JP3860398B2 - サイトカインの免疫複合体 - Google Patents

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Description

【０００１】
本出願は、１９９０年ｌｌ月９日出願の係属中出願第６１２，０９９号の部分継続出願であり、その開示はここに言及により挿入される。
【０００２】
【発明の属する技術分野】
発明の背景
本発明は、一般に、インビボでの細胞を選択的に破壊する治療及び種々の癌やビールス感染の処置に有用な組成物に関する。
特に、本発明は感染細胞を標的化でき、細胞が死滅又は中和化するような局所性炎症応答を誘発できる遺伝子操作的手法による抗体融合構成体に関する。
腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）及びリンフォトキシン（ＬＴ又はＴＮＦβ）は先ず特定の腫瘍を直接殺すそれ等の能力に基づいて同定された。しかしながら、他の多くの生物学的活性が今やサイトカインと密接に関連している。これ等としては、組織適合性抗原及び付着レセピターの誘導等様々の細胞型に対する効果、並びにそれ等から結果する炎症、血管透過性変化及び単核細胞浸潤の効果が含まれる(Goeddel, D.V.(1986) Symp. Guant. Biol. 51:597, Cold Speing Harbor; Beutler, B. and Ruddel N. G. (1988) Ann. Rev. Immonol. 6:407) 。ＴＮＦαとＬＴは何れも半減期が極めて短いので、これ等炎症反応は全身的には起こらず、ＴＮＦ生成細胞の遊離箇所においてのみ起こる。 この局所性炎症応答性は、固形腫瘍や他の病変組織の治療において用いることができる。例えば、ＴＮＦα又はＬＴの何れかを腫瘍箇所に特異的に放出できれば、局所的炎症応答は、天然型キラー細胞、大きな顆粒状のリンパ球及び好酸球のようなエフェクター細胞、即ち抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性に必要とされる細胞の放出を導くことができる。
【０００３】
リンフォカインをインビボで特異的部位に供給する方法は、その特定部位に特有な免疫グロブリンをリンフォカインと結合することである。しかしながら、タンパク質領域の免疫グロブリン鎖又は断片のカルボキシ末端への融合は、融合されるべきタンパク質と免疫グロブリンの両者に、特に抗原結合、集合及びエフェクター機能に関し、予測不能の結果をもたらす。例えば、個々のタンパク質の望まれる生物学的機能は最終生成物では維持されないことがある。
【０００４】
他の、免疫グロブリン鎖にたいする融合タンパク質としてのリンフォカインＬＴのようなタンパク質発現に伴う問題は、天然型分子が三量体として可溶性状態で存在し、この形態でより効率的にレセプタと結合していることである。かくして、ＬＴが免疫グロブリン重（Ｈ）鎖とアミノ末端を介して結合し、二対のＨ鎖融合ポリペプチドを含む完全なＩｇ分子に集合されるときには、三量化は尚、形成されないようである。第二に融合ＬＴがそのレセプター結合する能力は、もし、遊離アミノ末端がレセプター結合活性に必要とされれば、厳しく制限される。事実、ＴＮＦαのアミノおよびカルボキシル末端は、そして多分、ＬＴも共にレセプター相互作用に必要とされる構造となっているものと推定されている。
【０００５】
【本発明の課題】
本発明の目的は、インビボで細胞を選択的に破壊できる組成物及びこれを達成する為の治療方法の提供にある。本発明は又、標的細胞を直接破壊するため、または標的細胞に致命的な環境を創出することによって標的細胞を破壊するために、サイトカインを標的細胞に選択的に供給する組成物及び治療方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
発明の要約
本発明は、免疫グロブリン（Ｉｇ）、典型的には重鎖とサイトカインを含む免疫複合体であって疾病を処置のための免疫複合体の使用に関する。免疫複合体は、Ｉｇの抗原結合活性とサイトカインの生物学的活性を保持し、そしてサイトカインを標的細胞に特異的に供給するのに用いることができる。
用語「サイトカイン」は、ここでは、細胞によって生成、分泌され、そしてサイトカインに対する受容体をもっている細胞中に特異的応答を引き起こすタンパク質、その類似物、またその断片を指す。好ましいサイトカインとしては、インターロイキン−２「ＩＬ−２］のごときインターロイキン、顆粒球マクロファ−ジコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のような増血因子及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）である。
【０００７】
用語「リンフォカイン」は、ここでは、活性化したリンフォサイトによって生成され例えばリンフォトキシンのようなリンフォカインにたいするレセプターを有する細胞内に特異的応答を誘導する能力を有するタンパク質、その類似物またはその断片を指す。リンフォカインはサイトカインの典型例である。
好ましい実施例において、免疫複合体は標的抗原にたいして特異的な可変領域と重鎖のカルボキシ末端でサイトカインにペプチド結合によって結合する不変領域とから成るキメラＩｇ鎖から成る。
【０００８】
本発明の免疫複合体は、それ等の構造の二つの観点からみて、キメラと考えて良い。先ず、免疫複合体は、それが与えられたサイトカインと融合し適切な抗原結合特異性を保持する免疫グロブリン鎖（通常重鎖だがそれに限らない）を含むと言う意味でキメラである。第二に本発明の免疫複合体は、それが可変領域と通常、該可変領域又は他の可変領域に接続する不変領域を含む、即ちＶ／Ｃキメラ；例えば、異なる天然の抗体分子または異なる種起原の可変又は不変領域を含むという意味でキメラとして良い。又、用語「免疫複合体」（”ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ”)に包括されるのは、Greg Wibter等、GB2,188,638 より開示されたような枠体領域から成る結合領域と可変領域を有する異なる種からの構成体（即ち、相補を決定する領域) でもある。好ましくは、免疫複合体のサイトカインは、ＬＴ又はＴＮＦαのごとき未融合状態で二量体又は多量体を天然に構成するタンパク質であっても良い。
【０００９】
好ましい実施例では、キメラのＩｇ鎖ＣＨｌ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む重（Ｈ）鎖から成る。タンパク分解酵素切断部位はＩｇ重鎖とサイトカインの間に見いだされ複合体が標的細胞に達すると、サイトカインは重鎖から切断されるようになる。「タンパク分解酵素切断部位」は配列の内部又は近接してもつ切断部位をタンパク分解酵素によって認識されるアミノ酸配列である。好ましくは、可変領域は、マウスから誘導され（即ち、そのＤＮＡ配列又はそのアミノ酸配列は、マウス起源のＤＮＡ配列又は同起源のアミノ酸配列に基づき、そして不変領域（好ましくは、枠体領域と可変領域のアミノ酸を含む）は、ヒトから誘導され、重鎖の可変領域はビールス感染細胞、又は腫瘍付随又はビールス抗原に特異的なＩｇから誘導される。好ましくは、キメラＩｇ鎖は、それを適当な対応品（軽、重）と組み合わせることにより、次に標的抗体に特定な二価の免疫複合体の生成する一価の抗原結合領域を形成し、免疫複合体とされる。
本発明は又、上述の免疫複合体をコードするＤＮＡ構成体及び細胞系統、例えば、これ等構成体によって形質転換される骨髄腫類を含む。
【００１０】
本発明は選択的にサイトカインを標的細胞に供給する方法であって、その方法は標的細胞に特異的な可変領域とカルボキシル末端でペプチド結合によってサイトカインに結合した不変領域とを有するＩｇ重鎖とキメラＩｇ重鎖と結合したＩｇ軽鎖を含むキメラＩｇ鎖とから成り、機能的抗原結合部位を形成し、そして患者のもつ標的細胞に体して標的細胞に達するのに充分な量の免疫複合体を投与できるサイトカイン免疫複合体を提供する。
本発明はかくして、抗原結合特異性と抗体活性が一分子に結合し、サイトカインの生物学的活性も組み合わされた免疫複合体を提供する。本発明の免疫複合体は、インビボでの標的細胞にサイトカインを選択的に供給し得るものであり、シキトンをして局所的炎症応答、Ｔ細胞の成長と活性化の刺激作用ＡＤＣＣ活性等局部的生物学的活性を行わしめるものである。かかる複合体は、本発明の方法に従い、それ等の特異性及び生物学的活性に依存して、標的化細胞溶解により、ビールス感染、又は癌等を含む疾病の処置に用いられる。
【００１１】
【発明の実施形態】
本発明は、悪性腫瘍細胞又はビールス感染標的細胞を殺すのに有用な免疫複合体に関する。この免疫複合体は、ビールス感染細胞若しくは悪性腫瘍細胞上の表面抗原にたいして特異性を有する抗体部を有する複合体、及びサイトカインを含む。
【００１２】
図１は代表的な免疫複合体１０の概略図をしめす。この実施例において、サイトカイン分子２及び４は、抗体の重鎖ｌ４及び１６のＣＨ３領域１０及び１２のカルボキシ末端６及び８と結合したペプチドである。ＶL領域２６及び２８には、ＶH１８領域及び２０と通常のＩｇ形態で対をなし、これによって、免疫複合体１０のアミノ末端に二つの抗原結合部位３０と３２を、免疫複合体１０のカルボキシ末端に二つのサイトカイン・レセプター結合部位４０と４２を提供する・勿論、より広い観点からは、免疫複合体は、図示のように対をなす必要はない。
【００１３】
本発明の免疫複合体は、遺伝子工学の技術によって、即ちキメラ免疫複合体をコードする核酸構成体を生成することによって、製造される。好ましくは、本発明の免疫複合体をコードする遺伝子構成体は、５’と３’の方向に重鎖の可変領域をコードするＤＮＡ断片、重鎖の不変領域をコードするＤＮＡ断片及びサイトカインをコードするＤＮＡから成る。融合される遺伝子は、それが発現されるところで、適切なレシピエント細胞の形質転換のため、発現ベクター中に組み込まれるか挿入される。ハイブリッド鎖は軽鎖（または重鎖）と反対部分で結合され、一価及び二価の免疫複合体を成す。サイトカインは、治療上価値のある生物学的機能を有するどんなサイトカインでも良いし、又その類似物または断片でもよい。有用なサイトカインはインターロイキン及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）のごとき増血因子を含む。マルチメトリック構造が機能することを要するＬＴ及びＴＮＦαのごときリンフォカインを用いることもできる。リンフォカイン又はサイトカインをコードする遺伝子は、デノボにクローンされても良いし、入手可能な原料から取得しても良いし、又公知のヌクレオチド配列から標準のＤＮＡ合成をもちいて合成しても良い。例えば、ＬＴのＤＮＡ配列はNedwin et al. (1985) Nucleic Acid Res. 13.6361. 同様に、インターロイキン−２の配列はTaniguchi et al. (1983) Nature 302:305-318。顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子はGasson et al.(1984) Science 266: 1339-1342. 腫瘍壊死因子アルファはNedwin et al. l. Ibid. 以上、それぞれ参照できる。
【００１４】
複合体にたいする重鎖差不変領域は以下の五つのアイソタイプのいずれからも選ぶことができる；アルファ、デルタ、エプシロン、ガンマ又はミュー。重鎖又は種々のサブ・クラスの重鎖（Ｉｇサブ・クラスのごとき）が利用できる。軽鎖はカッパ又はラムダのいずれかをもつ。これ等の免疫グロブリン領域にたいするＤＮＡ配列は当業技術分野で良く知られている。（例えば、Gillies at al. (1989) J. Immunol. Meth, 125:191) 。
【００１５】
好ましい実施例に於いて、可変領域は標的抗原にたいして特異的な抗体から誘導される（癌細胞又はビールス感染細胞のごとき疾病細に関連す抗原）また不変領域はＣＨ１，ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。サイトカインをコードする遺伝子は （例えば、適切なリンカーによって、例えば、ＤＮＡコード （Ｇｌｙ4−Ｓｅｒ）3によって不変領域（例えば、Ｃｈ３エクソン）をコードする遺伝子の３’末端の枠内で直接或いは遺伝子間領域を介して結合される。ある種の実施例によれば、遺伝子間領域はたんぱく分解酵素切断部位をコードする核酸配列から成る。免疫グロブリンとサイトカイン間のこの位置は、標的位置に於いて、サイトカインのたんぱく分解性供給をするようにすることができる。例えば、プラスミンとトリプシンはタンパク質分解しやすい部位としてリシンとアルギニン残基の後に切断することは良く知られている。多くの他の部位特異的エンドペプチダーゼとそれがアタックするアミノ酸配列は良く知られている。
【００１６】
核酸構成体は、キメラ免疫グロブリン鎖の発現を調節するため、変異領域をコードする遺伝子に対する内生のプロモータ及びエンハンサを含む。例えば、可変領域をコードする遺伝子は、リーダーペプチドから成るＤＮＡ断片として、軽鎖にたいしてはＶＪ遺伝子として（機能的に再配置され、接合（Ｊ）部分を有する可変領域（Ｖ））、重鎖にたいしてはＶＤＪ遺伝子として、そしてこれ等の遺伝子にたいする内生プロモタ及びエンハンサとして得られる。或いは、可変領域をコードする遺伝子は内生調節成分とは別個に得られ、これ等の成分を提供する発現ベクターの中で用いることもできる。
【００１７】
可変領域遺伝子は、所望の抗体を生成する細胞から標準クローニング技術を用いて得られる。特異的な機能に再構築した可変領域にたいするゲノム・ライブラリーのスクリーニングは、Ｊ領域配列及び下方の配列を含むＤＮＡ断片のような適切なＤＮＡプローブを用いることによって達成できる。正確なクローンの特定と確認は、次にクローン化した遺伝子のＤＮＡシーケンシングとその配列の全長に対応する配列、適切にスプライスしたｍＲＮＡと比較することによって達成できる。
【００１８】
標的抗原は腫瘍細胞、ビールス感染細胞又は他の疾患の有る細胞の細胞表面抗原である。適切な可変領域をコードする遺伝子は、一般に、Ｉｇ生成リンパ球様細胞から得られる。例えば、腫瘍関連抗原またはビールス抗原に特異的なＩｇを生成するハイブリドーマ細胞系は標準の体細胞ハイブリダイゼーション法によって生成できる（米国特許第４，９６，２６５号＊参照−ｓｉｃ）。これ等のＩｇ生成細胞系は、機能的に再構築された形態の可変領域遺伝子源を提供する。この可変領域の遺伝子は、ネズミ系は広範な所望特異性Ｉｇｓの生成を可能にするので、通常ネズミをオリジンとする。
【００１９】
機能的に再構築された可変領域の遺伝子を含むＤＮＡ断片は、所望の不変領域（またはその一部）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片に結合される。Ｉｇ不変領域（重および軽鎖）は、標準の遺伝子クローニング技術によって抗体産生細胞から得られる。ヒトの軽鎖２種とヒトの重鎖５種がクローンされた。かくして、ヒト・オリジンの不変領域がこれ等のクローンから容易に得られる。
ハイブリッドＩｇＨ鎖をコードする融合遺伝子は、レシピエント細胞に導入されるための発現ベクターに組み込まれ或いは挿入される。遺伝子構成体のプラスミッドベクターへの導入は標準の遺伝子スプライシング法で達成される。
キメラＩｇＨ鎖は同一細胞内で対応するＬ鎖と共に発現され、完全な免疫グロブリンが同時に発現、同時に集合される。この目的のため、重軽鎖構成体は、同一または別のベクター中に置かれても良い。
【００２０】
レシピエント細胞系列は一般に、リンパ球系の細胞である。好ましいレシピエント細胞は骨髄腫（またはハイブリドーマ）である。骨髄腫は形質転換された遺伝子によってコードされた免疫グロブリンを合成し、集合し分泌し、タンパク質をグリコシル化する。特に好ましいレシピエント細胞は、通常は内生の免疫グロブリンを生じないＳｐ２／０骨髄腫である。形質転換されると、この細胞は形質転換遺伝子構成体によってコードされたＩｇをのみ生成する。形質転換した骨髄腫は培養液またはマウスの腹腔で成長し得、そこで分泌される免疫複合体は腹水から回収される。Ｂリンパ球のような他のリンパ球系の細胞もレシピエント細胞として用いることができる。
【００２１】
リンパ球系の細胞をキメラＩｇ鎖をコードする核酸構造体を含むベクターで形質転換するのに、数種の方法がある。ベクターとリンパ球系細胞に導入するより好ましい方法は、ｓｐｈｅｒｏｂｌａｓｔ融合による(Gillis et al.(1989) Biotechnol. 7:798-804参照) 。他の方法はｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｏｒａｔｉｏｎ及び燐酸カルシウム沈澱法を含む。
【００２２】
免疫複合体を作る他の有用な方法は、構造物をコードするＲＮＡ配列を作成し、適切なインビボまたはインビトロ系でその翻訳をすることである。
本発明の免疫複合体は、サイトカインを体内の標的細胞に選択的に供給し、サイトカインが局所炎症応答、Ｔ細胞成長と活性化の刺激及び亜ＤＣＣ活性等の局部的生物学的効果を及ぼすことである。免疫複合体の治療的有効量が標的細胞をもつ被検者の循環系に投与される。
【００２３】
【実施例】
本発明は更に、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるがこれによって発明が限定されるものではない。
１．プラスミッドの構築
以下に記述されるのは、ＰｄＨＬ２の構築、即ち、ヒトのＣγ１重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子配列を含むプラスミッドとＶ領域ｃＤＮＡカセットの挿入位置である（Gillies et al. (1989) J. Immunol, Meth. 125:191 参照）。このプラスミッドは何れのＩｇＨ鎖サイトカイン融合を構成するための出発プラスミッドとして用いられる。例えば、ＰｄＨＬ２はＩｇ／ＬＴ融合タンパク質の発現のために用いられる。ＬＴ ｃＤＮＡはλｇｔ１０にクローンされたヒトの抹消性の血液白血球ライブラリーから分離された。配列はNedwin et al. による文献に報告されたものと同一であった（Nucleic Acid Res.(1985)13:6361) 。ｃＤＮＡは、先ず３’未翻訳領域の殆どをＢ１３１ヌクレアーゼで除去した後、ＸｈｏＩ断片としてベクターｐＤＥＭ（Gillies at al., ibid) に挿入された。その結果、プラスミッド、ｐＤＥＭ−ＬＴ（図２）は（形質転換された細胞中に）メタロチオネイン（ＭＴ）プロモータから誘導された５’未翻訳配列と共に、融合ｍＲＮＡを、そしてＬＴをコードする配列、３’未翻訳７及びマウスＣｋ遺伝子からのポリＡ追加信号を発現した。
【００２４】
融合タンパク質をコードするベクターは合成ＤＮＡリンカーを用いてＨｉｎｄIIIとＰｖｕIIで消化したＰＤＥＭ−ＬＴにＨｉｎｄIIIでＴａｑI（ＣＨ２−ＬＴ）にあるいはＨｉｎｄIIIでヒトＣγI遺伝子のＮｓｉI断片に結合することによって構築した（図２）。
【００２５】
これらのリンカー：
（５’−ＣＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡ／ＣＴＣＣＣＴＧＧＴＧＴＴＧＧＣＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＣＡＧ−３’（配列表配列番号１）（ＣＨ２−ＬＴにたいして）；及び
５’−ＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＡＡ／ＣＴＣＣＣＴＧＧＴＧＴＴＧＧＣＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＣＡＧ−３’）（配列表配列番号２）
は特異な位置（ＮｓｉＩまたはＴａｑＩ）から重鎖ドメイン （スラッシュによって示される）の末端までの配列をコードするタンパク質を提供し、それ等を成熟した型のＬＴのアミノ末端に結合する（特異的なＰｖｕlang=EN-US>II部位の上）。ＣＨ３融合タンパク質に対するリンカーは融合タンパク質をつくるのに将来の使用のため、ドメインの末端近傍にＳｍａＩ位置を創生する沈黙突然変異を含む。各構築物の境界にあるＤＮＡ配列が確認され、Ｈｉｎｄlang=EN-US>IIIからＥｃｏＲＩへの断片はプラスミッドｐｄＨＬＺ−ＶＣγｌｋ（１４，１８）に挿入された。このプラスミッドは、ｃｈ１４．１８抗ガンゴリオシドＧＤ２抗体のＶカセットを含む（lang=EN-US>Gikkies et al., ibid.)。
【００２６】
２．細胞培養と形質転換
Ｓｐ２／0 Ａｇ１４マウス・ハイブリドーマ細胞は、Gillie at al. (BioTechnology(1989) 7:8799)に述べられたように維持し、形質転換をおこなった。メトトレキセート（ＭＴＸ）中での薬物選択は、形質転換後２４時間で、等量の０．１μＭＭＴＸを含む培地を加えることによって開始された。３日の間隔おいて、選択媒体は２度に亘って供給された。ヒトＩｇ決定要素分泌形質転換体はELISA を用いて特定され(Gillies et al., 1989, ibid ）５μＭのＭＴＸを含む培地中での限界希釈によって継代培養された。
【００２７】
３．融合タンパク質の精製と特徴
タンパク質は、形質転換された細胞（１ｘ１０6 ／ｍＬ）を35Ｓ−メチオニン（５０μＣｉ／ｍＬ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む成長培地中で１６時間インキュベートして生合成的に標識した。培地上清は、次にマイクロセントリフュウジ中で遠心分離によって清澄し、標識したタンパク質はポリクロナール抗ヒトκ鎖抗血清（Jackson Immunoresearch, Bar Harbor, Cambridge, ME)とプロテインＡセファロース（Repligen, Vorp., Cambridge, MA) で免疫沈澱せしめた。タンパク質サンプルは２−メルカプトエタノールの存在下または非存在下でゲル・サンプル・バッファー中で５分間煮沸し、７％ポリアクリルアミド・ゲルで分析された。タンパク質は、蛍光間接撮影法（ＤＭＳＯ中ヂフェニールオクサゾール）とオートラジオグラフ法で検出された。
【００２８】
未標識化タンパク質は、鹸濁液状の培養媒体からＣＨ２−ＬＴに対するモノクロナール抗ヒト抗体を用い免疫親和性クロマトグラフィ使って、又ＣＨ３−ＬＴに対しては、プロテインＡセファロースクロマトグラフィを使って精製した。全ての物質は、ＰＢＳへの膜浸透を用いて濃縮した。Ｃｈ３−ＬＴタンパク質を精製する方法も開発され、プロテインＡカラムからの溶出中ＬＴ活性の損失を防いだ。使用済培養液は１０ｍＭ燐酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）の３倍量で希釈し、室温でＢａｋｅｒｂｏｎｄ Ａｂｘ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）カラムにいれた。カラムは、吸光度の吸収率が基線に戻るまで１０ｍＭ燐酸ナトリウムバッファーで洗浄し、次にｐＨ６．５もＰＢＳ（１５０ｍＭＮａｃｌ、１０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ６．５）で洗浄した。ＣＨ３−ＬＴタンパク質は１５０ｍＭＮａｃｌ、５０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ６．５で溶離した。
【００２９】
４．活性測定
Ｉｇ−ＬＴタンパク質の抗原結合活性はGillies et al. (J. Immunoi. Meth. (1989) 125:191) に述べられたように測定され、ＬＴ活性はマウス９２９の１５９１２４Ｔ２．５サブ・クローン（Dr, F. Schreiber. University of Chicago により提供）を用いて、細胞溶解または細胞増殖抑制分析（Kahn et al. (1982)）によって決定した。細胞は９６−穴にプレートに、 （細胞溶解）或いは（細胞増殖抑制）マイトミシンＣ（２μｇ／ｍＬ）を用いて或いは用いずに穴当たり４ｘｌ０4 細胞を蒔種し、２４時間後１０μＬの試験サンプルがくわえられた。細胞は２４時間または４８時間後、クリスタルバイオレットで染色され（図の説明参照）穴中に残る染料の量が未処理の穴のそれ及びＬＴ標準値(Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ)。同じ分析が、ＧＤ２−保持ヒト黒色腫ラインＭ２１（D. L. Morton, Universityof Californiam Los Angelesより提供）で行われた。後者の細胞系統は、上述の通り、ＣＤＣ及びＡＤＣＣ活性の測定に用いられた。(Gillies et al.(1990) Humann Antibody. Hyvridomas 1:47)
【００３０】
５．Ｉｇ／ＬＴ免疫複合体の発現
Ｉｇ／ＬＴ免疫複合体は、適切な合成リンカーを用いて、成熟型ＬＴをコードするｃＤＮＡ配列をヒトＣγ１遺伝子（図２）のＣＨ２又はＣＨ３のエクソンの端部に融合することによって作られた。この遺伝子の融合は、次にネズミの抗体１４．１８とヒトＣκ遺伝子のＶ領域とともにベクターで組み合わせられ、形質転換されたＳｐ２細胞に発現された。これ等の免疫複合体は、抗原結合活性とＩｇ鎖組立のために発現され、試験された。免疫複合体は、競合的抗原結合ＥＬＩＳＡ（以下参照）で測定されたとき、抗原結合を保持し、そして構築された。これ等の免疫複合体を発現する細胞は15Ｓ−メチオニンと呼ばれ、分泌されるタンパク質は還元剤の存在下で又非存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。
図３に見られるように、ＣＨ２−ＬＴ免疫複合体は全分子 （約１８０Ｋｄ）と半分子（９０Ｋｄ）の混合物として発現される。ＣＨ３−ＬＴ融合タンパク質は、他方に於いて、全分子で構築される構造をもつ。この結果は、ＣＨ３領域はＩｇ鎖構造に深く関わっていることから、驚くべきことではない。ＣＨ２−ＬＴの構造が何故成り立つか、即ち、抗体のヒンジ領域の二硫化結合をもつということは、カルボキシ末端のＬＴ領域の二量化によるものとみられる。
【００３１】
６．Ｉｇ／ＬＴ複合体の生物学的活性
ＣＨ２−ＬＴ及びＣＨ３−ＬＴ複合体のＬＴ活性は、マウス９２９サブ・クローンを用い、標準的な細胞溶解分析で比較できる（Kahn, A. et al. (1982 ）"A standardized automated computer assisted micro-assay for lymphotoxin."In: HumanLymphokines, Biological Response modified;(Kahn and Hill, eds.) AcademicPress, New York, p. 23)。この測定法は、免疫複合体のＴＮＦ／ＬＴレセプタへの結合能力と、この細胞系統における生細胞死滅プロセスを発動させる能力を測定する。粗原料の作成と比較すれば（培養液上清）（図４Ａ）、ＣＨ３−ＬＴはＣＨ２−ＬＴより極めてより活性的（この分析によれば約１００倍）であることが分かり、ＬＴ標準と約同じのモル当たりの比活性を示している。このＣＨ３−ＬＴのより高い活性は充分に構成されたＨ−鎖融合タンパク質のより多い配分によるとみられる。かくして、免疫複合体に於けるＣＨ３エクソンの存在は、Ｈ−鎖をしてより効率的に関与せしめ、多分ＬＴ領域の二量体化を許容し、その結果、より大きなＬＴレセプタ結合の許容するように配置せしめるものと思惟される。
【００３２】
精製調製品を比較すると、ＣＨ２−ＬＴとＣＨ３−ＬＴの活性の差異は更に明白になるが、複合体の活性は、特にＣＨ３−ＬＴでは、ＬＴコントロールと比して大きく減少する(図４Ｂ)。両方のタンパク質が酸性ｐＨ（即ち、ｐＨ４より小）溶出工程を用いることによって精製されたので、培養液上清のｐＨ感受性を調べ、ＬＴ活性は酸に極めて影響されやすいことがわかった。
他の精製様式が、ｐＨを６．５以下にならないように計画された。この様式による材料がプロテインＡのより精製されたもの、出発材料及びＬＴ標準と比較された。マイトミシンＣ非存在下の細胞増殖抑制分析の結果、図５に示す通り、低いｐＨを避けると、精製中、充分なＬＴ活性が維持されることを示す。この測定は、ＬＴ制御により良い投与量応答が得られること、ＣＨ２−ＬＴとＣＨ３−ＬＴの間の関係は両者の分析システムに首尾一貫していることを示す。同じ結は、細胞溶解の分析でも得られた。
以上の結果は、（この分析で測定されるとき）、ＬＴがＩｇＨ鎖に融合すると充分な活性が維持されることを示している。ＬＴアミノ末端が抗体のカルボキシ末端と共有結合で結合されるという事実は、ＬＴレセプタ結合を妨げず、結合工程後、細胞死滅プロセスを妨げることはないようである。
【００３３】
７．抗原結合とエフェクター
Ｉｇ／ＬＴ免疫複合体の機能
免疫複合体も抗原結合活性は、抗原で被覆したプレート上で、直接結合又は拮抗的分析形式で測定される。直接的結合分析では、抗原結合活性はコントロールｃｈ１４．１８抗体のそれよりずっと高いことが分かった。ＧＤ２抗原源は神経芽細胞腫細胞からの、粗い膜エキスであったので、ＴＮＦ／ＬＴレセプタを準備に存在せしめ、ＬＴ領域を通しての複合体の結合はこの増大した活性に効果があった。抗原結合を拮抗分析で測ったとき、複合体は標識ＣＨ１４．１８抗体とほぼ同じであり、抗原は非標識化ｃｈ１４．１８より僅かに有効であるに過ぎなかった。
【００３４】
この結果によれば、抗腫瘍細胞抗体の抗原結合活性をサイトカインの効力のある生物学的活性と組み合わせることは可能である。免疫複合体中のＣＨ３エクソンの存在は、完全なＨ−鎖の構築を可能にし、その結果、より高いＬＴとエフェクター活性に至ることになる。Ｈ−鎖の組立は、ＬＴの二量体化をもたらすものとおもわれる。
更に、高度に活性のあるＣＨ３−ＬＴ免疫複合体では、ＬＴ領域のアミノ末端はＩｇＨ鎖にペプチド結合されるので、遊離のアミノ末端はＬＴのそのレセプタへの結合には不必要である。
【００３５】
８．Ｉｇ／ＧＭ−ＣＳＦ免疫複合体の構築と発現
Ｉｇ／ＧＭ−ＣＳＦ複合体はＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸配列をＩｇ重鎖をコードする核酸配列に結合し、それによって、コードされたタンパク質がカルボキシ末端を介してＧＭ−ＣＳＦに融合された重鎖を含むようにした。ＧＭ−ＣＳＦの配列をコードする成熟したタンパク質は、ＬＹ複合体に付き上述したように、そして当業技術分野で良く知られているいるように、ＰｄＨＤＬ２及び適切なオリゴヌクレオチドリンカーを用いて、ヒトＣγ１遺伝子に結合される。又、ＬＴ複合体について上記したように、Ｉｇ重鎖ＧＭ−ＣＳＦ融合遺伝子は１４．１８抗ＧＤ２重鎖の重鎖Ｖ領域の遺伝子と組み合わされ、ヒトｃｋ遺伝子及び１４．１８抗体のＶ領域遺伝子と結合された。次に、ＤＮＡのハイブリドーマ細胞への形質転換、その結果としてのＨ及びＬ遺伝子の発現後、ＧＭ−ＣＳＦは各Ｈ鎖に接合した完全なｃｈ１４．１８抗体が生成された。融合タンパク質は、プロテインＡセファロースへの吸着及びそれからの溶出を用い調整した媒体から精製した。
【００３６】
融合タンパク質は１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミッドを用い（図８）、還元（Ｒ）条件で、又は非還元条件（ＮＲ）で、電気泳動により分析された。タンパク質は、クマジーブルーを用い、染色され視覚化された。レーンｌはｃｈ１４．１８−ＣＨ３−ＧＭＣＳＦ；レーン２はｃｈ１４．１８；分子量マーカーは指示された大きさでｋＤで表示された。レーンｌの融合Ｈ−鎖の相対的分子量７５ｋＤは、Ｈ−鎖（５０ｋＤ）に融合されたグリコシル化ＧＭ−ＣＳＦ（〜２５ｋＤ）と一致する。非還元レーンｌで、融合タンパク質が〜２００ｋＤの単一高分子量種に成っていることに留意。
【００３７】
９．Ｉｇ／ＧＭ−ＣＳＦ複合体の生物学的活性
ｃｈ１４．１８−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質のＧＭ−ＣＳＦ活性は、ＧＭ−ＣＳＦ依存細胞系統ＡＭＬ−１９３（ヒト急性骨髄性白血病）を用いて増殖分析で検討された。細胞は、インシュリンとトランスフェリンを含む血清のない媒体で２日間培養された（ＧＭ−ＣＳＦのない状態で）。そして、ＧＭ−ＣＳＦ即ち、融合サンプルを薄めて添加された。五日後に、５μＣｉのチミヂンが加えられ、１６時間後。、細胞は１０％トリクロロ酢酸の中に回収された。３０分後、氷上に析出物質ＧＦ／Ｃフィルターで集められ、乾燥され、液体シンチレーションで測定された。
【００３８】
図９において、ＧＭ−ＣＳＦの各種量、分泌融合蛋白質またはプロテインＡセファロースによって精製されたｃｈ１４．１８−ＧＭ−ＣＳＦを含むコンデイション培地で得られた増殖が比較された。結果は、一度分子がＨ−鎖に融合すると、有意のＧＭ−ＣＦＳ活性が維持されることを示している。だが、活性はｇＧＭ−ＣＦ標準値（精製された融合タンパク質）の２０％（調整された媒体の時）か１０％である。最大の取り込みは精製融合タンパク質（ＧＭ−ＣＳＦ等価値又は全タンパク質の５０ｎｇ）の１０ｎｇ／ｍＬ以下であった。この僅かな活性の損失はこの融合タンパク質も有用性に影響するとは思えない。これは、特に大量のｃｈ１４．１８−ＧＭ−ＣＳＦがＤＧ２抗原を発現する固型腫瘍に集積するときである。
【００３９】
免疫複合体のインビボの半減期は、マウスにＣＨ１４．１８−ＧＭ−ＣＳＦＷＯ注射（尾の静脈に２０μｇ注射）して決定された。血液のサンプルを指定時間に回収し、血清中の融合タンパク質の量をＥＬＩＳＡにより決定した。捕獲抗体は、ポリクロナールヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）で、検出抗体はペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ヒトＫであった。表１に見られるように、半減期（２４時間と４日の時間点を取った）はほぼ３日であった。これはヒトの場合の８５分(Herrmann et al. (1989) J. Clin Oncol. 7:159-167) と比較になる。この長い半減期は、特に腫瘍部分の免疫複合体の局所濃度は抗体標的によって長くなり得るから、融合タンパク質の減少した活性の補償するものといえる。
【００４０】
Figure 0003860398
* ネズミは尾の静脈部に融合タンパク質ch14.18-CH3-GM-CSFを20μg 注射された。
小さいサンプル(-50μL)が尾の静脈部から採取され、ヒトの抗体の決定因子のため分析された。
【００４１】
１０．Ｉｇ／ＴＮＦ免疫複合体の構築、発現及び活性
Ｉｇ／ＴＮＦ免疫複合体は、ＴＮＦαをコードする核酸配列と免疫グロブリン重鎖を融合して、それによりＴＮＦαが重鎖のカルボキシ末端に融合するようにして、作成された。簡単には、成熟したＴＮＦαをコードする配列を、オリゴヌクレオチドを用い、ヒトＣγ１ ＣＨ３エクソンの末端に融合した。再構築された断片は、抗−ＧＤ２マウス抗体１４．１８からの遺伝子をコードする重鎖Ｖ領域の下方で結合する。このベクターに更に加わるのは、抗−ＧＤ２マウス抗体１４．１８からの軽いＶ領域をコードするＶ領域遺伝子とＣ領域符合化遺伝子の両方を含むヒトκ遺伝子である。ハイブリドーマ細胞は、上述のように、形質転換され、選択される。ヒト抗体決定因子を分泌するクローンは、拡張され、プロテインＡセファロースクロマトグラフィーのよってｃｈ１４．１８−ＣＨ３−ＴＮＦα融合タンパク質の生成と精製のために用いられる。融合タンパク質の活性は上述のようにＣＨ３−ＬＴ融合タンパク質に対してテストされた。
【００４２】
図１０に示されるように、融合タンパク質で得られる細胞毒性の量は分析の早期（２０ｈｒ）又は後期（２４ｈｒ）で天然型のＴＮＦαのそれに達するか上回るかした。この融合タンパク質は、たとえそれがプロテインＡセファロースを用いて精製されたとしても、ＴＮＦα活性として充分に機能的である。ＣＨ３−ＬＴ構造体は同じプロトコルを用いて、酸性のｐＨでは溶出により部分的に不活性になった。
Ｉｇ／ＬＴ、Ｉｇ／ＧＭ−ＣＳＦ及びＩｇ／ＴＮＦα免疫複合体について上述の結果はの示すところは、抗体は一般に、抗原結合活性又は抗体の機能を失なわずにサイトカインに融合できるということであり、またサイトカインのレセプター結合活性も生物学的能力も失わずにこれができるということである。
【００４３】
１１．適用量
本発明の免疫複合体は、一日当たりｌ００ｍｇ／ｋｇ体重比の範囲で治療上有効な適用量で投与できる。免疫複合体は生理的食塩水で或いは他のどんな生体適合性緩衝液でも投与できる。この液は全身性に投与できる（例えば、静脈又は筋肉注射で）。
【００４４】
他の実施例
本発明は、その精神と本質的特徴から離れることなく、他の特定形式でも実施できる。本文中の実施例は、従って、あらゆる観点において、例示的とみなされるべきで、限定的に考えられるべきではない。本発明の範囲は、以上の記載からではなく、添付する請求項で示される。従って、請求項の意味及び等価の範囲に入るあらゆる変更はその範囲に包含される。
【００４５】
【図面の簡単な説明】
本発明の以上及び他の目的、及びその種々の特徴は添付する図面とともに読まれるとき、以下の記載からより充分に理解されよう。
【図１】 本発明の免疫複合体の一実施例の概略的説明図でさる；
【図２】 ＡはＬＴとヒトＩｇ Ｈ鎖間の融合タンパク質の概略図である；ここで、図２あはプラスミッドｐＢＲ３２２にクローンされたヒトＣγ１遺伝子断片地図である；図２ＢはＣＨ２領域の末端でＬＴに融合されたＣγ１遺伝子を示す；図２ＣはＣＨ３領域の末端でＬＴに融合されたＣγ１遺伝子を示す；図２Ｄはプロモータ（矢印）、ＬＴ（空欄）の天然型リーダーペプチド、成熟タンパク質（＋１）の第一の残基及びマウスのκＬー鎖およびポリＡ未翻訳配列含む発現ベクターｐＤＥＭにクローンされたＬＴをコードするｃＤＮＡを示す；空欄はＡ−ＣにおけＣγ１のタンパク質コード領域を示し、ブラック・ボックスはタンパク質をコードする配列を結合するのに用いられる合成リンカー示す；そしてストライプ・ボックスはＬＴコードする配列を示す。
【図３】 ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲルの写真であり、融合タンパク質鎖集合の分析を示す；ここでキメラｃｈ１４．１８抗体はレーン１及び４に示されており、ＣＨ２−ＬＴはレーン２及び５に示されており、ＣＨ３−Ｌはレーン３及び６に示されいる。染色マーカータンパク質の位置とそれ等の見かけ状の分子量が、示されている。乾燥したゲル４時間（レーン１及び４）又は１８時間、被膜に露光された。細胞は35Ｓ−メチオニンで標識され、分泌されたタンパク質は抗ヒトκ抗血清とタンパク質で沈澱せしめ、還元（レーン１−３）又は未還元の（レーン４−６）ＳＤＳゲルで分析した。
【図４】 免疫複合体の天然型ＬＴ（△−−△）、ＣＨ２−ＬＴ（ｏ−−ｏ）又はＣＨ３−ＬＴ（●−−●）のＬＴ細胞溶解の活性を示すグラフである。マウスの繊維芽細胞の感受性クローンを用い、一日分析でマイトマシンＣを用いて行った。クリスタルバイオレットで染色し、６３０ｎｍにおける吸収率を測定して相対的細胞生存率を測定した。図４ＡはＥｌｉｓａによって複合体を最初に測定後分析され形質転換された細胞の培養上清を示す。
図４Ｂは、プロテインＡセファローズ又は免疫親和性クロマトグラフィーに引き続いて分析された精製タンパク質を示す。
【図５】 精製中のｐＨのＣＨ３−ＬＴの細胞増殖抑制活性についての精製過程における影響を示すグラフである。天然のＬＴ（ｏ−−ｏ）、培養上清のＣＨ３−ＬＴ（△−−△）、プロテインＡセファローズ・クロマトグラフィーで精製したＣＨ３−ＬＴ、ｐＨ６．５（△−−△）で精製したＣＨ３−ＬＴが、マウス９２９サブクローンを用いて、細胞増殖抑制分析（マイトマシンＣは使わず）で比較した。
【図６】 ＬＴとＣＨ３−ＬＴ ＧＤ２−陽性Ｍ２１ヒト黒色腫細胞の細胞溶解性及び細胞増殖抑制活性を示すグラフである。Ｍ２１細胞が、マイトミシンＣの存在下で（図６Ａ）又は非存在下で（図６Ｂ）９６−穴プレートに藩種され、ＬＴ（ｏ−−ｏ）又はＣＨ３−ＬＴ（●−−●）の希釈溶液が添加された。相対的細胞成長率が、４８時間後にクリスタルバイオレットで染色し、６３０ ｎｍにおける吸収率を測り、測定された。
【図７】 Ｉｇ／ＬＴ免疫複合体の抗原結合活性を示すグラフである。相対的結合率は、拮抗剤として未標識ｃｈ１４、１８ （○−−○）、ＣＨ２ーＬＴ（●−−●）又は標識ｃｈ１４、１８（□−−□）のいずれかとトレーサーとしてＨＲＰを結合したｃｈ１４、１８抗体をもちい、比較抗原結合分析で測定された。
【図８】 融合タンパク質ｃｈ１４．１８−ＣＨ３−ＧＭ−ＣＳＦ（レーンＬ）と未融合のタンパク質ｃｈ１４．１８（レーン２）の還元状態（Ｒ）または非還元状態（ＮＲ）でのＳＤＳ−ポリアクリルアニド・ゲルの写真でａｒｕ．ここで、Ｍは指定された大きさ分子量マーカーである。
【図９】 ＧＳ−ＣＳＦ標準（ｏ−−ｏ）及びコンデイション培地（△−−△）と比較したＩｇ／ＧＭ−ＣＳＦ免疫複合体ｃｈ．１４．１８−ＧＭ−ＣＳＦ（●−−●）のＧＭ−ＣＳＦ活性を示すグラフである。
【図１０】 ＴＮＦ-α（前期）（ｏ−−ｏ）とＴＮＦ-α（後期）（△−−△）と比較されるＩｇ／ＴＮＦ免疫複合体ｃｈ１４．１８−ＴＮＦ- α（前期）、ｃｈ１４．１８−ＴＮＦ- α（後期）（▲−−▲）のＴＮＦαの活性を示すグラフある。

Claims (7)

  1. Ｉｇ重鎖とサイトカインとを含んで成る、ただしＩｇ軽鎖を含まないキメラ免疫グロブリン（Ｉｇ）鎖であって、
    該Ｉｇ重鎖は可変領域と、ＣＨ１及びＣＨ２領域を含有する不変領域とを有するものであり、
    該可変領域は、Ｉｇ軽鎖の可変領域と組合せて使用されると、ガングリオシドＧＤ２に特異的な機能的抗原結合部位を形成し、かつ
    該不変領域は、ペプチド結合を介してサイトカインのアミノ末端アミノ酸に結合している、
    前記キメラ免疫グロブリン鎖。
  2. Ｉｇ重鎖とサイトカインとを含んで成る、ただしＩｇ軽鎖を含まないキメラ免疫グロブリン（Ｉｇ）鎖であって、
    該Ｉｇ重鎖は可変領域と、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含有する不変領域とを有するものであり、
    該可変領域は、Ｉｇ軽鎖の可変領域と組合せて使用されると、ガングリオシドＧＤ２に特異的な機能的抗原結合部位を形成し、かつ
    該不変領域は、ペプチド結合を介してサイトカインのアミノ末端アミノ酸に結合している、
    前記キメラ免疫クロブリン鎖。
  3. （ａ）請求項１または２に記載のキメラ免疫グロブリン鎖、および
    （ｂ）該キメラ免疫グロブリン鎖中のＩｇ重鎖と組合わせて使用されるＩｇ軽鎖
    を含んで成る、サイトカイン免疫複合体。
  4. 請求項１に記載のキメラ免疫グロブリン鎖をコードする核酸。
  5. 請求項２に記載のキメラ免疫クロブリン鎖をコードするリコンビナントＤＮＡ。
  6. 請求項４の核酸で形質転換したセルライン。
  7. 請求項５の核酸で形質転換したセルライン。
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