JPS63112995A - 腫瘍関連抗原に特異的なキメラ齧歯類／ヒト免疫グロブリン - Google Patents
腫瘍関連抗原に特異的なキメラ齧歯類／ヒト免疫グロブリンInfo
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- JPS63112995A JPS63112995A JP62169580A JP16958087A JPS63112995A JP S63112995 A JPS63112995 A JP S63112995A JP 62169580 A JP62169580 A JP 62169580A JP 16958087 A JP16958087 A JP 16958087A JP S63112995 A JPS63112995 A JP S63112995A
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Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、ヒト不変部に結合された腫瘍−または増殖−
関連抗原に対して特異的な齧歯類−誘導抗原結合領域か
ら成るキメラ免疫グロブリンに関する。
関連抗原に対して特異的な齧歯類−誘導抗原結合領域か
ら成るキメラ免疫グロブリンに関する。
（従来技術）
モノクローナル抗体は、癌の治療に使用するために、腫
瘍と関連した抗原忙対して開発された。
瘍と関連した抗原忙対して開発された。
１つの例は、結腸直腸癌細胞および他の腫瘍細胞の表面
抗原に対して特異的なネズミモノクローナル抗体１７−
１Ａである。この抗体は結腸癌の免疫療法において使用
され、そしていくつかの場合にこの治療は結腸直腸癌の
部分後退または完全後退をもたらした。
抗原に対して特異的なネズミモノクローナル抗体１７−
１Ａである。この抗体は結腸癌の免疫療法において使用
され、そしていくつかの場合にこの治療は結腸直腸癌の
部分後退または完全後退をもたらした。
腫瘍関連抗原に対して開発された大部分のモノクローナ
ル抗体はネズミ抗体である。その主な理由は、この動物
種でのモノクローナル抗体のｓ 造波術が十分に開発さ
れているからである。ヒトモノクａ−ナル抗体は製造す
るのが難しい。ネズミハイプリドーマを作るための標準
技術（すなわち、抗原を投与して免疫化し、その後融合
用の牌細胞を採取する技術）は明らかにヒトモノクロー
ナル抗体を製造する際だ使用できない０特定抗原に対す
る抗体を生産するヒ） ＩＪンバ球は自然界で抗原にさ
らされたヒトから選択しうるが、ヒト細胞から作られた
ハイプリドーマは往々にして不安定であり、抗体の生産
を中止してしまう。
ル抗体はネズミ抗体である。その主な理由は、この動物
種でのモノクローナル抗体のｓ 造波術が十分に開発さ
れているからである。ヒトモノクａ−ナル抗体は製造す
るのが難しい。ネズミハイプリドーマを作るための標準
技術（すなわち、抗原を投与して免疫化し、その後融合
用の牌細胞を採取する技術）は明らかにヒトモノクロー
ナル抗体を製造する際だ使用できない０特定抗原に対す
る抗体を生産するヒ） ＩＪンバ球は自然界で抗原にさ
らされたヒトから選択しうるが、ヒト細胞から作られた
ハイプリドーマは往々にして不安定であり、抗体の生産
を中止してしまう。
モノクローナル抗体の生産に関するネズミ系での成功は
、多くのタイプの癌抗原に対するモノクローナル抗体の
生産手段を提供する。しかしながら、ネズミ抗体はヒト
の癌治療へのその使用を相当に制限するいくつかの欠点
をもっている。外来タンパク質としてのネズミ抗体はし
ばしば、それらの治療効力を減少または破壊する反作用
的な免疫反応を誘発させる。さらに、ネズミ抗体は患者
にアレルギー反応を引き起こすことがある。不幸にも、
治療での再投与の必要性は、患者におけるこれらの免疫
反応の可能性を増大させるものである０ これらの問題を回避するために示唆された方法は、ヒト
の不変部に結合されたマウスの可変部から成る抗体を作
ることである。例えばモリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、
Ｓ、Ｌ、 ）ら、′キメラヒト抗体分子：ヒト不変部ド
メインをもつマウス抗原結合ドメイン″’ Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ３１
：６８５１（１９８４）；ニーＬ−バーガー（Ｎｅｕ−
ｂｅｒｇｅｒ、 Ｍ、Ｓ、 ）およびラピツツ（Ｒａｂ
ｂｉｔｓ。
、多くのタイプの癌抗原に対するモノクローナル抗体の
生産手段を提供する。しかしながら、ネズミ抗体はヒト
の癌治療へのその使用を相当に制限するいくつかの欠点
をもっている。外来タンパク質としてのネズミ抗体はし
ばしば、それらの治療効力を減少または破壊する反作用
的な免疫反応を誘発させる。さらに、ネズミ抗体は患者
にアレルギー反応を引き起こすことがある。不幸にも、
治療での再投与の必要性は、患者におけるこれらの免疫
反応の可能性を増大させるものである０ これらの問題を回避するために示唆された方法は、ヒト
の不変部に結合されたマウスの可変部から成る抗体を作
ることである。例えばモリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、
Ｓ、Ｌ、 ）ら、′キメラヒト抗体分子：ヒト不変部ド
メインをもつマウス抗原結合ドメイン″’ Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ３１
：６８５１（１９８４）；ニーＬ−バーガー（Ｎｅｕ−
ｂｅｒｇｅｒ、 Ｍ、Ｓ、 ）およびラピツツ（Ｒａｂ
ｂｉｔｓ。
Ｔ、Ｈ，）、゛キメラ抗体の製造”ＰＣＴ出願番号ＰＣ
Ｔ／ＧＢ８５ ００３９２を参照されたい。これらのキ
メラ抗体はネズミ抗体の抗原結合特異性をもつであろう
が、それらはヒト不変部を有するので大部分はヒト抗体
であるだろう。不変部は抗体に対する免疫応答に大きく
関与するので、ヒト由来の不変部をもつキメラネダミ／
ヒト抗体はヒトにおいて抗ネズミ免疫応答を恐らく引き
起こさないと思われる。さらに、ヒト不変部はより優れ
たエフェクター機能をもつ抗体を提供する。
Ｔ／ＧＢ８５ ００３９２を参照されたい。これらのキ
メラ抗体はネズミ抗体の抗原結合特異性をもつであろう
が、それらはヒト不変部を有するので大部分はヒト抗体
であるだろう。不変部は抗体に対する免疫応答に大きく
関与するので、ヒト由来の不変部をもつキメラネダミ／
ヒト抗体はヒトにおいて抗ネズミ免疫応答を恐らく引き
起こさないと思われる。さらに、ヒト不変部はより優れ
たエフェクター機能をもつ抗体を提供する。
ヒト不変部のネズミ可変部への結合は、得られろキメラ
の結合能を低下または破壊する方法で、可変部のコンホ
メーションを変更するかもしれない。ハプテン（例えば
アゾフェニルアルソネートおよびトリニトロフェニル）
のための可変部をもつキメラネズミ／ネズミ抗体および
ネズミ／ヒト抗体が作られ、これらの抗体は可変部が誘
導される不ズミ抗体のもとのハプテン結合特異性を保持
することが見出された。例えばシャロン（Ｓｈ ａ ｒ
ｏ ｒＬＪ、）ら、°゛マウスミエローマ細胞よるＶ
ＩＩＣＫキメラタンパク質の発現” Ｎａｔｕｒｅ ３
０９ ： ３６４〜３６６（１９８４）；ボーリア７
（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ。
の結合能を低下または破壊する方法で、可変部のコンホ
メーションを変更するかもしれない。ハプテン（例えば
アゾフェニルアルソネートおよびトリニトロフェニル）
のための可変部をもつキメラネズミ／ネズミ抗体および
ネズミ／ヒト抗体が作られ、これらの抗体は可変部が誘
導される不ズミ抗体のもとのハプテン結合特異性を保持
することが見出された。例えばシャロン（Ｓｈ ａ ｒ
ｏ ｒＬＪ、）ら、°゛マウスミエローマ細胞よるＶ
ＩＩＣＫキメラタンパク質の発現” Ｎａｔｕｒｅ ３
０９ ： ３６４〜３６６（１９８４）；ボーリア７
（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ。
Ｇ、Ｌ、 ） ら、°゛機能的なキメラマウス／ヒト
抗体（１９８４）；およびニューバーガー（Ｎｅｕｂｅ
ｒ−ｇｅｒ、 Ｍ、Ｓ、 ）ら、 ”ヒト生理学的エフ
ェクター機能をもつハプテン特異的キメラＩｇＥ抗体″
Ｎａｔｕｒｅ ３１４ ： ２６８〜２７０（１９８５
） を参照されたい。しかしながら、ハプテン分子は
小さいので、ヒト不変部の結合によってネズミ可変部に
起こりうるコンホメーションの変化は、この種の分子へ
の結合を有意に変更しないのかもしれない。その同族抗
原が腫瘍−または増殖−関連細胞の表面抗原のような大
きい分子である場合、可変部におけるコンホメーション
の変化は実質的に結合能に影響を及ぼし得るだろう。
抗体（１９８４）；およびニューバーガー（Ｎｅｕｂｅ
ｒ−ｇｅｒ、 Ｍ、Ｓ、 ）ら、 ”ヒト生理学的エフ
ェクター機能をもつハプテン特異的キメラＩｇＥ抗体″
Ｎａｔｕｒｅ ３１４ ： ２６８〜２７０（１９８５
） を参照されたい。しかしながら、ハプテン分子は
小さいので、ヒト不変部の結合によってネズミ可変部に
起こりうるコンホメーションの変化は、この種の分子へ
の結合を有意に変更しないのかもしれない。その同族抗
原が腫瘍−または増殖−関連細胞の表面抗原のような大
きい分子である場合、可変部におけるコンホメーション
の変化は実質的に結合能に影響を及ぼし得るだろう。
（発明の構成）
本発明は、ヒト不変部に結合された腫瘍−または増殖−
関連抗原に特異的な齧歯類誘導抗原結合領域から成るキ
メラ免疫グロブリンに関する。そのキメラ免疫グロブリ
ンは ａ）ヒト重鎖不変部に結合された、腫瘍−または増殖−
関連抗原に対して特異的な脇歯類抗体の重鎖から誘導さ
れる抗原結合領域から成る少なくとも１本のキメラ重鎖
；およびｂ）ヒト軽鎖不変部に結合された、脇線類抗体
の軽鎖から誘導される抗原結合領域から成る少なくとも
１本のキメラ軽鎖； から構成される。免疫グロブリンは１価ダイマー、２価
テトラブーまたは多価集合体であり得ろ。これらのキメ
ラネスミ／ヒト免疫グロブリンは腫瘍−または増殖−関
連抗原に対するもとの結合能を保持している。
関連抗原に特異的な齧歯類誘導抗原結合領域から成るキ
メラ免疫グロブリンに関する。そのキメラ免疫グロブリ
ンは ａ）ヒト重鎖不変部に結合された、腫瘍−または増殖−
関連抗原に対して特異的な脇歯類抗体の重鎖から誘導さ
れる抗原結合領域から成る少なくとも１本のキメラ重鎖
；およびｂ）ヒト軽鎖不変部に結合された、脇線類抗体
の軽鎖から誘導される抗原結合領域から成る少なくとも
１本のキメラ軽鎖； から構成される。免疫グロブリンは１価ダイマー、２価
テトラブーまたは多価集合体であり得ろ。これらのキメ
ラネスミ／ヒト免疫グロブリンは腫瘍−または増殖−関
連抗原に対するもとの結合能を保持している。
キメラ免疫グロブリンの齧歯類可変部は、腫瘍−または
増殖−関連抗原に対して特異的な免疫グロブリンから誘
導される。通常、その可変部はネズミ由来のものである
だろう。なぜなら、この種の抗原に対するネズミ抗体は
入手可能であるか、又は十分に確立されたネズミ系にお
いて製造可能であるからである。腫瘍−関連抗原（この
抗原と特異的に反応するネズミ免疫グロブリンが使用さ
れる）の例は抗原１７−１Ａ（胃腸の１！！ＩＸ瘍）、
０Ｃ１２５（卵巣癌）、０Ｖ−ＴＬ３（卵巣癌）、１０
３Ｄ２ （、乳癌）および１２３．Ｇ３（腎癌）である
。その他には抗原７２．３（結腸）、ＤＦ３．１１５Ｄ
８、ＲＣ３８（腎臓）、Ｇ２５０および５５−２Ａが含
まれる。ラット系は別の可変部源を提供する。
増殖−関連抗原に対して特異的な免疫グロブリンから誘
導される。通常、その可変部はネズミ由来のものである
だろう。なぜなら、この種の抗原に対するネズミ抗体は
入手可能であるか、又は十分に確立されたネズミ系にお
いて製造可能であるからである。腫瘍−関連抗原（この
抗原と特異的に反応するネズミ免疫グロブリンが使用さ
れる）の例は抗原１７−１Ａ（胃腸の１！！ＩＸ瘍）、
０Ｃ１２５（卵巣癌）、０Ｖ−ＴＬ３（卵巣癌）、１０
３Ｄ２ （、乳癌）および１２３．Ｇ３（腎癌）である
。その他には抗原７２．３（結腸）、ＤＦ３．１１５Ｄ
８、ＲＣ３８（腎臓）、Ｇ２５０および５５−２Ａが含
まれる。ラット系は別の可変部源を提供する。
キメラ免疫グロブリンの不変部はヒト免疫グロブリンか
ら誘導される。重鎖の不変部はアイソタイプクラスまた
はサブクラスのいずれからも選択することができ、一方
軽鎖の不変部はカンハ（ｋ）またはラムダ（λ）クラス
のものであり得ろ。
ら誘導される。重鎖の不変部はアイソタイプクラスまた
はサブクラスのいずれからも選択することができ、一方
軽鎖の不変部はカンハ（ｋ）またはラムダ（λ）クラス
のものであり得ろ。
キメラ抗体は、腫瘍−関連抗原に対して特異的な齧歯類
抗体の重鎖および経鎖可変部をコードするＤＮＡセグメ
ントをクローニングし、次にこれらのＤＮＡセグメント
をヒト重鎖および軽鎖不変部をコードするＤＮＡセグメ
ントに結合してキメラ免疫グロブリンコード化遺伝子を
作ることにより製造される。軽鎖および重鎖をコードす
る融合遺伝子構築物は発現ベクター中に集められるか、
またはその中に挿入される。これらの遺伝子は免疫グロ
ブリンタンパク質を合成し、集成し、分泌することがで
きるリンパ様受容細胞（例えばミエローマ細胞）に同時
トランスフェクションされる。
抗体の重鎖および経鎖可変部をコードするＤＮＡセグメ
ントをクローニングし、次にこれらのＤＮＡセグメント
をヒト重鎖および軽鎖不変部をコードするＤＮＡセグメ
ントに結合してキメラ免疫グロブリンコード化遺伝子を
作ることにより製造される。軽鎖および重鎖をコードす
る融合遺伝子構築物は発現ベクター中に集められるか、
またはその中に挿入される。これらの遺伝子は免疫グロ
ブリンタンパク質を合成し、集成し、分泌することがで
きるリンパ様受容細胞（例えばミエローマ細胞）に同時
トランスフェクションされる。
本発明のキメラ抗体は癌の治療および診断に有用である
。キメラ抗体は単独で、あるいは異なる腫瘍によっても
たらされる別の抗原に特異的な抗体の混合物または゛′
カクテル″として数種の他の免疫グロブリンと共て、ｌ
ｉ！ｆｉ瘍の治療のために使用される。他の治療形式で
は、キメラ免疫グロプリンを癌治療薬剤と化学的にまた
は遺伝子工学技術により結合させて、癌細胞に特異的に
向かういわゆる６スマー） （ｓｍａｒｔ ）”剤を形
成することができる。診断用途のために、キメラ免疫グ
ロブリンはＪｌ！！！瘍画像形区画像形成用提供するこ
とができる。例えば、免疫グミプリンは重鎖を切断して
“抗体フラグメント”を得、直接にまたは標識キレート
剤を介して標識することにより作られる。
。キメラ抗体は単独で、あるいは異なる腫瘍によっても
たらされる別の抗原に特異的な抗体の混合物または゛′
カクテル″として数種の他の免疫グロブリンと共て、ｌ
ｉ！ｆｉ瘍の治療のために使用される。他の治療形式で
は、キメラ免疫グロプリンを癌治療薬剤と化学的にまた
は遺伝子工学技術により結合させて、癌細胞に特異的に
向かういわゆる６スマー） （ｓｍａｒｔ ）”剤を形
成することができる。診断用途のために、キメラ免疫グ
ロブリンはＪｌ！！！瘍画像形区画像形成用提供するこ
とができる。例えば、免疫グミプリンは重鎖を切断して
“抗体フラグメント”を得、直接にまたは標識キレート
剤を介して標識することにより作られる。
キメラ免疫グロブリンは６ビルトイン（ｂｕｉｌｔ−ｉ
ｎ）”標識キレートタンパク質またはタンパク質ドメイ
ンを含むようにデザインすることができる０ キメラネズミ／ヒト抗体のｉｎ ｖｉｖｏ使用はネズミ
モノクローナル抗体の使用に比べていくつかの利点を提
供する。第一に、これらの抗体は患者にヒト抗マウス反
応を誘起する点でより弱い免疫原性をもつ。第二に、所
定のヒト不変部をマウス可変部遺伝子に結合させて、意
図する生物学的エフェクター機能をもつ抗体を作ること
ができる。
ｎ）”標識キレートタンパク質またはタンパク質ドメイ
ンを含むようにデザインすることができる０ キメラネズミ／ヒト抗体のｉｎ ｖｉｖｏ使用はネズミ
モノクローナル抗体の使用に比べていくつかの利点を提
供する。第一に、これらの抗体は患者にヒト抗マウス反
応を誘起する点でより弱い免疫原性をもつ。第二に、所
定のヒト不変部をマウス可変部遺伝子に結合させて、意
図する生物学的エフェクター機能をもつ抗体を作ること
ができる。
最後に、Ｉｇ ＤＮＡと非Ｉｇ ＤＮＡ配列を結合させ
ることにより構築されたハイブリッド遺伝子な発現させ
ることが可能である。先に述べたように、これらの融合
タンパク質は選択的破壊または腫瘍細胞の画像形成のた
めの、抗体をベースとした輸送系を構成する。
ることにより構築されたハイブリッド遺伝子な発現させ
ることが可能である。先に述べたように、これらの融合
タンパク質は選択的破壊または腫瘍細胞の画像形成のた
めの、抗体をベースとした輸送系を構成する。
本発明のキメラ免疫グロブリンは、個々のキメラ重鎖お
よび軽鎖免疫グロブリンから成る。キメラ重鎖は齧歯類
重鎖可変部およびヒト重鎖不変部をもつ連続ポリペプチ
ドである。キメラ軽鎖は齧歯類軽鎖可変部およびヒト軽
鎖不変部をもつ連続ポリペプチドである。
よび軽鎖免疫グロブリンから成る。キメラ重鎖は齧歯類
重鎖可変部およびヒト重鎖不変部をもつ連続ポリペプチ
ドである。キメラ軽鎖は齧歯類軽鎖可変部およびヒト軽
鎖不変部をもつ連続ポリペプチドである。
免疫グロブリンは１価、２価または多価であり得る。１
価免疫グロブリンは１本のキメラ軽鎖と（ジスルフィド
架橋を介して）結合した１本のキメラ重鎖から成るダイ
マー（）ＩＬ）である。２価免疫グロブリンは２本のダ
イマーが結合されたテトラマー（Ｈ２Ｌ２）である。多
価免疫グロブリンは、例えば凝集する重鎖不変部（例え
ばミュー（μ）タイプの不変部）を使用することにより
作られる。
価免疫グロブリンは１本のキメラ軽鎖と（ジスルフィド
架橋を介して）結合した１本のキメラ重鎖から成るダイ
マー（）ＩＬ）である。２価免疫グロブリンは２本のダ
イマーが結合されたテトラマー（Ｈ２Ｌ２）である。多
価免疫グロブリンは、例えば凝集する重鎖不変部（例え
ばミュー（μ）タイプの不変部）を使用することにより
作られる。
可変部は腫瘍−または増殖−関連抗原に特異的な抗体か
ら誘導される。その抗原結合領域は胃腸、***、卵巣、
肺および腎の癌細胞抗原に特異的でありうる。抗原の例
は１７−１Ａ（胃腸の腫瘍）、０Ｃ１２５（卵巣癌）、
０Ｖ−ＴＬ３（卵巣癌）、１０３Ｄ２ （乳癌）および
１２３．０３（腎癌）に特異的なネズミ抗体によって規
定される抗原である。その他には７２．３（結腸）、Ｄ
Ｆ３．１１５Ｄ８、ＲＣ３８（腎）、Ｇ２５０および５
５−２Ａが含まれる。重鎖不変部は５種のアイソタイプ
アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガ
ンマ（γ）またはミュー（μ）のいずれからも ′選択
することができる。さらに、種々のサブクラス（例えば
ＩｇＧサブクラス）の重鎖も使用できる。異なるクラス
およびサブクラスの１鎖は異なるエフェクター機能の原
因となり、こうして所望の重鎖不変部を選ぶことにより
、所望のエフェクター機能をもつキメラ抗体を製造する
ことができる。好適な不変部はガンマ１（ＩｇＧ１）お
よびガンマ３（ＩｇＧ３）である。軽鎖不変部はカッパ
またはラムダ鎖でありうる。
ら誘導される。その抗原結合領域は胃腸、***、卵巣、
肺および腎の癌細胞抗原に特異的でありうる。抗原の例
は１７−１Ａ（胃腸の腫瘍）、０Ｃ１２５（卵巣癌）、
０Ｖ−ＴＬ３（卵巣癌）、１０３Ｄ２ （乳癌）および
１２３．０３（腎癌）に特異的なネズミ抗体によって規
定される抗原である。その他には７２．３（結腸）、Ｄ
Ｆ３．１１５Ｄ８、ＲＣ３８（腎）、Ｇ２５０および５
５−２Ａが含まれる。重鎖不変部は５種のアイソタイプ
アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガ
ンマ（γ）またはミュー（μ）のいずれからも ′選択
することができる。さらに、種々のサブクラス（例えば
ＩｇＧサブクラス）の重鎖も使用できる。異なるクラス
およびサブクラスの１鎖は異なるエフェクター機能の原
因となり、こうして所望の重鎖不変部を選ぶことにより
、所望のエフェクター機能をもつキメラ抗体を製造する
ことができる。好適な不変部はガンマ１（ＩｇＧ１）お
よびガンマ３（ＩｇＧ３）である。軽鎖不変部はカッパ
またはラムダ鎖でありうる。
一般に、キメラ抗体はキメラ免疫グロブリンの軽鎖およ
び重鎖成分のそれぞれのために、ネズミ可変部の少なく
とも機能部分をコードする第１ＤＮＡセグメントを、ヒ
ト不変部の少なくとも一部をコードする第２ ＤＮＡセ
グメントに結合させた融合遺伝子をつくることにより製
造される。各融合遺伝子は発現ベクター中に集められる
か、またはそのベクター中に挿入される。その後、遺伝
子産物を発現しうる受容細胞にその遺伝子をトランスフ
ェクションする。トランスフェクションされた受容細胞
を培養し、発現された免疫グロブリンまたは免疫グロブ
リン鎖を回収する。
び重鎖成分のそれぞれのために、ネズミ可変部の少なく
とも機能部分をコードする第１ＤＮＡセグメントを、ヒ
ト不変部の少なくとも一部をコードする第２ ＤＮＡセ
グメントに結合させた融合遺伝子をつくることにより製
造される。各融合遺伝子は発現ベクター中に集められる
か、またはそのベクター中に挿入される。その後、遺伝
子産物を発現しうる受容細胞にその遺伝子をトランスフ
ェクションする。トランスフェクションされた受容細胞
を培養し、発現された免疫グロブリンまたは免疫グロブ
リン鎖を回収する。
ネズミＩｇ軽鎖および重鎖の可変部をコードする遺伝子
は、意図する腫瘍抗原に特異的な抗体を生産するリンパ
様細胞から得られる。例えば、抗原１７−１Ａ１０Ｃ１
２５、または他の抗原のいずれか疋対する抗体を産生ず
る・・イブリドーマ細胞株は、ある種の肺癌関連抗原に
対する免疫グロブリン可変部遺伝子の源を提供する。細
胞株は謡肉類な腫瘍細胞または腫瘍抗原含有細胞成分ま
たは分画でチャレンジ（免疫化）し、抗体産生細胞トミ
エローマ細胞との融合ノ・イブリッド細胞を形成し、そ
のハイブリッドをクローニングし、そして腫瘍−関連抗
原に対する抗体を産生ずるクローンを選択することによ
り作ることができる。コブロースキー（Ｋｏｐｒｏｗｓ
ｋｉ ）らの米国特許第４１７２１２４号を参照された
い。
は、意図する腫瘍抗原に特異的な抗体を生産するリンパ
様細胞から得られる。例えば、抗原１７−１Ａ１０Ｃ１
２５、または他の抗原のいずれか疋対する抗体を産生ず
る・・イブリドーマ細胞株は、ある種の肺癌関連抗原に
対する免疫グロブリン可変部遺伝子の源を提供する。細
胞株は謡肉類な腫瘍細胞または腫瘍抗原含有細胞成分ま
たは分画でチャレンジ（免疫化）し、抗体産生細胞トミ
エローマ細胞との融合ノ・イブリッド細胞を形成し、そ
のハイブリッドをクローニングし、そして腫瘍−関連抗
原に対する抗体を産生ずるクローンを選択することによ
り作ることができる。コブロースキー（Ｋｏｐｒｏｗｓ
ｋｉ ）らの米国特許第４１７２１２４号を参照された
い。
不変部は標準クローニング法によりヒト抗体産生細胞か
ら得られる。また、２つのクラスの軽鎖および５つのク
ラスの重鎖なコードする遺伝子はすでにクローニングさ
れているので、ヒト由来の不変部はこれらのクローンか
ら容易に入手しうる。
ら得られる。また、２つのクラスの軽鎖および５つのク
ラスの重鎖なコードする遺伝子はすでにクローニングさ
れているので、ヒト由来の不変部はこれらのクローンか
ら容易に入手しうる。
好ましくは、キメラ軽鎖および重鎖をコードする融合遺
伝子は２つの異なる発現ベクター（これらのベクターは
受容細胞を同時形質転換するために使用しうる）中に挿
入される。それぞれのベクターは２つの選択遺伝子（す
なわち細菌系での選択遺伝子および真核生物系での選択
遺伝子）を含み、各ベクターは異なる対の遺伝子を有す
る０これらのベクターは細菌系での融合遺伝子の生産お
よび増幅、その後の真核細胞の同時トランスフェクショ
ンおよび同時トランスフェクションされた細胞の選択を
可能にする。細菌系のための選択遺伝子の例は、アンピ
シリン耐性を与える遺伝子およびクロラムフェニコール
耐性を与える遺伝子である。トランスフェクションされ
た真核細胞の選択のためには、２つの選択遺伝子：すな
わち（１）キサンチン−グアニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）、および（ｆｔ） Ｔｎ
５からのホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅ。
伝子は２つの異なる発現ベクター（これらのベクターは
受容細胞を同時形質転換するために使用しうる）中に挿
入される。それぞれのベクターは２つの選択遺伝子（す
なわち細菌系での選択遺伝子および真核生物系での選択
遺伝子）を含み、各ベクターは異なる対の遺伝子を有す
る０これらのベクターは細菌系での融合遺伝子の生産お
よび増幅、その後の真核細胞の同時トランスフェクショ
ンおよび同時トランスフェクションされた細胞の選択を
可能にする。細菌系のための選択遺伝子の例は、アンピ
シリン耐性を与える遺伝子およびクロラムフェニコール
耐性を与える遺伝子である。トランスフェクションされ
た真核細胞の選択のためには、２つの選択遺伝子：すな
わち（１）キサンチン−グアニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）、および（ｆｔ） Ｔｎ
５からのホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅ。
と称す）が好適である。ｇｐｔ での選択は、この遺伝
子によってコードされる酵素がプリンヌクレオチド合成
のために基質としてキサンチンを使用する能力に基づい
ている；類似の内因性酵素はキサンチンを利用できない
。キサンチンおよびミコフェノール酸（イノシンモノホ
スフェートのキサンチンモノホスフェートへの転化を遮
断スル）￥含む培地では、ｇｐｔ遺伝子を発現する細胞
だけが生き残る。ｎｅｏの生産物は、抗生物質Ｇ４１８
およびこのクラスの他の抗生物質によって起こる真核細
胞によるタンパク質合成の阻止を遮断する。
子によってコードされる酵素がプリンヌクレオチド合成
のために基質としてキサンチンを使用する能力に基づい
ている；類似の内因性酵素はキサンチンを利用できない
。キサンチンおよびミコフェノール酸（イノシンモノホ
スフェートのキサンチンモノホスフェートへの転化を遮
断スル）￥含む培地では、ｇｐｔ遺伝子を発現する細胞
だけが生き残る。ｎｅｏの生産物は、抗生物質Ｇ４１８
およびこのクラスの他の抗生物質によって起こる真核細
胞によるタンパク質合成の阻止を遮断する。
２つの選択方法は真核細胞中の２つの異なるＤＮＡベク
ターに導入された免疫グロブリン鎖遺伝子の発現を選択
するために、同時にまたは順次使用される。
ターに導入された免疫グロブリン鎖遺伝子の発現を選択
するために、同時にまたは順次使用される。
好適な受容細胞株はミエローマ細胞である。ミエローマ
細胞ハトランスフエクションされたＩｇ遺伝子によりコ
ードされる免疫グロブリンを合成し、集成し、そして分
泌することができる。さらに、それらは免疫グロブリン
のグリコジル化機構を有する。特に好適な受容細胞はＩ
ｇ非産生ミエローマ細胞５ｐ２１０である。この細胞は
トランスフェクションされた免疫グロブリン遺伝子によ
りコードされる免疫グロブリンのみを生産する。
細胞ハトランスフエクションされたＩｇ遺伝子によりコ
ードされる免疫グロブリンを合成し、集成し、そして分
泌することができる。さらに、それらは免疫グロブリン
のグリコジル化機構を有する。特に好適な受容細胞はＩ
ｇ非産生ミエローマ細胞５ｐ２１０である。この細胞は
トランスフェクションされた免疫グロブリン遺伝子によ
りコードされる免疫グロブリンのみを生産する。
ミエローマ細胞は培地中で、又はマウスの腹膜中（この
場合は分泌された免疫グロブリンが腹水から得られる）
で増殖させることができる。８９７７球のような他のリ
ンパ様細胞またはハイプリドーマ細胞も１渦な受容細胞
として役立つだろう０免疫グロブリンコード化遺伝子で
リンパ様細胞をトランスフェクションするいくつかの方
法が存在する。ＤＮＡをリンパ様細胞中に導入する好適
な方法はプロトプラスト融合によるものである。
場合は分泌された免疫グロブリンが腹水から得られる）
で増殖させることができる。８９７７球のような他のリ
ンパ様細胞またはハイプリドーマ細胞も１渦な受容細胞
として役立つだろう０免疫グロブリンコード化遺伝子で
リンパ様細胞をトランスフェクションするいくつかの方
法が存在する。ＤＮＡをリンパ様細胞中に導入する好適
な方法はプロトプラスト融合によるものである。
この方法では、キメラＩｇ遺伝子を含む組換えプラスミ
ドを保有する細菌から細胞壁を溶解するために、リンチ
ームが使用される。得られたスフェロプラストはポリエ
チレングリコールを用いてミエローマ細胞と融合させろ
。プロトプラスト融合の後、トランスフェクションされ
た細胞を選択し、分離する。ＤＮＡを多くの細胞型へ導
入するために使用できる他の技術はリン酸カルシウム沈
降である。
ドを保有する細菌から細胞壁を溶解するために、リンチ
ームが使用される。得られたスフェロプラストはポリエ
チレングリコールを用いてミエローマ細胞と融合させろ
。プロトプラスト融合の後、トランスフェクションされ
た細胞を選択し、分離する。ＤＮＡを多くの細胞型へ導
入するために使用できる他の技術はリン酸カルシウム沈
降である。
キメラ免疫グロブリン遺伝子は、細菌や酵母のような非
リンパ様細胞中で発現させることができる。細菌による
発現の場合は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖が細胞封
入体の一部てなる。従って、これらの鎖は単離精製した
あと機能的な免疫グロブリン分子とするために集成しな
ければならない。
リンパ様細胞中で発現させることができる。細菌による
発現の場合は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖が細胞封
入体の一部てなる。従って、これらの鎖は単離精製した
あと機能的な免疫グロブリン分子とするために集成しな
ければならない。
結腸直腸癌およびいくつかの他の種類の癌に関連した１
７−１Ａ抗原に特異的な機能キメラ抗体は以下のように
して作られる。
７−１Ａ抗原に特異的な機能キメラ抗体は以下のように
して作られる。
１７−１Ａの重鎖および軽鎖Ｖ領域（ＩｇＧ２ａ、カッ
パ軽鎖）をコードするゲノムＤＮＡセグメントをクロー
ニングし、その後ヒトγ３不変部（Ｃｒ３）およびカッ
バネ変部（Ｃに）をコードするＤＮＡセグメントに連結
した。組換え遺伝子はマウスミエローマ細胞にトランス
フェクションして、Ｉｇタンパク質を合成し、集成し、
そして分泌させた。■領域のためのプローブを得るため
に、１７−１Ａの（！ＤＮＡライブラリーを作製した０
ＲＮＡを抽出し、ポリＡ＋ＲＮＡをオリゴｄＴセルロー
スクロマトグラフィーにより調製した。２重鎖ｃＤＮＡ
はポリＡ”ＲＮＡを鋳型としてＡＭＶ逆転写酵素および
大腸菌（Ｅ、ｃｏＨ）ＤＮＡポリメラーゼエを使って合
成した。２重鎖ｃＤＮＡはＳｔ ヌクレアーゼで処理し
、デオキシシチジン残基で伸長させ、そして予めＰｓｔ
Ｉで切断したｄＧ付加ｐＵＣ８とアニーリングさせた。
パ軽鎖）をコードするゲノムＤＮＡセグメントをクロー
ニングし、その後ヒトγ３不変部（Ｃｒ３）およびカッ
バネ変部（Ｃに）をコードするＤＮＡセグメントに連結
した。組換え遺伝子はマウスミエローマ細胞にトランス
フェクションして、Ｉｇタンパク質を合成し、集成し、
そして分泌させた。■領域のためのプローブを得るため
に、１７−１Ａの（！ＤＮＡライブラリーを作製した０
ＲＮＡを抽出し、ポリＡ＋ＲＮＡをオリゴｄＴセルロー
スクロマトグラフィーにより調製した。２重鎖ｃＤＮＡ
はポリＡ”ＲＮＡを鋳型としてＡＭＶ逆転写酵素および
大腸菌（Ｅ、ｃｏＨ）ＤＮＡポリメラーゼエを使って合
成した。２重鎖ｃＤＮＡはＳｔ ヌクレアーゼで処理し
、デオキシシチジン残基で伸長させ、そして予めＰｓｔ
Ｉで切断したｄＧ付加ｐＵＣ８とアニーリングさせた。
この組換えプラスミドを大腸菌ＤＨＩに形質転換し、コ
ロニーはマウスＣにプローブおよびマウスＣγ２ａプロ
ーブを用いてスクリーニングして、それぞれ軽鎖クロー
ンおよび重鎖クローンを単離した。これらのクローンは
Ｖ領域プローブの供給源として使用した。
ロニーはマウスＣにプローブおよびマウスＣγ２ａプロ
ーブを用いてスクリーニングして、それぞれ軽鎖クロー
ンおよび重鎖クローンを単離した。これらのクローンは
Ｖ領域プローブの供給源として使用した。
機能的に再配列されたカッパ軽鎖遺伝子を含むゲノムＤ
ＮＡフラグメントを単離するために、ゲノムライブラリ
ーはＥＭＢＬ３Ａファージアームを使って５ａｕ３Ａ部
分消化１７−１ＡＤＮＡから作製した。全部で２００，
０００個の組換えプラークがマウスミエローマによりス
クリーニングされ、３個の陽性クローンが得られた。こ
れらのクローンのうちの１つλ＆４は、制限マツピング
および１７−１Ａ１ｃ’ＤＮＡをプローブとして使用す
るサザン分析により、１７−１Ａの機能的に再配列され
たカッパ軽鎖遺伝子のＶおよびＣ領域の両方を含むこと
がわかった。マウスＣγ２ａプローブおよび（！ＤＮＡ
クローンから誘導された重鎖Ｖ （、ＶＨ）プローブを
使用して同じ方法を繰り返した場合、どの陽性クローン
も重鎖遺伝子のＶおよびＣ領域の両方を含まないことが
わかった。
ＮＡフラグメントを単離するために、ゲノムライブラリ
ーはＥＭＢＬ３Ａファージアームを使って５ａｕ３Ａ部
分消化１７−１ＡＤＮＡから作製した。全部で２００，
０００個の組換えプラークがマウスミエローマによりス
クリーニングされ、３個の陽性クローンが得られた。こ
れらのクローンのうちの１つλ＆４は、制限マツピング
および１７−１Ａ１ｃ’ＤＮＡをプローブとして使用す
るサザン分析により、１７−１Ａの機能的に再配列され
たカッパ軽鎖遺伝子のＶおよびＣ領域の両方を含むこと
がわかった。マウスＣγ２ａプローブおよび（！ＤＮＡ
クローンから誘導された重鎖Ｖ （、ＶＨ）プローブを
使用して同じ方法を繰り返した場合、どの陽性クローン
も重鎖遺伝子のＶおよびＣ領域の両方を含まないことが
わかった。
ｖ■遺伝子をクローニングするために別の方法が行われ
た。１７−１Ａの再配列された重鎖Ｖ遺伝子を含むフラ
グメントは、融合パートナ−ＭＳ−１のパターンと比較
したとき別のバンドとしてサザン分析により同定された
。１７−１Ａ細胞のＤＮＡ試料を制限酵素Ｅ ｃｏ Ｒ
Ｉで消化したとき、７．４ｋｂと３．８ｋｂの２つの再
配列フラグメントが、Ｊ３およびＪ４配列を含むマウス
重鎖Ｊ領域（Ｊ ）Ｉ ） プローブを用いることに
より見出された。
た。１７−１Ａの再配列された重鎖Ｖ遺伝子を含むフラ
グメントは、融合パートナ−ＭＳ−１のパターンと比較
したとき別のバンドとしてサザン分析により同定された
。１７−１Ａ細胞のＤＮＡ試料を制限酵素Ｅ ｃｏ Ｒ
Ｉで消化したとき、７．４ｋｂと３．８ｋｂの２つの再
配列フラグメントが、Ｊ３およびＪ４配列を含むマウス
重鎖Ｊ領域（Ｊ ）Ｉ ） プローブを用いることに
より見出された。
分離用アガロースゲル電気泳動により単離した約７ｋｂ
および約４ ｋｂのＤＮＡフラグメントは、それぞれλ
ｇｔ ＷＥＳおよびλｇｔｌｌファージアームと連結さ
せた。これらの２つの部分ライブラリーの組換えプラー
クはマウスＪＩ＋プローブでスクリーニングした。７．
４ｋｂおよび３．８ｋｂのＥＣ０ＲＩフラグメントの両
方をクローニングした。
および約４ ｋｂのＤＮＡフラグメントは、それぞれλ
ｇｔ ＷＥＳおよびλｇｔｌｌファージアームと連結さ
せた。これらの２つの部分ライブラリーの組換えプラー
クはマウスＪＩ＋プローブでスクリーニングした。７．
４ｋｂおよび３．８ｋｂのＥＣ０ＲＩフラグメントの両
方をクローニングした。
７．４ｋｂフラグメントは制限マツピングおよび１７−
１Ａ重鎖ｃ Ｄ Ｎ Ａ ’、ｒニブロープとして使用
するサザン分析により、機能的に再配列されたＶ、Ｈ遺
伝子を含むことが判明した。
１Ａ重鎖ｃ Ｄ Ｎ Ａ ’、ｒニブロープとして使用
するサザン分析により、機能的に再配列されたＶ、Ｈ遺
伝子を含むことが判明した。
Ｖｋ遺伝子はゲノムクローンλに４かう４ ｋｂのＨｉ
ｎｄ菖フラグメント中に単離し、そして発現ベクターｐ
ＡｃＹｃｓＶｎｅｏ中のヒトＣｋ配列に結合させた。Ｋ
遺伝子の転写方向はｎｅｏ遺伝子のそれと反対である。
ｎｄ菖フラグメント中に単離し、そして発現ベクターｐ
ＡｃＹｃｓＶｎｅｏ中のヒトＣｋ配列に結合させた。Ｋ
遺伝子の転写方向はｎｅｏ遺伝子のそれと反対である。
ｖＨ遺伝子を含む７．４ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント
は、発現ベクターｐｓＶ２ｇｐｔ中のヒ） Ｃｒ３遺伝
子に、転写方向がＥｃｏｇｐｔと反対になるように結合
させた。ｐＡＣＹＣ８Ｖｎｅｏ７’ラスミドはクロラム
フェニコール耐性を与え、またＰＳＶ２ｇｐｔプラスミ
ドはアンピシリン耐性を与えるので、両方のプラスミド
で大腸菌を形質転換して二重の薬剤耐性表現型を発現す
る細胞を選択することが可能である。Ｉｇ遺伝子をミエ
ローマ細胞中に移すために、両プラスミドをもつ大腸菌
はプロトプラストに変換し、そして非産生性マウスミエ
ローマ細胞株５ｐ２１０と融合させた。プロトプラスト
融合の後、トランスフェクションされた細胞はＧ４１８
で処理することによりｎｅｏ遺伝子について選択した。
は、発現ベクターｐｓＶ２ｇｐｔ中のヒ） Ｃｒ３遺伝
子に、転写方向がＥｃｏｇｐｔと反対になるように結合
させた。ｐＡＣＹＣ８Ｖｎｅｏ７’ラスミドはクロラム
フェニコール耐性を与え、またＰＳＶ２ｇｐｔプラスミ
ドはアンピシリン耐性を与えるので、両方のプラスミド
で大腸菌を形質転換して二重の薬剤耐性表現型を発現す
る細胞を選択することが可能である。Ｉｇ遺伝子をミエ
ローマ細胞中に移すために、両プラスミドをもつ大腸菌
はプロトプラストに変換し、そして非産生性マウスミエ
ローマ細胞株５ｐ２１０と融合させた。プロトプラスト
融合の後、トランスフェクションされた細胞はＧ４１８
で処理することによりｎｅｏ遺伝子について選択した。
重鎖および軽鎖タンパク質合成を調べるために、トラン
スフェクションされた細胞を３５８−メチオニ／で標識
し、細胞質抽出物と分泌物の両方をセファロース結合ヤ
ギ抗ヒトに抗体で免疫沈降させた。
スフェクションされた細胞を３５８−メチオニ／で標識
し、細胞質抽出物と分泌物の両方をセファロース結合ヤ
ギ抗ヒトに抗体で免疫沈降させた。
沈殿物質は非還元条件下でリン酸緩衝液を含むＳＤＳ／
ポリアクリルアミドゲル上で分析した。
ポリアクリルアミドゲル上で分析した。
４Ｘ１０６細胞から、７個の安定した形質転換体が確立
され、分析された。これらのクローンのうち２１［１！
ｉｆは重鎖タンパク質と軽鎖タンパク質の両方を産生じ
、２個は軽鎖タンパク質のみを産生じ、そして３個は検
出可能な量のＩｇタンパク質な産生じなかった。重鎖お
よび軽鎖の両タンパク質を産生ずる２つの形質転換体の
１つ、クローン５Ｇ３１５はＨ２Ｌ２、Ｈ２Ｌおよび）
（Ｌ分子の混合物を産生じた。培地中に分泌された主な
成分はテトラマー分子Ｈ２Ｌ２であった。キメラＨ２Ｌ
２免疫グロブリンはネズミ１７−１Ａ抗体と同じ抗原結
合性を示した。
され、分析された。これらのクローンのうち２１［１！
ｉｆは重鎖タンパク質と軽鎖タンパク質の両方を産生じ
、２個は軽鎖タンパク質のみを産生じ、そして３個は検
出可能な量のＩｇタンパク質な産生じなかった。重鎖お
よび軽鎖の両タンパク質を産生ずる２つの形質転換体の
１つ、クローン５Ｇ３１５はＨ２Ｌ２、Ｈ２Ｌおよび）
（Ｌ分子の混合物を産生じた。培地中に分泌された主な
成分はテトラマー分子Ｈ２Ｌ２であった。キメラＨ２Ｌ
２免疫グロブリンはネズミ１７−１Ａ抗体と同じ抗原結
合性を示した。
癌−関連抗原に特異的なキメラ焔肉類／ヒト抗体は癌の
治療または診断忙使用される。治療のために、この抗体
は多くの異なる方法で使用することができる。ある種の
抗体は単独で腫瘍細胞に特異的に結合して、その細胞を
殺すことが可能である。この種の抗体の可変部をもつキ
メラ抗体は、腫瘍を治療するためて抗腫瘍量で患者に投
与される。例えば、キメラネダミ／ヒト１フーＬＡ抗体
は１７−１Ａ抗原と関連した胃腸の腫瘍をもつ患者に投
与される。
治療または診断忙使用される。治療のために、この抗体
は多くの異なる方法で使用することができる。ある種の
抗体は単独で腫瘍細胞に特異的に結合して、その細胞を
殺すことが可能である。この種の抗体の可変部をもつキ
メラ抗体は、腫瘍を治療するためて抗腫瘍量で患者に投
与される。例えば、キメラネダミ／ヒト１フーＬＡ抗体
は１７−１Ａ抗原と関連した胃腸の腫瘍をもつ患者に投
与される。
癌細胞は異成分から成り、その結果単一特異性キメラ抗
体はＩＩＩ！瘍の全細胞を認識することができないかも
しれない。従って、異なる抗原特異性のいくつかのキメ
ラ抗体を組合せて投与することが望ましい。
体はＩＩＩ！瘍の全細胞を認識することができないかも
しれない。従って、異なる抗原特異性のいくつかのキメ
ラ抗体を組合せて投与することが望ましい。
キメラ抗体は他の抗腫瘍剤と共に使用することができる
。この目的のために、キメラネスミ／ヒト抗体はある種
の治療薬剤または細胞障害性薬剤に、あるいはこの種の
タンパク質の機能的ドメインに結合される。この場合に
は、免疫グロブリンは癌細胞を特異的に標的とする投与
媒体（運搬体）として作用するであろう。このような結
合は治療薬剤を抗体に化学的に結合させることにより達
成し得る。治療薬剤がタンパク質系の物質である場合、
その結合は薬剤コード化ＤＮＡ配列を抗体類（好ましく
は重鎖）コード化キメラ遺伝子に結合させることにより
達成でき、その結果抗体類および薬剤が単一の連続タン
パク質（薬剤がペプチド結合によって免疫グロブリンに
結合されたもの）として発現される。この方法では、免
疫グロブリン部分と非免疫グロブリン部分を含むキメラ
免疫グロブリンが形成され、その場合非免疫グロブリン
部分はインターフェロンのような所定の治療薬剤、また
は腫瘍壊死因子のような所定の細胞障害性薬剤でありう
る。
。この目的のために、キメラネスミ／ヒト抗体はある種
の治療薬剤または細胞障害性薬剤に、あるいはこの種の
タンパク質の機能的ドメインに結合される。この場合に
は、免疫グロブリンは癌細胞を特異的に標的とする投与
媒体（運搬体）として作用するであろう。このような結
合は治療薬剤を抗体に化学的に結合させることにより達
成し得る。治療薬剤がタンパク質系の物質である場合、
その結合は薬剤コード化ＤＮＡ配列を抗体類（好ましく
は重鎖）コード化キメラ遺伝子に結合させることにより
達成でき、その結果抗体類および薬剤が単一の連続タン
パク質（薬剤がペプチド結合によって免疫グロブリンに
結合されたもの）として発現される。この方法では、免
疫グロブリン部分と非免疫グロブリン部分を含むキメラ
免疫グロブリンが形成され、その場合非免疫グロブリン
部分はインターフェロンのような所定の治療薬剤、また
は腫瘍壊死因子のような所定の細胞障害性薬剤でありう
る。
キメラ抗体はまたイムノシンチグラフィーのようなｉｎ
ｖｉｖｏ診断法において有用である。この目的のため
に、一般に抗体フラグメントが好適である。従って、キ
メラ重鎖遺伝子は）１・■区画像形成用のキメラＦａｂ
１ 免疫グロブリン分子またはキメラＦ（ａｂ’）ｚ様
分子を作るために、切断された形体でデザインされる。
ｖｉｖｏ診断法において有用である。この目的のため
に、一般に抗体フラグメントが好適である。従って、キ
メラ重鎖遺伝子は）１・■区画像形成用のキメラＦａｂ
１ 免疫グロブリン分子またはキメラＦ（ａｂ’）ｚ様
分子を作るために、切断された形体でデザインされる。
これらの分子はｊ：、Ｑ陽画像形成用の放射線イムノシ
ンチグラフィー剤を作るべく、 １３１ ヨウ素、１
２５ヨウ素、９９ｍテクネチウムまたは１１１インジウ
ムのようなラジオアイソトーブを用いて直接または結合
キレート剤を介して標識される。別法として、放射性金
属結合（キレート化）ドメインが部位標識泪のキメラ抗
体に遺伝子工学的に導入される。従って、キメラ抗体は
ネズミ可変部、ヒト不変部（好ましくは切断されたもの
）、およびメタロチオネインのような金属結合性タンパ
ク質から誘導される金属結合ドメインをもつ連続タンパ
ク質としてデザインされる。
ンチグラフィー剤を作るべく、 １３１ ヨウ素、１
２５ヨウ素、９９ｍテクネチウムまたは１１１インジウ
ムのようなラジオアイソトーブを用いて直接または結合
キレート剤を介して標識される。別法として、放射性金
属結合（キレート化）ドメインが部位標識泪のキメラ抗
体に遺伝子工学的に導入される。従って、キメラ抗体は
ネズミ可変部、ヒト不変部（好ましくは切断されたもの
）、およびメタロチオネインのような金属結合性タンパ
ク質から誘導される金属結合ドメインをもつ連続タンパ
ク質としてデザインされる。
本発明はさらに１７−１Ａ誘導可変部およびヒト不変部
をもつキメラ抗体の製造を示す下記の実施例てより詳し
く説明されるであろう。
をもつキメラ抗体の製造を示す下記の実施例てより詳し
く説明されるであろう。
実施例
細胞質ＲＮＡを１７−１Ａ細胞から抽出し、ポＩＪ Ａ
＋ＲＮＡ をオリゴｄＴセルロースクロマトグラフィ
によって調製した。ＡＭＶ逆転写酵素と大て、鋳型とし
てのポＩＪＡ＋ＲＮＡによって、二本鎖ｃＤＮＡを合成
した。二本鎖ｃＤＮＡをＳＩヌクレアーゼによって処理
し、デオキシシチジン残基によって延長し、ＰＳｔＩ
によって予め切断したｄＧ末端ｐＵＣ８によってアニー
リングした。
＋ＲＮＡ をオリゴｄＴセルロースクロマトグラフィ
によって調製した。ＡＭＶ逆転写酵素と大て、鋳型とし
てのポＩＪＡ＋ＲＮＡによって、二本鎖ｃＤＮＡを合成
した。二本鎖ｃＤＮＡをＳＩヌクレアーゼによって処理
し、デオキシシチジン残基によって延長し、ＰＳｔＩ
によって予め切断したｄＧ末端ｐＵＣ８によってアニー
リングした。
ピー・ジエイ・カーチス（Ｐ、Ｊ、 Ｃｕｒｔｉｓ ）
組換え体プラスミドを大腸菌ＤＨＩに形質転換し、ティ
１１ ？ ＝ ７テイ、ｘ、 （Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ
）等（１９８２年）が述べている一般方法〔モレキュ
ラークローニンク、ラボラトリ−マニュアル（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ ） ：］によって、コロニーを調べ
た。
組換え体プラスミドを大腸菌ＤＨＩに形質転換し、ティ
１１ ？ ＝ ７テイ、ｘ、 （Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ
）等（１９８２年）が述べている一般方法〔モレキュ
ラークローニンク、ラボラトリ−マニュアル（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ ） ：］によって、コロニーを調べ
た。
ゲノムライブラリーをラムダファージベクターＥＭＢ
Ｌ ａ Ａ中に造成した。高分子量ＤＮＡな制限エンド
ヌクレアーゼ５ａｕ３Ａによって部分的に消化させ、１
０〜４０チシヨ糖密度勾配法によってサイズ分画した。
Ｌ ａ Ａ中に造成した。高分子量ＤＮＡな制限エンド
ヌクレアーゼ５ａｕ３Ａによって部分的に消化させ、１
０〜４０チシヨ糖密度勾配法によってサイズ分画した。
１８〜２３ｋｂのＤＮＡフラグメントにＥＭＢＬ３Ａラ
ムダアームを連結し、ホーンとムライ（Ｈｏｈｎ ａｎ
ｄ Ｍｕｒｒａｙ ）の方法ＵＳＡ）７４巻、３２５９
頁〕に従ってパッケージした。ゲノムライブラリーを直
径１５０朋ぺｒり皿につき組換え体プラーク１０，００
０個の密度で分類した。プラークハイブリット化は６５
℃において５ＸＳＳＣで１８時間実施した。最終洗浄は
６５℃において１．０ Ｘまたは０．５ＸＳＳＣ中で実
施した。
ムダアームを連結し、ホーンとムライ（Ｈｏｈｎ ａｎ
ｄ Ｍｕｒｒａｙ ）の方法ＵＳＡ）７４巻、３２５９
頁〕に従ってパッケージした。ゲノムライブラリーを直
径１５０朋ぺｒり皿につき組換え体プラーク１０，００
０個の密度で分類した。プラークハイブリット化は６５
℃において５ＸＳＳＣで１８時間実施した。最終洗浄は
６５℃において１．０ Ｘまたは０．５ＸＳＳＣ中で実
施した。
高分子量ゲノムＤＮＡを制限ヌクレアーゼによって完了
するまで消化させ、０．８％寒天ゲル上で分画した。適
当なサイズのＤＮＡフラグメントな単離し、ラムダファ
ージアームと連結した。連結したＤＮＡをパンケージし
、組換え体プラークな上述のように分類した。
するまで消化させ、０．８％寒天ゲル上で分画した。適
当なサイズのＤＮＡフラグメントな単離し、ラムダファ
ージアームと連結した。連結したＤＮＡをパンケージし
、組換え体プラークな上述のように分類した。
ＤＮＡ分析
ゲノムＤＮＡを制限ヌクレアーゼによって消化させ、０
．７チ寒天ゲルを通しての電気泳動によって分画し、ニ
トロセルロースにスポットさせた。
．７チ寒天ゲルを通しての電気泳動によって分画し、ニ
トロセルロースにスポットさせた。
マニアテイス等の上述文献参照。ハイブリッド化は３７
℃の５ＸＳＳＣと５０多ホルムアルデヒド中において４
８時間実施した。最終洗浄は６５℃の０．５ＸＳＳＣに
おいて実施した。
℃の５ＸＳＳＣと５０多ホルムアルデヒド中において４
８時間実施した。最終洗浄は６５℃の０．５ＸＳＳＣに
おいて実施した。
マウスγ２ａプローブはｒ２ａ不変部遺伝子を含む４．
９ｋｂ ＥＣｏＲＩ ＤＮＡである。マウスＣｋプロー
ブはマウスＫＬ鎖不変部配列を含む６ｋｂ Ｂｇｌ Ｍ
ゲノムＤＮＡである。マウスＨ鎖Ｊ（ＪＨ） プロー
ブはＪ３とＪ４セグメントの両方を含む２ ｋｂ Ｂａ
ｍ ＨＩ／Ｅｃｏ ＲＩ ７ラグメントである。３２ｐ
標識プローブはウシ胸腺プライマーを用いて調製した
。ジエイ・サマース（Ｊ。
９ｋｂ ＥＣｏＲＩ ＤＮＡである。マウスＣｋプロー
ブはマウスＫＬ鎖不変部配列を含む６ｋｂ Ｂｇｌ Ｍ
ゲノムＤＮＡである。マウスＨ鎖Ｊ（ＪＨ） プロー
ブはＪ３とＪ４セグメントの両方を含む２ ｋｂ Ｂａ
ｍ ＨＩ／Ｅｃｏ ＲＩ ７ラグメントである。３２ｐ
標識プローブはウシ胸腺プライマーを用いて調製した
。ジエイ・サマース（Ｊ。
３ｕｍｍｅｒｓ ） （１９７５年）ジエイ・バイロル
（Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、） １５巻、９４６頁参照。遊離
ヌクレオチドは５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ −７５ミニカラ
ムを通しての遠心分離によって除去した。
（Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、） １５巻、９４６頁参照。遊離
ヌクレオチドは５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ −７５ミニカラ
ムを通しての遠心分離によって除去した。
キメラＬ鎖およびＨ鎖遺伝子を含むプラスミドによって
融導されたｐｓＶＩ８４ｎｅｏ およびｐｓＶ２ｇｐ
ｔの造成を下記に述べる。両プラスミドを含む大腸菌Ｈ
ＢＩＯＩをアンピシリンとクロラムフェニコールの存在
下で増殖させた。プラスミド複製数を１００μｇ／−１
のスペクチノマイシンによって増巾した。プロトプラス
トを調製し、マウス骨髄１連に融合した。１５％ウシ胎
仔血清を補充した、抗生物質Ｇ ４１８０．８ｍｌ／−
を含むダルベツコの改良イーグル培地中で形質転換体を
選択した。上記培地にキサンチン５０μ９ ／ ｍｌ、
／・イボキサンチア４μｇ／−およびミコフェノール酸
Ｏ，Ｓμｇ／−を加え、この中に５Ｇ３１５細胞ライン
を維持した。
融導されたｐｓＶＩ８４ｎｅｏ およびｐｓＶ２ｇｐ
ｔの造成を下記に述べる。両プラスミドを含む大腸菌Ｈ
ＢＩＯＩをアンピシリンとクロラムフェニコールの存在
下で増殖させた。プラスミド複製数を１００μｇ／−１
のスペクチノマイシンによって増巾した。プロトプラス
トを調製し、マウス骨髄１連に融合した。１５％ウシ胎
仔血清を補充した、抗生物質Ｇ ４１８０．８ｍｌ／−
を含むダルベツコの改良イーグル培地中で形質転換体を
選択した。上記培地にキサンチン５０μ９ ／ ｍｌ、
／・イボキサンチア４μｇ／−およびミコフェノール酸
Ｏ，Ｓμｇ／−を加え、この中に５Ｇ３１５細胞ライン
を維持した。
３５Ｓ−メチオニン ２５μＣｉ／ｉ を含む、メチ
オニンを含まないＲＰＭＩ１６４０培地中で細胞を培地
量標識した。アフイニテイ精製したヤギ抗ヒ）ＫＬ鎖抗
体〔サザン バイオテクノロジーアソシエイテソド（５
ｏｕｔｈｅｒｎ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｓｓｏ
ｃｉａｔｅｄ ）社、アラバマ州バーミンガム〕とヤギ
抗ヒトＩｇＧＦＣ抗体〔ジャクソン イムノリサーチ
ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎ−ｏｒ
ｅｓｅａｒｃｈ １ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社、ペン
シルバニア州、アバンダーレ〕を免疫沈降に用いた。
オニンを含まないＲＰＭＩ１６４０培地中で細胞を培地
量標識した。アフイニテイ精製したヤギ抗ヒ）ＫＬ鎖抗
体〔サザン バイオテクノロジーアソシエイテソド（５
ｏｕｔｈｅｒｎ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｓｓｏ
ｃｉａｔｅｄ ）社、アラバマ州バーミンガム〕とヤギ
抗ヒトＩｇＧＦＣ抗体〔ジャクソン イムノリサーチ
ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎ−ｏｒ
ｅｓｅａｒｃｈ １ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社、ペン
シルバニア州、アバンダーレ〕を免疫沈降に用いた。
ニス・エル・モリンｙ （Ｓ、Ｌ、 Ｍｏｒｒｉｓｏｎ
）１２３巻、７９３頁参照。細胞質抗体と分泌抗体の
両方を非還元性条件下においてリン酸緩衝液中の５％Ｓ
ＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上で分析した。エル・マ
ツウチ（Ｌ、 Ｍａｔｓｕｕｃｈｉ ）等（１９８１年
）バイオケム（１３ｉｏｃｈｅｍ ） ２０巻４８２７
頁参照。ゲルを３ｍｍＦ紙上で乾燥させる前に、オート
ラジオグラフィエンハンサ−のＥＮ３ＨＡＮＣＥ（ネン
プロダクツ（ＮＥＮ Ｐｒｏ−ｄｕｃｔｓ ） 、マサ
チュセツツ州、ボストン〕によって処理した。
）１２３巻、７９３頁参照。細胞質抗体と分泌抗体の
両方を非還元性条件下においてリン酸緩衝液中の５％Ｓ
ＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上で分析した。エル・マ
ツウチ（Ｌ、 Ｍａｔｓｕｕｃｈｉ ）等（１９８１年
）バイオケム（１３ｉｏｃｈｅｍ ） ２０巻４８２７
頁参照。ゲルを３ｍｍＦ紙上で乾燥させる前に、オート
ラジオグラフィエンハンサ−のＥＮ３ＨＡＮＣＥ（ネン
プロダクツ（ＮＥＮ Ｐｒｏ−ｄｕｃｔｓ ） 、マサ
チュセツツ州、ボストン〕によって処理した。
抗体産生の量的表現
組織培養上清を粒子濃度螢光イムノアッセイによって精
製ＩｇＧからの標準曲線を用いて、ｒｇＧ蛋白質含量に
関して分析した〔エム・イー・ジョリー（Ｍ、Ｅ、 Ｊ
ｏｌｌｅｙ ）等、（１９８４年）ジエイΦイムノ／Ｌ
／ ａメト（Ｊ、 ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ ）６７
巻、２１頁〕。ＭＡｂ１７−１Ａの濃度はヤギ抗マウス
Ｆａｂ抗体被覆ポリスチレンピーズとフルオレセイン結
合抗マウスＦａｂ抗体とを用いて測定した。ヒト不変部
を有するキメラ抗体はヤギ抗ヒトＩｇＧ ＦＣ抗体被覆
ポリスチレンビーズとフルオレセイン結合ヤギ抗ヒトＩ
ｇＧＦＣ抗体とを用いて測定した。この分析は自動機器
〔パンデツクス ラボラトリーズ（ｐａｎｄｅｘ Ｉ、
ａｂｏｒａｔ−□ｒｉｅｓ ）社、イリノイ州マンプラ
イン〕によって実施した。
製ＩｇＧからの標準曲線を用いて、ｒｇＧ蛋白質含量に
関して分析した〔エム・イー・ジョリー（Ｍ、Ｅ、 Ｊ
ｏｌｌｅｙ ）等、（１９８４年）ジエイΦイムノ／Ｌ
／ ａメト（Ｊ、 ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ ）６７
巻、２１頁〕。ＭＡｂ１７−１Ａの濃度はヤギ抗マウス
Ｆａｂ抗体被覆ポリスチレンピーズとフルオレセイン結
合抗マウスＦａｂ抗体とを用いて測定した。ヒト不変部
を有するキメラ抗体はヤギ抗ヒトＩｇＧ ＦＣ抗体被覆
ポリスチレンビーズとフルオレセイン結合ヤギ抗ヒトＩ
ｇＧＦＣ抗体とを用いて測定した。この分析は自動機器
〔パンデツクス ラボラトリーズ（ｐａｎｄｅｘ Ｉ、
ａｂｏｒａｔ−□ｒｉｅｓ ）社、イリノイ州マンプラ
イン〕によって実施した。
ＭＡｂ１７−１Ａを蛋白質Ａ−セファロース・クロマト
グラフィを用いて腹水液から精製した。
グラフィを用いて腹水液から精製した。
結合したＩｇＧをｐＨ３，５のクエン酸塩緩衝液によっ
て溶出した。精製したＭＡｂをｌｍＣ１Ｎａ１２５Ｉを
用いた１、４ｍＭコラミンＴによって標識した。３分後
に、反応は過剰なアスコルビン酸によって消光した。遊
離ヨウ化物は予め充填したＰＤ−１０カラム〔ファルマ
シア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））【よって除去した。比活
性は典型的に１０，０００ＣＰｍ／蛋白質ｎ９であった
。
て溶出した。精製したＭＡｂをｌｍＣ１Ｎａ１２５Ｉを
用いた１、４ｍＭコラミンＴによって標識した。３分後
に、反応は過剰なアスコルビン酸によって消光した。遊
離ヨウ化物は予め充填したＰＤ−１０カラム〔ファルマ
シア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））【よって除去した。比活
性は典型的に１０，０００ＣＰｍ／蛋白質ｎ９であった
。
結合阻害分析
組織培養上清をディアフロ（Ｄｉａｆ ｌｏ ） ＹＭ
１００限外濾過膜〔アミコン（Ａｍ１ｃｏｎ ）、マサ
チュセツツ州ダンバース〕によって濃縮した。単層の結
腸直腸癌細胞をトリプシン化し、リン酸緩衝液添加生理
的食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄した。
１００限外濾過膜〔アミコン（Ａｍ１ｃｏｎ ）、マサ
チュセツツ州ダンバース〕によって濃縮した。単層の結
腸直腸癌細胞をトリプシン化し、リン酸緩衝液添加生理
的食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄した。
細胞（５ｘ１０５）を放射性ヨウ素化１７−１Ａおよび
１００μｌの最終量中に競合抗体を含む培養上清と共に
インキュベートした。インキュベーションは１４０γｐ
ｍの振とう量中で室温において実施した。細胞をＰＢＳ
で洗浄し、細胞結合放射能なガンマカウンター中で計測
した。
１００μｌの最終量中に競合抗体を含む培養上清と共に
インキュベートした。インキュベーションは１４０γｐ
ｍの振とう量中で室温において実施した。細胞をＰＢＳ
で洗浄し、細胞結合放射能なガンマカウンター中で計測
した。
Ｂ結果
塩基配列決定
プラスミドベクターｐＵＣ８を用いて、１７−１λ細胞
のｃＤＮＡライブラリーを作製した。組換え体コロニー
をマウスＣｋプローブとマウスＣｒ２ａ プループとを
用いて調べ、Ｌ鎖りローンとＨ鎖りローンをそれぞれ単
離した。全体で７５００コロニーを調べ、その中の約２
５０がＣｋ配列を含み、１５０がＣγ２ａ配列を含んだ
。
のｃＤＮＡライブラリーを作製した。組換え体コロニー
をマウスＣｋプローブとマウスＣｒ２ａ プループとを
用いて調べ、Ｌ鎖りローンとＨ鎖りローンをそれぞれ単
離した。全体で７５００コロニーを調べ、その中の約２
５０がＣｋ配列を含み、１５０がＣγ２ａ配列を含んだ
。
これらの陽性コロニーの幾つかから調製したプラスミド
ＤＮＡ’、＜Ｐｓｔ Ｉ Ｋよって消化させて、ｃＤＮ
Ａ挿入体のサイズを比較した。ヌクレオチド塩基配列決
定のために、Ｌ鎖りローンｐＭＫ−９とＨ鎖りローンｐ
Ｍ １２ ａ −ｔ と？：選択した。リーダーペ
プチドを含む５′部位および可変部のヌクンオチド塩基
配列ならびに予想されるアミノ酸配列をｐＫＭ−９に関
しては第１Ａ図ＫｐＭｒ２Ｂ−１に関しては第１Ｂ図に
示す。（アミノ酸残基に番号を付け、負数はリーダーペ
プチド中のアミノ酸を意味する）。可変部特異性（Ｖｔ
、） プローブをｐＭＫ−９から、Ｌ鎖遺伝子の最初
の３２０ヌクレオチドを含むＢａｍＨＩ／Ｐｖｕ Ｉ
フラグメントとして得る（第１Ａ図）。Ｈ鎖可変部プル
ープは２個のＰｓｔＩフラグメント、すなわちヌクレオ
チド５２〜２８０および２８１〜４１２にそれぞれ対応
する２２８ ｂｐＶ、ＩＩおよび１３２ｂｐＶｏ２プロ
ーブを含有した（第１Ｂ図）。これらの可変部プローブ
を次の実験に用いて、機能的に再編成した遺伝子を含む
ゲノムＤＮＡフラグメントを特性化した。
ＤＮＡ’、＜Ｐｓｔ Ｉ Ｋよって消化させて、ｃＤＮ
Ａ挿入体のサイズを比較した。ヌクレオチド塩基配列決
定のために、Ｌ鎖りローンｐＭＫ−９とＨ鎖りローンｐ
Ｍ １２ ａ −ｔ と？：選択した。リーダーペ
プチドを含む５′部位および可変部のヌクンオチド塩基
配列ならびに予想されるアミノ酸配列をｐＫＭ−９に関
しては第１Ａ図ＫｐＭｒ２Ｂ−１に関しては第１Ｂ図に
示す。（アミノ酸残基に番号を付け、負数はリーダーペ
プチド中のアミノ酸を意味する）。可変部特異性（Ｖｔ
、） プローブをｐＭＫ−９から、Ｌ鎖遺伝子の最初
の３２０ヌクレオチドを含むＢａｍＨＩ／Ｐｖｕ Ｉ
フラグメントとして得る（第１Ａ図）。Ｈ鎖可変部プル
ープは２個のＰｓｔＩフラグメント、すなわちヌクレオ
チド５２〜２８０および２８１〜４１２にそれぞれ対応
する２２８ ｂｐＶ、ＩＩおよび１３２ｂｐＶｏ２プロ
ーブを含有した（第１Ｂ図）。これらの可変部プローブ
を次の実験に用いて、機能的に再編成した遺伝子を含む
ゲノムＤＮＡフラグメントを特性化した。
ニング
１７−１Ａ細胞のゲノムＤＮＡライブラリーを調製した
。約２００，０００ラムダ・ファージをマウスＣｋプロ
ーブによって検査した。３個の陽性クローンを得た。ク
ローンの１つであるλに４は制限酵素マツピングとｃ
Ｄ Ｎ Ａクローン、ｐＫＭ−９からのｖＬプローブを
用いるサザン分析法とによって、可変部配列を含むこと
が判定した。
。約２００，０００ラムダ・ファージをマウスＣｋプロ
ーブによって検査した。３個の陽性クローンを得た。ク
ローンの１つであるλに４は制限酵素マツピングとｃ
Ｄ Ｎ Ａクローン、ｐＫＭ−９からのｖＬプローブを
用いるサザン分析法とによって、可変部配列を含むこと
が判定した。
５′フランキング部の１．５Ｋｂおよびリーダーペプチ
ドとＶ遺伝子とをコード化する配列を含む４．２ ｋｂ
Ｈｉｎｄ １１１ ゲノムＤＮＡフラグメント１ｐｕ
ｃ１Ｂにサブクローン化し、ｐＶｋ４．２Ｈと名づけだ
。このサブクローンは次のマウス／ヒトキメラム鎖遺伝
子造成に用いた。
ドとＶ遺伝子とをコード化する配列を含む４．２ ｋｂ
Ｈｉｎｄ １１１ ゲノムＤＮＡフラグメント１ｐｕ
ｃ１Ｂにサブクローン化し、ｐＶｋ４．２Ｈと名づけだ
。このサブクローンは次のマウス／ヒトキメラム鎖遺伝
子造成に用いた。
１７−１ＡゲノムライブラリーをマウスＣγ２ａプロー
ブによって調べた場合に、２個の陽性クローンが得られ
たが、これらのいずれもｃＤＮＡクローンｐＭｒ２ａ−
１のＨ鎖可変（Ｖｏ）遺伝子を含んでいなかった。ＶＯ
遺伝子のクローン化にはこれに代るアプローチを用いた
。Ｉｇ遺伝子表現に必要な遺伝子再編成中に、■遺伝子
は常に適当なＪセグメントを伴う。そのため、ＤＮＡプ
ローブＪＨを用いて再編成ＶＨ遺伝子を検出することが
できる。第２図はＪＨ配列を含む再編成フラグメントの
サザン分析を示す。（ゲノムＤＮＡｌ０μｇをＥｃｏＲ
ｌ−によって消化させ、０．７ ％寒天上で分画し、ニ
トロセルロースに吸収させ、フィルターをマウス■鎖Ｊ
Ｈプローブによってハイブリッド化する。レーン１、マ
ウス肝臓ＤＮＡ；レーン２、Ｐ３、マウスプラズマ細胞
腫細胞ライン；レーン３．１７−１Ａ、融合パートナ−
としてＰ３を用いて誘導したハイプリドーマ細胞ライン
。
ブによって調べた場合に、２個の陽性クローンが得られ
たが、これらのいずれもｃＤＮＡクローンｐＭｒ２ａ−
１のＨ鎖可変（Ｖｏ）遺伝子を含んでいなかった。ＶＯ
遺伝子のクローン化にはこれに代るアプローチを用いた
。Ｉｇ遺伝子表現に必要な遺伝子再編成中に、■遺伝子
は常に適当なＪセグメントを伴う。そのため、ＤＮＡプ
ローブＪＨを用いて再編成ＶＨ遺伝子を検出することが
できる。第２図はＪＨ配列を含む再編成フラグメントの
サザン分析を示す。（ゲノムＤＮＡｌ０μｇをＥｃｏＲ
ｌ−によって消化させ、０．７ ％寒天上で分画し、ニ
トロセルロースに吸収させ、フィルターをマウス■鎖Ｊ
Ｈプローブによってハイブリッド化する。レーン１、マ
ウス肝臓ＤＮＡ；レーン２、Ｐ３、マウスプラズマ細胞
腫細胞ライン；レーン３．１７−１Ａ、融合パートナ−
としてＰ３を用いて誘導したハイプリドーマ細胞ライン
。
矢印ヘッドは１７−１Ａの機能的ｖｎ遺伝子を含む再編
成フラグメントを示す。黒丸印はＨ鎖遺伝子座の付加的
な再編成を示す。） １７−１Ａ細胞のＤＮＡは融合パートナ−Ｐ３の特徴的
なバンドの他に、７．４ｋｂと３．８ｋｂに２個の再編
成Ｅ（！ＯＲＩ フラグメントを示したＯＰ３細胞は
６ｋｂに共に移動した、２個の再編成Ｖ１１遺伝子を有
した。１７−１Ａの２バンドの中の１つは機能的再編成
を示したが、他のバンドはＨ鎖領域における異常型の遺
伝子再編成の産物でアル。マウスＪｎプローブを用いて
、両遺伝子を適当なサイズのエンリッチＤＮＡフラグメ
ントによって造成したファージゲノムライブラリーから
両遺伝子をクローン化した。クローンλＶ１１７．４Ｅ
をλｇｔＷＥｓ ライブラリーから単離すると、第２
図の矢印ヘッドで示すように、ＥＣ０ＲＩ インサー
トが７．４ ｋ ｂ再編成フラグメントとともに移動す
ることが判明した。クローンλＶｌ（３，８Ｅをλｇｔ
ｌｌ から単離すると、そのＥ（！ＯＲ１インサート
は第２図の黒丸印が示すように、３．８ｋｂバンドとと
もに移動した。
成フラグメントを示す。黒丸印はＨ鎖遺伝子座の付加的
な再編成を示す。） １７−１Ａ細胞のＤＮＡは融合パートナ−Ｐ３の特徴的
なバンドの他に、７．４ｋｂと３．８ｋｂに２個の再編
成Ｅ（！ＯＲＩ フラグメントを示したＯＰ３細胞は
６ｋｂに共に移動した、２個の再編成Ｖ１１遺伝子を有
した。１７−１Ａの２バンドの中の１つは機能的再編成
を示したが、他のバンドはＨ鎖領域における異常型の遺
伝子再編成の産物でアル。マウスＪｎプローブを用いて
、両遺伝子を適当なサイズのエンリッチＤＮＡフラグメ
ントによって造成したファージゲノムライブラリーから
両遺伝子をクローン化した。クローンλＶ１１７．４Ｅ
をλｇｔＷＥｓ ライブラリーから単離すると、第２
図の矢印ヘッドで示すように、ＥＣ０ＲＩ インサー
トが７．４ ｋ ｂ再編成フラグメントとともに移動す
ることが判明した。クローンλＶｌ（３，８Ｅをλｇｔ
ｌｌ から単離すると、そのＥ（！ＯＲ１インサート
は第２図の黒丸印が示すように、３．８ｋｂバンドとと
もに移動した。
機能的Ｈ鎖遺伝子のゲノムカウンターパートな確認すル
？、：、１６ Ｋ、Ｊ Ｖ）、 ７．４ ＥとλＶ１．
３．８Ｅの両方をＰｓｔ ＩＫよって消化させ、ｅＤＮ
Ａクローン、ｐＭγ２ａ−１から誘導したＶｌｉｌとＶ
１１２の混合プローブによってハイブリッド化した。λ
ＶＨ７，４Ｅは３００ ｂｐと１３０ｂｐに２個のｐｓ
ｔ １フラグメントを含有した。ＶｏＩプローブはリー
ダーペプチド内のイントロン／エクソン境界のすぐ上方
にあるアミノ酸残基−５をコード化する配列を含むので
、ゲノムクローンの長いＰｓｔ Ｉ フラグメント（２
００ｂｐ）とｅＤＮＡクローンのＰＳｔＩ フラグメン
ト（２２８ｂｐ）との間の差は、リーダーペプチドと可
変部遺伝子との間のイントロンサイズが７０ｂｐである
ことを示唆した。
？、：、１６ Ｋ、Ｊ Ｖ）、 ７．４ ＥとλＶ１．
３．８Ｅの両方をＰｓｔ ＩＫよって消化させ、ｅＤＮ
Ａクローン、ｐＭγ２ａ−１から誘導したＶｌｉｌとＶ
１１２の混合プローブによってハイブリッド化した。λ
ＶＨ７，４Ｅは３００ ｂｐと１３０ｂｐに２個のｐｓ
ｔ １フラグメントを含有した。ＶｏＩプローブはリー
ダーペプチド内のイントロン／エクソン境界のすぐ上方
にあるアミノ酸残基−５をコード化する配列を含むので
、ゲノムクローンの長いＰｓｔ Ｉ フラグメント（２
００ｂｐ）とｅＤＮＡクローンのＰＳｔＩ フラグメン
ト（２２８ｂｐ）との間の差は、リーダーペプチドと可
変部遺伝子との間のイントロンサイズが７０ｂｐである
ことを示唆した。
クローンλＶ１１３．８Ｅは種々の長さのＰｓｔ １
フラグメントを含み、ＶＩ＋１およびＶ１１２グローブ
によって交差ハイブリッド化しなかった。λＶｌ＋７．
４ＥがＣＤＮＡクローンｐＭｒ２ａ−ｔ のゲノムカウ
ンターパートであることをさらに立証するために、ヌク
レオチド３５２〜３７５に対応する２＝４＠ｍｅｒ
オリゴヌクレオチドプローブ（第１Ｂ図）を合成し、こ
れが特異的にハイブリッド化してλＶｕ７．４Ｅの１３
０ｂｐ ＰｓｔＩ ７ラグメントになることを発見した
（データ示さず）。このオリゴマーはＣＤＲ３部位をコ
ード化した配列を含み、このＶ遺伝子に特徴的である。
フラグメントを含み、ＶＩ＋１およびＶ１１２グローブ
によって交差ハイブリッド化しなかった。λＶｌ＋７．
４ＥがＣＤＮＡクローンｐＭｒ２ａ−ｔ のゲノムカウ
ンターパートであることをさらに立証するために、ヌク
レオチド３５２〜３７５に対応する２＝４＠ｍｅｒ
オリゴヌクレオチドプローブ（第１Ｂ図）を合成し、こ
れが特異的にハイブリッド化してλＶｕ７．４Ｅの１３
０ｂｐ ＰｓｔＩ ７ラグメントになることを発見した
（データ示さず）。このオリゴマーはＣＤＲ３部位をコ
ード化した配列を含み、このＶ遺伝子に特徴的である。
マウス／ヒトキメラＨ鎖遺伝子の造成にλＶＨ７，４Ｅ
を用いた。
を用いた。
１７−１Ａ細胞からクローン化したし鎖およびＨ鎖■遺
伝子を発現ベクターｐｓｖ １８４ Ｈｎｅ。
伝子を発現ベクターｐｓｖ １８４ Ｈｎｅ。
〔エイ・シー・ワイ・チャンク（Ａ、Ｃ，Ｙ、Ｃｈａｎ
ｇ）とニス・エヌ・コーン（Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｎ ）によ
るジエイ瞭バクチリオル＠ （Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、 ）（１９７８）１４３巻、１１４１頁〕およびｐＳ
Ｖ２ Ｈｇｐｔ［アール・シー・ムリガン（Ｒ，Ｃ。
ｇ）とニス・エヌ・コーン（Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｎ ）によ
るジエイ瞭バクチリオル＠ （Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、 ）（１９７８）１４３巻、１１４１頁〕およびｐＳ
Ｖ２ Ｈｇｐｔ［アール・シー・ムリガン（Ｒ，Ｃ。
Ｍｕｌｌｉｇａｎ）とビー・ペルグ（Ｐ、 Ｂｅｒｇ
）による（１９８１）７８巻、２０７２頁〕のヒトにお
よびγ３不変部遺伝子にそれぞれ結合させた。
）による（１９８１）７８巻、２０７２頁〕のヒトにお
よびγ３不変部遺伝子にそれぞれ結合させた。
にクローン化したダンシル特異性り鎖遺伝子とヒト不変
部に遺伝子を有したｐＳＶ１８４△ＨｎｅＯＰＮＳＶＬ
−ｈＣｋビラスミドを用いた。好ましいキメラ遺伝子を
造成するために、ダンシルｖＬ遺伝子を含有するｐｓｖ
１８４△ＨｎｅｏＤＮＳｖＬ−ｈＣｋのＨｉｎｄｌｌ
ｌフラグメントをクローンｐＶｋ４．２Ｈから誘導した
１７−１Ａの機能的に再編成したゲノムＬ鎖遺伝子を含
む４．２ｋｂＨｉｎｄＩｌｌ フラグメントによって置
換した。Ｈ鎖ベクターに関しては、ダンシル特異性ＶＨ
遺伝子を含むｐＳＶ２ΔＨｇｐｔＤＮＳＶＨｈＣ１３プ
ラスミドのＥＣ０ＲＩ フラグメントを、ゲノムクロ
ーンλＶ１４７．４Ｅから誘導した機能的に再編成した
１７−１ＡＨ鎖遺伝子を含む７．４ｋｂ ＥｃｏＲ１フ
ラグメントによって置換した。生成したプラスミド′？
：ｐＳＶ２△Ｈｇｐｔ ｌ ７１ ＡＶｕ−ｈＣγ３と
名づける。ｐｓＶ １８４ ΔＨｎｅｏ １７− Ｉ
Ａ Ｖｋ −ｈｃγ３の構造を第３Ａ図に示し、ｐＳＶ
２Δｕｇｐｔ１７−１ＡＶｕ−ｈ（４３の構造は第３Ｂ
図に示す。
部に遺伝子を有したｐＳＶ１８４△ＨｎｅＯＰＮＳＶＬ
−ｈＣｋビラスミドを用いた。好ましいキメラ遺伝子を
造成するために、ダンシルｖＬ遺伝子を含有するｐｓｖ
１８４△ＨｎｅｏＤＮＳｖＬ−ｈＣｋのＨｉｎｄｌｌ
ｌフラグメントをクローンｐＶｋ４．２Ｈから誘導した
１７−１Ａの機能的に再編成したゲノムＬ鎖遺伝子を含
む４．２ｋｂＨｉｎｄＩｌｌ フラグメントによって置
換した。Ｈ鎖ベクターに関しては、ダンシル特異性ＶＨ
遺伝子を含むｐＳＶ２ΔＨｇｐｔＤＮＳＶＨｈＣ１３プ
ラスミドのＥＣ０ＲＩ フラグメントを、ゲノムクロ
ーンλＶ１４７．４Ｅから誘導した機能的に再編成した
１７−１ＡＨ鎖遺伝子を含む７．４ｋｂ ＥｃｏＲ１フ
ラグメントによって置換した。生成したプラスミド′？
：ｐＳＶ２△Ｈｇｐｔ ｌ ７１ ＡＶｕ−ｈＣγ３と
名づける。ｐｓＶ １８４ ΔＨｎｅｏ １７− Ｉ
Ａ Ｖｋ −ｈｃγ３の構造を第３Ａ図に示し、ｐＳＶ
２Δｕｇｐｔ１７−１ＡＶｕ−ｈ（４３の構造は第３Ｂ
図に示す。
（免疫グロブリンＤＮＡは太線で表し、エクソンは黒い
方形によって表す。ベクター配列は細線で示す。ｎｅｏ
およびｇｐｔ遣云遺伝転写方向は図示する通りである。
方形によって表す。ベクター配列は細線で示す。ｎｅｏ
およびｇｐｔ遣云遺伝転写方向は図示する通りである。
Ｌ、リーダーペプチドｅＶ。
ＶＪｔたはＶＤＪエクソン；Ｃ１不変部エクンン；Ｈ，
ヒンジエクソン；■、２および３．Ｈ鎖遺伝子の他のド
メインをコード化するエクソン。制限エンドヌクレアー
ゼの略算： Ｅ、Ｅ ｃ ｏ Ｒ１； Ｂ ｒＢａｍＨ
Ｉ ； Ｈ＋Ｈｉｎｄ １１１ ）第３図に示すＬ鎖お
よびＨ鎖ベクターを用いてマウス骨髄呻細胞にトランス
フェクトした。
ヒンジエクソン；■、２および３．Ｈ鎖遺伝子の他のド
メインをコード化するエクソン。制限エンドヌクレアー
ゼの略算： Ｅ、Ｅ ｃ ｏ Ｒ１； Ｂ ｒＢａｍＨ
Ｉ ； Ｈ＋Ｈｉｎｄ １１１ ）第３図に示すＬ鎖お
よびＨ鎖ベクターを用いてマウス骨髄呻細胞にトランス
フェクトした。
ｐＡＣＹＣ１８＝１ プラスミドはクロラムフェニコ
ール耐性を与え、ｐＢＲプラスミドはアンピシリン耐性
を与える。従って、大腸菌をＬ鎖およびＨ鎖の両プラス
ミドによって形質転換し、持続的耐薬性表現型を表す細
胞を選択することが可能である。キメラ遺伝子なマウム
骨髄肝細胞にトランスフェクトするために１両プラスミ
ドを有する大腸菌をプロトプラストに変え、非生産的マ
ウス骨髄腫細胞ライン、ｓｐ ２１０Ｋ融合した。プロ
トプラスト融合後に、トランスフェクトされた細胞を最
初にＧ４１８存在下でｎｅｏ遺伝子活性に関してのみ選
択した。安定な形質転換細胞ラインを次に、Ｇ４１８と
ミコフェノール酸の両方を含む培地中に導入した。
ール耐性を与え、ｐＢＲプラスミドはアンピシリン耐性
を与える。従って、大腸菌をＬ鎖およびＨ鎖の両プラス
ミドによって形質転換し、持続的耐薬性表現型を表す細
胞を選択することが可能である。キメラ遺伝子なマウム
骨髄肝細胞にトランスフェクトするために１両プラスミ
ドを有する大腸菌をプロトプラストに変え、非生産的マ
ウス骨髄腫細胞ライン、ｓｐ ２１０Ｋ融合した。プロ
トプラスト融合後に、トランスフェクトされた細胞を最
初にＧ４１８存在下でｎｅｏ遺伝子活性に関してのみ選
択した。安定な形質転換細胞ラインを次に、Ｇ４１８と
ミコフェノール酸の両方を含む培地中に導入した。
Ｈ鎖およびＬ鎖蛋白質合成を調べるために、トランスフ
ェクトされた細胞’４ Ｓ−メチオニンによって３
時間標識し、その後に細胞質抽出物と分泌物の両方をセ
ファロース結合ヤギ抗ヒ）ｋ抗体だよって免疫沈降させ
た。沈降物を非還元性条件下でリン酸緩衝液を含む５係
ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上で分析した〔エル・
マツウチ等（１９８１年）、バイオダム２０巻、４８２
７頁〕４ｘｌＯ細胞から、７個の安定な形質転換体が確
認され、分析された。これらのクローンの中の２個はＨ
鎖およびＬ鎖の両蛋白質を産生じ、２個はＬ鎖蛋白質の
みを産生じ、３個は検出可能な量の免疫グロブリン蛋白
質を産生じなかった。第４図はＨ鎖とＬ鎖の両蛋白質を
産生する５Ｇ３１５細胞ラインの生合成的標識実験の結
果を示す。
ェクトされた細胞’４ Ｓ−メチオニンによって３
時間標識し、その後に細胞質抽出物と分泌物の両方をセ
ファロース結合ヤギ抗ヒ）ｋ抗体だよって免疫沈降させ
た。沈降物を非還元性条件下でリン酸緩衝液を含む５係
ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上で分析した〔エル・
マツウチ等（１９８１年）、バイオダム２０巻、４８２
７頁〕４ｘｌＯ細胞から、７個の安定な形質転換体が確
認され、分析された。これらのクローンの中の２個はＨ
鎖およびＬ鎖の両蛋白質を産生じ、２個はＬ鎖蛋白質の
みを産生じ、３個は検出可能な量の免疫グロブリン蛋白
質を産生じなかった。第４図はＨ鎖とＬ鎖の両蛋白質を
産生する５Ｇ３１５細胞ラインの生合成的標識実験の結
果を示す。
（Ｃ，細胞質；Ｓ２分泌、テトラマーＨ２Ｌ２蛋白質と
Ｌ鎖（Ｌ）蛋白質の位置を示唆する。）細胞抽出物中で
は、Ｈ鎖とＬ鎖分子の混合物が検出された。しかし、培
養培地中に分泌された主要成分はテトラマー分子、Ｈ２
Ｌ２であった。免疫沈降忙セファロース結合抗ヒトＩｇ
Ｇ ＦＣ抗体を用いた場合にも、同じような結果が得ら
れた。０４１８とミコフェノール酸の両方に対して耐性
を示すＳＧ３／７細胞はＬ鎖蛋白質のみを産生じて分泌
した。
Ｌ鎖（Ｌ）蛋白質の位置を示唆する。）細胞抽出物中で
は、Ｈ鎖とＬ鎖分子の混合物が検出された。しかし、培
養培地中に分泌された主要成分はテトラマー分子、Ｈ２
Ｌ２であった。免疫沈降忙セファロース結合抗ヒトＩｇ
Ｇ ＦＣ抗体を用いた場合にも、同じような結果が得ら
れた。０４１８とミコフェノール酸の両方に対して耐性
を示すＳＧ３／７細胞はＬ鎖蛋白質のみを産生じて分泌
した。
５Ｇ３１５細胞の抗体分泌レベルは２０μｇ／−＝１で
あることが、粒子濃度螢光イムノアッセイによって確認
された。培養上清を精製しないで、キメラＭＡｂ ＳＧ
３１５源として用いた。結合阻害分析を用いて、キメ
ラＭＡｂＳＧ３１５がＭ Ａ ｂ１７−１Ａと同じ、５
Ｗ１１１６結腸直腸癌細胞の表面抗原に結合することを
実証した。第５図に示すように、放射性ヨウ素化１７−
１Ａと５Ｇ３１５との結合曲線はスーパーインポーズ可
能であった。このことは、ＭＡｂ１７−１Ａと５Ｇ３１
５の異なる不変部がこれら２抗体の抗原結合性に殆んど
影響を与えないことを示している。
あることが、粒子濃度螢光イムノアッセイによって確認
された。培養上清を精製しないで、キメラＭＡｂ ＳＧ
３１５源として用いた。結合阻害分析を用いて、キメ
ラＭＡｂＳＧ３１５がＭ Ａ ｂ１７−１Ａと同じ、５
Ｗ１１１６結腸直腸癌細胞の表面抗原に結合することを
実証した。第５図に示すように、放射性ヨウ素化１７−
１Ａと５Ｇ３１５との結合曲線はスーパーインポーズ可
能であった。このことは、ＭＡｂ１７−１Ａと５Ｇ３１
５の異なる不変部がこれら２抗体の抗原結合性に殆んど
影響を与えないことを示している。
マウスＭＡｂ１７−１ＡからのＨ鎖可変部をコード化す
るＤＮＡセグメントをヒトγ１．γ２およびγ４不変部
に結合させた。生成するキメラＨ鎖遺伝子なキメラＬ鎖
遺伝子（第３Ｂ図）とともにＳ Ｐ ２１０細胞中にト
ランスフェクトして、（ｒｌ、ｋ）、（ｒ２．ｋ）およ
び（ｒ４．ｋ）抗体を分泌する安定な細胞ラインを得た
。これらのキメラ抗体の全てはネズミＭＡｂ１７−１Ａ
と同じ腫瘍抗原・結合特異性を有することが判明した。
るＤＮＡセグメントをヒトγ１．γ２およびγ４不変部
に結合させた。生成するキメラＨ鎖遺伝子なキメラＬ鎖
遺伝子（第３Ｂ図）とともにＳ Ｐ ２１０細胞中にト
ランスフェクトして、（ｒｌ、ｋ）、（ｒ２．ｋ）およ
び（ｒ４．ｋ）抗体を分泌する安定な細胞ラインを得た
。これらのキメラ抗体の全てはネズミＭＡｂ１７−１Ａ
と同じ腫瘍抗原・結合特異性を有することが判明した。
キメラμ造成（ｐｓＶ２ΔＨｇｐｔ １７−１Ａ−ＶＨ
−ｈＣμ）を第６図に示す。この遺伝子造成は、１７−
１ＡキメラＫＬ鎖遺伝子造成（第３Ａ図）とともに、非
生産的マウス骨髄腫Ｓ Ｐ ２１０細胞中にトランスフ
ェクトした。キメラＩｇ（μ、ｋ）抗体を産生ずる安定
な細胞ラインが樹立された。
−ｈＣμ）を第６図に示す。この遺伝子造成は、１７−
１ＡキメラＫＬ鎖遺伝子造成（第３Ａ図）とともに、非
生産的マウス骨髄腫Ｓ Ｐ ２１０細胞中にトランスフ
ェクトした。キメラＩｇ（μ、ｋ）抗体を産生ずる安定
な細胞ラインが樹立された。
分泌された抗体を抗ヒトＩｇＭアフイニテイカラムで精
製した。精製ＩｇＭはヒトペンタマーＩｇＭ対照と同じ
ようなＨＰ Ｌ Ｃプロフィルを有し、１ピーク下に９
９ｑ６の物質が含まれた。この精製キメラＩｇＭを用い
て、結合特異性と補体依存性細胞毒性とを調べた。
製した。精製ＩｇＭはヒトペンタマーＩｇＭ対照と同じ
ようなＨＰ Ｌ Ｃプロフィルを有し、１ピーク下に９
９ｑ６の物質が含まれた。この精製キメラＩｇＭを用い
て、結合特異性と補体依存性細胞毒性とを調べた。
的阻害
１２５Ｉ標識生１７−１Ａを種々な濃度の競合的非放射
性キメラ１７−１Ａ ＩｇＧ＋およびＩｇＭの存在下ま
たは不在下の４℃において、付着ＨＴ−２９結腸癌細胞
とともに２時間インキュベートした。細胞関連性放射能
を測定した。各競合免疫グロブリン製剤の阻害曲線をプ
ロットし、５０％阻害（Ｉｓｏ）を生ずる濃度を測定し
た。
性キメラ１７−１Ａ ＩｇＧ＋およびＩｇＭの存在下ま
たは不在下の４℃において、付着ＨＴ−２９結腸癌細胞
とともに２時間インキュベートした。細胞関連性放射能
を測定した。各競合免疫グロブリン製剤の阻害曲線をプ
ロットし、５０％阻害（Ｉｓｏ）を生ずる濃度を測定し
た。
第１表
１７−１Ａ ＩｇＧ、 ２．８
１７−１Ａ ＩｇＭ ４．５
ウサギ補体の連続希釈物とともにインキュベートした抗
体被覆ターゲット細胞の４５分間放射性標識放出分析に
よって、補体依存性細胞毒性を評価した。分析に用いた
ターゲット細胞はヒト結腸直腸癌ライン、ＳＷ １１１
６．ＨＴ−２９および５Ｗ９４８；ヒト胸部価ライン、
ＢＴ−２０およびＺＲ７５−１；ヒト卵巣癌、０ＶＧＡ
Ｒ３； ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）；ヒト胎児膜（ＨＥＩ
）であった。
体被覆ターゲット細胞の４５分間放射性標識放出分析に
よって、補体依存性細胞毒性を評価した。分析に用いた
ターゲット細胞はヒト結腸直腸癌ライン、ＳＷ １１１
６．ＨＴ−２９および５Ｗ９４８；ヒト胸部価ライン、
ＢＴ−２０およびＺＲ７５−１；ヒト卵巣癌、０ＶＧＡ
Ｒ３； ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）；ヒト胎児膜（ＨＥＩ
）であった。
第２表
ウサギ １７−１Ａ ＩｇＭによる５１−Ｃγ放
出チ第３表 ウサギ １７−１Ａ ＩｇＧによる５１−Ｃγ放
出チ１／３２ − − − − − −
− 一実施例４ キメラ１７−１Ａ 抗体の抗１］
１瘍活性を単離したＧＩＫ１７−１Ａキメラ遣遺伝産物
を（１）抗体依存性細胞仲介細胞毒性分析（ＡＤＣＣ）
および（２）ＨＴ−２９細胞（１７−１Ａ抗原を表す結
腸癌細胞ライン）と部分的に精製した１７−１Ａ抗原と
を用いる結合分析において生物学的に試験した。これら
の研究方法は、ディ・アール・−・レヴイ（Ｐ、Ｃ，Ｌ
ｅｖｙ ）等のジエイ・イムノルー１２３（２）、５９
４頁（１９７９）；およびエイ・ニッチ・ロス（Ａ、Ｈ
，Ｒｏｓｓ ） 等のパイ（１）：２９７頁（１９８６
年）に詳細に述べられている。ＨＴ−２９細胞における
ＡＤＣＣと競合的結合試験では、ＧＬＫ１７−１Ａキメ
ラを天然型ネズミ１７−１ＡＩｇＧと下記に示す付加的
な３個のキメラインタイブとともにテストした；ウサギ
抗ＣＥＭ をポリクローナル対照として用いた。部分
的に精製した１７−１Ａ抗原を泪いる競合的結合試験で
は、ＧＩＫ１７−１Ａキメラを天然型ネズミ１７−１Ａ
ＩｇＧと比較した〇単球およびリンパ球ＡＤＣＣ分析の
データは、４人の異なる成人ドナーからの単球およびリ
ンパ球を用いた４種類の実験から得た。自然放出平均値
上ＳＤは全ターゲット細胞”’ＣＲ（Ｎ＝ ２８ ）の
１８．７±２．８チであった。
出チ第３表 ウサギ １７−１Ａ ＩｇＧによる５１−Ｃγ放
出チ１／３２ − − − − − −
− 一実施例４ キメラ１７−１Ａ 抗体の抗１］
１瘍活性を単離したＧＩＫ１７−１Ａキメラ遣遺伝産物
を（１）抗体依存性細胞仲介細胞毒性分析（ＡＤＣＣ）
および（２）ＨＴ−２９細胞（１７−１Ａ抗原を表す結
腸癌細胞ライン）と部分的に精製した１７−１Ａ抗原と
を用いる結合分析において生物学的に試験した。これら
の研究方法は、ディ・アール・−・レヴイ（Ｐ、Ｃ，Ｌ
ｅｖｙ ）等のジエイ・イムノルー１２３（２）、５９
４頁（１９７９）；およびエイ・ニッチ・ロス（Ａ、Ｈ
，Ｒｏｓｓ ） 等のパイ（１）：２９７頁（１９８６
年）に詳細に述べられている。ＨＴ−２９細胞における
ＡＤＣＣと競合的結合試験では、ＧＬＫ１７−１Ａキメ
ラを天然型ネズミ１７−１ＡＩｇＧと下記に示す付加的
な３個のキメラインタイブとともにテストした；ウサギ
抗ＣＥＭ をポリクローナル対照として用いた。部分
的に精製した１７−１Ａ抗原を泪いる競合的結合試験で
は、ＧＩＫ１７−１Ａキメラを天然型ネズミ１７−１Ａ
ＩｇＧと比較した〇単球およびリンパ球ＡＤＣＣ分析の
データは、４人の異なる成人ドナーからの単球およびリ
ンパ球を用いた４種類の実験から得た。自然放出平均値
上ＳＤは全ターゲット細胞”’ＣＲ（Ｎ＝ ２８ ）の
１８．７±２．８チであった。
エフェクタ一対ターゲット（Ｅ：Ｔ）比２５：１．１０
：１および３：ｌｋ用イテ、単球ＡＤＣＣ分析を実施し
た。特定のＥ：Ｔ比における各試験材料の平均溶解％（
±ＳＤ）を下記に示す。
：１および３：ｌｋ用イテ、単球ＡＤＣＣ分析を実施し
た。特定のＥ：Ｔ比における各試験材料の平均溶解％（
±ＳＤ）を下記に示す。
第４表
＊Ｔ細胞リンパ芽球様細胞ラインに対する単球ＡＤＣＣ
分析では、ＧＩｋ１７−１ＡキメラＩｇＧによる溶解チ
はネズミ１７ １Ａによる溶解係に匹敵した。
分析では、ＧＩｋ１７−１ＡキメラＩｇＧによる溶解チ
はネズミ１７ １Ａによる溶解係に匹敵した。
リンパ球ＡＤＣＣ分析はＥ：Ｔ比１００：１゜３０：１
および１０：１を用いて実施した。平均溶解チ（±Ｓ、
Ｄ）値を下記に示す。
および１０：１を用いて実施した。平均溶解チ（±Ｓ、
Ｄ）値を下記に示す。
リンパ球ＡＤＣＣ分析では、ＧＩｋ １７−１Ａキメラ
ＩｇＧによる溶解チは１７−１Ａによる溶解係に匹敵し
た。
ＩｇＧによる溶解チは１７−１Ａによる溶解係に匹敵し
た。
完全ＨＴ−２９細胞を用いる結合分析では、細胞を試験
抗体で被覆した。１７−１Ａとウサギ抗ＣＥＭの定量に
は ニー蛋白質Ａを用いた；キメラ抗体の定量には１
２５Ｉ−抗ヒトＩｇＧ（ＦＣ）を用いた。腫瘍細胞に結
合したＩｇＧの定量に関するデータを下記に示す。結果
は４または５回の実験の平均値（±Ｓ、Ｅ）を表す。
抗体で被覆した。１７−１Ａとウサギ抗ＣＥＭの定量に
は ニー蛋白質Ａを用いた；キメラ抗体の定量には１
２５Ｉ−抗ヒトＩｇＧ（ＦＣ）を用いた。腫瘍細胞に結
合したＩｇＧの定量に関するデータを下記に示す。結果
は４または５回の実験の平均値（±Ｓ、Ｅ）を表す。
第６表
１７−１Ａキメラ ８５，５００（±１６，０００
） ５Ｇｌｋ キメラ ７７．９００（±１
３，７００） ４Ｇ２ｋ キメラ ４３，７
００（± ５，０００） ５Ｇ３ｋ キメラ
７３，５００（± ７，６００） ５Ｇ４ｋ キ
メラ １０９，０００（±２１，２００） ５ウ
サギ抗 ＣＥＭ ３０３，０００（±８６，８００
） ４ＨＴ−２９細胞への結合はＧＩＫ１７−１Ａ
キメラＩｇＧとネズミ１７−１Ａとで匹敵した。
） ５Ｇｌｋ キメラ ７７．９００（±１
３，７００） ４Ｇ２ｋ キメラ ４３，７
００（± ５，０００） ５Ｇ３ｋ キメラ
７３，５００（± ７，６００） ５Ｇ４ｋ キ
メラ １０９，０００（±２１，２００） ５ウ
サギ抗 ＣＥＭ ３０３，０００（±８６，８００
） ４ＨＴ−２９細胞への結合はＧＩＫ１７−１Ａ
キメラＩｇＧとネズミ１７−１Ａとで匹敵した。
部分的に精製した１７−１Ａ抗原を用いる競合的結合分
析では、ミクロタイタープレートラ部分的に精製した１
７−１Ａ抗原（ＳＷ１１１６細胞から単離）とともに３
７℃において２時間インキュベートした。孔の非特異性
結合部位をＰＢＳ＋１％ＢＳＡによって室温において１
時間ブロックし、ＰＢＳによって洗浄した。 ■標
識ネズミ１７−１Ａと競合抗体（低温ネズミ１７−１Ａ
またはＧＬＫ１７−１ＡキメラＩｇＧ）？：孔の中で４
℃において、１晩インキユベートした。孔をＰＢＳによ
って３回洗浄し、ガンマカウンター内で計測した。ＧＩ
Ｋ１７−１Ａキメラおよびネズミ１７−ＬＡの５０チ結
合値はそれぞれ、０．３０μｇ／−と０．１６μｇ／−
であると測定された。
析では、ミクロタイタープレートラ部分的に精製した１
７−１Ａ抗原（ＳＷ１１１６細胞から単離）とともに３
７℃において２時間インキュベートした。孔の非特異性
結合部位をＰＢＳ＋１％ＢＳＡによって室温において１
時間ブロックし、ＰＢＳによって洗浄した。 ■標
識ネズミ１７−１Ａと競合抗体（低温ネズミ１７−１Ａ
またはＧＬＫ１７−１ＡキメラＩｇＧ）？：孔の中で４
℃において、１晩インキユベートした。孔をＰＢＳによ
って３回洗浄し、ガンマカウンター内で計測した。ＧＩ
Ｋ１７−１Ａキメラおよびネズミ１７−ＬＡの５０チ結
合値はそれぞれ、０．３０μｇ／−と０．１６μｇ／−
であると測定された。
これらの結果はＧＩＫ１７−１ＡキメラＩｇＧが抗体結
合に関してネズミ１７−１Ａに匹敵することを実証して
いる。
合に関してネズミ１７−１Ａに匹敵することを実証して
いる。
上記インビトロ試験の他に、免疫螢光法を用いて、種々
のヒト組織に関するＧＩＫ１７−１Ａとネズミ１７−１
Ａによるインビトロ免疫組織病理学的研究を実施した。
のヒト組織に関するＧＩＫ１７−１Ａとネズミ１７−１
Ａによるインビトロ免疫組織病理学的研究を実施した。
ネズミ１７−１Ａ（２４μｇ／−）とＧＩＫ１７−１Ａ
キメラエｇＧ（９６μ９／−１＞ は４級験結腸腫瘍
標本中の全てに反応することが判明した。他の被験腫瘍
細胞は膵臓癌、肺癌（腺癌および気管支価）、胸部線維
腺腫と癌、胃癌、メラノーマ、ヘパドームおよび卵巣癌
である。ネズミ１７−１Ａは肺癌（気管支）、胃癌、メ
ラノーマおよび卵巣癌と反応した。ＧＩＫ１７−１Ａキ
メラＩｇＧは結腸腫瘍以外のいずれの被験腫瘍標本とも
反応しなかった。
キメラエｇＧ（９６μ９／−１＞ は４級験結腸腫瘍
標本中の全てに反応することが判明した。他の被験腫瘍
細胞は膵臓癌、肺癌（腺癌および気管支価）、胸部線維
腺腫と癌、胃癌、メラノーマ、ヘパドームおよび卵巣癌
である。ネズミ１７−１Ａは肺癌（気管支）、胃癌、メ
ラノーマおよび卵巣癌と反応した。ＧＩＫ１７−１Ａキ
メラＩｇＧは結腸腫瘍以外のいずれの被験腫瘍標本とも
反応しなかった。
ヌードマウスにおけるｊｉｆｆ！ｆｊｆｆ増殖阻害実験
はＧＩＫ１７−１Ａキメラが腫瘍拡大の遅延に有効であ
ることを示した。ヌードマウス腫瘍阻害研究を生後６〜
８週間のヌードマウス（ＮＵ／ＮＵ Ｂａ１ｂ Ｃバッ
クグランド）において、既述した方法［ディ・エム・ヘ
ルリン（１］、Ｍ、Ｈｅｒｌｙｎ ）等のカンサ（１９
８０年）〕を用いて実施した。マウス（５匹／群）の頚
部に５Ｘ１０ ５Ｗ９４８（結腸腫瘍細胞）を皮下注射
し、次にネズミ１７−１Ａまたは４キメラインタイブの
各々（ＧＩｋ１７−１Ａを含む）または対照の抗インフ
ルエンザ抗体（Ｈ２４Ｂ５）１日量１００μｇを５回腹
腔内投与した。外部測定によって、腫瘍サイズを１週間
に１回、６週間にわたってモニターした。各測定間隔に
対する個々の動物種湯量と群平均値とを第７表に示す。
はＧＩＫ１７−１Ａキメラが腫瘍拡大の遅延に有効であ
ることを示した。ヌードマウス腫瘍阻害研究を生後６〜
８週間のヌードマウス（ＮＵ／ＮＵ Ｂａ１ｂ Ｃバッ
クグランド）において、既述した方法［ディ・エム・ヘ
ルリン（１］、Ｍ、Ｈｅｒｌｙｎ ）等のカンサ（１９
８０年）〕を用いて実施した。マウス（５匹／群）の頚
部に５Ｘ１０ ５Ｗ９４８（結腸腫瘍細胞）を皮下注射
し、次にネズミ１７−１Ａまたは４キメラインタイブの
各々（ＧＩｋ１７−１Ａを含む）または対照の抗インフ
ルエンザ抗体（Ｈ２４Ｂ５）１日量１００μｇを５回腹
腔内投与した。外部測定によって、腫瘍サイズを１週間
に１回、６週間にわたってモニターした。各測定間隔に
対する個々の動物種湯量と群平均値とを第７表に示す。
相対的な腫瘍阻害ランキングは１７−１Ａ、Ｇ４に、Ｇ
ＩＫであることが判明した。
ＩＫであることが判明した。
キメラ抗体Ｇ３におよびＧ２には試験した用量レベルで
は有効ではなかった。
は有効ではなかった。
第７表
５Ｘ１０ ＳＷ ９４８ Ｓ、Ｃ，注入および次にネ
ズミ１７−１Ａ、１７−１Ａの４キメラ抗体またはＨ２
４Ｂ５（陰性対照）１００μ９１日１回腹腔内注入５回
後のヌードマウス（５匹／群）のｌ１１１瘍量（ｃｎｌ
）。
ズミ１７−１Ａ、１７−１Ａの４キメラ抗体またはＨ２
４Ｂ５（陰性対照）１００μ９１日１回腹腔内注入５回
後のヌードマウス（５匹／群）のｌ１１１瘍量（ｃｎｌ
）。
投与後の日数
ｏｏｏｏ ｏ 。
０ １ ５０ １０９．６ ２５２ １０５０平均値
０．２ ２．２ １２，２２４．７ ８６８ ３０
９Ｓ、Ｄ、 ０．４ ２．７ ２１，３４７．６
１１６．４ ４５９Ｈ２Ｂ４５ ０ ９０Ｂ ４０５
４９９．１ １８００３３６０２４ ２Ｂ８ ２４４
．８ ９２ ６７７２２４４７．６５８８ １８０
３８８．８ ４７５１０３５４ ９ ３６ ４９
．１ １１０４１９５８４ ８２．５２８０．８３９６
１８７ ２１１Ｏ平均値 ７．９５３．９２２９．
３ ２８５ ８４８．６１７６７．４Ｓ、Ｄ、 ９
．４３４．８１３５．６ ２０１ ６２７．９ １１９
０．５Ｇｌｋ ０ ３２ １２４ ２
１３．１３８２．５ ７００４．２４ ９
９ ３２ ５０１９．８ ６８．９ １
５７．８ ２３６ ２３０．４ １０４０１０．５
１８ ４６．６ １０２．６ ６１４．３ ４０
８平均値 ７．７３０．２７７．８１７２．６３４６．
９６５５．６Ｓ、Ｄ、 ７．７ ２４，２ ６１
．１ １１６．４ ２２４．７ ．４３５．３４ ５５
１０３．９ ３６５．２ ８８０ １４０８０
０ ３９６ １９８．４ ８２８ ９２４３
４５ １９３．４ ３５１ ５９４ １６８３
平均値 １．６２５．４１８９．４３２４．７７６２１
３６２ＢＳ、Ｄ、 １．８ ２４．７ １２０．
８ ８９．０ １２５ ３９３．９Ｇ３ｋ
２４．５ ２０ １３５ ４１２．５１２６０
７９２１９．８ ４ ５７．６ １４６．３
８２８ １１２０！ ２４ ４８ ２７５．
５ ５２９ ８２７０ １８ ８４．８
１７８．８ ３３６ １１２０平均値 １０．３２５
．２９４．２２５２．６７５３．８１１６７．８Ｓ、Ｄ
、 １１．２ ２０，９ ４４．４ １０３．
５ ３５０．３ ４８０．０２．３ ２ ５
５ １３２ ２２８５ １３．５
４０ １１５．５ ４１０ ３１４平均値
３．３ ７，９２７．８４１．９ ２２６ ３５３Ｓ、
Ｄ、 ２．１ ８，１ ２３，４ ４６．３
２１６ ３８５均等性 当業者はここに述べた本発明の特定の実施態様の多くの
等価物を認識する、または実際にルーチンの実験を用い
て確認することができると考えられる。このような等価
物は特許請求の範囲に含むように意図されている。
０．２ ２．２ １２，２２４．７ ８６８ ３０
９Ｓ、Ｄ、 ０．４ ２．７ ２１，３４７．６
１１６．４ ４５９Ｈ２Ｂ４５ ０ ９０Ｂ ４０５
４９９．１ １８００３３６０２４ ２Ｂ８ ２４４
．８ ９２ ６７７２２４４７．６５８８ １８０
３８８．８ ４７５１０３５４ ９ ３６ ４９
．１ １１０４１９５８４ ８２．５２８０．８３９６
１８７ ２１１Ｏ平均値 ７．９５３．９２２９．
３ ２８５ ８４８．６１７６７．４Ｓ、Ｄ、 ９
．４３４．８１３５．６ ２０１ ６２７．９ １１９
０．５Ｇｌｋ ０ ３２ １２４ ２
１３．１３８２．５ ７００４．２４ ９
９ ３２ ５０１９．８ ６８．９ １
５７．８ ２３６ ２３０．４ １０４０１０．５
１８ ４６．６ １０２．６ ６１４．３ ４０
８平均値 ７．７３０．２７７．８１７２．６３４６．
９６５５．６Ｓ、Ｄ、 ７．７ ２４，２ ６１
．１ １１６．４ ２２４．７ ．４３５．３４ ５５
１０３．９ ３６５．２ ８８０ １４０８０
０ ３９６ １９８．４ ８２８ ９２４３
４５ １９３．４ ３５１ ５９４ １６８３
平均値 １．６２５．４１８９．４３２４．７７６２１
３６２ＢＳ、Ｄ、 １．８ ２４．７ １２０．
８ ８９．０ １２５ ３９３．９Ｇ３ｋ
２４．５ ２０ １３５ ４１２．５１２６０
７９２１９．８ ４ ５７．６ １４６．３
８２８ １１２０！ ２４ ４８ ２７５．
５ ５２９ ８２７０ １８ ８４．８
１７８．８ ３３６ １１２０平均値 １０．３２５
．２９４．２２５２．６７５３．８１１６７．８Ｓ、Ｄ
、 １１．２ ２０，９ ４４．４ １０３．
５ ３５０．３ ４８０．０２．３ ２ ５
５ １３２ ２２８５ １３．５
４０ １１５．５ ４１０ ３１４平均値
３．３ ７，９２７．８４１．９ ２２６ ３５３Ｓ、
Ｄ、 ２．１ ８，１ ２３，４ ４６．３
２１６ ３８５均等性 当業者はここに述べた本発明の特定の実施態様の多くの
等価物を認識する、または実際にルーチンの実験を用い
て確認することができると考えられる。このような等価
物は特許請求の範囲に含むように意図されている。
第１図は１７−１Ａ機能軽鎖（Ａ）および重鎖（Ｂ）遺
伝子のヌクレオチド配列、およびその推定上のアミノ酸
配列を示す。 第２図はＪＨ配列を含む再配列１７−１ＡＶＨ遺伝子の
サザンプロット分析を示す。 第３図はキメラ重鎖および軽鎖ベクターＡ１ｐｓＶ１８
４△Ｈｎｅｏ １．７− Ｉ Ａ Ｖｋ −１１Ｃｋ
；Ｂ、 ｐＳＶ ２ΔＨｇｐｔ １７−１Ａ Ｖｒ＋
−ｈＣ７３（１）構造を示す。 第４図はトランスフェクションされたＳｐ２／。 細胞株の３５３−メチオニン標識キメラ免疫グロブリン
タンパク質５Ｇ３１５およびＳＧ３／７のＳＤＳ／ＰＡ
ＧＥを示す。 第５図はキメラ免疫グロブリン５Ｇ３１５によるＳＷ
１１１６細胞への１７−１Ａ結合の阻害を示す。 第６図はキメラ重鎖ベクターｐｓＶ２△）（ｇｐｔｌ
７− Ｉ Ａ Ｖｏ−ｈｃμ）構造ヲ示す。 （外４名） １０ ＡＴＧ ＧＡＡ ＴＧＧ ＡＧＣＡＧＡ ＧＴ
ＣＴＴｒＭＥＴ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖ
ａｌ Ｐｈａ７０ ＧＴＣＣＡＧ ＴＴＧ ＣＡＧ
ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＧＡＶａｌ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｇｉ
ｎ Ｃ１ｎ Ｓｅｒ Ｇａｙ１３０ ＴＧＣＡＡＧ
ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＧＡ ＴＡＣＧＣＣＣｙｓ Ｌｙｓ
Ａｌａ Ｓａｒ Ｇａｙ Ｔｙｒ Ａｌａ１９０
ＧＧＡ ＣＡＧ ＧＧＣＣＴＴ ＧＡＧ ＴＧＧ 入Ｔ
ＴＧｌｙ Ｇｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｒｐ工
１ｅＧｉｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔ、ｅｕ Ｔｈ
ｒ ５ｅｒ３７０ ＴＧＣＴＴＴ ＧＣＴ ＴＡＣＴ
ＧＧ ＧＧＣＣＡＡＴｒｐ Ｐｈａ Ａｌａ Ｔｙｒ
Ｔｒｐ Ｇｌｙ ＧｉｎＦＩＧυＨＥ １ｂ 一ノ Ｏ’）（Ｊ） Ｖ
（鳩 （〜 為
Φ ■ ０「
工 〜 「 〜
伝子のヌクレオチド配列、およびその推定上のアミノ酸
配列を示す。 第２図はＪＨ配列を含む再配列１７−１ＡＶＨ遺伝子の
サザンプロット分析を示す。 第３図はキメラ重鎖および軽鎖ベクターＡ１ｐｓＶ１８
４△Ｈｎｅｏ １．７− Ｉ Ａ Ｖｋ −１１Ｃｋ
；Ｂ、 ｐＳＶ ２ΔＨｇｐｔ １７−１Ａ Ｖｒ＋
−ｈＣ７３（１）構造を示す。 第４図はトランスフェクションされたＳｐ２／。 細胞株の３５３−メチオニン標識キメラ免疫グロブリン
タンパク質５Ｇ３１５およびＳＧ３／７のＳＤＳ／ＰＡ
ＧＥを示す。 第５図はキメラ免疫グロブリン５Ｇ３１５によるＳＷ
１１１６細胞への１７−１Ａ結合の阻害を示す。 第６図はキメラ重鎖ベクターｐｓＶ２△）（ｇｐｔｌ
７− Ｉ Ａ Ｖｏ−ｈｃμ）構造ヲ示す。 （外４名） １０ ＡＴＧ ＧＡＡ ＴＧＧ ＡＧＣＡＧＡ ＧＴ
ＣＴＴｒＭＥＴ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖ
ａｌ Ｐｈａ７０ ＧＴＣＣＡＧ ＴＴＧ ＣＡＧ
ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＧＡＶａｌ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｇｉ
ｎ Ｃ１ｎ Ｓｅｒ Ｇａｙ１３０ ＴＧＣＡＡＧ
ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＧＡ ＴＡＣＧＣＣＣｙｓ Ｌｙｓ
Ａｌａ Ｓａｒ Ｇａｙ Ｔｙｒ Ａｌａ１９０
ＧＧＡ ＣＡＧ ＧＧＣＣＴＴ ＧＡＧ ＴＧＧ 入Ｔ
ＴＧｌｙ Ｇｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｒｐ工
１ｅＧｉｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔ、ｅｕ Ｔｈ
ｒ ５ｅｒ３７０ ＴＧＣＴＴＴ ＧＣＴ ＴＡＣＴ
ＧＧ ＧＧＣＣＡＡＴｒｐ Ｐｈａ Ａｌａ Ｔｙｒ
Ｔｒｐ Ｇｌｙ ＧｉｎＦＩＧυＨＥ １ｂ 一ノ Ｏ’）（Ｊ） Ｖ
（鳩 （〜 為
Φ ■ ０「
工 〜 「 〜
Claims (25)
- （１）ヒト由来の不変部に結合された、腫瘍関連抗原に
特異的な齧歯類由来の抗原結合領域から成るキメラ免疫
グロブリン。 - （２）齧歯類はマウスである、特許請求の範囲第１項記
載のキメラ免疫グロブリン。 - （３）抗原結合領域は胃腸、***、卵巣、肺または腎の
癌細胞と関連した抗原に特異的な抗体から誘導される、
特許請求の範囲第２項記載のキメラ免疫グロブリン。 - （４）抗原は１７−１Ａ、ＯＣ１２５、ＯＶＴＬ−３、
１０３Ｄ２、１２３Ｃ３、７２．３、ＤＦ３、１１５Ｄ
８、ＲＣ３８、Ｇ２５０または５５−２Ａに特異的なネ
ズミ抗体によつて定められる胃腸、***、卵巣、肺また
は腎の癌細胞抗原である、特許請求の範囲第３項記載の
キメラ免疫グロブリン。 - （５）抗原結合領域は抗原１７−１Ａに対する抗体から
誘導される、特許請求の範囲第２項記載のキメラ免疫グ
ロブリン。 - （６）ａ）ヒト重鎖不変部に結合された、腫瘍−または
増殖−関連抗原に特異的なネズミ抗体重鎖から誘導され
る抗原結合領域から成る少なくとも１本のキメラ重鎖と
、 ｂ）ヒト軽鎖不変部に結合されたネズミ抗体軽鎖から誘
導される抗原結合領域から成る少なくとも１本のキメラ
軽鎖と、 を会合させて成るキメラ免疫グロブリン。 - （７）抗原は１７−１Ａ、ＯＣ１２５、ＯＶＴＬ−３、
１０３Ｄ２、１２３Ｃ３、７２．３、ＤＦ３、１１５Ｄ
８、ＲＣ３８、Ｇ２５０または５５−２Ａに特異的なネ
ズミ抗体によつて定められる胃腸、***、卵巣、肺また
は腎の癌細胞抗原である、特許請求の範囲第６項記載の
キメラ免疫グロブリン。 - （８）重鎖不変部はガンマ型のものである、特許請求の
範囲第７項記載のキメラ免疫グロブリン。 - （９）ａ）ヒト重鎖不変部に結合された、腫瘍−または
増殖−関連抗原に特異的なネズミ抗体重鎖から誘導され
る抗原結合領域から成る少なくとも１本のキメラ重鎖と
； ｂ）該キメラ重鎖に会合された、ヒト軽鎖不変部に結合
されたネズミ抗体軽鎖から誘導される抗原結合領域から
成る少なくとも１本のキメラ軽鎖と； ｃ）該ヒト不変部の少なくとも１つに結合された非免疫
グロブリンタンパク質またはペプチド； から成るキメラ免疫グロブリン。 - （１０）抗原は１７−１Ａ、ＯＣ１２５、ＯＶＴＬ−３
、１０３Ｄ２、１２３Ｃ３、７２．３、ＤＦ３、１１５
Ｄ８、ＲＣ３８、Ｇ２５０または５５−２Ａに特異的な
ネズミ抗体によつて定められる胃腸、***、卵巣、肺ま
たは腎の癌細胞抗原である、特許請求の範囲第９項記載
のキメラ免疫グロブリン。 - （１１）重鎖不変部はガンマ型のものである、特許請求
の範囲第９項記載のキメラ免疫グロブリン。 - （１２）非免疫グロブリンタンパク質またはペプチドは
抗癌治療薬剤、細胞障害性薬剤、金属結合剤またはその
機能的なドメインである、特許請求の範囲第９項記載の
キメラ免疫グロブリン。 - （１３）ａ）腫瘍−または増殖−関連抗原に特異的な齧
歯類由来の抗原結合領域； ｂ）ヒト不変部； から成るキメラＦ（ａｂ′）＿２免疫グロブリンフラグ
メント。 - （１４）＾１＾３＾１ヨウ素、＾１＾２＾５ヨウ素、＾
９＾９＾ｍテクネチウムおよび＾１＾１＾１インジウム
より成る群から選ばれるラジオアイソトーブで標識され
た特許請求の範囲第１３項記載のキメラ免疫グロブリン
から成る腫瘍シンチグラフイー用試薬。 - （１５）ｃ）該不変部に結合された金属結合タンパク質
またはタンパク質ドメイン； をさらに含む、特許請求の範囲第１３項記載のキメラ免
疫グロブリンフラグメント。 - （１６）金属結合タンパク質はメタロチオネインである
、特許請求の範囲第１５項記載のキメラ免疫グロブリン
フラグメント。 - （１７）ヒト不変部に結合された１７−１Ａ抗原に特異
的なネズミ抗体から誘導される抗原結合領域から成るネ
ズミ／ヒトキメラ免疫グロブリン。 - （１８）ａ）齧歯類免疫グロブリン鎖の可変部をコード
する第１ＤＮＡ配列と； ｂ）ヒト免疫グロブリンの不変部の少なくとも一部をコ
ードする第２ＤＮＡ配列と； を結合して成る、腫瘍−または増殖−関連抗原に特異的
なキメラ齧歯類／ヒト免疫グロブリンをコードする融合
遺伝子。 - （１９）第１ＤＮＡ配列は１７−１Ａ、ＯＣ１２５ＯＶ
ＴＬ−３、１０３Ｄ２、１２３Ｃ３、７２．３、ＤＦ３
、１１５Ｄ８、ＲＣ３８、Ｇ２５０または５５−２Ａに
特異的なネズミ抗体により定められる胃腸、***、卵巣
、肺または腎の癌細胞抗原のための可変部をコードする
、特許請求の範囲第１８項記載の融合遺伝子。 - （２０）ｃ）第２ＤＮＡ配列の３′末端に結合された、
非免疫グロブリンタンパク質またはペプチドをコードす
る第３ＤＮＡ配列； をさらに含む、特許請求の範囲第１８項記載の融合遺伝
子。 - （２１）非免疫グロブリンタンパク質またはペプチドは
抗癌治療薬剤、細胞障害性薬剤、金属結合剤またはその
機能的ドメインである、特許請求の範囲第１８項記載の
融合遺伝子。 - （２２）腫瘍患者に、腫瘍関連抗原に特異的な齧歯類由
来の抗原結合領域およびヒト不変部から成るキメラ齧歯
類／ヒト免疫グロブリンの抗腫瘍量を投与することから
成る、腫瘍の免疫治療法。 - （２３）腫瘍は胃腸の腫瘍であり、抗原結合領域は抗原
１７−１Ａに特異的である、特許請求の範囲第２２項記
載の方法。 - （２４）腫瘍患者に、 ａ）ヒト重鎖不変部に結合された、腫瘍−または増殖−
関連抗原に特異的なネズミ抗体重鎖から誘導される抗原
結合領域から成る少なくとも１本のキメラ重鎖と； ｂ）該キメラ重鎖に会合された、ヒト軽鎖不変部に結合
されたネズミ抗体軽鎖から誘導される抗原結合領域から
成る少なくとも１本のキメラ軽鎖と； ｃ）該不変部の少なくとも１つに結合された抗腫瘍治療
剤または細胞障害性薬剤； から成る齧歯類／ヒトキメラ免疫グロブリンの抗腫瘍量
を投与することから成る腫瘍の免疫治療法。 - （２５）抗原結合領域は１７−１Ａ、ＯＣ１２５、ＯＶ
ＴＬ−３、１０３Ｄ２、１２３Ｃ３、７２．３、ＤＦ３
、１１５Ｄ８、ＲＣ３８、Ｇ２５０または５５−２Ａに
特異的なネズミ抗体によつて定められる胃腸、***、卵
巣、肺または腎の癌細胞抗原に特異的である、特許請求
の範囲第２４項記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US88249286A | 1986-07-07 | 1986-07-07 | |
| US882492 | 1986-07-07 | ||
| US69414 | 1987-07-01 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9228781A Division JPH1070991A (ja) | 1986-07-07 | 1997-07-22 | 腫瘍関連抗原のためのキメラ免疫グロブリン遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63112995A true JPS63112995A (ja) | 1988-05-18 |
Family
ID=25380710
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62169580A Pending JPS63112995A (ja) | 1986-07-07 | 1987-07-07 | 腫瘍関連抗原に特異的なキメラ齧歯類／ヒト免疫グロブリン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63112995A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2495160A2 (en) | 2011-03-04 | 2012-09-05 | Shimano Inc. | Bicycle brake assembly |
| EP2495159A1 (en) | 2011-03-04 | 2012-09-05 | Shimano Inc. | Bicycle brake assembly |
| DE202012013632U1 (de) | 2011-03-04 | 2018-10-16 | Shimano Inc. | Fahrradbremsanordnung |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60155132A (ja) * | 1983-04-08 | 1985-08-15 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | 組換免疫グロブリン |
| JPS6147500A (ja) * | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
-
1987
- 1987-07-07 JP JP62169580A patent/JPS63112995A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60155132A (ja) * | 1983-04-08 | 1985-08-15 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | 組換免疫グロブリン |
| JPS6147500A (ja) * | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2495160A2 (en) | 2011-03-04 | 2012-09-05 | Shimano Inc. | Bicycle brake assembly |
| EP2495159A1 (en) | 2011-03-04 | 2012-09-05 | Shimano Inc. | Bicycle brake assembly |
| EP3000708A1 (en) | 2011-03-04 | 2016-03-30 | Shimano Inc. | Bicycle brake assembly |
| DE202012013632U1 (de) | 2011-03-04 | 2018-10-16 | Shimano Inc. | Fahrradbremsanordnung |
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