JPH02501191A

JPH02501191A - 組換え抗体及び方法

Info

Publication number: JPH02501191A
Application number: JP63507237A
Authority: JP
Inventors: ボドマー，マーク，ウィリアム; アデェール，ジョン，ロバート; ホワイトル，ナイジェル，リチャード
Original assignee: セルテク　リミティド
Priority date: 1987-09-04
Filing date: 1988-09-05
Publication date: 1990-04-26
Also published as: DK216189A; JP2675380B2; DE3877955D1; AU2301688A; CA1337640C; EP0348442B1; GB8720833D0; FI892135A0; WO1989001783A3; DE3888172D1; JP2761012B2; DK216189D0; DK215889A; FI892136A0; WO1989001974A1; DE3877955T2; FI892136A; EP0348442A1; WO1989001782A1; FI892137A0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】組換え抗体及び方法本発明は、ある種の悪性細胞上に存在する抗原に対する特異性を有するヒト化（ｈｕｍａｎ　１ｚｅｄ）抗体分子（ｌ（ＡＭ）および組み換えＤＮＡ技術を使用してそれを製造する方法に関する。

本出願において、用語「組み換え抗体分子Ｊ　（ＲＡＭ）は、組み換えＤＮＡ技術の使用を用いる方法によって産生される、自然免疫グロブリンの類似体またはそれらの断片を包含する抗体を記載するために使用する。用語「ヒト化（ｈｕｍａｎ　１ｓｅｄ）抗体分子Ｊ　（ｔｌＡＭ）は、ヒト以外の種からの免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を有する分子を記載するために使用し、この分子の残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グロブリンに由来する。抗原結合部位は、定常ドメイン上に融合された完全な可変ドメインからなるか、あるいは常に可変ドメイン中の適当なフレームワーク領域上に移植された相補性決定領域からなることができる。略号ｒＭＡｂ　Ｊはモノクローナル抗体を示すために使用する。

説明において、刊行物を番号によって引用する。刊行物はこの説明の終わりに番号順に記載されている。

天然免疫グロブリンは、多年にわたって、それらの種々の断片、例えば、Ｆａｂ、　（Ｆａｂ’　）２およびＦｃ断片を有するものとして、知られており、これらは酵素的開裂によって誘導される。天然免疫グロブリンは、上アームの各々の末端に、抗原特表平２−５０１１９１（２）結合部位を有する、略Ｙ字形分子からなる。この構造体の残部、とくにＹの幹部は、免疫グロブリンに関連するエフェクターの機能を仲介する。

天然免疫グロブリンは、アッセイ、診断および、限定された程度では治療に使用されている。しかしながら、治療剤としての免疫グロブリンの可能性の実現に向かう有意な工程は、定義された特異性のモノクローナル抗体の発見であった（１）。

しかしながら、はとんどのＭＡｂは、誓歯類牌細胞と誓書類の骨髄腫細胞との融合によって産生された。したがって、それらは本質的に誓書類タンパク質である。ヒ）ＭＡｂの産生について非常にわずかの報告が存在する。

はとんどの入手可能なＭＡｂは誓書類由来であるので、ヒトにおいて当然抗原性である。したがって、ヒトにおける療法剤としての誓書類ＭＡｂの使用は、ヒト対象がＭＡｂへの免疫応答を行い、そしてそれを完全に除去するか、あるいは少なくともその有効性を減少する点において、本来的に制限される。

したがって、ヒトにおける抗原性が低い非ヒ）ＭＡｂをつくる提案がなされてきている。このような技術は一般にＭＡｂを「ヒト化コすると呼ぶことができる。

これらの技術は、一般に、抗体分子のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作する組み換えＤＮＡ技術の使用を包含する。

このような手順を実施するいくつかの初期の方法は、欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）　０１７１４９６号（Ｒｅｖ　Ｄｅｖ、　Ｃｏｒｐ、　Ｊａｐａｎ）、欧州特許出願（ＢＰ−Ａ＞　０１７３４９４号（Ｓｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、欧州特許出願（ＢＰ−Ａ）　０１９４２７６号（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ）およびＷＯ−Ａ−８７０２６７１号（Ｉｎｔ、Ｇｅｎ、Ｅｎｇ、　Ｉｎｃ、）に記載されている。Ｃｅ１ｌｔｅｃｈ　Ｌｉｍ１ｔｅｄの特許出願は、マウスＭＡｂの可変ドメインおよびヒト免疫グロブリンから定常ドメインを有する抗体分子を調製する方法を開示している。それは、また、マウスＭＡｂの可変ドメイン、ヒト免疫グロブリンのＣＨＩおよびＣＬドメイン、並びにひと免疫グロブリンのＦｃ部分に代る非免疫グロブリン由来タンパク質を有する抗体分子の製造を示している。

欧州特許出願（ＢＰ−Ａ）　８７３（１２６２０，７号（Ｗｉｎｔｅｒ）に記載されている別のアプローチにおいては、マウスＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、長いオリゴヌクレオチドを使用する部位特異的突然変異を使用して、ヒト免疫グロブリンの可変ドメインのフレームワーク領域上に移植されてきている。

ヒト化ＭＡｂについての最も早い研究は、合成抗原、例えば、ＮＰまたはＮＩＰ抗原を認識するＭＡｂに基づいて実施されてきている。しかしながら、リソ゛チームを君忍識するマウスＭＡｂおよびヒ）Ｔ−細胞上の抗原を認識するラッ）ＭＡｂをヒト化する例は、それぞれベルヘイエンら（２）およびレイヒマンら（３）によって示された。

免疫グロブリン、とくにＭＡｂは癌の診断および処置において潜在的に非常に有用であることが広く示唆されてきている（４．５）。したがって、腫瘍特異的抗原に対して向けられた免疫グロブリンまたはＭＡｂの製造を試みる活動が多く行われてきた。これまで、種々のヒト癌に対して向けられた１００を越えるＭＡｂが、腫瘍の診断または処置の種々の面において使用されてきている（６）。

細胞表面抗原を認識するキメラモノクローナル抗体の産生に関する、刊行されたいくつかの論文が存在する。例えば、サバガンら（７）は、ヒト腫瘍関連抗原に対する特異性を保持する、遺伝子操作したネズミ／ヒトキメラ抗体を開示している。また、ニジムラら（８）は、急性リンパ性白血病共通抗原に対して特異性である、組み換えネズミ／ヒトキメラモノクローナル抗体を開示している。

本発明によれば、ＴＡＧ−７２抗原に対する特異性を有しかつ抗原結合部位を有し、可変ドメインの少なくとも相補性決定領域（ＣＤＲ）はマウスモノクローナル抗体８７２．３　（Ｂ７２．３　ＭＡｂ）に由来し、そしてヒト化抗体分子（ＨＡＭ）の残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グロブリンに由来するヒト化抗体分子（ｌ（ＡＭ）が提供される。

ＨＡＭの可変ドメインは、全体可変ドメインを含んで成るか、あるいはその上に８７２．３　ＭＡｂのＣＤＲが移植されているヒト可変ドメインのフレームワーク領域を有することができる。

８７２．３　ＭＡｂは、乳癌のヒト肝臓転移癌の膜濃縮抽出物に対して生成したＩｇＧ１−カッパ型のマウスＭＡｂである（９）。

８７２．３　ＭＡｂは、多数の研究所において広く研究されてきている。それは腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２である約１０６の分子量のムチン様分子を認識することが知られている（１０）。

免疫組織化学的研究は、Ｂ７２．３　ＭＡｂがほぼ直腸結腸癌の９０％、乳癌の８５％および卵巣癌の９５％を認識するこ七を立証した。しかしながら、それは広いスペクトルの正常ヒト組織と有意の交差反応性を示さない（１１〜１４）。

驚くべきことには、ヒト化８７２．３　ＭＡｂはその活性に悪影響を及ぼさず、そしである種の癌の治療および診断の両者においてきわめて有用であることが見出された。

好ましくは、本発明のＨＡＭは組み換えＤＮＡ技術によって製造されるであろう。

本発明のＲＡＭは、次のものを含む：全長の重鎮および軽鎖を有する完全な抗体分子；その断片、例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ’　）２断片：軽鎮または重鎮の二量体；あるいは８７２．３抗体と同一の特異性をもつ他の任意の分子。

あるいは、本発明のＨＡＭは、それに結合したエフェクターまたはリポータ−の分子を有することができる。例えば、ＲＡＭは、重金属イオンをキレート化する大環状物質、または共有結合架橋構造によってそれに結合したトキシン、例えば、リシンを有することができる。あるいは、組み換えＤＮＡ技術の手順を使用して、完全な抗体分子のＦｃ断片またはＣ１１３ドメインが酵素またはトキシン分子によって置換されているＨＡＭを製造することができる。

ＨＡＭの残部は、任意の適当なヒト免疫グロブリンに由来することができる。しかしながら、ヒト免疫グロブリンからのタンパク質配列のみからなる必要はない。例えば、ヒト免疫グロブリン鎮の一部分をコードするＤＮＡ配列がポリペプチドであるエフェクターまたはリポータ−の分子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に融合されている遺伝子を構成することができる。

本発明の他の面によれば、（ａ）発現ベクター中に抗体の重鎮または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを生成せしめ、ここで可変ドメインの少なくともＣＤＲはＢ？２．３　ＭＡｂに由来し、そして抗体の鎖の残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グロブリンに由来し：（ｂ）発現ベクター中に相補的抗体軽鎖または重鎮をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを生成せしめ、ここで可変ドメインの少なくともＣＤＲはＢ７２．３　ＭＡｂに由来し、そして抗体の鎖の残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グロブリンに由来し；（ｃ）宿主細胞を前記ベクターまたは各ベクターでトランスフェクションし；そして（ｄ）トランスフェクションした細胞系を培養してＲＡＭを産生せしめる；工程を含んで成る、本発明の第１の観点のＲＡＭを製造する方法が提供される。

細胞は２つのベクターでトランスフェクションすることができ、第１ベクターは軽鎖由来ポリペプチドをコードするオペロンを含有し、第２ベクターは重鎮由来ポリペプチドをコードするオペロンを含有する。好ましくは、ベクターはポリペプチド鎖の各々が等しく発現されることを出来るだけ保証するために、コード配列および選択可能なマーカーに関する限りを除外して、同一である。

あるいは、単一のベクターを使用することができ、このベクターは軽鎖由来ポリペプチドおよび重鎮由来ポリペプチドの両者をコードする配列を含む。

軽鎖および重鎮のためのコード配列におけるＤＮＡは、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡまたはこれらの両者からなることができる。しかしながら、重鎮または軽鎖をコードするＤＮＡ配列は少なくとも部分的にゲノムＤＮＡ配列を含んで成ることが好ましい。最も好ましくは、重鎮または軽鎖をコードする配列は、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ配列の融合体を含んで本発明のＨＡＭを発現するために使用される宿主細胞は、好ましくは真核生物の細胞、最も好ましくは哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＤ細胞または骨髄性細胞である。驚くべきことには、重鎮または軽鎖コード配列のためにｃＤＮＡ／ゲノムＤＮＡ配列融合体を使用すると、非骨髄性哺乳動物細胞における本発明のＲＡＭの産生が増大することが発見された。

こうして、本発明の１つの重要な面は、非骨髄性哺乳動物細胞中でこのような融合体を使用してＲＡＭを発現することである。

本発明は、また、本発明の方法において使用するクローニングベクターおよび発現ベクター並びにトランスフェクトされた細胞系、本発明のＨＡＭを含有する治療および診断組成物、並びにこのような組成物の治療および診断における使用を包含する。

ベクターを構成する一般的方法、トランスフェクション法および培養法はそれ自体よく知られており、そして本発明の部分を形成しない。このような方法は、例えば、参考文献（１５）および（１６）において示されている。

例として、添付図面を参照して、本発明を説明する。

第１図は、ｃＤＮＡクローンｐＢＨ４１およびｐＢＬ　５２を配列決定することによって得られた、８７２．３　ＭＡｂのプロセシングされない可変部域をコードするＤＮＡ配列を示す。パネルＡはＶＨ領領域遺伝情報を指定する配列および予測されるアミノ酸配列を示す。パネルＢはＶＬ領領域よびＣＬ領領域最初の２１残基の遺伝情報を指定する配列、ならびに予測されるアミノ酸配列を示す。ヒ）Ｃ領域との融合点は矢印で示されている。

シグナルペプチドの切断の推定上の部位は、白い三角形で示されている。数はもとのｃＤＮＡクローン中のヌクレオチドに関する。

第２図は、部位特定突然変異、制限酵素処理および連結によるキメラ重鎮遺伝子の作製の路線図である。

第３図は、部分的制限酵素処理および連結によるキメラ軽鎖遺伝子の作製の路線図である。

（第２図および第３図において、コード配列は箱として示されており、暗い箱は可変領域および明るい箱は定常領域である。制限酵素は次のように略した：ＥｃｏＲＩ　＝Ｅ　；ＢｇｌＩＩ＝Ｂ　；　ＨｉｎｄＩＩＩ＝Ｈ；　ＭｂｏＩＩ　＝Ｍ　；　Ｈｐａ　Ｉ　＝Ｈｐ　；およびＳｃａ　Ｉ　＝Ｓ（０点線はベクターまたは定常領域ＤＮＡ中への配列の連続を示す。）第４図は、ｈＣＭＶ発現ベクターおよびＢｃｏＲＩ部位中に挿入された４つのこう伍するｃＤＮＡまたは遺伝子構成体の路線図である。キメラ重鎮遺伝子は、ＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲＩオリゴヌクレオチドアダプターを使用して挿入した。解読配列は箱で表されており、暗い箱は可変領域を示し、そして明るい箱は定常領域を示す。転写の方向は矢印で示されている。

第５図は、’ｃｏｓ細胞ト細胞トランスフコクシ３２体み液のＥＬＩＳＡ分析を示す。ＣＯ３−細胞トランスフェクション体の上澄み液中の抗原結合能力のレベルを後に示す様に分析した。

希釈曲線は、色変化の光学密度に対してプロットした。マウスまたはヒトエピトープを認識するために異なる抗体が使用された。結局、曲線の各々についての抗原結合レベルは厳格に゛は匹敵しない。曲線の各々は、次のように、同時トランスフェクションを表す：△マウス重鎮、マウス軽鎖；ムマウス重鎮、キメラ軽鎖；ロキメラ重鎮、マウス軽鎖；■キメラ重鎖、キメラ軽鎖。

第６図は、トランスフェクトされたＣＯ３−細胞の上澄み液からの免疫沈澱の還元性ゲルにおける５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

トランスフェクションのために使用したＤＮＡは、次の通りであった：レーン１、マウス軽鎖単独：レーン２、マウス軽鎖、マウス重鎮：レーン３、マウス軽鎖、キメラ重鎮；レーン４、キメラ軽鎖単独；レーン５、キメラ軽鎖、マウス重鎮：およびレーン６、キメラ軽鎖、キメラ重鎮。免疫沈澱に使用した抗体は、次の通りであった：レーン１〜３、ウサギ抗マウス（Ｆａｂ’　）、；レーン４〜６、ウサギ抗ヒト（Ｐａｂ’　）２゜第７図は、非還元（レーン１〜３）および還元（レーン４〜６）条件下での、トランスフェクトされたＣＯ３−細胞の上澄み液からの免疫沈澱の５Ｏ３−ＰＡＧＥ分析を示す。トランスフェクションに使用したＤＮＡは、次の通りであった：レーン１および４、キメラ軽鎖のクローン；レーン２および５、キメラ軽鎖、マウス重鎮；レーン３および６、キメラ軽鎖、キメラ重鎮。各場合において免疫沈澱に使用した抗体は、ウサギ抗ヒト（Ｆａｂ ’　）２であった。

第８図は、ツニカマイシンの不存在下（レーン１および３）および存在下（レーン２および４）において増殖および標識した、トランスフェクトされたＣＯ３− 細胞の上澄み液からの免疫沈澱の還元性ゲル上のＳ［ｌＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。トランスフェクションに使用したＤＮＡは、次の通りであった：レーン１および２、キメラ軽鎖クローン；およびレーン３および４、キメラ軽鎖およびキメラ重鎮。各場合において免疫沈澱に使用した抗体は、ウサギ抗ヒ）　（Ｆａｂ’　）２であった。

第９図は、ＣＨＯ細胞によって産生されたキメラＢ　７２．３の還元および非還元５Ｏ３−ＰＡＧＥゲルを示す。

第１０図は、ＣＨＯ細胞によって産生されたキメラＢ　７２．３の二次元ＳＯ３ −ＰＡＧＥを示す。

第１１図は、８７２．３抗体を使用する腫瘍標識の時間過程の研究を示す。

第１２図は、Ｂ　７２．３抗体の組織／腫瘍比率を示す。

第１３図は、プラスミドＴＲ（１０２の作製を示す。

実施例１ポリアデニル化ＲＮＡを、８７２．３ハイブリドーマ細胞系から、グアニジニウムイソチオシアネート／塩化セシウム法（１５）を使用して単離した。二重鎖ｃＤＮＡを合成しく１７）　、そしてｃＤＮＡライブラリーをバクテリオファージ λｇｔｌｏベクター中にＥｃｏＲＩリンカ−を使用して構成した（１８）。マウス免疫グロブリンの重鎮および軽鎖の定常領域に対して相補的である、２つのスクリーニングプローブを合成した。重鎮プローブは、マウスＴ１配列のＣＩ（１ドメイン（１９）中の残基１１５−１３３に対して相補的である１９マーであった。軽鎖プローブは、ゲノムマウスＣＫ配列の残基４６５８−４６７７に対して相補的な２０マーであった。プローブを５′末端において〔γ３２Ｐ〕ＡＴＰでＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｎａｌ）を使用して放射線標識し、そしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。

重鎮および軽鎖の両者の完全なリーダー、可変領域および定常領域を含有するクローンを分離した。ＥｃｏＲＩ　ｃＤＮＡインサートをＭ１３ｍｐ８ベクター中にサブクローニングして配列決定しく２１）　、ｐＢＨ４１と表示する重鎮クローン、およびｐＢＬ　５２と表示する軽鎖クローンを生じさせた。ヌクレオチド配列の分析を、チェインターミネーション法（２２）に従って実施した。

ｐＢＬ　５２中の９８０塩基対のＥｃｏＰ！　Ｉインサートは完全に配列決定された（２２）。ｐＢＩＩ　４１中のＥｃｏＲＩインサートは、アガロースゲルの電気泳動によってほぼ１７００塩基対からなることが示された。可変ドメインおよびＣ）１１ドメインの５′領域を配列決定し、どうようにクローンの３′末端を配列決定して、正しいマウスγ１末端配列の存在を確認した。ｐＢＨ４１およびｐＢＬ　５２のプロセシングされていない可変部域についてのＤＮＡおよび予測されるアミノ酸配列を第１図に示す。誘導されたアミノ酸配列の検査は他の特徴づけられた免疫グロブリン遺伝子との間のかなりの相同性を示し、そしてリーダー、可変ドメインおよび定常ドメインの範囲を正確に決定することを可能とした。さらに、ＭＡｂ　Ｂ７２Ｊは、前に報告されたように（９）、ＩｇＧＩ　Ｋ抗体であることが確認された。

キメラマウス−ヒト重鎮クローンの作製重鎮Ｃγ４領域の遺伝情報を指定する配列を含有するゲノムクローンを、コスミドＣＯＳ　１ｇ８　（２３）からの旧ｎｄＩＩＩ断片として分離し、次いでｐＡＴ１５３を経てＭ１３　ｔｇ　１３０中にＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ断片としてクローニングしてｐＪＡ　７８を形成した。ＤＮＡ配列の分析後、１８マーのオリゴヌクレオチドを合成し、そして部位特定突然変異を実施してＣ残基をＡ残基に転化し、これによりＣＨＩエクソンの開始部に新たな旧ｎｄＩ［Ｉ部位を生じさせて、ｐＪＡ　９１をを得た。

ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩで切断したＭ１３ｍｐ１８を使用して、関連するファージ鋳型と共にギャップド・デュプレックス（ｇａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ）を発生させることにより部位特定突然変異を行った（１４）。ＤＮＡを大腸菌ＨＢ２１５４に形質転換し、そして、提供されたプロトコルに記載されているように、得られる形質転検体を大腸菌ＨＢ２１５１（Ａｎｇｌｉａｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上で増殖せしめた。すべての突然変異体はチェインターミネーション法（２２）により配列決定した。すべての配列決定した断片を引き続いて他のベクター中に再クローニングして、突然変異誘発の間に起こり得る二次突然変異の可能性を排除した。

Ｍ１３ｍｐ１９中にｐＢＨ４１としてクローニングされた、８７２．３重鎖ｃＤＮＡからのＶＨドメインを、ＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｌ　Ｉ断片として単離し、そしてｐＪＡ　９１のＥｃｏＲｌ−Ｈ１ｎｄＩＩＩ部位中に、３２塩基対のＢｇｌ　ｌ−ＨｌｎｄＩ［Ｉアダプターといっしょに、導入してｐＪＡ　９３を生成せしめた。したがって、この生成物は、ヒトゲノムク４、ローンから誘導された、イントロンによって分離されたＣＨＩ。

Ｈ，Ｃ）１２およびＣＨ３ドメインを含んで成る配列に融合した、マウスｃＤＮＡクローンに由来する可変領域を含有するキメラ免疫グロブリン重鎮ゲノムであった。可変／定常領域接合部の正しさがヌクレオチド配列の分析によって確認された。この作製の詳細の路線図は第２図に与えられている。Ｔ４定常領域は、エフェクター機能の制限された能力範囲を有するが、精製のために潜在的に有用な試薬であるスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロティンＡに結合するものとして、選択マウス軽鎖ｃＤＮＡクローンであるｐＢＬ　５２は、可変ドメインおよび定常ドメインの連結点より１８塩基対下流にＭｂｏ　ｎのための切断部位を含有する。マウスとヒトのＣＫゲノムの間の配列の相同性のために、同一切断部位が後者の遺伝子中に存在しく２５）、そしてこの部位の使用によりマウス可変ドメインとヒト定常ドメインとを融合する方法が提供される。

マウスｃＤＮＡクローンを含有するＥｃｏＲＩ断片をＭｂｏＩＩで部分的消化すると、単一の残基のオーバーハングをもつ４１６塩基対のＥｃｏＲＩ　−Ｍｂｏ　ＩＩ断片が生じた。Ｐｓｔ　ｌ−ＨｌｎｄＩ［Ｉ断片上にヒトＣ−カッパ遺伝子を含有するＭ１３誘導ベクターを含んで成るゲノムクローンをＦｏｋ　Ｉで消化した。Ｃ−カッパのほとんどを含有する３９５塩基対の断片を、ＥｃｏＲＩ！Ｊンヵーを使用してｐＡＴ１５３中ニクローユニクローニングＷ２００を形成した。ｐＮＷ２００がらの９４５塩基対のＳｃａ　Ｉ−ＨｒｎｄＩ［［断片を消化すると、３７４塩基対のＭｂｏ　ｎ−旧ｎｄＩＩＩが生じ、これは、前述の４１６塩基対のＢｃｏＲＩ　−ＭｂｏＩＩ断片とアニールしかつそれに結合することができた。２つの断片をＥｃｏＲＩおよび旧ｎｄＩＩＩで線状化したｐＳＰ６４ベクター中に結合し、そしてコンピテント大腸菌ＨＢ　１０１を形質転換するために使用した。可変／定常領域連結部の配列を決定して、正しい融合を確認した。この作製を第３図に概略的に示されている。

ＣＯ３細胞中の一時的発現のための発現ベクターの作製重鎮および軽鎖のキメラ遺伝子、ならびにマウス重鎮および軽鎖Ｃ口ＮＡクローンを、別々に、プラスミドｐＥ８６　（２７）のユニークＢｃｏＲ１部位中に挿入した。軽鎖をコードするプラスミドをＢＯ２，ｃＬ、　ｎｅｏと表示する。キメラ重鎮について、これは、オリゴヌクレオチドアダプターを使用して、３’ＢａｍＨＩ部位をＢｃｏＲ１部位に変化させて、クローニングのためのＥｃｏＲＩ断片を得ることによって達成した。重鎮をコードするプラスミドをＢＯ６，ｃＨ，ｇｐｔと表示する。この断片は、強いプロモーター／エンハンサ−１およびＢｃｏＲ１部位より上流のユニーク旧ｎｄＩ［Ｉ部位中に挿入されたヒトサイトメガロウィルス（ｈｃＭＶ）からの転写制御要素を含有する。さらに、ＳＶ４０複製起点部位はＳＶ４０の前期のプロモーターによって提供され、これは、ユニークＢｇｌＩ中に挿入された、選択マーカー遺伝子、すなわち軽鎖遺伝子のためのネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）または重鎮のためのグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子テリア宿主における選択および増殖を可能とするアンピシリン耐性遺伝子を含有する。発現ベクターおよび免疫グロブリン遺伝子インサートは第４図に概略的に示されている。

トランスフェクションおよび抗体の産生のＥＬＩＳＡ分析前述の４つの発現構成体は、単独で使用するか、あるいは重鎮／軽鎖遺伝子対において使用して、ＣＯ３−１細胞（２６）をトランスフェクションした。細胞をＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン溶液中で６時間インキュベーションし、次いでＨＥＰＢＳ　Ｉｌ衝衝止生理的塩類溶液中１０％ＤＭＳＯで２分間ショックを与えた。

細胞を洗浄し、そして１０％胎児仔ウシ血清を含有する培地中で７２時間インキュベーションした。

３７℃において７２時間後、細胞の上澄み液および細胞溶解物をＥＬＩＳＡにより重鎮および軽鎖産生並びに抗原の結合について分析した。

培地（５００Ｊ／１０’細胞）をＥＬＩＳＡのために取り出した。細胞溶解物を、５００Ｉ１１の１％トリトンＸ−１００，０，５％のデオキシコレ−）、０．１％のＳＯＳ　、　０．０１モルのリン酸ナトリウムｐＨ７，５，０，１モルの塩化ナトリウムおよび０．００１モルのＥＤＴＡ中で１０５細胞を溶菌することによって調製した。細胞溶解物およびコンディショニングした培地を、エッペンドルフ遠心機内で５分間遠心して、核および細胞破片を除去し、そして４℃において分析まで貯蔵した。

マイクロタイタープレートを、重鎮または軽鎖上のヒトまたはマウス特異性エピトープのいずれかに対して反応性のヒツジまたはヤギ抗体で０．２５ｘ／ウエルで被覆した。トランスフェクションしたＣＯ８細胞の上澄み液または細胞溶解物を、０．１モルのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，０）　０．１モルの塩化ナトリウム、０．０２％ツイーン２０および０．２％カゼインを含有する試料接合緩衝液中で、それぞれ、１：２または１：４に希釈した。

希釈した試料の各々をウェルの各々に添加し、そして室温においておだやかに撹拌しながら１時間インキュベーションした。洗浄緩衝液（０，２％ツイーン２０、ｐＨ７，２）で６回洗浄した後、ヒトまたはマウス特異的エピトープに対して反応性の、標準の西洋ワサビペルオキシダーゼ−接合抗体の１＝５０００希釈液１００１１１をウェルの各々に添加した。プレートを室温において１時間インキュベーションし、次いで洗浄緩衝液で６回洗浄した。０．１■／ｒｎｌのテトラメチルベンジジン（ＴＡＢ）、０．１モルのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６，０）および０．００５％のＨ２Ｏ，を含有する基質緩衝液１０〔舅をウェルの各々に添加して、色を変化させた。この反応の２〜３分後、この溶液を１．５モルの硫酸の添加によりｐＨ１，０とすることによって反応を停止した。光学密度を４５０ｎｍにおいてウェルの各々について、ダイナチク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）ラボラトリーズＭＲ６００マイクロタイタープレートリーダーでの測定により決定した。適当なヒトまたはマウス免疫グロブリンの既知の濃度を使用して標準の曲線を得た。

抗原結合アッセイを類似の方法で実施した。マイクロタイタープレートを、ヒト患者から、あるいはヌードマウス中に移植した腫瘍異種移植片から得られた精製したＴＡＧ−７２抗原（６）０．２５ｇ／ウェルで被覆した（両者はＪ、Ｓｃｈｌｏｍ、　ＮＣＩから得た）。洗浄緩衝液中で６回洗浄した後、ＣＯ３細胞トランスフェクション体からの試料を前のように添加し、そして同一の引き続く手順を、第２抗体としてＨＲＰに結合したヤギ抗マウスまたはヒト（Ｆａｂ’　）２を使用して実施した。

異なる捕捉抗体を使用する多数のアッセイ系を開発し、そして交差関連づけて、トランスフェクションの各々の潜在的産生物を研究した。すべての場合において、軽鎖およびキメラ軽鎖は、適当にトランスフェクションした細胞の上澄み液および細胞溶解物中において検出された。しかしながら、重鎮は、゛軽鎖と同時トランスフェクションしたとき初めて、上澄み液中に検出された。低いレベルの重鎮は各場合において細胞溶解物中に検出され、軽鎖の不存在下の重鎮の分泌の阻害の示唆が支持された。

会合したポリペプチドの存在を検出する、アセンブリーアッセイは、両者の遺伝子が同時トランスフェクションされるととき、少なくとも１つの重鎮および少なくとも１つ軽鎖を含有するマルチマーの形成を立証した。マウス遺伝子およびキメラ遺伝子は、等しく、集成してバイブリド分子を形成できるように思われた。

抗原結合分析（上を参照）は、マウスの重鎮および軽鎖の同時トランスフェクションが抗原を認識できる抗体分子を生じさせたことを立証した。いずれかの鎮ついてマウス遺伝子を適当なキメラ遺伝子で置換すると、Ｅｌ、ＩｓＡ分析において抗原結合特異性をもつバイブリド分子を産生じた。最後に、ＣＯ８細胞をキメラ重鎮および軽鎖の両者の遺伝子でトランスフェクションすると、抗原結合特異性をもつ完全なキメラ抗体分子が生じた。１つの実験からのＥＬＩＳＡのデータを第５図に示す。これらの実験は、抗体分子の「ヒト化」がその抗原認識　５能力に有意の影響を及ぼさないことを証明している。

予備実験は、最初の２４時間以内には、トランスフェクションしたＤＮＡからの発現がほとんど存在しないことを示唆した。したがって、トランスフェクション後、ＣＯ３細胞を１０％胎児仔ウシ血清を含有する。ｕｉｕ中で２４時間回復せしめた。次いで、培地を、メチオニン不含ＤＭＥＭに〔３５Ｓ〕メチオニン（ＮＥＭ）を２００μＣｉ／ｍｌ添加したもので置換した。細胞を４８時間代謝的に標識し、そしてコンディショニング培地および細胞溶解物を前記のようにして調製した。

ＣＯ８細胞の上澄み液のアリコートの還元的５Ｏ３−ＰＡＧＥによる分析は、それ以上精製を伴わないで、標識した免疫グロブリンタンパク質の出現を立証し、他方、プロティンＡ−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）の使用は、ＣＯ８細胞上澄み液から、全体抗体を選択的に沈澱させるが、軽鎖単独を沈澱させなかった。

抗体分子の集成−および分泌の更なる分析は、プロティンＡ−セファローズに結合した抗ヒトＣ−カッパ血清および抗ヒ）　（Ｆａｂ’　）２を使用する免疫沈澱によって実施した。ヒ）ＩｇＧ（Ｆａｂ’　）　２およびヒトに鎖に対するアフィニティー精製したウサギ抗体を、プロティンＡ−セファローズへの結合後、免疫沈澱に使用した。細胞質抗体および分泌された抗体の両者を、還元的および非還元的条件下で、５Ｏ３−１０％ＰＡＧＥ系上で分析した。このゲルをオートラジオグラフィーのエンハンサ−で処理し、乾燥し、そしてフジＲＸフィルムに露出した。結果を第６図に示す。

両者の抗血清は、それぞれ、クーマツシー（Ｃｏｏｍａｓｓ　ｉｅ）着色した免疫沈澱する免疫グロブリン重鎮及び軽鎖の位置に一致する、５５におよび２８にの見掛は分子量をもつタンパク質を免疫沈澱させた。後者の抗血清の使用は、軽鎖がＣＯ８細胞上澄み液中の重鎮と会合して存在することを証明した。還元的および非還元的５ＯＳ−ＰＡＧＥによって分析した免疫沈澱（第７図参照）を比較すると、重鎮および軽鎖は正しい四量体分子として集成されることが示唆される。さらに、遊離の軽鎖二量体および部分的に集成された重鎮および軽鎖の多量体の分泌の証拠が存在する。

ジサルファイド結合により発生した二次構造の存在のために、免疫グロブリン鎮の移動性は２つの系において異なる。

グリコジル化の存在および潜在的役割を分析するために、ＣＯ８細胞をツニカマイシンで処理すると同時に放射線標識を添加した。Ｎ−結合グリコシル化を阻止するために、ＣＯ３細胞を原溶液から希釈した１　０　ｔｒｇ　／ｍｌのツニカマイシンを含有する培地中で増殖させた。脂質結合オリゴ糖のプールの消耗を確実にするために、細胞をツニカマイシン含有培地中に２時間維持した後、放射線標識を添加した。

免疫沈澱後、タンパク質生成物を、第８図に示すように、５ＯＳ−ＰＡＧＥによって分析した。５５Ｋから５２にへの見掛は分子量の減少から明らかなようにキメラ重鎮はＮ−結合のグリコジル化を行うが、軽鎖はそれを行わない。グリコジル化が阻止される場合、発現レベルは低下するがタンパク質はなお分泌されるように思われる。

これらの結果が立証するように、免疫グロブリン遺伝子の各々は正しく転写および翻訳される。２つのマウス遺伝子およびキメラ軽鎖はｃＤＮＡ様であるが、キメラ重鎖遺伝子はｃＤＮＡおびゲノムＤＮＡの両者の特性を有する。両者のタイプの構成体は、同様なレベルでかつ同様な信頼性をもって発現されるように思われる。したがって、転写物のスプライシングは必要に応じて起こることが明らかであるが、それはＣＯ８細胞における免疫グロブリン遺伝子の正しい発現のための必須の要件ではない。

発現された重鎮および軽鎖は、正しい状態で会合するが、多分遊離ポリペプチド鎖の利用可能性によって制限されるであろう。マウスおよびヒトポリペプチド配列は、重鎮および軽鎖の会合において交換可能であるように思われる。生製物は集成された四量体の抗体分子であり、これは高いレベルで発現され、グリコジル化され、そして培養培地中に分泌される。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＤ−Ｋｌ）細胞を、１０％胎児仔ウシ血清（Ｆｅ２）　、非必須アミノ酸（ＮＢＡＡ）およびグルタミン（２ミリモル）を含有するダルベツコ変性イーグル培地（口ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｂａｇｌｅｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）中で付着培養により増殖させた。

コンプルエンド培養物をトリプシン処理し、細胞をリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）中で１回洗浄し、そして１０７細胞／ｒｎ１で再懸濁させた。

ＨＣＭＶプロモーターから発現されるキメラ軽鎖遺伝子を含んで成るプラスミドＥＥ６．　ｃＬ、ｎｅｏからのＤＮＡをＳｃａ　Ｉで消化して、線状分子を生じさせ、次いでエタノール沈澱した。沈澱をＰＢＳ中に再懸濁し、そして４０ｘのＤＮＡを緩衝液中で４℃において１０７のＣ）１０−　Ｋｌ細胞に添加した。ＤＮＡをエレクトロポレーションによって細胞中に導入し、この場合細胞懸濁液およびＤＮＡを２０００ボルトの２パルスで処理した。エレクトロポレーション後、細胞を４℃に１０分間戻した後、補給物質を含有するＤＭＥＭ増殖培地中で５Ｘ１０’細胞／　９０　ｍｍｍベト皿の密度でプレートした。

３７℃において一夜インキユベーションした後、導入されたＤＮＡについての選択を６４１８を１■／ｒｎｌの最終濃度に添加することによって適用した。耐性コロニーが選択的培地中での１０〜１４日間のインキュベーション後に観察された。

耐性コロニーを、形質転換プレートから、トリプシン溶液に浸漬した正゛方形の濾紙を用いて取り上げ、そして２４ウ工ル組織培養プレートの個々のウェル中に移した。ウェルからの培地を、キメラ軽鎖の存在について、ＥＬＩＳＡアッセイを使用してアッセイし、そして軽鎖を分泌する細胞系を同定した。

軽鎖を１１００ｎ／ｍ１〜１６ｇ／ｍｌのレベルで分泌する細胞系を制限希釈法によってクローニングした。１つのこのようなりローンｃＬ１８を引き続く研究において使用した。

安定なキメラ産生性細胞系１（ＣＭＶから発現されるキメラ重鎮遺伝子を含んで成るプラスミドＢＥ６．ｃＨ，ｇｐｔ　（また、ＪＡ９６と表示する）からのＤＮＡを、Ｓｃａ　Ｉで消化して線状分子を生じさせ、次いでエタノール沈澱した。キメラ軽鎖を産生するＣＩＯ−ｃＬ１８細胞を、前述したように、エレクトロポレーションのために調製し、そしてＪＡ９６０ＮＡ　Ｃ４０ｎ／　１０’細胞）をエレクトロポレーションにより導入した。非選択的培地中で一夜インキユベーションした後、マイコフェノール酸に対する耐性についての選択を適用した。選択培地はＤＭＥＭ、　１０％ＦＣＳ　５ＮＢＡＡ、グルタミン、キサンチン、ハイポキサンチン、チミンおよびマイコフェノール酸（１０ｎ／ｍｌ）を含有する。前述したように、耐コロニーは１０〜１４日後に検出され、そしてこれらを２４ウエルプレート中に取り上げた。抗体産生細胞系を、抗体８７２．３によって認識される抗原ＴＡＧ− ７２に基づく抗原結合アッセイを使用して同定した。抗体を０．１〜４０ｘ／ｍｌのレベルで産生ずる細胞系を分離した。これらの細胞系の２つ、Ｆ６およびＦｉｌ、を更なる研究において使用した。

キメラ抗体の精製ＣＨＤ細胞培養上澄み液からキメラＢ７２．３を、プロティンＡ−セファローズおよびイオン交換クロマトグラフィーを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。

細胞培養の上澄み液をナトリウムグリシネート（０，２モル）でｐＨ８，８に調節し、そしてグリシン／グリシネート緩衝液ｐＨ８，８であらかじめ平衡化したプロティンＡ−セファローズのカラムに適用した。試料を装填した後、カラム平衡化緩衝液で洗浄し、そしてリン酸水素二ナトリウム（０，２モル）およびクエン酸（０，１モル）から構成したｐＨが減少する勾配で抗体を溶出した。キメラ抗体を含有する分画をプールし、５０ミリモルのリン酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）中に透析し、次いで５０ミリモルのリン酸塩緩衝液（ｐ）１ｇ、　０　）であらかじめ平衡化したＤＢＡＥ−セファローズのカラムに適用した。このカラムを平衡化緩衝液で洗浄し、そして０．０から０．２モルの塩化ナトリウムの直線勾配で抗体を溶出した。次いで、精製した抗体を意図する使用に適当な緩衝液、例えば、動物の研究のためのＰＢＳ、中に透析し、そして限外濾過により精製した。

キメラ抗体の典型的な収量は、出発上澄み液の１１当たり２０■であった。

キメラ抗体の純度および集成は、還元的および非還的の両者の条件下に、５ＤＳ −ポリアクリルアミドゲルの電気泳動（ＰＡＧＥ）　（第９図）により、およびＨＰＬＣゲル濾過により試験した。

抗体のＮ−末端アミノ酸配列決定は、軽鎖をコードする単一の配列を示し、これはＤＮＡ配列から推定される期待のアミノ酸配列に正確に対応した。重鎮はＮ− 末端でブロックされ、そしてアミノ酸配列決定が不可能であった。抗原結合活性はＥＬＩＳＡアッセイにおいて立証された。

ＣＯ８またはＣＨＯ細胞中で作られたキメラＢ　７２．３は、重鎮間ジサルファイド架橋を形成ないが、２つの重鎮および２つの軽鎖を含有する１５０ｋＤの分子に正しく集成する物質をある比率（１０〜２０％）で含有していた。この物質は、細胞から分泌されるとき、抗体中に存在し、そして重鎮間ジサルファイド架橋が形成されている抗体と同時精製する。これはヒ）　１ｇＧ４の分子に共通の性質であるように思われ、そしてマウスーヒ）　１ｇＧ４キメラ抗ＮＰ抗体及び２つの異なる１ｇＧ４骨髄腫タンパク質を包含する、今日まで分析されたこのタイプのすべての分子に共通する。

キメラＢ　７２．３の非還元的５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動で、２つのバンドが見られ、１つは１５０ｋＤの期待する大きさであり、そして１つは８０ｋＤの大きさである（第９図）。これらのバンドの両者は、非還元的／還元的二次元５ＯＳ−ＰＡＧＥにより示されるように、完全な重鎮および軽鎖を含有する（第４０図）。還元的５ＯＳ−ＰＡＧＥは完全な重鎮および軽鎖のみを示す（第９図）。自然の（非５Ｏ３）電気泳動および）ＩＰＬｃゲル濾過は、１５０ｋＤに対応する１つの種のみを示す。こうして、非還元的ＳＯ３−ＰＡＧＥ上に見られる約８０ｋＩｌのバンドは、溶液中で１５０ｋＤの分子量をもつ物質を代表する。分子の２つの半分は、重鎮間の相互作用が中断されるとき、例えば、非還元的ＳＯ３−ＰＡＧＥで実施するとき、初めて分割される。

効能の研究キメラＢ　７２．３抗体は、多くの状況において有利に使用することができる。

例えば、放射性標識または他の検出手順による適当な標識化の後、抗体は、腫瘍細胞の一部またはすべてが特異的抗原ＴＡＧ−７２を発現する固形腫瘍を生体内で突き止めかつそれに結合することを立証することができる。下記の実験は、この場合はヌードマウスのモデルの系にける、特異的抗原を有するヒト腫瘍細胞を突き止めるキメ２抗体の能力の１つの例である。

キメラＢ７２．３およびマウス８７２．３抗体を１２５１でクロラミンＴ法によってほぼ５μＣ１／ｐｇＯ比活性に放射能標識した。

側腹部に皮下のＬＳ１７Ｔ異種移植片を有する４匹の雌のヌードマウスの群に、０．１　ｒｄのＰＢＳ中１００μｃｉのキメラＢ　７２．３またはマウス８７２．３のいずれかを静脈内注射した。動物の群を組織試料をあつめるために間隔をおいて殺し、この組織試料を秤量し、７モルの水酸化カリウム中に溶解し、そしてＬＫＢ１２７０型［ラックベータ（Ｒａｃｋｂｅｔａ）　Ｊで計数した。組織の取り入みは、４匹の動物群からの組織１ｇにつき注射した投与量の平均百分率として計算した。

第１１図は、マウスおよびキメラ抗体の時間経過の過程を示し、そして抗体の血液プールからのクリアランスおよび腫瘍部位おける取り込みを証明している。キメラ抗体は血液プールから多少より速く除去されるが、マウス抗体とほぼ同一のプロフィルで適切に腫瘍に集る。この試料のデータは、新規な操作された抗体が生体内で機能的であることを示唆している。

第１２図は、２４　、４８および１６８時間における腫瘍対組織の比を示す。理解できるように、腫瘍／組織の比は時間とともに増加し、そしてキメラ抗体はマウス抗体と比較してよりすぐれた腫瘍／組織比を有する。

ヒ）　）ｇＧｌ　、　２および３を含有するゲノムＤＮＡ配列を、ファージλ中のより大きいＤＮＡインサートから単離し、そしてＣＩ（１エクソンの５′末端に旧ｎｄＩ［Ｉ部位およびＣ）１３エクソンに対して３′にＢａｍＨＩをもつヒ）　１ｇＧ４遺伝子を含有するｐＪＡ１０３を経て、ファージＭ１３中に導入した。Ｍ１３ベクターは、必須遺伝子中に２つのアンバニ突然変異を有ししたがってすでに記載されている方法を使用する高い効率の部位特異的突然変異の実験のために適当であるＭ１３ｔｇ１３０である。旧ｎｄＩＩＩ部位をアイソタイプ遺伝子の各々中のＣ）ＩＩエクソンの５′末端に導入して、ｐＲ８１１（ＩｇＧ１）　、　ＰＲＢ１４　（１ｇＧ２）　′Ｊ６よびｐＲ８１６（Ｉ　ｇＧ３）を得た。５ａｌＩおよびＢｇｌＩＩ部位をまた、それぞれ、ｐＲＢ１１中のＣＨＩエクソンの３′末端に向かって及びＣＨＩエクソン後イフィントロン′末端に向かって導入した。次いで、アイソタイプを旧ｎｄＩＩＩ　−ＢｇｌＩ断片として再び単離し、そしてｐＡＴ１５３中にサブクローニングして、ＲＢ１８（ＩｇＧ１）、　ＲＢ２６（１ｇＧ２）およびＲＢ２０　（１ｇＧ３）を得た。Ｂ７２．３ＶＨＤＮＡ配列を単離し、そして前に１ｇＧ４キメラ重鎮遺伝子を作るために使用した連結用オリゴヌクレオチドに連結して、ＥｃｏＲＩ　−ｔｌｉｎｄＩＩＩ　ＶＨ断片を得た。この断片を、ＲＢ１８を含有するヒトＩｇＧ１　）１ｉｎｄＩＩＩ−Ｂａｍ）ｌ　Ｉに連結し、そしてｐＡＴ１５３中にクローニングしてｐＲＢ　２２を得た。

キメラＢ７２．３ＶＨを作製するため、前述のＶＨ断片をｐＲＢ　２６の旧ｎｄ　ｍ　−Ｂａｍ）ｌ　Ｉ断片に連結し、そしてｐＡＴ１５３中に再クローニングしてｐＲＢ　２７を得た。

キメ５　Ｂ　７２−３　Ｖｌ（／　ＩｇＧ３ヲ作製スルタめに、前述（７）ＶＨＩｆｒ片をｐＲＢ　２０の旧ｎｄＩ［−ＢａｍＨＩ断片に連結し、そしてｐＡＴ１５３中に再クローニングしてｐＲＢ　２３を得た。

発現ベクター中遺伝子の集成キメラ遺伝子を前述のｐＲＢ　２２　、２７および２３からＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ断片として単離し、そして８７２．３１ｇＧ４キメラ重鎮発現ベクターであるＪＡ９６のＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩ部位の間にクローニングし、こうして、１ｇＧ４キメラ遺伝子を置換した。得られるキメラ発現プラスミドをＲＢ２４　（ＩｇＧ１キメラ）　、ＲＢ２８（１ｇＧ２キメラ）およびＲＢ２５　（１ｇＧ３キメラ）と命名した。

産生、集成および活性の証明は実施例１におけるように実施した。

実施例３ｐＪＡ　７９ば、ヒンジエクソンの最後のコドンの後の最初のヌクレオチドからＣ）１３ドメインの最後のヌクレオチドまで配列がオリゴヌクレオチド指令部位特異的欠失によって除去されるように修飾されたヒ）ＩｇＧ４重鎮遺伝子を含有するＭ１２ｔｇ１３０ベクターである。ヒンジおよび３′−非翻訳領域並びにＭ１３１００一部分は、１．１　ｋｂｐのＥ１ｇｌＩＩ断片として単離することができる。この断片を使用して、全長８７２．３／　１ｇＧ４キメラ重鎖遺伝子クローンｐＪＡ　９３中の類似の断片を置換してＪＡ９６を生成することができ、したがってこれは８７２．３１ｇＧ４キメラＦ　（ａｂ’　）重鎮タンパク質を発現するように発現する能力を潜在的に有するキメラ遺伝子を含有する。

発現ベクター中遺伝子の集成前述のプラスミドｐＪＡ　９４を使用して、Ｆ　（ａｂ’　）遺伝子をＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ　１４７５ｂｐ断片として回収した。この断片をｐＥ８６発現ベクターのユニークＥｃｏＲＩ部位中に、Ｂａｍ）ｌ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩオリゴヌクレオチドアダプターを使用してクローニングしてｐＪＡ　９７を得た。

ＣＯ８細胞中の遺伝子の試験ｐＪＡ　９７中のキメラＦ　（ａｂ’　）遺伝子を、前述したように、キメラ軽鎖ポリペプチドを発現することができる適当な構成体と組み合わせて、ＣＯ８細胞中で発現させた。発現生成物のＰＡＧＥ分析および引き続＜ＣＨＩ−ヒンジイントロンのＤＮＡ配列の検査は、イントロンの切り取りが正しく起こらないで、異常な重鎮ポリペプチドの産生を導くことを示唆した。

前述のｐＪＡ　９４はｐＪＡ　９３に由来し、これはｐＪＡ　９１に由来する。

このクローンはもともとＭ１３ｔｇ１３０に基づくベクター、すなわち、前に記載した効率的なギャップ−ヘテロデュプレックス突然変異誘発法において使用することができるアンバーファージであった。高い収量での突然変異誘発を反復するために、キメラＦ　（ａｈ’　）重鎮遺伝子をＥｃｏＲＩ断片として単離し、そしてＭ１３ｔｇ１３０中に再クローニングしてｐＪＡｌｏｏを得た。オリゴヌクレオチド指令部位特異的突然変異誘発によって、５ａｌＩ部位をＣＩ（１エクソンの３′−末端に向けて導入してｐＪＡ１０８を得た。ＣＨＩドメイン中の導入された５ａｌＩ部位は、ＣＨＩドメインの最後のアミノ酸から第１および第４アミノ酸をコードする。ＣＨ１ドメインの末端中にヒンジを再構成するために、４つのオリゴヌクレオチドをつくった。これらは−緒になってＣＨＩドメインの最後の５つのアミノ酸、ヒンジ配列、２つのインフレーム停止コドンおよびＢｃｏＲＩ部位をコードする。

オリゴヌクレオチドを集成し、Ｍ１３ｍｐＨ中の５ａｌＩおよびＥｃｏＲＩ部位のポリリンカー中にクローニングし、配列決定し、再単離し、そしてｐＪＡ１０８からのＥｃｏＲＩ　−５ａｌ　Ｉ　７００ｂｐ断片を含有する遺伝子に連結して、キメラＢ７２．３　Ｐ　（ａｂ’　）重鎮遺伝子を再構成した。

再構成されたＣｔｌｌ／ヒンジ配列は、次の通りであろう：ＣＨＩ　ヒンジＡｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｐｒ。

Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　５ｔｏｐこのＣＩ（１／ヒンジを形成するために使用したオリゴヌクレオチドは次の通りであった：１、　５７ＣＧＡ［：ＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＧ２、３’ＧＴＴＣＴ［：ＴＣＡＡＣＴＣＡＧＧＴＴＴＡＴＡＣＣＣＧＧＧＧＧ３．５ ”ＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＡ’ｌ’ＧＡＴＧ４．３°ＣＡＣＧＧＧＴＡＧＴＡＣＧＧＧＴＡＣＴＡＣＴＴＡＡこのベクターにおいて、オリゴヌクレオチド１および３はセンス鎮を生成し、そしてオリゴヌクレオチド２および４はアンチセンス鎮を生成した。

発現ベクター中遺伝子の集成前述したように集成したキメラＢ７２．３　Ｆ　（ａｂ’　）重鎮遺伝子を、引き続いて、ｐＪＡ　９６のＥｃｏＲＩベクター断片中にクローニングしてｐＪＡ１１４を得た。

ＣＯ３細胞中の遺伝子の試験遺伝子を前述したようにＣＯ８細胞中で試験した。非還元的ＳＯ３−ＰＡＧＥ上で、この物質はＦ　（ａｂ’　）物質としてのみ産生されるように思われた。還元的ＳＯ３−ＰＡＧＥは、軽鎖およびＦ　（ａｂ’　）遺伝子から期待されるものに等しい端が切除された重鎮を示した。

ＣＯ３細胞における安定な細胞系の開発）１ｃＭＶから発現される８７２．３　Ｐ　（ａｂ’　）重鎮遺伝子を含んで成る発現プラスミドプラスミド１１４を、エレクトロポレーションにより前述のＣｌｌ０細胞系ＣＬ１８中に導入した。この方法は全長のキメラ重鎮の導入について記載したものに類似するが、５ａｌＩの消化は省略し、そしてＤＮＡは閉環状ＤＮＡとして導入した。マイコフェノール酸に対して耐性でありかつ機能的Ｆ　（ａｂ’　）抗体を産生ずる細胞系を、前述したように抗原結合ＥＬＩＳＡアッセイにおける培養上澄み液をスクリーニングすることによって同定した。０．１〜６■／ｒｎｌのＦ　（ａｂ’　）を発現する細胞系を単離した。１つの細胞系ＦＢ９をその後の研究に使用した。

キメラ（Ｐａｂ’　）　２抗体の精製キメラＦ　（ａｂ’　）抗体を、免疫精製法を使用してＣＨＯ細胞上澄み液から精製した。免疫精製試薬は、ヒトカッパー鎖配列に対する特異的抗体であるＮ）１３　／４１を臭化シアン活性化セファローズに標準的方法によって結合して調製した。この物質をカラム中に詰め、そしてＰＢＳで平衡化した。キメラＦ　（ａｂ’　）を含有するＣＨＯ細胞培養上澄み液をカラ釧ど適用し、そしてこのカラムをＰＢＳで洗浄した。次いで、キメラＦ　（ａｂ’　）を１．５モルの塩酸グアニジンで溶出した。キメラＦ　（ａｂ’　）を含有する分画をＰＢＳ中に十分に透析し、そして限外濾過により濃縮した。

Ｆ　（ａｂ’　）の純度および集成を、５Ｏ３−ＰＡＧＥ　（還元的および非還元的の両者）およびＨＰＬＣゲル濾過によって試験した。

抗原結合活性はＥＬＩＳＡアッセイを使用して証明された。この物質のほぼ１０％は、それ以上精製しないで形成される（Ｆａｂ’　）２　として存在した。

実施例２は、ｐＡＴ１５３中にクローン化された８　７２．３／ヒトＩｇＧ１キメラ遺伝子を含有するベクターＲＢ２２を開示する。ベクターＪＡ９６およびＪＡ　１０８は前述した。ヒンジが変形された遺伝子を含有するプラスミドＴＲ００２を第１３図に示すようにして作製した。Ｂ　７２．３　Ｖ）ｌ／　ＩｇＧ１を含有するキメラＦ　（ａｂ’　）領域を、ＲＢ２２からの０．７　ｋｂｐの断片として、ＤＮＡを５ａｌｌで処理し、５ａｌＩ部位から５′−ホスフェートを仔つシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で除去しそしてＤＮＡを３ｃｏＲＩで再切断することによって単離した。

ＩｇＧ１ヒンジを、玉鎖及び下調オリゴヌクレオチド５００ｐｒｎをキナーゼ標識し、キナーゼ緩衝液量で７０℃に加熱することによりオリゴヌクレオチドをアニールしそして室温に冷却することによって集成した。このヒンジ断片を、前述したように調製したＪＡ　１０８からの０．７　ｋｂｐの断片に連結し、そしてＣＩＰ処理された５′末端をキナーゼ処理した。

発現ベクター中遺伝子の集成前述したように集成したキメラＢ７２．３１ｇＧＩ　Ｐ（ａｂ’　）重鎮遺伝子断片を、引き続いてＥｃｏＲＩ／ＣＩＰ処理したＪＡ９６のベクター断片中にクローニングしてＴＲ００２を得た。有用な軽鎖、例えばキメラ又はヒト化Ｂ　７２．３、を産生することができる発現ベクターを伴う適当な細胞中でのＴＲ００２の発現が、集成してＦ　（ａｂ’　）をもたらしそして生体内または生体外での適当な後翻訳修飾により（Ｆａｂ’　）２をもたらすであろう物質を生成する。

こうして、マウスＭＡｂ由来の特異性を有するがしかしヒト定常領域を有し、癌の診断および治療において重要な役割を演することができるＲＡＭを産生ずることが可能であることが証明された。

本発明を、その好ましい実施態様を参照して説明してきたが、変更および変化を本発明の範囲を逸脱することなく行うことができることが当業者にとって明らかであることが理解されるであろう。

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Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、　０ｘｆｏｒｄ、　１９８０゜１７、にｕｂｌｅｒ及びＨｏｆｆｍａｎ、Ｇｅｎｅ、２５．２６３−２６９．　１９８３゜１３、Ｈｕｙｎｈ　等、　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　八ｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ＩＲＬ。

０ｘｆｏｒｄ（Ｅｄ、　Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｍ、Ｍ、）、　１９８４゜１９、　Ｈｏｎｊｏ等、Ｃｅ１ｌ、　１８．５５９−５６８．１９７９゜ＦＩＧ、Ｉ浄書（内容に変更なし）１ｇＧ４　ヒト重鎮遺伝子　。

浄書（内容に変更なし）Ｆ１７２．３ネズミ鵬鎖遺伝子浄書（内容に変更なし）１　ネズミ重鎖　ｃＤＮＡ νｔ）１カニ　、　、骨　：、−１・Ｖ　ＣＨＩ　ＨＣＨ２ＣＨ３２ネズミ軽鎖　ｃＤＮＡＣ＝＝＝＝コＶ　ＣＦＩＧ、４３　キメラ重鎮遺伝子、−ゝ→υフ、　ヤ　°　・３．♂　：・：Ｖ　Ｃ）Ｉｔ　ＨＣ）１２　ＣＨ３４キメラ軽鎖遺伝子Ｅ＝コ＝＝コＣ浄書（内容に変更なし）ＦＩＧ、５希釈ＦＩＧ、６浄書（内容に変更なし）非還元　還元１’　２　３　４　５　６ＦＩＧ、　７Ｔｍ　−＋　−＋一■−−■−− ＦＩＧ、　８浄書（内容に変更なし）キメラＢ７２．３（７）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ非還元　還元ＦＩＧ、　９浄書（内容に変更なし）キメラＢ７２６の２次元５ＤＳ−ＰＡ、ＧＥトーーゆ非還元ゲルのＭｒの減少第一次元：非還元　５Ｏ５−ＰＡＧＥ第二次元：還元５ＤＳ−ＰＡＧＥＦＩＧ、　１０浄１７（内容に変更なし）１４４　４６Ｎ　ＩａａＭ時間（時）ニネズミＩｒ７０　２クキメラ　ＩＩηＪＬｓ１７４ＴＩＩｔｊ！移植：　キメラ　Ｂ７２．３ｘ４Ｉ４ａｓｓ　ｒａａＩ４時間（時）区コネズミＶソ　ロキメラ８７Ｌ３浄書（内容に変更なし）手続補正書（方式）平成２年１月８日特許庁長官　吉　１）文　毅　殿１、事件の表示ＰＣＴ／ＣＢ　８　Ｂ１０　Ｏ７３１、発明の名称組換え抗体及び方法３、補正をする者事件との関係　特許出願人住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正命令の日付平成１年１２月１９日（発送日）６、補正の対象（１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者」の欄（２）明細書及び請求の範囲の翻訳文（３）図面の翻訳文（４）委任１状７、補正の内容（１）（４）　別紙の通り（２）明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし）（３）図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録（１）訂正した特許法第１８４条の５第１項の規定による書面　１通（２）明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通（３）図面の翻訳文　１通（４）委任状及びその翻訳文　各１通国際調査報告ｌｌ＋’−”ＩＩＩＬｌｊ１ＭＮ＝−１−””’　ＰＣＴ／ＧＢ　８Ｂ１００７３１

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＴＡＧ−７２抗原に対する特異性を有しかつ抗原結合部位を有し、可変ドメインの少なくとも相補性決定領域（ＣＯＲ）がマウスモノグローチル抗体Ｂ７２．３（Ｂ７２．３ＭＡｂ）に由来し、そしてヒト化抗体分子（ＨＡＭ）の残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グロブリンに由来するヒト化抗体分子（ＨＡＭ）。
２．全体可変ドメインがＢ７２．３ＭＡｂに由来する請求項１に記載のＨＡＭ。
３．組み換えＤＮＡ技術によって産生された第１項又は第２項記載のＨＡＭ。
４．完全抗体分子、Ｆａｂ断片または（Ｆａｂ′）２断片からなる請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＡＭ。
５．エフェクターまたはリポーター分子が結合している請求項１〜４のいずれか１項に記載のＨＡＭ。
６．エフェクターまたはリポーター分子が、ＨＡＭの鎖の１つとの融合タンパク質として同時発現されたタンパク質分子である請求項５項記載のＨＡＭ。
７．（ａ）発現ベクター中に抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを生成せしめ、ここで可変ドメインの少なくともＣＤＲはＢ７２．３−ＭＡｂに由来し、そして抗体鎖の残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グロブリンに由来し；（ｂ）発現ベクター中に相補的抗体軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを生成せしめ、ここで可変ドメインの少なくともＣＤＲはＢ７２．３ＭＡｂに由来し、そして抗体鎖の残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グロブリンに由来し；（ｃ）宿主細胞を前記ベクターまたは各ベクターによりトランスフェグションし；そして（ｄ）トランスフェクトされた細胞系を培養してＨＡＭを産生せしめる；工程を含んで成る、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＨＡＭを製造する方法。
８．重鎖および軽鎖が同一ベクター中に存在する請求項７に記載の方法。
９．重鎖および軽鎖が別々のベクター中に存在する請求項７に記載の方法。
１０．ＤＮＡコード配列がＣＤＮＡとゲノムＤＮＡとの融合体を含んで成る請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
１１．宿主細胞が非骨磁性哺乳動物細胞である請求項１０に記載の方法。