CN104749144A - 血细胞检测试剂及血细胞处理方法和识别方法 - Google Patents
血细胞检测试剂及血细胞处理方法和识别方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及血细胞检测领域，公开了一种血细胞的检测试剂及血细胞处理方法和识别方法。本发明公开的检测试剂包括荧光染料、球形化组分和有机醇。其荧光染料具有细胞通透性，且可以对细胞内核酸物质特异性染色；球形化组分能够球形化红细胞，保持红细胞膜完整且不对白细胞的内部结构产生破坏作用；有机醇能够增加细胞通透性，协助荧光染料进入细胞。同时，本发明公开了一种血细胞处理方法和识别方法。采用本发明中的试剂和方法，可实现通过一种试剂在一次检测中对不同血细胞，尤其是对未成熟白细胞和网织红细胞的同时检测，极大的节省了检测成本，提升了检测速度，降低了仪器的复杂性。
Description
技术领域
本申请涉及血细胞检测领域，特别是涉及一种血细胞检测试剂，以及利用该试剂对血细胞进行处理、识别的方法。
背景技术
外周血中的血细胞由造血干细胞增殖、分化、发育而成。血细胞逐渐成熟并进入外周血行使特定的功能：其中网织红细胞（Reticulocytes，RET）是尚未完全成熟的红细胞。未成熟白细胞是指未完成分化、发育的白细胞(未成熟白细胞也称为幼稚白细胞，主要包括原始细胞（Blast）、幼稚粒细胞（IG）、幼稚淋巴细胞等)。临床上，需要检验血液样本中的网织红细胞和未成熟白细胞。
美国专利5492833公开了一种利用红细胞影化试剂去除红细胞内血红蛋白，并通过光散射的检测方法实现网织红细胞分类的方法。美国专利5891731、5812127公开了可以染色网织红细胞和白细胞试剂荧光染料，可以实现网织红细胞与红细胞的区分，并能够差异染色白细胞和网织红细胞，去除白细胞的干扰。但这些网织红细胞检测的试剂并不能就未成熟白细胞进行检测。
中国专利CN94102901.8公开了使幼稚白细胞与其它细胞类群在体积和内部结构产生差别的试剂，用该试剂处理血液等液体样本，检测电导信号（DC）和高频电流信号（RF）实现幼稚白细胞的区分。美国专利5958776公开了一种溶解红细胞，损伤成熟白细胞，保护并维持未成熟细胞形态结构，同时对受损伤的白细胞进行特异性荧光染色，实现未成熟细胞区分。这几种方法均需要溶解红细胞、容易受到红细胞碎片的干扰，同时对白细胞的损伤破坏了白细胞的内部形态结构信息。
综上所述，目前的检测方法中无同时检测未成熟白细胞、白细胞及网织红细胞的方法的报道。如可通过一种试剂，实现在一次检测中对多种细胞进行检测，将会在很大程度上降低检测成本，并减少仪器的复杂性，对医疗设备的普及和推广具有较大的意义。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本申请的目的在于提供一种可实现同时对多种血细胞进行检测的试剂，尤其是提供一种可现实同时对未成熟白细胞和网织红细胞进行检测的试剂。
同时，本申请还提供了一种血细胞处理方法和一种血细胞识别方法。
为实现上述目的，本申请采用了以下技术方案。
本申请提供了一种血细胞检测试剂，该试剂包括：荧光染料、球形化组分和有机醇。其采用的荧光染料具有细胞通透性，且可以对细胞内核酸物质特异性染色。其采用的球形化组分能够球形化红细胞，保持红细胞膜完整且不对白细胞的内部结构产生破坏作用。其采用的有机醇能够增加细胞通透性，协助荧光染料进入细胞。
本申请还公开了一种血细胞处理方法，该方法包括：将待测样品与荧光染料、球形化组分和有机醇混合，得到处理后的样品。该荧光染料具有细胞通透性，且可以对细胞内核酸物质特异性染色。该球形化组分能够球形化红细胞，保持红细胞膜完整且不对白细胞的内部结构产生破坏作用。该有机醇能够增加细胞通透性，协助荧光染料进入细胞。
在本申请的具体实施方式中，上述处理方法中的混合时间优选为5到60秒，更优选20-50秒。
此外，本申请还公开了一种血细胞识别方法，该识别方法包括（1）将含有血细胞的待测样品与上述包括荧光染料、球形化组分和有机醇的试剂混合反应，使待测样品中的红细胞球形化，保持红细胞膜完整且不破坏白细胞的内部结构，对细胞内部核酸物质进行荧光染色，该血细胞中含有网织红细胞和未成熟白细胞。（2）检测处理后的血细胞的荧光信号和至少一种散射光信号，根据检测结果同时识别出网织红细胞和未成熟白细胞。
在本申请的具体实施方式中，上述识别方法中的混合时间优选为5到60秒，更优选20-50秒。
同时，本申请也提供了上述试剂和试剂盒在血细胞检测领域的应用。
本申请的有益效果是：本申请提供的试剂中包括荧光染料、球形化组分与有机醇，与血细胞反应时三者配合使用产生协同作用，使得细胞的膜通透性增加，可实现在不破坏血细胞细胞膜的情况下染色网织红细胞、成熟白细胞和未成熟白细胞等细胞。将待测样品与本申请提供的试剂混合一定时间再通过光学检测，即可实现通过一种试剂在一次检测中对不同血细胞，尤其是对未成熟白细胞和网织红细胞的同时检测。
附图说明
图1是本申请的一种血细胞检测装置的光学检测***模式图；
图2是本申请试剂检测血液样本各细胞类群分布的示意图，图2-A为前向散射光-侧向荧光检测结果示意图，图中通过侧向荧光强度和前向散射光强度可以划分为实线标志区域，分别为红细胞、网织红细胞、血小板、幼稚粒细胞、原始细胞和成熟白细胞分布区域；图2-B为侧向散射光-侧向荧光检测结果示意图，图中通过侧向荧光强度和侧向散射光强度可以划分实线标志区域，分别为红细胞、血小板、幼稚粒细胞、原始细胞、成熟白细胞分布区域；
图3是本申请实施例一中含有网织红细胞与未成熟白细胞的样本与检测试剂孵育不同时间后的散点图（图3-A的孵育时间为3.6秒；图3-B的孵育时间为12.6秒；图3-C的孵育时间为32.6秒；图3-D的孵育时间为62.6秒）；
图4是本申请中实施例二中含有网织红细胞样本检测散点图，图中根据前向散射光和荧光强度差异划分出红细胞、网织红细胞、血小板、成熟白细胞分布区域；成熟白细胞类群进一步可以划分为中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞区域；
图5是本申请中实施例三含幼稚粒细胞的血液样本检测散点图，图5-A为前向散射光-侧向荧光二维散点图，成熟白细胞荧光前方为幼稚粒细胞分布区域；图5-B为侧向散射光和侧向荧光二维散点图，成熟白细胞荧光前方为幼稚粒细胞区域，具有高的侧向散射光信号；
图6是本申请中实施例四含原始细胞的血液样本检测散点图，图6-A为前向散射光-侧向荧光二维散点图，原始细胞分布类群分布在较成熟白细胞荧光信号低的区域；图6-B为侧向散射光和侧向荧光二维散点图，原始细胞分布在侧向散射光相对低的区域，具有较低的侧向散射光信号；
图7是本申请中实施例五含网织红细胞、幼稚粒细胞和原始细胞的血液样本的经前向散射光、侧向散射光和侧向荧光信号检测结果图，图7-A为前向散射光-侧向荧光二维散点图，幼稚粒细胞、原始细胞分布类群分布在较成熟白细胞荧光信号低的区域；图7-B为侧向散射光和侧向荧光二维散点图，幼稚粒细胞较原始细胞具有更高的侧向散射光信号；
图8是本申请中实施例六中含有网织红细胞的样本检测结果与镜检结果对比散点图，两组结果相关性系数R为0.99。
具体实施方式
定义
除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
本文中使用的术语“烷基”，无论是单独使用还是与其他基团结合使用，指包含1-18、优选1-12,、更优选1-6个碳原子的直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“正丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。例如，“C1-6烷基”包括C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其他基团。
本文中使用的术语“烷基醇”是指至少一个羟基与上述定义的“烷基”结合的醇，该“烷基”包括直链烷基和支链烷基，该“烷基醇”可包含一个或多个羟基。例如，本文中的C1-6烷基醇包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇等。
本申请中的血细胞检测试剂和试剂盒，其检测目标为血细胞，该血细胞包括红细胞、白细胞和血小板，其中红细胞包括成熟红细胞（无核红细胞）和网织红细胞，白细胞包括成熟白细胞和未成熟白细胞，其中未成熟白细胞主要包括幼稚粒细胞和原始细胞。适用于本申请的待测样品具体包括但不限于血液样品、骨髓样品和体液等。
现有技术中对上述血细胞的检测，通常情况下需通过针对不同血细胞的特性而特制的试剂来进行分类检测，因此，不同血细胞的检测，特别是红细胞和白细胞的检测，往往需要对待测样品用不同试剂处理，检测而得到该样品的不同血细胞的分类检测结果。而本申请通过对各类血细胞的细胞膜结构差异的深入研究，并经过反复实验发现：采用包括荧光染料、球形化组分和有机醇的试剂对血细胞进行处理时，如果保持各类血细胞细胞膜基本完整的情况下，带正电荷的荧光染料进入细胞的速率不一致，荧光染料对细胞的染色效果和速度不同，未成熟细胞染色速度和程度低于成熟细胞。通过检测侧散射荧光信号的强弱就可以将未成熟细胞和正常细胞进行有效的区分。该荧光染料对细胞内核酸物质具有很强的信号响应，而正常红细胞中并不含有核酸物质，利用其对网织红细胞内核酸的染色，可以将其和正常红细胞进行有效的区分。因此，本申请提供的试剂中含有荧光染料、少量球形化组分和有机醇，球形化组分能够使血细胞球形化（尤其是红细胞球形化），保持红细胞膜的完整且不对白细胞的内部结构产生破坏作用；有机醇组分，提高网织红细胞膜的通透性并协助荧光染料进入细胞，提高染色效率。本申请公开的试剂中的荧光染料、球形化试剂和有机醇的共同使用时彼此之间产生相互协同的作用，使得细胞的膜通透性增加的同时，不破坏血细胞细胞膜的完整性，使得网织红细胞、成熟白细胞和未成熟白细胞等细胞的染色程度不同。本申请的试剂不对白细胞的内部结构产生破坏作用，有利于保持各类白细胞的散射光信号的差异。将待测样品与该试剂混合一定时间再通过光学检测，利用各类细胞产生的散射光和荧光信号的差异，即可实现对不同血细胞，尤其是对未成熟白细胞和网织红细胞的同时检测。采用本申请公开的检测试剂进行检测时，一种试剂即可完成多细胞的检测，更能反映接近生理状态的细胞信息，并极大的节省了检测成本，提升了检测速度，降低了仪器的复杂性。
本申请中还提供了一种血细胞检测试剂盒，其包括荧光染料、球形化组分和有机醇。在该试剂盒中，各组分（荧光染料、球形化组分和有机醇）可作为单一包装的形式存在，也可将某一组分和其他组分分开包装，作为两个包装的形式存在。例如，荧光染料既可溶解于有机溶剂中与球形化组分、有机醇分开包装（保存），也可直接与球形化组分和/或有机醇混合包装（保存），而球形化组分与有机醇也可混合或各自独立包装（保存），只要在使用时，将三种组分混合使用即可。而使用前三种组分以何种形式包装或保存于试剂盒中，并不影响其在使用时的功能。因此，具体的，该试剂盒可采用：（1）该试剂盒可包括第一染色液和第一球形化缓冲液。其中，该第一染色液包括荧光染料，该第一球形化缓冲液包括球形化组分。同时，在该第一染色液和/或该第一球形化缓冲液中还含有有机醇。（2）该试剂盒也可包括第二染色液、第二球形化缓冲液和第二试剂。其中，第二染色液包括荧光染料，该第二球形化缓冲液包括球形化组分，该第二试剂包括有机醇。（3）该试剂盒还可包括：第一试剂和第二试剂。其中，第一试剂包括荧光染料和球形化组分，该第二试剂包括有机醇。使用上述试剂盒进行检测时，将上述试剂盒中的各试剂混合在一起使用即可。具体的，（1）将第一染色液与第一球形化缓冲液混合使用；（2）将第二染色液、第二球形化缓冲液和第二试剂混合使用；（3）将第一试剂和第二试剂混合使用。
具体的，本申请中采用的荧光染料是一种红色激发荧光染料，用于标记网织红细胞、未成熟白细胞和成熟白细胞等细胞中的核酸物质（DNA、RNA），通过配合使用的球形化组分和有机醇，可以在不损伤细胞的情况下，实现对细胞内核酸物质的标记。其中，本申请中所采用的染色网织红细胞、白细胞等的荧光染料能够与细胞中的核酸物质结合并呈现荧光增强，其选自于申请号为200810002503.7的中国专利中所公开的荧光染料化合物，该染料具有如下结构通式I：
其中，
R1和R2各自独立选自H、OH、C1-18烷基、C1-6烷基OR5、C1-18烷基磺酸基、苯基或卤素；
R3和R4各自独立选自C1-6烷基COOR6、C1-6烷基OR6、苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基任选取代；
R5为H或C1-6烷基；
R6为C1-6烷基或者苯基，所述苯基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基任选取代；
X为C(CH3)2、O、S或Se；
Y-为负离子，优选卤素离子、ClO4 -、PF6 -、CF3SO3 -、BF4 -、乙酸根或对甲苯磺酸负离子；
n为1、2或3。
上述具有通式I结构的荧光染料化合物的具体结构可如以下的荧光染料A、荧光染料B、荧光染料C。关于荧光染料A、荧光染料B、荧光染料C的合成方法，在申请号为200810002503.7的中国专利中有详细的记载。
上述荧光染料对样品染色的合适浓度范围在0.002ppm到2000ppm，更优浓度范围为0.01ppm到1000ppm。保存或存放时，可将该荧光染料溶于有机溶剂。对于有机溶剂没有特殊限制，一般常见的有机溶剂如甲醇、乙醇、乙二醇、二甲亚砜等均可。
本申请中采用的球形化组分能球形化红细胞，保持红细胞膜完整且不对白细胞的内部结构产生破坏作用，能够消除由于红细胞形状带来的检测误差。该球形化组分在检测试剂中以引起红细胞系细胞等体积球形化且对细胞不产生损伤的适宜浓度使用，能够加快荧光染料对网织红细胞及白细胞等的染色速度。本申请中的球形化组分可选自两性表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂等，优选阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和两性表面活性剂中的至少一种。其中两性表面活性剂如磺基甜菜碱、烷基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱等均可，例如椰油酰胺甜菜碱（十二烷基二甲基甜菜碱）、椰油酰胺丙基甜菜碱和十四烷基酰胺丙基甜菜碱等；阳离子表面活性剂如季铵盐型、吡啶嗡盐型表面活性剂，例如十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵（CTAC）、氯化十二烷基三甲基铵（LTAC）、溴化辛基三甲基铵（OTAB）、溴化癸基三甲基铵（DTAB）、十四烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十六烷基氯化吡啶鎓盐等均可；阴离子表面活性剂如有机羧酸盐类、有机磺酸盐类、有机磷酸盐类、有机硫酸化物等，具体如十二烷基羧酸及其盐、邻苯二甲酸及其盐、柠檬酸及其盐、十二烷基磺酸及其盐、十二烷基苯磺酸及其盐、牛磺胆酸及其盐、十二烷基硫酸及其盐等均可；非离子表面活性剂如脂肪酸甘油酯、多元醇类、聚氧乙烯型非离子表面活性剂，如脂肪酸单甘油酯、脂肪酸二甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯、聚山梨酯、聚氧乙烯脂肪酸脂、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯酚醚、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物等，例如聚氧乙烯（40）硬脂酸脂、聚氧乙烯（20）油酸脂、聚氧乙烯（23）十二烷基醇醚、聚氧乙烯（20）十六烷基醇醚、壬基酚聚氧乙烯醚（或Triton X-100）、普朗尼克68等合适，另外常见的商品化非离子表面活性剂也适用，如司盘类（Spans）、吐温类（Tweens）、Triton类、卖泽类（Myri）、苄泽类（Brij）等均可。对于上述表面活性剂的种类来说，基于公知包括但不限于以上物质种类。本申请所用的表面活性剂浓度范围，由于所用物质不同而不同，同时可以一种表面活性剂成分单独使用，也可以多种表面活性剂成分混合使用，以使细胞球形化并且对细胞不产生损伤的浓度为宜，浓度优选1mg/L-4g/L，更优选1mg/L-100mg/L。具体可以通过试验得出最优化的使用浓度。
本申请中采用的有机醇，可采用具有以下结构通式Ⅱ的醇类或C1-6烷基醇中的至少一种。其中，结构通式Ⅱ的醇类如下所示：
其中，n为2到8的正整数；
R1为C1-6烷基、卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基或羧基。
上述具有通式II结构的有机醇化合物可以是苯氧乙醇、苯氧丙醇等化合物，也可以是对苯环进行烷基取代以及卤素取代后得到的苯氧乙醇类似化合物，如4-溴苯氧乙醇、4-氰基苯氧乙醇、3-乙基苯氧丁醇等。
上述C1-6烷基醇具体可包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇等。
本申请中所使用的有机醇的优选浓度范围为0.1g/L到50g/L，更优浓度范围为1g/L到30g/L。
本申请中的试剂和试剂盒中可含有使pH值保持稳定的缓冲液。使用缓冲液使得进行检测时反应体系的pH值保持稳定，由此可稳定血细胞的染色效果。缓冲液的种类，并不特别限定，常见的缓冲***如磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐类、邻苯二甲酸盐类、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris）缓冲液、N-（2-乙酰胺）亚氨基二乙酸（ADA）缓冲液、哌嗪-N,N-双（2-乙磺酸（PIPES）缓冲液、N,N-双（2-羟乙基）-2-氨基乙磺酸（BES）缓冲液、N-三（羟甲基）甲基-2-氨基乙磺酸（TES）缓冲液、3-（N-***啉）乙磺酸（MOPS）缓冲液、2-羟基-3-（N-***啉）乙磺酸（MOPSO）缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液等都可以用于本申请。适用于本申请试剂的合适pH值，因具体采用的荧光染料的使用浓度不同而有所不同，以保持细胞结构稳定且荧光染色合适为宜，一般pH值在5.0～11.0范围，优选pH值在7～10之间。另外本申请中的试剂和试剂盒中可以进一步包含凯松等防止细菌生长的抑菌成分。
本申请的检测试剂和试剂盒中，还可以含有渗透压调节剂，其可增加细胞的通透性。进行检测时，适用于本申请试剂的渗透压范围在150mOsm/kg到700mOsm/kg。本申请的渗透压调节剂无特殊限制，可以使用无机盐、有机酸碱金属盐等盐类；也可以使用葡萄糖、甘露糖等糖类；同时也可以使用甘氨酸、色氨酸等氨基酸类。
本申请还提供了一种血细胞处理方法，将本申请中提供的试剂与待测样品混合反应，即荧光染料、球形化组分和有机醇与待测样品混合（孵育），得到处理后的样品。处理时，混合（孵育）时间基于以下原理或原则为宜：（1）球形化试剂对血细胞不会造成损伤并能够使幼稚粒细胞、原始细胞和成熟白细胞在荧光强度上产生明显差异；（2）能染色网织红细胞内的核酸物质，使网织红细胞和成熟红细胞区分开。适用于本申请中的处理方法的混合时间可选5秒至60秒，优选20秒至50秒范围。具体的，可根据试剂中各组分的用量的不同，通过实验调节血细胞与试剂的混合（孵育）时间，得出最佳的混合时间。
同时，本申请还提供了一种血细胞识别方法，该方法包括：在进行上述血细胞处理方法后的样品，检测其荧光信号和至少一种散射光信号，记录检测结果以实现对样品中不同血细胞的识别。在本申请的一种具体实施方式中，该识别方法包括如下步骤：
（1）采集含有血液细胞的待测样本。可以通过手工方式定量吸取含有血液细胞的样本或者通过血液细胞分析仪的采样装置定量吸取含有血液细胞样本。
（2）将待测样本加入到本申请提供的试剂（包含荧光染料、球形化组分和有机醇）中，混合反应一段时间。反应可以在仪器外容器中进行，也可以在血液分析仪内反应池中进行。血样与本申请试剂的混合比例没有特别限制，但通常情况下采用待测样本（例如血样）与本申请试剂的体积比为1:50到1:1000的比例进行混合，优选1:200到1:500的比例。混合反应时间可选5秒至60秒，优选20秒至50秒范围。反应温度可选5℃至50℃范围，优选25℃至50℃。
（3）检测样本中各细胞粒子的荧光信号和至少一种散射光信号。使反应完成的含有待测样本和试剂的反应液通过流式检测仪，通过激光流式法检测各细胞粒子的荧光信号和至少一种散射光信号，散射光信号包括前向散射光信号和侧向散射光信号。前向散射光可反映细胞的形态和大小信息，侧向散射光可反映细胞内部结构信息。本申请所采用的激光流式法可以参考图1所示光学检测***模式，其中包括：半导体激光1，荧光2，前向散射光3，侧向散射光4，流动室5，第一光学透镜6，第二光学透镜7。激光器光源的选择可以选择同所使用的荧光染料激发波长相适应的激光器。
（4）对血细胞进行分类识别。基于采集的荧光信号和至少一种光散射信号信息，分别作出前向散射光强度-侧向荧光强度二维散点图和侧向散射光强度-侧向荧光强度二维散点图，分别如图2中图2-A和图2-B所示。在图2-A中，试剂处理后的不同种类细胞的形态大小差异导致前向散射光信号差异，试剂处理后的不同种类细胞荧光染色程度不同导致荧光信号差异，在前向散射信号和荧光信号的二维图形中，由于荧光信号和前向散射信号的差异，红细胞、网织红细胞、血小板、幼稚粒细胞、原始细胞和成熟白细胞分布在不同的区域，并得以区分。在图2-B中各个细胞类群分别出现在图示红细胞、血小板、幼稚粒细胞、原始细胞和成熟白细胞等区域。由于幼稚粒细胞比原始细胞具有更复杂的细胞内部结构，因此幼稚粒细胞比原始细胞具有更强的侧向散射光信号，结合图2-A的结果，幼稚细胞与其它细胞类群能够更有效的区分。
进一步的，通过对各区域内的散点分类和计数，可得到网织红细胞占总红细胞的百分比，以及幼稚粒细胞或原始细胞的检测结果和信息。
下面通过实施例结合附图对本申请作进一步详细说明。
本申请中，检测网织红细胞所采用的传统手工镜检方法为新亚甲蓝染色法，见参考文献——Methods for Reticulocyte Counting(Automated Blood CellCounters,Flow Cytometry,and Supravital Dyes)网织红细胞计数方法（H44-A2）。
本申请中，白细胞分类检测所采用的传统手工镜检方法为瑞氏－姬姆萨染色法，见参考文献——Reference Leukocyte(WBC)Differential Count(Proportional)and Evaluation of Instrumental Methods,白细胞分类计数参考方法和仪器评价方法》标准。
以下各实施例中的荧光染料A、荧光染料B、荧光染料C请参看上文。
实施例一
配制如下组成的血细胞细胞检测试剂A：
pH为7.5，渗透压为642mOsm/kg。
将新鲜抗凝血4μL（该抗凝血经传统手工镜检，该血样中含有网织红细胞和未成熟白细胞）加入到上述的1mL检测试剂A中，在温度保持42℃的条件下，分别混合孵育3.6秒、12.6秒、32.6秒和62.6秒后用激光流式法（激发波长633～635nm）检测细胞。
采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，采用测定前方低角度1-10度散射光测定细胞的前向散射光强度信息。前向散射光强度和侧向荧光强度所形成的的二维散点图，如图3的图3-A、图3-B、图3-C和图3-D所示（图3-A的孵育时间为3.6秒；图3-B的孵育时间为12.6秒；图3-C的孵育时间为32.6秒；图3-D的孵育时间为62.6秒）。从图中可以看出，随着孵育时间的延长，白细胞群的荧光强度逐渐增加并逐渐超出检测范围，当孵育时间为32.6秒时，网织红细胞、未成熟白细胞和成熟白细胞具有较为理想的分群效果。
实施例二
配制如下组成的血细胞检测试剂B：
pH为7.9，渗透压为229mOsm/kg。
将新鲜抗凝血4μL（该抗凝血经传统手工镜检，该血样中含有网织红细胞）加入到上述的1mL检测试剂B中，在温度保持40℃的条件下，混合30秒后用激光流式法（激发波长633～635nm）检测细胞。
采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，采用测定前方低角度1-10度散射光测定细胞的前向散射光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息。
在前向散射光强度及荧光强度信号所形成的二维散点图上通过计算网织红细胞分布区域的粒子数占成熟红细胞与网织红细胞区域粒子数的百分比来计算网织红细胞的比例，结果如图4所示，比正常红细胞具有更强荧光信号的为网织红细胞，其中网织红细胞（RET）在总红细胞中所占的比例为1.37%。同时进一步的，图4显示成熟白细胞可以划分为中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞等三个类群。
采用传统手工镜检法的镜检结果网织红细胞在总红细胞中所占的比例为1.58%。采用上述血细胞检测试剂B处理后经仪器检测的结果与手工镜检结果一致性较好。
实施例三
配制如下组成的血细胞检测试剂C：
pH为9.1，渗透压为274mOsm/kg。
将新鲜抗凝血4μL（该抗凝血经传统手工镜检，该血样中含有幼稚粒细胞）加入到上述的1mL检测试剂C中，在温度保持42℃的条件下，混合27秒后用激光流式法（激发波长633～635nm）检测细胞。
采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，采用测定前方低角度1-10度散射光测定细胞的前向散射光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息。在前向散射光强度和侧向荧光强度所形成的二维散点图5-A中低于成熟白细胞荧光信号强度的区域为幼稚粒细胞细胞分布区域，且在侧向散射光强度及侧向荧光强度信号所形成的二维散点图5-B中幼稚粒细胞分布在复杂度相对高的区域。通过图示区域对幼稚粒细胞和成熟白细胞进行计数分类，其中幼稚粒细胞（IG）在总白细胞中所占的比例为85.3%。采用传统手工镜检方法检测，结果幼稚粒细胞（IG）在总白细胞中所占的比例为91.5%。采用上述血细胞检测试剂C处理后经仪器检测的结果与手工镜检结果一致性好。
实施例四
配制如下组成的血细胞检测试剂D：
pH为10.0，渗透压为579mOsm/kg。
将新鲜抗凝血4μL（该抗凝血经传统手工镜检，该血样中含有原始细胞）加入到上述的1mL试剂D中，在温度保持37℃的条件下，混合35秒后用激光流式法（激发波长633～635nm）检测细胞。
采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，采用测定前方低角度1-10度散射光测定细胞的前向散射光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息。在前向散射光强度和侧向荧光强度所形成的的二维散点图6-A中原始细胞分布于荧光强度低于白细胞、前向散射信号低于幼稚粒细胞类群的分布区域。图6-B显示了原始细胞在侧向散射光强度及侧向荧光强度信号所形成的二维散点图中的分布区域。通过图示区域划分原始细胞和成熟白细胞进行计数分类，其中原始细胞（Blast）在总白细胞中所占的比例为87.9%。
将相同血样采用传统手工镜检方法检测，结果原始细胞（Blast）在总白细胞中所占的比例为91%。采用上述血细胞检测试剂D处理后经仪器检测的结果与手工镜检结果一致性好。
实施例五
配制如下组成的血细胞检测试剂E：
pH为7.5，渗透压为642mOsm/kg。
将新鲜抗凝血4μL（该抗凝血经传统手工镜检，该血样中含有网织红细胞、幼稚粒细胞和原始细胞）加入到上述的1mL试剂E中，在温度保持42℃的条件下，混合27秒后用激光流式法（激发波长633～635nm）检测细胞。
采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，采用测定前方低角度1-10度散射光测定细胞的前向散射光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息。前向散射光强度和侧向荧光强度所形成的二维散点图、侧向散射光强度及侧向荧光强度信号所形成的二维散点图，如图7-A和图7-B所示。图7-A显示了样本网织红细胞、白细胞、幼稚粒细胞、原始细胞的类群分布。图7-B显示原始细胞和幼稚粒细胞在侧向散射光信号上可以更好的区分。通过图中区域对网织红细胞、幼稚粒细胞和原始细胞进行计数分类，网织红细胞在总红细胞中所占比例为1.24%，幼稚粒细胞（IG）和原始细胞（Blast）在总白细胞中所占的比例分别为57.8%和5.6%。
将相同血样采用传统手工镜检方法检测，结果网织红细胞在总红细胞中的比例为1.38%，幼稚粒细胞（IG）和原始细胞（Blast）在总白细胞中所占的比例分别为66%和6.5%。采用上述血细胞检测试剂E处理后经仪器检测的结果与手工镜检结果一致性好。
实施例六
一种血细胞检测试剂盒F，该试剂盒F由以下的染色液Ⅰ和球形化缓冲液Ⅱ组成：
染色液Ⅰ
荧光染料A 10mg
乙二醇 1L
球形化缓冲液Ⅱ
pH为9.3，渗透压为309mOsm/kg。
取20支新鲜抗凝血（该抗凝血经传统手工镜检，该血样中含有网织红细胞），按照下述方法对其进行分类计数。
将上述新鲜抗凝血4μL和20μL染色液Ⅰ加入到980μL的球形化缓冲液Ⅱ中，在温度保持40℃的条件下，混合30秒后用激光流式法（激发波长633～635nm）检测细胞。
采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，采用测定前方低角度1-10度散射光测定细胞的前向散射光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息。在前向散射光强度及荧光强度信号所形成的二维散点图所示区域对网织红细胞和红细胞进行计数分类，并与传统手工镜检结果进行对比，如图8所示，采用上述试剂盒F中的试剂处理后经仪器检测的结果与手工镜检结果的相关性系数为0.99，具有良好的相关性。
实施例七
一种血细胞检测试剂盒G，该试剂盒G由以下的染色液Ⅰ和球形化缓冲液Ⅱ组成：
染色液Ⅰ
荧光染料B 10mg
乙二醇 1L
球形化缓冲液Ⅱ
pH为7.3，渗透压为237mOsm/kg。
取10支新鲜抗凝血（该抗凝血经传统手工镜检，该血样中含有幼稚粒细胞和/或原始细胞），按照下述方法对其进行分类计数。
将上述新鲜抗凝血4μL和20μL染色液Ⅰ加入到980μL的球形化缓冲液Ⅱ中，在温度保持37℃的条件下，混合35秒后用激光流式法（激发波长633～635nm）检测样本。
采用测定角度为90度的侧向荧光测定细胞的荧光强度信息，采用测定前方低角度1-10度散射光测定细胞的前向散射光强度信息，并采用测定角度为90度的侧向散射光测定细胞的侧向散射光强度信息。在前向散射光强度和侧向荧光强度、侧向散射光强度及侧向荧光强度信号所形成的二维散点图上通过图2所示的类群分布区域对幼稚粒细胞和/或原始细胞进行计数分类，并和传统手工镜检结果进行比较，所得结果如表1所示，采用上述检测试剂盒G中的试剂处理后经仪器检测的结果与手工镜检结果具有良好的一致性。
表1是本发明实施例七中含幼稚粒细胞和/或原始细胞血液样本检测结果与镜检结果。
表1
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
Claims (12)
1.一种血细胞检测试剂，其特征在于，所述试剂包括：
荧光染料，所述荧光染料具有细胞通透性，且可以对细胞内核酸物质特异性染色；
球形化组分，所述球形化组分能够球形化红细胞，保持红细胞膜完整且不对白细胞的内部结构产生破坏作用；
有机醇，所述有机醇能够增加细胞通透性，协助所述荧光染料进入细胞。
2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述荧光染料具有如下结构通式I：
其中
R1和R2各自独立选自H、OH、C1-18烷基、C1-6烷基OR5、C1-18烷基磺酸基、苯基或卤素；
R3和R4各自独立选自C1-6烷基COOR6、C1-6烷基OR6、苄基，所述苄基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基任选取代；
R5为H或C1-6烷基；
R6为C1-6烷基或者苯基，所述苯基由卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基任选取代；
X为C(CH3)2、O、S或Se；
Y-为负离子，优选卤素离子、ClO4 -、PF6 -、CF3SO3 -、BF4 -、乙酸根或对甲苯磺酸负离子；
n为1、2或3。
3.如权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述的荧光染料选自以下荧光染料A、荧光染料B或荧光染料C：
4.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述球形化组分为表面活性剂，所述表面活性剂选自阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和两性表面活性剂中的至少一种。
5.如权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述表面活性剂的浓度为1mg/L-4g/L，优选1mg/L-100mg/L。
6.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述有机醇为具有如下结构通式Ⅱ的醇类或C1-6烷基醇中的至少一种；
其中
n为2到8的正整数；
R1为C1-6烷基、卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基或羧基。
7.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂的pH值范围选自5.0-11.0。
8.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂的渗透压范围选自150-700mOsm/kg。
9.一种血细胞处理方法，其特征在于，所述方法包括：
将待测样品与荧光染料、球形化组分和有机醇混合，得到处理后的样品；
所述荧光染料具有细胞通透性，且可以对核酸物质特异性染色；所述球形化组分能够球形化红细胞，保持红细胞膜完整且不对白细胞的内部结构产生破坏作用；所述有机醇能够增加细胞通透性，协助所述荧光染料进入细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述混合的时间为5到60秒，优选20-50秒。
11.一种血细胞识别方法，所述方法包括：
（1）将含有血细胞的待测样品与权利要求1-8中任一项的试剂混合反应，使待测样品中的红细胞球形化，保持红细胞膜完整且不破坏白细胞的内部结构，对细胞内部核酸物质进行荧光染色，所述血细胞中含有网织红细胞和未成熟白细胞；
（2）检测所述血细胞荧光信号和至少一种散射光信号，根据检测结果同时识别出网织红细胞和未成熟白细胞。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述混合反应的时间为5到60秒，优选20-50秒。
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