JP2935520B2 - ガン治療に用いられる新規高親和性改変抗体系統群 - Google Patents

ガン治療に用いられる新規高親和性改変抗体系統群

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、免疫グロブリンの製造及び天然抗体アミノ
酸配列の変更に関する。具体的には、本発明は、組換え
DNA技術を用いてキメラ遺伝子を製造すること、および
これらの遺伝子修飾法を利用してキメラ抗体を作製する
ことに関する。
抗体は、外来タンパク質、糖タンパク質、細胞又は他
の抗原性外来物質による誘発に応答して脊椎動物の免疫
系により産生される特異的免疫グロブリン（Ig）ポリペ
プチドである。生体が外来細胞による侵入に打ち勝った
り、外来物質の系を取り除くことを可能にする際の系路
は、少なくとも部分的に理解されている。この過程で重
要なことは、特定の外来物質に特異的に結合する抗体の
製造である。特定の抗原に対するそのようなポリペプチ
ドの結合特異性は非常に厳密であり、そして個々の脊椎
動物により発生し得る多数の特異性は、その複雑性と多
様性が著しい。無数の抗原が抗体反応を惹起することが
でき、各抗体は、もっぱら殆どそれを惹起した特定の抗
原に対してのみ向けられる。
哺乳動物Ｂリンパ球による原位置（im situ）での産
生及び/B細胞ハイブリッドによる細胞増養での産生、と
いった脊椎動物抗体の２つの主要入手源が現在利用され
ている。抗体は、未成熟Ｂリンパ球が形質細飽に分化す
る結果、原位置で産生される。これは、特異的抗原によ
る刺激に反応して起こる。未分化Ｂ細胞において、免疫
グロブリンの種々の領域をコードしているDNAの部分
は、ゲノムDNAにおいては離れている。発現に先立ち、
配列が順次組立てられる。この過程については、Gough,
Trends in Biochem.Sci.,6、203（1981）に記載されて
いる。
得られる再配列遺伝子は、成熟Ｂリンパ球中で発現し
て所望の抗体を産生することができる。しかしながら、
たとえ特定の哺乳動物を単一抗原に暴露しても、抗体の
均一集団は得られない。特定の抗原に対する原位置免疫
反応は、抗原上に存在する種々の決定基に対する反応の
モザイクにより定義される。同種抗体の各サブセット
は、Ｂ細胞の単一集団により提供される。したがって、
抗体の原位置産生は「ポリクローナル」である。
この限定されているが生来の不均質性は、数多くの特
定の場合において、ハイブリドーマ技術を用いて、Ｂ細
胞ハイブリドーマにより細胞培養中で「モノクローナ
ル」抗体を製造することにより克服されている〔Kohler
及びMilstein,C.,Nature,256、495〜497（1975）参
照〕。
この方法では、抗原を注射した哺乳動物から得た比較
的短命の、または致死の脾細胞又はリンパ球を、不死の
腫瘍細胞系と融合させて、ハイブリッド細胞又は「ハイ
ブリドーマ」を製造する。これらは、両方とも、不死で
あり、Ｂ細胞の遺伝子的にコードされた抗体を産生でき
る。このようにして作製されたハイブリッドは、選択、
希釈及び再増殖により単一遺伝株に分離し、従って各株
は単一遺伝系を表す。したがって、これらの遺伝系は、
所望の抗原に対して確実に均一である抗体を産生する。
純粋な遺伝系統に関係して、これらの抗体は、「モノク
ローナル」と呼ばれる。
単一特異性を有するモノクローナル抗体は、免疫学に
非常に影響を及ぼしており、そしてそれらの有効性は、
生物学、薬理学、化学等の自然科学において既に示され
てきた。このようなモノクローナル抗体は、診断試薬と
して広く使用されているだけでなく〔例えば、Immunolo
gy for the 80's,Voller,A 編、Bartlett,A.及びBidwe
ll,D、MTP社、ランカスター、1981年参照〕、治療にも
使用されている〔例えば、Ritz,J.及びSchlossman,S.
F.,Blood,59,1〜11（1982）参照〕。
ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体
は、上記で説明したように理論上効果的であり、そして
それらの特異性ゆえに、ポリクローナル抗体よりも明ら
かに好ましいけれども、重大な欠点がある。即ち、多く
の用途において、非ヒト動物において産生されたモノク
ローナル抗体をヒトに使用しようとする場合、大きな制
限を受ける。ヒトにマウス抗体等の「外来」抗体を繰り
返し注射すると、有事な過敏症反応を生じることがあ
る。このような非ヒト由来モノクローナル抗体をヒトに
注射すると、抗非ヒト抗体（ANHA）反応を引き起こす。
マウス由来抗体を使用することにより生じる特異的ANHA
反応〔ヒト抗マウス抗体（HAMA）反応〕については、Sh
awler等、Journal of Immunology,135,1530〜1535（198
5）を参照のこと。
ヒト定常領域を有する動物免疫グロブリンは、ヒトに
注射したときに、非ヒト定常領域を有する動物免疫グロ
ブリンよりも小さいANHA反応を引き起こすだろう。
選択された抗原に対する良好な結合親和力を有しそし
てヒト定常領域を有するモノクローナル抗体は、免疫診
断及びガンを有するヒト患者の治療に大きな潜在約効用
を有するものと思われる。
いままで、ヒトハイブリドーマを使用することにより
ヒト由来のモノクローナルを製造する種々の試みがなさ
れてきた。例えば、ヒト・ヒトハイブリドーマ〔Olsso
n,L.等、Proc.Natl.Acad.Sci.）（USA）、77、5429（19
80）〕、ヒト・マウスハイブリドーマ〔Schlom,J.等、
同書、77、6841（1980）〕及びいくつかの他の外因性ハ
イブリッドの組み合わせが製造されている。また、ヒト
モノクローナル抗体は、エプスタイン・バーウイルス
（Epstein-Barr virus）を用いたリンパ球の形質転換に
より製造されている。しかしながら、このようなハイブ
リドーマは、病原性ヒトウイルスを潜伏させる可能性が
ある。あるいは、一次性抗体産生Ｂ細胞は、ウイルスDN
Aで形質転換することにより試験官内で不死化されてい
る。残念ながら、ヒトハイブリドーマ細胞系からのモノ
クローナル抗体の収率は比較的低く（マウスハイブリド
ーマでは100μg/mlであるのに対してヒトでは１μg/m
l）、生産コストが高い。
ヒト免疫グロブリンはヒトガン患者の免疫診断及び治
療に非常に望ましいが、ヒトハイブリドーマ技術は、必
要な抗原特異性を有するヒトモノクローナル抗体が容易
に得られる段階にはまだ達していない。さらに、明らか
な倫理上の理由から、研究者は、抜粋した有毒又は有害
な抗原を用いてヒト被験者を免疫し、特定の抗原に対す
る抗体を産生させることはできない。このため、ヒト患
者の免疫診断及び治療には、大きな制限がある。
ヒト由来モノクローナル抗体の生産は、可能であるこ
とは確実であるが、低再現性及び上記した他の問題の点
で未だ不十分である。〔さらに、Nature,300,316〜317
（1982）を参照のこと〕。その結果、ほとんどのモノク
ローナル抗体は、非ヒト動物由来のものである。
高い結合親和力でヒト腫瘍抗原と反応するが、ヒトに
より外来物質として認識されないモノクローナル抗体が
非常に望ましい。この困難を克服するための方法として
は、ヒト抗体に非常に類似しているが、人体内で外来物
質として認識されない抗体、即ち、キメラ抗体、または
「ヒト化（humanized）」抗体、を人工的に作製するこ
とが挙げられる。
典型的にキメラ抗体では、軽鎖及び重鎖の両方の可変
領域は哺乳動物の一種に由来する抗体の可変領域に類似
しているが、定常部分はヒト由来の抗体の配列と相同性
がある。このようなキメラ形の一つの明確な利点は、例
えば、可変領域が、例えばヒト細胞調製物由来の定常領
域との組合せにおいて、容易に入手可能な非ヒト宿主生
物からのＢ細胞のハイブリドーマを使って現在既知の源
から都合よく誘導できることである。可変領域の特異性
はその源により影響されないが、定常領域はヒトである
ときには、抗体を注射すると非ヒト起源の定常領域より
もヒト被験者から免疫応答を惹起せしめることが少ない
ようだ。
公知のヒト腫瘍抗原の一つは、腫瘍関連糖クンパク
（TAG72）である。TAG72は、ヒト起源のある種の腫瘍細
胞、具体的にはLSl74T腫瘍細胞系の表面と関連してい
る。LS174T〔アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（American Type Culture Collection）（以下、
ATCCと称する）番号第CL188号〕は、LS180（ATCC第 CL1
87号）結腸腺癌系の変異株である。
LSl74Tの核型は、LS180のものと類似しているが、大
部分の細胞でＸ染色体を欠いている。Johnson,V.G.等、
Cancer Res.,46,850〜857（1986）においては、データ
によりTGA72分子をムチンとして特性決定している。こ
の結論は、以下の考察に基づくものである：（ａ）TGA7
2は、セファロース（商標）CL-4Bカラムからの排除によ
り示されているように高分子量（＞１×106）を有して
いる；（ｂ）CsCl中での平衡遠心分離により測定された
TGA72の密度は1.45g/mlであり、高度にグリコシル化さ
れた糖タンパクであることを示す；（ｃ）TAG72は、ノ
イラミニダーゼ消化後に移動度の変化を示し、ムチンの
多量のＯ−グリコシド結合したオリゴ糖特性を有する高
度にシアル酸が付いた分子であることを示す；（ｄ）ム
チンにおいて一般に見られる血液型抗原が、アフィニテ
ィー精製したTAG72に見られる；（ｅ）コンドロイチナ
ーゼABC消化がTGA72に何ら影響を及ぼさないことから、
TAG72エピトープはコンドロイチン硫酸プロテオグリカ
ン上で発現されないことを証明している。
TGA72に対する結合特異性を有する数多くのマウスモ
ノクローナル抗体が開発されている。これらのモノクロ
ーナル抗体の一つであるB72.3は、ハイブリドーマB72.3
（ATCC第HB-8108号）により産生されるマウスIgG1であ
る。B72.3は、免疫原としてヒト乳癌抽出物を用いて開
発された第一世代モノクローナル抗体である〔Colcher,
D 等、Proc.Nat'1.Acad.Sci.(USA) 78,3199〜3203（1
981）；及び米国特許第4,522,918号及び4,612,282号参
照〕。本明細書において使用される表現「第一世代モノ
クローナル抗体」とは、免疫原として粗製細胞抽出物を
用いて産生されたモノクローナル抗体を意味する。TAG7
2に対して向けられる他のモノクローナル抗体を、「C
C」（結腸癌）と称する。CCモノクローナル抗体は、第
二世代マウスモノクローナル抗体群である。本明細書に
おいて使用される表現「第二世代モノクローナル抗体」
とは、第一世代モノクローナル抗体を用いて精製した抗
原を免疫原として使って製造されたモノクローナル抗体
を意味する。CCモノクローナル抗体は、B72.3を用いて
精製したTAG72を使用して製造されたものである。CC抗
体の製造方法については、1987年７月15日にSchlom等に
より出願された米国特許出願第7-073,685号（USPA7-07
3,685）に記載されており、そしてナショナル・インフ
ォメーション・サービス（National Technical Informa
tion Service）から入手できる。これらは、TAG72に対
して比較的良好な結合親和力を有しているため、以下の
CC抗体がATCCにアクセス制限つきで寄託された;CC49（A
TCC第HB9459号）;CC83（ATCC第HB9453号）;CC46（ATCC
第HB9458号）;CC92（ATCC第HB9454号）;CC30（ATCC第HB
9457号）;CC11（ATCC第HB9455号）；及びCC15（ATCC第H
B9460号）。
公知技術においては、TAG72に比較的強固に結合する
ヒト抗体は全く単離されていない。したがって、適当な
抗体を設計する必要がある。
Ig分子の機能はその分子の三次元構造により決まり、
そして三次元構造は一次アミノ酸配列により決まる。し
たがって、Igのアミノ酸配列を変化させると、活性に悪
影響を及ぼす。さらに、IgをコードしているDNA配列の
変化は、DNA配列を含んでいる細胞がIgを発現、分泌又
は集成する能力に影響することがある。
USPA 7-073,685は、当該技術分野において既知の組換
えDNA技術により、例えば、マウス定常領域をヒト定常
領域（Fc）ドメインで置換して、CC抗体をキメラ形に変
えることができることを教示している。USPA 7-073,685
に記載されている提案は、キメラIgポリペプチド鎖の発
現、Ig活性の産生、Ig鎖の所望のキメラIgへの分泌およ
び集成の実際の試みにはいたらなかったと思う。
したがって、公知の組換えDNA技術が、選択されたヒ
ト癌腫に特異的に結合しそしてヒトに注射したときにAN
HA副作用の開始を減少させる機能的キメラ抗体を産生す
る選択されたDNA源から、日常的に動物−ヒトキメラ抗
体を製造するであろうことは、当該技術から全く明らか
でない。
驚くべきことに、本発明は、上記の要望の多くを満た
し、そして所望の抗体の供給方法が提供される。例え
ば、本発明は、TAG72を発現しているヒト癌腫に結合す
る動物Igの少なくとも一部分をコードしている遺伝子
と、ヒトIgの少なくとも一部分をコードしている遺伝子
とを融合する方法を提供する。また、本発明は、分泌及
び集成されて機能的キメラ抗体を与えることのできるタ
ンパク質の発現を達成する方法を提供する。
さらに、本発明は、TAG72に対して向けられた抗体及
びその一部分をコードしているDNA配列を含む発現ベク
ターを提供する。
また、本発明は、TAG72に対して向けられた抗体及び
その一部分をコードしているDNA配列を含む発現ベクク
ーを用いて形質転換された細胞を提供する。
最後に、本発明は、生体内診断アッセイ、生体内治療
及び放射線免疫誘導手術に使用される新規抗体を提供す
る。
従って本発明は、重鎖を有する可変領域（VH）を含ん
で成る抗体または抗体断片であって、前記VHは、VHαTA
Gジャームライン遺伝子（VHαTAG）と事実上相同なDNA
配列によりコードされ、 ここで前記抗体とB72.3の結合親和力を同じ方法によ
り測定した時、前記可変領域はB72.3の可変領域がTAG72
に結合するよりも少なくとも25％大きい結合親和力でTA
G72に結合することを特徴とする抗体または抗体断片に
関する。
本発明は、抗体重鎖の少なくとも部分をコードするDN
A配列であって、前記配列は、VHαTAGジャームライン遺
伝子（VHαTAG）と事実上相同であるDNA配列セグメント
を含んで成り、ここで前記DNA配列セグメントが重鎖可
変領域（VH）の少なくとも部分をコードすることを特徴
とする前記DNA配列に関する。
更に本発明は、 （Ａ）抗体または抗体断片の重鎖をコードする配列セグ
メントであって、 （１）VHαTAGジャームライン遺伝子（VHαTAG）と事実
上相同である配列サブセグメントであって、ここで該DN
A配列セグメントがVHの少なくとも部分をコードし、お
よび （２）CHの少なくとも部分をコードする配列サブセグメ
ント、 を有する配列セグメント；並びに （Ｂ）抗体または抗体断片の軽鎖をコードする配列セグ
メントであって、 （１）動物軽鎖可変領域（VL）の少なくとも部分をコー
ドする配列サブセグメント、および （２）ヒト軽鎖定常領域（CL）の少なくとも部分をコー
ドする配列サブセグメント、 を有する配列セグメント；を含んで成るDNA配列であっ
て、 前記DNA配列によりコードされる抗体または抗体断片
は、該抗体とB72.3の結合親和力を同じ方法により測定
した時、B72.3の可変領域がTAG72に結合するよりも少な
くとも25％大きい結合親和力でTAG72に結合することを
特徴とする、前記DNA配列に関する。
さらに、本発明は、単独の又は画像診断マーカー若し
くは治療薬と接合した形態の上記抗体に関する。また、
本発明は、医薬上許容される非毒性の無菌担体中に未接
合又は接合形態で上記抗体を含有する組成物に関する。
また、本発明は、癌の病巣の原位置検出用の上記組成
物の医薬上効果的な量を動物に投与することを含んで成
る癌の生体内診断方法にも関する。
また、本発明は、（ａ）上記組成物の医薬上効果的な
量を動物に投与し、それにより腫瘍を局在定位、そして
（ｂ）局在定位された腫瘍を切除することを含む手術内
療法（intraoperative therapy）に関する。
さらに、本発明は、種々の抗体又は抗体断片、それら
の接合体、適当な組換え発現ビヒクル及び適当な宿主へ
の挿入断片の調製方法に関する。これらの方法のいくつ
かは以下のとおりである。VH領域をVL領域と接触させて
抗体又は抗体断片の可変領域を形成することを含んで成
る抗体又は抗体断片の調製方法。抗体又は抗体断片を画
像診断マーカー又は治療薬と接触させることを含む抗体
又は抗体断片接合体の調製方法。DNA配列を発現ビヒク
ルに挿入することを含んで成る組換え発現ビヒクルの調
製方法。プラスミドを適当な宿主に挿入することを含ん
で成る形質転換宿主の調製方法。
他の態様において、本発明は、上記抗体及びその断片
をコードするDNA、適当な宿主細胞中でそのような免疫
グロブリンの産生を行うことのできる発現ベクター又は
プラスミドに関する。また、本発明は、宿主細胞及び上
記のベクターによる形質転換から得られる細胞培養物に
関する。
図面の説明 第１図は、酵素的開裂部位を示した基本的な免疫グロ
ブリン構造を示す。
第２図は、VHαTAG VH,CC46 VH,CC49 VH,CC83 VH及び
CC92 VHのヌクレオチド配列を示す。
第３図は、VHαTAG VH,CC46 VH,CC49 VH,CC83 VH及び
CC92 VHのアミノ酸配列を示す。
第4a図はCC49 VLのヌクレオチド配列を示し、そして
第4b図は対応するアミノ酸配列を示す。
第5a図はCC83 VLのヌクレオチド配列を示し、そして
第5b図は対応するアミノ酸配列を示す。
第6a図はCC92 VLのヌクレオチド配列を示し、そして
第6b図は対応するアミノ酸配列を示す。
第７図は、プラスミドpGDlから単離されたHindIII-Ps
tＩ断片のヌクレオチド配列を示す。
第８図は、pBLUESCRIPT SK（−）のプラスミド地図を
示す。
第９図は、pRL101のプラスミド地図を示す。
第10図は、pRL101中のCC49 L鎖ゲノムDNA挿入断片の
制限酵素地図を示す。
第11図は、pRL200のプラスミド地図を示す。
第12図は、pRL200中のCC83 L鎖ゲノムDNA挿入断片の
制限酵素地図を示す。
第13図は、プラスミドpNP9から単離されたEco RI-Bam
HI断片のヌクレオチド配列を示す。
第14図は、pHH49のプラスミド地図を示す。
第15図は、pHS83のプラスミド地図を示す。
第16図は、CC49VHのヌクレオチド配列を示し、下線の
付いたセグメントはmRNAにおいてオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて誘導した配列を示す。
第17図は、CC83VHのヌクレオチド配列を示し、下線の
付いたセグメントはmRNAにおいてオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて誘導した配列を示す。
第18図は、CC49VHのアミノ酸配列を示し、下線の付い
たセグメントはタンパク質配列決定法により決定された
配列を示す。
第19図は、CC83VHのアミノ酸配列を示し、下線の付い
たセグメントはタンパク質配列決定法により決定された
配列を示す。
第20図は、CC83抗体のPNGアーゼＦ処理の結果ととも
にSDSポリアクリルアミドゲルの結果を示す。
第21図は、ヒトガンマ１、ヒトガンマ２、ヒトガンマ
３及びヒトガンマ４の制限酵素地図を示す。
第22図は、pSV2gpt/R/Bのプラスミド地図を示す。
第23図は、pSV2gpt/γ1-7.8のプラスミド地図を示
す。
第24図は、pSV2gpt/γ1-2.3のプラスミド地図を示
す。
第25図は、pSV2gpt-γ２のプラスミド地図を示す。
第26図は、pSV2gpt-γ３のプラスミド地図を示す。
第27図は、pSV2gpt-γ４のプラスミド地図を示す。
第28図は、p49γ1-7.8のプラスミド地図を示す。
第29図は、p49γ1-2.3のプラスミド地図を示す。
第30図は、p49-γ２のプラスミド地図を示す。
第31図は、p49-γ３のプラスミド地図を示す。
第32図は、p49-γ４のプラスミド地図を示す。
第33図は、p83 γ1-7.8のプラスミド地図を示す。
第34図は、p83 γ1-2.3のプラスミド地図を示す。
第35図は、p83-γ２のプラスミド地図を示す。
第36図は、p83-γ３のプラスミド地図を示す。
第37図は、p83-γ４のプラスミド地図を示す。
第38図は、Hortonら、Gene,77,61（1989）の方法に基
づいたハイブリッド遺伝子の操作のための全体反応を示
す。
第39A図は、第39B図及び第39C図は、CH44-1の生体分
布と全身保持率を示す。
第40A図及び第40B図は、CH84-1の生体分布と全身保持
率を示す。
本発明の免疫グロブリンは、従来技術に開示されてい
るマウスモノクローナル抗体の課題を解決するために開
発された。この免疫グロブリンは、VHαTAG由来のDNAに
よりコードされる重鎖可変領域から成るキメラ構造を有
することを特徴とする。
定義 本明細書において使用される「免疫グロブリン」と
は、特異的免疫反応活性の有無にかかわらず、四量体又
はその凝集体を言う。「抗体」とは、軽鎖及び重鎖を含
有し（両者の間に共有結合を有するかまたは有しな
い）、抗原に対して有意な公知の特異的免疫反応活性を
有する集成物を言い、「非特異的免疫グロブリン」（NS
I）とは、抗原に対して公知の特異性を有さない免疫グ
ロブリンを意味する。
脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造単位
は、比較的よく理解されている〔Edelman,G.M.,Ann.N.
Y.Acad.Sci.,190,5（1971）〕。第１図から明らかなよ
うに、構造単位は、分子量が約23,000ダルトンである２
本の同一の軽ポリベプチド鎖と分子量が53,000〜70,000
の２本の同一の重鎖から成る。４本の鎖は、ジスルフィ
ド結合によりＹ字形に接合されており、軽鎖は、Ｙの口
部から始まり多様性領域を経て継続している重鎖の両側
にある。
重鎖は、ガンマ、ミュー、デルタ又はイプシロンとし
て分類され、それらのうちいくつかはサブクラスを有し
ている。長い定常領域を有しているので、この鎖の特性
により、抗体の「クラス」をIgA,IgD,IgE,IgG又はIgMと
決定する。
軽鎖は、カッパ（κ）又はラムダ（λ）に分類され
る。各重鎖クラスは、カッパ又はラムダ軽鎖のいずれか
と結合することができる。一般的に、軽鎖と重鎖は、互
いに共有結合で結合しており、そして免疫グロブリンが
ハイブリドーマまたはＢ細胞により産生される時に、２
本の重鎖の「尾」部分はジスルフィド共有結合により互
いに結合されている。しかしながら、鎖の非共有結合が
正確な幾何学で行われ得る場合には、非ジスルフィド結
合鎖の凝集体はまだ抗原と反応できる。
アミノ酸配列は、Ｙ字の二又の端部のＮ端から各鎖の
底部のＣ末端までに及ぶ。可変領域はＮ末端にあり、そ
して定常領域はＣ末端にある。
「定常」及び「可変」という用語は、機能的観点から
使用される。軽鎖（VL）と重鎖（VH）の両方の可変領域
により、抗原に対する結合認識および特異性が決定され
る。軽鎖の定常領域ドメイン（CL）と重鎖の定常領域ド
メイン（CH）により、抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動性
及び補体結合等の重要な生物学的性質が付与される。
可変領域は、各鎖において、Ｖ遺伝子配列とＣ遺伝子
配列とを結合している結合により定常領域に結合されて
いる。この結合はゲノムレベルで生じ、組換え部位を介
してヌクレオチド配列を結びつける。この結合配列は、
現在、軽鎖遺伝子では「Ｊ」配列として知られており、
約12個のアミノ酸をコードしている。一方、重鎖遺伝子
では「Ｄ」配列と「Ｊ」配列との組み合わせとして知ら
れており、これらは一緒になって約25個のアミノ酸をコ
ードしている。
本発明の目的の「キメラ抗体」は、重鎖において、マ
ウスジャームライン遺伝子由来のヌクレオチド配列によ
りコードされる可変領域アミノ酸配列と、ヒト遺伝子由
来のヌクレオチド配列によりコードされる定常領域アミ
ノ酸配列とを有する抗体について言及する。
しかしながら、本発明は、単に、免疫グロブリン定常
領域をコードするマウスＣ遺伝子配列を、免疫グロブリ
ン定常領域をコードするヒトＣ遺伝子と置換することに
は限定されない。したがって、本発明は、融合点が可変
／定常境界にあるかどうかには限定されない。
種々の技術により、本明細書において開示されるヌク
レオチド配列によりコードされる改変キメラ抗体、複合
キメラ抗体及び断片化キメラ抗体を製造することが可能
である。
「複合」免疫グロブリンは、いままで互いに会合して
いることが天然に見出されていないポリペプチド可変領
域を含んでいる。凝集物が特定の抗原又は抗原ファミリ
ーと選択的に反応することができる限りは、上記のいず
れかが共有的又は非共有的に凝集しているかどうかは重
要ではない。
「改変抗体」とは、アミノ酸配列（特に可変領域にお
いて）が変更された抗体を意味する。組換えDNA技術と
本発明との関連性のため、天然源から選択された抗体の
アミノ酸配列に限定する必要はなく、所望の特性が得ら
れるように抗体のアミノ酸配列を再設計してもよい。可
能な変形は数多くあり、そしてその範囲も一つ若しくは
数個のアミノ酸の変更から抗体可変領域および／または
定常領域の完全な再設計までに及ぶ。
可変領域の変更は、抗原結合特性を改善するためにな
されるだろう。一方、定常領域の変更は、一般に補体結
合、膜との相互作用及び他のエフェクター機能等の細胞
過程の特性を向上させるためになされるだろう。変更
は、標準的な組換え技術により行われ、また、オリゴヌ
クレオチド指向突然変異誘発法によっても行うことがで
きる〔Dalbadie-McFarlandら、Proc.Natl.Acad.Sci.(US
A),79,6409（1982）〕。
免疫グロブリンの「断片」は、例えば、特定の抗原又
は抗原群と選択的に反応できる、抗体分子のタンパク質
分解で開裂された部分または組換えで調製した部分のセ
グメントを含む。このようなタンパク質分解および／ま
たは組換え断片の非限定例としては、例えば、「Fa
b」、「Ｆ（ab′）2」及び「Fab」（これらのタンパク
質分解開裂部位は第１図に示されている）；並びに
「FV」及び「VH」が挙げられる。
「FV」断片とは、軽鎖可変領域と重鎖可変領域の部分
が、通常カルボキシ末端でいっしょに結合していること
を意味する。FV断片を製造するための組換え技術は、WO
88/0169、WO 88/06630、WO 88/07085、WO 88/07086及
びWO 88/09344に記載されている。「VH」断片とは、可
変領域が抗原結合性官能基として使用することのできる
重鎖可変領域の少なくとも部分を有していることを意味
する。抗原結合性官能基としての軽鎖可変領域（VL）の
調製及び用途は、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86,5537〜
5541（1989）において、Williams等により「抗体構造に
基づく生物学的に活性なペプチドの開発」と題する論文
に記載されている。
本発明において、「動物」とは、牛、ブタ、ネズミ及
びヒトなどの霊長類等が含まれることを意味する。
「発現ベクター」という用語は、適当な宿主中で特定
のDNAコードの発現を行うことのできるいずれのDNA配列
の機能的定義に与えられる。現在、このようなベクター
は、しばしばプラスミドの形態であるので、「プラスミ
ド」と「発現ベクター」は、しばしば交換できるように
用いられる。しかしながら、本発明では、同等の機能を
果たし、そして当該技術分野において時々公知となるこ
とがある他の形態の発現ベクターも含まれる。
「形質転換」とは、遺伝子型を変化せしめ、その結
果、受容細胞の変化をもたらすような受容宿主細胞への
DNAの導入を意味する。
「宿主細胞」とは、組換えDNA技術を使って作製され
たベクターにより組換え形質転換されている細胞を言
う。本明細書で明らかにされているように、宿主細胞に
より産生される抗体又はその変異体は、この形質転換に
よるものである。
組換え宿主から抗体を単離する方法の説明において、
特記しない限り、「細胞」と「細胞培養物」とは抗体の
入手源を示すために交換できるように用いられる。即
ち、「細胞」からの抗体の回収は、遠心沈澱された全細
胞からの回収か、倍地と懸濁細胞の両方を含有する細胞
培養物からの回収を意味するだろう。
略語 核酸、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性基及び類似
成分を略記するときにはIUPACIUB（Commission on Biol
ogical Nomenclature）又は関連分野における慣例によ
り行う。以下にその例を示す。
試薬 EDTA:エチレンジアミン四酢酸 SDS :ドデシル硫酸ナトリウム 核酸 RNA :リボ核酸 DNA :デオキシリボ核酸 含窒素塩基 プリン ピリミジン A:アデニン T:チミン G:グアニン C:シトシン U:ウラシル DNAとRNAは、両方とも、リン酸、糖及び含窒素塩基か
らなる長鎖を含んでいる。DNAは糖が２−デオキシリボ
ースである二本鎖らせんであり、一方、RNAは糖がＤ−
リボースである一本鎖である。DNAヌクレオチドを特徴
づける４種の含窒素塩基は、相補的対において水素結合
により結合してDNAの二重らせんを形成する。この際、
アデニンはチミンに結合し、グアニンはシトシンに結合
する。RNAにおいては、記載したDNA対においてチミンが
ウラシルに置き換わる。
アミノ酸 Gly:グリシン Phe:フェニルアラニン Ala:アラニン Tyr:チロシン Val:バリン Thr:トレオニン Leu:ロイシン Cys:システイン Ile:イソロイシン Met:メチオニン Ser:セリン Glu:グルタミン酸 Asp:アスパラギン酸 Trp:トリプトファン Lys:リジン Pro:プロリン Arg:アルギニン Asn:アスパラギン His:ヒスチジン Gln:グルタミン 可変領域 重鎖をコードするDNAは、VH遺伝子配列、DH遺伝子配
列及びJH遺伝子配列から成る。軽鎖をコードするDNA
は、VL遺伝子配列及びJL遺伝子配列から成る。
VH遺伝子配列 本発明は、TAG72に対して特異的反応性があるジャー
ムライン遺伝子（VHαTAG）由来のDNA配列によりコード
されるVH領域を有する選択されたキメラ抗体に関し、そ
の配列を第２図に示す。該キメラ抗体は、TAG72に結合
する能力に基づいて選択される。即ち、可変領域は、B7
2.3の可変領域がTAG72に結合するよりも少なくとも25％
多くがTAG72に結合する。一般的に、キメラ抗体とB72.3
の結合親和力は、同じ方法で測定される。抗体結合親和
力を測定するための方法については、例えば、下記の文
献に記載されている:Scatchard G.Annals of the N.Y.A
cad.of Sciences 51,660（1949）;Steward.M.W.,および
Petty,R.E.,Immunology 23,881（1972）;Muraro,R.,
ら、Cancer Research 48,4588（1988）；並びにHeyma
n,B.,J.of Immunol.Methods 68,193−204（1984）。
当業者は、本発明の結果としてVHαTAGのヌクレオチ
ド配列（及びVHαTAGによりコードされるアミノ酸配
列）には、事実上相同なヌクレオチド配列及び対応する
アミノ酸配列が含まれることは理解できるであろう。
「事実上相同な」とは、ヌクレオチド又はアミノ酸配列
が同一又はほぼ同一であることを意味する。したがっ
て、本明細書における開示において、低度の配列の変化
が相同配列内に存在することができ、少なくとも80％の
相同性を示すいずれの配列も等価とみなされることは理
解されるであろう。
相同性は、２つの配列（恐らく長さの異なる）を整列
した後の一致する塩基（又はアミノ酸）の割合又は百分
率で表される。用語「整列」は、The Time Warps,Strin
g Edits,and Macromolecules:The Theory and Practice
of Sequence Comparison Addison-Welsley,Reading,マ
サチユーセッツ州（1983）の第１章においてSankoff及
びKruskalにより定義されている意味で用いられる。お
おまかに説明すると、最小数の「ブランク」又は「ヌ
ル」塩基を２つの配列の一方に挿入させて重なりが最大
となるようにしながら、一致する塩基（又はアミノ酸）
の数を最大することにより２つの配列を整列させる。
当該技術分野において理解されるように、ヌクレオチ
ドのミス対合（mismatch）が、最終的なポリペプチド配
列におけるアミノ酸置換を生じることなくコドンの第三
塩基または対合を緩める（wobble）塩基で生じてもよ
い。また、遺伝子配列の一定領域における低度のヌクレ
オチド変異（例えば、置換、挿入又は欠落）は、そのよ
うな変異が最終生成物の機能を変更しないアミノ酸配列
の変化を生じる時は常に許容され、重要でないと考えら
れる。遺伝子機能を損失することなく、遺伝子配列全体
又は一部分を化学的に合成したコピーを天然遺伝子中の
対応部分と置換できることは示されている。
特定のDNA配列の相同体は、当該技術分野において十
分理解されるような〔Nucleic Acid Hybridization,Ham
es and Higgens（編）、IRL Press,Oxford,UK（1985）
において記載されているような〕緊縮条件下での核酸の
交差ハイブリダイゼーション試験を使って当業者により
同定することができる。２つの配列に与えられたアルゴ
リズムは、それらの相同性を計算するのに利用できる
〔例えば、Needleham及びWunsch J.Mol.Biol.,48,443〜
453（1970）；並びにSankoff及びKruskal（前掲）、第2
3〜29頁参照〕。また、このような比較を行うのに民間
のサービス例えば、Intelligenetics,Inc.（Palo Alto,
CA）を受けることができる。
DH及びJH遺伝子配列 DH及びJH遺伝子セグメントは種々のタイプで存在する
が、選択されるＤ又はＪ遺伝子セグメントのタイプは本
発明にとって重要ではない。即ち、DH及びJHは、いずれ
の動物に由来するものでもよい。好ましい動物として
は、マウス及びヒトが挙げられる。明らかに、ヒトDHお
よび／またはJH遺伝子セグメントが特に好ましいが、本
発明は、別の動物種由来のＤ又はＪ遺伝子セグメントが
重要な性質、即ち、TAG72に対する増加された結合を提
供できる限りは、このようなものには限定されない。
典型的なマウスDH及びJH配列は、「免疫グロブリン重
鎖多様性DNAセグメント」、黒沢及び利根川、J.Ex.Me
d.,155,201（1982）並びに「免疫グロブリン重鎖の接合
領域遺伝子の配列及び抗体多様性の発生におけるそれら
の役割」、Gough及びBernard,Proc.Nat'l.Acad.Sci.(US
A),78、509（1981）〕に記載されている。典型的なマウ
スDH及びJH配列については、「縦列多重遺伝子族にコー
ドされているヒト免疫グロブリンＤセグメント」、Sieb
enlistら、Nature 294,631（1981）に記載されてお
り、そして典型的なJH配列については、「ヒト免疫グロ
ブリンμ遺伝子座の構造：胚性及び再配列Ｊ及びＤ遺伝
子の特性決定」（Ravetch）等、Cell 27,583（1981）に
記載されている。
VL及びJL遺伝子配列 一般に、VHαTAGに事実上相同なヌクレオチド配列に
よりコードされるVHに相補的であるVLの一部分をコード
するいずれのVL及びJL遺伝子配列も使用できる。「相補
的」とは、VHに結合し、そして結合親和力定数を測定す
る標準法により測定した時、B72.3より少なくとも25％
大きい結合親和力を有する抗体可変領域を生じるVLを意
味する。
選択されるVL及びJL遺伝子セグメントのタイプは、本
発明にとっては重要ではない。即ち、VL及びJLは、いず
れの動物に由来するものでもよい。好ましい動物は、マ
ウス及びヒトを含む。明らかに、ヒトVL及び／又はJL遺
伝子セグメントが特に好ましいが、本発明は、別の種由
来のJLセグメントが重要な性質、即ち、TAG72に対する
結合力の増加を提供できる限りは、これに限定されな
い。
マウスJL配列は、「マウスκ免疫グロブリンＪ及びＣ
領域遺伝子を含有する5.5キロ塩基対のDNAセグメントの
ヌクレオチド配列」Max等、J.Biol.Chem.256,5116〜512
0（1981）に記載されている。ヒトJL配列については、
「ヒト免疫グロブリンκＪ領域遺伝子の進化」、The Jo
urnal of Bioloical Chemistr,357（２）,1516〜1522
（1982）に記載されている。
可変領域の誘導 上記の教示から、本発明の範囲内の抗体可変領域、即
ち、VHαTAGに対して事実上相同なVH配列を有し、そし
て該抗体とB72.3の結合親和力を同じ方法で測定した
時、B72.3の可変領域がTAG72に結合するよりも少なくと
も25％多くTAG72に結合する抗体可変領域の多数の特定
の実施態様を誘導することが可能である。いくつかの可
能な方法を以下に示す。
天然産生可変領域 免疫原TAG72に応答して、免疫処置動物は選択された
抗体産生Ｂ細胞を増加させるだろう。Ｂ細胞により産生
される抗体の可変領域は、再配列されたジャームライン
重鎖及び軽鎖DNAによりコードされるだろう。例えば、
再配列されたジャームライン重鎖は、リーダー配列を含
むV,DおよびＪ遺伝子セグメント、並びに以後除去され
得るイントロンを含むだろう。軽鎖をコードしているDN
Aは、リーダー配列を含むＶおよびＪ遺伝子セグメン
ト、並びに以後除去され得るイントロンを含むだろう。
多様性は、VHαTAGの生産的な再配列の際中にＢ細胞
に起こる体細胞突然変異から生じる。これらの体細胞突
然変異は、ヌクレオチド変化であり、この変化は、生産
的に再配列されたVHのTAGT2に対する活性を変化させる
ようなアミノ酸変化をもたらす場合と、そうでない場合
がある。
スクリーニング法 モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体をスクリ
ーニングして、前記抗体のどれが選択的にTAG72に結合
するかを測定することができる。このようなスクリーニ
ングは、固相ラジオイムノアッセイ、エンザイム−リン
クドイムノソルベントアッセイ、ロゼットアッセイ及び
ブロッキングアッセイ等の多数の周知の方法により達成
することができる。上記の方法は、当該技術分野におい
て周知である。
VHαTAGの生産的再配列から産生される抗体の可変領
域をコードするヌクレオチド配列が得られた。VHαTAG
のヌクレオチド配列に加えて、第２図は、CC46,CC49,CC
83及びCC92抗体の重鎖可変領域をそれぞれコードするヌ
クレオチド配列も示している。第３図は、第２図に示し
たヌクレオチド配列に対応するVHαTAGVH,CC46 VH,CC49
VH,CC83 VH及びCC92 VHのアミノ酸配列を示す。VHαTA
GVH,CC46 VH,CC83 VH及びCC92 VHのヌクレオチド配列と
アミノ酸配列を比較すると、最も注目すべき特徴、即
ち、鎖が非常に類似していることが分かる。
CC46 VH,CC49 VH,CC83 VH及びCC92 VH領域をコードす
るDNA、特に５′フランキングセグメントをコードするD
NAの相対的類似性は、これらのDNA配列がVHαTAG由来の
ものであることを証明する。Ｂ細胞中で発現されるべき
VH領域遺伝子の生産的再配列中に起こる体細胞突然変異
は、ある種のヌクレオチド変化を生じる。このヌクレオ
チド変化は、２つの生産的に再配列されたVHαTAGを産
生するハイブリドーマ間の相同アミノ酸変化をもたらす
こともたらさないこともある。
CC49 VLのヌクレオチド配列と対応アミノ酸配列を、
それぞれ第4a図及び第4b図に示す。CC83 VLのヌクレオ
チド配列と対応アミノ酸配列を、それぞれ第5a図及び第
5b図に示す。CC92 VLのヌクレオチド配列と対応アミノ
酸配列を、それぞれ第6a図及び第6b図に示す。
プローブ法 VHαTAG由来のDNAによりコードされる他の抗体は、ハ
イブリダイゼーションプローブとしてVHαTAGを使用す
ることにより誘導できる。一般的に、VHαTAGのDNA又は
RNAまたは組換えVHαTAGを含有する再配列遺伝子から作
製されたプローブは、未知のハイブリドーマ中の相同遺
伝子を見つけるために当業者により使用され得る。この
ような相同抗体は、そのmRNAがVHαTAGジャームライン
遺伝子及びそのフランキング領域の全部又は一部分のプ
ローブとハイブリダイズするDNA配列を有するだろう。
「フランキング領域」は、VHαTAGの５′末端から上流
遺伝子の３′末端までのDNA配列及びVHαTAGの３′末端
から下流遺伝子の５′末端までのDNA配列を含む。
合理的に合成された可変領域の さらなるアプローチは、本明細書に開示される抗体の
他にプロービングにより発見された抗体の変性可変領域
の合理的な合成である。このようなアプローチは、いく
つかの潜在的な利点がある。即ち、研究者は、免疫処置
した宿主動物をスクリーニングして、まずTAGに結合す
る抗体を選択し、次にVHαTAG由来のDNAによりコードさ
れるVH領域を特異的に有する抗体を選択する必要がなく
なるだろう。
突然変異誘発法 VH及び／又はVL遺伝子セグメントは、突然変異誘発に
より「改変」することができる。典型的な方法は、限ら
れた数の種々のヌクレオチドの付加、削除若しくは保存
性置換又は多数のヌクレオチドの保存置換を含むが。但
し、この際、適当な読み枠が維持されなければならな
い。
置換、削除、挿入又はいずれかのサブコンビネーショ
ンを組み合わせて、最終的な構成物に到達することがで
きる。64個のコドン配列があり得るが、20個のアミノ酸
が公知であるにすぎないので、遺伝子コードは、異なる
コドンが同一のアミノ酸を生じ得る点で退化している。
しかしながら、このコードは各アミノ酸について正確で
ある。したがって、各アミノ酸に対して少なくとも一つ
のコドンがあり、即ち、各コドンは単一アミノ酸を生
じ、他のアミノ酸は生じない。最終的に産生されるポリ
ペプチドにおいて適当なアミノ酸を得るために、翻訳中
に適当な読み枠は維持されなければならないことは明ら
かである。
公知の配列を有する所定のアミノ酸部位に付加させる
手法はよく知られている。
典型的な方法は、例えば、オリゴヌクレオチド媒介部
位特異的突然変異誘発及びポリメラーゼ鎖反応が挙げら
れる。
既知の配列を有する所定のアミノ酸部位での削除方法
もよく知られている。典型的な方法は、例えば、オリゴ
ヌクレオチド媒介部位特異的突然変異誘発及びポリメラ
ーゼ鎖反応を含む。
既知の配列を有する所定のアミノ酸部位での置換方法
も周知である。典型的な方法は、部位特異的突然変異誘
発及びポリメラーゼ鎖反応を含む。
オリゴヌクレオチド媒介部位特異的突然変異誘発は、
本質的には、所望の変異をコードしているオリゴヌクレ
オチドを、突然変異させようとする領域を含む一本鎖DN
Aとハイブリダイズせしめ、そしてオリゴヌクレオチド
の延長のための鋳型としてその１本鎖を使って突然変異
を含む鎖を製造することを含む。この方法の種々の態様
が以下の文献に記載されている:Zoller,M.J.及びSmith,
M.,Nuc.AcidsRes.10,6487-6500（1982）;Norris,K.,Nor
ris,F.,Christiansen,L.及びFiii,N.,Nuc.Acids Res.1
1,5103-5112（1983）;Zoller,M.J.及びSmith,M.,DNA
3,479-488（1984）;Kramer,W.,Schughart,K.及びFritz,
W.J.,Nuc.Acids Res 10,6475-6485（1982）。
ポリメラーゼ鎖反応（PCR）は、本質的には、配列特
異的オリゴヌクレオチドを用いて試験官内でDNAを指数
的に増幅することを含む。オリゴヌクレオチドには、所
望であれば、配列の変化を組み込むことができる。ポリ
メラーゼ鎖反応方法は、Mullis及びFaloona,Meth.Enz.,
155,335〜350（1987）に記載されている。PCRを用いた
突然変異誘発の例は、Higuchi等、Nuc.Acids.Res.,16,7
351〜7367（1988）;Ho等、Gene,77,51〜59（1989）；及
び「制限酵素を使用しないハイブリッド制限遺伝子の操
作；オーバラップ延長による遺伝子スプライシング」Ho
rton等Gene 77 61（1989）に記載されている。
抗体可変領域の改変は、特にモノクローナル抗体の治
療用途に用いることができる。現在、完全マウス可変ド
メインを含むキメラ抗体をヒトに注射すると、完全マウ
ス抗体ではないにもかかわらず、人体の免疫系はマウス
可変ドメインを外来のものとして認識し、そしてそのマ
ウス可変ドメインに対する免疫反応を生じる。したがっ
て、それ以後にヒトにマウス抗体又はキメラ抗体を注射
すると、外来抗体に対する人体免疫系の作用によりその
有効性がかなり減少する。従って、マウスVH及びVL領域
の改変は、改変抗体に対するヒト免疫反応を減らすこと
ができる。
組換え技術 抗体は、組換え技術により作製することができる。言
い換えれば、種々のVHコード領域及びVLコード領域のヌ
クレオチド配列が現在提供されているので、当業者は、
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードしている完全遺
伝子を試験管内で製造できる。
作製された遺伝子は、選択されたDH及びJH遺伝子セグ
メントが、選択されたVH遺伝子セグメント即ち、VHαTA
Gセグメント又はCC49もしくはCC83のVH遺伝子セグメン
トと機能的に組合わされている形態で操作することがで
きる。
例えば、作製された重鎖コードDNAは、ジャームライ
ンVHαTAGの３′末端と隣接しているDH及びJH遺伝子配
列を含み、それによりVHドメインのCDR3とフレームワー
ク（FR）４を完成する。リーダー配列は存在していても
よいが、以後に除去してもよい。
用いられる軽鎖によっては、作製した軽鎖コードDNA
を提供することが必要なことがある。このようなDNA遺
伝子は、例えば、以後に除去することができるリーダー
配列を含んだJL遺伝子セグメントと隣接した機能的組合
わせにおいてVL遺伝子セグメントを含んで成るだろう。
JL遺伝子セグメントは、軽鎖がラムダ系又はカッパ系で
あるかどうかにより異なるだろう。Ｊ領域配列は、VLエ
クソンの末端に隣接してVLドメインのFR4を完成してい
る。このような作製は、VH遺伝子を作製するのに使用さ
れる方法により行うことができる。
作製された遺伝子は、従来の組換え技術により操作し
て、例えば、発現できるプラスミド中の遺伝子挿入断片
を提供することができる。その後、プラスミドは、宿主
細胞中で発現され得る。典型的な組換えの生物学的方法
を以下に説明する。軽鎖又は重鎖可変領域のいずれかを
コードしている断片を提供する際、通常、Ｊ領域から下
流にイントロンの全部又は一部分を含めることが望まし
いだろう。特に、可変領域が、融合遺伝子を発現させよ
うとする宿主に由来する場合そうである。イントロンが
保持される場合、イントロン末端に機能的スプライスア
クセプター及びドナー配列が存在することが必要であろ
う。融合遺伝子のＪ領域と定常領域との間のイントロン
は、主に、（１）定常領域、（２）Ｊドメイン又は
（３）各々の一部分と関連したイントロン配列でよい。
最後のものは、便宜上２つの源からのイントロン中に便
利な制限部位がある場合である。イントロンを定常領域
に連結するためにアダプターを設けることが必要である
かもしれない。ある場合には、イントロンの全体又は一
部分を、削除、ヌクレオチド置換又は挿入により改変し
て、操作、発現等をより容易にすることができる。好ま
しくは、天然プロモーターに対して機能的に活性である
エンハンサーを含ませるために十分な量のイントロンが
存在することが必要である。
また、Ｊ遺伝子とＣ遺伝子との間にイントロンがない
融合遺伝子を有することが望ましいことがある。即ち、
Ｊ遺伝子の３′末端がＣ遺伝子の５′末端に隣接する。
エキソヌクレアーゼを使用することができ、そして消化
期間を変えることにより３′末端を変えることができ
る。その後、これを定常領域との結合に用い、そして機
能的生成物についての選択を種々の方法で行うことがで
きる；また、ポリメラーゼ連鎖反応技術を用いた重複延
長によるスプライシングによっても可能である（Horton
ら、前掲参照〕。この場合、エンハンサーに対して必ず
しも機能的に活性である必要がない人工プロモーターが
一般的に利用されるだろう。
好ましい一態様において、VH及びVLをコードしている
遺伝子は、抗体の軽鎖又は重鎖可変領域中の相補性決定
領域（CDRs）の少なくとも一部分を、異なる特異性の抗
体からのCDRsの類似部分で置換することにより変更でき
る。CDRsを置換する典型的な方法は、Gregory Winterに
よるヨーロッパ特許出願公開公報第0 239 400号及びハ
ストン（Huston）等によるPCT出願第WO 88/09344号に記
載されている。本発明の改変抗体においては、抗体のCD
Rsのみが人体に対して外来であるので、人の治療に使用
しても副作用を最小に抑えることができる。しかしなが
ら、ヒト及びマウスフレームワーク領域は、ヒトフレー
ムワーク領域とマウスフレームワーク領域とを区別する
特徴を有している。したがって、ヒトフレームワーク中
にマウスCDRsを含有する抗体は、もはや真性ヒト抗体よ
りも人体に対して外来であることはない。
VHαTAG,CC46,CC49,CC83及びCC92のVHアミノ酸配列に
対応するヌクレオチド配列並びに、CC49,CC83及びCC92
のVL遺伝子セグメントのヌクレオチド配列が提供され
る。その結果、本発明の抗体からのCDRsはヒト抗体のフ
レームワーク領域上にグラフトさせることができると思
われる。
一般に、ヒトVH又はVLドメインからCDR領域は、本発
明の抗体のVH又はVL領域からのCDRsにより置換すること
ができる。フレームワーク部分が使用できる典型的なヒ
ト抗体としては、Greg Winter博士から入手できるヒト
プラズマ細胞NEWM〔Jones等、「ヒト抗体における相補
性決定領域とマウスからのものとの置換」Nature 321,
522〜525（1986）〕；及びTerrence Rabbitts博士から
入手できる他の種々のVH及びVL遺伝子が含まれる。上記
の両研究者は、WIN4AL、ロンドン、20パーク・クレセン
トにあるザ・メディカル・リサーチ・カウンセル（The
Medical Research Council）の研究者である。
何がCDRを構成しているかそして何がフレームワーク
を構成しているかの決定は、Kabat等、Sequences of Pr
oteins of Immunological Interest、第４版（1987）、
U.S.Dept.of Health and Human Services,NIHにおいて
示されている選択されたIgのアミノ酸配列に基づいて行
われる。
４つのフレームワーク領域は主としてβシート高次構
造をとり、そしてCDRsはβシート構造を接続しているそ
してある場合にはβシート構造の一部分を形成している
ループを形成する。
さらに、ループ領域中のアミノ酸残基の全てが溶媒に
近づきやすいわけではなく、そしてある場合には、フレ
ームワーク領域中のアミノ酸残基が抗原結合に関与して
いる〔Amit,A.G.,Mariuzza,R.A.,Phillips,S.E.V.及びP
oljak,R.J.,Science,233,747〜753（1986）参照〕。
また、抗原結合性部位の２つの部分の可変領域は、鎖
間非共有相互作用により正しい方向に保たれる。それら
は、CDR内のアミノ酸残基が関与することがある。
したがって、一つの可変ドメインの抗原結合能力を別
の可変ドメインに移すために、CDRsの全てをドナー可変
領域からの完全CDRsと置換する必要はない。抗原結合性
部位に必要な残基を移動させればよいだけであり、そし
てこれはフレームワーク領域残基とCDR残基を移動する
ことを含むだろう。
したがって、一つまたは複数のCDRを単に相補的なCDR
sと置換するだけでは、かならずしも機能的に変更され
た抗体が生じるわけではないことは明らかである。しか
しながら、ヨーロッパ特許出願公開第0 239 400に記載
されているように、日常の実験を行うか、試行錯誤試験
により機能変更抗体を得ることは、当業者の能力の範囲
内であろう。
重鎖と軽鎖の両方可変ドメインが、少なくとも部分的
なCDR置換により、並びに必要ならば、部分的フレーム
ワーク領域置換及び配列変更により変更されるのが好ま
しい。CDRは、フレームワーク領域の由来する抗体と同
じクラス又は同じサブクラスの抗体に由来してもよい
が、CDRは異なるクラスの抗体、好ましくは異なる種か
らの抗体に由来することを意図する。
複合可変領域 一般的に、VLをコードするＶ遺伝子は、選択されたVH
と本来結合しているVLをコードするものと同じＶ遺伝子
である。例えば、CC49及びCC83のVHをコードするＶ遺伝
子を用いるときには、それぞれCC49及びCC83のVL領域を
コードするＶ遺伝子を用いるのが有利である。
驚くべきことに、本発明の抗体のVH領域は、VHαTAG
由来のVH遺伝子によりコードされるので、複合抗体が有
利に形成され得る。換言すれば、本発明の一つの抗体の
VH領域は、本発明の別の抗体のVL領域と適切に組み合わ
され得る。CC49及びCC83重鎖のアミノ酸配列は表面的に
は類似しているが、数個又は１個のアミノ酸の変化が抗
体の結合機能に著しく影響することが予想される。即
ち、得られる抗体は、一般的に、非特異的免疫グロブリ
ン（NSI）であり、即ち、抗体特性を欠いていると推定
される〔ヨーロッパ特許出願公開第0 125 023号参
照〕。
全く驚くべきことに、本発明の必須のVHを有する抗体
は、同じ天然の動物抗体からのVLとのみ再結合する必要
はないことが判明した。例えば、実施例に記載されてい
るように、CC83からのVHを有する重鎖とCC49からのVLを
有する軽鎖を含むキメラ抗体を作製することが可能であ
る。このようにして形成された複合抗体は、TAG72へのB
72.3の結合親和力よりも25％大きい結合特異性を有して
いる。
定常領域 重鎖（CH）ドメイン CHドメインは種々のヒトイソタイプ、即ち、IgG（例
えばIgG1,IgG2,IgG3およびIgG4）,IgA,IgD,IgM並びに個
々のグループの種々のサブタイプであることができる。
ヒトγ１の論文については、例えばEllisonら、「ヒ
ト免疫グロブリンＣ−ガンマ−１のヌクレオチド配
列」、Nucl.Acid Res.10、4071-4079（1982）;Takahash
iら、「ヒト免疫グロブリンガンマ遺伝子の構造：遺伝
子ファミリーの進化についての暗示」、Cell 29,671-6
79（1982）を参照のこと。ヒトガンマ２（γ２）につい
ては、Krawinkelら、「ヒト免疫グロブリンガンマ重鎖
遺伝子中のヒンジ−コードゼグメントの比較並びにガン
マ２およびガンマ４サブクラス遺伝子の連鎖」、EMBO
J.1,403-407（1982）;Ellisonら、「２つのヒト免疫グ
ロブリンガンマ重鎖定常領域遺伝子の連鎖および配列相
同性」、Proc.Nat.Acad.Sci(USA) 79,1984-1988（198
2）;Takahashiら、後述を参照のこと。ヒトガンマ３
（γ３）については、Krawinkelら、後述、およびTakah
ashiら、後述を参照のこと。ヒトガンマ４（γ４）につ
いては、Ellisonら、「ヒト免疫グロブリンＣ−ガンマ
−４遺伝子のヌクレオチド配列」、DNA 1,11-18（198
1）;Krawinkelら、後述；およびTakahashiら、後述を参
照のこと。
ヒトミューについては、Rabbittら、「ヒト免疫グロ
ブリン重鎖遺伝子:Cμ、ＣδおよびＣγ遺伝子並びに関
連のスイッチ配列の進化的比較」、Nucl.Acid Res. 9,45
09-45024を参照のこと。
ヒトアルファについては、Flanaganら、「ヒト免疫グ
ロブリンアルファ１およびアルファ２定常領域遺伝子配
列の分岐および収束のメカニズム」、Cell 36,681-688
（1984）を参照のこと。
ヒトデルタについては、Whiteら、「免疫グロブリン
D:デルタ重鎖のゲノム配列」、Science 228,733-737（1
985）を参照のこと。
ヒトイプシロンについては、Maxら、「ヒト免疫グロ
ブリンε遺伝子における重複および欠失」、Cell 29,6
91-699（1982）を参照のこと。
軽鎖（CL）ドメイン CLドメインは、ヒトカッパ（κ）またはヒトラムダ
（λ）であることができる。
ヒトκについては、「クローン化されたヒトおよびマ
ウスカッパ免疫グロブリン定常およびＪ領域遺伝子は機
能性セグメントにおいて相同性を保存している」、Heit
erら、Cel1 22,197-207、11月（1980）を参照のこと。
ヒトλについては、「プロセシングされた遺伝子:RNA
タイプのプロセシングの証拠を有する分散ヒト免疫グロ
ブリン遺伝子」、Hollisら、Nature 296,321-325を参照
のこと。
CHおよび／またはCL遺伝子セグメントは、突然変異誘
発により“変更”することもできる。典型的な方法は、
限定された数の種々のヌクレオチドの付加、欠失もしく
は非保存性置換、または多数のヌクレオチドの保存性置
換を含み、ただし正しいリーディングフレームが維持さ
れることを前提とする。加えて、例えばCH３をCH２で置
換することにより、タンパク質の完全ドメインを変更す
ることができる。この置換は、配列の完全エキソンを挿
入、除去または置換することによりDNAレベルで行われ
る。
抗体の作製 免疫処置 モノクローナルであるかポリクローナルであるかには
かかわらず、VHαTAG由来のDNAによりコードされるVHを
有する抗体を製造するための第一の方法は、宿主動物を
精製TAG72で免疫処置することである。宿主動物をTAG72
で免疫処置する典型的なプロトコールは、米国特許第4,
522,918号及び第4,612,282号（免疫原としてヒト乳癌抽
出物を使用）；並びに米国特許出願第7-073,685号（こ
れは一般に入手できる）（免疫原としてB72.3で精製し
たTAG72を使用）に記載されている。
その後、免疫処置プロトコールから製造されたモノク
ローナル又はポリクローナル抗体をスクリーニングし
て、前記抗体のどれが選択的にTAG72に結合するかを決
定する。このようなスクリーニングは、固相ラジオイム
ノアッセイ、エンザイムリンクドイムノソルベントアッ
セイ、ロゼッティングアッセイ及びブロッキングアッセ
イ等の多数の周知の方法のいずれかにより行うことがで
きる。上記の方法は、当該技術分野において周知であ
る。
アミノ酸配列の合成 本発明の免疫グロブリンは、それらの構成アミノ酸か
ら合成できる。適当な手法は、J.Amer.Chem.Soc.85,214
9〜2154（1963）に記載されているメリフィールド固相
法である。アミノ酸の配列を合成するためのこの固相法
は、Stewart及びYoung、Solid Phase Peptide Synthesi
s（W.H.Freemen and Co.,サンフランシスコ、1969年）
の第１頁〜第４頁にも記載されている。
DNAの作製 VHびVLをコードするDNA 抗体重鎖及び軽鎖をコードするDNAは、当業者に公知
の種々の入手源、例えば、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA又
はそれらの組み合わせから得ることができる。
所望の配列をコードしている細胞を単離し、そしてゲ
ノムDNAを一種または複数の制限酵素により断片化でき
る。ゲノムDNAは、天然のイントロンを含んでいてもい
なくてもよい。得られた断片は、クローニングし、そし
て重鎖Ｊ領域（JH）プローブを用いて着目のポリペプチ
ド配列をコードしているDNA配列の存在についてスクリ
ーニングすることができる。調製用アガロースゲル電気
泳動により単離されたDNA断片を連結する。ライブラリ
ーの組換えプラークを、マウスJHプローブを用いてスク
リーニングする。
また、DNAはcDNAライブラリーから得ることもでき
る。重鎖又は軽鎖をコードしているメッセンジャーRNA
を、RNA単離の標準方法を用いて、適当な入手源（成熟
Ｂ細胞又はハイブリドーマ培養物）から単離し、そして
オリゴdTセルロースクロマトグラフィーを用いてポリA
mRNAを分離する。さらに、ポリA mRNAを分画して、必要
に応じて所望の抗体の軽鎖又は重鎖中のアミノ酸配列を
コードするのに十分な大きさの配列を得る。
次いで、適当なプライマー、好ましくは所望のcDNAに
特徴的な核酸配列を用いて、mRNA混合物からcDNAライブ
ラリーを調製する。そのようなプライマーは、抗体のア
ミノ酸配列に基づいて合成することができる。また、所
望の抗体又はポリdTを産生する細胞系からの未分画ポリ
A mRNA由来のcDNAも使用できる。得られたcDNAは、所望
により、ポリアクリルアミドゲルでサイズ分画した後、
例えばdC残基で延長し、PstＩ等の適当な制限酵素によ
り開裂せしめそしてdG残基で延長したpBR322又は他の適
当なクローニングベクターとアニーリングする。他のテ
ール及び他のクローニングベクター残部を使ってcDNAを
含むクローニングベクターを形成せしめる代替手段をも
ちろん使用できるが、上記の方法は標準的で好ましいも
のである。適当な宿主細胞株、典型的には大腸菌（E.co
li）をアニールしたクローニングベクターで形質転換せ
しめ、そして好結果の形質転換体を、例えば、アンピシ
リン若しくはテトラサイクリン耐性又はクローニングベ
クタープラスミド上に残存している他の表現型特性によ
り同定する。
好結果の形質転換体を採取し、そして更なる増殖およ
び保存のためミクロタイタープレート又は他の支持体に
移す。これらの増殖培養物のニトロセルロースフィルタ
ー転写物を、次に、cDNA中の所望の配列と相補的である
ことが知られている塩基を含有する適当なヌクレオチド
配列で探索する。数種のプローブを使用できるが、γ−
32P ATPでリン酸化することにより標識した合成一本鎖D
NA配列が好ましい。ニトロセルロースフィルターに固定
された細胞を溶解し、DNAを変性し、固定した後、リン
酸化プロープと反応させる。好結果にハイブリダイズす
るクローンをフォトプレートと接触させることにより検
出し、増殖しているコロニーからプラスミドを単離し、
そして当該技術分野で公知の手段により配列決定して、
遺伝子の所望の部分が存在することを確認する。
所望の遺伝子断片を切り取り、操作して、適当な発現
ベクターに挿入した時調節セグメントを有する適当なリ
ーディングフレームを確保する。典型的には、ヌクレオ
チドを５′端に付加して開始シグナルおよび適当に配置
された制限エンドヌクレアーゼ部位を含める。
本発明等はVHαTAGのヌクレオチド配列を提供したの
で、DNAも、例えば、アプライド・バイオシステムズ
（商標）380A型DNA合成装置を用いて合成し、そして標
準法により作製することができる。
上記の技術の組み合わせを利用する典型的な方法は、
ポリメラーゼ連鎖反応を使った重複伸長でのスプライシ
ングによるものである（Horton等、前掲）。一般的に、
いわゆる「ワギング・テール（Wagging tail）」を有す
る合成プライマーを、選択された配列、例えば、ゲノム
DNAと共に挿入できる。その後、配列を増幅し、一緒に
スプライスする。
CH及びCLをコードするDNA ヒト定常領域のアミノ酸配列をコードするDNA断片
は、ヒト免疫グロブリンを産生している細胞の染色体DN
Aをスクリーニングすることにより得ることができる。
ベクター 所望のDNA断片は、選択されたDNA断片中に存在しない
適当な調節配列を含むことがある生物学的に機能的な発
項ビヒクルに置くことができる。「生物学的に機能的」
とは、発現ビヒクルが、染色体外因子として維持する
か、または宿主ゲノム中への組込みにより、適当な宿主
中で複製及び／又は発現できることを意味する。多数の
ベクターが入手可能であるか又は容易に調製でき、そし
て当業者にとって周知である。
ヨーロッパ特許出願公開第0036776号、第0048970号及
び第0051873号に記載されているものなど、既に遺伝子
を有するリーディングフレーム中にプロモーターを含
み、そして提案された宿主細胞に適合する多数のプラス
ミドが記載されている。
本明細書において開示されるベクター及び方法は、形
質転換を受けやすい広範囲の微生物（原核又は真核）に
渡る使用に適当である。このプラスミドは、微生物、特
に細菌中で複製することができる。
一般的に、それ本来のタンパク質の発現のために微生
物により使用され得る適当なプロモーターを含有するプ
ラスミドベクターは、調節配列、リボソーム結合部位及
び転写終止部位も含んでいる。一般的に、宿主細胞に適
合する種に由来するレプリコン及び調節配列は、これら
の宿主に関連して使用される。
より小さいSV40断片又はより大きい断片もまた使用で
きる。但し、この場合、ウイルスの複製開始点に位置す
るHindIII部位からPvuIIまでに及ぶ約250塩基対（bp）
の配列が含まれることを前提とする。さらに、所望の遺
伝子配列と通常関連したプロモーター又は調節配列を利
用することも可能であり、しばしば望ましい。但し、こ
のような調節配列は、宿主細胞系と適合するものである
ことを前提とする。
最終的に、望ましくは、プラスミドは、発現ベクター
を含んでいる宿主細胞の選択を考慮して表現型特性を提
供できる遺伝子（マーカー遺伝子）を有するべきであ
る。特に有用なものは、生存選択のための遺伝子であ
る。生存選択は、増殖阻害物質に対する耐性を付与する
か、または増殖因子能力をこのような能力を欠いている
細菌に付与することにより達成できる。一般的に、原核
生物が好ましい。例えば、E.coli種由来のプラスミドで
あるpBR322〔Bolivar等、Gene 2,95（1977）〕が、特
に有用である。pBR322は、アンピシリン耐性及びテトラ
サイクリン耐性遺伝子を含んでおり、従って、形質転換
細胞を同定するための簡単な手段を提供する。
それらの原核生物が最も一般的に使用されるが、使用
され得る他の微生物株は、E.coliＢ、E.coli K12株294
（ATCC第31446号）及びE.coli X1776（ATCC第 31537
号）、E.coli W3110（F-、γ-、、原栄養体、ATTC第 27
325号）等の大腸薗株、バシラス・サブチリス（Bacillu
s subtilus）等の桿菌並びにサルモネラ・チフィムリ
ウム（Salmonella typhimurium）又はセラチア・マセ
ッセンス（Serratia macrcesans）等の他の腸肉細菌を
含み、そして種々のシュードモナス（Pseudomonas）種
も用いることができる。これらの例は例示の目的のみに
取り上げたものである。
原核生物の他に、真核微生物も使用できる。サッカロ
ミセス・セレビシェー（Saccharomyces cerevisia
e）、または普通のイースト（baker's yeast）が、真核
微生物のうちで最も普通に用いられるが、他の多数の菌
株も一般的に利用可能である。
サッカロミセス中での発現には、例えばプラスミドYR
p7〔Stinchcombら、Nature 282,39（1979）;Kingsman
ら、Gene 7,141（1979）;Tschemperら、Gene 10,157
（1980）〕が通常使用される。このプラスミドは、既に
トリプトファン中で増殖する能力を欠いている酵母変異
株、例えばATCCNo.44076またはPEP4-1〔Jones,Gene 8
5,12（1977）〕に選択マーカーを提供するtpl遺伝子を
既に含んでいる。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのtp
l損傷の存在は、トリプトファン不在下での増殖により
形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。
酵母適合性プロモーター、複製開始点及び終止配列を
含むプラスミドベクターは、酵母に用いるのに適当であ
る。酵母ベクターにおける適当なプロモーター配列とし
ては、３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター
〔Hitzeman等、J.Biol.Chem. 255,2073（1980）〕又は他
の解糖酵素のプロモーター〔Hess等、J.Adv.Enzyme Re
g. 7,149（1968）;Holland等、Biochemistry 17,4900（1
978）〕が含まれる。
哺乳動物細胞中での使用のためには、発現ベクター上
の調節機能がウイルス材料によりしばしば提供される。
例えば、通常使用されるプロモーターは、ポリオーマ、
アデノウイルス２及び最も頻繁にはシミアンウイルス40
（SV40）である。SV40ウイルスの初期及び後期プロモー
ターが特に有効である。というのは、SV40ウイルス複製
開始点も含んでいる断片としてウイルスから容易に得ら
れるからである〔Fiers等、Nature 273,113（197
8）〕。
例えば、pSV2neoは、SV40プロモーターの支配下にあ
るアンピシリン耐性ネオマイシン耐性遺伝子を含む。し
たがって、pSV2neoは、動物可変領域とヒト定常領域の
両方の遺伝子で形質転換された細胞を同定する容易な手
段を提供する。
キメラDNAの調製 重鎖又は軽鎖をコードしている遺伝子は、定常領域を
コードしているDNA断片の５′末端を可変領域をコード
しているDNA断片の３′末端に連結することにより作製
されるだろう。抗体アミノ酸配列をコードしているDNA
配列は、ゲノムDNAからプロモーターと複製部位との関
連において得られる。宿主細胞が異種遺伝子に関連する
転写調節シグナル及び転写開始シグナルを認識する区域
まで、次に可変領域コード配列の５′及び３′領域が可
変領域コード配列とともに保持され、そして転写開始及
び翻訳開始調節に使用され得る。定常領域の３′−非コ
ード領域は、終止及びポリアデニル化等の転写終止調節
配列のために保持され得る。２本鎖の５′又は３′を言
及する場合、転写方向を意味し、５′は３′から上流で
ある。
各鎖の可変領域間のイントロン配列は、いずれかの便
利な制限部位のところで対応するヒト定常DNA断片に接
合できる。可変領域をコードする断片を提供する際、Ｊ
領域から下流にイントロンの一部分を含めることが通常
望ましいだろう。イントロンが保持される場合、イント
ロン末端に機能的なスプライスアクセプター及びドナー
配列が存在する必要があろう。可変領域に隣接する５′
−非コード領域は、通常、TATAボックス、キャップ配列
及びCAAT配列等の転写及び翻訳の開始に関係する配列を
含むだろう。通常、５′−非コード配列は、約１〜２キ
ロ塩基（kb）を超えない。
エンハンサー配列が、Ｊ領域と定常領域との間に存在
するである。用いられるエンハンサーは、（１）動物Ｖ
領域又は（２）ヒト定常領域のエンハンサーであること
ができる。
定常領域をコードしているDNA配列に生来隣接してい
る３′領域を保持することにより、その遺伝子に転写終
止シグナルを提供してもよい。転写終止シグナルが発現
宿主細胞中において十分に機能的でない場合には、宿主
細胞中で機能的な３′領域で置換してもよい。３′−非
コード領域は、便利には発現宿主からの定常領域の非コ
ード隣接３′領域から得ることができる。３′−非コー
ド領域は、DNA断片の操作及び連結について以前に記載
されている手段のいずれかによって定常領域に接合でき
る。次に、この領域は遺伝子を調製する際の組立てブロ
ック（building block）として使用できる。
発現のビヒクルの調製 所望のコード配列及び調節配列を含む適当な発現ビヒ
クルの構成物は、以下のようにして製造できる。ベクタ
ー及びDNA断片の末端を再連結せしめ、所望の発現ビヒ
クルを形成できる。用いられる方法は、DNA源又は意図
する宿主とは無関係である。
軽鎖及び重鎖をコードしているDNA断片は、別々の発
現ビヒクルまたは同じベクターに挿入できる。好ましく
は、軽及び重キメラ鎖をコードする融合遺伝子を、２つ
の異なる発現ベクターに組立て、これらを用いて受容細
胞を同時又は逐次形質転換せしめることができる。
キメラ遺伝子を含有するDNA断片を発現ベクターに挿
入する手段は、制限エンドヌクレアーゼの使用を含む。
「制限エンドヌクレアーゼ」（又は「制限酵素」）は、
DNA分子の部位特異的開裂を触媒することができる加水
分解酵素である。制限エンドヌクレアーゼ作用の位置
は、特定のヌクレオチド配列の存在により決定される。
このような配列は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位
と呼ばれる。種々の細菌種由来の数多くの制限エンドヌ
クレアーゼが単離され、そして認識部位のヌクレオチド
配列の観点から特性決定されている。制限エンドヌクレ
アーゼのあるものは、両方の鎖上の同じ点でホスホジエ
ステル結合を加水分解して、平滑端を生成する。他のも
のは、数個のヌクレオチドにより互いに離れた結合の加
水分解を触媒し、開裂された分子の各末端に遊離の１本
鎖領域を生成する。このような一本鎖末端は、自己相補
性であり、したがって粘着性であるので、加水分解DNA
を再連結するのに使用できる。典型的な制限酵素として
は、AatII,Bam HI,Eco RI,Hind III,Nde I,Spe I,Xba
I,Sac I,Bgl II,Pst I,Sal I及びPvu IIが含まれる。
さらに、発現ベクターは、複数のユニーク制限部位を
有するポリリンカーが挿入されていてもよい。発現ベク
ターを適当な制限酵素で消化することにより、遺伝子を
含む少なくとも１つのDNA断片が挿入できるようにポリ
リンカーが開裂されるだろう。ポリリンカーが、識別で
きる末端を許容する場合、DNA断片は単一方向で挿入で
きる。末端が同じである場合、DNA断片の挿入により、
２つの異なる配向性を有するプラスミドを生じる。
プラスミドを制限酵素で処理することにより開裂を行
うことができる。一般的に、約10μｇのプラスミド又は
DNA断片を、緩衝液約100μｌ中で酵素約10単位と共に用
いる。エンドヌクレアーゼ消化は、通常、37〜65℃の温
度でpH7〜９で行われる。（個々の制限酵素に関する適
当な緩衝液及び基質の量は、製造業者により規定されて
いる。）反応時間は１〜18時間である。
開裂ベクターをアルカリホスファターゼで前処理する
ことにより開裂ベクターの再連結を防止するのが有効な
ことがある。特定の条件は、製造業者により規定されて
いる。
制限酵素消化が完了した後、フェノール及びクロロホ
ルムで抽出してタンパク質が除去される。核酸は、約2.
5容のエタノールでの沈澱により水性分画（約0.3M酢酸
ナトリウム含有）から回収される。
制限酵素による開裂方法の記載は、下記の文献中に見
つけることができる:Greene等、Methods in Molecular
Biology、第９巻、Wickner,R.B.編、Marcel Dekker In
c.、ニューヨーク、「DNAの複製及び生合成」;Mertz及
びDavis、Proc.Nat.Acad.Sci.(USA) 69,3370（197
2）。
アガロースゲル電気泳動による開裂断片のサイズ分離
は容易に実施でき、反応の推移を追跡できる。消化が一
旦所望の程度まで進んだ時点で、約65℃以上で10分間加
熱するか、有機抽出を行うことによりエンドヌクレアー
ゼを不活性化することができる。
次に、所望の断片を消化物から精製する。適当な精製
方法としては、ゲル電気泳動又はショ糖勾配遠心分離が
挙げられる。
その後、プラスミドビヒクル及び外来DNA断片をDNAリ
ガーゼで連結して再環化する。このプロセスは、アニー
リング及びDNA連結と呼ばれる。
DNA断片、DNAリガーゼ及び適当な共同因子を含有する
適当な緩衝液を用いる。使用温度は、25℃〜４℃であ
る。DNAセグメントが水素結合するとき、DNAリガーゼ
は、２つのセグメントの間に共有結合を導入できる。ア
ニーリングに用いられる時間は、使用温度、塩溶液の性
質の他に、粘着タンパク又は相補末端の性質により異な
る。一般的に、連結反応時間は、５〜18時間であろう。
〔ManiatisT.,Molecular Cloning,Cold Spring Harbo
r,前掲〕を参照のこと。
宿主細胞 その後、発現ビヒクル構成物を用いて適当な宿主細胞
を形質転換することができる。適当な宿主細胞は、単細
胞生物及び多細胞生物由来の細胞を包含する。
キメラ免疫グロブリン遺伝子は、細菌又は酵母等の非
リンパ系細胞中で発現させることができる。
細菌等の種々の単細胞微生物を形質転換せしめること
ができる。即ち、培養又は醗酵で増殖できる単細胞生物
を形質転換せしめることができる。細菌は一般的に操作
するのに最も簡便な生物であるので、以下、他の単細胞
生物の典型例として言及することにする。形質転換を受
けやすい細菌としては、大腸菌（Escherichia coli）株
等の腸内細菌科；サルモネラ（Salmonella）；バシラス
・サブチリス（Bacillus subtilis）等のバシラス科；
肺炎球菌（Pnewmococcus）；ストレプトコッカス（Stre
ptococcus）；及びヘモフィルス・インフルエンザ（Hae
mohilus influenzae）のメンバーが挙げられる。
細菌中で発現されるとき、免疫グロブリン重鎖及び軽
鎖は、封入体の一部分となる。次に、鎖を単離し、精製
し、そして機能性免疫グロブリン分子に組み立てなけれ
ばならない。
原核微生物に加えて、酵母培養物等の真核微生物も使
用できる。真核微生物のうち、サッカロミセス・セレビ
シェー（Saccharomyces cerevisae）、または普通のイ
ースト（backer's yeast）が最も一般的に用いられる。
但し、多数の他の菌株も通常利用可能である。酵母宿主
細胞ゲノムの特徴としてtrpl損傷が存在すると、トリプ
トファンの不存在下での増殖により形質転換を検出する
のに効果的な環境が提供される。
微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞培養も宿主と
して使用できる。原則的に、細胞系が少なくとも初めは
抗体を産生したものである限りは、そのような細胞培養
物は、脊椎動物または無脊椎動物培養物からにかかわら
ず、操作可能である。培養中の脊椎動物の増殖は、近年
では日常の操作となっている〔Tissue Culture,Academi
c Press,KniseおよびPatterson編（1973）〕。このよう
な有用な宿主細胞系は、Sp2/0、ベロ（VERO）及びヘラ
（HeLa）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細
胞系並びにW138,BHK,COS-7及びMDCK細胞系が挙げられ
る。
好ましい受容細胞系は、Ｂリンパ球又はハイブリドー
マ細胞等の形質細胞腫細胞である。形質細胞腫細胞は、
形質転換された免疫グロブリン遺伝子によりコードされ
る免疫グロブリンを合成し、集成しそして分泌すること
ができる。さらに、それらは免疫グロブリンのグリコシ
ル化機構を有している。Sp2/0は、免疫グロブリン非産
生形質細胞腫細胞であるため受容細胞として好ましい。
この細胞は、形質転換された免疫グロブリン遺伝子によ
りコードされる免疫グロブリンのみを産生する。形質細
胞腫細胞は、培養において又はマウスの腹腔中で増殖さ
せることができ、後者の場合には、腹水から分泌免疫グ
ロブリンを得ることができる。
宿主細胞の形質転換 宿主細胞の形質転換は、以下のようにして行うことが
できる。発現ビヒクルを線状化し、そして抗体産生のた
めにDNAを宿主細胞に挿入する。DNAを宿主細胞に挿入す
る典型的な方法には、エレクトロポーション（electrop
ortion）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈
澱、又はデキストラン硫酸及びPEGを用いる他の従来の
方法が含まれる。
強力な細胞壁バリヤーのない細胞を宿主細胞として使
用するならば、GrahamおよびVan der Eb,Virology 52
546（1978）により記載されているリン酸カルシウム沈
澱法により行うことができる。
原核細胞又は堅固な細胞壁構造を有する細胞を使用す
る場合、好ましい形質転換法はCohn,F.N.ら、Proc.Nat'
l.Acad.Sci.(USA) 69 2110（1972）に記載されている
ような塩化カルシウムを用いたカルシウム処理である。
宿主細胞は、同時形質転換又は標的形質転換により形
質転換できる。
同時形質転換の場合、軽鎖及び重鎖をコードしている
遺伝子を用いて同一又は異なる種の別個の細胞培養物を
形質転換せしめることができ；軽鎖および重鎖の別々の
プラスミドを用いて単一細胞培養物を同時形質転換せし
めることができ；あるいは、両方の遺伝子を含みそして
軽鎖及び重鎖の両方の遺伝子を発現することができる単
一発現プラスミドを用いて単一細胞培養物を形質転換せ
しめることができる。
標的形質転換法では、宿主細胞は、軽鎖をコードして
いる遺伝子で形質転換され、そして軽鎖マーカーを含有
する細胞が選択される。細胞染色を用いるか、または分
泌されているのであれば多分上清中の軽鎖の検出により
軽鎖が見つかる。軽鎖を有するように選択した細胞を、
重鎖構成物で形質転換せしめ、そして重領マーカーも更
に含有している得られた細胞を選択する。
形質細胞腫細胞系等のある種の不死化リンパ球細胞系
は、通常の状態で、単離されたIg軽鎖又は重鎖を分泌す
る。その結果、このような細胞系を本発明のキメラ重鎖
又は軽鎖を含むベクターで形質転換せしめると、他方の
Ig鎖を用いてその細胞系又は別の細胞系を形質転換せし
める必要はない。但し、正常に分泌された鎖は、細胞系
を形質転換せしめるのに最初に使用したベクターにより
コードされるIg鎖の可変ドメインに相補的であることを
前提とする。
形質転換された宿主細胞の選択及び発現 一般に、宿主細胞の形質転換後、細胞を約48時間増殖
させてマーカー遺伝子を発現させることができる。次
に、細胞を選択倍地に入れ、そこで未形質転換細胞は死
滅し、該DNA構成物で形質転換された細胞のみが生き残
る。
重鎖及び軽鎖又はそれらの一部分は互いに単離した状
態で産生でき、そして抗体及びその断片を得ることがで
きる。そのような調製物は、単離した鎖を再集成するた
めの方法を使用する必要がある。
本発明の方法が互いに単離した形態で重鎖及び軽鎖又
はそれらの一部分を産生できることは、免疫グロブリン
のユニークな集成体、Fab領域及び一価抗体を得る機会
を付与する。重鎖及び軽鎖を試験管内で再結合し、鎖間
ジスルフィドのみの開裂により***させ、そして鎖間ジ
スルフィドの修復なしで抗体活性を回復することが可能
である〔Edelman,G.M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci(USA) 5
0,753（1963）〕。
形質転換細胞を軽鎖及び／又は重鎖の産生に適当な条
件下で増殖させ、そして重鎖及び／又は軽鎖タンパク質
合成についてアッセイする。典型的なアッセイ法には、
エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（ELIS
A）、ラジオイムノアッセイ（RIA）又は蛍光標示式細胞
分取器分析（FACS）、免疫組織化学等が含まれる。TAG7
2に対するモノクローナル抗体の結合親和力は、当該技
術分野に周知の手段により測定される〔Heyman,B.,J.Im
munol.Methods,68,193〜204（1984）参照；以下の実施
例でも詳細に説明する〕。
純粋な形質転換コロニーを単離するために、選択され
た陽性培養物をサブクローニングする。サブクローニン
グを得るための適当な方法は、Mckeara,Monoclonal Ant
ibodies，プレナム・プレス社、ニューヨークにより教
示されている限定希釈法によるものが挙げられる。
そのようなキメラ抗体を産生するハイブリドーマは、
公知の方法を用いて増殖させることができる。形質転換
細胞は、中空繊維系、スピナー培養、静置培養のような
試験管内培養、又は腹水形成等の生体内培養により、多
量の軽鎖及び／又は重鎖を分泌できる。
ハイブリドーマをプリスタン感作マウスの腹腔内に注
射し、適当な時間（約１〜２週間）の経過後に、マウス
から非常に高い力価の均一のモノクローナル抗体を生じ
る腹水を採取し、そして当該技術分野において公知の方
法によりそこからモノクローナル抗体を単離することに
より、キメラ抗体を多量に製造することができる〔Stra
mignoni,P等、Intl.J.Cancer,31,543〜552（1983）参
照〕。ハイブリドーマは、生体内で動物において腫瘍と
して増殖し、その血清又は腹水は、最大約50mg/mlのモ
ノクローナル抗体を提供することができる。通常、組織
適合性ハイブリドーマ細胞106〜107を注射（好ましくは
腹腔内）すると、数週間後に腫瘍が形成されるだろう。
次に、抗体を採取し、そして周知の方法により処理する
ことができる〔例えば、一般的に、Immunological Meth
ods，第Ｉ巻及び第II巻、Lefkovits,I及びPernis,B,（1
979及び1981）、アカデミックプレス社、ニューヨー
ク；Handbook of Experimental Immunology,Weir,D.（1
978）、ブラックウエル・サイエンティフィック・パブ
リケーションズ、セントルイス、MO）を参照のこと〕。
次に、抗体を、更なる使用のために通常安定な抗体溶
液を提供するリン酸塩緩衝化塩溶液（PBS）等の種々の
緩衝液中で保存することができる。
本発明のキメラ抗体は、公知のプロテアーゼ酵素、例
えば、パパイン及びペプシンを用いて断片化することに
より高度に免疫反応性のＦ（ab′）2、Ｆ（ab′）及びF
ab断片を得ることができる。さらに、タンパク質分解に
より形成されるIgの活性断片（分子量：約50,000）を分
割して十分に縮小した重鎖及び軽鎖成分とし、そしてか
なり効率的に再構成して活性抗体を得ることができる
〔Haber,E.Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 52,1099（196
4）;Whitney,P.L.,ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 53,
524（1965）〕。得られるF(ab′)2、Ｆ（ab′）及びFab
断片は、完全モノクローナル抗体分子について上記した
方法により測定できる。
抗体の用途 本発明の抗体並びにそれらの免疫反応性断片又は組換
え体は、種々の癌治療に利用するのに独特の利点を提供
する。悪性細胞に特異的に結合する能力及び腫瘍を局在
定位する能力に加えて、これらの抗体は、主要器官にお
ける線維芽細胞、内皮細胞又は上皮細胞等の正常細胞に
検出できる程には結合しない定常可変領域を有する。
特に、抗体、免疫反応性断片又はそれらの組換え体
は、以下のタイプの癌治療に有効であるが、これらに限
定されない：（１）以下でさらに詳細に説明するような
癌病変の原位置検出のための画像診断マーカーに接合し
た生体内診断アッセイ；（２）以下で説明するような単
独で又は放射性核種、毒素、エフェクター細胞、他の抗
体等の治療薬に接合させた形態で又は補体結合を介して
本発明の抗体を用いる生体内療法；及び（３）以下で説
明するような放射線免疫誘導手術（radioimmunoguided
surgery）。
さらに、生理的食塩水、非毒性緩衝液等の医薬上許容
される非毒性の無菌担体中に本発明の抗体を含有する医
薬組成物も可能である。
本発明の注射可能組成物は、懸濁液の形態でも、溶液
の形態でもよい。溶液形の場合、複合体（又は必要に応
じて別々の成分）を医薬上許容される担体に溶解する。
そのような担体は、適当な溶媒、必要に応じてベンジル
アルコール等の保存剤、及び緩衝剤を含む。有用な溶媒
には、例えば、水、水性アルコール、グリコール及びリ
ン酸エステル又は炭酸エステルが含まれる。そのような
水性溶液は、多くて50容積％の有機溶媒を含む。
本発明の組成物としての注射可能懸濁液には、補助薬
を含むかまたは含まない液体懸濁液媒質が担体として必
要である。懸濁液媒質は、例えば、水性ポリビニルピロ
リドン、植物油もしくは高度に精製した鉱油等の不活性
油、又は水性カルボキシメチルセルロースである。懸濁
液中で複合体を保持するために必要であれば、適当な生
理学的に許容される補助剤が、カルボキシメチルセルロ
ース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン及びアルギン酸
塩のような増粘剤の中から選択される。また、例えば、
レシチン、アルキルフェノール、ポリエチレンオキシド
付加物、ナフタレンスルホン酸塩、アルキルベンゼンス
ルホン酸塩及びポリオキシエチレンソルビタンエステル
等の多数の界面活性剤も懸濁化剤として有用である。液
体懸濁液媒質の親水性、密度及び表面張力に影響を及ぼ
す数多くの物質も、個々の場合に応じて注射可能懸濁液
を調製するのに役立つことができる。例えば、シリコー
ン消泡剤、ソルビトール及び糖は、全て、有用な懸濁化
剤である。
癌細胞は異種であるので、単一特異性キメラ抗体は、
腫瘍の異なるエピトープを発現している全ての細胞を認
識することができないかもしれない。
したがって、本発明の幾つかの異なるキメラ抗体を投
与することが望ましいだろう。これらの種々の抗体を逐
次使用すると、単一抗体の反復使用に比べて、ヒト患者
における抗イデオタイプ応答をかなり減少させる。例え
ば、CH92,CH88及びCH44を、患者に順次投与することが
できる。これらの抗体は異なる軽鎖を有し、そして実際
には、異なるCDR3領域を有しているので、抗イデオタイ
プ応答を最小限に抑えることができる。
生体内診断アッセイ 抗体、免疫反応性断片又はその組換え体を用いたヒト
腫瘍又はその転移の生体内診断アッセイでは、それらを
マーカーと接合し、患者に投与後、患者を適当な検出手
段に暴露することにより患者における画像診断マーカー
の存在を検出する。
抗体−画像診断マーカー接合体の投与及び検出並びに
画像診断マーカーへの抗体の接合は、例えば、以下の文
献から容易に知られ、または容易に決定できる方法によ
り達成される:Goldenberg,D.M.ら、New England J.Me
d.,298,1384-1388（1978）;Goldenberg,D.M.ら、J.Ame
r.Med.Assoc. 280,630-635（1983）;Goldenberg,D.M.
ら、Gastroenterol. 84,524-532（1983）;Siccardi,A.
G.ら、Cancer Res. 46.4817-4822（1986）;Epenetos,
A.A.ら，Cancer 55,984-987（1985）;Philben,V,J.
ら、Cancer 57,571-576（1986）;Chiou,R.ら、Cancer I
nst.76,849-855（1986）;Colcher,E.ら、Cancer Res.,4
3,736−742（1983）;Colcher.E.ら、Laboratory Resear
ch Methods in Biology and Medicine Immunodiagnosti
cs,New York,Alan R.Liss,pp.215-258（1983）;Keenan,
A.M.ら、J.Nucl.Med. 25,1197-1203（1984）;Colcber
D.ら、Cancer Res, 47,1185-1189（1987）;Estaban,J.
M.ら、Intl.J.Cancer 39,50-59（1987）;Martin,D.T.,
ら、Curr.Surg. 41,193-194 （1984）;Martin,E.W.Jr.
ら、Hybridoma 5,S97-S108（1986）;Martin,D.T.ら、A
m.J.Surg. 150,672-675（1985）;Mearesら、Anal.Bioc
hem. 142 68-78（1984）；およびKrejcarekら、Bioche
m.and Biophys.Res.Comm.77,581-585（1977）。
投与量は、患者の年令及び体重により異なるだろう。
一般的には、投与量は、正常組織とは異なる腫瘍部位を
視覚化又は検出するのに効果的な量でなければならな
い。好ましくは、１回の投与量は、患者一人当たり抗体
−マーカー接合体0.1〜200mgの間であろう。
抗体に接合できる画像診断マーカーは当業者に周知で
あり、例えば、上記で取り上げた文献に記載されている
ようなガンマスキャナー又は手持ガンマプローブ又はポ
シトロン・エミッション・トモグラフイー（Positron E
mission Tomography）等を用いた診断イメージングによ
り検出され得る物質、並びに上記で取り上げた文献に記
載されているような分光計を用いた核磁気共鳴分光分析
計により検出され得る物質を含む。
ガンマスキャナー等を用いて検出できる物質の適当な
例は、例えば、125I,131I,123I,111In,105Rh,153Sm,67C
u,67Ga,166Ho,177Lu,186Re,188Re及び99mTcのような放
射性核種を含む。125I,123I,153Sm及び99mTcは、エネル
ギーが低いうえに、遠距離検出に適当であるため好まし
い。
核磁気共鳴分光計等を使って検地できる物質の例は、
ガドリニウム（Gd）である。
生体内（in vivo）ガン治療 この方法では、ガン腫部位に抗体−治療薬接合体を供
給し、それによってガン腫組織を直接治療薬に暴露する
ことができる。
本発明の抗体、それの免疫反応性断片または組換え体
は、ヒトのガン腫またはそれの転移の生体内治療のため
に医薬上有効な量において投与することができる。「医
薬上有効な量」の抗体、それの免疫反応性断片または組
換え体とは、医薬組成物中の前記抗体の量が、前記抗体
が特異的親和性を有する抗原との効果的な結合を達成す
るのに十分であることを意味する。医薬組成物は一回ま
たは複数回投薬において投与することができる。
抗体、それの免疫反応性断片または組換え体と治療薬
との接合体の調製および投与方法は、当業者に周知であ
るかまたは容易に決定され得る。また、適当な用量は患
者の年令および体重に依存し、そして使用する治療薬は
当業者に周知であるかまたは容易に決定され得る。代表
的なプロトコールは下記の記載の参考文献中に記載され
ている。
治療において使用され得る抗体−治療薬接合体の例は
次のものを含む：（１）放射性核種、例えば131I,90Y,
105Rh,47Sc,67Cu,212Bi,211At,67Ga,125I,186Re,188Re,
177Lu,99mTc,153Sm,123Iおよび111Inと結合された抗体
であって、例えばGoldenberg,D.M.ら、Cancer Res. 4
1,4354-4360（1981）;Carrasquillo,J.A.ら、Cancer Tr
eat.Rep. 68,317-328（1984）;Zalcberg,J.R.ら、J.Na
tl.Cancer Inst. 72,697-704（1984）;Jones,D.H.ら、
Int.J.Cancer 35,715-720（1985）;Lange,P.H.ら、Sur
gery 98,143-150（1985）;Kaltovich,F.A.ら、J.Nucl.
Med. 27,897（1986）,Order,S.E.ら、Int.J.Radiothe
r.Oncol.Biol.Pbys. 8,259-261（1982）,Courtenay-Lu
ck,N.ら、Lancet 1,1441-1443（1984）およびEttinge
r,D.S.ら、Cancer Treat.Rep. 66,289-297（1982）に
記載されたもの：（２）薬剤または生体応答調節剤、例
えばメトトレキセート、アドリアマイシン、およびリン
ホカイン、例えばインターフェロン、と結合された抗体
であって、例えば、Chabner,B.ら、Cancer,Principles
and Practice of Oncology,Philadelphia,PA,J.B.Lippi
ncott Co.Vol.1,pp.290-328（1985）;Oldham,R.K.ら、C
ancer,Princiles and Practice of Oncology,Philadelp
hia,PA,J.B.Lippincott Co.,Vol.2,pp.2223-2245（198
5）;Deguchi,T.ら、Cancer Res. 46,3751-3755（198
6）;Deguchi,T.ら、Fed.Proc. 44,1684（1985）;Emble
ton,M.J.ら、Br.J.Cancer 49,559-565（1984）およびP
imm,M.V.ら、Cancer Immunol.Immunother.12,125-134
（1982）に記載されたもの；（３）毒素と結合された抗
体であって、例えば、Uhr,J.W.ら、Monoclonal Antibod
ies and Cancer,Academic Press,Inc.,pp.85-98（198
3）,Vitetta,E.S.ら、Biotechnology and Bio.Frontier
s,Ed.P.H.Abelson,pp.73-85（1984）およびVitetta,E.
S.ら、Sci.,219,644-650（1983）に記載されたもの；
（４）ヘテロ機能性抗体、例えば、ガン腫細胞とエフェ
クター細胞、例えばＴ細胞などのキラー細胞との両方に
複合体が結合するように、別の抗体と結合または連結さ
れた抗体であって、例えば、Perez,P.ら、J.Exper.Med.
163,166-178（1986）；およびLau,M.A.ら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.(USA)82,8648-8652（1985）に記載されたも
の；並びに（５）生来の抗体、即ち接合または複合体形
成されていない抗体であって、例えば、Herlyn,D.ら、P
roc.Natl.Acad.Sci.,(USA)79,4761-4765（1982）;Schul
z,G.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,(USA)80,5407-5411（198
3）;Capone,P.M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,(USA)80,732
8-7332（1983）;Sears,H.F.ら、Cancer Res. 45,5910-
5913（1985）;Nepom.G.T.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,(US
A)81,2864-2867（1984）;Koprowski,H.ら、Proc.Natl.A
cad.Sci.,(USA)81,216-219（1984）；およびHoughton,
A.N.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,(USA)82,1242-1246（198
5）に記載されたもの。
上述のような抗体または抗体断片を所望の治療薬と結
合させる方法は、当業界において常用でありそして周知
である。例えば、その方法は上記の参照文献中に与えら
れている。
放射線免疫誘導外科学 抗体、それの免疫反応性断片または組換え体は、放射
線免疫誘導外科学（RIGS）にとって重要である。RIGS、
即ち手術内療法においては、腫瘍が局在定位されそして
切除される。画像診断マーカーで標識された抗体を患者
に注入し、そして結合した抗体を手動ガンマ検出プロー
ブ（GDP）により局在定位し、そして切除する。模範的
なGDPは、NeoprobeTM Corporation,Tampa,FLから市放さ
れているNeoprobeTMである。Martinら、「放射線免疫誘
導外科学:B72.3抗体を使った腫瘍の手術内検出に対する
新規アプローチ」、Amer.J.Surg. 156,386-392（198
8）;Martinら、「放射線免疫誘導外科学：結腸ガンにお
ける17-1A抗体の手術内利用」、Hybridoma 5,S97-S108
（1986）を参照のこと。
抗体−画像珍断マーカー接合体の投与および検出、並
びに画像診断マーカーと抗体との接合方法は、例えば上
述したような当業者に周知である方法により達成される
か、または容易に決定される。
用量は患者の年令および体重に依存して異なることが
できるが、一般に患者あたり0.1〜200mgの抗体−マーカ
ー接合体の一回量が十分である。
次の非限定的実施例は、本発明の抗体をコードするキ
メラDNA配列の作製および発現の単なる説明に過ぎな
い。特に指定しない限り、温度は全て摂氏度である。特
に指定しない限り、百分率は全て重量百分率である。
実施例 マウス定常領域の置換 CC抗体はマウス由来であり、これはヒト定常領域が有
するエフェクター機能を発揮することがほとんど不可能
である。
従って、次の実施例において、重鎖および軽鎖の定常
領域を遺伝子的に除去し、そしてそれらをヒトの等価物
で置き換えることにより、特定の抗体を「ヒト化」す
る。
マウス軽鎖定常領域遺伝子をヒトカッパ（κ）遺伝子
で置換し、そしてマウス重鎖遺伝子を４つのヒトガンマ
イソタイプ（γ1,γ2,γ３およびγ４）の各々で置換し
た。それら４つのガンマイソタイプの各々は、固有の生
物学性質を有する。一般的概観については、「ヒトIgG
サブクラス」、Hamilton,R.G.（1989）Doc.No.CB0051-2
89,Calbiochem Corporationを参照のこと。
重鎖および軽鎖可変領域の調製 CC49軽鎖の単離 CC49ハイブリドーマ細胞は、IgG1イソタイプ重鎖およ
びカッパ軽鎖を有する抗体を分泌する。CC49ハイブリド
ーマ細胞、Balb/Cマウス腎臓細胞およびNSI形質細胞腰
細胞からの全DNAをCell,24,353-356（1981）に記載の方
法に従って単離した。
一般に、各細胞系から抽出されたDNA約10〜20μｇ
を、適当な反応緩衝液を含む50〜100μｌの反応混合物
中で80単位のBamHI,EcoRI,HindIII,Spe I,XbaI,SacI,Bg
l IIおよびPst Iで37℃にて一晩完全消化した。
次いで、各細胞系からの全抽出DNAを、E.M.Southern
〔J.Mol.Biol. 98,503-517（1975）〕により開発され
たサザンハイブリダイゼーション技術にかけた。0.8％
アガロースゲル上での電気泳動により、それらのサイズ
に基づいてDNA断片を分画した。二本鎖DNA断片をアルカ
リ溶液中で一本鎖DNA断片に変性せしめ、次いでニトロ
セルロース濾紙をゲルと密着させて置き、高塩濃度溶液
の存在下で変性DNAセグメントを濾紙に移行せしめた。
ハイブリダイゼーションは、プローブとして、ランダ
ムプライミングされた［32P］−標識Ｌ鎖を使って行っ
た。
より詳しくは、プローブはマウスJL領域（J1-J5）を
コードするエクソンを含む1.71キロ塩基対（kbp）のHin
dIII-PstＩ断片であり、プラスミドpGD1から単離され
た。このプローブ断片のヌクレオチド配列は第７図に与
えられている。このプラスミドは、「リンパ系細胞抽出
物による免疫グロブリン遺伝子セグメントの部位特異的
開裂」、Agostaroら、Can.J.Biochem.Cell Biol. 63,9
69-976（1985）中に記載されている。このプラスミドは
Nobumichi HozumiおよびJohn Roder,Mt.Sinai Research
Institute,Toronto,Ontario,Canadaにより提供され
た。
プローブを放射能標識するために、Amersham,Arlingt
on Heights,IL,USAからα‐［32P］‐dCTPを入手し、そ
してPharmacia,Piscataway,NJ.USAからランダムプラン
ミングキットを入手した。
サザントランスファーにおけるシグナルを、Kodak X-
OMATTM ARフィルムを使ったオートラジオグラフィーに
より可視化した。明らかに再配列されたバントは全く観
察されなかった。従って、標準と比較して、HindIIIで
消化されたCC49DNAについてのオートラジオグラム上に
全くユニークなバンドが検出されなかった。しかしなが
ら、Ｌ鎖についての再配列されたバンドが、CC49のHind
III消化されたDNAにおいてマウス腎臓細胞DNA（ジャー
ムラインDNAを表わす）のHindIII消化物から生じるバン
ドと平行して移動するバンドにより遮蔽されることを、
サザンのデータから除外することはできなかった。実際
に、事実そうであることがわかった。
マウスVL遺伝子を含むプラスミドの調製 自己切除可能なラムダベースの挿入クローニングベク
ターであるLAMBDA-ZAPTMをStratagene Co.,La Jolla,C
A,USAから購入した。LAMBDA-ZAPTMは、1987年Stratagen
eカタログの20-21頁に記載されている。LAMBDA-ZAPTMの
粘着（cos）末端を、製造業者のプロトコールに従って
一晩連結した。
20μｇの連結したLAHBDA-ZAPTMを、New England Biol
abs,Inc.から購人した５μｌ（15単位）のSpe Iで消化
した。55分の消化後、更に６単位のSpe Iを添加した。7
0分後、Stratageneのプロトコールに従ってフェノール
抽出により反応を停止しそしてエタノール沈澱を行っ
た。
Spe I制限酵素での消化は、両端に「粘着末端」の生
成をもたらす。それらの粘着末端をT4DNAポリメラーゼ
で変更し、半分フィルインされたSpe I粘着末端、例え
ば５′ACT/3′TCATGを作製した。半分のフィルイン反応
を行うために、エタノール沈澱で得られたDNAペレット
を８μｌの水に溶解した。これに２μｌの10mM dTTP,2
μｌの10mM dCTP,2μｌのStratageneの10×リガーゼ緩
衝液、４μｌの脱イオン化蒸留水、および２μｌのクレ
ノウ断片〔Bethesda Research Laboratories（BRL）〕
を添加した。周囲温度にて30分間反応を行った。DNAポ
リメラーゼを65℃で10分間不活性化することにより反応
を止めた。
160μｇの全CC49ハイブリドーマDNA（マウス軽鎖プロ
モーター並びにＬおよびVJエクソンを含む）をHindIII
で完全消化した。約1kb〜約20kbの断片を0.8％アガロー
スゲルから切り出した。BIO 101（La Jolla,CA,USA）か
ら市取されているGENECLEANTMを使ってDNAを精製した。
全CC49ハイブリドーマDNAのHindIII消化断片を、LAMB
DA-ZAPTMのSpe I断片と同様にして半分フィルインし
た。ただし、dATPとdGTPを使用した。半分フィルインさ
れたHindIII消化断片は、５′AGCTT/3′GAA粘着末端を
生じ、これは上記のSpe Iの半分フィルインされたLAMBD
A-ZAPTM断片と適合性である。
フェノール抽出とエタノール沈澱の後、Maniatisの教
示に従って、全CC49ハイブリドーマHindIII改変DNA断片
およびLAMBDA-ZAPTM Spe I改変DNA断片をT4 DNAリガー
ゼにより連結した。連結反応は、次のものを含む6.1μ
ｌの連結混合物を使って行った:3μｌの溶液中の約0.2
μｇの全CC49ハイブリド一マHindIII改変DNA、１μｌの
溶液中の約１μｇのLAMBDA-ZAPTM Spe I改変DNA、0.6
μｌのStratageneの10×リガーゼ緩衝液、0.5μｌの10m
M ATP、および１μｌのStratageneリガーゼ。これを水
浴中で一晩インキュベートし、そして温度を約18℃から
約４℃に大幅に下げた。この連結はHindIIIおよびSpe I
部位を両方とも除去した。
連結混合物のゲノムライブラリーをStratageneのプロ
トコールに従って作製した。簡単に言えば、上記で生成
された連結混合物２μｌを、製造業者の指示に従ってSt
ratageneのGigapack Goldパッケージングシステムにお
いて使用した。プレートあたり50,000プラークの密度を
有する15枚の150mmプレートを、製造業者の指示に従っ
て、Schleicher-Schuell,Keene,NE,USAから入手したニ
トロセルロース濾紙へのハイブリダイゼーションによ
り、陽性のクローンについてスクリーニングした。pGD1
から誘導した［32P］−ランダム標識プローブをハイブ
リダイゼーションに使用した。２つの陽性クローンが得
られた。
各クローンをプラーク精製し、そしてStratageneの自
己切除プロトコールを使って、CC49L鎖可変領域を含むL
AMBDA-ZAPTMの組換えプラスミド（ファージミド）を得
た。得られた組換えプラスミドのベクター部分はpBLUES
CRIPT SK（−）と呼称され、そして1987年Stratageneカ
タログに記載されたような2964bpから成る。pBLUESCRIP
T SK（−）のプラスミド地図は第８図に示される。
２つの陽性クローンからのDNAを部分的に配列決定す
ると、両者とも同じであった。pRL101と命名された１つ
のクローンを更なる研究に使用した。
CC49軽鎖の制限マッピング pRL101は7.61kbであり、そしてDNA挿入断片のサイズ
は制限酵素マッピングにより4.65kbであることが決定さ
れた。pRL101のプラスミド地図は第９図に示される。pR
L101中のCC49L鎖ゲノムDNA挿入断片の制限酵素地図は第
10図に示される。
CC83軽鎖可変領域の単離 CC83軽鎖を単離するのに使われる方法は、本質的には
CC49重鎖を単離するのに使われたものであった。
ただし、［32P］でランダム標識されたpGD1由来の1.7
1kbのHindIII-Pst I断片をプローブとして使って、上述
のようにして７×105プラークを含むゲノムライブラリ
ーをスクリーニングした。１つの陽性クローンが得られ
た。この陽性クローンをpRL200と命名した。
CC83軽鎖の制限マッピング pRL200は7.44kbであり、そしてDNA挿入断片のサイズ
は制限酵素マッピングにより4.48kbであることが決定さ
れた。pRL200のプラスミド地図は第11図に示される。pR
L200中のCC83L鎖ゲノムDNA挿入断片の制限酵素地図は第
12図に示される。
CC49重鎖可変領域の単離 CC49重鎖を単離するのに使用される方法は、本質的に
はCC49軽鎖を単離するのに使用されたものであり、同じ
CC49HindIII改変DNAのスクリーニングを含んだ。
ラリブラリーをスクリーニングするめに使用されるハ
イブリダイゼーションプローブは、pNP9から作製され、
そしてCC49免疫グロブリン重鎖のJH３およびJH４のコー
ドエクソンを含有する1.98kbpのEcoRI-BamHI断片を含
む。このプローブ断片のヌクレオチド配列は第13図に与
えられる。プラスミドはDr.Nobumichi HozumiおよびDr.
John Roder,Mt.Sinai Research Institute,Toronto,Ont
ario,Canadaにより提供された。
9.5×105プラークを含むゲノムライブラリーをスクリ
ーニングし、それから１つの陽性クローンが得られた。
この陽性クローンをpHH49と命名した。
CC49重鎖の制限マッピング pHH49は約7.0kbであり、そしてDNA挿入断片のサイズ
は制限酵素マッピングにより約4.0kbであることが決定
された。pHH49のプラスミド地図は第14図に示される。
CC83重鎖可変領域の単離 CC83重鎖を単離するのに使われる方法は、本質的には
CC49重鎖を単離するのに使われたものであった。
ただし、約13μｇの連結したLAMBDA-ZAPTMベクターDN
Aを、New England Biolabs,Inc.,から購入した12単位の
Spe Iより、全体で100μｌの適当な緩衝液中で消化し
た。LAMBDA-ZAPTMは37℃で一時間消化した。Stratagene
のプロトコールに従って反応混合物をフェノール抽出し
そしてエタノール沈澱せしめた。Spe Iで消化されたLAM
BDA-ZAPTMを、Maniatisに記載の方法に従って、ただし4
0倍過剰の仔ウシ陽アルカリホスファターゼ（Boehringe
r Mannheim,Indianapolis,IN,USA）を使って、脱リン酸
した。
CC83からのDNAをSpe Iで完全消化した。Maniatisによ
り記載されたような電気溶出により、0.8％アガロース
ゲル切片から約3kb〜約40kbの断片を単離し、そして脱
リン酸されたSpe I切断LAMBDA-ZAPTMベクターと連結せ
しめた。
pNP9から作製されたプローブ（この配列は第13図に示
される）を使って、５×105プラークを含むゲノムライ
ブラリーをスクリーニングした。１つの陽性クローンが
得られた。この陽性クローンをpHS83と命名した。
CC83軽鎖の制限マッピング pHS83は7.95kbであり、そしてDNA挿入断片のサイズは
制限酵素マッピングにより約5kbであることが決定され
た。pHS83のプラスミド地図は第15図に示される。
CC46,CC49,CC83およびCC92 mRNAの配列決定 −70℃で凍結された約１×107個のCC49細胞からの全R
NAを、本質的にはManiatisにより報告されたようにして
抽出した。ただし、4Mグアニジウムイソチオシアネート
および2.5Mクエン酸ナトリウム（pH7.0）、並びに31,00
0rpmで遠心するSW40Tiローターを使用した。
全部で2.7mgのCC49 RNAが抽出された。遠心後、Colla
borative Research Inc.,Bedford,MA,USAから入手した
タイプ３のオリゴ（dT）−セルロースを使ったオリゴ
（dT）−セルロースクロマトグラフィーにより、約1.68
mgのRNAからポリＡ＋mRNAを精製した。この方法は、Avi
vおよびLeder,Proc.Nat'1.Acad.Sci.(USA) 69,1408（1
972）により記載されたものと同様である。1.68mgのRNA
から全部で50.24μｇのポリＡ十mRNAが得られた。
約１×107個の細胞から全部で3.82mgのCC83 RNAが単
離された。1.91mgの全RNAから全部で54.6μｇのポリＡ
＋mRNAが単離された。
約2.6×108個の細胞から全部で0.814mgのCC92 RNAが
単離された。0.814mgの全RNAから全部で41.88μｇのポ
リＡ＋RNAが単離された。
約2.89×108個の細胞から全部で1.7mgのCC46 RNAが単
離された。1.7mgの全RNAから全部で68.8gμｇのポリＡ
＋RNAが単離された。
Applied Biosystems〔Applied Biosystems（ABI）,Fo
ster City,CA,USA〕のモデル380A DNA合成装置を使っ
て、ABIにより指示されたようなホスホルアミダイドに
基づく化学により、合成オリゴヌクレオチドプライマー
を合成した。製造業者により指示されたようにして、7M
尿素を含む20％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動
後、オリゴヌクレオチドを精製した。オリゴヌクレオチ
ド濃度は260nmの光学濃度により分光光度的に決定し
た。この場合、10D260nm単位は33μg/mlの一本鎖DNAに
等しい。
mRNA配列決定用に次のようなオリゴヌクレオチドプラ
イマーを合成した： （１）CC49,CC83およびCC92軽鎖については、マウス免
疫グロブリンκ鎖の定常領域の５′末端のコード配列と
相補的である22マーのKL（−）： を使って、軽鎖可変領域の３′‐mRNA配列のほとんどを
決定した。
更に、CC49軽鎖については、17マーの49FRl（−）： を使って残りの配列を決定した。
更に、CC83軽鎖については、24マーのJ4（−）： および更に17マーの83L CDR2（−）： を使って残りの配列を決定した。
更に、CC92軽鎖については、J5（−）： を使って残りの配列を決定した。
CC46,CC49,CC83およびCC92γ１重鎖については、マウ
スγ１重鎖定常領域の５′末端のコード配列と相補的で
ある24マーのCH1（‐）： を使った。CH1（−）24マーを使った重鎖可変領域の大
部分の３′mRNA配列を決定した。
更に、CC49重鎖については、JR4（‐）‐20マー： を使って残りの配列を決定した。
更に、CC83重鎖については、J82（‐）‐16マー： を使って残りの配列を決定した。
更に、CC92重鎖およびB72.3重鎖については、B72.3/C
C92 HC-20マー： を使って残りの配列を決定した。
Jah GelliebterによりBRL FOCUS 9,1（1987）におい
て概説されるようにして、次の操作を行った。
次のようにしてオリゴヌクレオチドプライマーを末端
標識した。100ngのオリゴヌクレオチドを、13μｌの容
量において50mMTris-HCl（pH8）、10mM MgCI2、5mMジチ
オトレイトール、1mMスペルミジン、100μCi（γ−
32P）ATP（Amersham,5000Ci/ミリモル）および７単位の
T4ポリヌクレオチドキナーゼと混合した。反応は37℃で
30分間進行させ、次いで65℃で５分間加熱してキナーゼ
を不活性化し、そして７μｌの水を添加して5ng/μｌの
濃度にした。標識されたプライマーは使用まで−20℃で
保存した。
それぞれCC49,CC83,CC92またはCC46のポリ(A)+mRNA約
13μｇを含む個々の試料を、アニーリング緩衝液〔10mM
Tris-HCl（pH8.3）および250mM KCl〕10μｌ中に再懸
濁した。
各mRNA試料に5ng試料の末端標識されたオリゴヌクレ
オチドプライマーを添加し、80℃で３分間加熱し、そし
てKL（−）については61℃で、CH1（−）オリゴヌクレ
オチドについては65℃で45分間アニーリングした。各mR
NA配列決定反応のために６単位のレベルでAMV逆転写酵
素（Boebringer Mannheim）を使った。配列決定の残り
は、BRL FOCUS 9,1（1987）に記載のようにして行っ
た。
最初の配列データは、重鎖および軽鎖が次の通りに再
配列されたことを示した:J5を使ったCC49κ軽鎖；JH４
を使ったCC49γ１重鎖。J4を使ったCC83軽鎖；JH２を使
ったCC83γ１。J2を使ったCC46κ軽鎖；JH３を使ったCC
46重鎖。J5を使ったCC92軽鎖；JH２を使ったCC92γ１。
第16図は、CC49VHのヌクレオチド配列を示し、下線を
引いたセグメントは、mRNAにおいてオリゴヌクレオチド
プライマーを使って誘導された配列を示す。
第17図は、CC83 VHのヌクレオチド配列を示し、下線
を引いたセグメントは、mRNAにおいてオリゴヌクレオチ
ドプライマーを使って誘導された配列を示す。
第２図に示されるCC46 VHおよびCC49 VHの完全なヌク
レオチド配列は、mRNAにおいてオリゴヌクレオチドプラ
イマーを使って誘導された。
第4a図は、CC49 VLのヌクレオチド配列を示し、下線
を付したセグメントは、オリゴヌクレオチドプライマー
を使ってmRNAにおいて誘導された配列を示す。
第5a図は、CC83 VLのヌクレオチド配列を示し、下線
を付したセグメントは、オリゴヌクレオチドプライマー
を使ってmRNAにおいて誘導された配列を示す。
第６図に示されるCC92 VLの完全なヌクレオチド配列
は、オリゴヌクレオチドプライマーを使ってmRNAにおい
て誘導された。
タンパク質配列 精製されたマウスCC49およびCC83免疫グロブリン分子
を、Ｎ−末端アミノ酸配列分析のためにミシガン大学タ
ンパク質配列決定施設のDr.George Tarrに送った。Dr.T
arrは、「手動エドマン配列決定システム」、Microchar
acterization of Peptides:A Practical Mannual〔John
E.Shively編、Humana Press,Inc.,Clifton,N.J.,pp155
-194（1986）〕においてTarr,G.E.により変形されたエ
ドマン分解法を使用した。簡単に言えば、Dr.Tarrは免
疫グロブリン分子を還元アルキル化し、免疫グロブリン
分子の軽鎖および重鎖を逆相HPLCにより分離した。
第4b図はCC49 VLについてのアミノ酸配列を示し、成
熟CC49 VLの最初の24アミノ酸についてのアミノ酸配列
決定の結果に下線を引いた。第5b図はCC83 VLについて
のアミノ酸配列を示し、成熟CC83 VLの最初の51アミノ
酸についてのアミノ酸配列決定の結果に下線を引いた。
CC83軽鎖においてASN-20は決定できなかった。というの
は、下記のPNGアーゼＦ実験において示されるように、
この位置にＮ−結合した炭水化物残基が存在するためで
ある。Asn-Ile-Thr配列は、Asnへの炭水化物結合のため
の共通配列Asn-X-Thr/Serに相当する。
免疫グロブリンCC49およびCC83の重鎖はＮ末端でブロ
ックされており、従ってアミノ酸配列決定に利用できな
いので、生来の糖ペプチドを臭化シアン（CNBr）で処理
し、メチオニン残基のところで開裂せしめた。開裂で生
成した断片を逆相HPLCにより精製した。このCNBr断片に
ついてＮ末端アミノ酸配列決定を行った。
１つのCC49 VH CNBrペプチド断片のアミノ酸配列決定
の結果を、第18図において下線を引いた残基として示
す。１つのCC49 VH CNBrペプチド断片のアミノ酸決定の
結果を、第19図において下線を引いた残基として示す。
CC49と同様に、その他全てのペプチド配列はマウスγ１
の定常領域から誘導されたCNBr断片と一致する。
CC83L鎖上のＮ−結合した炭水化物の決定 この実験は、おそらくASN-20においてCC83軽鎖に結合
したＮ−結合炭水化物があることを確かめるために行っ
た（第5b図参照）。酵素グリコペプチダーゼＦ（PNGア
ーゼＦ）はフラボバクテリウム・メニンゴセプチカム
（Flavobacteriummeningosepticum）の培養濾液から単
離され〔Tarentino,A.Lら、Biochmistry 24,4665-467
1〕、そしてこれはASNにＮ−結合した高マンノースおよ
び／または二触角状の（biantennary）複合糖質を開裂
し、遊離の炭水化物構造およびそれが結合していたASN
からASP残基を生成せしめる。同一ペプチドのグリコシ
ル化形と非グリコシル化形の間の分子量の相違は、SDS-
PAGEにより決定することができる。
精製したマウス抗体CC49,CC83およびCC11F（ab′）2
（正の対照）12μｇについての反応は、PNGアーゼＦ（B
oehringer Mannheim,Indianapolis,IN,USA）を含有する
かまたは含有しないで40μｌの最終水性反応液量で行っ
た。各反応混合物に４μｌの10×緩衝液（1Mリン酸カリ
ウム、0.1M EDTA二ナトリウム、pH7.4）を添加した。
「PNGアーゼＦ含有」と指示した試験管には7.5μｌのPN
GアーゼＦを更に添加し、そして全試験管を37℃で１時
間インキュベートした。この反応試験管に、β−メルカ
プトエタノールを含有するLaemmliの２×試料希釈緩衝
液40μｌを添加した。10％SDSポリアクリルアミド上で
電気泳動し、ゲルをクーマシーブリリアントブル−Ｒ−
250で染色し、次いで脱色した。その結果を第20図に示
す。レーン２において示されるように、RNGアーゼＦで
処理されたCC33試料には新しいバンド（＊）が現われる
が、未処理のCC83試料（レーン３）には現われない。こ
の新しいバンドは、生来の軽鎖のバンドよりも小さい約
2,000-3,000の分子量であり、これはＮ−結合した炭水
化物成分の除去を示す。CC83軽鎖の唯一の共通グリコシ
ル化部位はASN20のところであり、よって推論の結果、
これが実際のグリコシル化部位であり、そしてCC83軽鎖
のＮ−末端配列分析時に何故ASNと判明しなかったが推
測される。CC49軽鎖はPNGアーゼで処理した時に成分が
変化しなかった（レーン６）が、正の対照として働くCC
11F（ab′）2重鎖断片については新しいバンドが観察さ
れた（レーン４の＊印）。CC11重鎖のmRNA配列データ
は、Ｖ領域中の共通グリコシル化部位を示す（データは
示してない）。標準（レーン１）は、ウシ血清アルブミ
ン（BSA）MW68,000およびダイズトリプシンインヒビタ
ー（STI）MW21,500である。
DNA配列 プラスミドDNAは、United States Biochemical（US
B）,Cleveland,OH,USAから入手したSequenase DNA配列
決定キットを使って直接配列決定した。USBのプロトコ
ールに従って二本鎖DNAを配列決定した。各可変領域のD
NAは、各々が生産的に再配列された重鎖または軽鎖道伝
子それぞれに特異的であることがmRNA配列情報から決定
されたJHまたはJLオリゴを使って配列決定した。
最初の配列を決定した後、追加のプライマーを使って
配列を更に拡張した。追加のプライマーは、前に作製し
た配列から推測される情報を使って合成した。
上述の方法を使って、CC49およびCC83の完全な重鎖可
変領域エクソンと軽鎖可変領域エクソンが得られた。該
DNA配列を編集し、そして日立のDNA配列分析ソフトウエ
アプログラムDNASYSTMを使って分析した。
DNA配列分析のために次のオリゴヌクレオチドプライ
マーを作製した： （１）両者の軽鎖については、Ｃκイントロン（−）： （２）CC49軽鎖については、CC49 FRI（＋）： およびJK5（−）−23マー： （３）CC83軽鎖については、CC83 CDR2（−）： CC83 Lイントロン（−）： およびJK4（−）−24マー： CC49VLおよびCC83VLの完全ヌクレオチド配列は、それぞ
れ第4a図および第5a図に示される。
CC49重鎖については、JH４（−）−20マー： およびJH４イントロン（−）： CC83重鎖については、JH２（−）−16マー： およびJH２イントロン（−）： その後、次の配列を使って各重鎖の配列決定を拡張し
た： CC49/83 HC/5′（＋）： およびCC49/83 H鎖FRI（−）： CC49 VHおよびCC83 VHについての完全ヌクレオチド配
列は第２図に示される。
特徴付けられたmRNA配列と特徴付けられたDNA配列と
の比較、特徴付けられたアミノ酸配列とDNA配列から推
定されるアミノ酸配列との比較を行った。それらの比較
に基づいて、CC49およびCC83の重鎖および軽鎖可変領域
をコードする正しいDNA配列を含むプラスミドクローン
を同定した。
CC49およびCC83の重鎖可変領域のヌクレオチド配列か
ら推定されるアミノ酸配列は、第２図に示されるよう
に、フレームワーク領域並びに超可変領域１および２に
渡り広範な配列相同性を示す。超可変領域３は、異なる
ＤおよびJH配列によるVH領域の組換え、即ちJH４を使っ
たCC49γ１重鎖、およびJH２を使ったCC83γ１による組
換えのため、二者の間で全く異なる。
CC49およびCC83重鎖可変領域遺伝子中の５′からコー
ド領域までの広範なDNA配列相同性は、２つの重鎖可変
領域遺伝子が同じジャームラインエクソンに由来するこ
とを示す。
CC46,CC49,CC83およびCC92の重鎖に対するジャームラ
イン前駆体遺伝子であるVHαTAGの単離 CC46,CC49,CC83およびCC92の重鎖可変領域に対するジ
ャームライン前駆体遺伝子を単離するのに使用する方法
は、本質的には、CC49重鎖可変領域を単離するのに使用
したものであった。ただし、LAMBDA−ZAPTMライブラリ
ーを作製するのに用いるDNAは、無意味なハイブリドー
マ細胞系（即ち、感知できるほどにはTAG72に結合しな
い抗体を産生する細胞系）からのものであった。約900,
000プラークを含むゲノムライブラリーをスクリーニン
グし、そこから１つの陽性クローンを単離した。この陽
性クローンをpVHαTAGと命名した。pVHαTAGは約5.2kb
であり、そして制限酵素マッピングによりDNA挿入断片
のサイズが約2.2kbであることが決定された。
VHTAGのDNA配列 VHαTAGのDNA配列を決定するために、次のオリゴヌク
レオチドプライマーを使った： VHαTAGの完全ヌクレオチド配列は第２図に示され
る。
ヒト重鎖定常領域遺伝子の単離 種々の重鎖ヒト定常領域を含むプラスミド構成物（ｐ
γl,pγ2,pγ３およびｐγ４）は、National Cancer In
stitute,Bethesda,MarylandのDr.Ilan.R.Kirschにより
提供された。
それらの遺伝子に関して制限酵素マッピングを行な
い、それらの正体を確かめた。ヒト定常領域についての
制限地図は第21図に示される。
キメラ軽鎖 マウスCC49V領域 J5とＣκの間のマウスイントロン領域中に存在するCC
49軽鎖ゲノムDNAのHindIII部位〔Max,Edward E.ら、J.B
iol.Chem. 256,5116（198l）参照〕は、半分フィルイ
ンされたHindIII部位をLAMBDA-ZAPTMベクター中の半分
フィルインされたSpe I部位と連結するクローニング操
作において消失した。プラスミドpRL101（第９図）はこ
の変更物を有した。HindIII-BamHIヒトジャームライン
κ軽鎖DNA断片〔Hieter,P.ら、J.Biol.Chem. 257,1516
（1982）参照〕を直接マウス可変領域と連結できるよう
にするために、上述の段階において要約したようにして
イントロンHindIII部位を再生せしめた。当業者によく
知られておりそしてManiatisのようなマニュアルにおい
て見つけることができる標準的な分子生物学技術を使っ
て、全ての段階を行った。
上述のpRL101から1.69kbのBam HI-Pst I断片を単離す
る。上述のpBluescript SK（−）（Stratageneから購
入）から2.96kbのBam HI-Pst I断片を単離する。この二
断片を連結し、そして下記のpRL103を単離する。
プラスミドpGDl（上述）をPstＩおよびHindIII制限酵
素で消化し、必要な1.03kbのイントロン含有断片を得、
そしてpREL103もPst IおよびHindIII制限酵素で消化
し、ポリリンカー中のDNAの小断片を除去した。
得られた二断片をT4 DNAリガーゼを用いて連結し、pR
L104と命名した5.68kbのプラスミドを作製した。pGDlお
よびpRL104の部分制限地図は下記に示される。
ヒトＣκ領域 プラスミドphum CκをDr.John Roder.Mt Sinai Resea
rch Institute,Toronto,Ontario,Canadaから入手した。
このプラスミドはpBR322由来であり、ヒトＣκエクソン
を含む12kbのBam Hl断片がその中に挿入されたものであ
る。12kbのBam HI断片の制限地図は下記に示される〔He
iter.p.ら、J.Biol.Chem.257,1516（1982）から〕。
プラスミドphum CκをHindIIIおよびBamHI制限酵素で
消化し、ヒトＣκエクソンを含む5.0kb断片を得た。pEL
104をFsp IおよびHindIII制限酵素で消化し、CC49のマ
ウス軽鎖可変エクソンを含む4.2kbの断片を得た。
得られた２断片をT4 DNAリガーゼにより連結し、生成
した断片混合物の中から9.2kbの断片を得た。この混合
物をBamHIで消化し、BamHI粘着末端を有する7.7kbのBam
HI CC49 L鎖キメラ構成物を得た。これは、マウス可変
領域エクソンとヒト定常領域（κ）エクソンの両方を含
む。それらの構成物は、ヒトエンハンサー配列とマウス
プロモーター配列を使用する。
マウス軽鎖可変領域エクソン（ＬおよびVJ）とヒト定
常領域カッパ（κ）エクソンの両方を含むキメラBamHI
断片を、選択可能なマーカー遺伝子neoを含むpBR322由
来のプラスミドであるpSV2neoプラスミド（5.6kb）（AT
CCから入手）とBamHI部位で連結せしめた。活性neo遺伝
子の存在は、細胞をG418とも称されるネオマイシン様薬
剤ゲネチシンによる増殖阻害に対して耐性にする。
下記に示されるように、両方向においてキメラBamHI
断片をpSV2neo中に挿入した。neo遺伝子に関して、両方
の転写方向のキメラ軽鎖遺伝子を作製した。プラスミド
pSV2neoをBamHI部位のところで線状にし、仔ウシ腸アル
カリホスファターゼを使って（Maniatisにより記載され
た方法に従って）脱リン酸し（自己連結を防ぐため）、
そして上記からのキメラCC49 L鎖BamHI断片と連結せし
めた。
pRL105とpRL105においてneo遺伝子およびCC49キメラ
軽鎖の転写方向は矢印で示されている。pSV2neoに由来
する部分も示されている。それらのプラスミドを、大ス
ケールにおいて各プラスミドを複製するE.コリ（E. co
li）クローンの調製スケール（1.0l）培養物から精製し
た。精製したプラスミドを用いて後述のようにしてキメ
ラCC49軽鎖をSp2/0形質細胞腫細胞中に導入した。
マウスCC83VL領域およびヒトＣκ領域 CC83軽鎖のクローニング工程において失われたpRL200
中のHindIII部位を、CC49軽鎖キメラ構成物と同じ理由
で再生せしめた。再生は次のようにして行った。プラス
ミドpRL200をユニークNheＩ部位のところで線状化し、
そしてdNTPsとDNAポリメラーゼＩを用いてフィルインす
ることにより両端の粘着末端を平滑末端に変換した。こ
のフィルイン部位にBam HIリン酸化リンカー（New Engl
and Biolabsから購入）を連結した。新規プラスミドをp
RL201と命名し、そして下記に示す。
CC83軽鎖可変領域のゲノムDNAを含むpRL201からの2.5
kbのBam HI-Pst I断片を、CC49軽鎖構成物において上述
されておりそして既にHindIII含有イントロン断片を有
しているpRL104からの4kbのBamHI-Pst Iベクター断片と
連結せしめた。新規プラスミドをpRL202と命名し、そし
て下記に示す。
pRL202から約5.05kbのFsp I-HindIII断片を単離し、
そしてCC49軽鎖キメラ構成物について上述したヒトＣκ
含有5.0kbHindIII-Bam HI断片と連結せしめた。CC83軽
鎖ベクターの作製は、この時点からはCC49軽鎖について
実施されたものと同じ方式で行った。得られた8.5kbのB
am HI CC83軽鎖キメラ構成物をpSV2neo−Bam HI（ホス
ファターゼ処理したもの）と連結し、そして下記に示さ
れるように２つの可能な方向の挿入断片を有するプラス
ミドを得た。
neo遺伝子およびCC83キメラ軽鎖遺伝子の転写方向
は、pRL203およびpRL230において矢印により示されてい
る。それらのプラスミドは、該プラスミドの各々を複製
しているE.コリ（E.coli）クローンの市販インキュベー
ター中での分取スケール（1.0l）培養物から大スケール
で精製した。精製したプラスミドを用いて、後述のよう
にして、Sp2/0形質細胞腫細胞中にキメラCC83軽鎖を導
入した。
４つのキメラ軽鎖プラスミド構成物（pRL105,pRL150,
pRL203およびpRL230）の全てが、制限酵素AatIIでの消
化により線状化され得る。それらプラスミド中のAatII
部位は、キメラ軽鎖遺伝子または選択可能マーカー遺伝
子neoの発現にとって重要でない領域中にある。
キメラ重鎖 ヒトγ定常遺伝子エクソン キメラ重鎖構成物を運ぶのに使われるプラスミドベク
ターはpSV2gptと称し、MulliganおよびBerg,「キサンチ
ン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコー
ドしているE.コリ遺伝子を発現する動物細胞の選択」、
Proc.Nat'1.Acad.Sci(USA) 78（４）,2072-2076中に発
表されたものである。pSV2gptは、pBR322由来のプラス
ミドであり、選択可能マーカー遺伝子であるグアニンホ
スホリボシルトランスフェラーゼ（gpt）遺伝子を含
み、これはミコフェノール酸を含有する培地中での選択
的増殖のために使用することができる。ヒトＣγ1,Cγ
2,Cr3,Cγ４エクソンのための受容体としてpSV2gptを調
製するために、それをEco RIおよびBamHIで消化した。
消化されたDNAを４％ポリアクリルアミドゲル上で分画
し、そしてManiatisにおいて記載されたような電気溶出
によりゲルから4.5kbのベクター断片を回収した。この
線状化されたプラスミドをpSV2gpt/R/Bと命名し、その
プラスミド地図は第22図に示されている。それはEco RI
-BamHIで終わる断片を収容することができる。
ヒトIgG1定常領域断片上に存在する５′HindIII部位
を、pSV2gptのEco RI部位中へのクローニングに向ける
ためEco RI部位に変換した。γ1,γ2,γ３およびγ４に
ついては、pBR322ベクター中のEco RI部位を使用した。
Ｃγ１ ヒトＣγ１エクソンを含む断片は、ｐγ１をHindIII
で消化しそして線状化し、次いで全４種のdNTPおよびDN
Aポリメラーゼのクレノウ断片を使ってHindIII粘着末端
をフィルインし、HindIII末端を平滑にした。Eco RIリ
ンカーをこの平滑末端に連結せしめ、HindIII部位をEco
RIに置き換えた。次いでこの構成物をEco RIおよびBam
HIで消化し、Ｃγ１エクソンを含む7.8kb断片を遊離せ
しめた。この断片をＣγ1-7.8kbと命名した。
この断片を、pSV2-gpt/R/BのEco RI-BamHI部位中にそ
れぞれ連結した。このベクター（pSV2-gpt-γ1-7.2）デ
ザインは、いずれかのマウス重鎖可変領域遺伝子（Eco
RI末端を有する）をヒトIgG重鎖ベクターのEco RI中に
挿入することを可能にする。より詳しくは、125ngのヒ
トＣγ1-7.8kb断片を、400単位のT4 DNAリガーゼ（New
England Biolabsから入手）を使って、10μｌの容量に
おいて100ngの線状化したpSV2gpt2R/Bベクターと連結せ
しめた。この連結反応物を用いてInvitrogenのプロトコ
ールに従ってInvitrogen（San Diego,CA）からコンピテ
ントE.コリ（E.coli）DH1細胞を形質転換せしめた。得
られたプラスミドをpSV2gptγ1-7.8と命名した。pSV2gp
tγ1-7.8のプラスミド地図は第23図に示されている。
加えて、Ｃγｌエクソンを含むより短い別の断片を作
製した。7.8kbのＣγ１断片、4.5kbのpSV2-gpt/R/Bベク
ターおよび1.9kbのCC49可変領域を有する全サイズのキ
メラ重鎖ベクター（全体＝14.2kb）について、大きいサ
イズの7.8kb CrlEco RI-BamHI断片を縮小することを思
いついた。7.8kbのＣγ１のコード領域は、その断片の
５′末端の最初のわずか1/3を占めるにすぎない。
サイズ縮小は、BamHIリンカーの平滑末端付加によりP
vuII部位の下流をBamHI部位に変換することにより達成
された。ｐγ１をHindIIIで消化し、３′末端をフィル
インして平滑末端を作り、そして上述のようにEco RIリ
ンカーを付加することにより、ｐγ１のHindIII部位をE
co RI部位に変換した。次いでPvuIIで消化しそして平滑
PvuII末端に直接BamHIリンカーを連結することにより、
Pvu II部位の2.3kb下流をBamHI部位に変換した。この構
成物を次にEco RIおよびBamHIで消化し、Ｃγｌエクソ
ンを含む2.3kb断片を遊離せしめた。短縮されたEco RI-
BamHI断片（2.3kb）は、まだγ１エクソンと３′ポリア
デニル化配列を含んでいる。これは全ベクターサイズを
5.5kb減らし、全体の構成物をより扱いやすくする（全
体＝8.7kb）。
約200ngのヒトＣγ12.3kb断片を、400単位のT4 DNAリ
ガーゼ（New England Biolabs）を使って10μｌの容量
において100ngの線状化されたプラスミドpSV2gpt/R/Bベ
クターと連結せしめた。この連結混合物を用いてInvitr
ogenのプロトコールに従って、Invitrogenから入手した
凍結コンピテントE.コリ（E.coli）細胞を形質転換せし
めた。得られたプラスミドをpSV2gptγ1-2.3と命名し
た。pSV2gptγ1-2.3のプラスミド地図は第24図に示され
る。
他の３つのヒトIgG定常領域エクソンを含むDNA断片も
単離した。Ｃγ２エクソンはプラスミドｐγ２から4.0k
bのEco RI-BamHI断片として回収された。Ｃγ３エクソ
ンはプラスミドｐγ３から8.0kbのEco RI-BamHI断片と
して回収された。Ｃγ４エクソンはプラスミドｐγ４か
ら7.6kbのEco RI-BamHI断片として回収された。それら
の断片を、Ｃγ1-7.8およびＣγ1-2.3について記載した
ようにしてpSV2gpt/R/B中にそれぞれ連結せしめた。得
られたプラスミドのプラスミド地図は、pSV2gpt-γ２が
第25図に;pSV2gpt-γ３が第26図に；そしてpSV2gpt-γ
４が第27図に示されている。
重鎖キメラ構成物 完全なマウス重鎖可変領域／ヒトγ１定常領域キメラ
構成物は、マウス重鎖可変領域エクソンを含む断片を、
次のようにして、ヒトγ１定常領域を含むプラスミド中
に挿入することにより作製された。
まず、CC49およびCC83ハイブリドーマ細胞からのマウ
ス重鎖可変領域遺伝子を含むEco RI断片を、次のように
してγ１〜γ４含有pSV2-gptベクター（pSV2gpt-γ1;pS
V2gpt-γ2;pSV2gpt-γ3;pSV2gpt-γ４）の各々に連結せ
しめた。
CC49 14μｇのpHH49を50単位のEco RI（BRLから入手）で37
℃にて２時間消化することにより、CC49重鎖可変領域を
コードしている重鎖可変領域エクソンを含む断片を調製
した。消化物を４％ポリアクリルアミドゲル上で分画
し、そしてManiatisにより記載されたような電気溶出に
より、CC49の重鎖可変領域エクソンを含む1.9kbのEco R
I断片を回収した。この断片をf49Rと命名した。
γ１をコードしている7.8kb配列を含む断片を次のよ
うにして調製した。
約50μｇのベクターpSV2gptγ1-7.8をEco RIで消化し
た。Maniatisにより記載されたようにして仔ウシ腸アル
カリホスファクーゼを使って該生成断片を脱リン酸した
（自己連結を防ぐため）。0.8％アガロースゲルから電
気溶出により該断片を精製した。このベクターをpSV2gp
t γ1-7.8/Rと命名した。
転写開始部位の245kb上流にEco RI部位が置かれ、そ
して効率的な発現のためのプロモーターおよび必要な組
織特異的配列を含む。可変領域遺伝子の３′側のイント
ロン領域は、ヒトIgG重鎖ベクター上にないマウス重鎖
エンハンサー配列を含んでいる。従って、重鎖キメラベ
クターはマウスプロモーターとエンハンサー配列の両方
を使用する。
約325ngの線状化されたpSV2gptγ1-7.8/Rを、１単位
のT4 DNAリガーゼ（BRL）を用いて10μｌの容量におい
て188ngのf49Rと連結せしめた。Stratageneのプロトコ
ールに従って、この連結混合物を用いてStratageneから
の凍結コンピテントE.コリAG-1細胞を形質転換せしめ
た。得られたプラスミドをp49γ1-7.8と命名した。第28
図はp49γ1-7.8のプラスミド地図を表わす。
pSV2gptγ1-7.8についてと同様にして約50μｇのベク
ターpSV2gptγ1-2.3をEco RIで消化した。生じた断片
を、Maniatisにより記載されたようにして仔ウシ腸アル
カリホスファターゼを使って脱リン酸した。該断片を0.
8％アガロースゲルから電気溶出により精製した。この
線状プラスミドをpSV2gptγ1-2.3/Rと命名した。
約300ngの線状化されたプラスミドpSV2gptγ1-2.3/R
を、１単位のT4 DNAリガーゼ（BRL）を用いて10μｌの
容量において188ngのf49Rと連結せしめた。Stratagene
（La Jolla,CA）のプロトコールに従って、この連結混
合物を用いてStratageneからの凍結コンピテントE.コリ
AG-1細胞を形質転換せしめた。得られたプラスミドをp4
9γ1-2.3と命名した。第29図はp49γ1-2.3のプラスミド
地図を示す。
プラスミドpSV2gpt-γ2,pSV2gpt-γ３およびpsv2gpt-
γ４をそれぞれEco RIで消化し、それぞれ線状プラスミ
ドベクターpSV2gpt-γ2/R,pSV2gpt-γ3/RおよびpSV2gpt
-γ4/Rを生ぜしめた。それら３種の線状プラスミドベク
ターの各々をf49Rと連結せしめた。得られたプラスミド
のプラスミド地図は、p49-γ２が第30図;p49-γ３が第3
1図；およびp49-γ４が第32図に示されている。
CC83 CC49のキメラ構成物と同様にして、CC83の重鎖可変領
域を含むキメラ構成物を作製した。19μｇのpHS83を50
単位のEco RI（BRLから入手）で37℃にて２時間消化す
ることにより、CC83重鎖可変領域をコードしている重鎖
可変領域エクソンを含む断片を調製した。消化物を４％
ポリアクリルアミドゲル上で分画し、そしてManiatisに
より記載されたような電気溶出により、CC83の重鎖可変
領域エクソンを含む2.9kbのEco RI断片を回収した。こ
の断片をf83Rと命名した。
上記で得られた線状化されたプラスミドpSV2gptγ1-
7.8/R約300ngを、１単位のT4 DNAリガーゼ（BRLから入
手）を用いて10μｌの容量において270ngのf83Rと連結
せしめた。Stratageneのプロトコールに従って、この連
結混合物を用いてStratageneから入手した凍結コンピテ
ントE.コリAG-1細胞を形質転換せしめた。得られたプラ
スミドをp83γ1-7.8と命名した。第33図はp83γ1-7.8の
プラスミド地図を示す。
上記で得られた約90ngの線状化されたプラスミドpSV2
gptγ1-2.3 /Rを、１単位のT4 DNAリガーゼ（BRL）を
用いて10μｌの容量において270ngのf83Rと連結せしめ
た。Stratageneのプロトコールに従って、この連結混合
物を用いてStratageneからの凍結コンピテントE.コリAG
-1細胞を形質転換せしめた。得られたプラスミドをp83
γ1-2.3と命名した。第34図はp83γ 1-2.3のプラスミ
ド地図を示す。
pSV2gpt-γ2/Rについて上述したようにして、プラス
ミドpSV2gpt-γ2,pSV2gpt-γ３およびpSV2gpt-γ４をそ
れぞれEco RIで消化し、それぞれ線状プラスミドベクタ
ーpSV2gpt-γ2/R,pSV2gpt-γ3/RおよびpSV2gpt-γ4/Rを
生ぜしめた。それら３種の線状プラスミドベクターの各
々をf83Rと連結せしめた。得られたプラスミドのプラス
ミド地図は、p83-γ２が第35図;p83-γ３が第36図；お
よびp83-γ４が第37図に示されている。
10種類の環状プラスミド構成物（p49γ1-7.8;p49γ1-
2.3;p83γ1-7.8;p83γ1-2.3;p49-γ2;p83-γ2;p49-γ3;
p83-γ3;p49-γ4;およびp83-γ４）を制限酵素Nde Iで
消化することにより、形質転換のために線状化した。該
プラスミド中のNde I部位は、キメラ免疫グロブリン遺
伝子または選択可能マーカー遺伝子gptの発現にとって
重要でない領域中に存在する。該プラスミドは、受容細
胞中への形質転換前に線状形にして宿主細胞のゲノムDN
A中への該DNAの選択的組込みを増加させる必要がある。
構成物の確認 Eco RI断片はどちらの方向においても連結され得るの
で、正しい方向をNco RIでの消化により決定した。上述
の構成物において、プラスミドに制限酵素部位マッピン
グを行うことによりプラスミド構成物についての正しい
連結が確かめられる。制限酵素消化とゲル電気泳動から
作成した制限酵素地図と、個々の出発断片から理論上作
成され得るものとが比較される。軽鎖ベクターにおける
転写方向に関する経験により、重鎖ベクターはgpt遺伝
子と反対の転写方向においてのみ作製された。
マウス形質細胞腫細胞中へのプラスミドの形質転換 軽鎖および重鎖キメラ遺伝子の両方を同一の細胞中に
形質転換せしめると、四量体（H2L2）免疫グロブリンが
得られる。それらの「キメラ」抗体タンパク質の合成お
よび分泌は、キメラ（マウスV:ヒトＣ領域）遺伝子をマ
ウス形質細胞腫細胞（Sp2/0）中に導入することにより
行った。形質転換はエレクトロポレーション〔Sahagan,
B.G.ら、J.Immunology 137,1066（1986）〕により達成
された。
形質転換されたマウス形質細胞腫細胞（Sp2/0）中で
のキメラ（マウスV:ヒトＣ領域）遺伝子の発現は、２つ
の異なる方法を使って行われた。１つの方法では、軽鎖
対重鎖遺伝子を種々の比で一緒に導入することができ
る。これは同時形質転換と呼ばれている。あるいは、キ
メラ軽鎖遺伝子を有する適当なクローンを得、続いて標
的形質転換と呼ばれる第二の方法において使用すること
ができる。いずれの方法においても、目標は上述のよう
な完全H2L2免疫グロブリンを産生する、Ｈ鎖遺伝子とＬ
鎖遺伝子の両方を含むクローンを得ることである。
A.同時形質転換 同時形質転換は、２つの薬剤耐性マーカーを同時に用
いた細胞の形質転換、次いで１または２つの薬剤での選
択を含む。重鎖および軽鎖ベクターの同時形質転換（そ
れぞれ1:1および1:10の比で）は、最初はneo選択のみを
使って行った。明白なTAG72結合活性を有する第一のキ
メラIgG 1抗体を発現するneo−耐性細胞を得た。Cornal
ia Gorman,「哺乳類細胞中への高効率の遺伝子トランス
ファー」、DNA Cloning Vol II、D.M.Glover編、IRL Pr
ess,Oxford,Eagland（1985）に記載されたプロトコール
に従って同時形質転換を行った。
B.標的形質転換 軽鎖および重鎖キメラ免疫グロブリン遺伝子を含む構
成物を逐次的に使って、Sp2/0マウス形質細胞腫細胞を
形質転換せしめた。標的形質転換は、第一の薬剤耐性遺
伝子（即ち、キメラ軽鎖遺伝子ベクターについてはゲネ
チシン）を含むベクターを用いた形質転換および選択、
続いて第二の薬剤耐性遺伝子（即ち、キメラ重鎖遺伝子
ベクターについてはミコフェノール酸）を含むベクター
を用いた形質転換および選択を伴う。
Neo選択 キメラ軽鎖構成物を含むpSV2-neoベクターを用いた形
質転換の前に、形質転換されていないSp2/0形質細胞腫
細胞〔アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ATCC）から入手〕の増殖の抑制のための薬剤選択条件
を、ネオマイシン様薬剤ゲネチシン（GIBCO）の滴定に
より確立させた。薬剤選択に使われるゲネチシン濃度に
ついて発表された値は、100-1000μg/mlの範囲であっ
た。400μg/ml以上の濃度が本発明者らの組織培養環境
においてSp2/0細胞の増殖を防ぐことがわかった。
軽鎖含有細胞の作製 最初に次のようにして軽鎖含有pSV2-neoベクターを用
いてSp2/0マウス形質細胞腫細胞を形質転換せしめた。
５％ウシ胎児血清を有するRPMI1640培地中で細胞を増殖
させた。細胞をPBS中で洗浄し、１×107生存細胞/ml PB
Sの濃度に懸濁した。0.8mlの細胞懸濁液を、20μｇの軽
鎖含有pSV2-neoベクター（CC49キメラＬ鎖についてはpR
L105とpRL150、そしてCC83キメラＬ鎖についてはpRL203
とpRL230）を含むエレクトロポレーションキュベット
（氷上）に移し、Aat II制限エンドヌクレアーゼで線状
にした。試料を65℃で10分間加熱することによりAat II
を不活性化した。線状化されたDNAをエタノール沈澱さ
せ、次いで10-20μｌのPBS中に溶解した。氷上で15分間
後、キャパシタンスエキステンダー（BioRad）を追加し
てGene Pulserエレクトロポレーション装置を使って0.2
キロボルトおよび960μＦにおいてエレクトロポレーシ
ョンを行った。時定数（τ）は通常約26msecであった。
形質転換後、乱れた膜の緩和を可能にするため氷上に
15分間置き細胞を再生させた。その後、５％ウシ胎児血
清を含むRPMI1640培地（RPMI＋）24ml中に細胞を懸濁
し、そして96または24ウエルのプレートに移した。ウエ
ルあたり１より多い薬剤耐性細胞の確率を滅らすため
に、更に細胞を培地（RPMI＋）で10倍布釈し、そして別
の96ウエル（または24ウエル）プレートに入れた。細胞
懸濁液を37℃および５％CO2雰囲気においてインキュベ
ートした。
48時間後（薬剤耐性の発現を考慮して）、培地を除去
し、そして1mg/mlのゲネチシンを含む培地と交換した。
7-10日後、ゲネチシン耐性クローンをサブクローニン
グし、そして細胞染色によりキメラ軽鎖についてスクリ
ーニングした。
細胞染色 細胞のアリコートを、Cytospia-2遠心機（Shandon,In
c）を使ってスライドガラス上にペレット化した。風乾
した後、細胞を酢酸／エタノール（酢酸５部／エタノー
ル95部）中で固定した。PBS（Ca2+とMg2+を含まない）
で３回すすいだ後、スライドを湿潤チャンバー（100％R
H）中に置き、そして20μｌのヤギ抗−ヒトκ−FITC、
即ちヒトκ軽鎖に特異的である蛍光色素接合抗体で20分
間染色した。該接合抗体は、PBS中１％BSAで1:3希釈さ
れた。PBSで一晩洗浄した後、組織用固定培地であるFlu
oromount-Gでスライドをカバーガラス下に固定した。こ
のスライドを、外部照明UV付属品を備えた01ympusモデ
ルBH-2顕微鏡を用いて観察した。
蛍光の強度に基づいて、ベクター中のneor遺伝子の転
写方向とは反対の転写方向において軽鎖の方向を有する
構成物が最も高いＬ鎖発現を与えることがわかった。従
って、pRL105が好ましいCC49 L鎖構成物であり、pRL230
が好ましいCC83 L鎖構成物であった。それらの実験の結
果として、次のようなキメラ軽鎖含有細胞系（Sp2/0由
来）を標的形質転換に使用した。
CC49キメラＬ鎖については、CC49由来のキメラ軽鎖を
発現する１つの細胞系（49K-13-13）を得た。この細胞
系を、キメラCC49軽鎖を使った構成物へのキメラ重鎖ベ
クターによる次なる標的形質転換に使った。
CC83キメラＬ鎖については、CC83由来のキメラ軽鎖を
発現する３つの細胞系（83K-26-5,83K-34-10および83E-
42-2）を得た。１つの細胞系（83K-26-5）は、他よりも
強く染色され、そして細胞質免疫強度の領域が局在化さ
れていた。キメラCC83γ１重鎖ベクターによる形質転換
後に高レベルのキメラ抗体を産生する相対能力につい
て、３つの全ての細胞系を比較した。キメラ抗体をより
多く発現する細胞系は、他の２つのキメラ軽鎖標的細胞
系のいずれよりも88K-34-10標的細胞系のエレクトロポ
レーションから誘導された。従って、83K-34-10軽鎖細
胞系を、キメラ重鎖ベクターでの次なるエレクトロポレ
ーションのためのCC83軽鎖可変領域を含む構成物の標的
として使用した。
CC49およびCC83キメラＨ鎖構成物を所有しているgpt耐
性クローンの作製 キメラ重鎖構成物を含むpSV2-gptベクターでの形質転
換の前に、形質転換されていないSp2/0形質細胞腫細胞
〔アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（AT
CC）から入手〕の増殖の抑制のための薬剤選択を確立し
た。pSV2-gptベクターにより形質転換された細胞の薬剤
選択のための条件は確立することが難しかった。グアノ
シンホスホリボシルトランスフエラーゼ酵素をコードす
るE.コリgpt遺伝子は、哺乳類のグアニン代謝経路がミ
コフェノール酸（MPA）により阻害される時、グアニン
の生合成のための基質としてキサンチンおよびヒポキサ
ンチンを利用する出力を付与する。
pSV2-gptベクターで形質転換された他のリンパ系細胞
の増殖を考慮したMPAの濃度について発表された値は、
ほとんど２オーダーの大きさであり、本発明者らの組織
培養環境におけるpSV2-gptベクターで形質転換された細
胞の増殖には高すぎる。その後、0.1μg/mlのMPAの濃度
が、gpt耐性の選択に最適であることがわかった。加え
て、アミノプテリンおよびチミジンの使用（グアニン経
路を更に遮断するため）は不必要であることがわかっ
た。
キメラ44抗体を産生するクローンの作製 CC44-1 キメラ重鎖構成物の標的として49K-13-13細胞を使っ
た。この細胞を、Nde I消化により線状化された20μｇ
のキメラ重鎖DNAベクター（p49γ1-7.8またはp49r1-2.
3）を用いて形質転換せしめた。キメラ軽鎖について上
述した通りにエレクトロポレーションにより形質転換を
行った。
しかしながら、48時間後の選択は、ゲネチシン含有培
地を、ゲネチシン並びに0.3μg/mlミコフェノール酸、2
50μg/mlキサンチンおよび10μg/mlヒポキサンチンを含
有する培地で置き換えることにより行った。
形質転換細胞は、14日間のうちに肉眼で見ることがで
きるコロニーに増殖した。その時点で50μｌの上清を取
り出し、そしてELISA法によりTAGへの結合およびヒトIg
G定常領域の発現についてアッセイした。陽性のTAG結合
を有する細胞を含むウエルを、新鮮な薬剤選択培地を使
って24ウエルに広げ、そして３−７日間増殖させた。
サブクローニングは次のように行った。生存細胞数を
決定し、そして細胞を２枚の96ウエルプレートに再び移
した。一方のプレートは50個の生存細胞を含み、そして
他方は250個の生存細胞を含んだ。再サブクローニング
が必要である場合には、液体窒素中での保存を考慮して
細胞密度が十分となるまで６ウエルプレートにサブクロ
ーン化してない細胞を広げた。
サブクローニング後、最も高いキメラ抗体産生を示す
それらのクローンを、バイオリアクター中でのキメラ抗
体産生のために選択した。
CH44-2 キメラ重鎖ベクターとして20μｇのp49-γ２を使用す
ること以外は、CH44-1の作製においてSp2/0形質細胞腫
細胞を逐次的に形質転換せしめるのに使った方法を繰り
返した。
CH44-3 重鎖ベクターとして20μｇのp49-γ３を使用すること
以外は、CH44-1の作製においてSp2/0形質細胞腫細胞を
逐次的に形質転換せしめるのに使った方法を繰り返し
た。
CH44-4 重鎖ベクターとして20μｇのp49-γ４を使用すること
以外は、CH44-1の作製においてSp2/0形質細胞腫細胞を
逐次的に形質転換せしめるのに使った方法を繰り返し
た。
キメラ88抗体を産生するクローンの作製 CH88-1 CH44-1の作製においてSp2/0形質細胞腫細胞を逐次的
に形質転換せしめるのに使った方法を繰り返した。
ただし、キメラCC83重鎖遺伝子を含むpSV2gptベクタ
ーである20μｇのp83γ1-7.8またはp83γ1-2.3を重鎖ベ
クターとして使用すること以外は、CH44-1の形質転換に
おいて記載されたようにして、CC83軽鎖の産生が証明さ
れている83K-26-5,83K-34-10および83K-42-2細胞を形質
転換せしめた。
CH88-2 重鎖ベクターとして20μｇのp83-γ２を使用すること
以外は、CH88-1の作製においてSp2/0形質細胞腫細胞を
逐次的に形質転換せしめるのに使った方法を繰り返し
た。
CH88-3 重鎖ベクターとして20μｇのp83-γ３を使用すること
以外は、CH88-1の作製においてSp2/0形質細胞腫細胞を
逐次的に形質転換せしめるのに使った方法を繰り返し
た。
CH88-4 重鎖ベクターとして20μｇのp83-γ４を使用すること
以外は、CH88-1の作製においてSp2/0形質細胞腫細胞を
逐次的に形質転換せしめるのに使った方法を繰り返し
た。
キメラ84抗体を産生するクローンの作製 CC49とCC83の重鎖可変領域間の高度な配列相同性のた
め、軽鎖と重鎖が異なる親に由来するキメラ抗体を混合
標的形質転換により作製した。２つの「混合された」化
合物を作製するために、CC49およびCC83のキメラ重鎖γ
１イソタイプを、それぞれキメラ軽鎖標的83K-34-10お
よび49E-13-3中にエレクトロポレーションした。生じた
細胞系をCH48-1およびCH84-1と命名した。これは最初の
２つの数字がそれぞれ親の重鎖と軽鎖を表わしている。
例えば、CH48-1は、CC49由来の重鎖とCC83由来の軽鎖を
有するγ１イソタイプを表わす。
CH48-1複合抗体は、TAG72に結合しなかった。これ
は、真実のキメラ抗体を作ることができなかったためで
はない。何故なら、ほとんどの薬剤耐性細胞系がキメラ
IgGを産生したからである（プローブとしてヤギ抗‐ヒ
トIgG-アルカリホスファターゼによるヤギ−抗ヒトIgト
ラップを使ったELISA分析により測定）。もし結合親和
力が存在するとしても、第一世代抗体B72.3について観
察されたものよりも有意に小さく、TAG72に対する親和
力がCC49やCC83よりもかなり小さいオーダーであった。
驚くべきとに、CH84-1は、両親と同様の親和力でTAG7
2に結合した。この新規抗体は本発明者らの研究室にお
いて初めから作製され、そして天然には未だ発見されて
いない。
競合実験を行ってこの新規混合抗体CH84-1の特異性を
決定した。CC49とCC83の両者はTAG72抗原に対して幾ら
か競合的認識を示すことに注目すべきである。CH84-1
は、TAG72への結合に対してCC83とよりもCC49とより多
く競合することがわかった。これはTAG72への結合に対
する特異性が軽鎖中にあることを示すだろう。
CH84-1 次のこと以外は、Cu44-1の作製においてSp2/0形質細
胞腫細胞を逐次的に形質転換せしめるのに使った方法を
繰り返した。
CH44重鎖遺伝子を含むpSV2gptベクターであるp49γ1-
2.3の代わりに、CH83重鎖遺伝子を含むpSV2gptベクター
であるp83γ1-2.3を20μｇ用いること以外は、CH44-1の
形質転換において記載されたようにして、細胞染色によ
りCH44軽鎖の産生が証明されている49K-13-13細胞を形
質転換せしめた。
CH84-2 p83γ1-2.3の代わりに20μｇのp83γ‐２を用いるこ
と以外は、CH84-1の作製においてSp2/0形質細胞腫細胞
を逐次的に形質転換せしめるのに使った方法を繰り返し
た。
CH84-3 p83γ1-2.3の代わりに20μｇのp83γ‐３を用いるこ
と以外は、CH84-1の作製においてSp2/0形質細胞腫細胞
を逐次的に形質転換せしめるのに使った方法を繰り返し
た。
CH84-4 p83γ1-2.3の代わりに20μｇのp83γ‐４を用いるこ
と以外は、CH84-1の作製においてSp2/0形質細胞腫細胞
を逐次的に形質転換せしめるのに使った方法を繰り返し
た。
組換え抗体の精製 キメラ抗体を発現している細胞を遠心によって培地か
ら除去し、そして培地を0.2μｍのフィルターを通して
濾過した。培養上清から２段階においてキメラ抗体を精
製した。精製の第一段階において、製造業者の指示に従
ってプロテインＡアフィニティーカートリッジ（Nygene
Corporation,Yonkers,NY）を使った。1.0lまでの培養
上清を5ml/分の速度で1mg容量カートリッジに通過させ
た。カートリッジをリン酸塩緩衝化塩溶液（PBS）で洗
浄し、微量のアルブミンを除去した。0.1M硝酸ナトリウ
ム緩紡液（pH3.0）での溶出によりキメラ抗体を回収し
た。キメラ抗体を含む画分のpHをTrizma塩基の1M溶液に
より直ちに中性に調整した。最後の精製は、この溶液の
Amicon centricon 30装置上での濃縮後、製造業者（Pha
rmacia Piscataway,NJ）により明記されたようにしてPh
armacia Superose 12 HR 16/50カラムを使ったゲル濾過
により達成された。
実施例：マウスVHαTAGジャームライン可変領域を含む
免疫グロブリンの作製 次の例は、当業者に、VHαTAG由来のDNA配列によりコ
ードされるVH領域を有する抗体を調製するための再現性
のある方法を提供するために記載される。
発現可能なVHαTAG重鎖遺伝子のための成分 マウスVHαTAGジャームライン重鎖可変領域、VHαTAG
VHと相補的である軽鎖可変領域、例えばCC49またはCC83
マウス軽鎖可変領域、およびヒト定常領域を含む、マウ
ス−ヒトキメラ抗体分子を作製することができる。
VHαTAG VHエクソン配列を含む2.2kbのHindIIIジャー
ムラインDNA断片を鋳型として使い、機能的に再配列さ
れたVHαTAG可変領域が得られる。マウスゲノムJ-Cμイ
ントロン領域がマウス重鎖エンハンサー配列の入手源と
して使われる。後者の領域はプラスミドpNP9から得られ
る（「CC49重鎖可変領域の単離」における上記例を参照
のこと）。第38図は、Hortonら（1989）、前掲の方法に
基づくハイブリッド遺伝子の提作についての全体反応を
示す。４種のオリゴヌクレオチド（オリゴ）は、標的DN
Aの酵素的増幅および改変において使用するために設計
されている。オリゴ１は、ATG開始コドンの249bp5′側
にあるEco RI部位にかかるVHαTAGの５′末端にアニー
ルする。オリゴ２は、VHαTAGエクソンの３′末端に相
補的な配列にアエールし、そしてＤセグメントをコード
している配列も含む。オリゴ２中のＤセグメント配列
は、VHαTAG配列と全くアニールしない。オリゴ３は、
マウスゲノムJ-Cμ領域の５′末端に相補的な配列を含
み、そしてＤセグメント（オリゴ２中のものと同じ）お
よびＪセグメントをコードしている配列を含む。オリゴ
４は、J-Cμ領域の３′末端にアニールし、そしてJH４
の1219bp3′側にあるEco RI部位に相補的な配列を含
む。それらオリゴの配列は次のようである： この実施例では、Ｄ配列はKurosawaおよびTonegawa,
J.Exp.Med.,155:201（1982）の発表された配列からとっ
たSP2.3である。Ｄ配列は、オリゴ２と３の中に肉太活
字体（ボールド）で示されている。オリゴ２および３の
それらの位置においてそれらの配列を置きかえることに
より、他のいずれかの特徴付けられたマウスまたはヒト
Ｄセグメントを使用することができる。
オリゴヌクレオチド３中のＪセグメントは下線が引か
れている。それはGoughおよびBernard,Proc.Nat'l.Aca
d.Sci. (USA),78:509（1981）の発表された配列からと
ったマウスJH４である。オリゴ３中のJH４配列の代わり
に用いることにより、他のいずれかのマウスまたはヒト
Ｊセグメントを含めることができる。
オリゴ１と４において、Eco RI部位（GAATTC）はイタ
リック体で示されている。
完全なVHαTAGの集成 上述の成分を使って、２つの別個のDNA増幅反応を行
った。DNA増幅反応＃１は、VHαTAG配列をコピーしそし
てその３′末端にＤセグメントを付加する。DNA増幅反
応＃２は、重鎖エンハンサー配列を含むマウスイントロ
ン配列をコピーし、そしてオリゴ３内部にコードされた
ＤおよびＪセグメントを付加する。反応１および２から
の増幅反応生成物をゲル精製し、一緒にし、そしてオリ
ゴ１および４を添加して反応＃３を開始する。反応３で
は、反応１および２の生成物がそれらの共通のＤ配列の
向こう側にアニールする。オリゴ１と４からの次なるDN
A増幅は、第38図の最下部に示される生成物をもたら
す。この断片をEco RIで消化しそしてゲル精製する。改
変されたVHαTAG断片を、上記例の「重鎖キメラ構成
物」のところで述べたようにしてpSV2gptγ１（2.3）の
Eco RI部位中に連結する。完全VHαTAG-D-J-エンハンサ
ー含有断片を完全に配列決定し、DNA増幅反応中に全く
変異が導入されなかったことを確かめる。同じ改変VHα
TAG断片を他の３種のγ含有pSV2gptベクター（pSV2gpt-
γ2;pSV2gpt-γ3;pSV2gpt-γ４）中に連結せしめること
により、他の３種の重鎖γイソタイプを作製することが
できる。
改変VHαTAG遺伝子の発現 改変VHαTAG遺伝子を含むプラスミドをNde Iで線状化
し、そしてエレクトロポレーションによりキメラCC49ま
たはCC83軽鎖発現細胞系中に導入することができる（上
記例の「C.標的形質転換」を参照のこと）。形質転換細
胞を、「C.標的形質転換」において概説したようにして
ゲネチシンおよびミコフェノール酸の存在下での増殖に
ついて選択する。発現抗体の存在はTAG72ELISAによりモ
ニターする〔結果の部のエンザイム−リンクドイムノア
ッセイ（ELISA）を参照のこと〕。それらの細胞からの
発現抗体は、ヒトIgγ1,κ定常領域と、CC49またはCC83
軽鎖可変領域および改変VHαTAGジャームラインVHエク
ソンからの重鎖可変領域を含むだろう。
種々のＤおよびＪセグメントを有する改変VHαTAG重
鎖可変領域の４つの例を下記に示す。VHセグメント Ｄセグメント Ｊセグメント VHαTAG＃ｉ マウス D（SP2.3）マウス Ｊ VHαTAG＃ii ヒト D（D 1） マウス Ｊ VHαTAG＃iii マウス D（SP2.3）ヒト Ｊ VHαTAG＃iv ヒト D（D 1） ヒト Ｊ ヒトＤ配列Dlの配列は、Siebenlistら、Nature,294:6
31（1981）から得られる。ヒトJH１の配列は、Ravetch
ら、Cell 27,583（1981）から得られる。
VHαTAG＃ｉの作製は、上記に示されたオリゴ１〜オ
リゴ４により説明される。VHαTAG＃ii〜ivを作製する
ためには、対応するＤおよびＪセグメントをオリゴ２お
よび３において変更する必要がある。次のオリゴはそれ
らの変化を描写する。反応＃１と反応＃２におけるそれ
らのオリゴの置換がVHαTAG＃ii〜ivの生成をもたらす
だろう。
VHαTAG＃ii VHαTAG＃iii オリゴ２ ５′CAGTGTATTTCTGTAAAAGATCTACTATGG（35マ
ー）TTACG VHαTAG＃iv 結果 Ａキメラ抗体産生細胞系 重鎖と軽鎖の同時検出は次のプローブ抗体を使って達
成された： １）蛍光染料FITCで標識されたヤギ抗−ヒトμ；および ２）蛍光染料TRITCで標識されたヤギ抗−ヒトIgG。
重鎖および軽鎖の両方について陽性応答を有する細胞
系を、集成されたキメラ免疫グロブリンの産生および生
物活性、即ちTAG72への結合について更にテストした。
エンザイム−リングドイムノアッセイ（ELISA） キメラモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を
選択するために、ELISA法を使用した。重鎖および軽鎖
薬剤選択構成物を含むクローンを、選択培地中でのそれ
らの増殖により選択した。次の細胞系をテストした：
（１）CH44-1:CC49 VH,CC49 VLおよびIgG1の定常領域を
有する細胞系；（２）CH44-2:CC49VH,CC49 VLおよびIgG
2の定常領域を有する細胞系；（３）CH44-4:CC49 VH,CC
49 VLおよびIgG4の定常領域を有する細胞系；（４）CH8
8-1:CC83 VH,CC83 VLおよびIgG1の定常領域を有する細
胞系；（５）CH88-2:CC83 VH,CC83 VLおよびIgG2の定常
領域を有する細胞系；（６）CH88-3:CC83 VH,CC83 VLお
よびIgG3の定常領域を有する細胞系；（７）CH88-4:CC8
3 VH,CC83 VLおよびIgG4の定常領域を有する細胞系；
（８）CH84-1:CC83 VH,CC49 VLおよびIgG1の定常領域を
有する細胞系；（９）CH84-2:CC83 VH,CC49 VLおよびIg
G2の定常領域を有する細胞系；（10）CH84-3:CC83 VH,C
C49 VLおよびIgG3の定常領域を有する細胞系；および
（11）CH84-4:CC83VVH,CC49 VLおよびIgG4の定常領域を
有する細胞系。
それらの培養液の上清をELISAにかけた。抗原（TAG7
2）でコーティングされたミクロタイターウエルにキメ
ラ抗−TAG72を結合させた後、アルカリホスファターゼ
のような酵素で標識された過剰のヤギ抗−ヒトIgG抗体
の反応により、キメラ抗‐TAG72抗体の存在を直接測定
した。好結果の組換えの基準として抗−TAG72活性を測
定した。
14日間の増殖後、サブクローニングされた細胞のウエ
ルから50μｌの上清を取り出し、そしてELISAによりTAG
結合について再びアッセイした。薬剤耐性細胞系からの
上清の試料（50μｌ）を、予めTAG抗原（1/50希釈）で
コーティングされているNunc Immulon 96ウエルプレー
トのウエルに適用した。洗浄により未結合物質を除去し
た後、該プレート上に固定されたTAG抗原に結合したキ
メラ抗体のヒト定常領域を検出するためのプローブとし
て、アルカリホスファターゼと接合したヤギ抗‐ヒトIg
G抗体（GAHIgG-AP）を用いて、該ウエルをインキュベー
トし、次いで色素産生アルカリホスファターゼ基質の添
加により、ヒト定常領域に関係するTAG結合（即ち、キ
メラ抗−TAG72抗体）を有するそれらのウエルにおいて
色を生成させた。405nmでの吸光度の読みは、薬剤耐性
細胞系により産生されるキメラ抗体の相対量を示す。
CH44-1 好結果の組換えの基準として抗‐TAG72活性を使っ
た。精製TAG72〔Muraro,R.ら、Cancer Research 48,45
88-4596（1988）〕の1:75希釈液50μｌを室温で18時間
インキュベートすることにより、ミクロタイタープレー
トのウエルをTAGでコーティングした。次いでウエルを
リン酸塩緩衝化塩溶液（PBS）で４回洗浄し、そしてPBS
中の0.5％BSA50βを37℃で２時間インキュベートするこ
とによりブロックし、次いでPBSで４回洗浄した。それ
らのプレートは、４℃にて湿らせておけば安定である。
次に50μｌの試料を各ウエルに適用する。新鮮な培地を
含むブランクを対照として用いる。プレート中の全ての
試料を37℃で90分間または４℃にて一晩のいずれかで密
閉容器中でインキュベートした。
次に、プレートをPBSで４回洗浄し、そしてヤギ抗ヒ
トIgG−アルカリホスファターゼ（Southern Biotecb As
soc.）を、1:250希釈液50μｌを添加することにより各
ウエルに適用した。この溶液を37℃で90分間インキュベ
ートした。PBSで４回プレートを洗浄し、該プローブを
除去した後、色の生成をモニターした。
色の生成のため、エタノールアミン緩衝化塩溶液中の
ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Kirkegaard ＆ Perr
y）基質溶液200μｌにおいて基質を室温で６分間インキ
ュベートした。Dynatechミクロプレートリーダー（Dyna
tech Inc.）により各ウエルの450nmでの光学濃度を読み
取った。
TAG72結合キメラ抗体活性を有する上清を含むウエル
中のSp2/0コロニーを、限界希釈によりサブクローニン
グした。比較的高いキメラ抗体産生に基づいて個々のサ
ブクローニングを選択した。
CH44-2 前記抗体がCH44-2であること以外は、CH44-1で使った
TAG-ELISA法を繰り返した。
CH44-3 前記抗体がCH44-3であること以外は、CH44-1で使った
TAG-ELISA法を繰り返した。
CH44-4 前記抗体がCH44-4であること以外は、CH44-1で使った
TAG-ELISA法を繰り返した。
CH88-1 前記抗体がCH88-1であること以外は、CH44-1で使った
TAG-ELISA法を繰り返した。
CH88-2 前記抗体がCH88-2であること以外は、CH44-1で使った
TAG-ELISA法を繰り返した。
CH88-3 前記抗体がCH88-3であること以外は、CH44-1で使った
TAG-ELISA法を繰り返した。
CH88-4 前記抗体がCH88-4であること以外は、CH44-1で使った
TAG-ELISA法を繰り返した。
CH84-1 前記抗体がCH84-1であること以外は、CH44-1で使った
TAG-ELISA法を繰り返した。
CH84-2 前記抗体がCH84-2であること以外は、CH44-1で使った
TAG-ELISA法を繰り返した。
CH84-3 前記抗体がCH84-3であること以外は、CH44-1で使った
TAG-ELISA法を繰り返した。
CH84-4 前記抗体がCH84-4であること以外は、CH44-1で使った
TAG-ELISA法を繰り返した。
CH48-1 前記抗体がCH48-1であること以外は、CH44-1で使った
TAG-ELISA法を繰り返した。
B.生体内（in vivo）ガン腫ターゲッティング 動物実験において使用されそして下記第１−４表に示
されるキメラモノクローナル抗体を、Iodogen（Pierce
Chemical Rockford,IL）を使ってNa125Iで標識した。よ
り詳しくは、約0.5-2mgの精製キメラモノクローナル抗
体を約0.5mlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）に
調整し、そして50μｇのIodogenでコーティングされた1
2cm×75cmのガラス管に添加し、次いで0.1-0.5mCiのNa
125I（New England Nuclear,Boston,MA）を添加した。
室温での２分間のインキュベーション後、取込まれなか
った125Iを、緩衝液としてPBSを使って10mlカラムSepha
dexTM G-25を適すゲル濾過により抗体から分離させた。
このヨウ素化プロトコールは、0.05〜0.2μCi/μｇの比
活性を有する標識IgGキメラ抗体をもたらした。
CD 1バックグラウンドにおける雌の無胸腺マウス（nu
/nu）を約４週齢においてCharles Riverから入手した。
９日後、マウスにLS174T細胞（１×106細胞／動物）を
皮下接種（0.1ml/マウス）した。
重さ70〜400mgのガン腫を有する無胸腺マウスに、前
記細胞の接種の約12〜13日後に、PBS中の0.5〜2.0μCi
（10〜50μｇタンパク質）の上述のようにしてヨウ素化
されたキメラモノクローナル抗体を静注した。５匹ずつ
のマウスのグループを種々の時点で瀉血により犠牲に
し、ガン腫および正常組織を切除しそして重さを量り、
ガンマカウンター中でcpmを判定した。各組織中のcpm/m
gを決定し、そしてガン腫中に認められるものと比較し
た。
CH44-1についての結果は第１〜２表並びに第39A,39B
および39C図に示される。CH84-1についての結果は第３
〜４表並びに第40Aおよび40B図に示される。125 I−標識抗体のグラム当りの注入線量％ 第１表に示されるように、注入後約122時間目に、CH4
4-1についての腫瘍への注入線量％は44.16％であった。
従って、CH44-1はヒト腫瘍を原位置でターゲットするの
に効果的であった。これは、本発明のキメラモノクロー
ナル抗体が生体内ガン腫ターゲッティングに効果的であ
り、従ってガンの生体内治療に有用であることを証明す
る。125 I−標識抗体の器官当りの注入線量％ 第２表に示されるように、注入後約122時間目に、CH4
4-1についての腫瘍への注入線量％は4.5％であった。従
って、CH44-1はヒト腫瘍を原位置でターゲットするのに
効果的であった。これは、本発明のキメラモノクローナ
ル抗体が生体内ガン腫ターゲッティングに効果的であ
り、従ってガンの生体内治療に有用であることを証明す
る。125 I−標識抗体のグラム当りの注入線量％ 第３表に示されるように、注入後約118時間目に、CH8
4-1についての腫瘍への注入線量％は30.27％であった。
従って、CH84-1はヒト腫瘍を原位置でターゲットするの
に効果的であった。これは、本発明のキメラモノクロー
ナル抗体が生体内ガン腫ターゲッティングに効果的であ
り、従ってガンの生体内治療に有用であることを証明す
る。125 I−標識抗体の器官当りの注入線量％ 第４表に示されるように、注入後約118時間目に、CH8
4-1についての腫瘍への注入線量％は7.02％であった。
従って、CH84-1はヒト腫瘍を原位置でターゲットするの
に効果的であった。これは、本発明のキメラモノクロー
ナル抗体が生体内ガン腫ターゲッティングに効果的であ
り、従ってガンの生体内治療に有用であることを証明す
る。
キメラ抗体を産生する細胞系の寄託 上記実施例により作製された、全てκ軽鎖を有するキ
メラ抗体を分泌する11種の実例となる細胞系は、1988年
10月19日アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（ATCC）に寄託された。詳しくは、次の細胞系が寄託
された：（１）CH44-1:CC49 VH,CC49 VLおよびIgG1の定
常領域を有する細胞系（ATCC No.HB9884）；（２）CH88
-2:CC83VH,CC83VLおよびIgG2の定常領域を有する細胞系
（ATCC No.HB9880）；（３）CH44-4:CC49 VH,CC49 VLお
よびIgG4の定常領域を有する細胞系（ATCC No.9887）；
（４）CH88-1:CC83 VH,CC83 VLおよびIgG1の定常領域を
有する細胞系（ATCC No.9882）；（５）CH44-2:CC49
VH,CC49 VLおよびIgG2の定常領域を有する細胞系（ATCC
No.9881）；（６）CH88-3:CC83 VH,CC83 VLおよびIgG3
の定常領域を有する細胞系（ATCC No.9876）；（７）CH
88-4:CC83 VH,CC83 VLおよびIgG4の定常領域を有する細
胞系（ATCC No.9874）;.（８）CH84-1:CC83 VH,CC49 VL
およびIgG1の定常領域を有する細胞系（ATCC No.988
3）；（９）CH84-2:CC83 VH,CC49 VLおよびIgG2の定常
領域を有する細胞系（ATCC No.9879）；（10）CH84-3:C
C83 VH,CC49 VLおよびIgG3の定常領域を有する細胞系
（ATCC No.9878）；および（11）CH84-4:CC83 VH,CC49
VLおよびIgG4の定常領域を有する細胞系（ATCC No.987
5）。
寄託された態様物は本発明の１つの観点の単なる例示
であるので本発明は寄託された細胞系により範囲を限定
されるものではなく、そして機能的に等価である全ての
細胞系が本発明の範囲内に含まれる。実際、本発明をそ
の特定の態様に関して詳細に記載してきたが、添付され
た請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、
様々な変更および改良を行い得ることは当業者にとって
明らかであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ０７Ｋ 16/30 51/00 16/46 Ｃ０７Ｋ 16/30 19/00 16/46 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ 19/00 33/574 Ａ Ｃ１２Ｎ 5/10 33/577 Ｂ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｇ０１Ｎ 33/531 5/00 Ｂ 33/574 Ａ６１Ｋ 49/02 Ａ 33/577 43/00 (Ｃ１２Ｐ 21/08 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 リクソン，マーク アメリカ合衆国，ミシガン 48640，ミ ッドランド，キャッスル ドライブ 4110 (56)参考文献 特表 平２−501190（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−501191（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−504436（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ ｎｇ，Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．６（1987) ｐ．499−505 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．78，Ｎｏ．５ （1981）ｐ．3199−3203 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 21/08 C12N 15/13 C12N 15/14 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ

Claims (21)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】細胞系CH44-1、CH44-2、CH44-4、CH88-1、
    CH88-2、CH88-3、CH88-4、CH84-1、CH84-2、CH84-3及び
    CH84-4から成る群のいずれか１により産生される抗体又
    はその抗体断片であって、TAG72についての結合特異性
    を有する、前記抗体又は抗体断片。
  2. 【請求項２】画像形成マーカーと接合された請求項１に
    記載の抗体又は抗体断片を含んで成る、抗体又は抗体断
    片接合体。
  3. 【請求項３】前記画像形成マーカーが125I、131I、
    123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177L
    u、186Re、188Re又は99mTcである、請求項２に記載の抗
    体又は抗体断片接合体。
  4. 【請求項４】治療薬と接合された請求項１に記載の抗体
    又は抗体断片を含んで成る、抗体又は抗体断片接合体。
  5. 【請求項５】前記治療薬が放射性核種、薬剤若しくは生
    体応答調節剤、毒素又は他の抗体である、請求項４に記
    載の抗体又は抗体断片接合体。
  6. 【請求項６】前記放射性核種が131I、90Y、105Rh、47S
    c、67Cu、212Bi、211At、67Ga、125I、186Re、188Re、
    177Lu、99mTc、153Sm、123I又は111Inである、請求項５
    に記載の抗体又は抗体断片接合体。
  7. 【請求項７】前記薬剤若しくは生体応答調節剤がメトト
    レキセー卜、アドリアマイシン又はリンホカインであ
    る、請求項５に記載の抗体又は抗体断片接合体。
  8. 【請求項８】TAG72についての結合特異性を有する抗体
    の少なくとも一部をコードし、かつ、細胞系CH44-1、CH
    44-2、CH44-4、CH88-1、CH88-2、CH88-3、CH88-4、CH84
    -1、CH84-2、CH84-3及びCH84-4から成る群のいずれか１
    内に含まれたDNA配列。
  9. 【請求項９】請求項８に記載のDNA配列を含む生物学的
    機能性発現ビヒクル。
  10. 【請求項１０】請求項９に記載の生物学的機能性発現ビ
    ヒクルにより形質転換された細胞。
  11. 【請求項１１】CH44-1、CH44-2、CH44-4、CH88-1、CH88
    -2、CH88-3、CH88-4、CH84-1、CH84-2、CH84-3又はCH84
    -4の細胞の特徴を有する、請求項10に記載の細胞。
  12. 【請求項１２】TAG72発現性癌の治療のための、医薬上
    許容される非毒性の無菌担体中に請求項１に記載の抗体
    又は抗体断片を含む組成物。
  13. 【請求項１３】TAG72発現性癌の治療のための、医薬上
    許容される非毒性の無菌担体中に請求項２又は３に記載
    の抗体又は抗体断片接合体を含む組成物。
  14. 【請求項１４】TAG72発現性癌の治療のための、医薬上
    許容される非毒性の無菌担体中に請求項４〜７のいずれ
    か１項に記載の抗体又は抗体断片接合体を含む組成物。
  15. 【請求項１５】抗体又は抗体断片接合体の製造方法であ
    って、 請求項１に記載の抗体又は抗体断片を、画像形成マーカ
    ーまたは治療薬と接触せしめることを含む、前記方法。
  16. 【請求項１６】前記画像形成マーカーが125I、131I、
    123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177L
    u、186Re、188Re又は99mTcである、請求項15に記載の方
    法。
  17. 【請求項１７】前記治療薬が放射性核種、薬剤若しくは
    生体応答調節剤、毒素又は他の抗体である、請求項15に
    記載の方法。
  18. 【請求項１８】前記放射性核種が131I、90Y、105Rh、47
    Sc、67Cu、212Bi、211At、67Ga、125I、186Re、188Re、
    177Lu、99mTc、153Sm、123I又は111Inである、請求項17
    に記載の方法。
  19. 【請求項１９】前記薬剤若しくは生体応答調節剤がメト
    トレキセート、アドリアマイシン又はリンホカインであ
    る、請求項17に記載の方法。
  20. 【請求項２０】組換え発現ビヒクルの製造方法であっ
    て、請求項８に記載のDNA配列を、発現ビヒクル内に挿
    入することを含む、前記方法。
  21. 【請求項２１】形質転換された宿主の製造方法であっ
    て、請求項９に記載の発現ビヒクルを、好適な宿主内に
    挿入することを含む、前記方法。
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