JPS62153758A - フロ−サイトメ−タによる網状赤血球測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 不発明は血液分析時に血液中の網状赤血球のフローサイ
トメータによる測定技術に関するものである。

不発明のフローサイトメータによる網状赤血球測定方法
は臨床検査の分野において検体血液中の幼若な網状赤血
球をはじめ他の血球等有形成分ン光学的に分類測定する
際にきわめて■益である。

従来の技術 染色試薬ヶ用いて予め特定細胞や粒子を染色して検体の
血液分析χ行う光学的かつフローサイトメトリーによる
血液分析測定技術はこれまで昧々に具体比されている。

血液試料については、螢光染色した血球か放出する螢光
の水平・垂直方向の異方性比馨測定するもの（特開昭５
９−１０２１５９号公報参照）、細胞の螢光強度分布よ
り細胞の分類計数を行うもの（特公昭５４−１４９５７
号公報参照）、細胞の螢光染色試薬として網状赤血球に
対する選択性の強いチオフラピンＴ乞用いているもの（
特開昭５９−１４２４６５号公報参照）、下、″ａ出願
人による三角フローセルで挟角散乱光についてこれを高
効率で受光しようとするもの（待筑昭６０−６６１６９
号）、同じく不願出、願人による別状赤血球に対して極
めて選択性の強いオーラミンＱを螢光染色試薬とするも
の（特願昭６０−１２３１２８号）、レーザ光源乞用い
螢光と散乱光乞同時測光して網状赤血球を同定計数する
もの（米国特許第４５２５７０６号）などを挙げること
ができる。

フローサイトメータによる上記の如き代表的な血液分析
には例えば゛第４図に示す基本構成の測定系が用いられ
ている。血液試料を流動させるフローセルろの細胃耶に
励起光Ｅをレーザ光源１からコンデンサレンズ２を介し
て入射し、この光学的刺激域からの側方散乱光及び側方
螢光を散乱光除去フィルタソ、コンデンサレンズ１０．
フィールドアパーチャ１１．受光フィルタ１２乞経て光
検出素子１６で側方螢光のみ測光すると共に、フローセ
ル６かも直進し１０光のうち励起光Ｂの一部χビームス
トッパ４で除去しｆこ後コンデンサレンズ５、フィール
ドアパーチャ６を経て前方散乱元Ｓを光検出素子７で測
光し、同一細胞まγこは粒子から発せられ１こものとし
てそれぞれの光強度信号は渭幅器１４，８を経て解析部
１５に入力され血球種別１粒子ごとに特定され計数され
て表示又は記録器１６により表示される。

上記のフローサイトメータによる血球分析では光学的刺
激域からの応答としての散乱光及び螢光が複数の光軸に
沼って配置された測光系に進み。

それぞれの光軸上で受光するようにされている。

従って、第２図（ｂ）及び第４図に見る如（、Ｖ−ザ光
源１から真直ぐに（Ｌｏで調整後固定しである）フロー
セル乙に向かう励起光Ｅの光軸Ａに宿ってフローセル？
法んで配置され１こコンデンサレンズ２，５については
、それらのｍノし−及び焦点位置稠整乞矢印し。＋　Ｌ
　１　＋　Ｌ２　　のそれぞれに対し終了したとしても
、上記調整に伴って、光＠Ａと置父する光軸Ｂに溜つ１
こ側方螢光Ｆの測光系についてもコンデンサレンズ１０
乞矢印Ｌ３方向にコンデンサレンズ２，５とのずれを解
消するように調整しなければならず、この元＠Ｂ上での
ずれの修正は再び光軸ＡＫ沼った光学系のずれを生むの
でＬＬ＋Ｌ２を再修正する必要が生ずる。かくして、光
軸Ａ　、　Ｂ　Ｋｌ”ｏつた焦点及び細心のずれの修正
後にも。

さらにこれらの再修正が少なくとも数回要求されるのみ
ならず、散乱光と螢光とて家光軸か異なるので経時変［
ヒが異質となり、第６図左側の従来り１」に示すように
調整時の実線信号に対して点線のよ５な４怒度ずれ波形
か螢光信号（場合によっては散乱元信号）に偏って現わ
れる。この１こめ、特定の血球細胞又は粒子に対応した
複数の元学的特性乞同時に、相対的に解析部べぎフロー
サイトメータでは定時的に感度のずれを再調整しないと
血球又は粒子の種類別の同定及びそれらの計数に相当の
誤差の発生が避けられなかった。特に、この偏りは２次
元分布解析乞行う従来技術において問題であつ１こ。

次に、複数の検出情報によって成熟赤血球及び血小板か
ら網状赤血球の正確な弁別２行うために１ｉ複雑な信号
処理法が採用されてさ１こ。詳しくは。

前記米国特許第１１３２５７０６号乞参照され１Ｃ２゜
これは、１）散乱光強度と螢光強度の２次元分布図を作
成し、１１）赤血球と血小板と’＆［号上分離するため
に升別基準直顧を作り、１１１）血小板乞取除い１こ血
球群の螢光強度を散乱光強度信号で補正し、ＩＶ）補正
された螢光強度に対して頻度分布曲線を求めこの分布曲
線の半分で成熟赤血球の分布曲線ケ正規分布として推定
しこの正規分布曲線からすれ１こ信号群を網状赤血球群
として算定する。という手順である。上記ｉＶ）は特に
複雑であるだけでな（、赤血球の螢元分布乞正規分布と
して仮定しているので、これに伴って成熟赤血球と（幼
若）網状赤血球のそれぞれの螢光強度に相関関係かある
ものと擬制しなければならず、これン前提とした血球分
析結果が無視し難い誤差乞発生することがあつ１こ。こ
のことは現実の検体の螢光特性かこうした正規分布や相
関関係にそれほど捉われない多様なものであるところか
ら派生しており、特にこの傾向は網状赤血球比率が多い
検体はど大きい等から染色時の染色量も関係し壬いるも
のと見られる。

問題？解決する１こめの手段 本発明は、フローサイトメータによる網状赤血球の測定
に際し網状赤血球比率の大小に代表される検体の特質に
左右されろことなく、多様な検俸乞同時に処理しても検
体相互の待機ン正しく挾出し計数誤差の発生を最小［ヒ
すること並ひに測光光学系を簡素［ヒすることを可能に
したものであり。

二の１こめに不発明は新しい螢光染色染料を使用し。

倹（１）信号を改善して弁別処理乞簡素で安定なものと
すると共に、励起光の光軸に沿って配置され１こフロー
セルの光学的刺激域から放出される出射光について励起
光χ事実上除去し１こうえで励起光の光軸に沿つ１こ同
軸上の前方散乱光及び前方螢光ン測元して網状赤血球を
測定するフローサイトメータによる網状赤血球測定方法
ヶ特色とするものである。

実　施　列 不発明によるフローサイトメータによる網状赤血球測定
方法では先ずフラボホスフィンＲ４主剤とする血球測定
用試薬５００に対して抗凝固性全血液試料１の比率で混
合して螢光染色７行う。試薬について詳しくは特願昭５
９−２０１２７３号ケ参照のこと、次に試料を測定する
。第１図罠示す如くフローサイトメータのフローセル２
６に対してｖ　−サ光源２０からフィルタ２１．コンデ
ンサレンズ２２χ介して励起光Ｅ′が入射される。フロ
ーチャンネル中の試料液ヲ泣むよ５にして流れるシース
族の中心部ン光学的刺激域として上記励起元暑入射集束
し、上記光学的刺激域から出射されγこ光のうち励起光
を主成分とする光馨ビームストッパ２４で遮断する。前
方螢光Ｆ′と前方散乱光Ｓ′とはコンデンサレンズ２５
で平行光勝に戻し１こ後スリット板２６を通して小径の
ビームに絞り、これをダイクロイックミラー２７で削方
散乱元Ｓ、削万螢光ｒの２成分に分離する。前方散乱光
はダイクロイックミラー２７の背後で光検出素子２Ｂで
受光され、増幅器２９で増幅され１こ前方散乱光強度信
号はＡ／Ｄ変換器６０ケ経て解析部６６に入り表示ｍ３
７で表示される。−万、ダイクロイックミラー２７で反
射された前方螢光ｆはフィルタ′５１で迷光等を除去し
１こ後光侠出素子３２で受光され、増幅器６４で増幅さ
れ１こ前号螢光強度信号はＡ／Ｌ）変換器３５乞経て解
析部ろ６に入り表示部６７で表示される。なお、前方散
乱光強度１３号の増幅度と前方螢光強度の増幅度は必要
な場合それぞれ独立して又は相関連させてゲインコント
ロール３乙により制御することかできる。

作　　　　用 上記フローサイトメータを用いる測定方法では。

第２図（ａ）に示す如＜、Ｌｏの設定−１，、、Ｌ、２
の調整後フローセル２ろへの入射励起光の光軸と同軸上
で前方螢光と前方散乱光とが集光され波長域でそれぞれ
分離し測光される。励起光Ｅ′は励起光波長選択フィル
タ２１馨透過すると光源２０の発光波長から特定の波長
帯に絞られているが、フローセル２６０通過後にビーム
ストッパ２４でカットされる。スリット板２６？通じて
点光源になされ１こ３答元は、ダイクロイックミラー２
７で吸光波長に達しない波長光を主取分とする前方螢光
強度射し又吸光改良を越える波長光を主成分とする前方
散乱光を透過させて二分割する。光検出累子２８．３２
は検知し１こ散乱光、螢光ン強度信号として谷血球毎の
元応答馨光電変換し、これらの信号は瑠幅、Ａ／Ｄ変換
された後解析部６６でデータ記録解析され、公知の知見
に従って通常（成熟）赤血球、血小板、網状（幼若）赤
血球、白血球などに分類計数され得るか、螢光染色し１
こ場合これらの血球のうち網状赤血球の計数テークは臨
床検査上置も重要である。１個の網状赤血球による光応
答は、第２図に示すように、従来方法では測光光学系の
調整をフローセルを中心とする６個のレンズにつき異な
る、光軸に市って行っていたので光学的な偏りが相違し
ており、第６図（ａ）、（ｂ）の右側の散乱光及び螢光
の対応ピークで表わされるように理想的に調整されてい
たものか１時間経過により１例えば第６図左＄１１１（
ａ）のように散乱光の信号は変比しないが同図（ｂ）の
ように螢光の信号のみ理想からかなりずれて２Ｅｔｊｌ
ｌｌ（ｂ）の点線のように低値乞とり易くなる。従って
、螢光が減弱し１こ網状赤血球の強度信号は血小板や一
部の通常赤血球との混同２生じ弁別が不安定であり結果
的に計数誤差編与えろことになる。不発明によれば。

第２図（ａ）に示す様に唯一の元＠への同軸上において
集束系馨しｌ　＋　Ｌ２　ｒ　ＬＯで位置及び則・し・
ル、ｆｌ整するため、同一血球起源の散乱光と螢光とは
事央上対応した最大ピーク及び減弱傾回乞も１こらし、
この対応ピークは第６図（ａ）（ｂ）　　中央の芙紛同
士。

点１嵌同士の様に対口、して検知される。

発明の効果 本発明は次の９口き特有の効果２有する。

（１）　　血球の弁別安定性が著しく改善された。

同一血球起源の螢光と散乱光とを一軸で同時測定でるの
で、集束光学系を最高感反になるように１こや丁く、短
時間に調整し優るのみならず。

このルー整に多少の不足があっても、或いは経時的に調
整が少しすね、Ｃさても一軸上の散乱光と螢光か同時に
対応して強度変動するので、前しい試薬θ〕封状１ヒ作
用による恢ｌｆ１倍号の改善と相俟って１、布状赤血球
についてその弁別レベル乞固定しても極めて安定な弁別
が可能である。

（２）　　試料処理速度が高い。

フローセルの元刺激域乞成熟赤血球と血小板とが同時通
過し１こ場合、この時の光応答は網状赤血球に類似する
即ち網状赤血球による散乱光。

蛍光強度信号と紛られしい信号χ発し、この紛れは特に
網状赤血球比率が小さくフローチャンネルに名ける試薬
の流動径か太さいと増大する。従来法ではこれ乞避ける
１こめ、７０−チヤンイ・ル馨細く絞り細胞通過を１個
つつにして同時通過乞防止しようとしたが、これに伴っ
て試料処理スピード乞格段に落とさざる乞イ身なかった
。不発明方法によれば、弁別レベルの安定性が尚く、こ
の１こめ成熟赤血球数及び血小板数の監視ン導入して同
時通過乞補償しやてい１こめ試料処理スピード馨犠牲に
することな（高能率で試料処理を遂行し得る。

（３）　　光学系の調整工数か低減され１こ。

特定の血球起源の散乱光と螢光と２異なる光軸において
検知すると、−万の光軸上の測光系の修正が他方の光軸
上σ連軸光系の修正を誘発させ。

このため両党強度の正確な測定を可能にする集束位置と
光軸の細密な調整に至るまでには何回もの修正を反覆し
なければならす、この手間と所要時間は相当大ぎなもの
かあった。本発明では一軸に沼って測光糸７ａ−調整丁
れは足りるので調整工数が最小限でしかも簡単に行われ
ることになっＴこ。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によるフローサイトメーク２用い１こ網
状赤血球の測定方法を実施する際の基本構成の説明図、
第２図は光軸？中心として見１こ従来法と不発明方法に
おける測光光学系の比較のための概略図、第６図は検知
される光強度信号の同様な比較の１こめのビーク波形図
、第４図は従来の代表的なフローサイトメータの基本構
成を示す。 特許出願人　東亜医用電子株式会社 （従来　） ３図 時間

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 励起光の光軸に沿つて配置されたフローセルの光学的刺
   激域から放出される出射光について前記励起光を事実上
   除去したうえで、前記光学的刺激域から放出される前記
   光軸に沿つた同軸上の前方散乱光及び前方螢光を測光し
   て測光データより成熟赤血球及び血小板と網状赤血球と
   を弁別し網状赤血球数を測定することを特徴とするフロ
   ーサイトメータによる網状赤血球測定方法。