を恐らく引き
起こさないと思われる。さらに、ヒト不変部はより優れ
たエフエクター機能をもつ抗体を提供する。ヒト不変部
のネズミ可変部への結合は、得られるキメラの結合能を
低下または破壊する方法で、可変部のコンホメーシヨン
を変更するかもしれない。ハプテン（例えばアゾフエニ
ルアルソネートおよびトリニトロフエニル）のための可
変部をもつキメラネズミ／ネズミ抗体およびネズミ／ヒ
ト抗体が作られ、これらの抗体は可変部が誘導されるネ
ズミ抗体のもとのハプテン結合特異性を保持することが
見出された。例えばシヤロン（Ｓｈａｒｏｎ，Ｊ．）
ら、“マウスミエローマ細胞によるＶＨＣＫキメラタン
パク質の発現”Ｎａｔｕｒｅ ３０９：３６４〜３６６
（１９８４）；ボーリアン（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ，Ｇ．
Ｌ．）ら、“機能的なキメラマウス／ヒト抗体の製造”
Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４〜６０８（１９８４）；
およびニユーバーガー（Ｎｅｕｂｅｒ−ｇｅｒ，Ｍ．
Ｓ．）ら、“ヒト生理学的エフエクター機能をもつハプ
テン特異的キメラＩｇＥ抗体”Ｎａｔｕｒｅ ３１４：
２６８〜２７０（１９８５）を参照されたい。しかしな
がら、ハプテン分子は小さいので、ヒト不変部の結合に
よつてネズミ可変部に起こりうるコンホメーシヨンの変
化は、この種の分子への結合を有意に変更しないのかも
しれない。その同族抗原が腫瘍−または増殖−関連細胞
の表面抗原のような大きい分子である場合、可変部にお
けるコンホメーシヨンの変化は実質的に結合能に影響を
及ぼし得るだろう。
方法は、ヒトの不変部に結合されたマウスの可変部から
成る抗体を作ることである。例えばモリソン（Ｍｏｒｒ
ｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．）ら、“キメラヒト抗体分子：ヒト
不変部ドメインをもつマウス抗原結合ドメイン”Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８
５１（１９８４）；ニユーバーガー（Ｎｅｕ−ｂｅｒｇ
ｅｒ．Ｍ．Ｓ．）およびラビツツ（Ｒａｂｂｉｔｓ，
Ｔ．Ｈ．）、“キメラ抗体の製造”ＰＣＴ出願番号ＰＣ
Ｔ／ＧＢ８５ ００３９２を参照されたい。これらのキ
メラ抗体はネズミ抗体の抗原結合特異性をもつであろう
が、それらはヒト不変部を有するので大部分はヒト抗体
であるだろう。不変部は抗体に対する免疫応答に大きく
関与するので、ヒト由来の不変部をもつキメラネズミ／
ヒト抗体はヒトにおいて抗ネズミ免疫応答を恐らく引き
起こさないと思われる。さらに、ヒト不変部はより優れ
たエフエクター機能をもつ抗体を提供する。ヒト不変部
のネズミ可変部への結合は、得られるキメラの結合能を
低下または破壊する方法で、可変部のコンホメーシヨン
を変更するかもしれない。ハプテン（例えばアゾフエニ
ルアルソネートおよびトリニトロフエニル）のための可
変部をもつキメラネズミ／ネズミ抗体およびネズミ／ヒ
ト抗体が作られ、これらの抗体は可変部が誘導されるネ
ズミ抗体のもとのハプテン結合特異性を保持することが
見出された。例えばシヤロン（Ｓｈａｒｏｎ，Ｊ．）
ら、“マウスミエローマ細胞によるＶＨＣＫキメラタン
パク質の発現”Ｎａｔｕｒｅ ３０９：３６４〜３６６
（１９８４）；ボーリアン（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ，Ｇ．
Ｌ．）ら、“機能的なキメラマウス／ヒト抗体の製造”
Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４〜６０８（１９８４）；
およびニユーバーガー（Ｎｅｕｂｅｒ−ｇｅｒ，Ｍ．
Ｓ．）ら、“ヒト生理学的エフエクター機能をもつハプ
テン特異的キメラＩｇＥ抗体”Ｎａｔｕｒｅ ３１４：
２６８〜２７０（１９８５）を参照されたい。しかしな
がら、ハプテン分子は小さいので、ヒト不変部の結合に
よつてネズミ可変部に起こりうるコンホメーシヨンの変
化は、この種の分子への結合を有意に変更しないのかも
しれない。その同族抗原が腫瘍−または増殖−関連細胞
の表面抗原のような大きい分子である場合、可変部にお
けるコンホメーシヨンの変化は実質的に結合能に影響を
及ぼし得るだろう。
【０００５】
【発明の構成】本発明は、ヒト不変部に結合された腫瘍
−または増殖−関連抗原に特異的な齧歯類誘導抗原結合
領域から成るキメラ免疫グロブリンに関する。そのキメ
ラ免疫グロブリンは ａ）ヒト重鎖不変部に結合された、腫瘍−または増殖−
関連抗原に対して特異的な齧歯類抗体の重鎖から誘導さ
れる抗原結合領域から成る少なくとも１本のキメラ重
鎖；および ｂ）ヒト軽鎖不変部に結合された、齧歯類抗体の軽鎖か
ら誘導される抗原結合領域から成る少なくとも１本のキ
メラ軽鎖；から構成される。免疫グロブリンは１価ダイ
マー、２価テトラマーまたは多価集合体であり得る。こ
れらのキメラネズミ／ヒト免疫グロプリンは腫瘍−また
は増殖−関連抗原に対するもとの結合能を保持してい
る。キメラ免疫グロブリンの齧歯類可変部は、腫瘍−ま
たは増殖−関連抗原に対して特異的な免疫グロブリンか
ら誘導される。通常、その可変部はネズミ由来のもので
あるだろう。なぜなら、この種の抗原に対するネズミ抗
体は入手可能であるか、又は十分に確立されたネズミ系
において製造可能であるからである。腫瘍−関連抗原
（この抗原と特異的に反応するネズミ免疫グロブリンが
使用される）の例は抗原１７−１Ａ（胃腸の腫瘍）、Ｏ
Ｃ１２５（卵巣癌）、ＯＶ−ＴＬ３（卵巣癌）、１０３
Ｄ２（乳癌）および１２３．Ｃ３（腎癌）である。その
他には抗原７２．３（結腸）、ＤＦ３、１１５Ｄ８、Ｒ
Ｃ３８（腎臓）、Ｇ２５０および５５−２Ａが含まれ
る。ラツト系は別の可変部源を提供する。
−または増殖−関連抗原に特異的な齧歯類誘導抗原結合
領域から成るキメラ免疫グロブリンに関する。そのキメ
ラ免疫グロブリンは ａ）ヒト重鎖不変部に結合された、腫瘍−または増殖−
関連抗原に対して特異的な齧歯類抗体の重鎖から誘導さ
れる抗原結合領域から成る少なくとも１本のキメラ重
鎖；および ｂ）ヒト軽鎖不変部に結合された、齧歯類抗体の軽鎖か
ら誘導される抗原結合領域から成る少なくとも１本のキ
メラ軽鎖；から構成される。免疫グロブリンは１価ダイ
マー、２価テトラマーまたは多価集合体であり得る。こ
れらのキメラネズミ／ヒト免疫グロプリンは腫瘍−また
は増殖−関連抗原に対するもとの結合能を保持してい
る。キメラ免疫グロブリンの齧歯類可変部は、腫瘍−ま
たは増殖−関連抗原に対して特異的な免疫グロブリンか
ら誘導される。通常、その可変部はネズミ由来のもので
あるだろう。なぜなら、この種の抗原に対するネズミ抗
体は入手可能であるか、又は十分に確立されたネズミ系
において製造可能であるからである。腫瘍−関連抗原
（この抗原と特異的に反応するネズミ免疫グロブリンが
使用される）の例は抗原１７−１Ａ（胃腸の腫瘍）、Ｏ
Ｃ１２５（卵巣癌）、ＯＶ−ＴＬ３（卵巣癌）、１０３
Ｄ２（乳癌）および１２３．Ｃ３（腎癌）である。その
他には抗原７２．３（結腸）、ＤＦ３、１１５Ｄ８、Ｒ
Ｃ３８（腎臓）、Ｇ２５０および５５−２Ａが含まれ
る。ラツト系は別の可変部源を提供する。
【０００６】キメラ免疫グロブリンの不変部はヒト免疫
グロブリンから誘導される。重鎖の不変部はアイソタイ
プクラスまたはサプクラスのいずれからも選択すること
ができ、一方軽鎖の不変部はカツパ（ｋ）またはラムダ
（λ）クラスのものであり得る。キメラ抗体は、腫瘍−
関連抗原に対して特異的な齧歯類抗体の重鎖および軽鎖
可変部をコードするＤＮＡセグメントをクローニング
し、次にこれらのＤＮＡセグメントをヒト重鎖および軽
鎖不変部をコードするＤＮＡセグメントに結合してキメ
ラ免疫グロブリンコード化遺伝子を作ることにより製造
される。軽鎖および重鎖をコードする融合遺伝子構築物
は発現ベクター中に集められるか、またはその中に挿入
される。これらの遺伝子は免疫グロブリンタンパク質を
合成し、集成し、分泌することができるリンパ様受容細
胞（例えばミエローマ細胞）に同時トランスフエクシヨ
ンされる。
グロブリンから誘導される。重鎖の不変部はアイソタイ
プクラスまたはサプクラスのいずれからも選択すること
ができ、一方軽鎖の不変部はカツパ（ｋ）またはラムダ
（λ）クラスのものであり得る。キメラ抗体は、腫瘍−
関連抗原に対して特異的な齧歯類抗体の重鎖および軽鎖
可変部をコードするＤＮＡセグメントをクローニング
し、次にこれらのＤＮＡセグメントをヒト重鎖および軽
鎖不変部をコードするＤＮＡセグメントに結合してキメ
ラ免疫グロブリンコード化遺伝子を作ることにより製造
される。軽鎖および重鎖をコードする融合遺伝子構築物
は発現ベクター中に集められるか、またはその中に挿入
される。これらの遺伝子は免疫グロブリンタンパク質を
合成し、集成し、分泌することができるリンパ様受容細
胞（例えばミエローマ細胞）に同時トランスフエクシヨ
ンされる。
【０００７】本発明のキメラ抗体は癌の治療および診断
に有用である。キメラ抗体は単独で、あるいは異なる腫
瘍によつてもたらされる別の抗原に特異的な抗体の混合
物または“カクテル”として数種の他の免疫グロブリン
と共に、腫瘍の治療のために使用される。他の治療形式
では、キメラ免疫グロブリンを癌治療薬剤と化学的にま
たは遺伝子工学技術により結合させて、癌細胞に特異的
に向かういわゆる“スマート（ｓｍａｒｔ）”剤を形成
することができる。診断用途のために、キメラ免疫グロ
ブリンは腫瘍画像形成用の薬剤を提供することができ
る。例えば、免疫グロブリンは重鎖を切断して“抗体フ
ラグメント”を得、直接にまたは標識キレート剤を介し
て標識することにより作られる。キメラ免疫グロブリン
は“ビルトイン（ｂｕｉｌｔ−ｉｎ）”標識キレートタ
ンパク質またはタンパク質ドメインを含むようにデザイ
ンすることができる。
に有用である。キメラ抗体は単独で、あるいは異なる腫
瘍によつてもたらされる別の抗原に特異的な抗体の混合
物または“カクテル”として数種の他の免疫グロブリン
と共に、腫瘍の治療のために使用される。他の治療形式
では、キメラ免疫グロブリンを癌治療薬剤と化学的にま
たは遺伝子工学技術により結合させて、癌細胞に特異的
に向かういわゆる“スマート（ｓｍａｒｔ）”剤を形成
することができる。診断用途のために、キメラ免疫グロ
ブリンは腫瘍画像形成用の薬剤を提供することができ
る。例えば、免疫グロブリンは重鎖を切断して“抗体フ
ラグメント”を得、直接にまたは標識キレート剤を介し
て標識することにより作られる。キメラ免疫グロブリン
は“ビルトイン（ｂｕｉｌｔ−ｉｎ）”標識キレートタ
ンパク質またはタンパク質ドメインを含むようにデザイ
ンすることができる。
【０００８】キメラネズミ／ヒト抗体のｉｎ ｖｉｖｏ
使用はネズミモノクローナル抗体の使用に比べていくつ
かの利点を提供する。第一に、これらの抗体は患者にヒ
ト抗マウス反応を誘起する点でより弱い免疫原性をも
つ。第二に、所定のヒト不変部をマウス可変部遺伝子に
結合させて、意図する生物学的エフエクター機能をもつ
抗体を作ることができる。最後に、Ｉｇ ＤＮＡと非Ｉ
ｇ ＤＮＡ配列を結合させることにより構築されたハイ
ブリツド遺伝子を発現させることが可能である。先に述
べたように、これらの融合タンパク質は選択的破壊また
は腫瘍細胞の画像形成のための、抗体をベースとした輸
送系を構成する。
使用はネズミモノクローナル抗体の使用に比べていくつ
かの利点を提供する。第一に、これらの抗体は患者にヒ
ト抗マウス反応を誘起する点でより弱い免疫原性をも
つ。第二に、所定のヒト不変部をマウス可変部遺伝子に
結合させて、意図する生物学的エフエクター機能をもつ
抗体を作ることができる。最後に、Ｉｇ ＤＮＡと非Ｉ
ｇ ＤＮＡ配列を結合させることにより構築されたハイ
ブリツド遺伝子を発現させることが可能である。先に述
べたように、これらの融合タンパク質は選択的破壊また
は腫瘍細胞の画像形成のための、抗体をベースとした輸
送系を構成する。
【０００９】本発明のキメラ免疫グロブリンは、個々の
キメラ重鎖および軽鎖免疫グロブリンから成る。キメラ
重鎖は齧歯類重鎖可変部およびヒト重鎖不変部をもつ連
続ポリペプチドである。キメラ軽鎖は齧歯類軽鎖可変部
およびヒト軽鎖不変部をもつ連続ポリペプチドである。
免疫グロブリンは１価、２価または多価であり得る。１
価免疫グロブリンは１本のキメラ軽鎖と（ジスルフイド
架橋を介して）結合した１本のキメラ重鎖から成るダイ
マー（ＨＬ）である。２価免疫グロブリンは２本のダイ
マーが結合されたテトラマー（Ｈ２Ｌ２）である。多価
免疫グロブリンは、例えば凝集する重鎖不変部（例えば
ミユー（μ）タイプの不変部）を使用することにより作
られる。
キメラ重鎖および軽鎖免疫グロブリンから成る。キメラ
重鎖は齧歯類重鎖可変部およびヒト重鎖不変部をもつ連
続ポリペプチドである。キメラ軽鎖は齧歯類軽鎖可変部
およびヒト軽鎖不変部をもつ連続ポリペプチドである。
免疫グロブリンは１価、２価または多価であり得る。１
価免疫グロブリンは１本のキメラ軽鎖と（ジスルフイド
架橋を介して）結合した１本のキメラ重鎖から成るダイ
マー（ＨＬ）である。２価免疫グロブリンは２本のダイ
マーが結合されたテトラマー（Ｈ２Ｌ２）である。多価
免疫グロブリンは、例えば凝集する重鎖不変部（例えば
ミユー（μ）タイプの不変部）を使用することにより作
られる。
【００１０】可変部は腫瘍−または増殖−関連抗原に特
異的な抗体から誘導される。その抗原結合領域は胃腸、
***、卵巣、肺および腎の癌細胞抗原に特異的でありう
る。抗原の例は１７−１Ａ（胃腸の腫瘍）、ＯＣ１２５
（卵巣癌）、ＯＶ−ＴＬ３（卵巣癌）、１０３Ｄ２（乳
癌）および１２３．Ｃ３（腎癌）に特異的なネズミ抗体
によつて規定される抗原である。その他には７２．３
（結腸）、ＤＦ３、１１５Ｄ８、ＲＣ３８（腎）、Ｇ２
５０および５５−２Ａが含まれる。重鎖不変部は５種の
アイソタイプアルフア（α）、デルタ（δ）、イプシロ
ン（ε）、ガンマ（γ）またはミユー（μ）のいずれか
らも選択することができる。さらに、種々のサブクラス
（例えばＩｇＧサブクラス）の重鎖も使用できる。異な
るクラスおよびサプクラスの重鎖は異なるエフエクター
機能の原因となり、こうして所望の重鎖不変部を選ぶこ
とにより、所望のエフエクター機能をもつキメラ抗体を
製造することができる。好適な不変部はガンマ１（Ｉｇ
Ｇ１）およびガンマ３（ＩｇＧ３）である。軽鎖不変部
はカツパまたはラムダ鎖でありうる。
異的な抗体から誘導される。その抗原結合領域は胃腸、
***、卵巣、肺および腎の癌細胞抗原に特異的でありう
る。抗原の例は１７−１Ａ（胃腸の腫瘍）、ＯＣ１２５
（卵巣癌）、ＯＶ−ＴＬ３（卵巣癌）、１０３Ｄ２（乳
癌）および１２３．Ｃ３（腎癌）に特異的なネズミ抗体
によつて規定される抗原である。その他には７２．３
（結腸）、ＤＦ３、１１５Ｄ８、ＲＣ３８（腎）、Ｇ２
５０および５５−２Ａが含まれる。重鎖不変部は５種の
アイソタイプアルフア（α）、デルタ（δ）、イプシロ
ン（ε）、ガンマ（γ）またはミユー（μ）のいずれか
らも選択することができる。さらに、種々のサブクラス
（例えばＩｇＧサブクラス）の重鎖も使用できる。異な
るクラスおよびサプクラスの重鎖は異なるエフエクター
機能の原因となり、こうして所望の重鎖不変部を選ぶこ
とにより、所望のエフエクター機能をもつキメラ抗体を
製造することができる。好適な不変部はガンマ１（Ｉｇ
Ｇ１）およびガンマ３（ＩｇＧ３）である。軽鎖不変部
はカツパまたはラムダ鎖でありうる。
【００１１】一般に、キメラ抗体はキメラ免疫グロブリ
ンの軽鎖および重鎖成分のそれぞれのために、ネズミ可
変部の少な〈とも機能部分をコードする第１ＤＮＡセグ
メントを、ヒト不変部の少なくとも一部をコードする第
２ＤＮＡセグメントに結合させた融合遺伝子をつくるこ
とにより製造される。各融合遺伝子は発現ベクター中に
集められるか、またはそのベクター中に挿入される。そ
の後、遺伝子産物を発現しうる受容細胞にその遺伝子を
トランスフエクシヨンする。トランスフエクシヨンされ
た受容細胞を培養し、発現された免疫グロブリンまたは
免疫グロブリン鎖を回収する。ネズミＩｇ軽鎖および重
鎖の可変部をコードする遺伝子は、意図する腫瘍抗原に
特異的な抗体を生産するリンパ様細胞から得られる。例
えば、抗原１７−１Ａ、ＯＣ１２５、または他の抗原の
いずれかに対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株
は、ある種の腫瘍関連抗原に対する免疫グロブリン可変
部遺伝子の源を提供する。細胞株は齧歯類を腫瘍細胞ま
たは腫瘍抗原含有細胞成分または分画でチヤレンジ（免
疫化）し、抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合ハイ
ブリツド細胞を形成し、そのハイブリツドをクローニン
グし、そして腫瘍−関連抗原に対する抗体を産生するク
ローンを選択することにより作ることができる。コプロ
ースキー（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ）らの米国特許第４１７
２１２４号を参照されたい。
ンの軽鎖および重鎖成分のそれぞれのために、ネズミ可
変部の少な〈とも機能部分をコードする第１ＤＮＡセグ
メントを、ヒト不変部の少なくとも一部をコードする第
２ＤＮＡセグメントに結合させた融合遺伝子をつくるこ
とにより製造される。各融合遺伝子は発現ベクター中に
集められるか、またはそのベクター中に挿入される。そ
の後、遺伝子産物を発現しうる受容細胞にその遺伝子を
トランスフエクシヨンする。トランスフエクシヨンされ
た受容細胞を培養し、発現された免疫グロブリンまたは
免疫グロブリン鎖を回収する。ネズミＩｇ軽鎖および重
鎖の可変部をコードする遺伝子は、意図する腫瘍抗原に
特異的な抗体を生産するリンパ様細胞から得られる。例
えば、抗原１７−１Ａ、ＯＣ１２５、または他の抗原の
いずれかに対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株
は、ある種の腫瘍関連抗原に対する免疫グロブリン可変
部遺伝子の源を提供する。細胞株は齧歯類を腫瘍細胞ま
たは腫瘍抗原含有細胞成分または分画でチヤレンジ（免
疫化）し、抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合ハイ
ブリツド細胞を形成し、そのハイブリツドをクローニン
グし、そして腫瘍−関連抗原に対する抗体を産生するク
ローンを選択することにより作ることができる。コプロ
ースキー（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ）らの米国特許第４１７
２１２４号を参照されたい。
【００１２】不変部は標準クローニング法によりヒト抗
体産生細胞から得られる。また、２つのクラスの軽鎖お
よび５つのクラスの重鎖をコードする遺伝子はすでにク
ローニングされているので、ヒト由来の不変部はこれら
のクローンから容易に入手しうる。好まし〈は、キメラ
軽鎖および重鎖をコードする融合遺伝子は２つの異なる
発現ベクター（これらのベクターは受容細胞を同時形質
転換するために使用しうる）中に挿入される。それぞれ
のベクターは２つの選択遺伝子（すなわち細菌系での選
択遺伝子および真核生物系での選択遺伝子）を含み、各
ベクターは異なる対の遺伝子を有する。これらのベクタ
ーは細菌系での融合遺伝子の生産および増幅、その後の
真核細胞の同時トランスフエクシヨンおよび同時トラン
スフエクシヨンされた細胞の選択を可能にする。細菌系
のための選択遺伝子の例は、アンピシリン耐性を与える
遺伝子およびクロラムフエニコール耐性を与える遺伝子
である。トランスフエクシヨンされた真核細胞の選択の
ためには、２つの選択遺伝子：すなわち（１）キサンチ
ン−グアニンホスホリボシルトランスフエラーゼ遺伝子
（ｇｐｔ）、および（ｉｉ）Ｔｎ５からのホスホトラン
スフエラーゼ遺伝子（ｎｅｏと称す）が好適である。ｇ
ｐｔ での選択は、この遺伝子によつてコードされる酵
素がプリンヌクレオチド合成のために基質としてキサン
チンを使用する能力に基づいている；類似の内因性酵素
はキサンチンを利用できない。キサンチンおよびミコフ
エノール酸（イノシンモノホスフエートのキサンチンモ
ノホスフエートへの転化を遮断する）を含む培地では、
ｇｐｔ遺伝子を発現する細胞だけが生き残る。ｎｅｏの
生産物は、抗生物質Ｇ４１８およびこのクラスの他の抗
生物質によつて起こる真核細胞によるタンパク質合成の
阻止を遮断する。２つの選択方法は真核細胞中の２つの
異なるＤＮＡベクターに導入された免疫グロブリン鎖遺
伝子の発現を選択するために、同時にまたは順次使用さ
れる。
体産生細胞から得られる。また、２つのクラスの軽鎖お
よび５つのクラスの重鎖をコードする遺伝子はすでにク
ローニングされているので、ヒト由来の不変部はこれら
のクローンから容易に入手しうる。好まし〈は、キメラ
軽鎖および重鎖をコードする融合遺伝子は２つの異なる
発現ベクター（これらのベクターは受容細胞を同時形質
転換するために使用しうる）中に挿入される。それぞれ
のベクターは２つの選択遺伝子（すなわち細菌系での選
択遺伝子および真核生物系での選択遺伝子）を含み、各
ベクターは異なる対の遺伝子を有する。これらのベクタ
ーは細菌系での融合遺伝子の生産および増幅、その後の
真核細胞の同時トランスフエクシヨンおよび同時トラン
スフエクシヨンされた細胞の選択を可能にする。細菌系
のための選択遺伝子の例は、アンピシリン耐性を与える
遺伝子およびクロラムフエニコール耐性を与える遺伝子
である。トランスフエクシヨンされた真核細胞の選択の
ためには、２つの選択遺伝子：すなわち（１）キサンチ
ン−グアニンホスホリボシルトランスフエラーゼ遺伝子
（ｇｐｔ）、および（ｉｉ）Ｔｎ５からのホスホトラン
スフエラーゼ遺伝子（ｎｅｏと称す）が好適である。ｇ
ｐｔ での選択は、この遺伝子によつてコードされる酵
素がプリンヌクレオチド合成のために基質としてキサン
チンを使用する能力に基づいている；類似の内因性酵素
はキサンチンを利用できない。キサンチンおよびミコフ
エノール酸（イノシンモノホスフエートのキサンチンモ
ノホスフエートへの転化を遮断する）を含む培地では、
ｇｐｔ遺伝子を発現する細胞だけが生き残る。ｎｅｏの
生産物は、抗生物質Ｇ４１８およびこのクラスの他の抗
生物質によつて起こる真核細胞によるタンパク質合成の
阻止を遮断する。２つの選択方法は真核細胞中の２つの
異なるＤＮＡベクターに導入された免疫グロブリン鎖遺
伝子の発現を選択するために、同時にまたは順次使用さ
れる。
【００１３】好適な受容細胞株はミエローマ細胞であ
る。ミエローマ細胞はトランスフエクシヨンされたＩｇ
遺伝子によりコードされる免疫グロブリンを合成し、集
成し、そして分泌することができる。さらに、それらは
免疫グロブリンのグリコシル化機構を有する。特に好適
な受容細胞はＩｇ非産生ミエローマ細胞Ｓｐ ２／０で
ある。この細胞はトランスフエクシヨンされた免疫グロ
ブリン遺伝子によりコードされる免疫グロブリンのみを
生産する。ミエローマ細胞は培地中で、又はマウスの腹
膜中（この場合は分泌された免疫グロブリンが腹水から
得られる）で増殖させることができる。Ｂリンパ球のよ
うな他のリンパ様細胞またはハイブリドーマ細胞も適当
な受容細胞として役立つだろう。免疫グロブリンコード
化遺伝子でリンパ様細胞をトランスフエクシヨンするい
くつかの方法が存在する。ＤＮＡをリンパ様細胞中に導
入する好適な方法はプロトプラスト融合によるものであ
る。この方法では、キメラＩｇ遺伝子を含む組換えプラ
スミドを保有する細菌から細胞壁を溶解するために、リ
ソチームが使用される。得られたスフエロプラストはポ
リエチレングリコールを用いてミエローマ細胞と融合さ
せる。プロトプラスト融合の後、トランスフエクシヨン
された細胞を選択し、分離する。ＤＮＡを多くの細胞型
へ導入するために使用できる他の技術はリン酸カルシウ
ム沈降である。
る。ミエローマ細胞はトランスフエクシヨンされたＩｇ
遺伝子によりコードされる免疫グロブリンを合成し、集
成し、そして分泌することができる。さらに、それらは
免疫グロブリンのグリコシル化機構を有する。特に好適
な受容細胞はＩｇ非産生ミエローマ細胞Ｓｐ ２／０で
ある。この細胞はトランスフエクシヨンされた免疫グロ
ブリン遺伝子によりコードされる免疫グロブリンのみを
生産する。ミエローマ細胞は培地中で、又はマウスの腹
膜中（この場合は分泌された免疫グロブリンが腹水から
得られる）で増殖させることができる。Ｂリンパ球のよ
うな他のリンパ様細胞またはハイブリドーマ細胞も適当
な受容細胞として役立つだろう。免疫グロブリンコード
化遺伝子でリンパ様細胞をトランスフエクシヨンするい
くつかの方法が存在する。ＤＮＡをリンパ様細胞中に導
入する好適な方法はプロトプラスト融合によるものであ
る。この方法では、キメラＩｇ遺伝子を含む組換えプラ
スミドを保有する細菌から細胞壁を溶解するために、リ
ソチームが使用される。得られたスフエロプラストはポ
リエチレングリコールを用いてミエローマ細胞と融合さ
せる。プロトプラスト融合の後、トランスフエクシヨン
された細胞を選択し、分離する。ＤＮＡを多くの細胞型
へ導入するために使用できる他の技術はリン酸カルシウ
ム沈降である。
【００１４】キメラ免疫グロブリン遺伝子は、細菌や酵
母のような非リンパ様細胞中で発現させることができ
る。細菌による発現の場合は、免疫グロブリン重鎖およ
び軽鎖が細胞封入体の一部になる。従つて、これらの鎖
は単離精製したあと機能的な免疫グロブリン分子とする
ために集成しなければならない。結腸直腸癌およびいく
つかの他の種類の癌に関連した１７−１Ａ抗原に特異的
な機能キメラ抗体は以下のようにして作られる。
母のような非リンパ様細胞中で発現させることができ
る。細菌による発現の場合は、免疫グロブリン重鎖およ
び軽鎖が細胞封入体の一部になる。従つて、これらの鎖
は単離精製したあと機能的な免疫グロブリン分子とする
ために集成しなければならない。結腸直腸癌およびいく
つかの他の種類の癌に関連した１７−１Ａ抗原に特異的
な機能キメラ抗体は以下のようにして作られる。
【００１５】１７−１Ａの重鎖および軽鎖Ｖ領域（Ｉｇ
Ｇ２ａ、カツパ軽鎖）をコードするゲノムＤＮＡセグメ
ントをクローニングし、その後ヒトγ３不変部（Ｃγ
３）およびカツパ不変部（Ｃκ）をコードするＤＮＡセ
グメントに連結した。組換え遺伝子はマウスミエローマ
細胞にトランスフエクシヨンして、Ｉｇタンパク質を合
成し、集成し、そして分泌させた。Ｖ領域のためのプロ
ーブを得るために、１７−１ＡのｃＤＮＡライブラリー
を作製した。ＲＮＡを抽出し、ポリＡ＋ＲＮＡをオリゴ
ｄＴセルロースクロマトグラフイーにより調製した。２
本鎖ｃＤＮＡはポリＡ＋ＲＮＡを鋳型としてＡＭＶ逆転
写酵素および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラー
ゼＩを使つて合成した。２本鎖ｃＤＮＡはＳ１ヌクレア
ーゼで処理し、デオキシシチジン残基で伸長させ、そし
て予めＰｓｔＩで切断したｄＧ付加ｐＵＣ８とアニーリ
ングさせた。この組換えプラスミドを大腸菌ＤＨ１に形
質転換し、コロニーはマウスＣκプローブおよびマウス
Ｃγ２ａプローブを用いてスクリーニングして、それぞ
れ軽鎖クローンおよび重鎖クローンを単離した。これら
のクローンはＶ領域プローブの供給源として使用した。
Ｇ２ａ、カツパ軽鎖）をコードするゲノムＤＮＡセグメ
ントをクローニングし、その後ヒトγ３不変部（Ｃγ
３）およびカツパ不変部（Ｃκ）をコードするＤＮＡセ
グメントに連結した。組換え遺伝子はマウスミエローマ
細胞にトランスフエクシヨンして、Ｉｇタンパク質を合
成し、集成し、そして分泌させた。Ｖ領域のためのプロ
ーブを得るために、１７−１ＡのｃＤＮＡライブラリー
を作製した。ＲＮＡを抽出し、ポリＡ＋ＲＮＡをオリゴ
ｄＴセルロースクロマトグラフイーにより調製した。２
本鎖ｃＤＮＡはポリＡ＋ＲＮＡを鋳型としてＡＭＶ逆転
写酵素および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラー
ゼＩを使つて合成した。２本鎖ｃＤＮＡはＳ１ヌクレア
ーゼで処理し、デオキシシチジン残基で伸長させ、そし
て予めＰｓｔＩで切断したｄＧ付加ｐＵＣ８とアニーリ
ングさせた。この組換えプラスミドを大腸菌ＤＨ１に形
質転換し、コロニーはマウスＣκプローブおよびマウス
Ｃγ２ａプローブを用いてスクリーニングして、それぞ
れ軽鎖クローンおよび重鎖クローンを単離した。これら
のクローンはＶ領域プローブの供給源として使用した。
【００１６】機能的に再配列されたカツパ軽鎖遺伝子を
含むゲノムＤＮＡフラグメントを単離するために、ゲノ
ムライブラリーはＥＭＢＬ３Ａフアージアームを使つて
Ｓａｕ３Ａ部分消化１７−１Ａ ＤＮＡから作製した。
全部で２００，０００個の組換えプラークがマウスＣκ
プローブによりスクリーニングされ、３個の陽性クロー
ンが得られた。これらのクローンのうちの１つλ κ４
は、制限マツピングおよび１７−１Ａｋ ｃＤＮＡをプ
ローブとして使用するサザン分析により、１７−１Ａの
機能的に再配列されたカツパ軽鎖遺伝子のＶおよびＣ領
域の両方を含むことがわかつた。マウスＣγ２ａプロー
ブおよびｃＤＮＡクローンから誘導された重鎖Ｖ（Ｖ
Ｈ）プローブを使用して同じ方法を繰り返した場合、ど
の陽性クローンも重鎖遺伝子のＶおよびＣ領域の両方を
含まないことがわかつた。
含むゲノムＤＮＡフラグメントを単離するために、ゲノ
ムライブラリーはＥＭＢＬ３Ａフアージアームを使つて
Ｓａｕ３Ａ部分消化１７−１Ａ ＤＮＡから作製した。
全部で２００，０００個の組換えプラークがマウスＣκ
プローブによりスクリーニングされ、３個の陽性クロー
ンが得られた。これらのクローンのうちの１つλ κ４
は、制限マツピングおよび１７−１Ａｋ ｃＤＮＡをプ
ローブとして使用するサザン分析により、１７−１Ａの
機能的に再配列されたカツパ軽鎖遺伝子のＶおよびＣ領
域の両方を含むことがわかつた。マウスＣγ２ａプロー
ブおよびｃＤＮＡクローンから誘導された重鎖Ｖ（Ｖ
Ｈ）プローブを使用して同じ方法を繰り返した場合、ど
の陽性クローンも重鎖遺伝子のＶおよびＣ領域の両方を
含まないことがわかつた。
【００１７】ＶＨ遺伝子をクローニングするために別の
方法が行われた。１７−１Ａの再配列された重鎖Ｖ遺伝
子を含むフラグメントは、融合パートナーＮＳ−１のパ
ターンと比較したとき別のバンドとしてサザン分析によ
り同定された。１７−１Ａ細胞のＤＮＡ試料を制限酵素
ＥｃｏＲＩで消化したとき、７．４ｋｂと３．８ｋｂの
２つの再配列フラグメントが、Ｊ３およびＪ４配列を含
むマウス重鎖Ｊ領域（ＪＨ）プローブを用いることによ
り見出された。分離用アガロースゲル電気泳動により単
離した約７ｋｂおよび約４ｋｂのＤＮＡフラグメント
は、それぞれλｇｔ ＷＥＳおよびλｇｔ １１フアー
ジアームと連結させた。これらの２つの部分ライブラリ
ーの組換えプラークはマウスＪＨプローブでスクリーニ
ングした。７．４ｋｂおよび３．８ｋｂのＥｃｏＲＩフ
ラグメントの両方をクローニングした。７．４ｋｂフラ
グメントは制限マツピングおよび１７−１Ａ重鎖ｃＤＮ
Ａをプローブとして使用するサザン分析により、機能的
に再配列されたＶＨ遺伝子を含むことが判明した。
方法が行われた。１７−１Ａの再配列された重鎖Ｖ遺伝
子を含むフラグメントは、融合パートナーＮＳ−１のパ
ターンと比較したとき別のバンドとしてサザン分析によ
り同定された。１７−１Ａ細胞のＤＮＡ試料を制限酵素
ＥｃｏＲＩで消化したとき、７．４ｋｂと３．８ｋｂの
２つの再配列フラグメントが、Ｊ３およびＪ４配列を含
むマウス重鎖Ｊ領域（ＪＨ）プローブを用いることによ
り見出された。分離用アガロースゲル電気泳動により単
離した約７ｋｂおよび約４ｋｂのＤＮＡフラグメント
は、それぞれλｇｔ ＷＥＳおよびλｇｔ １１フアー
ジアームと連結させた。これらの２つの部分ライブラリ
ーの組換えプラークはマウスＪＨプローブでスクリーニ
ングした。７．４ｋｂおよび３．８ｋｂのＥｃｏＲＩフ
ラグメントの両方をクローニングした。７．４ｋｂフラ
グメントは制限マツピングおよび１７−１Ａ重鎖ｃＤＮ
Ａをプローブとして使用するサザン分析により、機能的
に再配列されたＶＨ遺伝子を含むことが判明した。
【００１８】Ｖｋ遺伝子はゲノムクローン λｋ４から４
ｋｂのＨｉｎｄ ＩＩＩフラグメント中に単離し、そし
て発現ベクターｐＡＣＹＣＳＶｎｅｏ中のヒトＣｋ配列
に結合させた。Ｋ遺伝子の転写方向はｎｅｏ遺伝子のそ
れと反対である。ＶＨ遺伝子を含む７．４ｋｂのＥｃｏ
ＲＩフラグメントは、発現ベクターｐＳＶ２ｇｐｔ中の
ヒトＣγ３遺伝子に、転写方向がＥｃｏｇｐｔと反対に
なるように結合させた。ｐＡＣＹＣＳＶｎｅｏプラスミ
ドはクロラムフエニコール耐性を与え、またＰＳＶ２ｇ
ｐｔプラスミドはアンピシリン耐性を与えるので、両方
のプラスミドで大腸菌を形質転換して二重の薬剤耐性表
現型を発現する細胞を選択することが可能である。Ｉｇ
遺伝子をミエローマ細胞中に移すために、両プラスミド
をもつ大腸菌はプロトプラストに変換し、そして非産生
性マウスミエローマ細胞株Ｓｐ２／０と融合させた。プ
ロトプラスト融合の後、トランスフエクシヨンされた細
胞はＧ４１８で処理することによりｎｅｏ遺伝子につい
て選択した。重鎖および軽鎖タンパク質合成を調べるた
めに、トランスフエクシヨンされた細胞を３５Ｓ−メチ
オニンで標識し、細胞質抽出物と分泌物の両方をセフア
ロース結合ヤギ抗ヒトＫ抗体で免疫沈降させた。沈殿物
質は非還元条件下でリン酸緩衝液を含むＳＤＳ／ポリア
クリルアミドゲル上で分析した。４×１０６細胞から、
７個の安定した形質転換体が確立され、分析された。こ
れらのクローンのうち２個は重鎖タンパク質と軽鎖タン
パク質の両方を産生し、２個は軽鎖タンパク質のみを産
生し、そして３個は検出可能な量のＩｇタンパク質を産
生しなかつた。重鎖および軽鎖の両タンパク質を産生す
る２つの形質転換体の１つ、クローンＳＧ３／５はＨ２
Ｌ２、Ｈ２ＬおよびＨＬ分子の混合物を産生した。培地
中に分泌された主な成分はテトラマー分子Ｈ２Ｌ２であ
つた。キメラＨ２Ｌ２免疫グロブリンはネズミ１７−１
Ａ抗体と同じ抗原結合性を示した。
ｋｂのＨｉｎｄ ＩＩＩフラグメント中に単離し、そし
て発現ベクターｐＡＣＹＣＳＶｎｅｏ中のヒトＣｋ配列
に結合させた。Ｋ遺伝子の転写方向はｎｅｏ遺伝子のそ
れと反対である。ＶＨ遺伝子を含む７．４ｋｂのＥｃｏ
ＲＩフラグメントは、発現ベクターｐＳＶ２ｇｐｔ中の
ヒトＣγ３遺伝子に、転写方向がＥｃｏｇｐｔと反対に
なるように結合させた。ｐＡＣＹＣＳＶｎｅｏプラスミ
ドはクロラムフエニコール耐性を与え、またＰＳＶ２ｇ
ｐｔプラスミドはアンピシリン耐性を与えるので、両方
のプラスミドで大腸菌を形質転換して二重の薬剤耐性表
現型を発現する細胞を選択することが可能である。Ｉｇ
遺伝子をミエローマ細胞中に移すために、両プラスミド
をもつ大腸菌はプロトプラストに変換し、そして非産生
性マウスミエローマ細胞株Ｓｐ２／０と融合させた。プ
ロトプラスト融合の後、トランスフエクシヨンされた細
胞はＧ４１８で処理することによりｎｅｏ遺伝子につい
て選択した。重鎖および軽鎖タンパク質合成を調べるた
めに、トランスフエクシヨンされた細胞を３５Ｓ−メチ
オニンで標識し、細胞質抽出物と分泌物の両方をセフア
ロース結合ヤギ抗ヒトＫ抗体で免疫沈降させた。沈殿物
質は非還元条件下でリン酸緩衝液を含むＳＤＳ／ポリア
クリルアミドゲル上で分析した。４×１０６細胞から、
７個の安定した形質転換体が確立され、分析された。こ
れらのクローンのうち２個は重鎖タンパク質と軽鎖タン
パク質の両方を産生し、２個は軽鎖タンパク質のみを産
生し、そして３個は検出可能な量のＩｇタンパク質を産
生しなかつた。重鎖および軽鎖の両タンパク質を産生す
る２つの形質転換体の１つ、クローンＳＧ３／５はＨ２
Ｌ２、Ｈ２ＬおよびＨＬ分子の混合物を産生した。培地
中に分泌された主な成分はテトラマー分子Ｈ２Ｌ２であ
つた。キメラＨ２Ｌ２免疫グロブリンはネズミ１７−１
Ａ抗体と同じ抗原結合性を示した。
【００１９】癌−関連抗原に特異的なキメラ齧歯類／ヒ
ト抗体は癌の治療または診断に使用される。治療のため
に、この抗体は多くの異なる方法で使用することができ
る。ある種の抗体は単独で腫瘍細胞に特異的に結合し
て、その細胞を殺すことが可能である。この種の抗体の
可変部をもつキメラ抗体は、腫瘍を治療するために抗腫
瘍量で患者に投与される。例えば、キメラネズミ／ヒト
１７−１Ａ抗体は１７−１Ａ抗原と関連した胃腸の腫瘍
をもつ患者に投与される。
ト抗体は癌の治療または診断に使用される。治療のため
に、この抗体は多くの異なる方法で使用することができ
る。ある種の抗体は単独で腫瘍細胞に特異的に結合し
て、その細胞を殺すことが可能である。この種の抗体の
可変部をもつキメラ抗体は、腫瘍を治療するために抗腫
瘍量で患者に投与される。例えば、キメラネズミ／ヒト
１７−１Ａ抗体は１７−１Ａ抗原と関連した胃腸の腫瘍
をもつ患者に投与される。
【００２０】癌細胞は異成分から成り、その結果単一特
異性キメラ抗体は腫瘍の全細胞を認識することができな
いかもしれない。従つて、異なる抗原特異性のいくつか
のキメラ抗体を組合せて投与することが望ましい。キメ
ラ抗体は他の抗腫瘍剤と共に使用することができる。こ
の目的のために、キメラネズミ／ヒト抗体はある種の治
療薬剤または細胞障害性薬剤に、あるいはこの種のタン
パク質の機能的ドメインに結合される。この場合には、
免疫グロブリンは癌細胞を特異的に標的とする投与媒体
（運搬体）として作用するであろう。このような結合は
治療薬剤を抗体に化学的に結合させることにより達成し
得る。治療薬剤がタンパク質系の物質である場合、その
結合は薬剤コード化ＤＮＡ配列を抗体鎖（好ましくは重
鎖）コード化キメラ遺伝子に結合させることにより達成
でき、その結果抗体鎖および薬剤が単一の連続タンパク
質（薬剤がペプチド結合によつて免疫グロブリンに結合
されたもの）として発現される。この方法では、免疫グ
ロブリン部分と非免疫グロブリン部分を含むキメラ免疫
グロブリンが形成され、その場合非免疫グロブリン部分
はインターフエロンのような所定の治療薬剤、または腫
瘍壊死因子のような所定の細胞障害性薬剤でありうる。
異性キメラ抗体は腫瘍の全細胞を認識することができな
いかもしれない。従つて、異なる抗原特異性のいくつか
のキメラ抗体を組合せて投与することが望ましい。キメ
ラ抗体は他の抗腫瘍剤と共に使用することができる。こ
の目的のために、キメラネズミ／ヒト抗体はある種の治
療薬剤または細胞障害性薬剤に、あるいはこの種のタン
パク質の機能的ドメインに結合される。この場合には、
免疫グロブリンは癌細胞を特異的に標的とする投与媒体
（運搬体）として作用するであろう。このような結合は
治療薬剤を抗体に化学的に結合させることにより達成し
得る。治療薬剤がタンパク質系の物質である場合、その
結合は薬剤コード化ＤＮＡ配列を抗体鎖（好ましくは重
鎖）コード化キメラ遺伝子に結合させることにより達成
でき、その結果抗体鎖および薬剤が単一の連続タンパク
質（薬剤がペプチド結合によつて免疫グロブリンに結合
されたもの）として発現される。この方法では、免疫グ
ロブリン部分と非免疫グロブリン部分を含むキメラ免疫
グロブリンが形成され、その場合非免疫グロブリン部分
はインターフエロンのような所定の治療薬剤、または腫
瘍壊死因子のような所定の細胞障害性薬剤でありうる。
【００２１】キメラ抗体はまたイムノシンチグラフイー
のような ｉｎ ｖｉｖｏ診断法において有用である。
この目的のために、一般に抗体フラグメントが好適であ
る。従つて、キメラ重鎖遺伝子は腫瘍画像形成用のキメ
ラＦａｂ、免疫グロブリン分子またはキメラＦ（ａ
ｂ′）２様分子を作るために、切断された形体でデザイ
ンされる。これらの分子は腫瘍画像形成用の放射線イム
ノシンチグラフイー剤を作るべく、１３１ヨウ素、
１２５ヨウ素、９９ｍテクネチウムまたは１１１インジ
ウムのようなラジオアイソトープを用いて直接または結
合キレート剤を介して標識される。別法として、放射性
金属結合（キレート化）ドメインが部位標識用のキメラ
抗体に遺伝子工学的に導入される。従つて、キメラ抗体
はネズミ可変部、ヒト不変部（好ましくは切断されたも
の）、およびメタロチオネインのような金属結合性タン
パク質から誘導される金属結合ドメインをもつ連続タン
パク質としてデザインされる。
のような ｉｎ ｖｉｖｏ診断法において有用である。
この目的のために、一般に抗体フラグメントが好適であ
る。従つて、キメラ重鎖遺伝子は腫瘍画像形成用のキメ
ラＦａｂ、免疫グロブリン分子またはキメラＦ（ａ
ｂ′）２様分子を作るために、切断された形体でデザイ
ンされる。これらの分子は腫瘍画像形成用の放射線イム
ノシンチグラフイー剤を作るべく、１３１ヨウ素、
１２５ヨウ素、９９ｍテクネチウムまたは１１１インジ
ウムのようなラジオアイソトープを用いて直接または結
合キレート剤を介して標識される。別法として、放射性
金属結合（キレート化）ドメインが部位標識用のキメラ
抗体に遺伝子工学的に導入される。従つて、キメラ抗体
はネズミ可変部、ヒト不変部（好ましくは切断されたも
の）、およびメタロチオネインのような金属結合性タン
パク質から誘導される金属結合ドメインをもつ連続タン
パク質としてデザインされる。
【００２２】本発明はさらに１７−１Ａ誘導可変部およ
びヒト不変部をもつキメラ抗体の製造を示す下記の実施
例により詳しく説明されるであろう。
びヒト不変部をもつキメラ抗体の製造を示す下記の実施
例により詳しく説明されるであろう。
【００２３】
【実 施 例】実施例１．キメラ１７−１Ａ ＩｇＧ３の作製 Ａ．材料と方法 ＣＤＮＡライブラリー造成 細胞質ＲＮＡを１７−１Ａ細胞から抽出し、ポリＡ＋Ｒ
ＮＡ をオリゴｄＴセルロースクロマトグラフイによつ
て調製した。ＡＭＶ逆転写酵素と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩとを用いて、鋳型としてのポ
リＡ＋ＲＮＡによつて、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。二
本鎖ｃＤＮＡをＳＩヌクレアーゼによつて処理し、デオ
キシシチジン残基によつて延長し、Ｐｓｔ Ｉ によつ
て予め切断したｄＧ末端ｐＵＣ８によつてアニーリング
した。ピー・ジエイ・カーチス（Ｐ．Ｊ．Ｃｕｒｔｉ
ｓ）（１９８３年）、ジエイ・バイオル・ケム・（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５３号、４４５９頁。組換え
体プラスミドを大腸菌ＤＨＩに形質転換し、テイ・マニ
アテイス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）等（１９８２年）が
述べている一般方法〔モレキユラークローニング、ラボ
ラトリーマニユアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）〕に
よつて、コロニーを調べた。
ＮＡ をオリゴｄＴセルロースクロマトグラフイによつ
て調製した。ＡＭＶ逆転写酵素と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩとを用いて、鋳型としてのポ
リＡ＋ＲＮＡによつて、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。二
本鎖ｃＤＮＡをＳＩヌクレアーゼによつて処理し、デオ
キシシチジン残基によつて延長し、Ｐｓｔ Ｉ によつ
て予め切断したｄＧ末端ｐＵＣ８によつてアニーリング
した。ピー・ジエイ・カーチス（Ｐ．Ｊ．Ｃｕｒｔｉ
ｓ）（１９８３年）、ジエイ・バイオル・ケム・（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５３号、４４５９頁。組換え
体プラスミドを大腸菌ＤＨＩに形質転換し、テイ・マニ
アテイス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）等（１９８２年）が
述べている一般方法〔モレキユラークローニング、ラボ
ラトリーマニユアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）〕に
よつて、コロニーを調べた。
【００２４】ゲノムライブラリー造成 ゲノムライブラリーをラムダフアージベクターＥＭＢＬ
３Ａ中に造成した。高分子量ＤＮＡを制限エンドヌクレ
アーゼＳａｕ３Ａによつて部分的に消化させ、１０〜４
０％シヨ糖密度勾配法によつてサイズ分画した。１８〜
２３ｋｂのＤＮＡフラグメントにＥＭＢＬ３Ａラムダア
ームを連結し、ホーンとムライ（Ｈｏｈｎ ａｎｄ Ｍ
ｕｒｒａｙ）の方法（１９７７年）〔プロク・ナトル・
アカド・サイ・ユーエスエイ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）７４巻、３２５９頁〕に従
つてパツケージした。ゲノムライブラリーを直径１５０
ｍｍペトリ皿につき組換え体プラーク１０，０００個の
密度で分類した。プラークハイブリツト化は６５℃にお
いて５ＸＳＳＣで１８時間実施した。最終洗浄は６５℃
において１．０Ｘまたは０．５ＸＳＳＣ中で実施した。
３Ａ中に造成した。高分子量ＤＮＡを制限エンドヌクレ
アーゼＳａｕ３Ａによつて部分的に消化させ、１０〜４
０％シヨ糖密度勾配法によつてサイズ分画した。１８〜
２３ｋｂのＤＮＡフラグメントにＥＭＢＬ３Ａラムダア
ームを連結し、ホーンとムライ（Ｈｏｈｎ ａｎｄ Ｍ
ｕｒｒａｙ）の方法（１９７７年）〔プロク・ナトル・
アカド・サイ・ユーエスエイ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）７４巻、３２５９頁〕に従
つてパツケージした。ゲノムライブラリーを直径１５０
ｍｍペトリ皿につき組換え体プラーク１０，０００個の
密度で分類した。プラークハイブリツト化は６５℃にお
いて５ＸＳＳＣで１８時間実施した。最終洗浄は６５℃
において１．０Ｘまたは０．５ＸＳＳＣ中で実施した。
【００２５】部分ゲノムライブラリー造成 高分子量ゲノムＤＮＡを制限ヌクレアーゼによつて完了
するまで消化させ、０．８％寒天ゲル上で分画した。適
当なサイズのＤＮＡフラグメントを単離し、ラムダフア
ージアームと連結した。連結したＤＮＡをパツケージ
し、組換え体プラークを上述のように分類した。
するまで消化させ、０．８％寒天ゲル上で分画した。適
当なサイズのＤＮＡフラグメントを単離し、ラムダフア
ージアームと連結した。連結したＤＮＡをパツケージ
し、組換え体プラークを上述のように分類した。
【００２６】ＤＮＡ分析 ゲノムＤＮＡを制限ヌクレアーゼによつて消化させ、
０．７％寒天ゲルを通しての電気泳動によつて分画し、
ニトロセルロースにスポツトさせた。マニアテイス等の
上述文献参照。ハイブリツド化は３７℃の５×ＳＳＣと
５０％ホルムアルデヒド中において４８時間実施した。
最終洗浄は６５℃の０．５×ＳＳＣにおいて実施した。
０．７％寒天ゲルを通しての電気泳動によつて分画し、
ニトロセルロースにスポツトさせた。マニアテイス等の
上述文献参照。ハイブリツド化は３７℃の５×ＳＳＣと
５０％ホルムアルデヒド中において４８時間実施した。
最終洗浄は６５℃の０．５×ＳＳＣにおいて実施した。
【００２７】ＤＮＡプローブ マウスγ２ａプロープはγ２ａ不変部遺伝子を含む４．
９ｋｂ ＥＣｏＲＩＤＮＡである。マウスＣｋプローブ
はマウスＫＬ鎖不変部配列を含む６ｋｂ Ｂｇ１ ＩＩ
ゲノムＤＮＡである。マウスＨ鎖Ｊ（ＪＨ）プローブは
Ｊ３とＪ４セグメントの両方を含む２ｋｂ Ｂａｍ Ｈ
Ｉ／ＥｃｏＲＩフラグメントである。３２Ｐ標識プロー
ブはウシ胸腺プライマーを用いて調製した。ジエイ・サ
マース（Ｊ．Ｓｕｍｍｅｒｓ）（１９７５年）ジエイ・
バイロル（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）１５巻、９４６頁参照。
遊離ヌクレオチドはＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５ミニカラ
ムを通しての遠心分離によつて除去した。
９ｋｂ ＥＣｏＲＩＤＮＡである。マウスＣｋプローブ
はマウスＫＬ鎖不変部配列を含む６ｋｂ Ｂｇ１ ＩＩ
ゲノムＤＮＡである。マウスＨ鎖Ｊ（ＪＨ）プローブは
Ｊ３とＪ４セグメントの両方を含む２ｋｂ Ｂａｍ Ｈ
Ｉ／ＥｃｏＲＩフラグメントである。３２Ｐ標識プロー
ブはウシ胸腺プライマーを用いて調製した。ジエイ・サ
マース（Ｊ．Ｓｕｍｍｅｒｓ）（１９７５年）ジエイ・
バイロル（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）１５巻、９４６頁参照。
遊離ヌクレオチドはＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５ミニカラ
ムを通しての遠心分離によつて除去した。
【００２８】プロトプラスト融合による遺伝子移動 キメラＬ鎖およびＨ鎖遺伝子を含むプラスミドによつて
融導されたｐｓＶＩ８４ｎｅｏ およびｐｓＶ２ｇｐｔ
の造成を下記に述べる。両プラスミドを含む大腸菌ＨＢ
１０１をアンピシリンとクロラムフエニコールの存在下
で増殖させた。プラスミド複製数を１００μｇ／ｍｌの
スペクチノマイシンによつて増巾した。プロトプラスト
を調製し、オイ（Ｏｉ）等（１９８３年）のプロク・ナ
トル・アカド・サイ・ユーエスエイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８０巻、８２５頁に従
つて、マウス骨髄腫に融合した。１５％ウシ胎仔血清を
補充した、抗生物質Ｇ４１８０．８ｍｇ／ｍｌを含むダ
ルベツコの改良イーグル培地中で形質転換体を選択し
た。上記培地にキサンチン５０μｇ／ｍｌ、ハイポキサ
ンチン４μｇ／ｍｌおよびミコフエノール酸０．８μｇ
／ｍｌを加え、この中にＳＧ３／５細胞ラインを維持し
た。
融導されたｐｓＶＩ８４ｎｅｏ およびｐｓＶ２ｇｐｔ
の造成を下記に述べる。両プラスミドを含む大腸菌ＨＢ
１０１をアンピシリンとクロラムフエニコールの存在下
で増殖させた。プラスミド複製数を１００μｇ／ｍｌの
スペクチノマイシンによつて増巾した。プロトプラスト
を調製し、オイ（Ｏｉ）等（１９８３年）のプロク・ナ
トル・アカド・サイ・ユーエスエイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８０巻、８２５頁に従
つて、マウス骨髄腫に融合した。１５％ウシ胎仔血清を
補充した、抗生物質Ｇ４１８０．８ｍｇ／ｍｌを含むダ
ルベツコの改良イーグル培地中で形質転換体を選択し
た。上記培地にキサンチン５０μｇ／ｍｌ、ハイポキサ
ンチン４μｇ／ｍｌおよびミコフエノール酸０．８μｇ
／ｍｌを加え、この中にＳＧ３／５細胞ラインを維持し
た。
【００２９】生合成的標識と免疫沈降によるＩｇの分析 ３５ Ｓ−メチオニン ２５μＣｉ／ｍｌ を含む、メチ
オニンを含まないＲＰＭＩ１６４０培地中で細胞を３時
間標識した。アフイニテイ精製したヤギ抗ヒトＫＬ鎖抗
体〔サザン バイオテクノロジーアソシエイテツド（Ｓ
ｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏ
ｃｉａｔｅｄ）社、アラバマ州バーミンガム〕とヤギ抗
ヒトＩｇＧＦＣ抗体〔ジヤクソン イムノリサーチ ラ
ボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌｍｍｕｎ−ｏｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社、ペンシル
バニア州、アバンダーレ〕を免疫沈降に用いた。エス・
エル・モリソン（Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）（１９７
９年）ジエイ・イムノル（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）１２３
巻、７９３頁参照。細胞質抗体と分泌抗体の両方を非還
元性条件下においてリン酸緩衝液中の５％ＳＤＳ／ポリ
アクリルアミドゲル上で分析した。エル・マツウチ
（Ｌ．Ｍａｔｓｕｕｃｈｉ）等（１９８１年）バイオケ
ム（Ｂｉｏｃｈｅｍ）２０巻４８２７頁参照。ゲルを３
ｍｍ▲ろ▼紙上で乾燥させる前に、オートラジオグラフ
イエンハンサーのＥＮ３ＨＡＮＣＥ〔ネンプロダクツ
（ＮＥＮ Ｐｒｏ−ｄｕｃｔｓ）、マサチユセツツ州、
ボストン〕によつて処理した。
オニンを含まないＲＰＭＩ１６４０培地中で細胞を３時
間標識した。アフイニテイ精製したヤギ抗ヒトＫＬ鎖抗
体〔サザン バイオテクノロジーアソシエイテツド（Ｓ
ｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏ
ｃｉａｔｅｄ）社、アラバマ州バーミンガム〕とヤギ抗
ヒトＩｇＧＦＣ抗体〔ジヤクソン イムノリサーチ ラ
ボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌｍｍｕｎ−ｏｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社、ペンシル
バニア州、アバンダーレ〕を免疫沈降に用いた。エス・
エル・モリソン（Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）（１９７
９年）ジエイ・イムノル（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）１２３
巻、７９３頁参照。細胞質抗体と分泌抗体の両方を非還
元性条件下においてリン酸緩衝液中の５％ＳＤＳ／ポリ
アクリルアミドゲル上で分析した。エル・マツウチ
（Ｌ．Ｍａｔｓｕｕｃｈｉ）等（１９８１年）バイオケ
ム（Ｂｉｏｃｈｅｍ）２０巻４８２７頁参照。ゲルを３
ｍｍ▲ろ▼紙上で乾燥させる前に、オートラジオグラフ
イエンハンサーのＥＮ３ＨＡＮＣＥ〔ネンプロダクツ
（ＮＥＮ Ｐｒｏ−ｄｕｃｔｓ）、マサチユセツツ州、
ボストン〕によつて処理した。
【００３０】抗体産生の量的表現 組織培養上清を粒子濃度螢光イムノアツセイによつて精
製ＩｇＧからの標準曲線を用いて、ＩｇＧ蛋白質含量に
関して分析した〔エム・イー・ジヨリー（Ｍ．Ｅ．Ｊｏ
ｌｌｅｙ）等、（１９８４年）ジエイ・イムノル・メト
（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ）６７巻、２１頁〕。
ＭＡｂ１７−１Ａの濃度はヤギ抗マウスＦａｂ抗体被覆
ポリスチレンビーズとフルオレセイン結合抗マウスＦａ
ｂ抗体とを用いて測定した。ヒト不変部を有するキメラ
抗体はヤギ抗ヒトＩｇＧＦＣ抗体被覆ポリスチレンビー
ズとフルオレセイン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧＦＣ抗体とを
用いて測定した。この分析は自動機器〔パンデツクス
ラボラトリーズ（Ｐａｎｄｅｘ Ｌａｂｏｒａｔ−ｏｒ
ｉｅｓ）社、イリノイ州マンデライン〕によつて実施し
た。
製ＩｇＧからの標準曲線を用いて、ＩｇＧ蛋白質含量に
関して分析した〔エム・イー・ジヨリー（Ｍ．Ｅ．Ｊｏ
ｌｌｅｙ）等、（１９８４年）ジエイ・イムノル・メト
（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ）６７巻、２１頁〕。
ＭＡｂ１７−１Ａの濃度はヤギ抗マウスＦａｂ抗体被覆
ポリスチレンビーズとフルオレセイン結合抗マウスＦａ
ｂ抗体とを用いて測定した。ヒト不変部を有するキメラ
抗体はヤギ抗ヒトＩｇＧＦＣ抗体被覆ポリスチレンビー
ズとフルオレセイン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧＦＣ抗体とを
用いて測定した。この分析は自動機器〔パンデツクス
ラボラトリーズ（Ｐａｎｄｅｘ Ｌａｂｏｒａｔ−ｏｒ
ｉｅｓ）社、イリノイ州マンデライン〕によつて実施し
た。
【００３１】ＭＡｂ １７−１Ａの放射性ヨウ素化 ＭＡｂ １７−１Ａを蛋白質Ａ−セフアロース・クロマ
トグラフイを用いて腹水液から精製した。結合したＩｇ
ＧをｐＨ３．５のクエン酸塩緩衝液によつて溶出した。
精製したＭＡｂをＩｍＣｉＮａ１２５Ｉを用いた１．４
ｍＭコラミンＴによつて標識した。３分後に、反応は過
剰なアスコルビン酸によつて消光した。遊離ヨウ化物は
予め充填したＰＤ−１０カラム〔フアルマシア（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）〕によつて除去した。比活性は典型的に
１０，０００ＣＰｍ／蛋白質ｎｇであつた。
トグラフイを用いて腹水液から精製した。結合したＩｇ
ＧをｐＨ３．５のクエン酸塩緩衝液によつて溶出した。
精製したＭＡｂをＩｍＣｉＮａ１２５Ｉを用いた１．４
ｍＭコラミンＴによつて標識した。３分後に、反応は過
剰なアスコルビン酸によつて消光した。遊離ヨウ化物は
予め充填したＰＤ−１０カラム〔フアルマシア（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）〕によつて除去した。比活性は典型的に
１０，０００ＣＰｍ／蛋白質ｎｇであつた。
【００３２】結合阻害分析 組織培養上清をデイアフロ（Ｄｉａｆｌｏ）ＹＭ１００
限外▲ろ▼過膜〔アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）、マサチユ
セツツ州ダンバース〕によつて濃縮した。単層の結腸直
腸癌細胞をトリプシン化し、リン酸緩衝液添加生理的食
塩水（ＰＢＳ）中で洗浄した。細胞（５×１０５）を放
射性ヨウ素化１７−１Ａおよび１００μｌの最終量中に
競合抗体を含む培養上清と共にインキユベートした。イ
ンキユベーシヨンは１４０γｐｍの振とう器中で室温に
おいて実施した。細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞結合放射
能をガンマカウンター中で計測した。
限外▲ろ▼過膜〔アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）、マサチユ
セツツ州ダンバース〕によつて濃縮した。単層の結腸直
腸癌細胞をトリプシン化し、リン酸緩衝液添加生理的食
塩水（ＰＢＳ）中で洗浄した。細胞（５×１０５）を放
射性ヨウ素化１７−１Ａおよび１００μｌの最終量中に
競合抗体を含む培養上清と共にインキユベートした。イ
ンキユベーシヨンは１４０γｐｍの振とう器中で室温に
おいて実施した。細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞結合放射
能をガンマカウンター中で計測した。
【００３３】Ｂ 結 果 １７−１ＡのＬ鎖およびＨ鎖ｃＤＮＡの単離と塩基配列
決定 プラスミドベクターｐＵＣ８を用いて、１７−１Ａ細胞
のｃＤＮＡライブラリーを作製した。組換え体コロニー
をマウスＣｋプローブとマウスＣγ２ａ プルーブとを
用いて調べ、Ｌ鎖クローンとＨ鎖クローンをそれぞれ単
離した。全体で７５００コロニーを調べ、その中の約２
５０がＣｋ配列を含み、１５０がＣγ２ａ配列を含ん
だ。これらの陽性コロニーの幾つかから調製したプラス
ミドＤＮＡをＰｓｔ Ｉによつて消化させて、ｃＤＮＡ
挿入体のサイズを比較した。ヌクレオチド塩基配列決定
のために、Ｌ鎖クローンｐＭＫ−９とＨ鎖クローンｐＭ
γ２ａ−１とを選択した。リーダーペプチドを含む５′
部位および可変部のヌクレオチド塩基配列ならびに予想
されるアミノ酸配列をｐＫＭ−９に関しては
決定 プラスミドベクターｐＵＣ８を用いて、１７−１Ａ細胞
のｃＤＮＡライブラリーを作製した。組換え体コロニー
をマウスＣｋプローブとマウスＣγ２ａ プルーブとを
用いて調べ、Ｌ鎖クローンとＨ鎖クローンをそれぞれ単
離した。全体で７５００コロニーを調べ、その中の約２
５０がＣｋ配列を含み、１５０がＣγ２ａ配列を含ん
だ。これらの陽性コロニーの幾つかから調製したプラス
ミドＤＮＡをＰｓｔ Ｉによつて消化させて、ｃＤＮＡ
挿入体のサイズを比較した。ヌクレオチド塩基配列決定
のために、Ｌ鎖クローンｐＭＫ−９とＨ鎖クローンｐＭ
γ２ａ−１とを選択した。リーダーペプチドを含む５′
部位および可変部のヌクレオチド塩基配列ならびに予想
されるアミノ酸配列をｐＫＭ−９に関しては
【図１】１Ａ図にｐＭγ２ａ−１に関しては
【図２】１Ｂ図に示す。（アミノ酸残基に番号を付け、
負数はリーダーペプチド中のアミノ酸を意味する）。可
変部特異性（ＶＬ）プローブをｐＭＫ−９から、Ｌ鎖遺
伝子の最初の３２０ヌクレオチドを含むＢａｍ ＨＩ／
Ｐｖｕ Ｉフラグメントとして得る（１Ａ図）。Ｈ鎖可
変部プルーブは２個のＰｓｔＩフラグメント、すなわち
ヌクレオチド５２〜２８０および２８１〜４１２にそれ
ぞれ対応する２２８ｂｐ ＶＨＩおよび１３２ｂｐ Ｖ
Ｈ２プローブを含有した（
負数はリーダーペプチド中のアミノ酸を意味する）。可
変部特異性（ＶＬ）プローブをｐＭＫ−９から、Ｌ鎖遺
伝子の最初の３２０ヌクレオチドを含むＢａｍ ＨＩ／
Ｐｖｕ Ｉフラグメントとして得る（１Ａ図）。Ｈ鎖可
変部プルーブは２個のＰｓｔＩフラグメント、すなわち
ヌクレオチド５２〜２８０および２８１〜４１２にそれ
ぞれ対応する２２８ｂｐ ＶＨＩおよび１３２ｂｐ Ｖ
Ｈ２プローブを含有した（
【図２】１Ｂ図）。これらの可変部プローブを次の実験
に用いて、機能的に再編成した遺伝子を含むゲノムＤＮ
Ａフラグメントを特性化した。
に用いて、機能的に再編成した遺伝子を含むゲノムＤＮ
Ａフラグメントを特性化した。
【００３４】１７−１Ａの機能的に再編成したＬ鎖およ
びＨ鎖遺伝子を含むゲノムＤＮＡフラグメントのクロー
ニング １７−１Ａ細胞のゲノムＤＮＡライブラリーを調製し
た。約２００，０００ラムダ・フアージをマウスＣｋプ
ローブによつて検査した。３個の陽性クローンを得た。
クローンの１つであるλｋ４は制限酵素マツピングとｃ
ＤＮＡクローン、ｐＫＭ−９からのＶＬプローブを用い
るサザン分析法とによつて、可変部配列を含むことが判
定した。５′フランキング部の１．５Ｋｂおよびリーダ
ーペプチドとＶ遺伝子とをコード化する配列を含む４．
２ｋｂ Ｈｉｎｄ １１１ゲノムＤＮＡフラグメントを
ｐｕＣ１８にサブクローン化し、ｐＶｋ４．２Ｈと名づ
けた。このサブクローンは次のマウス／ヒトキメラＬ鎖
遺伝子造成に用いた。１７−１Ａゲノムライブラリーを
マウスＣγ２ａプローブによつて調べた場合に、２個の
陽性クローンが得られたが、これらのいずれもｃＤＮＡ
クローンｐＭγ２ａ−１ のＨ鎖可変（ＶＨ）遺伝子を
含んでいなかつた。ＶＨ遺伝子のクローン化にはこれに
代るアプローチを用いた。Ｉｇ遺伝子表現に必要な遺伝
子再編成中に、Ｖ遺伝子は常に適当なＪセグメントを伴
う。そのため、ＤＮＡプローブＪＨを用いて再編成ＶＨ
遺伝子を検出することができる。
びＨ鎖遺伝子を含むゲノムＤＮＡフラグメントのクロー
ニング １７−１Ａ細胞のゲノムＤＮＡライブラリーを調製し
た。約２００，０００ラムダ・フアージをマウスＣｋプ
ローブによつて検査した。３個の陽性クローンを得た。
クローンの１つであるλｋ４は制限酵素マツピングとｃ
ＤＮＡクローン、ｐＫＭ−９からのＶＬプローブを用い
るサザン分析法とによつて、可変部配列を含むことが判
定した。５′フランキング部の１．５Ｋｂおよびリーダ
ーペプチドとＶ遺伝子とをコード化する配列を含む４．
２ｋｂ Ｈｉｎｄ １１１ゲノムＤＮＡフラグメントを
ｐｕＣ１８にサブクローン化し、ｐＶｋ４．２Ｈと名づ
けた。このサブクローンは次のマウス／ヒトキメラＬ鎖
遺伝子造成に用いた。１７−１Ａゲノムライブラリーを
マウスＣγ２ａプローブによつて調べた場合に、２個の
陽性クローンが得られたが、これらのいずれもｃＤＮＡ
クローンｐＭγ２ａ−１ のＨ鎖可変（ＶＨ）遺伝子を
含んでいなかつた。ＶＨ遺伝子のクローン化にはこれに
代るアプローチを用いた。Ｉｇ遺伝子表現に必要な遺伝
子再編成中に、Ｖ遺伝子は常に適当なＪセグメントを伴
う。そのため、ＤＮＡプローブＪＨを用いて再編成ＶＨ
遺伝子を検出することができる。
【図３】はＪＨ配列を含む再編成フラグメントのサザン
分析を示す。（ゲノムＤＮＡ１０μｇをＥｃｏＲ１ に
よつて消化させ、０．７％寒天上で分画し、ニトロセル
ロースに吸収させ、フイルターをマウスＨ鎖ＪＨプロー
ブによつてハイプリツド化する。レーン１、マウス肝臓
ＤＮＡ；レーン２、Ｐ３、マウスプラズマ細胞腫細胞ラ
イン；レーン３、１７−１Ａ、融合パートナーとしてＰ
３を用いて誘導したハイブリドーマ細胞ライン。矢印ヘ
ツドは１７−１Ａの機能的ＶＨ遺伝子を含む再編成フラ
グメントを示す。黒丸印はＨ鎖遺伝子座の付加的な再編
成を示す。）
分析を示す。（ゲノムＤＮＡ１０μｇをＥｃｏＲ１ に
よつて消化させ、０．７％寒天上で分画し、ニトロセル
ロースに吸収させ、フイルターをマウスＨ鎖ＪＨプロー
ブによつてハイプリツド化する。レーン１、マウス肝臓
ＤＮＡ；レーン２、Ｐ３、マウスプラズマ細胞腫細胞ラ
イン；レーン３、１７−１Ａ、融合パートナーとしてＰ
３を用いて誘導したハイブリドーマ細胞ライン。矢印ヘ
ツドは１７−１Ａの機能的ＶＨ遺伝子を含む再編成フラ
グメントを示す。黒丸印はＨ鎖遺伝子座の付加的な再編
成を示す。）
【００３５】１７−１Ａ細胞のＤＮＡは融合パートナー
Ｐ３の特徴的なバンドの他に、７．４ｋｂと３．８ｋｂ
に２個の再編成ＥｃｏＲ１ フラグメントを示した。Ｐ
３細胞は６ｋｂに共に移動した、２個の再編成ＶＨ遺伝
子を有した。１７−１Ａの２バンドの中の１つは機能的
再編成を示したが、他のバンドはＨ鎖領域における異常
型の遺伝子再編成の産物である。マウスＪＨプローブを
用いて、両遺伝子を適当なサイズのエンリツチＤＮＡフ
ラグメントによつて造成したフアージゲノムライブラリ
ーから両遺伝子をクローン化した。クローンλＶＨ７．
４ＥをλｇｔＷＥＳ ライブラリーから単離すると、図
３の矢印ヘツドで示すように、ＥｃｏＲ１ インサート
が７．４ｋｂ再編成フラグメントとともに移動すること
が判明した。クローンλＶＨ３．８Ｅをλｇｔ１１ か
ら単離すると、そのＥｃｏＲ１インサートは図３の黒丸
印が示すように、３．８ｋｂバンドとともに移動した。
Ｐ３の特徴的なバンドの他に、７．４ｋｂと３．８ｋｂ
に２個の再編成ＥｃｏＲ１ フラグメントを示した。Ｐ
３細胞は６ｋｂに共に移動した、２個の再編成ＶＨ遺伝
子を有した。１７−１Ａの２バンドの中の１つは機能的
再編成を示したが、他のバンドはＨ鎖領域における異常
型の遺伝子再編成の産物である。マウスＪＨプローブを
用いて、両遺伝子を適当なサイズのエンリツチＤＮＡフ
ラグメントによつて造成したフアージゲノムライブラリ
ーから両遺伝子をクローン化した。クローンλＶＨ７．
４ＥをλｇｔＷＥＳ ライブラリーから単離すると、図
３の矢印ヘツドで示すように、ＥｃｏＲ１ インサート
が７．４ｋｂ再編成フラグメントとともに移動すること
が判明した。クローンλＶＨ３．８Ｅをλｇｔ１１ か
ら単離すると、そのＥｃｏＲ１インサートは図３の黒丸
印が示すように、３．８ｋｂバンドとともに移動した。
【００３６】機能的Ｈ鎖遺伝子のゲノムカウンターパー
トを確認するために、λＶＨ７．４ＥとλＶＨ３．８Ｅ
の両方をＰＳｔＩによつて消化させ、ｃＤＮＡクロー
ン、ｐＭγ２ａ−１ から誘導したＶＨ１とＶＨ２の混
合プローブによつてハイブリツド化した。λＶＨ７．４
Ｅは３００ｂｐと１３０ｂｐに２個のＰｓｔ１フラグメ
ントを含有した。ＶＨＩプローブはリーダーペプチド内
のイントロン／エクソン境界のすぐ上方にあるアミノ酸
残基−５をコード化する配列を含むので、ゲノムクロー
ンの長いＰｓｔＩフラグメント（２００ｂｐ）とｃＤＮ
ＡクローンのＰｓｔＩ フラグメント（２２８ｂｐ）と
の間の差は、リーダーペプチドと可変部遺伝子との間の
イントロンサイズが７０ｂｐであることを示唆した。ク
ローンλＶＨ３．８Ｅは種々の長さのＰＳｔ１フラグメ
ントを含み、ＶＨ１およびＶＨ２プローブによつて交差
ハイブリツド化しなかつた。λＶＨ７．４ＥがｃＤＮＡ
クローンｐＭγ２ａ−１のゲノムカウンターパートであ
ることをさらに立証するために、ヌクレオチド３５２〜
３７５に対応する２４・ｍｅｒ オリゴヌクレオチドプ
ローブ（
トを確認するために、λＶＨ７．４ＥとλＶＨ３．８Ｅ
の両方をＰＳｔＩによつて消化させ、ｃＤＮＡクロー
ン、ｐＭγ２ａ−１ から誘導したＶＨ１とＶＨ２の混
合プローブによつてハイブリツド化した。λＶＨ７．４
Ｅは３００ｂｐと１３０ｂｐに２個のＰｓｔ１フラグメ
ントを含有した。ＶＨＩプローブはリーダーペプチド内
のイントロン／エクソン境界のすぐ上方にあるアミノ酸
残基−５をコード化する配列を含むので、ゲノムクロー
ンの長いＰｓｔＩフラグメント（２００ｂｐ）とｃＤＮ
ＡクローンのＰｓｔＩ フラグメント（２２８ｂｐ）と
の間の差は、リーダーペプチドと可変部遺伝子との間の
イントロンサイズが７０ｂｐであることを示唆した。ク
ローンλＶＨ３．８Ｅは種々の長さのＰＳｔ１フラグメ
ントを含み、ＶＨ１およびＶＨ２プローブによつて交差
ハイブリツド化しなかつた。λＶＨ７．４ＥがｃＤＮＡ
クローンｐＭγ２ａ−１のゲノムカウンターパートであ
ることをさらに立証するために、ヌクレオチド３５２〜
３７５に対応する２４・ｍｅｒ オリゴヌクレオチドプ
ローブ（
【図２】１Ｂ図）を合成し、これが特異的にハイブリツ
ド化してλＶＨ７．４Ｅの１３０ｂｐ ＰｓｔＩフラグ
メントになることを発見した（データ示さず）。このオ
リゴマーはＣＤＲ３部位をコード化した配列を含み、こ
のＶ遺伝子に特徴的である。マウス／ヒトキメラＨ鎖遺
伝子の造成にλＶＨ７．４Ｅを用いた。
ド化してλＶＨ７．４Ｅの１３０ｂｐ ＰｓｔＩフラグ
メントになることを発見した（データ示さず）。このオ
リゴマーはＣＤＲ３部位をコード化した配列を含み、こ
のＶ遺伝子に特徴的である。マウス／ヒトキメラＨ鎖遺
伝子の造成にλＶＨ７．４Ｅを用いた。
【００３７】ベクターと発現系 １７−１Ａ細胞からクローン化したＬ鎖およびＨ鎖Ｖ遺
伝子を発現ベクターｐＳＶ １８４Ｈｎｅｏ〔エイ・シ
ー・ワイ・チヤング（Ａ．Ｃ．Ｙ．Ｃｈａｎｇ）とエス
・エヌ・コーン（Ｓ．Ｎ．Ｃｏｈｎ）によるジエイ・バ
クテリオル・（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）（１９７
８） １４３巻、１１４１頁〕およびｐＳＶ２Ｈｇｐｔ
〔アール・シー．ムリガン（Ｒ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａ
ｎ）とピー．ベルグ（Ｐ．Ｂｅｒｇ）によるプロク・ナ
トル・アカド．サイ・ユーエスエイ．（１９８１）７８
巻、２０７２頁〕のヒトＫおよびγ３不変部遺伝子にそ
れぞれ結合させた。ｐＳＶ１８４ＨｎｅｏのＢａｍＨＩ
とＨｉｎｄ １１１にクローン化したダンシル特異性Ｌ
鎖遺伝子とヒト不変部Ｋ遺伝子を有したｐＳＶ１８４△
ＨｎｅｏＰＮＳＶＬ−ｈＣｋピラスミドを用いた。好ま
しいキメラ遺伝子を造成するために、ダンシルＶＬ遺伝
子を含有するｐＳＶ １８４△Ｈｎｅｏ ＤＮＳＶＬ−
ｈＣｋのＨｉｎｄ１１１フラグメントをクローンｐＶｋ
４．２Ｈから誘導した１７−１Ａの機能的に再編成した
ゲノムＬ鎖遺伝子を含む４．２ｋｂ Ｈｉｎｄ１１１フ
ラグメントによつて置換した。Ｈ鎖ベクターに関して
は、ダンシル特異性ＶＨ遺伝子を含むｐＳＶ２△Ｈｇｐ
ｔ ＤＮＳＶＨ−ｈＣγ３プラスミドのＥｃｏＲ１ フ
ラグメントを、ゲノムクローンλＶＨ７．４Ｅから誘導
した機能的に再編成した１７−１Ａ Ｈ鎖遺伝子を含む
７．４ｋｂ ＥｃｏＲ１フラグメントによつて置換し
た。生成したプラスミドをｐＳＶ２△Ｈｇｐｔ１７１Ａ
ＶＨ−ｈＣγ３と名づける。ｐｓＶ１８４△Ｈｎｅｏ１
７−１ＡＶｋ−ｈＣγ３の構造を
伝子を発現ベクターｐＳＶ １８４Ｈｎｅｏ〔エイ・シ
ー・ワイ・チヤング（Ａ．Ｃ．Ｙ．Ｃｈａｎｇ）とエス
・エヌ・コーン（Ｓ．Ｎ．Ｃｏｈｎ）によるジエイ・バ
クテリオル・（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）（１９７
８） １４３巻、１１４１頁〕およびｐＳＶ２Ｈｇｐｔ
〔アール・シー．ムリガン（Ｒ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａ
ｎ）とピー．ベルグ（Ｐ．Ｂｅｒｇ）によるプロク・ナ
トル・アカド．サイ・ユーエスエイ．（１９８１）７８
巻、２０７２頁〕のヒトＫおよびγ３不変部遺伝子にそ
れぞれ結合させた。ｐＳＶ１８４ＨｎｅｏのＢａｍＨＩ
とＨｉｎｄ １１１にクローン化したダンシル特異性Ｌ
鎖遺伝子とヒト不変部Ｋ遺伝子を有したｐＳＶ１８４△
ＨｎｅｏＰＮＳＶＬ−ｈＣｋピラスミドを用いた。好ま
しいキメラ遺伝子を造成するために、ダンシルＶＬ遺伝
子を含有するｐＳＶ １８４△Ｈｎｅｏ ＤＮＳＶＬ−
ｈＣｋのＨｉｎｄ１１１フラグメントをクローンｐＶｋ
４．２Ｈから誘導した１７−１Ａの機能的に再編成した
ゲノムＬ鎖遺伝子を含む４．２ｋｂ Ｈｉｎｄ１１１フ
ラグメントによつて置換した。Ｈ鎖ベクターに関して
は、ダンシル特異性ＶＨ遺伝子を含むｐＳＶ２△Ｈｇｐ
ｔ ＤＮＳＶＨ−ｈＣγ３プラスミドのＥｃｏＲ１ フ
ラグメントを、ゲノムクローンλＶＨ７．４Ｅから誘導
した機能的に再編成した１７−１Ａ Ｈ鎖遺伝子を含む
７．４ｋｂ ＥｃｏＲ１フラグメントによつて置換し
た。生成したプラスミドをｐＳＶ２△Ｈｇｐｔ１７１Ａ
ＶＨ−ｈＣγ３と名づける。ｐｓＶ１８４△Ｈｎｅｏ１
７−１ＡＶｋ−ｈＣγ３の構造を
【図４】４Ａに示し、ｐＳＶ２△Ｈｇｐｔ１７−１ＡＶ
Ｈ−ｈＣγ３ の構造は
Ｈ−ｈＣγ３ の構造は
【図４】４Ｂに示す。（免疫グロブリンＤＮＡは太線で
表し、エクソンは黒い方形によつて表す。ベクター配列
は細線で示す。ｎｅｏおよびｇｐｔ遺伝子の転写方向は
図示する通りである。Ｌ，リーダーエクソン；Ｖ，ＶＪ
またはＶＤＪエクソン；Ｃ，不変部エクソン；Ｈ，ヒン
ジエクソン；Ｉ，２および３，Ｈ鎖遺伝子の他のドメイ
ンをコード化するエクソン。制限エンドヌクレアーゼの
略写：Ｅ，ＥｃｏＲ１；Ｂ，ＢａｍＨＩ ；Ｈ，Ｈｉｎ
ｄ１１１ ） 図４に示すＬ鎖およびＨ鎖ベクターを用いてマウス骨髄
腫細胞にトランスフエクトした。ｐＡＣＹＣ１８４ プ
ラスミドはクロラムフエニコール耐性を与え、ｐＢＲプ
ラスミドはアンピシリン耐性を与える。従つて、大腸菌
をＬ鎖およびＨ鎖の両プラスミドによつて形質転換し、
持続的耐薬性表現型を表す細胞を選択することが可能で
ある。キメラ遺伝子をマウム骨髄腫細胞にトランスフエ
クトするために、両プラスミドを有する大腸菌をプロト
プラストに変え、非生産的マウス骨髄腫細胞ライン、Ｓ
ｐ２／０に融合した。プロトプラスト融合後に、トラン
スフエクトされた細胞を最初にＧ４１８存在下でｎｅｏ
遺伝子活性に関してのみ選択した。安定な形質転換細胞
ラインを次に、Ｇ４１８とミコフエノール酸の両方を含
む培地中に導入した。
表し、エクソンは黒い方形によつて表す。ベクター配列
は細線で示す。ｎｅｏおよびｇｐｔ遺伝子の転写方向は
図示する通りである。Ｌ，リーダーエクソン；Ｖ，ＶＪ
またはＶＤＪエクソン；Ｃ，不変部エクソン；Ｈ，ヒン
ジエクソン；Ｉ，２および３，Ｈ鎖遺伝子の他のドメイ
ンをコード化するエクソン。制限エンドヌクレアーゼの
略写：Ｅ，ＥｃｏＲ１；Ｂ，ＢａｍＨＩ ；Ｈ，Ｈｉｎ
ｄ１１１ ） 図４に示すＬ鎖およびＨ鎖ベクターを用いてマウス骨髄
腫細胞にトランスフエクトした。ｐＡＣＹＣ１８４ プ
ラスミドはクロラムフエニコール耐性を与え、ｐＢＲプ
ラスミドはアンピシリン耐性を与える。従つて、大腸菌
をＬ鎖およびＨ鎖の両プラスミドによつて形質転換し、
持続的耐薬性表現型を表す細胞を選択することが可能で
ある。キメラ遺伝子をマウム骨髄腫細胞にトランスフエ
クトするために、両プラスミドを有する大腸菌をプロト
プラストに変え、非生産的マウス骨髄腫細胞ライン、Ｓ
ｐ２／０に融合した。プロトプラスト融合後に、トラン
スフエクトされた細胞を最初にＧ４１８存在下でｎｅｏ
遺伝子活性に関してのみ選択した。安定な形質転換細胞
ラインを次に、Ｇ４１８とミコフエノール酸の両方を含
む培地中に導入した。
【００３８】キメラ抗体産生の分析 Ｈ鎖およびＬ鎖蛋白質合成を調べるために、トランスフ
エクトされた細胞を３５Ｓ−メチオニンによつて３時間
標識し、その後に細胞質抽出物と分泌物の両方をセフア
ロース結合ヤギ抗ヒトｋ抗体によつて免疫沈降させた。
沈降物を非還元性条件下でリン酸緩衝液を含む５％ＳＤ
Ｓ／ポリアクリルアミドゲル上で分析した〔エル・マツ
ウチ等（１９８１年）、バイオケム２０巻、４８２７
頁〕４×１０６細胞から、７個の安定な形質転換体が確
認され、分析された。これらのクローンの中の２個はＨ
鎖およびＬ鎖の両蛋白質を産生し、２個はＬ鎖蛋白質の
みを産生し、３個は検出可能な量の免疫グロブリン蛋白
質を産生しなかつた。図５はＨ鎖とＬ鎖の両蛋白質を産
生するＳＧ３／５細胞ラインの生合成的標識実験の結果
を示す。（Ｃ，細胞質；Ｓ，分泌．テトラマーＨ２Ｌ２
蛋白質とＬ鎖（Ｌ）蛋白質の位置を示唆する。）細胞抽
出物中では、Ｈ鎖とＬ鎖分子の混合物が検出された。し
かし、培養培地中に分泌された主要成分はテトラマー分
子、Ｈ２Ｌ２であつた。免疫沈降にセフアロース結合抗
ヒトＩｇＧＦＣ抗体を用いた場合にも、同じような結果
が得られた。Ｇ４１８とミコフエノール酸の両方に対し
て耐性を示すＳＧ３／７細胞はＬ鎖蛋白質のみを産生し
て分泌した。
エクトされた細胞を３５Ｓ−メチオニンによつて３時間
標識し、その後に細胞質抽出物と分泌物の両方をセフア
ロース結合ヤギ抗ヒトｋ抗体によつて免疫沈降させた。
沈降物を非還元性条件下でリン酸緩衝液を含む５％ＳＤ
Ｓ／ポリアクリルアミドゲル上で分析した〔エル・マツ
ウチ等（１９８１年）、バイオケム２０巻、４８２７
頁〕４×１０６細胞から、７個の安定な形質転換体が確
認され、分析された。これらのクローンの中の２個はＨ
鎖およびＬ鎖の両蛋白質を産生し、２個はＬ鎖蛋白質の
みを産生し、３個は検出可能な量の免疫グロブリン蛋白
質を産生しなかつた。図５はＨ鎖とＬ鎖の両蛋白質を産
生するＳＧ３／５細胞ラインの生合成的標識実験の結果
を示す。（Ｃ，細胞質；Ｓ，分泌．テトラマーＨ２Ｌ２
蛋白質とＬ鎖（Ｌ）蛋白質の位置を示唆する。）細胞抽
出物中では、Ｈ鎖とＬ鎖分子の混合物が検出された。し
かし、培養培地中に分泌された主要成分はテトラマー分
子、Ｈ２Ｌ２であつた。免疫沈降にセフアロース結合抗
ヒトＩｇＧＦＣ抗体を用いた場合にも、同じような結果
が得られた。Ｇ４１８とミコフエノール酸の両方に対し
て耐性を示すＳＧ３／７細胞はＬ鎖蛋白質のみを産生し
て分泌した。
【００３９】キメラ抗体の分析 ＳＧ３／５細胞の抗体分泌レベルは２０μｇ／ｍｌであ
ることが、粒子濃度螢光イムノアツセイによつて確認さ
れた。培養上清を精製しないで、キメラＭＡｂＳＧ３／
５源として用いた。結合阻害分析を用いて、キメラＭＡ
ｂＳＧ３／５がＭＡｂ１７−１Ａと同じ、ＳＷ１１１６
結腸直腸癌細胞の表面抗原に結合することを実証した。
図６に示すように、放射性ヨウ素化１７−１ＡとＳＧ３
／５との結合曲線はスーパーインポーズ可能であつた。
このことは、ＭＡｂ１７−１ＡとＳＧ３／５の異なる不
変部がこれら２抗体の抗原結合性に殆んど影響を与えな
いことを示している。
ることが、粒子濃度螢光イムノアツセイによつて確認さ
れた。培養上清を精製しないで、キメラＭＡｂＳＧ３／
５源として用いた。結合阻害分析を用いて、キメラＭＡ
ｂＳＧ３／５がＭＡｂ１７−１Ａと同じ、ＳＷ１１１６
結腸直腸癌細胞の表面抗原に結合することを実証した。
図６に示すように、放射性ヨウ素化１７−１ＡとＳＧ３
／５との結合曲線はスーパーインポーズ可能であつた。
このことは、ＭＡｂ１７−１ＡとＳＧ３／５の異なる不
変部がこれら２抗体の抗原結合性に殆んど影響を与えな
いことを示している。
【００４０】実施例２． キメラＩｇＧ１，２および４
の作製 マウスＭＡｂ１７−１ＡからのＨ鎖可変部をコード化す
るＤＮＡセグメントをヒトγ１，γ２およびγ４不変部
に結合させた。生成するキメラＨ鎖遺伝子をキメラＬ鎖
遺伝子（図４Ｂ）とともにＳＰ２／０細胞中にトランス
フエクトして、（γ１，ｋ）、（γ２，ｋ）および（γ
４，ｋ）抗体を分泌する安定な細胞ラインを得た。これ
らのキメラ抗体の全てはネズミＭＡｂ１７−１Ａと同じ
腫瘍抗原・結合特異性を有することが判明した。
の作製 マウスＭＡｂ１７−１ＡからのＨ鎖可変部をコード化す
るＤＮＡセグメントをヒトγ１，γ２およびγ４不変部
に結合させた。生成するキメラＨ鎖遺伝子をキメラＬ鎖
遺伝子（図４Ｂ）とともにＳＰ２／０細胞中にトランス
フエクトして、（γ１，ｋ）、（γ２，ｋ）および（γ
４，ｋ）抗体を分泌する安定な細胞ラインを得た。これ
らのキメラ抗体の全てはネズミＭＡｂ１７−１Ａと同じ
腫瘍抗原・結合特異性を有することが判明した。
【００４１】実施例３． キメラ１７−１ＡＩｇＭの産
生 キメラμ造成（ｐＳＶ２△Ｈｇｐｔ１７−１Ａ−ＶＨ−
ｈＣμ）を図７に示す。この遺伝子造成は、１７−１Ａ
キメラＫＬ鎖遺伝子造成（図４Ａ）とともに、非生産的
マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞中にトランスフエクトし
た。キメラＩｇ（μ，ｋ）抗体を産生する安定な細胞ラ
インが樹立された。分泌された抗体を抗ヒトＩｇＭアフ
イニテイカラムで精製した。精製ＩｇＭはヒトベンタマ
ーＩｇＭ対照と同じようなＨＰＬＣプロフイルを有し、
１ピーク下に９９％の物質が含まれた。この精製キメラ
ＩｇＭを用いて、結合特異性と補体依存性細胞毒性とを
調べた。
生 キメラμ造成（ｐＳＶ２△Ｈｇｐｔ１７−１Ａ−ＶＨ−
ｈＣμ）を図７に示す。この遺伝子造成は、１７−１Ａ
キメラＫＬ鎖遺伝子造成（図４Ａ）とともに、非生産的
マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞中にトランスフエクトし
た。キメラＩｇ（μ，ｋ）抗体を産生する安定な細胞ラ
インが樹立された。分泌された抗体を抗ヒトＩｇＭアフ
イニテイカラムで精製した。精製ＩｇＭはヒトベンタマ
ーＩｇＭ対照と同じようなＨＰＬＣプロフイルを有し、
１ピーク下に９９％の物質が含まれた。この精製キメラ
ＩｇＭを用いて、結合特異性と補体依存性細胞毒性とを
調べた。
【００４２】キメラ１７−１Ａ ＩｇＧ１とＩｇＭによ
る、ＨＴ−２９細胞ラインへの１２５Ｉ １７−１Ａ結
合の競合的阻害 １２５ Ｉ標識生１７−１Ａを種々な濃度の競合的非放射
性キメラ１７−１ＡＩｇＧ１およびＩｇＭの存在下また
は不在下の４℃において、付着ＨＴ−２９結腸癌細胞と
ともに２時間インキユベートした。細胞関連性放射能を
測足した。各競合免疫グロブリン製剤の阻害曲線をプロ
ツトし、５０％阻害（Ｉ５０）を生ずる濃度を測定し
た。
る、ＨＴ−２９細胞ラインへの１２５Ｉ １７−１Ａ結
合の競合的阻害 １２５ Ｉ標識生１７−１Ａを種々な濃度の競合的非放射
性キメラ１７−１ＡＩｇＧ１およびＩｇＭの存在下また
は不在下の４℃において、付着ＨＴ−２９結腸癌細胞と
ともに２時間インキユベートした。細胞関連性放射能を
測足した。各競合免疫グロブリン製剤の阻害曲線をプロ
ツトし、５０％阻害（Ｉ５０）を生ずる濃度を測定し
た。
【００４３】キメラ１７−１Ａ ＩｇＧ１とＩｇＭ と
によつて仲介される腫瘍細胞ラインと正常細胞ラインの
補体依存性細胞毒性 ウサギ補体の連続希釈物とともにインキユベートした抗
体板覆ターゲツト細胞の４５分間放射性標識放出分析に
よつて、補体依存性細胞毒性を評価した。分析に用いた
ターゲツト細胞はヒト結腸直腸癌ライン、ＳＷ１１１
６，ＨＴ−２９およびＳＷ９４８；ヒト胸部癌ライン、
ＢＴ−２０およびＺＲ７５−１；ヒト卵巣癌、ＯＶＧＡ
Ｒ ３；ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）；ヒト胎児腸（ＨＥ
Ｉ）であつた。
によつて仲介される腫瘍細胞ラインと正常細胞ラインの
補体依存性細胞毒性 ウサギ補体の連続希釈物とともにインキユベートした抗
体板覆ターゲツト細胞の４５分間放射性標識放出分析に
よつて、補体依存性細胞毒性を評価した。分析に用いた
ターゲツト細胞はヒト結腸直腸癌ライン、ＳＷ１１１
６，ＨＴ−２９およびＳＷ９４８；ヒト胸部癌ライン、
ＢＴ−２０およびＺＲ７５−１；ヒト卵巣癌、ＯＶＧＡ
Ｒ ３；ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）；ヒト胎児腸（ＨＥ
Ｉ）であつた。
【００４４】
【００４５】実施例４ キメラ１７−１Ａ 抗体の抗腫
瘍活性を実証するインビトロおよびインビボ試験 Ａ．インビトロ試験 単離したＧ１Ｋ１７−ＩＡキメラ遺伝子産物を（１）抗
体依存性細胞仲介細胞毒性分析（ＡＤＣＣ）および
（２）ＨＴ−２９細胞（１７−１Ａ抗原を表す結腸癌細
胞ライン）と部分的に精製した１７−１Ａ抗原とを用い
る結合分析において生物学的に試験した。これらの研究
方法は、デイ・アール・シヨウ（Ｄ．Ｒ．Ｓｈａｗ）等
のジエイ．イムノル．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．） １９
８７年６月号；ピー・シー・レヴイ（Ｐ．Ｃ．Ｌｅｖ
ｙ）等のジエイ・イムノル・１２３（２），５９４頁
（１９７９）；およびエイ・エツチ・ロス（Ａ．Ｈ．Ｒ
ｏｓｓ）等のバイオチム・バイオフイズ：レス・コム
ン．（Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃ
ｏｍｍｕｎ．）１３５（１）：２９７頁（１９８６年）
に詳細に述べられている。ＨＴ−２９細胞におけるＡＤ
ＣＣと競合的結合試験では、ＧＬＫ１７−１Ａキメラを
天然型ネズミ１７−１Ａ ＩｇＧと下記に示す付加的な
３個のキメライソタイプとともにテストした；ウサギ抗
ＣＥＭ＊をポリクローナル対照として用いた。部分的に
精製した１７−１Ａ抗原を用いる競合的結合試験では、
ＧＩＫ１７−１Ａキメラを天然型ネズミ１７−１Ａ Ｉ
ｇＧと比較した。単球およびリンパ球ＡＤＣＣ分析のデ
ータは、４人の異なる成人ドナーからの単球およびリン
パ球を用いた４種類の実験から得た。自然放出平均値±
ＳＤは全ターゲツト細胞５１ＣＲ（Ｎ＝２８）の１８．
７±２．８％であつた。エフエクメー対ターゲツト
（Ｅ：Ｔ）比２５：１，１０：１および３：１を用い
て、単球ＡＤＣＣ分析を実施した。特定のＥ：Ｔ比にお
ける各試験材料の平均溶解％（±ＳＤ）を下記に示す。
瘍活性を実証するインビトロおよびインビボ試験 Ａ．インビトロ試験 単離したＧ１Ｋ１７−ＩＡキメラ遺伝子産物を（１）抗
体依存性細胞仲介細胞毒性分析（ＡＤＣＣ）および
（２）ＨＴ−２９細胞（１７−１Ａ抗原を表す結腸癌細
胞ライン）と部分的に精製した１７−１Ａ抗原とを用い
る結合分析において生物学的に試験した。これらの研究
方法は、デイ・アール・シヨウ（Ｄ．Ｒ．Ｓｈａｗ）等
のジエイ．イムノル．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．） １９
８７年６月号；ピー・シー・レヴイ（Ｐ．Ｃ．Ｌｅｖ
ｙ）等のジエイ・イムノル・１２３（２），５９４頁
（１９７９）；およびエイ・エツチ・ロス（Ａ．Ｈ．Ｒ
ｏｓｓ）等のバイオチム・バイオフイズ：レス・コム
ン．（Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃ
ｏｍｍｕｎ．）１３５（１）：２９７頁（１９８６年）
に詳細に述べられている。ＨＴ−２９細胞におけるＡＤ
ＣＣと競合的結合試験では、ＧＬＫ１７−１Ａキメラを
天然型ネズミ１７−１Ａ ＩｇＧと下記に示す付加的な
３個のキメライソタイプとともにテストした；ウサギ抗
ＣＥＭ＊をポリクローナル対照として用いた。部分的に
精製した１７−１Ａ抗原を用いる競合的結合試験では、
ＧＩＫ１７−１Ａキメラを天然型ネズミ１７−１Ａ Ｉ
ｇＧと比較した。単球およびリンパ球ＡＤＣＣ分析のデ
ータは、４人の異なる成人ドナーからの単球およびリン
パ球を用いた４種類の実験から得た。自然放出平均値±
ＳＤは全ターゲツト細胞５１ＣＲ（Ｎ＝２８）の１８．
７±２．８％であつた。エフエクメー対ターゲツト
（Ｅ：Ｔ）比２５：１，１０：１および３：１を用い
て、単球ＡＤＣＣ分析を実施した。特定のＥ：Ｔ比にお
ける各試験材料の平均溶解％（±ＳＤ）を下記に示す。
【００４６】
【００４７】ポリクローナルウサギ抗血清 単球ＡＤＣＣ分析では、ＧＩｋ １７−１ＡキメラＩｇ
Ｇによる溶解％はネズミ１７−１Ａによる溶解％に匹敵
した。リンパ球ＡＤＣＣ分析はＥ：Ｔ比１００：１，３
０：１および１０：１を用いて実施した。平均溶解％
（±Ｓ．Ｄ）値を下記に示す。
Ｇによる溶解％はネズミ１７−１Ａによる溶解％に匹敵
した。リンパ球ＡＤＣＣ分析はＥ：Ｔ比１００：１，３
０：１および１０：１を用いて実施した。平均溶解％
（±Ｓ．Ｄ）値を下記に示す。
【００４８】 リンパ球ＡＤＣＣ分析では、ＧＩｋ １７−１Ａキメラ
ＩｇＧによる溶解％は１７−１Ａによる溶解％に匹敵し
た。完全ＨＴ−２９細胞を用いる結合分析では、細胞を
試験抗体で被覆した。１７−１Ａとウサギ抗ＣＥＭの定
量には１２５Ｉ−蛋白質Ａを用いた；キメラ抗体の定量
には１２５Ｉ−抗ヒトＩｇＧ（ＦＣ）を用いた。腫瘍細
胞に結合したＩｇＧの定量に関するデータを下記に示
す。結果は４または５回の実験の平均値（±Ｓ．Ｅ）を
表す。
ＩｇＧによる溶解％は１７−１Ａによる溶解％に匹敵し
た。完全ＨＴ−２９細胞を用いる結合分析では、細胞を
試験抗体で被覆した。１７−１Ａとウサギ抗ＣＥＭの定
量には１２５Ｉ−蛋白質Ａを用いた；キメラ抗体の定量
には１２５Ｉ−抗ヒトＩｇＧ（ＦＣ）を用いた。腫瘍細
胞に結合したＩｇＧの定量に関するデータを下記に示
す。結果は４または５回の実験の平均値（±Ｓ．Ｅ）を
表す。
【００４９】 ＨＴ−２９細胞への結合はＧＩＫ １７−１ＡキメラＩ
ｇＧとネズミ１７−１Ａとで匹敵した。部分的に精製し
た１７−１Ａ抗原を用いる競合的結合分析では、ミクロ
タイタープレートを部分的に精製した１７−１Ａ抗原
（ＳＷ １１１６細胞から単離）とともに３７℃におい
て２時間インキユベートした。孔の非特異性結合部位を
ＰＢＳ＋１％ＢＳＡによつて室温において１時間ブロツ
クし、ＰＢＳによつて洗浄した。１２５Ｉ標識ネズミ１
７−１Ａと競合抗体（低温ネズミ１７−１ＡまたはＧＬ
Ｋ １７−１ＡキメラＩｇＧ）を孔の中で４℃におい
て、１晩インキユベートした。孔をＰＢＳによつて３回
洗浄し、ガンマカウンター内で計測した。ＧＩＫ １７
−１Ａキメラおよびネズミ１７−１Ａの５０％結合値は
それぞれ、０．３０μｇ／ｍｌと０．１６μｇ／ｍｌで
あると測定された。これらの結果はＧＩＫ １７−１Ａ
キメラＩｇＧが抗体結合に関してネズミ１７−１Ａに匹
敵することを実証している。
ｇＧとネズミ１７−１Ａとで匹敵した。部分的に精製し
た１７−１Ａ抗原を用いる競合的結合分析では、ミクロ
タイタープレートを部分的に精製した１７−１Ａ抗原
（ＳＷ １１１６細胞から単離）とともに３７℃におい
て２時間インキユベートした。孔の非特異性結合部位を
ＰＢＳ＋１％ＢＳＡによつて室温において１時間ブロツ
クし、ＰＢＳによつて洗浄した。１２５Ｉ標識ネズミ１
７−１Ａと競合抗体（低温ネズミ１７−１ＡまたはＧＬ
Ｋ １７−１ＡキメラＩｇＧ）を孔の中で４℃におい
て、１晩インキユベートした。孔をＰＢＳによつて３回
洗浄し、ガンマカウンター内で計測した。ＧＩＫ １７
−１Ａキメラおよびネズミ１７−１Ａの５０％結合値は
それぞれ、０．３０μｇ／ｍｌと０．１６μｇ／ｍｌで
あると測定された。これらの結果はＧＩＫ １７−１Ａ
キメラＩｇＧが抗体結合に関してネズミ１７−１Ａに匹
敵することを実証している。
【００５０】上記インビトロ試験の他に、免疫螢光法を
用いて、種々のヒト組織に関するＧＩＫ１７−１Ａとネ
ズミ１７−１Ａによるインビトロ免疫組織病理学的研究
を実施した。ネズミ１７−１Ａ（２４μｇ／ｍｌ）とＧ
ＩＫ １７−１ＡキメラＩｇＧ（９６μｇ／ｍｌ）は４
級験結腸腫瘍標本中の全てに反応することが判明した。
他の被験腫瘍細胞は膵臓癌、肺癌（腺癌および気管支
癌）、胸部線維腺腫と癌、胃癌、メラノーマ、ヘパトー
ムおよび卵巣癌である。ネズミ１７−１Ａは肺癌（気管
支）、胃癌、メラノーマおよび卵巣癌と反応した。ＧＩ
Ｋ １７−１ＡキメラＩｇＧは結腸腫瘍以外のいずれの
被験腫瘍標本とも反応しなかつた。
用いて、種々のヒト組織に関するＧＩＫ１７−１Ａとネ
ズミ１７−１Ａによるインビトロ免疫組織病理学的研究
を実施した。ネズミ１７−１Ａ（２４μｇ／ｍｌ）とＧ
ＩＫ １７−１ＡキメラＩｇＧ（９６μｇ／ｍｌ）は４
級験結腸腫瘍標本中の全てに反応することが判明した。
他の被験腫瘍細胞は膵臓癌、肺癌（腺癌および気管支
癌）、胸部線維腺腫と癌、胃癌、メラノーマ、ヘパトー
ムおよび卵巣癌である。ネズミ１７−１Ａは肺癌（気管
支）、胃癌、メラノーマおよび卵巣癌と反応した。ＧＩ
Ｋ １７−１ＡキメラＩｇＧは結腸腫瘍以外のいずれの
被験腫瘍標本とも反応しなかつた。
【００５１】Ｂ．インビボ試験 ヌードマウスにおける腫瘍増殖阻害実験はＧＩＫ１７−
１Ａキメラが腫瘍拡大の遅延に有効であることを示し
た。ヌードマウス腫瘍阻害研究を生後６〜８週間のヌー
ドマウス（ＮＵ／ＮＵ Ｂａｌｂ Ｃバツクグランド）
において、既述した方法〔デイ・エム・ヘルリン（Ｄ．
Ｍ．Ｈｅｒｌｙｎ）等のカンサー・レス（Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．）４０巻、７１７頁（１９８０年）〕を用い
て実施した。マウス（５匹／群）の頸部に５×１０６Ｓ
Ｗ９４８（結腸腫瘍細胞）を皮下注射し、次にネズミ１
７−１Ａまたは４キメライソタイプの各々（ＧＩｋ１７
−１Ａを含む）または対照の抗インフルエンザ抗体（Ｈ
２４Ｂ５）１日量１００μｇを５回腹腔内投与した。外
部測定によつて、腫瘍サイズを１週間に１回、６週間に
わたつてモニターした。各測定間隔に対する個々の動物
腫瘍量と群平均値とを第７表に示す。相対的な腫瘍阻害
ランキングは１７−１Ａ，Ｇ４Ｋ，Ｇ１Ｋであることが
判明した。キメラ抗体Ｇ３ＫおよびＧ２Ｋは試験した用
量レベルでは有効ではなかつた。
１Ａキメラが腫瘍拡大の遅延に有効であることを示し
た。ヌードマウス腫瘍阻害研究を生後６〜８週間のヌー
ドマウス（ＮＵ／ＮＵ Ｂａｌｂ Ｃバツクグランド）
において、既述した方法〔デイ・エム・ヘルリン（Ｄ．
Ｍ．Ｈｅｒｌｙｎ）等のカンサー・レス（Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．）４０巻、７１７頁（１９８０年）〕を用い
て実施した。マウス（５匹／群）の頸部に５×１０６Ｓ
Ｗ９４８（結腸腫瘍細胞）を皮下注射し、次にネズミ１
７−１Ａまたは４キメライソタイプの各々（ＧＩｋ１７
−１Ａを含む）または対照の抗インフルエンザ抗体（Ｈ
２４Ｂ５）１日量１００μｇを５回腹腔内投与した。外
部測定によつて、腫瘍サイズを１週間に１回、６週間に
わたつてモニターした。各測定間隔に対する個々の動物
腫瘍量と群平均値とを第７表に示す。相対的な腫瘍阻害
ランキングは１７−１Ａ，Ｇ４Ｋ，Ｇ１Ｋであることが
判明した。キメラ抗体Ｇ３ＫおよびＧ２Ｋは試験した用
量レベルでは有効ではなかつた。
【００５２】第 ７ 表 ５×１０６ＳＷ９４８Ｓ．Ｃ．注入および次にネズミ１
７−１Ａ、１７−１Ａの４キメラ抗体またはＨ２４Ｂ５
（陰性対照）１００μｇ１日１回腹腔内注入５回後のヌ
ードマウス（５匹／群）の腫瘍量（（ｃｍ３）。
７−１Ａ、１７−１Ａの４キメラ抗体またはＨ２４Ｂ５
（陰性対照）１００μｇ１日１回腹腔内注入５回後のヌ
ードマウス（５匹／群）の腫瘍量（（ｃｍ３）。
【００５３】
【００５４】均 等 性 当業者はここに述べた本発明の特定の実施態様の多くの
等価物を認識する、または実際にルーチンの実験を用い
て確認することができると考えられる。このような等価
物は特許請求の範囲に含むように意図されている。
等価物を認識する、または実際にルーチンの実験を用い
て確認することができると考えられる。このような等価
物は特許請求の範囲に含むように意図されている。
【図１】 １７−１Ａ機能軽鎖遺伝子のヌクレオチド配
列及びその推定上のアミノ酸配列を示す。
列及びその推定上のアミノ酸配列を示す。
【図２】 １７−１Ａ機能重鎖遺伝子のヌクレオチド配
列及びその推定上のアミノ酸配列を示す。
列及びその推定上のアミノ酸配列を示す。
【図３】 ＪＨ配列を含む再配列１７−１Ａ ＶＨ遺伝
子のサザンプロツト分析を示す。
子のサザンプロツト分析を示す。
【図４】 キメラ重鎖および軽鎖ベクターＡ、ｐＳＶ１
８４△Ｈｎｅｏ１７−１Ａ Ｖｋ−ｈＣｋ；Ｂ、ｐＳＶ
２△Ｈｇｐｔ１７−１Ａ ＶＨ−ｈＣγ３の構造を示
す。
８４△Ｈｎｅｏ１７−１Ａ Ｖｋ−ｈＣｋ；Ｂ、ｐＳＶ
２△Ｈｇｐｔ１７−１Ａ ＶＨ−ｈＣγ３の構造を示
す。
【図５】 トランスフエクシヨンされたＳｐ２／０細胞
株の３５Ｓ−メチオニン標識キメラ免疫グロプリンタン
パク質ＳＧ３／５およびＳＧ３／７のＳＤＳ／ＰＡＧＥ
を示す。
株の３５Ｓ−メチオニン標識キメラ免疫グロプリンタン
パク質ＳＧ３／５およびＳＧ３／７のＳＤＳ／ＰＡＧＥ
を示す。
【図６】 キメラ免疫グロブリンＳＧ３／５によるＳＷ
１１１６細胞への１７−１Ａ結合の阻害を示す。
１１１６細胞への１７−１Ａ結合の阻害を示す。
【図７】キメラ重鎖ベクターｐＳＶ２△ＨｇＰｔ１７−
１Ａ ＶＨ−ｈＣμの構造を示す。
１Ａ ＶＨ−ｈＣμの構造を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 9282−4Ｂ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 リー・ケイ・サン アメリカ合衆国ペンシルバニア州19063, メディア，ギャラント・フォックス・ドラ イブ 11
Claims (12)
- 【請求項１】 ａ）齧歯類動物免疫グロブリン鎖の可変
領域の少なくとも機能部分をコードする第１のＤＮＡ配
列と； ｂ）ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を
コードする第２のＤＮＡ配列と；を結合をして成る、１
７−１Ａモノクローナル抗体によって定められる腫瘍関
連抗原に対して特異性をもつキメラ齧歯類動物・ヒト免
疫グロブリン鎖をコードする融合遺伝子。 - 【請求項２】 ｃ）前記第２のＤＮＡの３’末端に結合
された、非免疫グロブリンタンパク又はペプチドをコー
ドする第３のＤＮＡ配列、を更に含む請求項１記載の融
合遺伝子。 - 【請求項３】 非免疫グロブリンタンパク又はペプチド
が抗癌治療剤、細胞傷害剤、金属結合剤又はその機能性
ドメインである、請求項２記載の融合遺伝子。 - 【請求項４】 融合遺伝子を含む宿主細胞であって、該
融合遺伝子が、１７−１Ａモノクローナル抗体によって
定められる腫瘍関連抗原に対して特異性をもつネズミ抗
体の可変領域の少なくとも抗原結合部分をコードする第
１のＤＮＡ断片と、ヒト定常領域の少なくとも一部をコ
ードする第２のＤＮＡ断片と、から成ることを特徴とす
る宿主細胞。 - 【請求項５】 齧歯類動物抗原結合領域と、ヒト定常領
域の少なくとも一部と、から成る免疫グロブリンを発現
する宿主細胞であって、該免疫グロブリンが、１７−１
Ａネズミモノクローナル抗体によって定められる腫瘍関
連抗原に対して特異性を持つものである、組換え宿主細
胞。 - 【請求項６】 齧歯類動物抗原結合領域と、少なくとも
ヒト定常領域と、から成る免疫グロブリンを発現する宿
主細胞であって、該免疫グロブリンが、１７−１Ａネズ
ミモノクローナル抗体によって定められる腫瘍関連抗原
に対して特異性を持つものである、組換え宿主細胞。 - 【請求項７】 １７−１Ａネズミモノクローナル抗体に
よって定められる腫瘍関連抗原に対して特異性を持つ免
疫グロブリンを製造する方法において、 該方法は、その免疫グロブリンの発現に適した条件下
に、組換え宿主細胞を置くことから成り、該組換え宿主
細胞は、齧歯類動物抗原結合領域と少なくともヒト定常
領域とから成る免疫グロブリンを発現するものである、
方法。 - 【請求項８】 発現した免疫グロブリンを回収する工程
を更に含む、請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 前記免疫グロブリンが、ＳＷ１１１６細
胞への結合について、１７−１Ａモノクローナル抗体と
競合できるものである、請求項７記載の方法。 - 【請求項１０】 １７−１Ａネズミモノクローナル抗体
によって定められる腫瘍関連抗原に対して特異性を有す
る免疫グロブリンを製造する方法であって、 該方法は、それぞれ軽鎖及び重鎖について、融合遺伝子
を含む宿主細胞を該遺伝子の発現に適した条件下に培養
することから成り、 該融合遺伝子が、１７−１Ａモノクローナル抗体によっ
て定められる腫瘍関連抗原に対して特異性をもつネズミ
抗体の可変領域の少なくとも抗原結合部分をコードする
第１のＤＮＡ断片と、ヒト定常領域の少なくとも一部を
コードする第２のＤＮＡ断片とを結合したものである、
方法。 - 【請求項１１】 発現された免疫グロブリンを回収する
工程を更に含む、請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 前記免疫グロブリンが、ＳＷ１１１６
細胞への結合について、１７−１Ａモノクローナル抗体
と競合できるものである、請求項１１記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US88249286A | 1986-07-07 | 1986-07-07 | |
| US882492 | 1986-07-07 | ||
| US6941487A | 1987-07-01 | 1987-07-01 | |
| US69414 | 1987-07-01 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62169580A Division JPS63112995A (ja) | 1986-07-07 | 1987-07-07 | 腫瘍関連抗原に特異的なキメラ齧歯類／ヒト免疫グロブリン |
Publications (1)
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|---|---|
| JPH1070991A true JPH1070991A (ja) | 1998-03-17 |
Family
ID=26750032
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9228781A Pending JPH1070991A (ja) | 1986-07-07 | 1997-07-22 | 腫瘍関連抗原のためのキメラ免疫グロブリン遺伝子 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0256654B1 (ja) |
| JP (1) | JPH1070991A (ja) |
| AT (1) | ATE143052T1 (ja) |
| CA (1) | CA1340456C (ja) |
| DE (1) | DE3751908T2 (ja) |
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| US6710169B2 (en) | 1987-10-02 | 2004-03-23 | Genentech, Inc. | Adheson variants |
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| US5843708A (en) * | 1988-01-05 | 1998-12-01 | Ciba-Geigy Corporation | Chimeric antibodies |
| US5750375A (en) * | 1988-01-22 | 1998-05-12 | Zymogenetics, Inc. | Methods of producing secreted receptor analogs and biologically active dimerized polypeptide fusions |
| US5567584A (en) * | 1988-01-22 | 1996-10-22 | Zymogenetics, Inc. | Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF |
| US6018026A (en) | 1988-01-22 | 2000-01-25 | Zymogenetics, Inc. | Biologically active dimerized and multimerized polypeptide fusions |
| ES2092468T3 (es) * | 1988-01-22 | 1996-12-01 | Zymogenetics Inc | Metodos para producir analogos de receptores secretados. |
| US4975369A (en) * | 1988-04-21 | 1990-12-04 | Eli Lilly And Company | Recombinant and chimeric KS1/4 antibodies directed against a human adenocarcinoma antigen |
| US5290914A (en) * | 1988-04-28 | 1994-03-01 | Mycogen Corporation | Hybrid diphtheria-B.t. pesticidal toxins |
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| PT92900A (pt) * | 1989-01-24 | 1990-07-31 | Sistema de vectores de expressao para a producao de anticorpos monoclonais quimericos | |
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| JPH07507440A (ja) * | 1990-03-02 | 1995-08-24 | レプリゲン・コーポレーション | 結合親和性を高めた抗体構築物 |
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| DE4133791A1 (de) * | 1991-10-11 | 1993-04-15 | Behringwerke Ag | Monoklonale antikoerper gegen tumorassoziierte antigene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
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| US6030797A (en) * | 1992-10-08 | 2000-02-29 | Dade Behring Marburg Gmbh | Monoclonal antibodies against tumor-associated antigens, processes for the preparation thereof and the use thereof |
| US5877016A (en) | 1994-03-18 | 1999-03-02 | Genentech, Inc. | Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors |
| DE19543039C1 (de) * | 1995-11-08 | 1996-11-21 | Medac Klinische Spezialpraep | Rekombinante Liganden für das menschliche Zellmembran-Antigen CD30 |
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