JPH07501527A - 修飾されたピリミジンを含有するオリゴマーを使用する増強された三重らせんおよび二重らせんの成形 - Google Patents

修飾されたピリミジンを含有するオリゴマーを使用する増強された三重らせんおよび二重らせんの成形

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １２２、核酸を増幅するための方法であって、請求の範囲第１項記載のオリゴマ ーと標的核酸を含むサンプルとを混合し；前記オリゴマーを前記標的核酸により ハイブリダイズし；そして 前記標的核酸をＰＣＲ又はＬＣＲにより増幅する段階を含んで成る方法。
１２３、核酸を増幅するための方法であって、請求の範囲第３項記載のオリゴマ ーと標的核酸を含むサンプルとを混合し；前記オリゴマーを前記標的核酸により ハイブリダイズし；そして 前記標的核酸をＰＣＲ又はＬＣＲにより増幅する段階を含んで成る方法。
１２４、前記オリゴマーがアンチセンスオリゴマーである請求の範囲第１項記載 のオリゴマー。
１２５、前記オリゴマーがアンチセンスオリゴマーである請求の範囲第３項記載 のオリゴマー。
Ｉ２６．前記オリゴマーが三重らせん状オリゴマーである請求の範囲第１項記載 のオリゴマー。
１ｚ７．前記オリゴマーが三重らせん状オリゴマーである請求の範囲第３項記載 のオリゴマー。
浄害（内容に変更なし） 明細書 修飾されたピリミジンを含有するオリゴマーを使用する増強された三重らせんお よび二重らせんの成形 技術分野 本発明は、一般にヌクレオモノマーおよびオリゴマーの類似体、および−水路ま たは二本鎖の核酸標的配列へのオリゴヌクレオチドの類似体の結合によるオリゴ ヌクレオチドに基づく治療および診断に関する。さらに詳しくは、本発明は、あ る種の５−置換ピリミジン塩基の残基を含有するオリゴマーおよびそれらの合成 における中間体に関する。
背景の技術 一本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡおよび二重らせんＤＮＡの両者へのオリゴヌクレオチ ドの配列特異的結合は実証された。一本鎖標的への結合のために適当な配列の認 識はよく知られている：二重らせんの成形のＡ−ＴおよびＧ−Ｃ対成形の特性は 、ＤＮＡの複製および転写のための基礎として確立された。
より最近、オリゴヌクレオチドは配列特異的な方法で二重らせんＤＮＡに結合し て三重らせんを成形することが示された。一本鎖核酸、主としてＲＮＡは、「ア ンチセンス」のメカニズムにより遺伝子の発現を阻害するために使用されるオリ ゴヌクレオチドのための標的分アンチセンスのオリゴヌクレオチドは、相補的Ｒ ＮＡ配列とハイブリダイゼーションすることによって、標的遺伝子の発現に対し て作用を発揮すると推定される。このモデルにおいて、ハイブリッドのＲＮＡ− オリゴヌクレオチドの二重らせんは、プロセシング、翻訳および代謝回転を包含 するＲＮＡの代謝の１または２以上の面を妨害する。化学的に修飾されたオリゴ ヌクレオチドは、それらのヌクレアーゼ安定性を増強するために使用されてきて いる。
二重らせんＤＮＡは、認識可能なヌクレオモノマーの配列に基づくオリゴマーに より特異的に認識されることができる。２つの主要な認識のモチーフが認識され た。ｒ　ＣＴＪモチーフの初期の説明において、プロトン化シトシン残基はＧ− Ｃ塩基対を認識するが、チミン残基は二重らせんにおいてＡ−Ｔ塩基対を認識す る。これらの認識いる。より最近、「ＧＴＪ認識と呼ばれる追加のモチーフが記 載され（ＥＰ）公開第３７５４０８号）。Ｇ−Ｔモチーフにおいて、Ａ−Ｔ対は アデニンまたはチミンにより認識された、モしてＧ−Ｃ対はグアニン残基により 認識される。
これらの結合のモチーフの両者において、オリゴマーの認識配列は二重らせんの プリン鎖の相補的配列と整列しなくてはならない：こうして、例えば、Ａ−Ｔ対 のチミンによる認識は二重らせんのプリン鎖に沿ったアデニル残基の位置に依存 する。前述の例外はＧｒｉｆｆｉｎ、　Ｌ、Ｃ０ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８ ９）　２４５　：　９６７−９７１による最近の報告であり、すなわち、制限さ れた数のグアニン残基はピリミジンに富んだオリゴマー内に提供されそしてチミ ン−アデニン塩基対を特異的に認識することができる；これは少なくとも制限さ れた数のピリミジン残基のホモプリン標的の中への封入を可能とする。
２つのモチーフは、二重らせんの中のホモプリン標的鎖に関して反対の結合の向 きを示す。ＣＴモチーフにおいて、ターゲツティングオリゴヌクレオチドは標的 プリンに富んだ配列に対して平行である：ＧＴモチーフにおいて、オリゴヌクレ オチドは逆平行の向きである（Ｂｅａｌ、　Ｐ、　Ａ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（ １９９０）　２５１　：　１３６０−１３６３）。
ハイブリダイゼーションの１）Ｆｌが増加するにつれて、ＣＴモチーフの巾のＣ 残基により結合の効率は減少する。Ｃ（Ｃ”　）のプロトン化互変異性体はフー グスイーン（ｌｌｏｏｇｓ　ｔｅｅｎ）結合における結合の競争種であるが、生 理学的ｐＨにおいて低いレベルで存在するのみである。
これは４．２５であるシトシンのｐＫ、と一致する。塩基の類似体、例え３７６ ４　；国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１１０８８１１号）、シュードイソンチジ ン（Ｏｎｏ、　Ａ、　ら、Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、　（１９９２）　５７　 ：　３２２５−３２３０　；国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９０１０３２７５号） または炭素環式シチジン（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ、Ｂ、Ｃ，ら、Ｊ、　Ａｍ、Ｃｈｅ ｍ、Ｓａｃ、（１９９２）　１１４　：　８３２０−８３２２　、米国特許出願 第０７／８６４．８７３号、引用によってここに加える）は、拡張されたｐＨ範 囲にわたってＣＴモチーフの結合を得るために利用されてきている。
一本鎖および二重らせんの両者の標的配列は、診断、分析、および治療において 応用を有する。このような結合を実施すべきある環境下において、生ずる二重ら せんまたは三重らせんを長期間にわたって可溶化することは有利である。
標的へのオリゴマーの共有結合の架橋は、可溶化を延長する１つのアプローチを 提供する。共有結合の架橋を伴う一本鎖ＤＮＡの配列特異的認識は、いくつかの グループについて報告された。例えば、Ｖｌａｓｓｏｖ、　Ｖ、Ｖ、ら、Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８６）　１４：　４０６５−４０７６は 、−末鎖ＤＮＡ断片と標的配列に対して相補的なヌクレオモノマーのアルキル化 誘導体との共有結合を記載している。同一グループによる同様な研究の報告は、 Ｋｎｏｒｒｅ、　Ｄ、　Ｇ、ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ　（１９８５）　６７：７ ８５−７８９により報告である。１ｖｅｒｓｏｎおよびＤｅｒｖａｎは、また、 切断を活性化することができる修飾されたヌクレオモノマーの組み込みマー配列 に対して相補的なアルキル化剤を使用する標的ヌクレオモノマーへの共有結合の 架橋を実施している。プソラレンにより仲介される一本鎖オリゴヌクレオチドへ の光活性化架橋は、Ｌｅｅ、　Ｂ、　Ｌ。
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９８８）　２７：　３１９７−３２０３に より開示された。三重らせん成形プローブにおける架橋の使用は、また、Ｈｏｒ ｎｅら、Ｊ、　Ａｗ＋、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　（１９９０）　１１層２４５ ３−２４３７に開示された。
−水路および二本鎖のオリゴマーへの架橋に対するアルキル化剤としてＮ’、Ｎ ’−エタノシトシンの使用が、また、記載されたまた、誘導されたシトシンを含 有するオリゴヌクレオチドの合成をエタノアデニンを含有するオリゴマーの合成 および一本鎖ＤＮＡへのオリゴヌクレオチドの結合の場合におけるこの残基の架 橋の性質を記載している。
Ω四Ａ）　（１９８８）肋：　１３４９−１３５３は、−水路および二本鎖の両 者のＤＮＡへの光活性化可能な架橋剤に接合したオクタチミジレートの配列特異 的結合を記載している。
さらに、Ｖｌａｓｓｏｖ、　Ｖ、　Ｖ、ら、Ｇｅｎｅ　（１９８８）　３１３− ３２２およびＦｅｄｏｒｏｖａ＋　Ｏ，Ｓ、ら、ＦＢＢＳ　（１９８Ｂ）　２２ ８　：　２７３−２７６は、オリゴヌクレオチドの５′−リン酸塩を介して連鎖 したアルキル化剤を使用する二重らせんＤＮＡのターゲツティングを記載してい る。
プリン残基が標的の１つの鏡上に濃縮され、次いで反対の鏡上に濃縮される場合 を提供するに、三重らせんを得るための結合を実施するとき、逆転した極性のオ リゴマーを得ることができる。「逆転した極性Ｊとは、オリゴマーが反対の極性 を有する配列、すなわち、プール５′→３′を有する配列、次いで極性３’−５ ’をもつ配列、あるいはそのその逆である直列の配列を含有することを意味する 。
これが意味するように、これらの配列は、効果的に３’−３’インタ一ヌクレオ シド接合（しかしながら、連鎖は達成される）、あるいは効果的に５’−５’ヌ クレオシド接合と考えることができる連鎖により接合される。このようなオリゴ マーは、Ｃａｐｏｂｉｏｎｃｏ、　Ｍ、　Ｌ。
ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９９０）　１８二２６６１−２ ６６９により、環状オリゴヌクレオチドを得るための反応の副生物として示唆さ れた。３′＝３′逆位または５’−５’を使用してへＴ連鎖を固定するヘアピン を成形するようにデザインされた「平行の鎖のＤＡＮ　Ｊの組成物は、ｖａｎ　 ｄｅ　５ａｎｄｅ、　Ｊ、　Ｈ，ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８８）　２４１　 ：　５５１−５５７により合成された。さらに、３’−３’連鎖を含有するオリ ゴマーを使用する三重らせんの成形が記載された（Ｈｏｒｎｅ、　Ｄ、　Ａ、お よびＤｅｒｖａｎ、　Ｐ。
Ｂ、、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　（１９９０）　１１２：　２４３ ５−２４３７　；　Ｆｒｏｅｈｌｅｒ、　Ｂ。
Ｃ１ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９９２）　３１　：　１６０３−１６ ０９）。
標的遺伝子の発現を阻害する手段として三重らせん（またはトリプレックス）複 合体後の使用は、従来提示された（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８９１０５７６ ９号）。三重らせん構造は標的遺伝子の発現を妨害することが示され（国際特許 出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１１０９３２１号；　Ｙｏｕｎｇ。
Ｓ、　Ｌ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、（１９９１）　 ８８：　１００２３−１００２６）、このアプローチの可能性を実証する。
欧州特許出願公開第９２１０３７１２．３号、Ｒａｈｉｉ＋、　Ｓ、　Ｇ、ら（ ＡｎｔｉｖｉｒａｌＣｈｅｍ、　Ｃｈｍｏｔｈｅｒ、　（１９９２）　３：　２ ９３−２９７）、および国際特許出願第ＰＣＴ／５Ｅ９１１００６５３号は、５ −位置における不飽和基の存在により特徴づけられるピリミジンヌクレオモノマ ーを記載している。プロピニルおよびエチニル基は、前記特許出願に記載されて いる５−位置における誘導体の中に含まれる。
ウラシルの５−位置に不飽和アルキル基を有するヌクレオモノマ５２−１２５７ ）。５−プロピニル修飾ピリミジンを含有するオリゴマーは５−プロピニル−２ ′−デオキシウリジン、５−ブチニル−２′−デオキシウリジンおよび関係する 化合物の５′−トリホスフェートへの変換および引き続く大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ ｉ）ポリメラーゼによるこのモノマーのオリゴマーへの組み込みは記載された（ Ｖａｌｋｏ、　Ｋ、　ら、ルの５−位置の１系列の置換基を有するヌクレオチド 類似体の活性の分析について実施された。大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ポリメラー ゼのための基質としてのヌクレオチド類似体の活性は検査され、そしてモノマー の疎水性のような特性と相関関係づけられた。この類似体を含有するオリゴマー の性質に関する情報は提示されながった。
欧州特許出願公開第０４９２５７０号（１９９２年７月１日公開）は、一本鎖ポ リヌクレオチドのプローブを使用して標的ポリヌクレオチドを検出する方法を記 載しており、ここで挿入分子をリンカ−により結合し、そしてこのリンカ−は少 なくとも３個の炭素原子および塩基に関してアルファ位置に二重結合を含む。
ＰＣＴ特許出願Ｗ０９２１０２２５８号は、５または６位置に置換基、例えば、 フェニルを含む、ヌクレアーゼ耐性の、ピリミジン修飾オリゴマーを記載してい る。５−フェニル−２′−デオキシウリジンは引き続いてオリゴマーの中に組み 込まれ、そして−水路および二本鎖の両者の標的配列についてこの修飾を含有す るオリゴマーの結合アフィニティーを減少することが示された。
アミダイトおよび水素ホスホネートの化学を介するＤＮＡ合成は記載された（米 国特許第４．７２５．６７７号；米国特許第４．４１５．７３２号；米国特許第 ４．４５８．０６６号；米国特許第４．９５９．４６３号）。
相補的標的核酸配列に対して増強されたアフィニティーを有するオリゴマーは、 診断の応用、治療の応用および研究の試薬のための改良された特性を有するであ ろう。こうして、相補的配列に対して増強された結合アフィニティーをもつオリ ゴマーが要求されている。
本発明のオリゴマーは、二本鎖および／または一本鎖の標的配列に対して改良さ れた結合アフィニティーを有する。
図面の簡単な説明 １、本発明の塩基を含有する２量体のシントン。
２、本発明の塩基を含有しかっ５および６構成員のりポアセクール型連鎖を含有 する２量体のシントン。
３、本発明の塩基を含有しかっ６および７構成員のりボアセチル型連鎖を含有す る２量体のシントン。
４．２’−０−アリル修飾を含有するモノマーの合成。
５．０−キシレンスィッチバック２量体の合成（合成法＃ｌ）。
６．２’−３−アルキル修飾を含有するモノマーの合成。
７．３′−チオフォルムアセクール連鎖により連鎖された２量体の合成（方法＃ ２）。
８．３′−チオフォルムアセタール連鎖により連鎖された３量体の合成（方法＃ ２）。
９、リボアセクール連鎖により連鎖された２量体の合成（方法＃３）。
１０、アミダイトまたはトリエステル化学を介するオリゴマーの合成のためのカ ップリング基。
１１、ホルムアセタール連鎖により連鎖された２量体の合成（方法＃２）。
１２、（１）水素ホスホネート、（２）アミダイト化学および（３）メチルホス ホネート誘導体によりオリゴマーの合成（方法＃ｌ）。
１３、アミド連鎖を含有するオリゴマーのためのモノマーの合成（方法＃４）。
１４、　５−（（１−エチニル）−２ピリミジニル）−２′−デオキシウリジン のヌクレオモノマーの合成。
１５．５−（２−ピリミジニル）−２′−デオキシウリジンおよび５−（２−ピ リミジニル）−２′−デオキシシチジンのヌクレオモノマーの合成。
１６．５−（２−チェニル）−２′−デオキシウリジン誘導体の合成。
１７、アミド置換基の連鎖；反復ヌクレオモノマーの単位および例示のアミド連 鎖オリゴマーの構造を含有するオリゴマー。
１９、本発明の塩基および例示の２’、５’連鎖；チオホルムアセタールおよび カルバメートの連鎖を含有する２量体のシントン。
構造式 ここに記載する構造式は、括弧内の数字Ｈ：１）、（２）など）発明の開示 本発明は、少なくとも２つ、好ましくは多数のヌクレオモノマーからなるオリゴ マーを提供し、ここで少なくともｌっのヌクレオモノマーは式（１）または（２ ）の塩基からなる：式中、 Ｘは独立にＯまたはＳであり、 Ｒ２は塩基に結合した炭素原子に接続した少なくとも１つのｐｉ結合からなる基 であり、そして Ｐ「は（Ｈ）、または保護基であり、 ただし前記オリゴマーの前記ヌクレオモノマーの少なくとも１つが、ビニル、１ −ブテニル、ｌ−ペンテニル、ｌ−へキセニル、ｌ−へブテニル、ｌ−オクテニ ル、１−プロピニル、ｌ−ブチニル、■−へキシニル、ｌ−へブチニル、または ｌ−オクテニルにより５−置換されたデオキシウリジンからなるとき、前記オリ ゴマーを構成するヌクレオモノマーの残部はホスホジエステル連鎖した２′−デ オキシアデノシン、２′−デオキシグアノシン、２′−デオキシシチジン、チミ ジンまたはそれらの組み合わせのみから構成されない。
」 次の定義は、以後においていっそう完全に定義する用語の簡単な摘要である。
ヌクレオモノマー。ここにおいて使用するとき、用語「ヌクレオモノマー」は、 （２）第２部分に共有結合で連鎖した（１）塩基からなる部分を意味する。ヌク レオモノマーはヌクレオシドおよびヌクレオチドを包含する。ヌクレオモノマー は連鎖して、配列特異的な方法で核酸の中の標的または相補的塩基配列に結合す るオリゴマーを成形することができる。
「第２部分」は、ここにおいて使用するとき、糖部分の修飾を含有する種、例え ば、ヒドロキシル基の１または２以上がハロゲン、複素原子、脂肪族基で置換さ れているか、あるいはエーテル、アミンなどとして官能化されている種を包含す る。ペントース部分はヘキソースまたは別の構造、例えば、シクロペンタン環、 ６−構成員のモルホリノ環などにより置換されることができる。ヌクレオシドは 、ここにおいて定義するとき、また、遊離のカルボキシル基および／または遊離 アミノ基および／またはそれらの保護された形態を有するアミノ酸および／また はアミノ酸類似体に連鎖した塩基を包含することを意図する。
賓蒸。「塩基」は、ここにおいて使用するとき、既知のプリンおよびピリミジン の複素環および本発明のピリミジンばがりでなく、かつまた複素環およびそれら の互変異性体を含有する部分を包含する。プリンは、アデニン、グアニンおよび キサンチンを包含し、そして例示のプリン類似体は８−オキソ−Ｎ６−メチルア デニンおよび７−ジアザキサンチンを包含する。ピリミジンは、ウラシルおよび シトシンおよびそれらの類似体、例えば、５−メチルシトシン、５−メチルウラ シルおよび４，４−エタノシトシンを包含する。本発明の塩基は、５−位置にお いて誘導されたピリミジンである。誘導体は、ｌ−アルケニル、ｌ−アルキニル 、複素芳香族および１−アルキニル−複素芳香族の修飾体である。ｒｌ−アルケ ニル」はオレフィン系の不飽和の（二重結合を含有する）非環式基を意味する。
「ｌ−アルキニル」は、アセチレン系不飽和の（三重結合を含有する）アシル基 を意味する。「複素芳香族」は、少なくとも１つの複素環式環、５または６環原 子を有し、物理的および化学的性質が類似する化合物、例えば、芳香族基を有す る化合物を意味する。「複素芳香族ｊは、また、２環式部分、例えば、ベンズイ ミダゾール、ベンゾトリアゾール、ベンゾキサゾールおよびインドールを包含す る、ｌまたは２以上の環を有する系を意味する。塩基は、また、複素環、例えば 、２−アミノピリミジンおよびトリアジンを包含する。
ｌ−アルキニル−複素芳香族は、ｌ−エチニル−へチオロアリールを意味し、こ こでヘテオロアリールは上に定義した通りである。
ヌクレオシド。ここにおいて使用するとき、「ヌクレオシドＪは糖または糖類似 体に共有結合しかつホスファイトまたはホスフィンを含有することができる塩基 を意味する。用語ヌクレオシドは、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシ ド、あるいは塩基のＮ−グリコシドまたはＣ−グリコシドである他のヌクレオシ ドを包含する。糖炭素の立体化学は、Ｄ−リボースのそれ以外であることができ る。
ヌクレオシドは、糖部分の修飾を含有する種、例えば、ヒドロキシル基の１また は２以上がハロゲン、複素原子、脂肪族基で置換されているか、あるいはエーテ ル、アミン、チオールなどとして官能化されている種を包含する。ペントース部 分はヘキソースまたは別の構造、例えば、シクロペンタン環、６−構成員のモル ホリノ環などにより置換されることができる。ヌクレオシドは、ここにおいて定 義するとき、また、遊離のカルボキシル基および／または遊離アミノ基および／ またはそれらの保護された形態を有するアミノ酸および／またはアミノ酸類似体 に連鎖した塩基を包含することを意図する。
ヌクレオチド。ここにおいて使用するとき、「ヌクレオチド」は、ホスフェート 基またはホスフェート類似体を有するヌクレオシドを意味する。
糖の修飾。ここにおいて使用するとき、「糖の修飾」は２′−デオキシリボース 以外の任意のペントースおよびヘキソースの部分を意味する。修飾された糖は、 Ｄ−リボース、２′−〇−アルキル、２′−アミノ、２′−ハロ官能化ペントー ス、ヘキソースなどを包含する。Ｄ−リボースの立体化学以外の立体化学を有す る糖も包含オモノマーに共有結合的にカップリングするホスホジエステル部分（ −０−Ｐ　（０）（０）−０−）を意味する。
置換連鎖。ここにおいて使用するとき、「置換連鎖」は、隣接するヌクレオモノ マーに共有結合的にカップリングする自然のホスホジエステル基の任意の類似体 を意味する。置換連鎖は、ホスホジエステル類似体、例えば、ホスホロチオエー トおよびメチルホスホネートおよび非リン含有連鎖、例えば、アセタールおよび アミドを包は、逆の極性の少なくとも１つの領域を有するオリゴマーを意味する 。スイッチバッグオリゴマーは、また、二重らせんの反対の鎖に結合して、二重 らせんの両者の鏡上に三重らせんを成形することができる。逆の極性の領域を接 合するリンカ−は置換連鎖である。
オリゴマー。オリゴマーは、ここにおいて、連鎖または置換連鎖の部分により互 いに共有結合的にカップリングした２またはそれ以上のヌクレオモノマーとして 定義される。こうして、オリゴマーは２程度に少ないヌクレオモノマー（２量体 ）を有することができる。
オリゴマーは受容的に結合することができ、こうして、同族の一本鎖または二本 鎖の核酸配列と塩基対になることができる。オリゴマー（例えば、２量体〜ヘキ サマー）は、また、ここに記載するより長いオリゴマーのためのシントンとして 有用である。オリゴマーは、また、非塩基部位およびシュードヌクレオシドを含 有することができる。
ブロッキング基。ここにおいて使用するとき、「ブロッキング基」は、保護基、 合成のためのカップリング基、ｐｏｉ−’、または他の普通の接合体、例えば、 固体の支持体として、オリゴマー１六はヌクレオモノマーに共有結合されている Ｈ以外の置換基を呼ぶ。あう、「ブロッキング基］は、スラックン学術用語に従 い、保護基としてのみと解釈を意図するばかりでなく、かつまた、例えば、カッ プリング基、例えば、水素ホスホネートまたはホスホアミダイトを包含する。
保護基。「保護基」は、ここにおいて使用するとき、それが結合する０原子また はＮ原子が反応または結合に参加することを防止できる任意の基を意味する。ヌ クレオモノマーの中のＯおよびＮ原子のためのこのような保護基は記載されてお り、そしてそれらの導入方法は普通にこの分野において知られている。保護基は 、また、カルボン酸、チオールなどにおける反応および結合を防止する。
カップリング基。「カップリング基」は、ここにおいて使用するとき、ヌクレオ モノマーの間で連鎖または置換連鎖、例えば、水素ホスホネートまたはホスホア ミダイトを発生するために適当な任意の基を意味する。
接合。「接合」は、ここにおいて使用するとき、オリゴマーに末端またはオリゴ マーそれ自体内で結合する基を任意の意味する。接合は、固体の支持体、例えば 、シリカゲル、調節された孔のガラスおよびポリスチレン；標識、例えば、蛍光 、化学発光、放射線、酵素の部分およびリポータ−基；オリゴマーの輸送剤、例 えば、ポリカチオン、血清タンパク質および糖タンパク質およびポリマーなどを 包含する。
ｐｉ結合。ｒｐｉ結合」は、ここにおいて使用するとき、不飽和の共有結合、例 えば、二重結合または三重結合を意味する。両者の原子は、炭素であることがで きるか、あるいは一方は炭素でありそして他方は窒素であることができ、例えば 、フェニル、プロピニル、シアノなどであることができる。
シントン。「シントン」は、ここにおいて使用するとき、既知のまたは便利な合 成操作により成形および／またはアセンブリングすることができる分子内の構造 単位を意味する。
トランスフェクション。「トランスフェクション」は、ここにおいて使用すると き、オリゴマーの細胞の中への増大された送り出しのために適当な方法を呼ぶ。
発明の説明 修飾された塩基（１）または（２）のいずれかまたは両者を包含するオリゴマー は、それぞれ、−水路ＲＮＡまたはＤＮＡまたは二重らせんの標的配列との二重 らせんまたは三重らせんの成形において増強された結合能力を示す。
前述のある種の５＝置換ピリミジンが存在するとき、追加のヌクレオモノマーの 修飾は後述するように広く変化することができる。
好ましくは、追加の修飾は少なくとも１つの置換連鎖または糖の修飾、例えば、 ２′−置換デオキシリボースである。
本発明の塩基（１）または（２）の置換、例えば、ＤＮＡ二重らせんをターゲツ ティングするオリゴマーの中のチミンリードアウトシトシンのための５−（１− アルケニル）−１５−（ｌ−アルキニル）−１５−（Ｉ−複素芳香族）−または ｌ−アルキニル−複素芳香族で置換された塩基は、増強された結合アフィニティ ーをもつ結合受容オリゴマーを提供する。本発明の５−置換ウラシルまたはチオ ウラシル塩基の残基によりチミン塩基の残基についての置換あるいは本発明の５ −置換シトアン塩基の残基によるシトシンまたは２−チオシトシン塩基の残基に ついての置換は、生ずるオリゴマーの一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ標的への結合の 能力を増強する。さらに、５−置換ピリミジン塩基の残基のいくつかは二本鎖Ｄ ＮＡとの三重らせんの成形を有意に増強する。
いくつかのＲ２について、オリゴマーの中のＴについての５−Ｒ２置換Ｕ　（５ −Ｒ２−Ｕ）の置換は、チミンを含有するオリゴマーと比較したとき、三重らせ んおよび二重らせんを成形する増強された能力を生ずる。これらのオリゴマーに おける５−Ｒ２−Ｕは、三重らせんの成形において、平行のＣＴ三重らせんのモ チーフにおいてハイブリダイゼーションするとき、アデニン−チミン塩基対の中 のアデニン残基を認識する。８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン（三重らせんの 結合のためのシトシン類似体）および５−Ｒ２−Ｕを有するオリゴマーは、また 、ＣＴモチーフにおいて結合する。５−Ｒ”−Ｕおよびグアニンを有するオリゴ マーは、ＣＴモチーフを介する二重らせん配列への三重らせんの結合のために適 当である（５−Ｒ”　−Ｕはアデニンを認識する）。Ｃの代わりに５−Ｒ２−Ｕ 置換Ｃ（５−Ｒ２−Ｃ）の置換を含有するいくつかのオリゴマーは、二重らせん ＤＮＡに結合するが、対応する位置に５−メチルシトシンを含有する対照のオリ ゴマーはどよく結合しない。三重らせんの形動率の減少は、置換された塩基のｐ Ｋ＋の減少から主として生ずると信じられる。５−メチルシトシンを含有するヌ クレオモノマーに相当する５−プロピニル置換ヌクレオモノマーにおいてｐＫ、 はわずかに３．３ｏである。
こうして、本発明のオリゴマーは、生理学的ｐｔ＋の条件下に標的ＤＮＡ二重ら せんの主溝における結合により、種々の標的配列、例えば、腫瘍遺伝子またはウ ィルスの中に見いだされるものと三重らせんを成形することができる。
しかしながら、５−Ｒ２−Ｃについて前述したようにヘテロサイクルのｐＫ、の 変更は、−水路の標的核酸への結合に有意に影響を与えない。Ｔの代わりに５− Ｒ２置換Ｕおよび／またはＣの代わりに５−Ｒ２置換Ｃを含有する本発明のオリ ゴマーは、二本鎖標的配列に効率よく結合することに加えて、また、−水路ＲＮ Ａに効率よく結合することが発見された。５−Ｒ’　−Ｃまたは５−Ｒ”　−Ｕ を含有するオリゴマーは、後述するように対照オリゴマーにより形成された二重 らせんに比較して、増加した熱安定性（Ｔ、）を有した相補的−水路ＲＮＡと二 重らせん構造を形成した。
したがって、１つの面において、本発明は、少なくとも１つのヌクレオモノマー が上の式（１）または（２）の塩基からなる、少なくとも２つ、好ましくは多数 のヌクレオモノマーからなるオリゴマ−に関する。
好ましくは、各ＸはＯである、すなわち、式（１）はウラシルであり、そして式 （２）はシトシンである。他の適当なピリミジンは、４−チオウラシル、２−チ オウラシル、２．４−ジチオウラシルおよび２−チオシトシンを包含する。
本発明の１つの態様において、Ｒｔはシアノ、Ｃｔ−＋ｔｌ−アルケニルまたは ｌ−アルキニルであるか、あるいは環原子の１〜３つがＮ、ＳまたはＯである５ 〜６環原子を含有するＣ２−＋２複素芳香族基である。好ましくは、Ｒ２はＣｔ −５ｌ−アルケニルまたはｌ−アルキニルあるいは１つの環原子がＮでありそし て必要に応じて第２の環原子がＮ、ＳまたはＯである５〜６環原子を含有するＣ 　ｚ−ｓ複素芳香族基である。
「ｌ−アルケニル」とは、オレフィン系不飽和の非環式基、例えば、ビニル、■ −プロペニル、■−ブテニルを意味し、必要に応じてハロゲンまたはアルキニル 基により置換されていてもよい。
［Ｉ−アルキニルＪとは、アセチレン系不飽和の非環式基、例えば、エチニル、 ■−プロピニル、■−ブチニル、ｌ−ペンチニル、１．３−ペンタシイニルなど を意味し、必要に応じてアリールまたはヘテロアリール基により置換されていも よく、例えば、フェニルエチニル、ピリジン−エチニル、ピリミジン−エチニル 、トリアジン−エチニル、チオフェン−エチニル、チアゾール−エチニルおよび イミダゾール−エチニルである。
［複素芳香族ｊとは、物理的および化学的性質が類似する化合物を有する少なく とも１つの複素環を有する化合物、例えば、１〜３つの環原子がＮ、Ｓまたは０ である、５〜６環原子および２〜１２炭素原子の芳香族基、例えば、２−ピリミ ジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル、２−チアゾイル、トリアジニル 、２−イミダゾリル、２−オキサシリル、２−ピリジニル（０−ピリジニル）、 ３−ピリジニル（ｍ−ピリジニル）、４−ピリジニル（ｐ−ピリジニル）、２− チェニル、２−フラニル、２−ピロリルであり、必要に応じて好ましくは環Ｃ上 で酸素、１〜４炭素原子のアルキルまたはハロゲンにより置換されていてもよい か、あるいは環Ｎ上で１〜４炭素原子のアルキル置換されていてもよい。ヘテロ アリール基上の好ましい置換基は、メチル、エチル、トリフルオロメチル、およ びブロモである。
好ましいオリゴマーは、ｌまたは２以上の５−Ｒ”　−Ｕまたは５−Ｒ’　−Ｃ 塩基を含有する。
本発明の他の態様において、オリゴマーは式（１）または（２）の少なくとも１ つの塩基からなり、ここでＸは独立にＯまたはＳである；そしてＲ２はフェニル エチニル、２−．３−１および４−ピリジン−エチニル、２−９４−および５− ピリミジン−エチニル、トリアジン−エチニル、２−１４−および５−ピリミジ ニル、２−１４−１および５−チアゾリル、■−メチルー２−イミダゾリル、２ −および４−イミダゾリル、２−１４−および５−オキサジノル、３−ピリジニ ル、４−ピリジニル、２−ピリジニル、２−および３−フラニル−エチニル、２ −および３−チェニル−エチニル、２−および４−イミダゾリル−エチニル、ｚ −１４−および５−チアゾイル−エチニル、２−９４−および５−オキサシリル −エチニル、２−および３−ピロリル−エチニル、２−および３−チェニル、２ −および３−フラニル、２−および３−ピロリル、プロペニル（−Ｃ）ｌ＝　Ｃ Ｈ−ＣＨＩ）、ビニルおよび＝ＣヨＣ−Ｚ　（ここでＺは水素（Ｈ）またはＣＩ −１゜アルキル、ハロアルキル（１〜６）１０ゲン原子をもっＣ１−５゜または ヘテロアルキル（０，ＮおよびＳから成る群より選択されるｌ〜３複素原子をも つＣ１−１゜）である）から成る群より選択される；そして Ｐｒは（Ｈ）２または保護基である。
−ｃ＝ｃ−ｚの例は、ｌ−プロピニル（−Ｃ＝　ｃ−Ｃ１１，）、３−ブテン− １−イニル（−ＣＨＣＣＨ＝　ＣＬ）、３−メチル−１−ブチニル（Ｃ＝Ｃ−Ｃ Ｉ（（ＣＨＩ）２）、３．３−ジメチル−１−ブチニル（−Ｃ＝ＣＣ（Ｃ１ｌｓ ）＊）、Ｉ−ブチニル（−Ｃ＝Ｃ−Ｃ１，−Ｃｌ５）、１．３−ペンタジェニル （−（ｊＣ−Ｃ−：Ｃ−ＣＨＩ、）およびエチニルを包含する。
好ましいハロゲンは、フッ素、塩素および臭素から成る群より選択される。ブロ モビニルを含む置換基をオリゴマーの中に含めることができる。
本発明の１つの面は、ヌクレオモノマー、２つの連鎖しｔこヌクレオモノマー（ ２量体）、３つの連鎖したヌクレオモノマー（３員体）、４つの連鎖したヌクレ オモノマー（４量体）、５つの連鎖したヌクレオモノマー（５ｌ体）または６つ の連鎖したヌクレオモノマー（６ｌ体）を本発明のより長いオリゴマーの合成に お０て中間体として使用することを包含する。
他の面において、本発明は前述のオリゴマーを一本鎖またＣよ二本鎖の核酸標的 に結合することによって得られた二重らせんまた番ま三重らせんに関する。
本発明の合成における他の有用な本発明は、構造式（５）を有するＯ−キジロン ２量体を包含する； 式中、各Ｙは独立にオリゴマーまたはＲ’である；そして各Ｂは独立に塩基であ るが、ただし少なくとも１つのＢは式（１）または（２）の塩基であり、ここで Ｒｔはここにおいて定義した通りである。
また、第１図に示す式（６）の中間体が含まれ、式中Ｘは０およびＳから成る群 より選択される；そして各Ｙ、Ｂ、およびＲ３は独立に選択されそしてここにお いて定義する意味を有する。
本発明のオリゴマーは、また、ＣＴまたはＧＴ三重らせん結合のモチーフを介す るＤＮＡ二重らせん標的への結合のために適当である。
本発明の新規なオリゴマーは、アンチセンスの治療（ここでオリゴマーは選択さ れた相補的ＲＮＡ配列と）１イブリダイゼーシヨンする）または三重らせんの治 療（ここでオリゴマーは選択した相補的ＤＮＡ配列とハイブリダイゼーション） において有用である。
本発明は、また、本発明の式（１）または（２）の少なくとも１つの塩基の正の 修飾および負の修飾からなり、各々が相補的核酸配列に対して相補的なオリゴマ ーの結合アフィニティーに関する、オリゴマーに関する。正の修飾は、結合アフ ィニティーに関して加法的より多い程度に負の修飾に反作用する。
本発明の１つの面は、修飾をもたないオリゴデオキシヌクレオチドに関するヌク レアーゼの分解に対して耐性であるオリゴマーに本発明の塩基を含めることであ る。本発明のヌクレアーゼ耐性は、ヌクレアーゼが存在する条件下に有利に使用 される。ある種の応用、例えば、アンチセンスメカニズムを介する遺伝子の発現 の修飾のために、本発明のオリゴマーのヌクレアーゼ安定性はオリゴマーの重要 な機能的面である。
本発明の他の面は、本発明のオリゴマーからなる薬剤組成物、試薬およびキット 、状態、例えば、癌およびウィルスなどを処置する方法に関する。このような状 態は、特定の核酸、例えば、ＤＮＡ二重らせんまたは一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ に関連するか、あるいはそれらにより特徴づけられる。
本発明の追加の面は、生物学的（または他の）試料の中の特定の一本鎖ＲＮＡま たはＤＮＡまたは特定の標的二重らせんの存在、不存在または量を、本発明のオ リゴマーを使用して検出して、選択した核酸配列を置換方法を包含する。このよ うな配列は新形成の増殖、ウィルスまたは疾患の状態に関連させることができる 。本発明のオリゴマーを含有する試薬およびキットは、（ｉ）組織培養における 細胞の増殖を包含するｉｎ　ｖｉｔｒｏの細胞の中の遺伝子の発現を変調するた めに、および（２）標的配列を検出しおよび／または定量するために有用な試薬 としてのオリゴマーの円滑な使用を可能とする、本発明の面を表す。
本発明のオリゴマーのいくつかは、本発明の５−置換をもたない未修飾のオリゴ マーに比較して、相補的−水路および二本鎖の核酸配列に関して増強された結合 特性を有することが発見された。三重らせん構造体は、未修飾の対照オリゴマー が効率に劣る、７．０およびそれより高い生理学的レベルのｐＨにおいて成形す ることができる。
改良された二重らせんの成形がまた認められる。
本発明の特徴は、本発明のオリゴマーが種々の異なる配列から構成することがで き、これにより種々の異なる一本鎖または二本鎖の標的配列をターゲツティング するために使用できることである。
本発明の１つの利点は、生理学的ｐＨの条件下に三重らせんを成形できることで ある。
チミンまたはシトシンを含有するオリゴマーと比較して、本発明の５−Ｒ”ｆｉ 換ウラシルまたはシトシン塩基（１）または（２）を含有するオリゴマーの他の 面は、親油性基（Ｒ２）が細胞の透過または吸収を増強できるということに示す 。これらの塩基を含有するヌクレオモノマーは、逆相ＨＰＬＣ上の保持時間に基 づいて、ウリジン、シチジンまたはチミジン塩基よりいっそう親油性である。
追加のヌクレオモノマーの修飾 ヌクレオモノマーから構成された生物は、本発明の５−修飾ピリミジンに加えて 修飾をまた含有することができる。このような追加の修飾の非限定的例は、（ｉ ）ｌまたは２以上のヌクレオモノマー残基が２′位置において修飾されている、 （ｉｉ）　ｌまたは２以上の共有結合の架橋部分が組み込まれている、（市）逆 の極性のリンカ−が組み込まれている、（ｉ）置換連鎖かを含まれている、（ｖ ）他の塩基の類似体、例えば、８−オキソ−Ｒ６−メチルアデニンがを含まれて いる、および（ｖｉ　）接合体、例えば、それぞれ、核酸配列をターゲツティン グする結合アフィニティーを増強するか、あるいはオリゴマーと細胞とのアソシ エーションを増強する挿入剤またはポリリジンかを含まれている、オリゴマーを 包含する。
−水路および二本鎖の標的に対するオリゴマーのアフィニティーを増強する（正 の修飾）本発明の塩基（１）および（２）の５−置換の能力は、それらが含有さ れるオリゴマーのそれ以上の修飾を可能とする。これらのそれ以上の修飾は、ア フィニティーを減少するか、あるいはしないことがあるが、また他の有用な性質 、例えば、ヌクレアーゼの切断に対する安定性、細胞膜を透過する能力などを付 与する。それ以上の修飾（負の修飾）から生ずる結合アフィニティーの減少は、 ５−置換塩基（１）および（２）により付与される増強されたアフィニティーの ために許容される。こうして、本発明のとくに好ましいオリゴマーは、置換連鎖 および／または修飾された糖、ならびに本発明の５−置換塩基（１）および（２ ）を含有することができる。
オリゴマーは、また、これらの５−修飾ピリミジンを含有するヌクレオモノマー の中に、あるいはオリゴマーを構成する他のヌクレオモノマーの中に追加の修飾 を含有することができる。
ｌまたは２以上の置換連鎖、例えば、サルファイドまたはスルホン連鎖（Ｂｅｎ ｎｅｒ、　Ｓ、　Ａ、、国際特許公開第ＷＯ３９／　１２０６０号）、スルファ メート連鎖（国際特許公開第Ｗ０９１／１５５００号）、モルホリノ連鎖オリゴ マーの中のカルバメート連鎖（Ｓｔｉｒｅｈａｋ、　Ｅ、　Ｐ、ら、Ｎｕｃｌｅ ｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　（＋９８９）　１７　＋　６１２９−６１４１）お よび第１図に示す式（７）のモルホリノオリゴマーの中の関係する連鎖を含有す るオリゴマーは、また、包含され、式（７）においてＸ２はｃｏ、　ｃｓまたは ＳＯ２である；　Ｘ’　Ｌｔｄ、Ｓ、　ＮＨ，ＮＣ）＋８．　Ｃ）＋２．　ＣＦ ２マタ４；ｔｃＩＩＦ　テアル；　各Ｙハ独立にオリゴマーまたはＲ１，であり そしてＢは独立に選択されそして前に定義した意味を有するが、ただし少なくと も１つのＢは式（１）または（２）の塩基である。
リポアセタールまたは関係する連鎖、アミド連鎖および２’、５’連鎖は普通に 所有された係属中の米国特許出願第０７／８０６．７１０号、１９９１年１２月 １２日出願、米国特許出願第０７／８９９．７３６号、１９９２年１月２８日出 願、米国特許出願第０７／８９４．３９７号および米国特許出願第０７／８９２ ．９０２号（各々を引用によってここに加える）に記載されている。
リボアセクールおよび式（８〜１５）の関係する連鎖を含有する例示的２量体は 第２図および第３図に示されており、ここで各構造式Ｒ１およびＢは独立に選択 され、そして上に定義した意味を有する： Ｒ３は上に定義した意味を有する； Ｘ′はＯ，Ｓ、　ＮＨ，ＮＣＨ，、ＣＨ２，ＣＦ、またはＣＨＦから成る群より 独立に選択される； Ｘ′はＯ１乳ＳＯ，ＳＯ２，Ｃ＋１．、　ＣＦｔ、　ＣＳ、　ＮＨおよびＮＲ’ から成る群より独立に選択され、ここでＲ′は低級アルキル（Ｃ，、、メチル、 エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルまたはイソブチルである）である； Ｘ５はＯ，ＣＯ，Ｓ、　Ｃ１，、Ｃ３，ＮＨおよびＮＲ’から選択される：Ｘ＠ はＣＨ，Ｎ、　ＣＦ、　ＣＣ１，およびＣＲ’から成る群より選択され、ここて Ｒ１はメチルまたは低級アルキル（Ｃ２−υフルオロメチル、ジフルオロメチル 、トリフルオロメチルまたは低級フルオロアルキル（Ｃ２−１，Ｆ　＝−ｓ）で ある； Ｘ７はＯ，Ｓ、　ＣＨ２，ＣＯ，ＣＦ、およびＣＳから成る群より選択され、た だし少なくとも１つのＢが上に定義した式（１）または（２）を有する：そして さらにただし隣接するｘ’、ｘ’またはｘ７はＯ（すなわち、０−０−１過酸化 物）ではない。
５構成員の系列の化合物は、ｌまたは２以上のりボアセタール連鎖を含有するオ リゴマー（式（８）１式中Ｘ４はＯであり、そしてｘ”、ｘ’はＣＨ２であり、 そしてＸ　’ｈａＣＨである。
アミド結合を介して連鎖したヌクレオモノマー残基を含有するオリゴマーが、ま た、含まれる。例示的例は記載された（Ｍｉｅｌｓｅｎ、　Ｐ。
Ｅ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９１）　２５４　：　１４９７−１５００　； 普通に所有された同時係属米国特許出願第０７／８８９．７３６号、１９９２年 １月２８日出願、および米国特許出願第０７／８９４．３９７号、１９９２年６ 月５日出願（両者を引用によってここに加える）。
オリゴマー ここにおいて使用するとき「オリゴマー」は、　オリゴヌクレオチド、オリゴヌ クレオシド、ポリデオキシリボヌクレオチド（２′−デオキシ−ローリボースま たはその修飾された形態）、すなわち、ＤＮＡ　、ポリリボヌクレオチド（Ｄ− リボースまたはその修飾された形態）、すなわち、ＲＮＡ　、およびプリンまた はピリミジン塩基または修飾されたプリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシ ドまたはＣ−グリコシドの任意の他のタイプを包含する。オリゴマーは、ここに おいて使用するとき、また、隣接するヌクレオモノマーが従来記載されているよ うにアミド連鎖を介して連鎖した化合物を包含することを意図する（Ｎｉｅｌｓ ｅｎ、　Ｐ、　Ｅ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９１）　２５４　：　１４９７ −１５００）。本発明の塩基を含有するオリゴマーによる結合の増強された能力 は、主として塩基単独の機能であると信じられる。このために、オリゴマーの中 の通常見いだされる要素、例えば、フラノース環および／またはホスホジエステ ル連鎖は任意の適当な機能的に同等の要素で置換することができる。「オリゴマ ー」は、こうして、塩基のスカホールドまたは支持体として働く任意の構造体を 包含し、ここでスカホールドは配列依存性の方法で標的核酸への結合を可能とす る。現在知られているオリゴマーは、（ｉ）ホスホジエステルおよびホスホジエ ステル類似体（ホスホロチオエート、メチルホスホネートなど）の連鎖、（ｉｉ ）非リンのアイソスター（ホルムアセクール、リポアセクール、カルバメートな ど）を含有する置換連鎖、（ｉｉ）リボースまたはデオキシリボースの代わりに モルホリノ残基、炭素環式残基または他のフラノース糖、例えば、アラビノース またはヘキソースおよび（ｉｖ　）アミドを介して連鎖したヌクレオモノマーま たは任意の適当な置換連鎖を介して連鎖した非環式連鎖を有するとして特徴づけ ることができる４つのグループに定義することができる。
本発明のオリゴマーは本発明および普通のヌクレオモノマーを使用して成形する ことができ、そして標準の固相（または液相）オリゴマー合成技術（これらは現 在商業的に利用可能である）を使用して合成することができる。一般に、本発明 のオリゴマーは、工程：保護基を有するヌクレオモノマーまたはオリゴマーのシ ントンおよび塩基およびヌクレオモノマーまたはオリゴマーにカップリングする ことができるカップリング基を合成し；ヌクレオモノマーまたはオリゴマーのシ ントンをアクセプターのヌクレオモノマーまたはアクセプターのオリゴマーにカ ップリングし：保護基を除去し；そしてこのサイクルを必要に応じて所望のオリ ゴマーが合成されるまで反復する工程からなる方法により合成することができる 。
本発明のオリゴマーは、４０．５０または１００ヌクレオモノマーより大きい長 さを包含する長さを有することができる。一般に、好ましいオリゴマーは２〜３ ０ヌクレオモノマーを含有する。約８〜２０ヌクレオモノマーより大きいか、あ るいはそれに等しい長さは、治療および診断の応用のために有用である。２．３ ．４または５ヌクレオモノマーを含有する短いオリゴマーはシントンとして有用 である。
ランダム化した配列を有しかつ約６または７ヌクレオモノマーを含有するオリゴ マーは、ランダム配列のプライマーを使用するクローニングまたは増幅のプロト コールにおいて使用されるプライマーのために有用であるが、ただしオリゴマー はポリメラーゼまたは逆転写酵素として働くことができる残基を含有しなくては ならない。
オリゴマーは普通のホスホジエステル連鎖を含有することができるか、あるいは 置換連鎖、例えば、ホスホアミダイト連鎖を含有することができる。これらの置 換連鎖は、次の態様を包含するが、これらに限定されない；式−０−Ｐ　（０） （Ｓ）−０−（ｒホスホロチオエートＪ　）　、−０−Ｐ　（Ｓ）（Ｓ）　−０ −（ｒホスホロジチオエートＪ　）　、−０−Ｐ　（０）（ＮＲ’　、）−Ｘ− 、−０−Ｐ　（０）（Ｒ’　）−０−、−０−Ｐ　（Ｓ）（Ｒ”）−０−（ｒチ オアルキルホスホネート」）、−Ｐ　（０）（ＯＲ’）−Ｘ−、−０−Ｃ（０） −Ｘ−、または−０−Ｃ（０）（ＮＲ’　２）−Ｘ−、式中Ｒ′はＨ（または塩 ）またはアルキル（１−１２ｃ）であり、そしてＲ６はアルキル（１−９Ｃ）で あり、そして連鎖はヌクレオモノマーの炭素に結合した一〇−または−Ｓ−を通 して隣接するヌクレオモノマーに接合されている。ホスホロチオエートおよびホ スホジエステルの連鎖は第１２図に示されている。
とくに、本発明のオリゴマーにおいて使用するために好ましい置換連鎖は、ホス ホジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびチオノメチルホ スホネートの連鎖を包含する。ホスホロチオエートおよびメチルホスホネート連 鎖は、生理学的環境においてオリゴマーに追加の安定性を付与する。同一オリゴ マーの中のすべてのこのような連鎖は同定である必要はないが、とくに好ましい 本発明のオリゴマーは均一なホスホロチオエート連鎖または均一なメチルホスホ ネート連鎖を含有する。
製剤学的に許容されつる塩類 任意の製剤学的に許容されうる塩類を使用することができ、そしてこのような塩 酸形物質はこの分野においてよく知られている。
製剤学的に許容されつる塩類は、好ましくは前記本発明のオリゴマーの金属また はアンモニウム塩であり、そしてアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、例え ば、ナトリウム、カリウム、マグネシウムまたはカルシウム塩：あるいは有利に はアンモニアまたは有機アミン、例えば、モノ−、ジーまたはトリー低級（アル キル、シクロアルキルまたはヒドロキシアルキル（−アミン、低級アルキルアル キレンジアミンまたは低級（ヒドロキシアルキルまたはアリールアルキル）−ア ルキルアンモニウム塩基、例えば、メチルアミン、ジエチルアミン、トリエチル アミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、 トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノエタンまたはベンジルトリメチルアンモ ニウムヒドロキシドから誘導された容易に結晶化するアンモニウム塩を包含する 。本発明のオリゴマーは酸付加塩を形成し、これらは好ましくは治療的に許容さ れる無機または有機の酸、例えば、強い鉱酸、例えば、水素化水素酸、例えば、 塩酸または臭化水素酸；硫酸、リン酸；脂肪族または芳香族のカルボン酸または スルホン酸、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、リ ンゴ酸、酒石酸、グルコン酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、脂肪酸 、ヒドロキシマレイン酸、プルビン酸、フェニル酢酸、安息香酸、４−アミノ安 息香酸、アントラニル酸、４−ヒドロキシ安息香酸、サリチル酸、４−アミノサ リチル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ヒドロキシェタンスルホン酸 、ベンゼンスルホン酸、スルファニル酸またはシクロへキシルスルファミン酸な どの酸付加塩ここにおいて使用するとき、「ブロッキング基」は、保護基、合成 のためのカップリング基、ｐｏ、−”、または他の便利な接合体、例えば、固体 の支持体、標識、抗体、モノクローナル抗体またはその断片などとして、オリゴ マーまたはヌクレオモノマーに便利に力・ツブリングする、Ｈ以外の置換基を呼 ぶ。ここにおいて使用するとき、「ブロッキング基」はスラツジの記述用語に従 い保護基のみとして解釈を意図せず、また、例えば、カップリング基、例えば、 Ｈ−ホスホネートまたはホスホアミダイトを包含することを意味する。
「保護基」とは、それが結合するＯ原子またはＮ原子が反応または結合に参加す ることから保護することができる任意の基である。
ヌクレオモノマーの中の塩基部分上のＮ原子のためにこのような保護基およびそ れらの導入は、従来この分野において知られている。
適当な保護基の非限定的例は、ジイソブチルホルムアミジン、ベンゾイルなどを 包含する。０原子のために適当な「保護基」は、例えば、ＤＭＴ、　ＭＭＴ、　 またはＦＭＯＣである。
適当なカップリング基は、例えば、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホンアミダイ ト、またはホスホルアミダイトである。使用することができるホスホルアミダイ トは、β−シア人工チルホスホルアミダイト（好ましい）を包含する。また、メ チルホスホンアミダイト、アルキルホスホンアミダイト（エチルホスホンアミダ イトおよびプロピルホスホンアミダイトを包含する）を使用することができる。
例示的ホスホルアミダイトを第１０−１図および第１Ｏ−２図に示す。
適当な保護基は、５′末端におけるＤＭＴ（ジメトキシトリチル）、ＭＭＴ（モ ノメトキシトリチル）またはＦＭＯＣおよび／または３′末端における水素ホス ホネート、メチルホスホルアミダイト、メチルホスホンアミダイト、β−シアノ エチルホスホルアミダイトである。
匡！蒸 保護基、例えば、ジイソブチルホルムアミジン、ジアルキルホルムアミジン、ジ アルキルアセトアミジンまたはこの分野において知られている池の基を使用して 、シトシン複素環のエキソ環式窒素を保護できる。あるいは、シチジン前駆体は 保護基を使用しないでエキソ環式窒素において記載された方法によりオリゴマー の中に組み（１９９２）赳：　５８６９−５８７２）。エチニルへテロアリール 置換基としてＲ２を含有する塩基（１）および（２）を有するオリゴマーの合成 は、好ましくは、記載されているように５′−ヒドロキシル位置の保護のために ９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）を使用して達成される　（Ｌ ｅｈｍａｎ、　Ｃ，ら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８９）　１７ 　：２３７９−２３９０）。
好ましい保護基は、５′末端におけるＤＭＴ（ジメトキシトリチル）、ＭＭＴ（ モノメトキシトリチル）またはＦＭＯＣおよび／または３′末端における水素ホ スホネート、メチルホスホルアミダイト、メチルホスホンアミダイト、β−シア ノエチルホスホルアミダイトである。しかしながら、保護基の位置は必要に応じ て逆転することができることを意図する（例えば、５′−位置におけるホスホル アミダイトおよび３′−位置におけるＤＭＴ）。一般に、本発明のヌクレオモノ マーおよびオリゴマーは、関係する式において示すような「ブロッキング基」に この分野において知られている方法により誘導することができる。
カップリング基 適当なカップリング基は、例えば、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホンアミダイ ト、またはホスホルアミダイトである。使用することができるホスホルアミダイ トは、β−シアノエチルホスホルアミダイト（好ましい）を包含する。また、メ チルホスホンアミダイト、アルキルホスホンアミダイト（エチルホスホンアミダ イトおよびプロピルホスホンアミダイトを包含する）を使用することができる。
例示的ホスホルアミダイトを第１０−１図および第１Ｏ−２図に示す。
ここにおいて［アミダイトＪ化学と呼ぶ、ホスホルアミダイトトリエステル化学 を介するオリゴマーの合成のための３’、２’または５′位置において適当な「 カップリング基」は、Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピルアミノ−β−シアノエトキシホ スフィン、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ−メトキシホスフィン、Ｎ、Ｎ−ジエ チルアミノ−β−シアノエトキシホスフィン、（Ｎ−モルホリノ）−β−シアノ エトキシホスフィン、および（Ｎ−モルホリノ）−メトキシホスフィンを包含す る（もおれ、Ｍ、　Ｆ、ら、Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、　（１９８５）　５０ 　：５８５０　；　Ｄａｈｌ、　０．５ｕｌｆｕｒ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　（１９９ １）貝：　１６７−１９２）　。関係するカップリング基、例えば、Ｎ、　Ｎ− ジイソプロピルアミノ−メチル−ホスフィンまたはＮ、　Ｎ−ジエチルアミノ− メチル−ホスフィンを、また、メチルホスホネートの調整に使用できる（第１０ −４図）。
メチルホスホネートのオリゴマーは、カップリング基、例えば、Ｎ。
Ｎ−ジイソプロピルアミノ−メチルホスホンアミダイト、およびＮ。
Ｎ−ジエチルアミノ−メチルホスホンアミダイトを使用して普通の合成すること ができる。本発明のヌクレオモノマーのアミダイトは、普通の方法により達成す ることができる（例えば、Ｇｒｙａｚｎｏｖ、　Ｓ、　Ｍ。
ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（＋９９２）　２０　：　１８７９−１８ ８２　；　Ｖｉｎａｙａｋ、Ｒ，ら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９ ９２）　２０　：　１２６５−１２６９　；　５ｉｎｈａ、　Ｎ、Ｄ、ら、Ｎｕ ｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（＋９８４）　１２　：　４５３９−４５５７ 　；およびここにおいて引用する他の参考文献）。ここにおいて「トリエステル 」化学と呼ぶ、ホスフェートトリエステル化学を介するオリゴマーの合成のため の３’、２’　（または５′）位置における適当なカップリング基は、２−クロ ロフェニルホスフェート、４−クロロフェニルホスフェート、２．４−ジクロロ フェニルホスフェートおよび２．４−ジブロモフェニルホスフェートのヌクレオ チドジエステル誘導体あるいは、ホスホロチオエート連鎖の合成のために、それ らのチオノ誘導体を６７６０）。これらのカップリング基の構造は第１Ｏ図に示 されており、重量比Ｘは０またはＳであり、そして２１はＨまたは適当なベンゾ トリアゾールである。
オリゴマーまたはそれらのセグメントは便利に合成される。この分野において知 られているおよびここに記載する合成法を使用して、本発明の塩基、ならびにこ の分野において知られている他の塩基を含有するオリゴマーを、適当に保護され たヌクレオモノマーを使用して合成することができる（第１２図参照）。オリゴ マーの合成方法は、例えば、下記の文献に記載されている：　Ｆｒｏｅｈｌｅｒ 、　Ｂ、ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８６）　１４　： 　５３９９−５４６７　；　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　（１９８８ ）　１６　：　４８３１−４８３９　；　Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｎ ｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９８７）　６　：Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ ｅｒｓ　（１９８６）　２７　：　５５７５−５５７８　；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ 、　Ｍ、　Ｈ，、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｄｅｓ−Ａｎｔｉｓｅｎ ｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｓｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　（１９ ８９）、　Ｊ、　Ｓ、　Ｃｏｈｅｎ編、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　ＢｏｃａＲａｔｏ ｎ、ｐ７−２４　；　Ｒｅｅｓｅ、　Ｃ，Ｂ、ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌ ｅｔｔｅｒｓ　（１９８５）２６　：　２２４５−２２４８゜メチルホスホンア ミダイト化学を介するメチルホスホネート連鎖オリゴマーの合成は、また、記載 された（ＡｇｒａＷａｌ。
Ｓ、ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　（１９８７）　２８　：　 ３５３９−３５４２　；　ＫＩｅ＋ｎ、　Ｒ。
Ｅ、ら、国際特許公開筒ＷＯ９２／　０７８６４号）。
接合体 また、オリゴマーの「接合体」が含まれる。オリゴマーの［接合体ｊは、普通に この分野において認識されているものを包含する。
例えば、オリゴマーは種々の部分、例えば、挿入剤、およびＤＮＡ二重らせんの 小溝と特異的に相互作用する酢酸マグネシウムに共有結合的に連鎖することがで きる。他の選択される接合体の部分は、標識、例えば、放射性、蛍光性、酵素、 または切断リンカ−などを使用する細胞のアソシエーションを促進する部分であ ることができる。
適当な放射線標識は、＋２ｐ、　３−ｓ、　３　Ｈおよび１Ｃを包含し、そして 適当な蛍光性標識はフルオレセイン、リゾルフィン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ 　（分子のプローブ）およびテキサスレッドを包含する二適当な実施例はアルカ リ性ホスファターゼおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼを包含する。共有結 合的に連鎖した部分として使用できる他の化合物は、ビオチン、抗体または抗体 断片、トランスフェリンを包含し、そして旧ｖＴａｔタンパク質をまた本発明の オリゴマーに便利に連鎖することができる。
これらの追加の部分は任意の便利な連鎖を通して誘導体することができる。例え ば、挿入剤、例えば、アクリジンまたはプソラレンを、本発明のオリゴマーに、 オリゴマーの５′〜位置、ＲＮＡの２′−位置において任意の入手可能な−ＯＨ または一３Ｈを通して連鎖ことかできるか、あるいはＯＨ，Ｎｌ２．　Ｃ０ＯＨ またはＳＨをピリミジンの５−位置に挿入することができる。例えば、　ＣＨｚ ＣＨＪＨｔ、ＣＨｔＣＨ＊ＣＬＯ）１または−ＣＨ２ＣＨｚＣＨ＊ＳＨを含有す る誘導された形態は５−位置において好ましい。ポリリジンまたはリジンを含む 接合体は記載されているように合成することができ、そしてさらにオリゴマーの その標的核酸配列への結合アフィニティーを増強することができる（Ｌｅｍａｉ 　ｔｒｅ。
連鎖または置換連鎖を通して結合されたものを包含する、広範な種類の置換基を 結合することができる。オリゴマーの中の一〇Ｈ部分を、標準の保護基により保 護基されたホスフェート基、またはカップリングにより置換して他のヌクレオモ ノマーへの追加の連鎖を調製することができるか、あるいは接合された置換基に 結合することができる。５′末端のＯＨをリン酸化することができる。２’−Ｏ Ｈまたは３′末端における聞置換基をまたリン酸化することができる。
ヒドロキシル基を、また、標準の保護基に誘導することができる。
本発明のオリゴマーは、切断可能なリンカ−を使用する細胞のアソシエーンヨン を促進する部分に共有結合的に誘導することができる。このような接合体のため に使用するリンカ−は、オリゴマー−輸送剤の接合体が細胞の中に入った後、減 少するジサルファイド連鎖を含むことができる。適当な分子のリンカ−は、例え ば、　Ｙｌ−Ｘ”　Ｃ）１．ｃｌｌＲ’　−３Ｓ−Ｃ）ＩＲ’ＣＨ，Ｘ＠−Ｙ’ −を包含し、式中各Ｙ１は独立にアルキレン（Ｃ，−、；メチレン、エチレンお よびプロピレンを包含する）、またはＣＯであり、各Ｘｌは独立にＯ，Ｓ　（０ ）（０）。
Ｓ　（０）、　ＮＲ’、　Ｃ１＋２．Ｃ（Ｒ’）２またはＣＯである；Ｒ７ここ で各Ｒ７は独立にＨ１アルキル（ＣＩ−ｓ　；メチル、エチルおよびプロピルを 包含する）、アリールであり、そして前記リンカ−は従来記載された（ＷＯ９１ ／　１４６９６）。このタイプのジサルファイド含有リンカ−はｉｎ　ｖｉｖｏ のコントロール可能なｔ１７？を有し、プロドラッグ／輸送成分としてのその使 用を促進する。このようなリンカ−は、ジサルファイド連鎖のレドックス可能性 のために、細胞内の構成に関して細胞外条件下に安定である。
適当な接合体は、また、オリゴマー合成のためのおよび核酸配列の検出を促進す るための固体の支持体を包含する。固体の支持体は、シリカゲル、調節された孔 のガラス、ポリスチレン、および磁性ガラスピーズを包含するが、これらに限定 されない。
糖の修飾 糖上の置換により誘導体を作ることができる。本発明のオリゴマーの最も好まし い誘導体の中には、２′−〇−アリル誘導体が存在する。２′−〇−アリル基の 存在は、透過能力およびヌクレアーゼ分解に対する安定性を増強するように思わ れるが、−末鎖または二重らせんの標的に対するオリゴマーのアフィニティーを 減少するように思われない。
さらに、βアノマーについての方法に類似する方法であるが、逆の極性でＤＮＡ 二重らせんまたは一本鎖ＲＮＡにαアノマーは結合するので、オリゴマーはこの エピマーまたはそのドメインを有するヌクリミジンを含有するα−アノマーのオ リゴマーは、本発明に含まれる修飾されたオリゴマーの１つのクラスを表す。
置換連鎖 本発明のオリゴマーは、また、一般にこの分野において理解されているように、 ｌまたは２以上の「置換連鎖」を含有することができる。これらの「置換連鎖Ｊ は、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、チオノメチルホスホネート、ホ スホロジチオエート、リボアセタール、２’、５’連鎖、アルキルホスホネート 、モルホリノカルバメート、モルホリノスルファメートモルホリノスルファミド 、ボラノホスフェート（−〇−Ｐ　（ＯＣＨ３）（ＤＨ＋）−０−）　、シロキ サン（−０−３ｉ　（Ｘ’）　（Ｘ’）−０−；　Ｘ’はアルキルまたはフェニ ルである）およびホスホルアミダイト（メトキシエチルアミンなど）を包含し、 そして一般に入手可能文献およびその中に引用された参考文献に記載されている ように合成される（Ｓｏｏｄ、　Ａ、ら、Ｊ。
５、１４２．０４７号　；　Ｈｅｗｉｔｔ、Ｊ、Ｍ、ら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｓ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９９２）１１　：　１６６１−１６６ ６）。ここに開示するオリゴマーにおいて使用できる置換連鎖は、また、次のも のを包含する：スルホンアミド（−０−３Ｏ２−ＮＨ−）　、サルファイド（− ＣＨ２−３−ＣＨ，−）　、スルホネート（−０−５Ｏ□−ＣＨ２−）　、カル バメート（−０−Ｃ（０）−ＮＨ−１−ＮＨ−Ｃ（０）−０−）　、ジメチルヒ ドラジノ　（−ＣＨ，−ＮＣＨａ　ＮＣＨ＋　）　、スルファメート　（−０− ３（０）（０）−Ｎ−、−Ｎ−３（０）（０）−Ｎ−）　、３’−チオホルミア セタール（−３−ＣＨ２０）、ホルムアセクール（−０−ＣＨ，−０−）　、３ ’−アミン（−ＮＨ−Ｃ１２−ＣＨＩ２−）　、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン （−ＣＨ２−ＮＣＨ３−０−）および２′５′連鎖（例えば、２′５′カルバメ ート（２’　−Ｎ　（Ｈ）−Ｃ（０）−０−５’　）　、５’　、２’カルバメ ート（２’　−０−Ｃ（０）−Ｎ　（Ｈ）−５’　）　、５’　、２’メチルカ ルバメート（２’　−０−Ｃ（０）　−Ｎ　（ＣＬ）−５’　）および５’、２ ’チオホルムアセタール（２’　−０−ＣＨＩ　−３−５’　）。
２′５′連鎖は係属米国特許出願第０７／８９２．９０２号、１９９２年６月１ 日出願（引用によってここに加える）。リボアセタール連鎖は普通に所有された 係属米国特許出願第６９０．７８６号、１９９１年４月２４日出願、係属米国特 許出願第７６３．１３０号、１９９１年９月２０日出願および係属米国特許出願 第８０６．７１０号、１９９１年１２月１２日出願（引用によってここに加える ）において特許請求されている。特記しない限り、置換連鎖、例えば、ホルムア セクール連鎖、−０−ＣＨ２−０−は左側のヌクレオモノマーの３′または２′ 炭素および右側のヌクレオモノマーの５′炭素に連鎖されている。ホルムアセタ ール連鎖（３′。
５′）２量体は第１図、式（６）に示されている。こうして、ホルムアセクール 連鎖は、３　’　−０−ＣＨ２−０−５’または２’−Ｃ）−ＣＨ２−０−５’ として示すことができる。３’、２’または５′炭素の表示は、リボース、デオ キシリボースまたはアラビノース以外の構造が隣接するヌクレオモノマーに連鎖 されているとき、それに応して変更することができる。このような構造は、ヘキ ソース、モルホリノ環、炭素環式環（例えば、ンクロベンテン）などを包含する 。
アントンまたはオリゴマーの中のカルバメート、カーボネート、サルファイド、 スルホキシド、スルホン、Ｎ−メチルヒドロキシルアミンおよびジメチルヒドラ ジノ連鎖は記載された（Ｖａｓｅｕｒ、　Ｊ−Ｊ。
ら、Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、（１９９２）　１１４　：　４０ ０６−４００７　；　ＷＯ３９／１２０６０号；　Ｍｕｓｉｃｋｉ、　Ｂ、ら、 Ｊ、　Ｏｒｇ、　ＣｈｅＩＩ＋、（１９９０）　５５　：　４２３１−４２３３ 　；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、Ｒ，Ｃ，ら、Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、（１９９２） 　５７　：　２９８３−２９８５　；Ｍｅｒｔｅｓ、　Ｍ、　Ｐ、ら、Ｊ、　Ｍ ｅｄ、　Ｃｈｅｍ、　（１９６９）　１２：　１５４−１５７　；　Ｍｕｎｇａ ｌｌ。
Ｗ、　Ｓ、ら、Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、（１９７７）　４２　：　７０３− ７０６　；　５ｔｉｒｃｈａｋ、［！。
Ｐ、ら、Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｗ、（１９８７）　５２　：　４２０２−４２ ０６　；　Ｗａｎｇ、　’Ａ、ら、匪陰ｔｔ、　（＋９９１）並：　７３８５− ７３８８　：国際特許出願第ＰＣＴ／ＬＩＳ９１１０３６８０号）。ｌまたは２ 以上の置換連鎖を、オリゴマーにおいて、ある数の目的で、例えば、相補的標的 核酸配列との結合を促進するためにおよび／またはヌクレアーゼに対するオリゴ マーの安定性を増加するために利用することができる。
「正の修飾」とは、結合アフィニティーを増加させる本発明の式（１）または（ ２）の任意の修飾の使用を意味する。
「負の修飾」とは、結合アフィニティーを減少させる式（１）または（２）の塩 基からなるオリゴマーの追加のヌクレオモノマーの修飾、あるいは結合アフィニ ティーを減少することがある置換連鎖の使用を意味する。
例えば、負の置換連鎖の修飾は、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、チ オノメチルホスホネート、ホスホルアミダイトおよびホスホジエステル連鎖のた めのトリエステルから選択される少な用語［ヌクレオシドＪは、リボヌクレオシ ド、デオキシリポヌクレオシド、あるいはプリンまたはピリミジン塩基、または 修飾されたプリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドまたはＣ−グリコシド である他のヌクレオシドを包含する。糖炭素の立体化学は、ｌまたは２以上の残 基においてＤ−リボースのそれ以外のものであることができる。ペントース部分 をヘキソースにより置換し、そして記載されているようにオリゴマーの中に組み 込むことができる（八ｕｇｕｓｔｙｎｓ、Ｋ、ら、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅｓ、（１９９２）　１８　：　４７１１−４７１６）　。
また、リボースまたはデオキシリボースの部分が別の構造、例えば、ヘキソース または米国特許第５．０３４．５０８号に記載されているような６構成員のモル ホリノ環により置換された類似体が含まれる。ここに定義するヌクレオシドは、 また、アミノ酸あるいは遊離カルボキシル基および遊離アミノ基または保護され たそれらを有するアミノ酸類似体に連鎖したプリンまたはピリミジン塩基を包含 する。例示的ヌクレオシドは記載された（Ｎｉｅｌｓｅｎ、　Ｐ、　Ｅ、前掲； 普通に所有された同時係属米国特許出願第０７／８８９．７３６号、１９９２年 １月２８日提出および同第０７／８９４．３９７号、１９９２年６月５日提出、 両者の出願を引用によってここに加える）。
「ヌクレオシド」は、また、糖の修飾を含有する部分、例えば、ヒドロキシル基 の１または２以上がハロゲン、脂肪族基により置換されているか、あるいはエー テル、アミンなどとして官能化された部分を包含する。このような構造は、ヘキ ソース、モルホリノ環、炭素環式環（例えば、シクロペンタン）などを包含する 。
塩基 「塩基」は、ここにおいて使用するとき、既知のプリンおよびピリミジン塩基お よび本発明の塩基ばかりでなく、かつまた修飾された複素環式塩基およびそれら の互変異性体を含有する部分を包含する。このような修飾は、アルキル化された プリンまたはピリミジン、アシル化されたプリンまたはピリミジン、あるいは他 の複素環を包含する。このような「類似体のプリン」および［類似体のピリミジ ン」またはプリンまたはピリミジンの類似体の一般にこの分野において知られて いるものであり、それらのいくつかは化学療法剤として使用される。例示的であ るが、非限定的なリストは、次のものを包含する：Ｎ’、Ｎ’−エタノシトシン 、７−ジアザキサントシン、７−ジアザグアノシン、８−オキソ−Ｎ６−メチル アデニン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラ シル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミ ノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジ ヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソベンテニルーアデニン、１−メチルアデ ニン、１−メチルシュードウラシル、■−メチルグアニン、１−メチルイノシン 、２．２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３− メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグア ニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオ ウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデ ニン、シュードウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、 ４−チオウラシル、５−メチルウラシル、２−チオシトシン、および２，６−ジ アミツプリン。これらの塩基の類似体に加えて、Ｃｏｏｋ、　Ｄ、　Ｐら、国際 特許公開第Ｗ０９２１０２２５８号（引用によってここに加える）に記載されて いる６−アザシトシン、６−アザチミジンおよび５−トリフルオロメチルウラシ ルを含むピリミジン類似体を、本発明のオリゴマーの中に便利に組み込むことが できる。
２および／または４位置に硫黄を含有する式（１）または（２）の塩基をオリゴ マーの中に組み込み、そして本質的に前述したようにＲ２としてアルキニルで誘 導することができる。オリゴマーの中への４−チオウリジンおよび２−チオチミ ジンの組み込みは記載された（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ、　Ｔ、　Ｔ、ら、Ｔｅｔ、 　Ｌｅｔｔ、（１９９２）　３３　：　２３７９−２３８２　；Ｃ１１ｖｉｏ、 　Ｐ、ら、Ｔｅｔ、　Ｌｅｔｔ、（１９９２）　３３　：　６５−６８　；　Ｎ １ｋｊｆｏｒｏｖ、　Ｔ。
好ましい塩基は式（１）および（２）のものであるが、また、アデニン、グアニ ン、チミン、ウラシル、シトシン、５−メチルシトシン、８−オキソ−Ｎ６−メ チルアデニン、シュードイソシトシン、および７−ジアザキサントシンを包含す る。７−ジアザキサントシンを含有するＧＴ結合のモチーフを介して二重らせん ＤＮＡ配列に結合するオリゴマーの合成および使用は、普通に所有された米国特 許出願第０７／７８７．９２０号、１９９１年１１月７日提出（引用によってこ こに加える）に記載されている。
命惑 オリゴマーまたはそれらのセグメントは便利に合成される。この分野において知 られておりそしてここに記載する合成方法は、本発明の塩基を含有するオリゴマ ー、ならびにこの分野において知られている他の塩基を、適当に保護されたヌク レオモノマーを使用して、合成するために使用することができる（第１２図参照 ）。オリゴマーの合成方法は、例えば、次の文献の中に見いだされる：　Ｆｒ０ ｅｈｉｅｒ。
Ｂ、ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８６）　１４　：　５３ ９９−５４６７　；　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　（＋９８８）　＋ ６　：　４８３１−４８３９　；　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（ １９８７）　６２　：２８７−２９１　；　Ｆｒｏｅｈｌｅｒ、Ｂ、、　Ｔｅｔ ｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、（１９８６）　２７　：　５５７５−５５７８　 ：　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、　Ｈ，Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｄ ｅｓ−ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒ ｅｓｓｉｏｎ　（１９８９）、　Ｊ、　Ｓ、　Ｃｏｈｅｎ編、ＣＲＣＬｅｔｔｅ ｒｓ　（１９８５）　２６　：　２２４５−２２４８゜メチルホスホンアミダイ ト化学を介するメチルホスホネート連鎖オリゴマーの合成は、また、記載された （Ａｇｒａｗａｌ、　Ｓ、ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　（１ ９８７）　２８　：　３５３９−３５４２　；　Ｋｌｅｍ、　Ｒ，Ｅ、ら、国際 特許公開第Ｗ０９２１０７８６４号）。
式（１）または（２）の塩基およびｌまたは２以上の置換連鎖を含有する本発明 のオリゴマーは、所定の置換連鎖の合成について要求される反応条件に従い、４ つの一般的方法の１または２以上により合成することができる。第１の方法（＃ １）において、式（１）または（２）の塩基を含有するヌクレオモノマーを、標 準の合成条件および試薬を使用して、オリゴマーまたはその便利な断片の中に直 接組み込む。例示のスキームは第５図および第１２図に示されており、そして方 法＃ｌにより作ることができる例示の連鎖は、ホスホジエステル、ホスホロチオ エート、ホスホルアミダイト、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、カ ーボネート、モノホリノカルバメートおよびスルホネートを包含する。
方法＃２は、適当な前駆体、例えば、５−ブロモまたは５−ヨード前駆体（後述 するように）を使用して出発する短いシントン（２量体、３量体など）の合成を 包含し、前記前駆体は引き続いて式（１）または（２）のＣ−５置換基およびオ リゴマーの中への組み込みに適当なシントンに変換される。このアプローチは第 ７図、第８図および第１１図の中に例示されており、モしてＮ−メチルヒドロキ シルアミン、ジメチルヒドラジノ、スルファメート、カルバメート、スルホネー ト、スルホンアミド、ホルムアセクール、チオホルムアセタールおよびカーボネ ートを包含する連鎖の合成に適する。
合成方法＃３は、引き続いてヨウ素化されるウリジンまたはシチジン（未保護ま たは保護された）を使用して出発する。５−位置におけるＲ２基の導入は、所望 の２量体または３量体のシントンへの合成ルート内で達成される。方法＃３は第 ９図に例示されており、そしてＮ−メチルヒドロキシルアミン、ジメチルヒドラ ジノ、スルファメート、ホルムアセクール、チオホルムアセクール、リポアセタ ール、スルホネートスルホンアミド、カルバメート、カーボネートおよびボラノ ホスフエートの連鎖を包含する連鎖の合成に適する。
方法＃４は（１）Ｒ”を含有するウラシルまたはシトシンを使用して出発し、次 いで第１２図に例示されているようにオリゴマーの中への組み込みに適当なヌク レオモノマー（例えば、アミド連鎖）に変換するか、あるいは（２）グリコジル 化またはアルキル化される適当な前駆体、例えば、５−ヨードシトシン、５−ヨ ードウラシル、シトシンまたはウラシルを使用して出発し、次いでヌクレオモノ マーをＲ２を含有する誘導体に変換し、そして所望のシントン（例えば、サルフ ァイド、スルホキシドまたはスルホネート）に変換する。
一般に、特定の２量体、３量体またはより長いシントンを合成するために要求さ れかつＲ２アルキニル２′−デオキシウリジンまたは２′−デオキシウリンンと 適合しないことがある反応条件は、次の通りである＝　（１）親電子付加反応、 あるいはＣ−Ｃ多重結合への親電子付加を促進できる条件（例えば、ＨＣｌ、　 ＨＦ、　ＢＦｓ、　Ｃｌ　２またはＢｒ２）；　（２）　ＣＣ多重結合の還元を 促進できる条件（例えば、Ｒ２／Ｐｄ／Ｃを介する水素化または水素化物、例え ば、Ｂ、Ｈ，、Ｂｉ１２・錯塩または１つのクラスとして、水素化物または水素 化アルミニウム）；　（３）遊離基反応を促進する条件（例えば、Ｃ１，＼ｈν 、過酸化物またはＡＩＢＮ）　；および（４）Ｃ−Ｃ多重結合の酸化を促進する 条件（例えば、例えば、ＫＭｎＯｔ、　ｏｌｏｌ、アルキルカルボン過酸）。
これらの反応条件を含む合成スキームは、方法＃ｌの使用を妨害することがある 。
一般に、５−ヨード−２′−デオキシウリジンまたは５−ヨード−２′−デオキ シシチジンなどと適合性でないことがある反応条件は、次の通りである：　（１ ）ヨウ素化アリールの還元を促進する条件（例えば、Ｒ２または水素化物）、（ ２）有機金属試薬により仲介されるアルキル化またはアリール化反応または（３ ）遊離基反応を促進する条件（例えば、ＣＩ２＼ｈν、過酸化物またはＡＩＢＮ ）。これらの反応条件を含む合成スキームは、方法＃２の使用を妨害することが ある。
方法＃３は２′−デオキシウリジンまたは２′−デオキシシチジンを使用して出 発し、引き続いて所望の工程においてヌクレオモノマーを５−ヨード（または５ −プロまたは５−トリフレート）誘導体に変換しくＲｏｂｉｎｓ、　Ｍ、　Ｊ、 ら、Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　（１９８２）興：　５５４−５５７　：　Ｃ ｈａｎｇ、Ｐ、Ｋ、ら、Ｊ、　Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、（１９６３）　６　：　４２ Ｂ−４３０；Ｃｒ１ｓｐ、　Ｇ、　Ｔ、ら、Ｔｅｔ、　Ｌｅｔｔ、　（１９９０ ）　３１：　１３４７−１３５０　；およびＴｏｒｒｅｎｃｅ、　Ｐ、　Ｆ、ら 、Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｍ、　（１９７９）　２２　：　３１６−３１９）次 いて所望の工程においてＲ２置換基に変換する。あるスキームにおいて、２′− デオキシウリジンを必要に応じて５−Ｒ２−２’−デオキシウリンに従来記載さ れた方法により変換することは有利である（Ｄｉｖａｋａｒ、Ｋ、Ｊ、ら、Ｊ、 Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓ　１（１９８２）ｐ、　１１７１ −１１７６）。これらの反応または条件の１つを所定のオリゴマーまたはその断 片の合成のために使用する場合、ヌクレオモノマー例えば、２′−デオキシウリ ジンを利用し、次いでＲ２誘導体およびそのシチジン誘導体に変換する。
これらの一般的方法により合成した追加の例示的連鎖を、下表Ａに要約する。
表Ａ 連鎖の構造傘　方　法　参　照本＊ ２’　−３−ＣＨ２−５’　Ｉ−４１ ３’　−５−ＣＨ２−５’　ｌ−４２ ２’　−５（０）−ＣＨ２−５’　ｌ−４１３’　−３（０）−ＣＨ２−５’　 ｌ−４１２’　−３（０）（０）−ＣＨ，−５’　！−４１３’　−５（０）（ ０）−ＣＨ２−５’　１−４　１２’　−ＣＨ，−３−５’　３，４　１３’　 −Ｃ１（２−３−５’　３，４　２２’　−ＣＨ２−３（０）−５’　３，４　 １３’　−ＣＨ２−３（０）−５’　３．４　２２’　−ＣＨ，−５（０）ＣＤ ＞−５’　３，４　１３’　−ＣＨ２−３（０）（０）−５’　３，４　２２’ 　−ＣＨ２−ＣＨ２−０−５’　３．４　１３’　−ＣＨ２−Ｃｌ１２−０−５ ’　３，４　２２’　−Ｎ（Ｃ（０）（ＯＲＡ））−ＣＨ，−ＣＨ，−５’　３ ．４　１３’　−Ｎ（Ｃ（０）（ＯＲＡ））−ＣＨ２−Ｃ１（、−５’　３．４ 　２２’　−３−ＣＨ，−ＣＨ２−５’　３．４　１３’　−５−ＣＨ２−ＣＨ ２−５’　３．４　２２’　−ＮＨ−Ｃ（０）−０−５’　３，４　１２’　− ０−ＣＨ，−５−５’　２−４　１２’　−０−Ｃ（０）−Ｎ（Ｒ″）−５’　 ２−４　１５′モルホリノＮ−ＣＨ２−５’　１−４　２０−−−−−コ ３’　−Ｘ−Ｃ（（ＣＩ＋２）２ＮＲｃ（ＣＨ２）２）−Ｘ−５’　２−４　３ 「−−一−］ ３’　−Ｘ−Ｃ（（ＣＨ２）２０（Ｃ）１２）２）−Ｘ−５’　２−４　３３’ −Ｘ−Ｃ（（ＣＨｆ）Ｉ５（０）（０）（Ｃ）Ｉｔ）２））−Ｘ−５’　２−４ 　３「−一一一一一］ ３’　−Ｘ−Ｃ（（ＣＨ２）２３（０）（ＣＨ２）２））−Ｘ−５’　２−４　 ３−一一一一一一］ ３’　−Ｘ−Ｃ（（ＣＨ２Ｎ（Ｒｃ）（ＣＨ，）、）−Ｘ−５’　２−４　３「 −一一一一一一］ ３’−Ｘ−Ｃ（（ＣＨ２Ｎ（Ｒｃ）（ＣＩ２ＮＣＲ’））−Ｘ−５’　２−４　 ３＊ＲＡ＝Ｃ＋−ａアルキル、例えば、Ｃ）Ｉ２ＣＨ，または（ＣＨＩ）ｓＣＨ ，；Ｒ１１＝ＨまたはＣ，、、□、アルキル、例えば、ＣＩ、；Ｘ＝ＯまたはＳ ０Ｒｃ＝ＣＩ　−＠　７　／Ｌ／キル、ＣＮまたはＣ＋−ｓ　ハ０７　／Ｌ／キ ル、例えば、ＣＦ、。
連鎖はリボースまたはデオキシリボースの２’、３’または５′の炭素との示し た原子の共有結合を示す。
木目−合成は同等の３’、５’連鎮について本質的に［’ＣＴ／ＵＳ９１１０６ ８５５号に記載されているように達成される。
２−国際特許出願筒ＰＣＴ／ＵＳ６１１０６８５５号。
３−国際特許出願筒ＰＣＴ／　ＵＳ９０／　０６１１０号；Ｃ（（ＣＨｚ）２（ ＣＨ２）ｚ　Ｏのような構造を有する連鎖は環状ケタールである。
表Ａに記載する置換連鎖に加えて、第１７図はｌ系列の反復ヌクレオモノマー単 位（１７−１）および本発明の塩基類似体を含有できる選択した反復単位を含有 する例示のアミド連鎖オリゴマー（１７−２゜１７−３　＞を示す。第１７−１ 図において、Ｘｇはｓ、　ｏ、　ｓｏ、　ｓｏ２゜ＣＨ２，ＣＦ２またはＮＲ１ ０てあり、モしてＲ”は（独立に）　Ｈ，Ｆ、　ＯＨ。
０Ｃ）ｌ＋、またはＣＨ低級アルキルであるが、ただし隣接するＩ９の両者はＯ てはない。第１７−２図において、各Ｙは独立に選択され、そして上に定義した 意味を有する（例えば、ＹはＨ，オリゴマー、ブロッキング基、例えば、ＦＭＯ Ｃ，ｔＢＯｃ、　ＯＨ，ＤＭＴ、　ＭＭＴまたはオリゴマーの合成に適当なカッ プリング基である）。このような連鎖を含有するオリゴマーの合成に要求される ヌクレオモノマーは、方法＃４により合成される。
本発明のオリゴマーは、アミダイト、トリエステルまたは水素ホスホネートの調 節された孔のガラス方法および条件を包含する、任意の適当な化学により合成す ることができる。オリゴマーは、好ましくは、適当な出発シントン、例えば、式 （３）または（４）のヌクレオモノマーから合成され、式中５′−位置における Ｒ１はＤＭＴ。
ＭＭＴ、　ＦＭＯＣ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）　、ＰＡＣＯ（フ ェノキシアセチル）、シリルエーテル、例えば、ＴＢＤＭＳ（ｔ−ブチルジフェ ニルシリルまたはＴＭＳ（１−リンチルシリル）であり、そして３′−位置にお けるＲ１はエステル、Ｈ−ホスホネート、アミダイト、例えば、β−シアノエチ ルホスホルアミダイト、シリルエーテル、例えば、ＴＢＤＭＳまたはＴＭＳまた はｔ−ブチルジフェニルである。あるいは、適当なウリジンまたはシチジンの前 駆体、例えば、ブロックされた５−ヨード−２′−デオキシウリジン、５−ヨー ド−２′−デオキシシチジン、５−ブロモ−２′−デオキシウリジン、５−トリ フルオロメタンスルホネート−２′−デオキシウリジン、５−ブロモ−２′−〇 −アルキルウリジンまたはブロックかつ保護された５−ヨード−２′−デオキシ シチジン、５−ブロモ−２′−デオキシシチジン、５−トリフルオロメタンスル ホネート−２′−デオキシシチジン、５−ヨード−２′−〇−アルキルシチジン 、５−ブロモ−２’−０−アルキルシチジンを、短いオリゴマー、例えば、２量 体、３量体、４量体、５量体またはより長いシントンの中に便利に組み込むこと ができ、引き続いてこれらを誘導して５−位置にＲ２を生成し、次いで適当なシ ントンおよびより長いオリゴマーの中に組み込むことができる。
約４またはそれ以」二のヌクレオモノマー残基を含有するオリゴマーの合成は、 好ましくは、アミダイト、Ｈ−ホスホネートまたはトリエステルの化学とともに 使用するために適当な調節された孔のガラスを有するシントン、例えば、モノマ ー、２量体または３量体を使用して達成される。シントンを使用してオリゴマー をホスホジエステルまたはリン含有置換連鎖（ホスホロチオエート、メチルホス ホネート、チオノメチルホスホネート、ホスホルアミダイトなど）を介して連鎖 することができる。
他のリンを含有しない置換連鎖の合成は、ここに記載する（第７図〜第１Ｏ図） 適当な前駆体を使用して達成することができ、そしてこの分野において知られて いる。
これらの非常に便利なかつ現在量も普通に使用されている、固相合成技術を使用 することに加えて、オリゴマーは、また、溶液相法、例えば、トリエステル合成 を使用して合成することができる。これらの方法は操作可能であるが、一般に、 任意の実質的な長さのオリゴマーについて効率に劣る。
中間体または出発物質 池の面において、本発明は、式（３）または（４）のヌクレオモノマーの類似体 を包含する、本発明のオリゴマーの中間体に関する：式中、 各Ｒ１は独立にＨまたはブロッキング基であるＳＲ２およびＸは上に定義した通 りである；Ｒ３はＨ，ＯＨ，Ｆ、　ＮＨ３，ＯＲまタハＳＲテあり１．：、：、 テＯＲ＋；！Ｏ−７リルであるか、あるいはＳＲはＳ−アリルまたはＣまたはＳ −アルキル（Ｃ，−、、ここでアルキルはメチル、エチルまたはプロピルを包含 する）である；そして Ｐ「は（Ｈ）２または保護基である； ただしＸが０であり、Ｒ１はＨまたは０１１であり、がっ両者のＲ１がＨである 場合、Ｒ２は１．３−ペンタジェニル、２−１３−および４−ピリジン−エチニ ル、２−１４−および５−ピリミジン−エチニル、トリアジン−エチニル、アリ ールエチニル、２−１４−および５−ピリミジニル、２−および４−イミダゾリ ル、２−および３−ピロリル−エチニル、２−および３−フラニル−エチニル、 ２−および３−チェニル−エチニル、２−および４−イミダゾリル−エチニル、 ２−１４−および５−チアゾリル−エチニルまたは２−９４−および５−オキゾ リル−エチニル、４−オキゾリル、３−ピロリル、３−フラニル、３〜チエニル であり、そしてただし式３について、Ｘが０であり、かつＲ′およびＲ３がＨで あるとき、Ｒ２はビニル、１−ブテニル、■−ペンテニル、ｎ−へキセニル、ｎ −へブテニル、１−オクテニル、１−プロピニル、ｌ−ブチニル、Ｉ−へキシニ ル、１−へブチニルまたは！−オクテニルではない。
適当な保護基（Ｐｒ）は、ジイソブチルホルムアミジン、ジイソブチルホルムア ミジン、ジイソブチルホルムアミジンおよびＤＭＴ。
ＭＭＴ、　ＦＭＯＣ，ホスホルアミダイト、例えば、β−シアノエチルホスホル アミダイト、水素−ホスホネートおよびメチルホスホルアミダイトを包含する適 当なＲ２基を包含する。
好ましい保護されたヌクレオモノマーは、式（３）および（４）のヌクレオモノ マーであり、式中Ｘは０であり、５′位置におけるＲ１はＤＭＴ、　ＭＭＴまた はＦＭＯＣである；３′位置におけるＲ１　はＮ、　Ｎ−ジイソプロピルアミノ −β−シアノエトキシホスフィン、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノメトキシホス フィンまたは水素ホスホネートである。Ｒ２はｌ−プロピニル、３−メチル−１ −ブチニル、２−ピロリル、２−チェニル、２−イミダゾリルまたは２−チアゾ リルである：そしてＰｒは（Ｈ）２またはジイソブチルホルムアミジンである。
好ましい態様 本発明の好ましいオリゴマーの１つのグループは、式（１６）により表すするこ とができる； 式中、 各Ｂ、　Ｒ’およびＲ３は独立に選択され、そして上に定義した意味を有する； ｎは０〜９８の整数である（θ〜２８の値は好ましい）；そして各Ｘ１は独立に −ｐ　（ｓ）（０）−、−Ｐ　（０）（０）−または−Ｐ（ＣＨ３）　（０）　 −＋　−ｐ　（ＣＬ）　（Ｓ）−であり、ただし少なくとも１つのＢは上に定義 した式（１）または（２）を有する。そして さらにただし前記オリゴマーの前記ヌクレオモノマーの少なくとも１つがビニル 、■−ブテニル、１−ペンテニル、ｌ−へキセニル、ｌ−へブテニル、ｌ−オク テニル、■−プロピニル、■−ブチニル、ｌ−へキシニル、ｌ−へブチニルまた は１−オクテニルにより５−置換されたデオキシシチジンからなるとき、前記オ リゴマーを構成するヌクレオモノマーの残部はホスホジエステル連鎖２′−デオ キシアデノシン、２′−デオキシグアノシン、２′−デオキシシチジン、チミジ ンまたはそれらの組み合わせのみから構成されない。メチルホスホネート、チオ ノメチルホスホネートまたはホスホロチオエートの置換連鎖はオリゴマーのヌク レアーゼ安定性を増強すると同時に、標的核酸に対するオリゴマーのアフィニテ ィーへの負の衝撃は本発明の５−置換ピリミジンの包含により補償される。
最も好ましいＲ２基はｌ−プロピニルである。好ましいＲ３基はＨ，ＯＨ，Ｆお よびＯ−アリルである。
本発明の他の好ましいオリゴマーは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、 チオノメチルホスホネートまたはメチルホスホネート以外の置換連鎖を含有する 。これらの置換連鎖のとくに有用な形態は、リボアセタール、ホルムアセタール および３′−チオフォルムアセクール連鎖を包含し、３′−チオフォルムアセタ ールは最も好ましい。
ホルムアセクール型置換連鎖を含有するオリゴマーの合成のために、少なくとも いくつかのホスホジエステルの代わりに、第１図に示す式（６）の２量体のシン トン（式中、置換基Ｂ、　Ｘ、　Ｒ’およびＲ２は上に定義した通りである）は とくに有用である。
前述のシントンは、まずＢの５−ヨードピリミジンの形態を調製し、次いて、例 えば、２量体のシントンをプロピンでパラジウム、Ｃｕ１．　トリエチルアミン 、およびＤＭＦの存在下に処理することによって、これらを５−プロピン誘導体 に変換することによって得られる。
第７図、第８図、第９図および第１１図に示す標準の合成技術を使用して、これ らのシントンをオリゴマーの中に組み込むことができる。
ホルムアセクールおよび３′−チオフォルムアセタールの置換連鎖の合成は、普 通に所有された係属米国特許出願第０７／８７４．３３４号、１９９２年４月２ ４日提出、および係属米国特許出願第０７／６９０．７８６号、１９９１年４月 ２４日提出（これらを引用によってここに加える）に記載されている。ホルムア セクール、３′−チオフォルムアセタール、リボアセタールまたは他の置換連鎖 を含有する３量体のシントンは、また、好ましい化合物である。３量体および４ 量体は、細胞膜を横切る増強された透過を有するオリゴマーの合成のために好ま しい。
メチルホスホネートおよびホスホジエステルの連鎖を含有するオリゴマーの合成 は、この分野において知られている固相オリゴマー合成技術を使用して実施され る。ホスホジエステル連鎖オリゴマーの合成において有用な修飾の記載は、例え ば、欧州特許公開第２８８、１６３号の中に見いだされる；ここでアミダイト化 学を使用する固相自動化合成における酸化工程を任意の工程において独立に調節 して、ホスホロチオエートを得ることができる。水素ホスホネート化学を介する 、ホスホロチオエートをもつオリゴマーの合成の別の方法は、また、記載された （ＦｒＯｅｈｌｅｒ、　Ｂ、ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。
（１９８６）　２７　：　５５７５−５５７８）。硫黄化は、記載されているよ うに、試薬、例えば、テトラエチルチウラムジサルファイド、ジベンゾイルテト ラサルファイド、チオリン酸ジサルファイドなど、３Ｈ−１゜２−ベンゾジチオ ール−３−オン１．１−ジオキシドを使用して違特許第５．１５１．５１０号、 同時係属米国特許出願第号、１９９２年９月１２日は、ホスホルアミダイトまた は水素−ホスホネートの化学ととＬに使用することができる。記載されているよ うに、コントロールされた立体化学を有するホスホロチオエートの合成を使用し て、立体規則的な本発明のオリゴマーを発生させることができる（国際特許公開 第ＥＰＯ５０６２４２号）。チオノメチルホスホネートは、記載されているよう に、メチルホスホンアミダイトを使用し、次いで硫黄化による（Ｒｏｅｌｅｎ、 　Ｈ，Ｐ、　Ｃ，Ｆ、ら、Ｔｅｔ、　Ｌｅｔｔ、　（１９９２）　３３　：　２ ３５７−２３６０）か、あるいは前述の硫黄化試薬を使用して調製される。
共有結合の部分 本発明のオリゴマーのいくつかの中に、オリゴマーと標的配列との間の少なくと も１つの共有結合を成形することができる部分が含められる。多重共有結合は、 また、このような部分の多重性を提供することによって成形できる。共有結合は 好ましくは標的路の中の塩基の残基に対してであるが、また、糖またはホスホジ エステルを包含する標的の他の部分を使用して作ることができる。架橋を行う部 分の反応の性質は、二重らせんにおける標的の性質を決定する。
好ましい架橋する部分は、アシル化剤およびアルキル化剤、および、とくに鎖の 中の標的位置との反応を可能とするように、配列特異性を付与する部分に関して 位置するものを包含する。
架橋する部分は、便利には、オリゴマーの配列の中に類似のピリミジンまたはプ リン残基として配置することができる。この配置は５′末端および／または３′ 末端、配列の内部の部分、またはそれらの組み合わせであることができる。柔軟 性を増大するために末端における配置は好ましい。類似の部分は、また、ペプチ ドの主鎖に取り付けることができる。
本発明の１つの好ましい態様において、いずれかの末端において架橋する部分を 含有するスイッチバッグオリゴマーを使用して、二重らせんの鎖を少なくとも２ つの共有結合で架橋することができる。
さらに、逆の極性のオリゴマーの配列を複数の架橋する部分と直列に配置して、 カルボキシを強化することができる。
本発明において有用であるアルキル化部分の例は、Ｎ　１　、　Ｎ　１−エタノ シトシンおよびＮ　８　、　Ｎ　＠−エタノアデニンを包含する。
塩基は必ずしもプリンまたはピリミジンであることが必要ではないことは明らか である；事実、反応官能性が結合している部分は結合である必要はまったくない 。反応性基を取り付ける任意の手段は、位置決めが正しいかぎり、満足すべきも のである。
逆の極性 それらの一般的形態において、逆の極性のオリゴマーは、■または２以上の前述 のヌクレオモノマーを組み込むことができ、次の式のそれらの長さに沿って少な くとも１つのセグメントを含有する：ここで一〇−は反対の極性のヌクレオモノ マーの配列をカップリン（１９９２）　３１　：　１６０３−１６０９　；　Ｈ ｏｒｎｅ、Ｄ、Ａ、ら、Ｊ、　Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ。
これらの式において、記号３’−−−−５’はオリゴマーのストレッチを示し、 ここで左に対してヌクレオモノマーのリボシル残基の５′−ヒドロキシルと、右 （すなわち、均一な極性の領域）に対してヌクレオモノマーのリボシル残基の３ ′−（または２′５′連鎖について２′−）との間で連鎖は首尾一貫して成形さ れ、こうして追加の接合のために自由の一番右のヌクレオモノマーのリボシル残 基の５′−ヒドロキシルが残る。同様に、５’−−−−３’は反対向きのオリゴ マーのストレッチを示し、ここで左のヌクレオモノマーのリボシル残基の３′− ヒドロキシルと右のヌクレオモノマーのリボシル残基の５′−ヒドロキシルとの 間に連鎖が成形され、こうして追加の接合のために自由の一番右のヌクレオモノ マーのリボシル残基の３′−ヒドロキシルが残る。
−Ｃ−により記号で表われる連鎖を成形して、式（１）における隣接するリボシ ル残基の５′−ヒドロキシルまたは式（２）における隣接するリボシル残基の３ ′−ヒドロキシルを連鎖することができるか、あるいはｒ−Ｃ−Ｊ連鎖を隣接す るヌクレオモノマーの他の部分と接合させて、逆の極性の鎖を連鎖することがで きる。
ｒ−Ｃ−Ｊはリンカ一部分、または単に共有結合を表すことができる。
逆の極性の鎖の間の連鎖が糖残基を含む場合、３′−または２′−を連鎖の中に 含めることができるか、あるいはこの位置のいずれかはＲまたはＳのコンフィグ レーションであることができることに注意すべきである。コンフィグレーション の選択は、一部分、連鎖の付近におけるオリゴマーの形状寸法を決定するであろ う。こうして、例えば、隣接する３′−位置を使用して共有結合を行う場合、連 鎖に関係する両者の３１１−１．２−ベンゾジチオール−３−オンｌ。
Ｉ−ンオキシドが普通のＲコンフィグレーションである場合、起こるオリゴマー の変形の程度はより少ないであろう。それらの両者がＳコンフィグレーションで ある場合、これは鎖の中に好適な［キンクＪを生ずるであろう。
標準のオリゴヌクレオチドの合成技術または他のカップリングを使用してリボシ ル部分の開の５’−５’または３′−３連鎖を成形することに加えて、逆の極性 の２つの鎖を接合する別のアプローチを使用することができる。例えば、逆の極 性のオリゴマーの配列の反対末端の２つの添付された塩基を直接にあるいはリン カ−を通して連鎖することができるか、あるいは一方の塩基を他方の糖部分に連 鎖することができる。連鎖を実施する任意の適当な方法を使用することができる 。本発明のスイッチバッグオリゴマーの特徴づける面は、それらが逆の極性の直 列の領域を構成し、こうして３′→５′極性の領域の次に５’−３’極性の１つ が存在するか、あるいはその逆か、あるいは両者であるということである。
逆の極性をもつセグメントをカップリングする方法に依存して、このカップリン グは２量体の挿入により実施することができ、ここで２量体の各構成員の適当な ３′−位置または２量体の各構成員の５′−位置は成長する鎖の中の２量体の包 含のために活性化されるか、あるいは鎖の極性が同一のままである場合、使用さ れる逆の方法でブロッキングされる縮合するヌクレオモノマーを使用して、普通 の合成を続けることができる。この追加のヌクレオモノマーは、また、鎖を伸長 するための縮合の前後に含めることができるリンカ一部分を含有することができ る。
修飾された残基および／または逆の極性を有するオリゴマーの合成は、標準の固 相合成法を利用して達成することができる。
一般に、普通の３′→５′または５′→３′を含有するオリゴマーの合成に対す る２つの普通に使用されているアプローチが存在し、一方は中間体のホスホルア ミダイトを含み、そして他方は中間体のホスホネートの連鎖を含む。ホスホルア ミダイトに基づく合成において、カップリングすべき位置にシアノエチルホスホ ルアミダイトを有する適当な保護されたヌクレオモノマーを、固体の支持体に対 して誘導された成長するヌクレオモノマー鎖の遊離のヒドロキシルと反応させる 。この反応はシアノエチルホスファイトを生じ、その連鎖は各中間の工程におい てシアノエチルホスフェートに酸化しなくてはならない。なぜなら、還元された 形態は酸に対して不安定であるからである。カップリングすべき位置にＨ−ホス ホネート部分を含有する適当に保護されたヌクレオモノマーを遊離ヒドロキシル 基を有する固相誘導ヌクレオモノマー鎖と適当なアクチベーターの存在下に反応 させて、酸に対して安定なＨ−ホスホネートジエステル連鎖を得ることによって 、Ｈ−ホスホネートに基づく合成はを実施する。こうして、ホスフェートまたは チオホスフェートへの酸化は、オリゴマーの合成の間の任意の点において、ある いはオリゴマーの合成が完結した後、実施することができる。Ｈ−ホスホネート は、また、四塩化炭素の存在下に第１または第２アミンとの反応によりホスホル アミダイト誘導体に変換することができる。２つのアプローチを一般的に示すの ために、入るヌクレオモノマーを１カツプリングホスフアイト／ホスフエート」 基を有すると見なす。
置換連鎖の型の変動は、例えば、ヌクレオモノマ一部分のチオール誘導体を使用 してかつこの分野において知られている方法により、Ｉ］−ホスホネートそれ自 体よりむしろメチルホスホネートの前駆体を使用することによって達成される。
非リンに基づく連鎖、例えば、前述のホルムアセクール３′−チオフォルムアセ クール、３′−アミノおよび５′−エーテル型の連鎖をまた使用することができ る。
こうして、３′→５′極性を有するオリゴマーのセグメントを得るために、５′ −位置において保護されかつ３′−位置にカップリングホスファイト／ホスフェ ート基を含有するヌクレオモノマーを、その３′−ヒドロキシルを通して固体の 支持体にカップリングしたヌクレオモノマーの５′−位置におけるヒドロキシル と反応させる。
生ずる縮合したオリゴマーを脱保護し、そして追加の５′−保護された、３′− ホスファイト／ホスフェートカップリングヌクレオモノマーを使用して反応を反 復する。逆に、５′→３′極性のオリゴマーのセグメントを得るために、３′− 位置において保護されかつ５′−位置にカップリングホスファイト／ホスフェー トを含有するヌクレオモノマーを、５′−位置を通して固体の支持体に取り付け られたオリゴマーまたはヌクレオモノマーと反応させ、反応に対して有効な３′ −ヒドロキシルを残す。同様に、入るヌクレオモノマーの縮合後、３′−基を脱 保護し、そして追加の３′−保護された、５′−カップリングヌクレオモノマー と反応させる。所望の数のヌクレオモノマーが付加されるまで、この配列を続け る。
オリゴマーの鎖の延長をｌ系列の縮合において前辺て決定した配列と一致するよ うに進行させ、縮合の各々は他のヌクレオモノマーの付加を生ずる。カップリン グホスファイト／ホスフェートを有するヌクレオモノマーの添加前に、固体の支 持体に結合したヌクレオモノマー上の保護基を除去する。典型的には、普通に使 用されるジメトキントリチル（ＤＭＴ）基の除去は、２．５％ジクロロ酢酸／ジ クロロメタンで処理することによって実施されるが、１％Ｗ／Ｖ）ジクロロ酢酸 ／ジクロロメタンまたはＺｎＢｒ２飽和ニトロメタンも有用である。他の保護基 について適当な他の脱保護手順は、当業者にとって明らかであろう。次いで、脱 保護された固体の支持体に結合するヌクレオモノマーまたはオリゴマーを、カッ プリングホスファイト／ホスフェートを含有する適当に保護されたヌクレオモノ マーと反応させる。各サイクル後、担体結合ヌクレオモノマーを好ましくは無水 ピリジン／アセトニトリル（１：　１．ｖ／ｖ）で洗浄し、再び脱保護し、モし て縮合反応を要求されるだけ多くのサイクルで完結させて、所望の数の適合した 極性のヌクレオシド間の結合を成形し、これらを必要に応じてホスホルアミダイ ト、ホスホロジチオエートホスホロチオエートまたはホスホジエステルに変換す る。
１つの態様において、スイッチバッグリンカ−を提供するために、保護されたヌ クレオモノマーを支持体結合オリゴマーに対して反対の極性で準備する。こうし て、例えば、支持体結合オリゴマーが３′→５′である場合、脱保護された５′ −ヒドロキシルを３′−保護された、５′−カップリングモノマーと反応させ、 そして５′−位置においてカップリングしかつ３′−位置において保護された分 を使用して合成を続ける。
他の態様において、スイッチバッグリンカ−を提供するために、支持体結合オリ ゴマーに縮合のためにカップリングする１つの末端（例えば、水素ホスホネート ）および保護されたヒドロキシル基（または保護されたチオ基）である他の末端 を有するリンカ−要素を含有する２量体のシントン、支持体結合オリゴマー上に 縮合する。
保護されたヌクレオモノマーの水素ホスホネートの縮合および脱保護のために使 用した条件と同一の条件を使用して、リンカ−２量体を縮合しかつ脱保護する。
次いで、オリゴマー鎖の引き続く伸長は、鎖の前の部分の合成に使用した方法と 反対の方法でカップリングおよび保護されるヌクレオモノマー残基を使用する。
この合成に対する１つのアプローチは第５図に図解されており、ここで鎖の各部 分に含まれる２つのヌクレオモノマー残基に既に誘導されたリンカ−を使用する 。この鎖の５′→３′ヌクレオモノマ一部分を、普通に、３　’　−ＤＭＴ−５ ’−カップリングホスフヱートヌクレオモノマーを使用して、固体の支持体にカ ップリングする。
スイッチバッグリンカ−を２つのヌクレオモノマー残基にそれらの３′−位置を 通して誘導する；残りの５′−位置を一方のヌクレオモノマー残基の中の保護基 ＤＭＴおよび他方の中のホスホネート残基により誘導する。誘導されたリンカ− を固体支持された鎖に標準の条件下にカップリングし、次いで普通の方法で脱保 護する。それ以上の標準のヌクレオモノマーのカップリングは、鎖を３′→５′ の向きに伸長させる。
あるオリゴマーにおいてスイッチバッグを仲介するために使用するとくに好まし い２量体のシントンは、第５図に示すＯ−キシロソリンカー（化合物９および式 （２１）である。Ｏ−キシロソリンカーは、各キシロース糖の３′−位置におい て０−キシレンにより互いに連鎖した２つのキシロース−ヌクレオモノマー（１ ８）から成る。
スイッチバッグリンカ−のシントンを、第５図に示すように、α。
α′−オルトジブロモキシレンおよび５’−ＤＭＴヌクレオモノマー（１８）を 使用して合成して２量体（１９）得た。この２量体をＨ−ホスホネート（２１） に変換し、そして固相合成において使用してオリゴマーを発生させた。塩基（第 ５図において位置「Ｂ」に）チミン、５−メチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ ６−メチルアデニン、シュードイソシトシン、５−プロピニルウラシルまたはシ トシンを含有するリンカ−をホモ２量体として合成する。しかしながら、スイッ チバッグリンカ−の２量体は、また、混合へテロ２量体として合成することがで き、このヘテロ２量体はクロマトグラフィーにより分割される。
逆の極性を含有するオリゴマーの調製においてとくに有用なシントンは第１図に 示す式（５）を有し、式中、各Ｙおよび各Ｂは独立に選択され、そして前に定義 した意味を有し、そして塩基Ｂの一方または双方は必要に応じて本発明の式（１ ）または（２）の修飾された塩基の残基であることができる。
２′修飾されたオリゴマー 本発明の（、−５修飾ピリミジンを含有するオリゴマーのいくつかの中に、リボ ースまたはデオキシリボース糖の修飾が含まれる。２′−〇−メチルー１２′− 〇−エチル−および２′−〇−アリルのオリゴマーが合成され、そして−水路の 相補的核酸配列に結合することが示された（Ｃｏｔｔｏｎ、　Ｍ、らＮｕｃｌｅ ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８９）　１９　：　２６２９−ら、欧州特 許出願第０３３９８４２号；　Ｃｈａｖｉｓ、　Ｃ，ら、Ｊ、　Ｏｒｇａｎｉｃ 　Ｃｈｅｍ。
（１９８２）　４７　：　２０２−２０６　；　５ｐｒｏａｔ、Ｂ、Ｓ、ら、Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。
（１９９１）　１９　：　７３３−７３８）。２′−修飾オリゴマーは、未修飾 対照と比較して、比較的ヌクレアーゼ安定性であると報告された。２′フルオロ ヌクレオモノマーの合成およびオリゴマーの中へのそれらのするオリゴマーの類 似体の合成は、記載した方法に基づくであろう。
２′−アミノヌクレオモノマーを含有するオリゴマーの合成は記載された（Ｐｉ ｅｋｅｎ、　Ｗ、Ａ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９１）　２５３　：　１４− ３１７）。
本発明のオリゴマーにおける塩基（１）および（２）の追加の使用において、本 発明の５−置換塩基（１）および（２）を含有するヌクレオモノマーの２′−〇 −アリル修飾糖の形態はオリゴマーの中に含まれる。他の２’−０−アリル置換 ヌクレオモノマーは、また、オリゴマーの中の他の位置において使用することが できる。２′−０−アリルヌクレオモノマーは標準の方法を使用して調製できる ：普通の中間体を通る本発明のピリミジンを含有する２′−〇−アリル誘導ヌク レオモノマーの合成の方法を後述する。こうして、例えば、５−（ｌ−プロピニ ル）ウリジンをまず５′−および３′−位置においてテトライソプロピルジシロ キサン試薬を使用して保護し、次いで４−オキシ位置においてオルト−ニトロフ ェノールを使用して保護する。次いで、保護されたヌクレオシドをアリルエチル カーボネートで２’−０−アリル誘導体に変換する；あるいは、この有用な誘導 体は２’−〇−アリル誘導−５−（ｌ−プロピニル）ウリジンまたは対応する５ −（ｌ−プロピニル）シチジンに変換する。この変換のための反応順序は第４図 に概説されている。
２′−位置において誘導されたヌクレオモノマーは、未誘導の形態と同一の方法 でオリゴマーの中に組み込むことができる。
２′−チオアルキルヌクレオモノマーの合成は、第６図に記載するように達成さ れる。このプロトコールはアンヒドロ中間体ヱの生成を介する２′−チオアルキ ルピリミジンの合成に有用であり、そして２′−チオアルキルピリミジンは引き 続いてチオアルキルヌクレオモノマー（２２）に変換される。Ｗと表示される基 は、低級アルカン（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルまたはイ ソブチル）またはアリルを包含する低級アルケンとして定義される。
このプロトコールを使用して５’−ＤＭＴブロックト５−メチルウリ（１９７９ ）　０１Ｂ＋−０１９７ｏ５　’−および３′−位置における別のブロッキング 基、例えば、テトラヒドロピランを、また、使用して同等の出発物質を得ること ができる。こうして、第６図に示す方法を使用して、他の修飾されたピリミジン ヌクレオモノマー、例えば、２′−チオアルキルシチジン、２′−チオアルキル チミジン、２′−チオアルキル−Ｎ”　、Ｎ’−エタノシチジンまたは２′−チ オアルキルウリジンの合成に加えて、本発明の修飾された塩基を含有するヌクレ オモノマーの２′−チオアルキル誘導体を合成することができる。ヌクレオモノ マー（２２）を他の５′−および３′−誘導化合物、例えば、ＭＭＴ、β−シア ノエチルホスホルアミダイト、またはメチルホスホルアミダイト−ブロックトヌ クレオモノマーへ変換する反応は、適当な試薬を使用して容易に達成することが できる。
された２量体のシントンを使用して合成される。一方または双方の塩基の残基が ５−Ｒ２−Ｕまたは５−Ｒ”　−Ｃまたは関係する類似体である２量体について 、ホルムアセタールまたは３′−チオフォルムアセクールが連鎖した２量体の合 成はここに記載するようにして達成される。第１図に示す式（６）のホルムアセ タール連鎖を含有する例示の２量体、Ｙ、　Ｘ、ＢおよびＲ３はこごにおいて定 義した通りである。
第７図および第８図は、オリゴマーの合成における中間体のための合成のスキー ムを示す。両者の図面において、構造Ｕ−１は５−ヨードウラシルを表し、そし てＵ〜＝−ＣＨ，は５−（１−プロピニル）ウリジンを表す。３′−チオフォル ムアセタールの２量体または３量体の合成は、便利に達成される。第７図に示す ように、エステル化により３′−位置において保護された、５−ヨードウリジン ヌクレオモノマー（２５）を、まず、パラホルムアルデヒドとＨＣＩの存在下に 反応させて、５′−位置に置換基ＣｌＣｌ＋０２−を含有する誘導されたヌクレ オモノマー（２６）を得る。このヌクレオモノマーは、例えば、長鎖アルキルま たは芳香族酸、例えば、デシル、ヘキシル、ベンゾイル、またはフェノキンアセ チルを使用してエステル化することができる。この第１工程において、３′−エ ステル化ヌクレオモノマーを不活性溶媒中で過剰のパラホルムアルデヒドで低温 において処理し、そして無水ＨＣＩを反応混合物を通して泡立てて通人する。こ の溶液は便利に乾燥され、そして溶媒を除去して中間体を得る。
次いて、ヌクレオシドの５′−位置にクロロメチルエーテル（ＣＩＣＨＯ２−） として示される中間体（２６）を不活性溶媒中に溶解する。５′−位置において 、例えば、ＤＭＴにより保護され、そして塩基、好ましくはジイソプロピルエチ ルアミン（ＤＩＰＥＡ）と−緒に３′−位置に一３Ｈを有する、第２ヌクレオモ ノマー（５−（１−プロピニル）ウリジン）の不活性溶媒中の溶液を、また、調 製する。クロロメチルエーテル中間体をこの溶液に満々添加し、そして反応混合 物を数時間攪拌する。
反応混合物を水で洗浄し、そして有機層を分離し、そして乾燥して３　’　−５ ＣＨ，ｌ　−５’連鎖を有しそして上のように５′−および３′−位置において 保護された２量体化された生成物得る。生ずる２量体を３′−位置において脱保 護し、次いで実施例Ｉにおいて示しかつ説明するようにプロピン誘導体に変換す る。２量体を標準のオリゴマーの合成において使用する場合、それを２−クロロ −４Ｈ−１゜２．３−ベンゾジオキサホスホリン−４−てン（リン酸化のための （ＰＡ）のためにパン・ブーム（ｖａｎ　Ｂｏｏｍ）試薬）を使用して水素ホス ホネートに変換する。第８図は３′−チオフォルムアセタール３量体の合成を示 す。
リポアセタール連鎖２量体の合成を第９図に示す。５　’　−ＤＭＴ、　３　’ −Ｈ−ホスホネート２量体を、直接オリゴマーの中への組み込みのために、普通 の方法により使用することができるか、あるいは適当な前駆体を必要に応じて３ 量体、４量体またはより長いオリゴマーへの変換のために使用することができる 。
エチニルへテロアリールおよびヘテロアリール誘導された塩基の合成 第１４図、第１５図および第１６図は、５位置にエチニルへテロアリールまたは へテロアリール基をもつ本発明の塩基を有するヌクレオモノマーの合成のための 合成スキームを示す。ヌクレオモノマーを、オリゴマーの中への組み込みのため に適当なブロックされたモノマーに普通の方法により変換することができる。
５′−フェニル−２′−デオキシウリジンの合成を、従来記載されているように 、フェニルトリメチルスタンナンを使用して達成された（Ｃｒｉｓｐ、　Ｇ、ら 、Ｔｅｔｒａｈｃｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　（１９９０）　３１　：　１３４ ７−１３５０）。ブロモピリミジンから得られる出発物質としてピリジニルトリ メチルスタンナンまたはピリジニルトリブチルスタンナンなどを使用するプロト コールを使用して、５−（２−ピリミジニル）−２′−デオキシウリジンを合成 する（実施例１５）。ヘテロアリールスタンナンの合成は、便利には記載されて いるように達成される（Ｂａｉｌｅｙ、　Ｔ、Ｒ，Ｔｅｔ、Ｌｅｔｔ、（１９８ ６）　２７　：　Ｊｕｔｚｉ、Ｐ、ら、Ｊ。
Ｏｒｇａｎｏｍｃｔａｌ　Ｃｈｅｍ、　（１９８３）　２４６！６ｌ−７３）。
ヘテロアリール基、例えば、２−チアゾリル、■−メチルー２−イミダゾリル、 ２−オキサシリル、２−フラニルなどをもっ５−置換ピリミジンヌクレオモノマ ーの合成は、発表されたプロトコールを使用して（Ｗｉｇｅｒｉｎｃｋ、　Ｐ、 ら、Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｍ、（１９９１）　３４　：　２３８３−２３８９ 　；　Ｐｅｔｅｒｓ、Ｄ、ら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｏ ｔｉｄｅｓ　（１９９２）旦：１１５１−１１７３）次いで標準の方法により対 応するヌクレオモノマーに変換することによって達成できる（実施例１６参照） 。５−シアノ置換基は記載されているようにして調製しくＩｎｏｕｅ、　Ｔ、ら 、Ｃｈｅｍ。
Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、　（１９７８）　！　：　２６５７−２６６３）そし て、また、記載されているように、出発親電子物質として使用してヘテロアリー ル置換ヌクレオモノマーを構成することができる（Ｗｉｇｅｒｉｎｃｋ、　Ｐ、 ら、Ｊ。
Ｍｅｄ、　Ｃｈｅ＋ｎ、　（１９９１）　３４　：　１７６７−１７７２）。
エチニルｎｔａ誘導体をエチニルトリメチルシランおよび適当なヘテロアリール から記載されているように調製する（Ａｕｓｌｉｎ、　Ｗ、Ｂ、ら、Ｊ、　Ｏｒ ｇ、　Ｃｈｅｍ、　（１９８１）　４６　：　２２８０−２２８６）（実施例１ ４参照）。次いで、脱プロトン化エチニルをヌクレオモノマーの中に標準の手順 により導入する（実施例１および１４）。
実用性および投与 本発明のオリゴマーは有意な一本鎖または二本鎖の標的核酸への結合活性を有し て二重らせん、三重らせんまたは安定なアソシエーションの池の形態を成形する ことができるので、これらのオリゴマーは１または２以上の遺伝子、例えば、多 数の異なる病理学的状態に関連する遺伝子の発現に関連する疾患の診断および治 療において有用である。治療的応用は、病理学的条件の確立または維持に関連す る遺伝子の発現を特異的に阻害（またはそれらの遺伝子によりエンコードされる ＲＮＡ配列の翻訳を特異的に阻害）するためにオリゴマーを使用できる。ターゲ ツティングすることができる遺伝子によりエンコードされるＲＮＡの遺伝子の例 は、酵素、ホルモン、血清タンパク質、付着分子、リポータ−分子、サイトカイ ン、腫瘍遺伝子、成長因子、およびインターロイキンをエンコードするものを包 含する。標的遺伝子またはＲＮＡは、病理学的状態、例えば、炎症状態、心臓血 管の障害、免疫反応、癌、ウィルスの感染、細菌の感染などに関連する状態に関 連させることができる。
本発明のオリゴマーは、ｉｎ　ｖｉｖｏおよびｅｘ　ｖｉｖｏの両者の治療的応 用のために適当である。ｅｘ　ｖｉｖｏの適応は、白血病またはウィルスの感染 のような状態における骨髄または末梢血液のような細胞の処置を包含する。標的 遺伝子または癌の処置のための標的として働くことができる遺伝子によりエンコ ードされるＲＮＡは、腫瘍遺伝子、例えば、ｒａｓ、　ｋ−ｒａｓ、　ｂｃｌ− ２，ｃ−＋ｎｙｂ、　ｂｃｒ、　ｃ−ｍｙｃ、　ｃ−ａｂｌまたは過度に発現し た配列、例えば、ｍｄｉ　２、オンコスタチンＭｉＬ−６（カポージ肉腫）　、 ＨＥＲ−２およびトランスロケーション、例えば、ｂｃｒ／ａｂｌを包含する。
ウィルス遺伝子の配列またはそれらの遺伝子によりエンコードされるされるＲＮ Ａ　、例えば、ポリメラーゼまたハＣＭＶ、　ＨＳＶ−１、）ＩｓＶ−２，ＨＴ Ｌ−１、ＨＴＬ−２，ＨＢＶ、　ＨＰＶ、　ＶＺＶ　、　インフルエンザウィル ス、ライノウィルスなどの逆転写遺伝子は、また、適当な標的である。特異的に 結合するオリゴマーの応用は、他の治療的処置と関連して使用ことかできる。本 発明のオリゴマーの他の治療的適応は、（１）炎症を仲介するときある役割を演 する遺伝子、例えば、ＩＬ−ルセブター、ＩＬ−１、ＩＣＡＭ−１またはＥ−選 択の発現を変調することによる炎症応答の変調および（２）（ａ）成長因子また はミトジヱン因子、例えば、非筋肉ミオシン、”ＶＣ＋　ｆｏｓ。
ＰＣＮＡ、　ＰＤＧＦＯＲＦＧＦまたはそれらのレセプター、または（ｂ）細胞 増殖因子、例えば、ｃ−ｍｙｂの発現を変調することによる血管成形後における 、動脈閉塞（再狭窄）このような状態における細胞の増殖の変調を包含する。他 の適当な細胞外増殖因子、例えば、ＴＧＦα、　ＩＬ−６，γＩＮＦ　、タンパ ク質キナーゼＣを乾癖または他の状態の処置のためにターゲツティングすること ができる。さらに、［！ＧＦレセプター、ＴＧＦαまたはＭＨＣアレルを自己免 疫疾患においてターゲツティングすることができる。
本発明のオリゴマーの細胞の中へのデリバリ−は、リン酸カルシウム、ＤＭＳＯ 、グリセロールまたはデキストランのトランスフェクション、エレクトロポレイ ションを包含する任意の適当な方法によるか、あるいはカチオン性、アニオン性 および／または中性の脂質組成物またはリポソームの使用により記載されている 方法によって増強することができる（国際特許公開第ＷＯ９０／　１４０７４号 、国際特許公開第ＷＯ９１／　１６０２４号、国際特許公開第Ｗ０９１／１７４ ２４号、米国特許第４、８９７．３５５号）。オリゴマーハ、カチオン性脂質、 例えば、ＤＯＴＭＡとの複合化により細胞の中に導入することができ、次いでこ のカルボキシを細胞と接触させる。適当なカチオン性脂質は次のものを包含する が、これらに限定されない：Ｎ−＜２．３−ジ（９−（Ｚ）−オクタデセニルオ キシル０−プロブ−１−イル−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯ ＴＭＡ）およびその塩類、１−０−才レイル−２−０−オレイル−３−ジメチル アミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモニウムおよびその塩類および］、 ２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパンおよびそ の塩類。
本発明のオリゴマーの増強されたデリバリ−は、また、（ｉ）つ（Ｗａｇｎｅｒ 、Ｅ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（１９９２）　８９　： 　６０９９−６０１３　；（１ｉ）化合物、例えば、ポリリジン、プロタミンま たはＮ１．Ｎ１２−ビス（エチル）スペルミンを使用するポリアミンまたはポリ カチ３６５５−３６５９　；　Ｃｈａｎｋ、Ｂ、に、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、　ＣｏｍＩＩＩ。
例えば、リポスペルミンを使用するりポスペルミンカルボキシ１８１５）　；　 （ｉｖ）アニオン性リン脂質、例えば、ホスファチジルグリセロール、カルシオ リピン、ホスファチジン酸またはホスファチジルエタノールアミンを包含する化 合物を使用するアニオン性、中性のような化合物との接合体または（ｖｉ）被検 体におけるオリゴマーの薬力学的性質を増強する血清タンパク質（アルブミンま たは抗体を包含する）、糖タンパク質またはポリマー（ポリエチレングリコール を包含する）のような化合物との接合体の使用により仲介することができる。こ こにおいて使用するとき、トランスフェクションは細胞の中へのオリゴマーのデ リバリ−に適当である任意の方法を呼ぶ。トランスフェクションのプロトコール において使用できる脂質のような試薬またはウィルスのような因子を、ここにお いて「透過増強因子」と集合的に呼ぶ。細胞の中へのオリゴマーのデリバリ−は 、他の核酸、例えば、（ｉ）１または２以上のタンパク質またはタンパク質断片 をエンコードする発現可能なりＮＡ断片あるいは（ｉｉ）　１または２以上のタ ンパク質またはタンパク質断片をエンコードする翻訳可能なＲＮＡとの共トラン スフェクションを介すことができる。
こうして、オリゴマーは細胞の中へのオリゴマーのデリバリ−を増強する任意の 適当な配合物混入することができる。適当な製剤配合物は、また、化合物を細胞 または組織の中に局所的投与により送り出す応用において普通に使用されるもの を包含する。ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、アゾン、ノンオ キソニル−９、オレイン酸、ＤＭＳＯ、ポリアミンまたはリポポリアミンのよう な化合物をオリゴマーを含有する局所的調製物において使用できる。
本発明のオリゴマーは、遺伝子の発現を望む研究または生産の目的のための試薬 として便利に使用することができる。いずれかのメカニズムにより標的遺伝子の 発現を効率的または特異的に阻害する入手可能な試薬は、現在、非常にわずかで ある。従来標的遺伝子の発現を阻害すると報告されてきているオリゴマーは、し ばしば非特異的作用を有し、および／または非常に低いレベル（未阻害レベルの 約４０％）に標的遺伝子の発現を減少しない。本発明のオリゴマーは、比較する と、マイクロインジェクションのアッセイにおいて０．０５μＭ程度に低いＩｃ １．値をもつ極端な効力を有する。これらの効力のレベルは、標的遺伝子の発現 の効率よい阻害をもつと同時に細胞への有意な非特異的作用を回避して、細胞へ のオリゴマーの適用を可能とする。これにかんがみて、本発明のオリゴマーは、 遺伝子の機能をブロービングしかつ一本鎖または二本鎖の核酸の役割をブロービ ングするために使用できる試薬の独特のクラスを表すことが明らかである。
こうして、ここに記載する結果は、タンパク質がＤＮＡ配列によりエンコードさ れそしてタンパク質がＲＮＡ配列から翻訳される被検体または細胞の中の選択し た１または２以上のタンパク質の発現を阻害する方法を提供し、この方法は、本 発明のオリゴマーを細胞の中に導入し；そしてオリゴマーがＤＮＡまたはＲＮＡ と三重らせんを成形するか、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡと二重らせんを成形す るようにし、これによりｌまたは２以上のタンパク質の発現を阻害するからなる 。
本発明の方法およびオリゴマーは、原核生物および真核生物の両者の細胞、例え ば、細菌、寄生生物、酵母および哺乳動物細胞の中の標的遺伝子の発現を変調す るために適当である。
後述する結果（実施例６および７）がが実証するように、オリゴマーは、アンチ センスのメカニズムにより遺伝子の発現を阻害するために使用するとき、ＲＮＮ アーゼ［受容ＪまたはＲＮアーゼ「非受容」種であることができる。修飾、例え ば、２′−置換（２’−０−アルキルなど）またはある種のアンチャージ連鎖を 有するオリゴマーは、ＲＮＮアーゼにより認識され、および／またはそれにより 作用される基質として通常非受容性である。ＲＮＮアーゼの受容能力は、ＲＮＡ −オリゴマー二重らせんの中の標的ＲＮＡを分解することによって、アンチセン スのオリゴマーの機能を促進することができる（Ｄａｇｌｅ。
Ｊ、Ｍ、ら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９９０）　１８　：　４７ ５１−４７５７　；　Ｗａｌｄｅｒ、　Ｊ、Ａ。
ら、国際特許公開第ＷＯ３９１０５３５８号）。コノ酵素ハＲＮＡ−ＤＮＡ　： 重らせんにおいてＲＮＡを切断する。
ＲＮＮアーゼの受容能力を保持するために、オリゴマーはその中に位置する３ま たはそれ以上の受容性の隣接する連鎖のＲＮＮアーゼ受容ドメインを必要とする （Ｑｕａｒｔｉｎ、　Ｒ，Ｓ、ら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。
（１９８９）見：　７２５３−７２６２）。ヌクレアーゼ消化に対して耐性のオ リゴマーのデザインは、ヌクレアーゼ耐性を実行するための末端の連鎖、糖およ び／または塩基の修飾を有するであろう。こうして、オリゴマーは５′末端およ び／または３′末端のいずれがまたは両者に修飾されたヌクレオモノマー残基を 有すると同時に内部のＲＮＮアーゼ受容ドメインを有するようにデザインするこ とができる。
ＲＮＮアーゼ受容能力を保持する例示的オリゴマーは、一般に、均一な極性を有 し、そして３′末端にオリゴマーをヌクレアーゼ消化に対して安定化する約２〜 約１２ヌクレオモノマー、および３′末端および５′末端の間のＲＮＮアーゼ受 容性ドメインとして機能する約３〜約２６ヌクレオモノマーからなる。このよう なオリゴマーについての変動は、（１）１または２ＲＮアーゼＨ受容連鎖からな るより短いＲＮＮアーゼ受容ドメイン、（２）　１２．２０またはそれ以上まで の置換連鎖またはヌクレオモノマーからなるより長いＲＮアーゼＨ非受容ドメイ ン、（３）　３０．４０またはそれ以上までの連鎖からなるより長いＲＮＮアー ゼ受容ドメイン、（４）３’末端または５′末端における単一のみのＲＮアーゼ Ｈ非受容ドメインをもつオリゴマー、あるいは（５）２以上のＲＮアーゼ■１受 容ドメインを有するオリゴマーを包含する。ＲＮＮアーゼ受容能力は、また、１ つの考えとして、逆の極性の１または２以上の領域を有するオリゴマー、環状の オリゴマーおよび他の型のオリゴマーに適用される。
約８捏度に少ないヌクレオモノマーを含有するオリゴマーは、標的核酸配列と二 重らせんまたは三重らせんの構造の形成によりｌまたは２以上の標的タンパク質 の発現を阻害するために使用できる。
しかしながら、二重らせんまたは三重らせんの形成を介して標的タンパク質の発 現を阻害するために使用する線状オリゴマーは、好ましくは約１２〜約２０のヌ クレオモノマー残基を有する。
本発明の塩基を含有するオリゴマーは、記載されているように普通の環化するこ とができる（国際特許公開第ＷＯ９２／１９７３２号；　Ｋｏｏｌ。
うなオリゴマーは一本鎖または二本鎖の核酸の標的への結合のために適する。環 状オリゴマーは種々のサイズを有することができる。
約２２〜５０ヌクレオモノマーのサイズ範囲のこのようなオリゴマーは、便利に 調製することができる。環状オリゴマーは、記載されているようにオリゴマーの 結合ドメインを分離するループ領域の中に約３〜約６ヌクレオモノマー残基を有 することができる（Ｐｒａｋａｓｈ、　Ｇ。
前掲）。オリゴマーはりガーゼによるか、あるいは５′末端および３′末端の糖 および／または塩基を通る連鎖を介して化学的手段により末端のホスフェートを 通して酵素的に環化することができる。
オリゴマーは、変調転写（Ｍａｈｅｒ、　Ｌ、Ｊ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９ ８９）２４５　：　７２５−７３０）または翻訳（下の実施例７）のための核酸 結合性タンパク質の相互作用を阻害することによって、標的遺伝子の発現を変調 するために使用できる。こうして、オリゴマーは、核酸結合性タンパク質（リポ ソーム、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、転写開始因子、転写を増加 または減少する転写因子、タンパク質−ホルモン転写因子などを包含する）と競 争する配列特異的因子として適当である。こうして、適当にデザインされたオリ ゴマーを使用して、発現の抑制のために転写因子を使用するメカニズム、例えば 、調節部位へまたはその付近への結合によるか、あるいは選択したリプレッサー タンパク質それ自体の発現の抑制により、標的タンパク質の合成を増加すること ができる。
本発明のオリゴマーは、２次または３次の構造、例えば、シュードノットまたは シュード−ハーフ−ノットを含有するようにデザインすることができる（Ｅｃｋ ｅｒ、　Ｄ、Ｊ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９２）　２５７　：　９５８−９ ６１）。このような構造は、対応する未修飾のオリゴマーより安定な２次または ３次の構造を有することができる。このような構造体の増強された安定性は、単 一のオリゴマーにおける自己相補性の領域の間におけるか、あるいは所定の構造 を形成する２またはそれ以上のオリゴマーの間の相補性の領域の間における、増 加した結合アフィニティーに頼るであろう。このような構造体は、ＨＩＶ　Ｔａ ｔタンパク質（ＴＡＲに結合するタンパク質）による結合を妨害するために、Ｈ ＩＶＴＡＲ構造体のような構造体をまねるために使用することができる。
高等の核酸構造体、例えば、ステム、ループ、ヘアピン、ノットなどを反応う他 の転写または翻訳の因子とともに、同様なアプローチを使用することができる。
あるいは、本発明のオリゴマーを使用して、核酸構造体へのタンパク質の結合を （１）妨害または（２）増強する方法として、このような構造体を（１）崩壊す るか、あるいは（２）前記前記に結合することができる。
アンチセンスまたは三重らせんの治療におけるそれらの使用に加えて、本発明の オリゴマーは、また、二重らせんの核酸における１つの鎖の直接の置換により機 能する治療剤または診断剤として適用することができる。自然の二重らせん、例 えば、染色体のＤＮＡまたは二重らせんのウィルスＤＮＡ、　ＲＮＡまたはハイ ブリッドＤＮＡ／　ＲＮＡの中の鎖の置換は、それらの相補的標的配列に対する 高い結合アフィニティーをもつオリゴマーについて可能である。この使用法によ るオリゴマーの治療的応用（ここにおいてＤ−ルーピングまたは［Ｄ−ルーピン グ治療」と呼ぶ）は、その相補的配列に対する自然のＤＮＡまたはＲＮＡのアフ ィニティーが二重らせんの中のＤＮＡまたはＲＮＡの鎖を効率よく置換するため に十分に大きくないので、従来不可能であった。Ｄ−ルーピングにより機能する オリゴマーの治療的効能は、核酸標的に関連するした正常の生物学的機能の変調 を生ずる相補的配列に対する高いアフィニティーの結合から生ずる。標的核酸の タイプは、次のものを包含するが、これらに限定されない：　（ｉ）遺伝子配列 、例えば、エクソン、イントロン、エクソン／イントロン接合、プロモーター／ エンハンサ−領域および５′または３′の非翻訳領域、（ｉｉ）機能するために ２次構造体を利用する核酸の領域（例えば、ＨＩＶ　ＴＡＲステム−ループ要素 またはｔＲＮＡ）、（市）構造的な機能を働く核酸、例えば、テロマーまたはセ ントロマーおよび（ｉ）任意の他の二重らせん領域。離散した機能的ドメインを もつオリゴマーを合成できることは明らかであり、ここでオリゴマーの１つの領 域はＤ−ルーピングにより標的に結合するが、隣接する領域は、例えば、三重ら せんを形成するか、あるいはアブタマーとしてタンパク質に結合することによっ て、標的分子に結合する。あるいは、Ｄ−ルーピングオリゴマーは、オリゴマー が結合する鎖をスイッチングすることによって（すなわち、１つの鎖に結合する オリゴマーの１つの領域および相補的鎖に結合する他の領域を有することによっ て）各鎖に二重らせんで結合することができる。結合のモード（すなわち、三重 らせんまたはＤ−ループ）を命令するコントロール要素はオリゴマーの配列であ り、そして固有のアフィニティーはオリゴマーの中に構成される。ワトソンーク リック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ　）二重らせんの結合における塩基の認識の ルールは、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｅｓｔｅｅｎ）調節三重らせんの結合に おけるものと異なる。このために、オリゴマーの塩基配列を使用して、オリゴマ ーが利用すう結合のルールのタイプを命令することができる。
Ｄ−ループの構造は自然において酵素仲介プロセスにより形成される（ｌ（ａｒ ｒｉｓ、Ｌ、Ｄ、ら、Ｊ、ＢｉＯ２，Ｃｈｅｍ、（１９８７）　２６２　：　９ ２８５−９２９２）か、あるいはＤＮＡの複製が起こる領域に関連する（Ｊａｃ ｏｂｓ、　Ｈ，Ｔ、ら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８９）　１ ７　：　８９４９−８９６６）　、オリゴマーの結合から発生すうＤ−ループは 、ｌまたは２工程のプロセスから生ずることができる。標的鎖の直接の置換は、 単一の結合の事象によりＤ−ループを発生する。しかしながら、Ｄ−ルーピング は、また、Ｄ−ループに導く鎖の置換の事象を促進する三重らせんを形成するこ とによって起こることができる。
変更された特性をもつ種をデザインするために、本発明の塩基を含有するりボザ イムをデザインすることができる。−重鎖を切断す４６８）が記載された。リボ ザイムのための治療的適用は仮定された（Ｓａｒｖｅｒ、　Ｎ、ら、５ｃｉｅｎ ｃｅ　（１９９０）　２４７　：　１２２２−１２２５：国際特許公開第Ｗ０９ ］、１０４３１９号）。リボザイム機能のために必要な２次または３次の構造は 、適当なオリゴマーの配列により影響を受けることがある。例えば、本発明の塩 基を含有するターゲツティングドメインを有するリボザイムはより高いアフィニ ティーを有すると同時に、標的配列のための塩基対の特異性を維持する。本発明 の塩基はそれらの相補的配列に対して高いアフィニティーをもつために、リボザ イムの中のより短い認識ドメイン（製造における利点）をデザインすることがで き、これはいっそう好適な代謝回転に導く　（リボザイム機能における利点）。
治療的応用において、オリゴマーは適当な標的遺伝子の発現を阻害することによ って、種々の状態を処置するために適当な方法で利用される。このような治療の ために、オリゴマーを投与の種々のモードで配合することができ、このようなモ ードは全身的、局所的または局在化された投与を包含する。技術および配合は、 一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｅｎｃｅ ｓ、　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、　、ペンシルベニア州イースト ン、最近の版、の中に見いだすことができる。オリゴマーの活性成分は、一般に １、投与のモードの性質および投与の形態に依存して、担体、例えば、希釈剤ま たは賦形剤と組み合わせ、このような希釈剤または賦形剤は充填剤、増量剤、結 合剤、湿潤剤、崩壊剤、表面活性剤、または滑剤を包含することができる。。典 型的な投与の形態は、錠剤、粉末、液体の調製物、例えば、懸濁液、乳濁液およ び溶液、顆粒、カプセル剤および半割、ならびに注射用の液状調製物、例えば、 リポソーム調製物を包含する。
全身の投与のために、注射は好ましく、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下を 包含する。注射のために、本発明のオリゴマーは液体の溶液、好ましくは生理学 的に適合性の緩衝液、例えば、バンク溶液で配合される。さらに、オリゴマーは 固体の形態で配合し、そして使用直前に再溶解または懸濁させることができる。
凍結乾燥した形態をまた包含される。全身的投与のための使用できる投与量は、 好ましくは約０．０１ｍｇ／　ｋｇ　〜５０ｍｇ／　ｋｇの範囲であり、１日１ 回または２回投与される。しかしながら、異なる投与のスケジュールは、（ｉ） 標的ＤＮＡまたはＲＮＡの活性を阻害すうときの個々のオリゴマーの効能、（ｉ ｉ）所定の標的遺伝子に関連する病理学的疾患の状態のひどさまたは程度、ある いは（ｉｎ）所定のオリゴマーの薬力学的挙動に依存して利用することができる 。
全身的投与は、また、経粘膜的または経皮的手段によることができるか、あるい は化合物は経口的に投与することができる。経粘膜的または経皮的投与のために 、透過すべき障壁に対して適当な浸透剤を配合物の中に使用する。このような浸 透剤は一般にこの分野において知られており、そして、例えば、経粘膜的投与の ための胆汁塩類およびフシジン酸誘導体を包含する。さらに、洗浄剤を使用して 透過を促進することができる。経粘膜的投与は、例えば、鼻の噴霧、または半割 の使用により行うことができる。オリゴマーは普通の経口的投与の形態、例えば 、カプセル剤、錠剤またはトニックに配合される。
局所的投与のために、本発明のオリゴマーは、この分野において一般に知られて いるように、軟膏、軟膏剤、ゲル、またはクリームに形成される。眼の適応、例 えば、ウィルスの感染のための本発明のオリゴマーの配合物は、この分野におい て知られている標準の組成物に基づく。
治療的使用に加えて、本発明のオリゴマーは、それらが特異的に結合する標的核 酸配列の存在または不存在を検出する診断試薬として使用できる。本発明のオリ ゴマーの増強された結合アフィニティーは、プライマーまたはプローブとしての それらの使用のための１つの利点である。診断試験は、二重らせんまたは三重ら せんの形成を通してハイブリダイゼーションにより実施することができ、次いで 二重らせんまたは三重らせんの形成を普通の手段により検出する。
例えば、オリゴマーを放射性、蛍光性、または発色性標識で標識化し、そして固 体の支持体に結合した標識の存在を検出することができる。あるいは、二重らせ んまたは三重らせんの存在は、これらの形態を特異的に認識する抗体により検出 することができる。プローブとしてこのようなオリゴマーを使用するアッセイを 実施する手段は一般に知られている。
三重らせんの形成による診断剤として修飾された塩基を含有するオリゴマーの使 用は有利である。なぜなら、三重らせんは温和な条件下にドメインし、こうして 被験標本を厳しい条件に実験しないでアッセイを実施できるからである。細菌、 真菌または原生動物の配列の同定のためのＲＮＡの検出に基づく診断アッセイは 、実験室において成長した試料または生物からのＲＮＡの単離をしばしば必要と し、これは、ＲＮＡが偏在するヌクレアーゼに対して極端に感受性であるので、 労力を要しかつ時間を消費する。
オリゴマーのプローブは、また、追加の修飾１、例えば、修飾された糖および／ または置換連鎖組み込むことができ、ここでこのような修飾はオリゴマーをこと にヌクレアーゼ安定性とし、こうして通常ヌクレアーゼ活性を含有する細胞また は組織抽出物の存在下に実施するアッセイのために有用である。末端の修飾を含 有するオリゴマーは、特異性を損失しないで、相補的配列に結合するそれらの能 力をしばしば保持する（Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ、　Ｒｅｖｉｅｗｓ　（１ ９９０）　９０：５４３−５８４）。前述したように、本発明のプローブは、ま た、別の鎖への特異的結合を可能とするリンカ−を組み込むことによって、この ようなリンカ−を含有することができる（Ｐｒｏｅｈｌｅｒ、　Ｂ、Ｃ，ら、Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９９２）　３１　：　１６０３−１６０９）　； 　１ｌｏｒｎｅ　ら、Ｊ、Ａｍｅｒ。
Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　（１９９０）　１１２　：　２４３５−２４３７）。
ある種の共有結合の架橋剤をまた含有するプローブの中への本発明の塩基類似体 の組み込みは、診断または検出のアッセイにおいて感受性を増加しかつバックグ ラウンドを減少する可能性を有する。
さらに、架橋剤の使用は、新規なアッセイの変更、例えば、（１）プローブの識 別を増加するための架橋の使用、（２）バックグラウンドを減少するための変性 洗浄工程の組み込み、および（３）標的の中の２次構造を減少しかつプローブの 特異性を増加するために、ハイブリッドの溶融温度またはその付近におけるハイ ブリダイゼーションおよび架橋を実施すること、を可能とするであろう。ハイブ リダイゼーションの条件の変更は従来記載された（Ｇａｍｐｅｒら、Ｎｕｃ！ｅ ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８６）　１４　：　９９４３）。
本発明のオリゴマーは、オリゴマーまたは検出すべきオリゴマー核酸を記載され ているように固体の支持体に共有結合的に取り付ける方法を使用する診断のアッ セイにおける使用に適する（米国特許第４．７７５．６１９号）。オリゴマーは 、また、記載された方法に従い標的配列を増幅するポリメラーゼ連鎖反応技術に 頼る診断のアッセイにおける使用に適する（欧州特許公開第０３９３７４４号） 。５−修飾ピリミジンを含有する本発明のオリゴマーは、ポリメラーゼ連鎖反応 法において使用するポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑまたはベント（ＶｅｎｔＲ） ポリメラーゼと適合する。こうして、本発明のオリゴマーはＰＣＲプロトコール におけるプライマーとして利用することができるか、あるいは５−位置にＲ２を 有しトリホスフェートピリミジンモノマーは好熱性物質（Ｔａｑまたはベント（ Ｖｅｎｔ’　））または他の源（大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）、ヒト、ライノウィ ルスなど）から誘導されたＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼにより基質として利 用して、種々の診断のプロトコールにおいて本発明のオリゴマーを発生させるこ とができる。モノマーのトリホスフェートの合成は既知の方法によりオリゴマー は、離散した配列であるプライマーとして、あるいはランダム配列をもつプライ マーとして有用である。ランダム配列のプライマーは、一般に、約６または７ヌ クレオモノマーの長さである。このようなプライマーは種々の核酸の増幅のプロ トコールにおいて使用することができる（ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応など）また はクローニングのプロトコールにおいて使用することができる。本発明の５−置 換体は、一般に、プライマーとして機能するオリゴマーの能力を妨害しない。３ ′末端の残基以外の部位に２′−修飾、オリゴマーをＲＮアーゼＨ非受容性とす るか、あるいはそうでなければヌクレアーゼ安定性とする他の修飾を有する本発 明のオリゴマーは、細胞抽出物またはヌクレアーゼを含有する他の溶液において ＲＮＡまたはＤＮＡ配列のためのプローブまたはプライマーとして有利に使用す ることができる。こうして、標的核酸を含有する試料とオリゴマーを混合し、次 いでオリゴマーを標的核酸とハイブリダイゼーションさせ、そしてＰＣＲ，ＬＣ Ｒまたは他の適当な方法により標的核酸を増幅することによって、試料の中の核 酸を増幅するプロトコールにおいてオリゴマーを使用することができる。
キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ、　ＤＴＰＡまたはｌ、２−ジアミノシクロヘキ サン酸の類似体に対して誘導したオリゴマーを、記載されているように種々のｉ ｎ　ｖｉｔｒｏの診断アッセイにおいて利用することができる（米国特許第４． ７７２．５４８号、米国特許第４．７０７．４４０号および米国特許第４．７０ ７．３５２号）。あるいは、本発明のオリゴマーは、架橋剤、例えば、５＝（３ −ヨードアセトアミドプロプ−１−イル）−２′−デオキシウリジンまたは５− 　（３−（４−ブロモブチルアミド）プロプ−１−イル）−２′−デオキシウリ ジンで誘導し、そして記載されているように種々のアッセイの方法またはキット において使用することができる（国際特許公開第ＷＯ９０／　１４３５３号）。
前述の用途に加えて、遺伝子の発現を阻害するオリゴマーの能力を、ｉｎ　ｖｉ ｔｒｏ系において被検体の細胞の中の発現のレベルを測定するか、あるいは組換 え系において適当な方法により評価することができる（Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ、 　Ｍ、ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９９１）　１９　：　５ ３−５９）。
ここにおいて引用したすべての参考文献を、それらの全体において、引用によっ てここに加える。
下記の実施例によって、本発明を説明するが、本発明はそれらに限定されない。
使用した数（例えば、量、温度など）に関して精度を保証することに努力したが 、多少の実験誤差および偏りを考慮すべきである。特記しない限り、部は重量部 であり、温度はセ氏であり、そして圧力は大気圧またはその付近である。
実施例１ ５−（１−プロピニル）−２′−デオキシウリジンＨ−ホスホネートのモノマー および類似体を含有するオリゴマーの合成５０ｍ１の丸底フラスコに、次の成分 を入れる：ａ　）　７０８ｍｇ　（２ｍｍｏｌ）の５−ヨードｄＵｂ）　ｌ０ｍ １の無水ＤＭＦ ｃ　）　７６ｍｇ　（０，４ｍｍｏｌ）のＣｕ１ｄ）　５５５ｕｌ　（４ｍｍｏ ｌ）のＥｔ＋Ｎｅ　）　２３１ｎｇ　（０，２＋ｎ＋ｎｏｌ）の（ＰｈｌＰ）、 Ｐｄｒ）室温において攪拌しながらプロピンガスで飽和する（はぼ１０分） ２時間後、さらにプロピンガスを泡立てて通人し、そして反応混合物を室温にお いて一夜攪拌する。次の朝、さらにプロピンを泡立てて通人し、そしてさらに２ 時間攪拌する。反応混合物に、ドウウエックス（Ｄｏｗｅｘ）イオン交換樹脂（ ＨＣＯｘ型）　、１０ｗ＋ｌのＭｅＯＨおよび１０ｍ１のＣＨ，Ｃ１１を添加し 、そして１時間攪拌する。樹脂を濾過し、ＭｅＯＨで洗浄し、そして上澄み液を 蒸発させる。シリカゲルのクロマトグラフィーにより、５１７ｍｇ　（１，９４ ｎ＋ｗ＋ｏｌ、　９７％収率）の生成物が得られた。＃脛：　）ｌｏｂｂｓ、　 Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、　（１９８９）　５４　：　３４２０−３４２２゜ 精製した物質を５　’　ＤＭＴで保護し、そして記載されているように用した（ Ｆｒｏｅｈｌｅｒ、　Ｂ、Ｃ，ら、米国特許第４．９５９．４６３号；　Ｆｒｏ ｅｈｌｅｒ。
Ｂ、　Ｃ，ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　（１９８６）　２７ 　：　５５７５−５５７８）。
次の表示法を使用して、以下の実施例において表示した番号のオリゴマーの中の 塩基を表す＋Ａ、　Ｔ、　ｃ、Ｃ１およびＵはそれらの普通　意味を有する。Ｃ ′＝５−メチル−２′−デオキシシチジン、Ｃ０＝５−　（１−プロピニル）− ２′−デオキシシチジン；Ｕ０＝５−（１−プロピニル）−２′−デオキシウリ ジン。
実施例２ 二重らせんＤＮＡに結合する５−プロピニルウラシル残基を含有するオリゴマー （ＯＮ）を使用する三重らせん構造体の形成これらのオリゴマーを次のようにし て合成した：０Ｎ−１　５’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＴ ＴＴＴ　３’０Ｎ−２５’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　Ｕ０Ｕ ０Ｕ０ＵＯＵ０３’０Ｎ−３５’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　Ｕ０Ｃ’　Ｕ’Ｃ ’　Ｕ０ＴＯ’　ＴＵ’　３’各オリゴマー（ＯＮ）を、標的配列５　’　ＡＧ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡ　３　’を含有する二重らせんＤＮＡとハイブリダ イゼーションさせた。ハイブリダイゼーションは１４０ｍＭ　ＫＣＩ、５ｍＭ　 ＭｇＣＬ、５ｍＭ　Ｎａ２■ＰＯ＋、　ｐＨ６，６の中で実施した。各オリゴマ ーと標的配列との間に形成した生ずる三重らせんの熱安定性Ｔ６を決定した。次 のＴ、値が得られ、０Ｎ−１（対照オリゴ７−）　ｉ；！４２．１℃テあった。
０Ｎ−２は４８．１℃テあり、そして０Ｎ−３は５５℃であった。０Ｎ−２およ び０Ｎ−３の増加したＴ１１は期待されず、そして形成した三重らせんが対応す る対照の三重らせん構造体よりいっそう安定であることを実証した。
実施例３ ５−プロピニルウラシルまたは５−プロピニルシチジンを含有するオリゴマーの 一本鎖ＲＮＡへの結合 オリゴマーを次のようにして合成した二０Ｎ−１５’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’ 　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＴＴＴＴ　３’０Ｎ−３５’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　 Ｕ’Ｃ’　Ｕ０Ｃ’　Ｕ’　ＴＯ’　ＴＯ’　３’０Ｎ−４５’　ＴＣ０ＴＣ’ 　ＴＣ’　ＴＣｏＴＣｏＴＴＴＴＴ　３’オリゴマーを一本鎖標的ＲＮＡ配列５ 　’　ＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ　３　’と、１４０ｍＭ　ＫＣｌ、　５ 　ｍＭ　ＭｇＣｌ□、５　ｍＭ　ＮａＪＰＯｔ、　ｐＨ６，６の中でハイブリダ イゼーションさせた。二重らせんについて次のＴ８値が得られた；０Ｎ−１（対 照）は６５．６℃であり、０Ｎ−３は７４．０℃であり、そして０Ｎ−４は７３ ．０℃であった。０Ｎ−３および０Ｎ−４と形成した二重らせんは、対照オリゴ マーよりもいっそう安定性であった。驚くべきことには、０Ｎ−３および０Ｎ− ４は、形成した二重らせんが対応する二重らせん構造体よりもいっそう安定であ ることを実証すう、増加したＴ、値を与えた。
実施例４ 対照としてＯＮ−１およびＯＮ−５、５’　００Ｃ’　Ｕ０Ｃ’　００Ｃ’　Ｕ ’Ｃ’　Ｕ０Ｃ’Ｕ０Ｕ０Ｕ０Ｌ１０Ｕ０３　’を使用して、高いｐｌ＋におけ る三重らせんの形成は実証された。オリゴマーを二重らせん標的ＤＮＡと実施例 ２に記載するようにハイブリダイゼーションしたが、ただし緩衝液はｐＨ７，４ であった。次いて、三重らせんのＴ６値を決定した。０Ｎ−１は２７．１のＴ７ を有したが、０Ｎ−５は５１．５のＴ、を有した。こうして、５−プロピニルウ ラシルを含有するオリゴマーは高いｐ■レベルにおいて三重らせんを形成するこ とができたが、対照オリゴマーは生理学的温度より低い温度においてのみ三重ら せん構造体を形成した。
決定の追加の組、デオキシウリジンの５−置換基が、プロピニルの代わりに、３ −メチルブチニル（ＯＮ−５Ａ）または３，３′−ジメチルブチニル（ＯＮ−５ Ｂ）である０Ｎ−５の修飾された形態において、二重らせんおよび三重らせんの 溶融温度への同様な作用が観察された。結果を下表１に示す。
０Ｎ−１６３，０５４，５３９，６−−０Ｎ−５７９，０６５，５６４，８＋２ ５．２ＯＮ〜５Ａ　７３．５　６５．５　５５．９　４１６．３ＯＮ−５Ｂ　６ ８，５　６６．０　４２．５　＋　２．９ａ　）　１４０ｍＭ　ＫＣＩ／　５　 ｍＭ　Ｎａ、ＰＯ，／　Ｉ　ｍＭ　ＭｇＣ１，（ｐＨ６，６０）におけるＴ。
実施例５ ５−（３−メチル−１−ブチニル）−２′−デオキシウリジンＨ−ホスホネート を５−ヨードウリジンから実施例１において５−（Ｉ−プロピニル）−２′−デ オキシウリジンＨ−ホスホネートについて本質的に記載したようにして合成した が、ただしプロピンの代わりに５当量の３−メチル−１−ブチン液体を使用した 。次いで、シリカゲルで精製した物質を５’−ＭＭＴ、３’−Ｈ−ホスホネート モノマーに変換し、モして固相合成において使用して次のようなオリゴマーを発 生させた（実施例２に記載するようにチミンおよび５−メチルシトシンを含有す る対照として、０Ｎ−１を使用した）二〇Ｎ−＋　５’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＴＴＴＴ　３’０Ｎ−６５’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’Ｕ’Ｃ ’Ｕ’ＣＵ’ＴＵ’ＴＵ’３’０Ｎ−７５’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’Ｕ ’Ｕ’Ｕ’Ｕ’Ｕ’３Ｕ′と表示する塩基の残基は５−（３−メチル−１−ブチ ニル）ウラシルに相当する。オリゴマーを、標的配列、５　’　ＡＧＡＧＡＧＡ ＧＡＧＡＡＡＡＡ３’を含有する二重らせんＤＮＡとハイブリダイゼーションさ せた。ハイブリダイゼーションは実施例２に記載する緩衝液の中でｐＨ６，２上 に実施した。０Ｎ−１は５１．０℃のＴ１を有したが、０Ｎ−６のＴ□は５５． ２℃であり、そして０Ｎ−７のそれは５５．０℃であった。
実施例６ 二重らせんおよび三重らせん構造体の安定性および標的遺伝子の発イゼーション させて、それぞれ、三重らせんおよび二重らせんを形成した後、熱的変性または 安定性（Ｔ、）に関して試験した。使用したＤＮＡ標的は、自己相補的領域を含 有しそしてヘアピンの末端に４ヌクレオチドのループを有するオリゴマーであっ た。標的は次の通りであった： ＤＮＡ二重らせん標的：　５’　ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡ　”　 Ｔ３’　ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴ　Ｔ　ＴＲＮＡ標的：　５’　 ＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ　３’三重らせんの結合についてのアッセイは １４０ｍＭ　ＫＣＩ／　５　ｍＭＮａ２１（ＰＯ＋　／　５ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ、 　ｐｔ（６，６０の中で実施し、そしてすべてのオリゴマーの最終濃度は約２μ Ｍであった。
前述の０Ｎ−１を対照として使用した。
被験オリゴマー８〜ｌＯはチミンについて５−プロピニルウラシルそしてメチル シトシンについて５−プロピニルシトシンの置換基を含有する。
０Ｎ−８５’　−ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　Ｕ’Ｃ’　Ｕ’Ｃ’　Ｕ’ＴＵ’Ｔ Ｕ０３’０Ｎ−９５’　−ＴＣｏＴＣｏＴＣｏＴＣｏＴＣｏＴＴＴＴＴ　３’０ Ｎ−１０５’　−ｕ０ｃ０ｕ０ｃ０ｕ０ｃ０ｕ０ｃ０ｕ０ｃ０ｕ０ｕ０ｕ０ｕ０ ｕ’　３’得られた結果が示すように、三重らせんの形成に関して、対照０Ｎ− １は４３．４℃のＴ□を与えた。０Ｎ−８は５５．５℃の高いＴ１を与えた；そ して０Ｎ−９は２６．３℃のＴ、を与えた。Ｕｏを含有する０Ｎ−８は、０Ｎ− １に関して、２．４℃のＴ、Ｒの増加／置換（ΔＴ、、６．６＝＋１２．１℃） を示し、そしてＣ０を含有する０Ｎ−９は、０Ｎ−１に関して、３．４℃のＴ、 の減少／置換（ΔＴ、　、　６．６　＝−１７，１℃）を示した。第３鎖が２′ −デオキシシチジンを含有する三重らせんのＴ。
はｐ＋依存性であり、そして異なるｐＨ（５，８〜７，４）におけるＴイを使用 して複合体のｐｏ依存性を検査した。すべてのＯＮでは、プロットの傾斜は比較 的一定に止まった（−１８〜−２０℃／ｐＨ単位）。
０Ｎ−９の低いＴ□は、０Ｎ−１および０Ｎ−８に関して、複素環の塩基性によ り説明することができる。Ｃ０およびＣ′の塩酸塩の滴定により、５−プロピン 分析Ｃ０のｐに、（３，３０±０．０５）は５−メチル誘導体Ｃ’　（４，３５ ±０．０５）より１．０５単位低いことが示された。三重らせんの形成における プロトン化の重要性が実証され、そして前述の結果が示すように、シトシンの核 塩基の塩基性の減少は複合体の安定性に劇的な作用を有する。驚くべきことには 、シトシン（Ｃ０およびＣ’）のｐＫ、における大きい差はＴ、／ｐＨのプロッ トの傾斜に対して有意な作用をもたない。
オリゴマー／ＲＮＡの二重らせんの形成に関すると、対照０Ｎ−１は６５．５℃ のＴ、を有し、０Ｎ−８は７４．０℃のＴ６を有し、０Ｎ−９は７３．０℃のＴ 、を有し、そして０Ｎ−１ｏは９０℃より大きいＴ、を有した；Ｕｏを含有する ０Ｎ−８は１．７℃／置換のＴ、の増加を生じ、そしてＣ０を含有する０Ｎ−９ は１．５℃／置換の増加を生ずる。これらの条件下で、ＵｏおよびＣ０との完全 な置換を含有する０Ｎ−１ｏは９０℃より大きいＴ、、（はぼ１．７℃／置換） を有し、これらの置換の結合アフィニティーの増加が加法的であることを示す。
これらの結果が示すように、二重らせんの複合体はＣ０およびＵｏとの置換によ り大きく安定化されそして、したがって、これらの類似体は有用なアンチセンス ＯＮの新規なりラスを表す。
追加の修飾としてホスホロチオエートのヌクレオチド内の連鎖を含有するオリゴ マーにおいて００とＵｏとの組み合わせを使用して、結合アッセイを実施した。
ホスホロチオエート連鎖はオリゴマーをヌクレアーゼ安定性するが、未修飾ホス ホジエステル連鎖に関して相補的標的配列に対する結合アフィニティーを減少す る。この分野において知られている他のホスホジエステル連鎖の類似体、例えば 、アルキルホスホネート、メチルホスホネート、ホスホルアミダイトおよびトリ エステルの連鎖は同様な制限に悩まされる。予期せざることには、結合アフィニ ティーを増強する複素環の修飾（ここにおいて正の修飾と定義する）、例えば、 ＵｏまたはＣ０、およびアフィニティーを減少する変更（ここにおいて負の修飾 として定義する）を含有するオリゴマーは、負の修飾のみを含有するオリゴマー に関して、改良された結合（すなわち、両者の加法的作用−正および負−により 予測されるより大きい結合アフィニティー）を有することが発見された。驚くべ きことには、プロピンの修飾はホスホロチオエート連鎖の負の結合作用と予期さ れない程度に反作用する。すなわち、ＴおよびＣ′を含有するオリゴマーについ て、ホスホジエステルとホスホロチオエートとの間のΔＴ６は１４℃（０，７℃ ／置換）であるが、ＵｏおよびＣ０を使用するときのΔＴ、は６．０℃（０，３ ℃／置換）である。これらの結果は、負の修飾（置換連鎖、例えば、ホスホロチ オエート）と正の修飾（塩基の類似体、例えば、５−置換ピリミジン）との間の 相乗的効果を明瞭に示し、ここで正の修飾は、結合アフィニティーに関して加法 的であるよりも大きい程度に補償した。得られた結合の結果（ホスホジエステル 連鎖に関するΔＴ、）を、下表２に示す。
表２ ＡＴＩＴＴＣ’　ＴｒＣ’　ＡＴＴＴＴＴＴＣ’　ＴＴＣ’　５４．０　４０． ０　−１４．０八ｕ０ｕ０ｕ０ｕ０ｃ’　ｕ０ｕ０ｃ’　八ｕｏｕｏｕｏｕｏｕ ｏυ０Ｃ’Ｌ１０Ｌ１０Ｃ’７６．５　６８．５　−８．０ＡＵ０Ｕ０Ｕ０［Ｊ ０Ｃ０Ｕ０Ｕ０Ｃ０ＡＵ０Ｕ０Ｕ０Ｕ０Ｕ０Ｌ１０Ｃ０Ｕ０Ｕ’Ｃ０８２，５７ ６，５−６，０Ｔ抗原（ＴＡｇ）に相当する標的ＲＮＡを使用する二重らせんの 形成に関してｉｎ　ｖｉｖｏで得られた追加のデータは、標的へのオリゴマーの 結合が本発明の５−置換オリゴマーについて配列特異的であることを示す。追加 のオリゴマー２１および２２を調製した。０Ｎ−２２は、前述したようにＴ抗原 のコーディング領域をターゲツティングするようにデザインした０Ｎ−２１の不 規則な形態である。
０Ｎ−２１：　ＡＵ’υ’Ｕ’Ｕ０Ｃ’　Ｕ’Ｕ’Ｃ’　ＡＵ０Ｕ’Ｕ’Ｕ０Ｕ ’Ｕ’Ｃ’　ＵｏＵｏＣ’０Ｎ−２２：　Ｕ０Ｕ’ＡＵ０Ｕ０ＡＵ０Ｃ’　Ｕ’ ００Ｃ’　Ｕ０Ｕ０Ｃ’　Ｕ０Ｕ’Ｕ’００Ｃ’υ０オリゴマーをホスホジエス テル（ＯＮ−２１，０Ｎ−２２）およびホスホロチオエート（ＯＮ−２１Ａ、　 ０Ｎ−２２Ａ）の形態で試験した；そして０Ｎ−２１Ｂおよび０Ｎ−２２Ｂは２ ′−〇−アリルＴおよびＣ′オリゴマーである。結果を表３に示す。
０Ｎ−２２５３，０２３，５ ＯＮ−２１Ａ　６８．０ ＯＮ−２２Ａ　４２．０　２６．０ ＯＮ−２１Ｂ　７０．０ ＯＮ−２２Ｂ　４５．　Ｏ２５，０ 不規則な形態と不規則でない形態との間のＴ□の差は、使用したピリミジンおよ び連鎖の置換を無視すると、おおよそ同一である。
載されているｉｎ　ｖｉｖｏのアンチセンスアッセイの変更において、Ｔ抗原（ ＴＡｇ）をターゲツティングするようにデザインした追加のオリゴマーを、また 、Ｕｏおよび／またはＣ０ならびに修飾されたヌクレオチド内の連鎖を含有する ように修飾した。このアッセイは５Ｖ４０Ｔ抗原のための発現ベクターを使用す る。コーディング領域における配列をターゲツティングするようにデザインした オリゴマー（ＯＮ−１１〜０Ｎ−１７）を使用した。このアッセイにおいて使用 したオリゴマーは、次の通りであった。
ＯＮ　１１：　５’　ＡＴＴＴＴＣ’　ＴＴＣ’　ＡＴＴＴＴＴＴＣ’　ＴＴＣ ’　３’ＯＮ　１２：　０Ｎ−１１のホスホロチオエートの形態ＯＮ　１３：　 ５’　ＡＵ０Ｕ０Ｕ０Ｕ０Ｃ０Ｕ０Ｕ０Ｃ’ＡＵ０Ｕ’Ｕ０Ｕ’Ｕ’Ｕ０Ｃ０Ｕ ’Ｕ０Ｃ’　ａ’ＯＮ　１４：　０Ｎ−１３のホスホロチオエートの形態ＯＮ　 １５：　ホスホロチオエート５’　Ｃ０Ｕ’Ｕ０Ｃ０ＡＵ０Ｕ０Ｕ’Ｕ０Ｕ’Ｕ ０Ｃ０Ｕ０Ｕ０Ｃ’　３’ＯＮ　１６：　；ｈス＊ｏチオエート５’　Ｃ０Ｕ０ Ｕ０Ｃ０ＡＵ０Ｕ’Ｕ０Ｕ０Ｕ’Ｕ０Ｃ０ＬＩ０３’ＯＮ　１７：　ホスホロチ オニー　ト５’　Ｃ０Ｕ０Ｕ’Ｃ０ＡＵ’Ｕ０Ｕ０Ｕ０Ｕ’Ｕ０３’ＯＮ　１８ ：　ホスホロチオエート５’　Ｃ０Ｕ０Ｕ０Ｃ０ＡＵ’Ｕ０＾Ｕ０Ｕ０Ｕ０ｃ０ Ｕ０Ｕ０ｃ０３′ＯＮ　１９：　ホスホロチオエート５’　Ｃ０Ｕ０Ｕ’Ｕ０Ｃ ０Ｕ０Ｕ０Ｃ０Ｕ０Ｕ’ＡＣ０Ｕ０Ｕ０Ｃ０３’０Ｎ１Ｂおよび１９は不一致の 対照であり、そして肉太の文字で示す配列の不一致をもつ０Ｎ１５において見い だされる同一の塩基組成を有する。
相補的ＲＮＡをもつオリゴマーのＴ１を前述したようにして決定した。
細胞の中のオリゴマーのヌクレアーゼ安定性およびＴ抗原の合成を阻害するオリ ゴマーの能力を、また、決定した。結合したＲＮＡにＲＮアーゼＨ感受性を付与 する０ＮＩＩ−ＯＮ１７の能力を、また、決定し、そして各オリゴマーはＲＮア ーゼＨ感受性を付与することが発見された。
アンチセンスの合成のプロトコールは、実施例７において詳述されている。結果 を表４に示す。
煮ユ ０Ｎ−１１５４，０℃ ０Ｎ−１２４０，０’　＋　ｎ、　ｓ。
０Ｎ−１３８２，５°　２．５ ＯＮ−１４７６、５°　＋　０．０５ ＯＮ−１５７１，０’　＋　０．１０ ＯＮ−１６６３，５°　＋　０．２５ ＯＮ−１７５３，５°　＋　１．０ ＯＮ−１８５９，５°　＋　０．５０ ＯＮ−１９４３，０’　＋ ０Ｔ、　、１　ｍＭ　ＭＣＣ１２の中のｐＨ６，６における前述と同一の条件下 に決定した二重らせんの熱安定性。
”　Ｓ、Ｎ、、　３７℃において生きている細胞の中のヌクレアーゼ消化に対す る安定性、（−）ヌクレアーゼ感受性、（＋）ヌクレアーゼ耐性。
”０１ｃ＋ｏ、　ＴＡｇ発現の５０％阻害を示すオリゴマー濃度（μＭ）；（− ）検出されたＴＡｇ発現の阻害なし；　（ｎ、ｓ、）　、　２５μＭにおける非 特異性阻害。
理解されるように、ホスホロチオエート連鎖をホスホジエステルで置換すると、 標的ＲＮＡに対するオリゴマーのアフィニティーは減少するが、細胞の中のオリ ゴマーのヌクレアーゼ安定性は増加する。
チミンおよびシトシン塩基を本発明の５−置換塩基で置換すると、オリゴマーの アフィニティーは増加する。オリゴマーの増加した濃度（ジエステル、０Ｎ−１ ３）において、オリゴマーのアフィニティーの増加は検出可能なＴ抗原合成の阻 害に導いた。修飾された塩基を含有するホスホロチオエート類似体は十分に安定 であり、モしてＴ抗原の合成の阻害を実行するために十分なアフィニティーを有 する。
ＩＣ，。値の増加は０Ｎ−１５に関してＯＮ＋８および０Ｎ−１９のＴ□の減少 に関連し、不一致の数が増加するとき、これらのオ＋）ゴマ−が標的配列へ効果 的に結合するていどは低くなった。これらの結果は、本発明のアンチセンスのオ リゴマーにより標的遺伝子の発現の配列特異的阻害を実証する。
ＴＡｇ合成の阻害に加えて、β−ガラクトシダーゼＲＮＡに対して相補的である 、ホスホロチオエートのオリゴマー、０Ｎ２０．　５　’　Ｕ’００ＧＣ’ｃ’ 　ｃｕ０ｕ０ｕ’ｕ０ｃ’　ＡＵ０Ｃ’　ＡＵ０Ｕ’Ｕ’ＡＡＵ０３　’　ハ、 ２．５μＭ（７）　１ｃｓｏ　テ配列特異的方法でβ−ガラクトシダーゼを阻害 することができた。ＴおよびＣ′をもつ０Ｎ２０Ａ、　０Ｎ２０は、配列特異的 方法でβ−ガラクトシダーゼの発現を阻害しなかった。
エクションの法を使用してｉｎ　ｖｉｖｏの生物学的効能について評価した。こ のプロトコールは、従来記載された方法と異なり、トランスフェクションした遺 伝子の発現についての内部の対照として働く追加の接合した遺伝子を使用する（ Ｇｒａｅｓｓｍａｎ、　Ｍ、ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ縫（１９９１）す ：　５３−５９）。ＴＡｇ　ＲＮＡに対して異なる領域にターゲツティングする アンチセンスのオリゴマーの変化する量と一緒に、ＴＡｇ発現するｐｓＶ４０プ ラスミドの５〜ｌＯコピー／細胞を使用して、マイクロインジェクションを実施 した。接合マーカー、例えば、４０コピーのプラスミド／細胞を使用し、ここで このマーカーはＲ３Ｖプロモーターのコントロール下にβ−ガラクトシダーゼ遺 伝子またはＳＶ４０のコントロール下にクロランフェニコールアセチルトランス フェラーゼ遺伝子を含有した。マーカー遺伝子は、遺伝子の発現の阻害の特異性 を示すすることができるように、容易に測定可能なタンパク質を発生する遺伝子 である。アンチセンスのオリゴマーは、マーカー遺伝子のタンパク質生産物を生 産し続ける細胞の能力に影響を与えない。適当なマーカー遺伝子は、クロランフ ェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）　、β−ガラクトシダーゼ、 ルシフェラーゼまたは細胞表面の抗原、酵素またはアッセイ法が既知であるマー カーを発生する。アンチセンスのオリゴマーを使用しない対照実験において、マ イクロインジェクションした細胞の１００％はマイクロインジェクション後４． ５時間でβ−ガラクトシダーゼタンパク質を発現したが、マイクロインジェクシ ョンした細胞のほぼ６０％は、二重標識の免疫蛍光標識化技術により検出して、 ＴＡｇ抗原を発現した。ＴＡｇ　ＲＮＡの中の標的配列は、転写開始ＡＵＧコド ンからほぼ１５０塩基のコーディング配列、５′−非翻訳領域における配列およ びＡＵＧコドンにおける配列を含んでいた。５μＭ〜２５μＭのオリゴマー濃度 において９〜２０塩基の長さのアンチセンスのオリゴマーを検査し、そして化合 物をインジェクション後４．５〜７２時間範囲の時間においてアッセイした。本 質的に記載されているような条件を使用してＣＶＩまたはＲａｔ　２細胞をマイ クロインジェクションした（Ｇｒａｅｓｓｍａｎ、　Ｍ。
ら、前掲）。
標的配列の結合および標的遺伝子 ■。ホスホジエステルのアンチセンスのオリゴマー（ＯＮ−１１）を対照として 使用して、オリゴマー（５’　ＡＴＴＴＴＣ’　ＴＴＣ’　ＡＴＴＴＴＴＴＣ’ ＴＴＣ’３’）を系統的に変化させた。同一オリゴマーのホスホロチオエート類 似体（ＯＮ−１２）をまた調製したが、これは変更した塩基をもたなかった。普 遍的に置換された本発明の塩基を有する対応するオリゴマーを、ホスホジエステ ル（ＯＮ−１３）およびホスホロチオエート（ＯＮ−１４）の両者の形態で調製 した：最後に、ホスホロチオエート連鎖をホスホジエステルで置換すると、標的 ＲＮＡに対するアフィニティーは減少するが、ヌクレアーゼ安定性は増加する。
Ｔ抗原の発現の経時的分析において、０Ｎ−１３（ＵｏおよびＣ０を含有するホ スホジエステル連鎖オリゴマー）は、２５μＭの濃度において細胞の中にマイク ロインジェクションした後、６時間まで検出可能な活性を有することが示された 。対照的に、０Ｎ−１４（ＯＮ−１３と同一の配列をもつＵｏおよびＣ０を含有 するホスホロチオエート連鎖オリゴマー）は、２５μＭのオリゴマーを細胞の中 にマイクロインジェクションした後、４８時間まで活性であった。
９７−（５’　Ｃ０Ｕ０Ｕ０Ｃ０ＡＵ０Ｕ０Ｕ０Ｕ０３　’　＞および１１マー （ＯＮ−１７）の両者のホスホロチオエートは、本発明の５＝置換塩基を含有す るとき、Ｔ抗原の合成を阻害することができた。しかしながら、９７−は比較的 弱い配列特異的阻害活性を有した。
また、前述のアッセイにおいてｍＲＮ＾のＣＡＰ部位付近におけるＴ抗原の５′ −非翻訳領域に結合するようにデザインしたオリゴマー（５’ＵＴ）、および開 始コドンの領域に結合するようにデザインしたオリゴマーを試験した。これらの オリゴマーは下に示す配列を有する： ５’ＵＴオリゴマー：　５’　−ＧＣＣＴＣＣＴＣＡ　ＣＴＡ　ＣＴＴ　ＣＴＧ 　ＧＡ−３’ＡＵＧオリゴマー：　５’　−ＣＡＴ　ＣＴＴ　ＴＧＣＡＡＡ　Ｇ ＣＴ　ＴＴＴ　ＴＧ−３’チミンおよび５−メチルシトシン塩基から構成された ５’ＵＴおよびＡＩＩＧオリゴマーのホスホロチオエートの形態を使用して、２ ０μＭにおいて検出可能な阻害を実施することができた。しかしながら、５−プ ロピニルウラシルが系統的にチミン残基で置換されたホスホロチオエート類似体 は、ｌμＭにおいて１００％の阻害を示した。
５′−非翻訳領域領域にＴ抗原の標的配列を使用するこのアッセイ系による他の 実験において、Ｃ０がＣと置換しそしてＵｏがＴと置換した完全に置換したヌク レオモノマーを含有するオリゴマーにおいて、２′−〇−アリル置換を含有する 以外にホスホジエステル連鎖を含有する本発明の修飾されたオリゴマーの置換は 、Ｔ抗原の合成を阻害することができることが証明された。表５は５’ＵＴオリ ゴマーを使用して得られた結果を示す。オリゴマー１〜４は上に示した配列を有 する２０マーであった。オリゴマー５は上に示した下線を施した配列およびチミ ジンと置換した５−プロピニルウリジンおよびシチジンと置換した５−プロピニ ルシチジンを有した。
１、　２’　−０−Ｍｅ　（Ｕ、Ｃ）　ｎ、ｉ、重重２、　チオエート（Ｔ、　 Ｃ’　）　７０．５　２．５３、　チオエート（Ｕｏ、　Ｃ’　）　８１．０　 ０．５４、　チオエート（Ｕｏ、Ｃ”）　＞９０．０　０．２５５、　２’−０ −アリル（Ｕｏ、　Ｃ０）　＞９０．０　５．０＊チオエートまたはホスホロチ オエートの連鎖＊＊５μＭにおいて検出可能な阻害なし表５に示すように、ホス ホルアミダイトの主鎖または２’−０−アリル置換と一緒にＵｏおよびＣ０を含 む種々の組み合わせは阻害を提供した。オリゴマー５はＲＮアーゼＨの基質では ないが、ＴＡｇ発現が観察された。オリゴマー５により仲介される阻害は、２′ −０−アリル修飾が付与する高いアフィニティーおよびヌクレアーゼ安定性から 生ずると信じられる。完全なまたは部分的な２′−〇−アリル修飾を含有するオ リゴマーの中へのＵｏおよび／またはＣ０の組み込みは、標的遺伝子の発現を阻 害するために使用できるオリゴマーを提供するであろう。
前述の５　’　ＵＴ、　ＡＵＧコドン領域およびエクソンの中の配列に加えて、 ＴＡｇのイントロン／エクソンの接合部、エクソン／エクソンの接合部における およびイントロンの中のＴＡｇ配列を、標的配列に従いＵｏおよび／またはＣ０ で完全に置換された１５マーのホスホロチオエートのオリゴマーを使用してター ゲツティングした。オリゴマーは約５０％〜約７０％のＵｏおよび／またはＣ０ 塩基をオリゴマーの中に含有した。オリゴマーのすべてはＴＡｇ合成を効果的に 阻害した。
これらの結果が示すように、高いアフィニティーのオリゴマーはＲＮＡ全体を通 じた位置において遺伝子の発現を阻害することができ、こうしてＴＡｇ　ＲＮＡ の中に存在した２次構造にかかわらず有効であった。
実施例７に記載する方法を使用して、０Ｎ−１５をＴ抗原（ＴＡｇ）の阻害につ いて試験した。０Ｎ−１５を組織培養培地の中の５０μＭの細胞外濃度において ＣＶＩ細胞と２４時間インキュベーションし、次いでＴＡｇおよびβ−ガラクト シダーゼ発現プラスミドをマイクロインジェクションした。インジェクション後 ４．５時間に、細胞を固定し、そしてＴＡｇ発現について染色した。ＴＡｇ発現 を効率よく阻害するマイクロインジェクションした０Ｎ−１５との比較により、 細胞外培地の中のインキュベーションした０Ｎ−１５は非常に効率が低く、ＴＡ ｇ合成の阻害は検出することができなかった。５′末端においてフルオレセイン −アミノヘキサノール（Ｆ　１−ＯＮ−１５）で誘導した０Ｎ−１５を５０μＭ の細胞外濃度で使用して、この実験を反復し、０Ｎ−１５を細胞と２４時間イン キュベーションした。０．５μＭの細胞外濃度のＦｌ−ＯＮ−１５をＴＡｇおよ びβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミドと一緒に、対照細胞の中にマイクロイン ジェクションした。マイクロインジェクションしたＦ　１−ＯＮ−１５は核の中 に局在化したが、細胞外培地に添加したＦ　１−ＯＮ−１５はエンドソームおよ びリソソームに似る細胞質の隔室の中に局在化した。ＣＶｌ、　Ｒａｔ　２．　 ＨｅＬａ、　５ＫＯＶ−３，ＢＵＤ−８゜ＢＣ３旧およびｃｃｄ４５ｓｋ細胞系 を使用して、結果の同一パターンが得られた。本発明のオリゴマーは異なる哺乳 動物種において活性であり、こうして種に無関係に遺伝子の発現を変調するため に適する。
商業的に入手可能なカチオン性脂質調製物、リポフエクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔ ｉｎＲ）（ＢＢＬ−ギブコ、カタログＮｏ、８２９２ＳＡ）を使用して、Ｆ　ｌ −０Ｎ−１５および０Ｎ−１５を細胞の細胞質の中に送り出した。オプチメン（ Ｏｐｔｉｍｅ＋ｎ）　（ＢＢＬ−ギブコ）の中の１０μＭのりポフェクチン（Ｌ ｉｐｏｆｅｃｔｉｎ’　）濃度を製造業者の使用説明書に従い使用した。
ＤＯＴＭＡはリポフェクチン（ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＲ）の中に存在する脂質で ある。細胞をＦ　１−０Ｎ−１５−脂質または０Ｎ−１５−脂質の調製物を含有 するオプチメン（ＯｐＬｉｍｅｍ）の中で４時間インキュベーションし、次いて 標準の培地（ＣＶＩ細胞についてｌＯ％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）の中で細胞を１ ６時間インキュベーションした。処理した細胞の免疫蛍光分析により、細胞の約 ９０％は核の中に局在化したＦ　１−０Ｎ−１５を含有することが示された。脂 質−オリゴマーの複合体どのインキュベーション後、細胞の中にＴＡｇおよびβ −ガラクトシダーゼ発現プラスミドをマイクロインジェクションすることによっ て、細胞の中への０Ｎ−１５のデリバリ−をアッセイした。０Ｎ−１５は、１０ μＭの濃度でリポフエクチン（ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＲ）を使用するより、５ｎ Ｍ低いＩＣ５ｏでＴＡｇ発現を阻害した。こうして、カチオン性脂質（例えば、 リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ”　））と複合化したオリゴマーの調製 物は、標識、例えば、フルオレセインおよび／または５−修飾ピリミジン、例え ば、ＵｏまたはＣ０を含有するオリゴマーを細胞の細胞質に送り出すことができ 、オリゴマーの中に組み込まれた修飾、例えば、塩基類似体または標識はカチオ ン性脂質−オリゴマー複合体の形成を妨害したいことが示された。
別のプロトコールにおいて、Ｆ　１−０Ｎ−１５をまた細胞の中にＤＭＳＯを使 用してトランスフェクションのプロトコール塩基送り出した。
１％ＤＭＳＯおよび１ＭＭ　Ｆ　１−ＯＮ−１５を含有するＤＭＥＭ−１０％Ｆ ＢＳ培地の中で、Ｃｖｌ細胞を３７℃において４時間インキュベーションした。
蛍光微鏡検査により、オリゴマーは処理した細胞の約２０％の核の中に局在化す ることが実証された。
商業的に入手可能なアミノヘキサンアミダイト（グレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）を０Ｎ−１５の５’−ＯＨに標準のカップリング条件下にカ ップリングすることによって、Ｆ　１−ＯＮ−１５を合成した。次いで遊離アミ ンをフルオレセイン−ＮＨＳエステル（モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ））に連鎖してＦ　ｌ　−０Ｎ−１５を発生させた。
フルオレセイン遊離オリゴマーの合成は、また、フルオレセインアミダイトまた はフルオレセイン−ＣＰＧを製造業者の使用説明書に従い（グレン・リサーチ） 使用して達成することができる。
実施例９ オリゴマーの合成のための２′−〇−七ソノマー合成５−プロピニル−２′−〇 −アリルウリジンの調製ヌクレオモノマー。３４３ｗ＋ｇ　（０，５０ｍｍｏｌ ）の旦（第４図）を無水ＣＨ１ＣＮ（５＋ｎｌ）中に溶解し、そしてこれに２− ピリジンアルドキシム（６７ｍｇ、　０．５５ｍｍｏｌ）および１．　１．　３ ．　３−テトラメチルグアニジン（７５μ／、　０．６＋ｎｍｏｌ）を室温にお いて添加した。１８時間後、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、そして水性クエ ン酸（０，１Ｍ）で洗浄した。水性層をＥｔＯＡｃで抽出し、−緒にした有機層 を飽和水性Ｎａ）ＩＣＯ，（３回）で洗浄し、ＮａｚＳＯｔで乾燥し、そして蒸 発させた。残留物をＥｔＯＡｃ（５ｍｌ）中に溶解し、そしてこれにＬＭ　ＴＢ ＡＦ／Ｔ）ＩＦ　（１，５ｍｌ、　１．５ｎ＋ｍｏｌ）を添加し、この溶液を１ 時間攪拌し、モしてＥｔＯＡｃで希釈した。この溶液を飽和水性ＮａＨＣＯｓ　 （２回）で洗浄し、−緒にした水性層を乾燥（ＮａｓＳＯｔ）　Ｌ、そして蒸発 させた。残留物を無水ピリジン（１０＋ｅｌ）から抽出し、無水ピリミジン（５ ｍｌ）中に溶解し、そしてこれに塩化ジメトキシトリチル（２００＋ｎｇ、　０ ．６＋ｎｍｏｌ）を添加し、そしてこの溶液を１８時間攪拌した。反応混合物を ほぼ２＋ｎｌに蒸発させ、ＣＨｇＣＩｇで希釈し、飽和水性Ｎａ１（ＣＯｓで洗 浄し、乾燥（ＮａｌＳＯ，）　Ｌ、そして蒸発させた。シリカゲルクロマトグラ フィー（ＥｔＯＡＣ／ヘキサン、１／１）により精製すると、１９７＋ｎｇ　（ ０，３２μｍ１ｍｏ！、　６４％）の第４図に示す６が得られた。
５−プロピニル−２′−〇−アリルシチジンの調製ヌクレオモノマー。３４３ｍ ｇ　（０，５０ｍｍｏｌ）の旦を無水ＣＨｓＣＮ（ｆｏｗ＋）中に溶解し、そし てこの溶液をパール・ボンベ（Ｐａｒｒ　Ｂｏｍｂ）に移し、０℃に冷却し、モ してＮＨ，で飽和した。これを８０℃の浴の中に２４時間（７５ｐｓｉ）入れ、 に関するに冷却し、そして蒸発乾固した。残留物を無水ＤＭＦ（１０ｍｌ）から 蒸発させ、無水ＤＭＦ（５１１１）中に溶解し、そしてこれにジイソブチルホル ムアミドジメチルアセタール（０，２ｍｌ。
０．８４ｍｍｏｌ）を室温において添加した。１８時間後、Ｈ２０（２５μｍ　 ）を添加し、この溶液を蒸発させ、ＥｔＯＡｃ（５ｍｌ）中に溶解し、これにＩ ＭＴＢＡＦ／ＴＨＦ　（１，５ｍｌ、　１．５ｍｍｏｌ）を添加した。１時間後 、反応混合物ＥｔＯＡＣで希釈し、飽和水性Ｎａ）ＩＣＯｌで洗浄し、乾燥（Ｎ ａｓＳＯｔ）　Ｌ、そして蒸発させた。残留物を無水ピリジン（１０ｍｌ）から 蒸発させ、無水ピリジン（５＋ｎｌ）中に溶解し、そしてこれに塩化ジメトキシ トリチル（２００ｍｇ、　０．６＋ｎｍｏｌ）を添加し、そしてこの溶液を５時 間攪拌した。反応混合物をほぼ２＋ｎｌに蒸発させ、ｃｏｔｃ＋ｔで希釈し、飽 和水性Ｎａ１（ＣＯ＋で洗浄し、乾燥（ＮａｓＳＯｔ）　Ｌ、そして蒸発させた 。シリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、２／３〜３／２）に より実施例１０ 第１１図は、ホルムアセクール連鎖５−プロピニル−２′−〇−デオキシウラシ ル２量体を得るために使用した合成のスキームを示す。
この合成プロトコールは、示すように５−ヨードウラシル前駆体の変換により２ 量体のレベルでプロピニル置換基を導入した。同様なプロトコールを使用して３ 量体、４量体、５量体またはより長い５−ヨード前駆体を５−プロピニル生成物 に同様な方法で変換することができる。この合成方法は５−プロピニル生成物の 予期せざるほどに高い収率を与えた。
アルデヒド（１，６当量）を添加し、この懸濁液を０℃に冷却し、そしてＨＣＩ （無水）をこの溶液に約１０分間通人した。この懸濁液を密閉し、モして０〜５ ℃において４時間貯蔵した。生ずる溶液を乾燥し、濾過し、そして蒸発させると 、（２６）が得られた。
ｌＯの調製：３−デオキシ−３′−チオアセチル−５′−ジメトキシトリチル− ５−プロピニル−デオキシウリジンを、０２で前辺てフラッシュしたフラスコの 中のメタノール性アンモニア中に溶解し、そしてこの溶液を密閉し、そして１時 間攪拌した。溶媒を除去し、そして残留物をＥｔＯＡｃ中に溶解し、そしてＮａ Ｈ８０＝およびブラインで洗浄した。有機相を乾燥し、蒸発させ、そしてシリカ ゲルのクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／　ＣＨ２Ｃｌ２）により精製した。生じ るジサルファイドをジオキサン／Ｈ２０中に溶解し、次いでｔ−ブチルホスフィ ン（１，０当量）を添加し、そしてこの溶液を３０分間攪拌した。溶媒を除去し 、そして粗製化合物１０を（２７）の調製に直接使用した。
（ジイソプロピルエチルアミン、２゜５当量）を添加し、そしてこの溶液をアル ゴン雰囲気下に０℃に冷却し、この溶液を１０時間攪拌し、希釈し、Ｈ２０に対 して抽出し、乾燥し、蒸発させて、そしてシリカゲルのクロマトグラフィー（Ｍ ｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ、）により精製した。
＋１の調製：　（２７）をメタノール性アンモニア中に溶解し、そして密閉した フラスコの中で室温において３時間攪拌した。溶媒を除去し、そして精製しくシ リカゲル、ＭｅＯＨ／ＣＨｔＣｌｔ　（０〜４％ＭｅＯＨ）　）そして導入され たプロピン部分は実施例１に記載した。
１５、６ｍｌの１．６Ｍ　ｎ−ブチルリチウム（２５，１＋＋ＩＩＩｏｌ）の溶 液をアルゴン雰囲気下に一７８℃において攪拌し、そしてこれに無水エーテル（ １２，５ｍ１）中の２−ブロモピリジンの溶液を添加した。生ずるオレンジ色溶 液を２時間攪拌し、そしてＴＨＦ（２６，０＋ｎｎ＋ｏｌ、　２６および１．Ｏ Ｍ）中の塩化トリメチルを１０分かけて添加した。反応混合物を一７８℃におい て１時間攪拌し、次いで１時間かけて室温に加温し、モして濾液を蒸発させた。
蒸留すると、３．１ｇ　（５１％）の標題化合物が無色の液体として得られ、こ れを受容フラスコの中で固化した。沸点６５℃／　２　ｍｍＨｇ　；文献の沸点 ７５℃／　４　ｍｍＨｇ。
５−プロピニル−２′−デオキシウリジン。２５ｍ１のセイヨウナシ形状のフラ スコの中に、５−ヨード−２′−デオキシウリジン（０，３５４ｇ　、　ｌ、　 Ｏｍｍｏｌ）、２−トリメチルスタンニルピリミジン（０，８４ｇ。
３、５ｍｍｏｌ）、塩化ビス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（１■） （０，０７０ｇ、　０．１ｍｍｏｌ）を入れた。反応混合物を６０℃に１５時間 加熱し、次いで９０℃に１時間加熱した。溶媒を蒸発させ、そして残留物をシリ カゲルのクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃ１ｔ中の１０％Ｃ１，０Ｈ（１％ＮＨ３ ））により精製すると、０．２５３ｇ　（８３％）の標題化合物が白色固体とし て得られた、融点２０１−２０３℃。
５−（２−ピリミジニル）−２′−デオキシシチジン。２５＋ｎｌのセイヨウナ シ形状のフラスコの中に、５−ヨード−２′−デオキシシチジン（０，４２５ｇ 　、　１．２ｍｍｏｌ）、２−トリメチルスタンニルピリミジン（１，４ｇ、　 ５．８ｍｍｏｌ）、塩化ビス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（１１） 　（０，０８４ｇ、　０．１２ｍｍｏｌ）を入れた。反応混合物を６０℃に１５ 時間加熱し、次いで９０℃に１時間加熱した。溶媒を蒸発させ、そして残留物を シリカゲルのクロマトグラフィー（ＣＨ，Ｃ１ｆ中の１０％ＣＩ＋Ｄ）ｌ（１％ Ｎｌ＋、））により精製すると、０．１７３ｇ　（４７％）の標題化合物が白色 固体として得られた、融点＋９７−１９８℃。
実施例１３ ５−（チェニル）−５′ジメトキシトリチル−２′−デオキシウリジンの合成 ２−トリメチルスタンニルチオフェン。無水ＴＩＩＦ（５０ｍｌ）の中のチオフ ェン（２，１ｇ　、　２５．０ｍｍｏｌ）の溶液に、−３８℃においてペンタン 中のｔ−ブチルリチウム（１，６Ｍ、　１６．０ｍ１．２５．６ｍｍｏｌ）を３ ０分かけて滴々に冷却した。ＴＩＩＦ中の塩化トリメチル錫（Ｉ　Ｍ、　２５． ３＋ｎｌ、　２５．３ｍｍｏｌ）を３０分かけて満々添加した。次いで、この混 合物を一７８℃において２時間攪拌し、次いで室温において１５時間攪拌した。
溶媒を蒸発させ、そして生ずる黄色固体をエーテル中に取り、水で洗浄し、そし て乾燥（ＮａｔＳＯｔ）　Ｌ、、次いで蒸発させると、淡褐色液体が得られ、こ れは放置すると固化した。
５−（２−チェニル）−２′−ジメトキシトリチル−２′−デオキシウリジン。
５０ｍ１のフラスコの中に５−ヨード−３′−ドルオリルー２′−デオキシウリ ジン（２，１５ｇ、　２．７７ｍｒｎｏｌ）　、２−トリメチルスタンニルチオ フェン（１，８５ｇ、　７．５ｍｍｏｌ）、塩化ビス（トリフェニルホスフィン ）−パラジウム（ＩＩ）　（０，１９６ｇ、　０．２８＋＋＋ｍｏｌ）を入れた 。
反応混合物を７３℃に１８時間加熱し、次いで室温に冷却した。生ずる黒色沈澱 を濾過し、そしてＴＩＩＦで洗浄した。溶媒を蒸発させ、そして緑色の残留物を 酢酸エチル（ｌｏＯｍｌ）中に溶解し、水（５０ｍｌ）で洗浄し、そして乾燥（ Ｎａ２ＳＯｔ）　シた。溶媒を蒸発さ、そして残留物をジオキサン／濃ＮＨ９Ｏ Ｈ（１／　１　、８０＋＋＋ｌ）中に取り、室温において１８時間攪拌し、そし て蒸発させた。シリカゲルで精製すると、０．４３０　ｇ（２５％）の５−（２ −チェニル）−２′−ジメトキシトリチル−２′−デオキシウリジンが得られた 。
２−ヨードピリミジン。液体旧（２８，０ｍｌ、　２１２Ｉｎｍｏ＋）を０℃に おいて激しく攪拌し、そして固体２−クロロピリミジン（７，０ｇ、　６１ｎ＋ ｍｏｌ）をゆっくり添加し、こうして温度が８℃を越えて上昇しないようにした 。反応混合物を５℃において１時間攪拌し、固体炭酸カリウム（１４，７ｇ、　 １０６０１１１１０１）を注意して０．５時間かけて添加しく１０℃以下の温度 ）そして反応混合物を少量の固体の亜硫酸ナトリウムの添加により脱色した。こ の溶液をエーテル（５Ｘ　５０＋ｎｌ）で抽出し、乾燥（Ｎａ、５Ｏ４）　Ｌ、 、蒸発させ、そして残留物をヘキサンから再結晶化すると、７．１１ｇ　（５６ ％）の標題化合物が得られた、融点２９−３０℃。
２−　（（）リメチルシリル）エチニル）ピリミジン。５０＋ｎｌのフラスコの 中に、２−ヨードピリミジン（２０，ｇ、　９．７ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（１） 　（９，５ｍｇ、　０．０５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０，７ｍｌ、　５ ．０ｍｍｏｌ）、塩化ビス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（ＩＩ）　 （０，０７ｇ。
０、１ｍｍｏｌ）および無水ジオキサン（１０ｍｌ）を入れた。反応混合物６０ ℃に１８時間攪拌し、次いで９５℃において８時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、 そして残留物をＣＨ２Ｃ１ｔ（２００ｍｌ）中に溶解し、Ｉ２０（４０ｍｌ）で 洗浄し、乾燥（ＮａｚＳＯ−）　Ｌ、そして蒸発させた。生成物をシリカゲルの クロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃ１ｔ）により精製すると、１．０６ｇ　（６０％ ）の標題化合物が得られた。
２−エチニルピリミジン。無水メタノール（９ｍｌ）中の２−（（）リメチルシ リル）エチニル）ピリミジン（１，０６ｇ、　６、Ｏｍｍｏ　Ｉ　）の溶液に、 固体炭酸カリウム（０，０８３ｇ、　６．０ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応混 合物を２．５時間攪拌した。この固体を濾過により除去し、メタノール（］００ ｍ１で洗浄し１、そして上澄み液を蒸発させた。残留物をＣＨ２Ｃ１２Ｃ１２（ ３０中に溶解し、飽和ＮａＨ５Ｏｚで洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ１）し、そして 蒸発させた。シリカゲルのクロマトグラフィー（ＣＨ２ＣＩ２中の１〜２％Ｃ） １．０）１）により精製すると、０．４００ｇ　（６４％）の標題化合物が得ら れた。これを実施例１におけるように５−ヨード−２′−デオキシウリジンにカ ップリングし、そして保護されたＨ−ホスホネートに変換した。
実施例ｌ５ Ｕｏおよび３′−チオフォルムアセクールまたはホルムアセクール連鎖を含有す るオリゴマーの結合 次のオリゴマーを合成した。特記しない限り、すべての連鎖はホスホジエステル である。記号・は３′−チオホルムアセクール連鎖（３′、５’）を示し、そし て記号○はホルムアセタール連鎖（３′。
５′）を示す。
０Ｎ−１５’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＴＴＴＴ　３’０ Ｎ−２３５’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　Ｕ０Ｕ０Ｕ’Ｕ０Ｔ 　３’０Ｎ−２４５’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’Ｔ・ＴＴ＠ＴＴ　３’０ Ｎ−２５５’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’Ｕ０・ｕｏｕｏ・Ｕ’Ｔ　３’０ Ｎ−２６５’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’Ｕ００Ｕ０υ００Ｕ０Ｔ　３’オ リゴマーをＤＮＡまたはＲＮＡ標的とハイブリダイゼーションして、それぞれ三 重らせんまたは二重らせんの構造体を形成した後、オリゴマーを熱的変性（Ｉ６ ）または安定性に関して試験した。使用したＤＮＡ標的は、自己相補性領域を含 有しかつ示すようにヘアピンの末端に４ヌクレオチドのループを有するオリゴマ ーであった。標的は次の通りであった： ＤＮＡ二重らせん：　５’ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡ”Ｔ３’　Ｔ ＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴ　ＴＴＲＮ八　標的　：　５’　ＡＡＡＡ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ　３’１４０ｍＭ　ＫＣＩ／　５　ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ ＋／　１　ｍＭ　ＭｇＣ１，の中でｐＦＩ＝７．２において一本鎖ＲＮＡまたは ＤＮＡ（二重らせんの／＼イブリダイゼーション）についておよびｐ）ｌ　＝　 ６．６において二重らせんＩ）ＮＡＣ三重らせんの／％イブリダイゼーション条 件）について、結合についてのア・ツセイを実施した。すべてのオリゴマーの最 終濃度は約２μＭであった。オリゴマーを使用して得られたＴ、のデータを表６ に示す。
表６ 二重らせんのＴ、　三重らせん ＯＮ　ＲＮＡ　ＤＮＡ　Ｔ。
０Ｎ−１６２，５５５，５３８，９ ＯＮ−２３６９，０５９，５４５，０ ＯＮ−２４６２，０５３，０４１，５ ＯＮ−２５７１，５６１，５４７，６ ＯＮ−２６６９，０５９，５４５，５ ５−（２−ピリミジニル）−２′−デオキシウリジン（Ｕ′）または５−（２− ピリミジニル）−２′−デオキシシチジン（Ｃ’　）および５−（２−チェニル ）−２′−デオキシウリジン（Ｕｌ）を含有するオリゴマーの結合 次のオリゴマーを合成した。すべての連鎖はホスホジエステルであった。
０Ｎ−１５’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＴＴＴＴ　３’０ Ｎ−２８５’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　Ｕ’Ｕ’Ｕ’Ｕ’Ｕ ’　３’０Ｎ−２９５’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　Ｕ’Ｃ’　Ｕ’Ｃ’　Ｕ’ ＴＵ’ＴＵ’　３’０Ｎ−３０５’　ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’ＴＴＴＴ Ｔ　３’０Ｎ−４３５’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’Ｕ”Ｕ”υＴＵＴＵ７ ３′０Ｎ−４４５’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’Ｕ”Ｃ’υ”Ｃ’　Ｕ”ＴＵ”ＴＵ”　 ３’オリゴマーを５ｓＤＮＡまたは５ｓＲＮＡ標的とハイブリダイゼーションし て二重らせんを形成し、そしてｄｓＤＮＡとハイブリダイゼーションして三重ら せんを形成した後、オリゴマーを熱的変性（Ｔ、）または安定性に関して試験し た。使用したＤＮＡ標的は自己相補性領域を含有しかつ示すようにヘアピンの末 端に４ヌクレオチドのループを有するオリゴマーであった。標的は次の通りであ った：ＤＮＡ二重らせん：　５’　ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡ　” 　Ｔ３’　ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴ　Ｔ　ＴＲＮＡ標的：　５’ 　ＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ　３’１４０ｍＭ　ＫＣＩ／　Ｓ　ｍＭ　Ｎ ａｔＨＰＯ＋／　１　ｍＭ　ＭｇＣＩｔの中で＋１）ｌ＝７．２において一本鎖 ＲＮＡまたはＤＮＡ　（二重らせんのハイブリダイゼーション）についておよび ｐＨ＝６．６において二重らせんＤＮＡ　（三重らせんのハイブリダイゼーショ ン条件）について、結合についてのアッセイを実施した。すべてのオリゴマーの 最終濃度は約２μＭであった。オリゴマーを使用して得られたＴ１のデータを表 ６に示す。
０Ｎ−１６２，５５５，０３９，６ ＯＮ−２８６４，０５４，０４１，８ ＯＮ−２９６２，５５２，０３１，７ ＯＮ−３０６１，５４６，５−一 ０Ｎ−４３６４，５５５，０３１，６ ＯＮ−４４６３，５５２，５１９，９ ５−（ｌ−プロピニル）−２′−デオキシウリジン（Ｕｏ）およびカルボン酸５ −メチル−２′デオキシシチジン（Ｃ＃）または８−オキソ−Ｎ８−メチル−２ ′−デオキシアデノシン（Ｍ）を含有するオリゴマーの結合 次のオリゴマーを合成した。すべての連鎖はホスホジエステルであった。
０Ｎ−１５’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＴＴＴＴ　３’０ Ｎ−３２５’Ｕ０Ｃ“Ｕ０Ｃ′Ｕ０Ｃ１１Ｕ０Ｃ”Ｕ０Ｃ’Ｕ０Ｕ０Ｕ０Ｕ０Ｕ ’　３’０Ｎ−３３５’　ＴＴＴＭＴＴＴＭＭＴＭＭＴＴＴＴＴ　３’０Ｎ−３ ４５’　ｕ０ｕ’ｕ０Ｍｕ０ｕ０ｕ’ＭＭｕ０ＭＭｕ０ｕ０ｕ’ｕ’ｕ０３’オ リゴマーを二重らせんＤＮＡを結合して三重らせん構造体を形成した後、フット プリント分析によりデオキシアデノシン消化を使用して、オリゴマーを標的配列 に関して試験した。ハイブリダイゼーションは、１４０＋ｎＭ　ＫＣＩ、　１１ ００Ｉ　ＮａＣｌ、　Ｉ　ｍＭ　Ｍｇｃ＋２．　ｌ　ＩｎＭ　塩酸スペルミン、 ＭＯＰＳ　ｐＨ７，２の中で標的ＤＮＡを使用してほぼ１ＮＭにおいてを使用し て３７℃において約１時間インキュベーションした。標的配列は次の通りであっ た： ＤＮＡ二重らせん：　５’　ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡ　３’３’　ＴＣ ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴＴ　５’配列はクローニングベクターから誘導された ゲル精製した３７０ｂｐの制限断片上に含有された。０Ｎ−１および０Ｎ−３２ の濃度は、０．０１−１０゜μＭの間で変化した。０Ｎ−１および０Ｎ−３２を 使用して得られたヌクレアーゼ保護の結果は、同一標的についての０Ｎ−１のア フィニティーより約１０００倍大きいである二重らせんＤＮＡについての結合ア フィニティーを有することを示した。
０Ｎ−３３および０Ｎ−３４の標的配列は次の通りであった：ＤＮＡの二重らせ ん標的： ５’　ＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡ　３’３’　ＴＴＴＣＴＴＴＣＣＴ ＣＣＴＴＴＴＴ　５’この配列は制限酵素の消化により線状化されたプラスミド の中に含有されていた。配列はＩＬ−１遺伝子のプロモーター領域の中に見いだ される。三重らせんの結合についてのアッセイは、　１４０ｍＭ　ＫＣＩ／１０ ｍＭ　ＮａＣｌ／　１　ＩｎＭ　ＭｇＣＬ／　ｌ　ｍＭ　塩酸スペルミン／　２ ０ｗ＋Ｍ　ＭＯＰＳ　ｐＨ７，２の中で実施した。標的の最終濃度は約２ｎＭで あったが、０Ｎ−３３および０Ｎ−３４は０．１−１０．０μＭの間で変化した 。０．１μＭにおいて完全なヌクレアーゼ保護を与える０Ｎ−３３、および０． １μＭよりかなり下の濃度において完全なヌクレアーゼ保護を与える０Ｎ−３４ を使用して得られたヌクレアーゼ保護の結果は、同一標的についての０Ｎ−３３ のアフィニティーの約１０倍より大きいか、あるいはそれに等しい二重らせんＤ ＮＡについての結合アフィニティーを０Ｎ−３４が有することを示した。
これらのオリゴマーを使用して得られた結果が示すように、本発明の塩基は他の 三重らせん結合受容塩基の類似体と適合性であり、こうして必要に応じて三重ら せん受容塩基および塩基類似体を使用して高いアフィニティーのオリゴマーをデ ザインすることができる。
次のオリゴマーを合成した。すべての連鎖はホスホジエステルであった。ヌクレ オモノマーは実施例９に記載されているようにして調製した。５−メチル−２′ −〇−アリルウリジン（Ｔ′）および５−メチル−２′−〇−アリルシトシン（ Ｃ′）をＵＸおよびＣＸに加えて使用した。
０Ｎ−１５’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＴＴＴＴ　３’０ Ｎ−３５５’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ’Ｔ’Ｔ’Ｔ’Ｔ’Ｔ’３’０Ｎ− ３６５’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　Ｕ’Ｕ’ＵＯＵＯＵ’　 ３’０Ｎ−３７５’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＵｘＵ”Ｕ” ｕ”Ｕ”　３’０Ｎ−３８５’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　ＴＣ’　Ｔ ＴＴＴＴ　３’０Ｎ−３９５’　ＴＣ０ＴＣ０ＴＣ’ＴＣ’ＴＣ０ＴＴＴＴＴ　 ３’０Ｎ−４０５’　ＴＣｘＴＣ”ＴＣｘＴＣ”ＴＣｘＴＴＴＴＴ　３’オリゴ マーをＲＮＡ標的とハイブリダイゼーションして二重らせんの構造体を形成した 後、オリゴマーを熱的変性（Ｔ、、）または安定性に関して試験した。標的は次 の通りであった：ＲＮＡ標的：　５’　ＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ３’１ ４０ｍＭ　ＫＣＩ／　５　ｍＭ　ＮａＪＰＯ＋／　ｌ　ｍＭ　ＭｇＣ１ｚの中で ｐｉ（＝６．６において二重らせんの結合についてのアッセイを実施した。すべ てのオリゴマーの最終濃度は約２μＭであった。オリゴマーを使用して得られた Ｔ、のデータを表８に示す。
０Ｎ−１６３，０− ０Ｎ−３５６４，５＋　０．３ ＯＮ−３６’７０．５　＋　１．５ ＯＮ−３７７１，５＋１．７ ＯＮ−３８６６、５＋　０．７ ＯＮ−３９７０，０＋　１．４ ＯＮ−４０７３，０＋　２．０ これらの分析から得られた結果が証明するように、本発明の塩基を修飾された糖 と結合受容性オリゴマーの中で組み合わせることができる。２′−〇−アリル糖 の修飾および本発明の塩基のために増強された結合は、修飾単独と比較して、有 意に増加した結合アフィニティーを与える。２′−〇−アリル修飾は、ＲＮアー ゼＨのための基質としてオリゴマーを非受容性とする。こうして、２′修飾およ び本発明の塩基を含有するオリゴマーにより結合されたＲＮＡは、ヌクレアーゼ を含有する細胞抽出物の中のＲＮＡ配列のためのプローブとして有利に使用する ことができる。
実施例１９ Ｕｏを含有するオリゴマーおよびＵｏを含有するスイッチバッグリンカ−（Ｘｏ ）を使用する三重らせんの形成次のオリゴマーを合成した。すべての連鎖はホス ホジエステルであった。
Ｎ−４１ ５’　Ｕ’Ｃ’Ｕ’Ｃ’Ｕ’Ｕ’Ｕ’Ｕ’Ｕ’Ｕ’Ｃ’Ｕ’Ｕ’Ｃ’Ｕ’Ｃ’Ｕ ’Ｕ’Ｕ’Ｃ’Ｘ０Ｕ’Ｕ’Ｕ’Ｕ’Ｕ’Ｕ’Ｕ’　３’Ｎ−４２ ５’　Ｕ’Ｃ’Ｕ’Ｃ’Ｕ’Ｕ’Ｕ’Ｕ’Ｕ’Ｕ’Ｃ’Ｕ’Ｕ’Ｃ’Ｕ’Ｃ’Ｕ ’Ｕ’Ｕ’Ｃ’Ｘ’Ｕ’Ｕ’　３’使用したＤＮＡ標的配列は次の通りであった ：ＤＮＡ二重らせん標的： ５’　ＡＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　 ３’３’　ＴＣＴＣＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡ Ａ　５’標標的列をＴＡｇ遺伝子のイントロンの中に導入し、そして約２ｎＭに おいて線状化制限断片としてＤＮアーゼ保護分析において使用した。
スイッチバッグリンカ−のシントン（Ｘｏ）は第５−１図に示す構造ユを有し、 そして標準のＨ−ホスホネート化学により０Ｎ−４１および０Ｎ−４２の中に組 み込んだ。スイッパラグリンカ−は２ヌル塩基対（それらとハイブリダイゼーシ ョンしなかった標的の中の塩基対）に関連した。１１００ｎより低い濃度におい て０Ｎ−４１または０Ｎ−４２を使用して、標的配列の完全なりＮアーゼ保護が 得られた。
これらの結果が証明するように、本発明の塩基はスイッチバッグリンカ−１例え ば、ここに記載する０−キシロースリンカ−と適合性である。
実施例２０ Ｕｏおよびホスホロチオエート連鎖を含有するオリゴマーを使用する三重らせん の形式 実施例１６に記載するように０Ｎ−５および０Ｎ−５のホスホロチオエートの形 態を使用して、三重らせんの形成は証明された。結果が示すように、０Ｎ−５は ５５．８℃のＴ、を有し、そしてホスホロチオエート誘導体は４４．９℃のＴ、 を有する。こうして、本発明の塩基と組み合わせて、ホスホロチオエート連鎖を 含有するオリゴマーは三重らせんの形成において結合受容性である。
最も実際的かつ好ましい態様であると考えられるものにおいて、本発明を示しか つ説明した。しかしながら、本発明の範囲内でそれから逸脱することができ、そ して変更はこの開示読むと当業者とって明らかであろうことが認識される。
浄書（内容に変更なし） Ｘ３＝　Ｏ，Ｓ、　ＣＨ２，ＣＦ２．　ＣＦＨＮＨ，ＮＣＨ３ ＦＩＧ、　１ 浄ｌ！（内容に変更なし） ＦＩＧ、４−１ 浄書（内容に変更なし） 浄ｉｇ（内容に変更なし） ＦＩＧ、５−１ 浄口（内容に変更なし） ＦＩＧ、５−２ ’ｔＴ　：’：　（ｉ’＋７：に変更なし）ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ、　７ 浄！！（内容に変更なし） 浄Ｖ（内容に変更なし） ＦＩＧ、　１０−１ 浄ＩＦ（内容に変更なし） ボスフィン 浄￥ＩＩ（内容に変更なし） ＦＩＧ、１０−３ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、１０−４ 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし〕 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄！（内容に変更なし） ＦＩＧ、１３ 浄ｉｉ（内容に変更ない ＦＩＧ、１５ ＦＩＧ、１６ ＦＩＧ、　１７−１ ＦＩＧ、１７−２ ＦＩＧ、　１７−３ ＦＩＧ、１Ｂ 手続補正書（方式） 平成６年６月１９日

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも２種のヌクレオモノマーを含んで成るオリゴマー及び医薬的に許 容できるその塩であって、前記ヌクレオモノマーの少なくとも１種が、下記式（ １）又は（２）：▲数式、化学式、表等があります▼（１）▲数式、化学式、表 等があります▼（２）〔式中、個々のＸは独立してＯ又はＳであり；Ｒ２は塩基 に結合される炭素原子に連結される少なくとも１種のＰｉ結合を含んで成る基で あり；そしてＰｒは（Ｈ）２又は保護基である〕で表わされる基を含んで成り、 但し、前記オリゴマーのヌクレオモノマーの少なくとも１種が、ビニル、１−ブ テニル、１−ペンチニル、１−ヘキセニル、１−ヘプテニル、１−オクテニル、 １−プロビニル、１−ブチニル、１−ヘキシニル、１−ヘブチニル又は１−オク テニルにより５−置換されたデオキシウリジンを含んで成り、次に前記オリゴマ ーを含んで成るヌクレオモノマーの残りがホスホジエステル結合の２′−デオキ シアデノシン、２′−デオキシグアノシン、２′−デオキシシチジン、チミヂン 又はそれらの組合せから単独では構成されないことを特徴とするオリゴマー。 ２．ＸがＯである請求の範囲第１項記載のオリゴマー。 ３．Ｒ２がフェニルではない請求の範囲第１又は２項記載のオリゴマー。 ４．Ｒ２がシアノ、Ｃ２−１２−アルケニル又は１−アルキニルであり、又は５ 〜６個の環原子（該原子の１〜３個はＮ、Ｓ又はＯである）を含むＣ２−１２複 素芳香族又は１−エチニル−複素芳香族基である請求の範囲第１又は２項記載の オリゴマー。 ５．Ｒ２はＣ２−８１−アルケニル又は１−アルキニルであり、又は５〜６個の 環原子（ここで１つの環原子がＮにより置換され、そして場合によっては、第２ 環原子がＮ、Ｓ又はＯである）を含むＣ２−６複素芳香族又は１−エチニル−複 素芳香族基である請求の範囲第４項記載のオリゴマー。 ６．Ｒ２が、フェニルエチニル、２−，３−及び４−ピリジン−エチル、２−， ４−及び５−ヒリミジン−エチニル、トリアジン−エチニル、２−ピリミジニル 、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル、２−，４−及び５−オキサゾリル−エ チニル、２−，４−及び５−チアゾイル−エチニル、１−メチル−２−イミダゾ リル、２−及び４−イミダゾリル、２−，４−及び５−オキサゾリル、２−，４ −及び５−イミダゾリル−エチニル、２−ピリジニル、３−ピリジニル、４−ピ リジニル、２−及び３−チエニル−エチニル、２−及び３−ブラニル−エチニル 、２−及び３−ピロールイル−エチニル、２−及び３−チエニル、２−，４−及 び５−オキサゾリル、２−及び３−ブラニル、２−及び３−ピロールイル、プロ ペニル、ビニル及び−Ｃ≡Ｃ−Ｚ（ここで、ＺはＨ、アルキル（Ｃ１−１０）、 ハロアルキル（１〜６個のハロゲン原子を有するＣｌ−１０）又はヘテロアルキ ル（１〜３個のヘテロ原子を有するＣ１−１０）である）から成る群から選択さ れる請求の範囲第５項記載のオリゴマー。 ７．Ｒ２が、１−プロビニル、１−プロペニル、３−ブテン−１−イニル、３− メチル−１−ブチニル、３，３−ジメチル−１−ブチニル、１，３−ペンタジイ ニル、１−ブチニル、エチニル、ビニル、ブロモビニル、フェニルエチニル、２ −，３−及び４−ピリジン−エチニル、２−，４−及び５−ピリミジン−エチニ ル、トリアジン−エチニル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミ ジニル、２−，４−及び５−オキサゾリル−エチニル、２−，４−及び５−チア ゾリル−エチニル、１−メチル−２−イミダゾリル、２−及び４−イミダゾリル 、２−，４−及び５−オキサゾリル、２−，４−及び４−，５−イミダゾリル− エチニル、２−ピリジニル、３−ビリジニル、４−ピリジニル、２−及び３−チ エニル−エチニル、２−及び３−フラニル−エチニル、２−及び３−ピロリル− エチニル、２−及び３−チエニル、２−，４及び５−オキサゾリル、２−及び３ −フラニル、及び２−及び３−ピロリルから成る群から選択される請求の範囲第 １項記載のオリゴマー。 ８．Ｒ２が１−プロビニルである請求の範囲第１項記載のオリゴマー。 ９．少なくとも１つの置換結合がホスホロチオエート結合である請求の範囲第８ 項記載のオリゴマー。 １０．すべての置換結合がホスホロチオエート結合である請求の範囲第９項記載 のオリゴマー。 １１．少なくとも１つの置換結合がホスホロチオエート結合である請求の範囲第 １項記載のオリゴマー。 １２．すべての置換結合がホスホロチオエート結合である請求の範囲第１１項記 載のオリゴマー。 １３．少なくとも１つの結合が置換結合である請求の範囲第１項記載のオリゴマ ー。 １４．前記置換結合が、ホスホラミデート、ホスホロチオエート、メチルホスホ ネート、リボアセタール、アミド、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、チオノメチ ルホスホネート、ホスホロジチオエート、２′，５′−結合、ホルマセタール、 及び３′−チオホルマセタールから成る群から選択される請求の範囲第１３項記 載のオリゴマー。 １５．前記置換結合がメチルホスホネート又はホスホロチオエートである請求の 範囲第１４項記載のオリゴマー。 １６．少なくとも１つの置換結合がホスホロチオエート結合である請求の範囲第 ３項記載のオリゴマー。 １７．すべての置換結合がホスホロチオエート結合である請求の範囲第１６項記 載のオリゴマー。 １８．少なくとも１つの結合が置換された結合である請求の範囲第３項記載のオ リゴマー。 １９．前記置換結合が、ホスホラミデート、ホスホルチオエート、メチルホスホ ネート、ロボアセタール、アミド、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、チオノメチ ルホスホネート、ホスホロジチオエート、２′，５′−結合、ホルマセタール及 び３′−チオホルマセタールから成る群から選択される請求の範囲第１８項記載 のオリゴマー。 ２０．前記置換結合がメチルホスホネート又はホスホロチオエートである請求の 範囲第１９項記載のオリゴマー。 ２１．逆転された極性の少なくとも１種のセグメントをさらに含んで成る請求の 範囲第１項記載のオリゴマー。 ２２．少なくとも１種のＯ−キシロソスイッチバックリンカーをさらに含んで成 る請求の範囲第２１項記載のオリゴマー。 ２３．前記Ｏ−キシロソスイッチバックリンカーが、請求の範囲第１項記載の式 （１）又は（２）の少なくとも１種の塩基を含んで成る請求の範囲第２２項記載 のオリゴマー。 ２４．少なくとも１種の塩基が共有結合成分を含んで成る請求の範囲第１項記載 のオリゴマー。 ２５．前記塩基がＮ４，Ｎ４−エタノシトシンである請求の範囲第２４項記載の オリゴマー。 ２６．カチオン性脂質により複合体化される請求の範囲第１項記載のオリゴマー 。 ２７．約１０〜約３０個のヌクレオモノマーをさらに含んで成り、そして一定し た極性を有する請求の範囲第１項記載のオリゴマー。 ２８．ヌクレアーゼ安定性ドメインを含んで成る、５′−及び３′−端で約２〜 約１２個の置換結合又はヌクレオモノマー、及び少なくとも１種のＲＮａｓｅＨ コンピテントドメインを含んで成り、そして前記ヌクレアーゼ安定性ドメイン間 に存在する約３〜約２６個の置換結合又はヌクレオモノマーをさらに含んで成る 請求の範囲第２７項記載のオリゴマー。 ２９．カチオン性脂質により複合体化される請求の範囲第３項記載のオリゴマー 。 ３０．約１０〜約３０個のヌクレオモノマーをさらに含んで成り、そして一定し た極性を有する請求の範囲第３項記載のオリゴマー。 ３１．前記ヌクレオモノマーが２′−変性ヌクレオモノマーである請求の範囲第 ４項記載のオリゴマー。 ３２．少なくとも１種のヌクレオモノマーが、２′−Ｏ−アリル変性ヌクレオモ ノマーである請求の範囲第３１項記載のオリゴマー。 ３３．５′ヌクレオモノマーと３′ヌクレオモノマーとの間に共有結合を有し、 それによって環条オリゴマーが形成される請求の範囲第１項記載のオリゴマー。 ３４．固体支持体、ラベル又はアミンリンカー（１−１２Ｃ）に接合される請求 の範囲第１項記載のオリゴマー。 ３５．ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマ一又はヘキサマーである請求 の範囲第１項記載のオリゴマー。 ３６．固体支持体、ラベル、又はアミンリンカー（１−１２Ｃ）に接合される請 求の範囲第３項記載のオリゴマー。 ３７．ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマ一又はヘキサマーである請求 の範囲第３項記載のオリゴマー。 ３８．相補的核酸配列へのオリコマーの結合親和性に関して、式（１）又は（２ ）の少なくとも１種の塩基を含んで成る正の変性及び負の変性を含んで成り、こ こで前記正の変性が、結合親和性に関して、付加物よりも高い程度に負のの変性 の効果に対して反作用する請求の範囲第１項記載のオリゴマー。 ３９．前記正の変性Ｒ２がシアノ、Ｃ２−１２１−アルケニル又は１ーアルキニ ルであり、又は１〜３個の環原子が独立してＮ，Ｓ又はＯである５〜６個の環原 子を含むＣ２−１２複素芳香族又は１−エチニルー複素芳香族基である請求の範 囲第３８項記載のオリゴマー。 ４０．前記複素環式塩基変性Ｒ２がＣ２−８１−アルケニル又は１−アルキニル であり、又は１つの環原子がＮであり、そして場合によっては、第２環原子がＮ ，Ｓ又はＯであり、そしてＸがＯである５〜６個の環原子を含むＣ２−８複素芳 香族又は１−エチニルー複素芳香族基である請求の範囲第３９項記載のオリゴマ ー。 ４１．前記負の変性が置換結合である請求の範囲第３７項記載のオリゴマー。 ４２．前記置換結合が、ホスホロチオエート、チオノメチルホスホネート、メチ ルホスホネート、ホスホロアミデート及びホスホジエステル結合のためのトリエ ステルから成る群から選択された少なくとも１種の結合を含んで成る請求の範囲 第４１項記載のオリゴマー。 ４３．少なくとも１つのＲ３がＯ−メチル、Ｏ−エチル又はＯ−プロピルである 請求の範囲第１項記載のオリゴマー。 ４４．少なくとも１つのＲ３がＯ−メチル、Ｏ−エチル又はＯ−プロピルである 請求の範囲第３項記載のオリゴマー。 ４５．下記式（１６）： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、 個々のＲ１は独立してＨ，ＰＯ３２−又はブロッキング基であり；個々のＲ３は 、Ｈ，ＯＨ，Ｆ，ＮＨ２，ＯＣＨ３，ＯＣ２Ｈ５，ＯＣ３Ｈ２，ＳＣＨ３，ＳＣ ２Ｈ５，ＳＣ３Ｈ７，ＯＣ３Ｈ５及びＳＣ３Ｈ６から成る群から独立して選択さ れ；個々のＸ１は独立して、−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）−，−Ｐ（Ｏ）（Ｏ）−−Ｐ（Ｍ ｅ）（Ｏ）−及び−Ｐ（Ｍｅ）（Ｓ）−から成る群から選択された置換結合であ り； Ｐｒが保護基であり； ｎが０〜９８の整数であり；そして Ｂがプリン又はピリミジン塩基であり、但し、少なくとも１つのＢが下記式（１ ）又は（２）： ▲数式、化学式、表等があります▼（１）▲数式、化学式、表等があります▼（ ２）（式中、個々のＸは独立してＯ又はＳであり；Ｒ２は塩基に結合される炭素 原子に連結される少なくとも１種のＰｉ結合を含んで成る基であり；そしてＰｒ は（Ｈ）２又は保護基である）で表わされるものである〕で表わされるオリゴマ ーであって、 但し、前記オリゴマーのヌクレオモノマーの少なくとも１種が、ビニル、１−ブ テニル、１−ペンテニル、１−ヘキセニル、１−ヘプテニル、１−オクテニル、 １−プロビニル、１−ブチニル、１−ヘキシニル、１−ヘブチニル又は１−オク テニルにより５−置換されたデオキシウリジンを含んで成り、次に前記オリゴマ ーを含んで成るヌクレオモノマーの残りがホスホジエステル結合の２′−デオキ シアデノシン、２′−デオキシグアノシン、２′−デオキシシチジン、チミヂン 又はそれらの組合せから単独では構成されないことを特徴とするオリゴマー。 ４６．少なくとも１つのＢが、５−プロビニルウラシル、５−（３−メチル−１ −ブチニル）ウラシル、５−プロビニルシトシン又は５−（３−メチル−１−ブ チニル）シトシンである請求の範囲第４５項記載のオリゴマー。 ４７．少なくとも１つのＢが、２−チエニルウラシル、２−チエニルシトシン、 ２−イミダゾイルウラシル、２−イミダゾイルシトシン、２−チアゾイルウラシ ル又は２−チアゾイルシトシンである請求の範囲第４５項記載のオリゴマー。 ４８．少なくとも１つのＲ１がＨ，ＰＯ３２−，ＤＭＴ，Ｈ−ホスホネート、メ チルホスホンアミジット、メチルホスホラミジット、β−シアノエチルホスホラ ミジット又はアルキルホスホラミジットである請求の範囲第４５項記載のオリゴ マー。 ４９．個々のＲ３が独立してＨ，ＯＨ、又は−Ｏ−アリルである請求の範囲第４ ５項記載のオリゴマー。 ５０．少なくとも１つのＲ３がＯ−メチル、Ｏ−エチル又はＯ−プロピルである 請求の範囲第５０項記載のオリゴマー。 ５１．Ｒ２が１−プロビニルである請求の範囲第４５項記載のオリゴマー。 ５２．約１０〜約３０個のヌクレオモノマーをさらに含んで成、そして一定した 極性を有し、そしてヌクレアーゼ安定ドメインを含んで成る、５′一端及び３′ 一端で約２〜約１２個の置換された結合又はヌクレオモノマー、及び少なくとも １つのＲＮａｓｅＨコンピテントドメインを含んでなり、そして前記ヌクレアー ゼ安定ドメイン間に存在する、約３〜約２６個の置換された結合又はヌクレオモ ノマーをさらに含んで成る請求の範囲第５１項記載のオリゴマー。 ５３．カチオン性脂質により複合体化される請求の範囲第４５項記載のオリゴマ ー。 ５４．前記カチオン性脂質がＤＯＴＭＡである請求の範囲第４６項記載のオリゴ マー。 ５５．Ｒ２がフェニルではない請求の範囲第４５項記載のオリゴマー。 ５６．少なくとも１つのＲ１がＨ，ＰＯ３２−，ＤＭＴ，ＭＭＴ，Ｈ−ホスホネ ート、メチルホスホンアミジット、メチルホスホラミジット、β−シアノエチル ホスホラミジット又はアルキルホスホラミジットである請求の範囲第５５項記載 のオリゴマー。 ５７．個々のＲ３が独立してＨ，ＯＨ、又は−Ｏ−アリルである請求の範囲第５ ５項記載のオリゴマー。 ５８．少なくとも１つのＲ２がＯ−メチル、Ｏ−エチル又は０−プロピルである 請求の範囲第５５項記載のオリゴマー。 ５９．カチオン性脂質により複合体化される請求の範囲第５５項記載のオリゴマ ー。 ６０．前記カチオン性脂質がＤＯＴＭＡである請求の範囲第５９項記載のオリゴ マー。 ６１．下記構造式（３）又は（４）： ▲数式、化学式、表等があります▼（４）個々のＲ１は独立してＨ又はブロッキ ング基であり；Ｒ２が塩基に結合される炭素原子を通して連結される少なくとも １つのＰｉ結合を含んで成る基であり；Ｐｒは（Ｈ２）又は保護基であり；そし てＲ３がＨ，ＯＨ，Ｆ，ＯＣＨ２，ＯＣ２Ｈ５，ＯＣ２Ｈ７，ＳＣＨ３，ＳＣ２ Ｈ５，ＳＣ２Ｈ７，ＯＣ３Ｈ５及びＳＣ３Ｈ５から成る群から選択され、但しを Ｒ３がＨ又はＯＨであり、そして両Ｒ１がＨである場合、Ｒ２は、１，３−ペン タジニル、２−，３−、及び４−ピリジン−エチニル、２−ピリミジン−エチニ ル、４−ピリミジン−エチニル、５−ピリミジン−エチニル、トリアジン−エチ ニル、２−ピリミジニル、２−及び４−イミダゾリル、２−及び３−ピロリル− エチニル、２−及び３−フラニル−エチニル、２−及び３−チエニル−エチニル 、２−，４−、及び５−イミダゾリル−エチニル、２，４−、及び５−チアゾリ ル−エチニル、２−，４−、及び５−オキサゾリル−エチニル、４−及び５−チ アゾリル、４−及び５−オキソゾリル、又は３−ピロリルである〕が表わされる ヌクレオモノマー。 ６２．Ｐｒが（Ｈ）２である請求の範囲第６１項記載のヌクレオモノマー。 ６３．Ｒ２が、１−プロビニル、１−プロペニル、３−ブテン−１−イニル、３ −メチル−１−ブチニル、３，３−ジメチル−１−ブチニル、１，３−ペンタジ イニル、１−ブチニル、エチニル、ビニル、ブロモビニル、フェニルエチニル、 ２−，３−及び４−ピリジン−エチニル、２−，４−及び５−ピリミジン−エチ ニル、トリアジン−エチニル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリ ミジニル、２−，４−及び５−オキサゾリル−エチニル、２−，４−及び５−チ アゾリル−エチニル、１−メチル−２−イミダゾリル、２−及び４−イミダゾリ ル、２−，４−及び５−オキサゾリル、２−，４−及び４−，５−イミダゾリル −エチニル、２−ピリジニル、３−ピリジニル、４−ピリジニル、２−及び３− チエニル−エチニル、２−及び３−フラニル−エチニル、２−及び３−ピロリル −エチニル、２−及び３−チエニル、２−，４−及び５−オキサゾリル、２−及 び３−フラニル、及び２−及び３−ピロリルから成る群から選択され；そして ブロッキング基がＤＭＴ，ＭＭＴ，ＦＭＯＣ，Ｈ−ホスホネート、メチルホスホ ンアミジット、メチルホスホラミジット又はβ−シアノエチルホスホラミジット である請求の範囲第６１項記載のヌクレオモノマー。 ６４．Ｒ３がＨ，ＯＨ又はＯ−アリルである請求の範囲第６３項記載のヌクレオ モノマー。 ６５．Ｒ２が１−プロビニルである請求の範囲第６３項記載のヌクレオモノマー 。 ６６．３′位でのＲ１がＨ−ホスホネート、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−β −シアノエトキシホスフィン、Ｎ，Ｎ−ジイソブロピル−アミノメトキシホスフ ィン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ−β−シアノエトキシホスフィン、Ｎ，Ｎ−モル ホリノ−β−シアノエトキシホスフィン、Ｎ，Ｎ−モルホリノ−メトキシホスフ ィン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノメチル−ホスホンアミジット、Ｎ，Ｎ−ジ エチルアミノ−メチルホスホンアミジット、ビス−モルホリノ−ホスフィン、Ｎ ，Ｎ−ジメチルアミノ−β−シアノエチルメルカプトホスフィン、２−クロロフ ェニルホスフェート、４−クロロフェニルホスフェート、２，４−ジクロロフェ ニルホスフェート、２，４−ジブロモフェニルホスフェート、２−クロロフェニ ルチオホスフェート、４−クロロフェニルチオホスフェート、２，４−ジクロロ フェニルチオホスフェート及び２，４−ジブロモフェニルホスフェートから成る 群から選択される請求の範囲第６３項記載のヌクレオモノマー。 ６７．Ｒ２が１−プロビニルである請求の範囲第６１項記載のヌクレオモノマー 。 ６８．ＸがＯであり； ５′位でのＲ１がＤＭＴ，ＭＭＴ又はＦＭＯＣであり；３′位でのＲ１がＮ，Ｎ −ジイソプロピルアミノ−β−シアノエトキシホスフィン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロ ピルアミノエトキシホスフィン又はＨ−ホスホネートであり； Ｒ２が１−プロビニル、３−メチル−１−ブチニル、２−チエニル、２−イミダ ゾリル又は２−チアゾリルであり；Ｒ２がＨ，ＯＨ、又はＯ−アリルであり；そ してＰｒが（Ｈ）２、ジイソブチルホルムアミジン又は他の保護基である請求の 範囲第６１項記載のヌクレオモノマー。 ６９．Ｐｒがベンゾイル、ジイソプロピルホルムアミジン、ＦＭＯＣ、ジ−ｎ− ブチルホルムアミジン又はイソブチリルである請求の範囲第６８項記載のヌクレ オモノマー。 ７０．下記式（５）： ▲数式、化学式、表等があります▼（５）個々のＹは独立してＲ１又はオリゴマ ーであり；Ｒ１はＨ，ＰＯ３２−又はブロッキング基であり；そして個々のＢは 独立してプリン又はピリミジン塩基であり、但し、少なくとも１つのＢは式（１ ）又は（２）（ここで、Ｒ２は塩基に結合される炭素原子を通して連結される少 なくとも１つのＰｉ結合を含んで成る基であり；そしてＰｒが（Ｈ）２又は保護 基である）で表わされる基である〕で表わされるＯ−チシロソダイマー。 ７１．Ｒ２が１−プロビニルである請求の範囲第７０項記載のダイマ７２．前記 ブロッキング基がＤＭＴ，ＭＭＴ，Ｈ−ホスホネート、メチルホスホンアミジッ ト、メチルホスホラミジット及びβ−シアノエチルホスホラミジットから成る群 から選択される請求の範囲第７０項記載のダイマー。 ７３．下記式（６），（７）又は（８）：▲数式、化学式、表等があります▼（ ６）▲数式、化学式、表等があります▼（７）▲数式、化学式、表等があります ▼（８）〔式中、 ＸはＯ及びＳから成る群から選択され；Ｘ２はＣＯ，ＣＳ及びＳＯ２から成る群 から選択され；Ｘ２はＯ，Ｓ１，ＣＨ２，ＣＦ２及びＣＦＨから成る群から独立 して選択され； Ｘ４は，Ｏ，Ｓ，ＳＯ，ＳＯ２，ＣＨ２，ＣＯ，ＣＦ２，ＣＳ，ＮＨ（ここで、 Ｒ４は低級アルキル（Ｃ１−４；メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブ チル又はイソブチル）である）から成る群から独立して選択され； Ｘ５は，Ｏ，ＣＯ，Ｓ，ＣＨ２，ＣＳ，ＳＯ２，ＣＯ，ＮＨ及びＮＲ４から成る 群から選択され； Ｘ６はＣＨ，Ｎ，ＣＦ，ＣＣｌ、及びＣＲ５（ここで、Ｒ５は低級アルキル（Ｃ １−４）、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル又は低級フ ルオロアルキル（Ｃ２−４，Ｆ１−５）である）から成る群から選択され； Ｘ７はＯ，Ｓ，ＣＨ２，ＣＯ，ＣＦ２及びＣＳから成る群から選択され；個々の Ｙは独立してオリゴマー又はＲ１（ここで、Ｒ１はＰＯ３２−又はブロッキング 基である）であり； 個々のＲ３はＨ，ＯＨ，Ｆ，ＮＨ２，ＯＣＨ３，ＯＣ２Ｈ５，ＯＣ３Ｈ７，ＳＣ Ｈ２，ＳＣ２Ｈ５，ＳＣ３Ｈ７，ＯＣ３Ｈ５及びＳＣ３Ｈ５から成る群から独立 して選択され；個々のＢは独立してプリン又はピリミジン塩基であり、但し、少 なくとも１つのＢは式（１）又は（２）（ここで個々のＸはＯ又はＳである）の ものであり； Ｒ２は塩基に結合される炭素原子を通して連結される少なくとも１つのＰｉ結合 を含んで成る基であり；そしてＰｒは（Ｈ）２又は保護基であり；そしてさらに 、但し、Ｘ５及びＲ７は両者ともＯではない〕で表わされるダイマー。 ７４．Ｒ１がＰＯ３２−，ＤＭＴ，ＭＭＴ，Ｈ−ホスホネート、メチルホスホラ ミジット又はβ−シアノエチルホスホラミジット−である請求の範囲第７３項記 載のダイマー。 ７５．少なくとも１つのＢが５−プロビニルウラシル、３−メチル−１−ブチニ ルウラシル、５−プロビニルシトシン又は３−メチル−１−ブチニルシトシンで ある請求の範囲第７３項記載のダイマー。 ７６．少なくとも１つのＲ２がプロビニルであり、Ｒ３がＨ又はＯＨであり、そ して置換結合におけるＸがＳである請求の範囲第７３項記載のダイマー。 ７７．Ｘ３及びＸ４がＯであり、Ｘ５及びＸ７がＣＨ２であり、そしてＸ６がＣ Ｈである請求の範囲第７３項記載のダイマー。 ７８．二倍体の２つのオリゴマーの１つが請求の範囲第１項記載のオリゴマーか ら成る二倍体。 ７９．二倍体の２つのオリゴマーの１つが請求の範囲第４５項記載のオリゴマー から成る二倍体。 ８０．三倍体の３つのオリゴマーが請求の範囲第１項記載のオリゴマーから成る 三倍体。 ８１．三倍体の３つのオリゴマーが請求の範囲第４５項記載のオリゴマーから成 る三倍体。 ８２．二倍体の２つのオリゴマーが請求の範囲第３項記載のオリゴマーから成る 二倍体。 ８３．二倍体の２つのオリゴマーが請求の範囲第５５項記載のオリゴマーから成 る二倍体。 ８４．三倍体の３つのオリゴマーが請求の範囲第３項記載のオリゴマーから成る 三倍体。 ８５．三倍体の３つのオリゴマーが請求の範囲第５５項記載のオリゴマーから成 る三倍体。 ８６．前記オリゴマーが、対応するオリゴデオキシヌクレオチドよりも長い時間 、細胞又は生物学的溶液に損なわれないまま存続する請求の範囲第１項記載のオ リゴマー。 ８７．前記オリゴマーが、対応するオリゴデオキシヌクレオチドよりも長い時間 、細胞又は生物学的溶液に損なわれないまま存続する請求の範囲第３項記載のオ リゴマー。 ８８．前記オリゴマーがリボザイムである請求の範囲第１項記載のオリゴマー。 ８９．前記オリゴマーがリボザイムである請求の範囲第３項記載のオリゴマー。 ９０．前記オリゴマーがプローブである請求の範囲第１項記載のオリゴマー。 ９１．前記オリゴマーがプローブである請求の範囲第３項記載のオリゴマー。 ９２．前記オリゴマーがプライマーである請求の範囲第１項記載のオリゴマー。 ９３．前記オリゴマーがプライマーである請求の範囲第３項記載のオリゴマー。 ９４．医薬的に許容できるキャリヤー；及び請求の範囲第１項記載のオリゴマー の治療的有効量を含んで成る医薬組成物。 ９５．特定のＤＮＡ二倍体又はＲＮＡにより特徴づけられる、対象における疾病 を処理するための方法であって：そのような処理の必要な対象に、請求の範囲第 １項記載のオリゴマーの治療的有効量を投与し；そして 前記オリゴマーの、前記ＤＮＡ二倍体又はＲＮＡへの十分な時間の結合を可能に する段階を含んで成る方法。 ９６．特定のＤＮＡ又はＲＮＡにより特徴づけられる、対象における疾病を処理 するための方法であって： そのような処理の必要な対象に、請求の範囲第１項記載のオリゴマーの治療的有 効量を投与し；そして 三倍体又は二倍体を形成するために、前記オリゴマーの、前記ＤＮＡ又はＲＮＡ への十分な時間の結合を可能にする段階を含んで成る方法。 ９７．生物学的サンプルにおける特定の二本鎖又は一本鎖核酸の存在、不在又は 量を検出するための方法であって、二倍体又は三倍体がオリゴマーと核酸との間 に形成される条件下で請求の範囲第１項記載のオリゴマーと前記サンプルとを接 触し；そして 前記二倍体又は三倍体の存在、不在又は量を検出する段階を含んで成る方法。 ９８．生物学的サンプルにおける特定の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの存在、不在又 は量を検出するための方法であって、ハイブリッド二倍体がオリゴマーとＤＮＡ 又はＲＮＡとの間に形成される条件下で請求の範囲第１項記載のオリゴマーと前 記サンプルとを接触し；そして 前記二倍体の存在、不在又は量を検出する段階を含んで成る方法。 ９９．少なくとも１種の選択されたタンパク質がＤＮＡ配列によりコードされ、 そしてそのタンパク質がＲＮＡ配列から翻訳される細胞において、前記タンパク 質の発現を阻害するための方法であって、前記細胞中に請求の範囲第１項記載の オリゴマーを導入し；そして 前記オリゴマーの前記ＤＮＡ又はＲＮＡとの三倍体又は前記ＤＮＡ又はＲＮＡと の二倍体の形成を可能にし、それによって前記タンパク質の発現が阻害される段 階を含んで成る方法。 １００．前記オリゴマーが、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＭＳＯ トランスフェクション、デキストラントランスフェクション、エレクトロポレー ション、カチオン性脂質トランスフェクション、アニオン性脂質トランスフェク ション又はリポソームトランスフェクションから成る群から選択された方法によ り前記細胞中に導入される請求の範囲第９９項記載の方法。 １０１．細胞中に請求の範囲第１項記載のオリゴマーを導入するための方法であ って、 複合体を形成するために前記オリゴマーと透過増強剤とを混合しそして 前記複合体と前記細胞とを接触することを含んで成る方法。 １０２．医薬的に許容できるキャリヤー；及び請求の範囲第３項記載のオリゴマ ーの治療的有効量を含んで成る医薬組成物。 １０３．特定のＤＮＡ二倍体又はＲＮＡにより特徴づけられる、対象における疾 病を処理するための方法であって：そのような処理の必要な対象に、請求の範囲 第３項記載のオリゴマーの治療的有効量を投与し；そして 前記オリゴマーの、前記ＤＮＡ二倍体又はＲＮＡへの十分な時間の結合を可能に する段階を含んで成る方法。 １０４．特定のＤＮＡ又はＲＮＡにより特徴づけられる、対象における疾病を処 理するための方法であって： そのような処理の必要な対象に、請求の範囲第３項記載のオリゴマーの治療的有 効量を投与し；そして 三倍体又は二倍体を形成するために、前記オリゴマーの、前記ＤＮＡ又はＲＮＡ への十分な時間の結合を可能にする段階を含んで成る方法。 １０５．生物学的サンプルにおける特定の二本鎮又は一本鎖核酸の存在、不在又 は量を検出するための方法であって、二倍体又は三倍体がオリゴマーと核酸との 間に形成される条件下で請求の範囲第３項記載のオリゴマーと前記サンプルとを 接触し；そして 前記二倍体又は三倍体の存在、不在又は量を検出する段階を含んで成る方法。 １０６．生物学的サンプルにおける特定の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの存在、不在 又は量を検出するための方法であって、ハイブリッド二倍体がオリゴマーとＤＮ Ａ又はＲＮＡとの間に形成される条件下で請求の範囲第３項記載のオリゴマーと 前記サンプルとを接触し；そして 前記二倍体の存在、不在又は量を検出する段階を含んで成る方法。 １０７．少なくとも１種の選択されたタンパク質がＤＮＡ配列によりコードされ 、そしてそのタンパク質がＲＮＡ配列から翻訳される細胞において、前記タンパ ク質の発現を阻害するための方法であって、前記細胞中に請求の範囲第３項記載 のオリゴマーを導入し；そして 前記オリゴマーの前記ＤＮＡ又はＲＮＡとの三倍体又は前記ＤＮＡ又はＲＮＡと の二倍体の形成を可能にし、それによって前記タンパク質の発現が阻害される段 階を含んで成る方法。 １０８．前記オリゴマーが、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＭＳＯ トランスフェクション、デキストラントランスフェクション、エレクトロポレー ション、カチオン性脂質トランスフェクション、アニオン性脂質トランスフェク ション又はリポソームトランスフェクションから成る群から選択された方法によ り前記細胞中に導入される請求の範囲第１０７項記載の方法。 １０９．細胞中に請求の範囲第１項記載のオリゴマーを導入するための方法であ って、 複合体を形成するために前記オリゴマーと透過増強剤とを混合しそして 前記複合体と前記細胞とを接触することを含んで成る方法。 １１０．細胞中に請求の範囲第３項記載のオリゴマーを導入するための方法であ って、 複合体を形成するために前記オリゴマーと透過増強剤とを混合しそして 前記複合体と前記細胞とを接触することを含んで成る方法。 １１１．所望する請求の範囲第１項記載のオリゴマーを合成するための方法であ って、 保護基及び塩基を有し、そしてヌクレオモノマー又はオリゴマーにカップリング できるカップリング基をさらに有する保護されたヌクレオモノマーシントン（ｓ ｙｎｔｈｏｎ）を合成し：前記ヌクレオモノマーシントンをアクセプターヌクレ オモノマー又はアクセプターオリゴマーにカップリングし；前記保護基を除去し ；そして 所望するオリゴマーが合成されるまで、必要により前記サイクルをくり返す段階 を含んで成る方法。 １１２．所望する請求の範囲第１項記載のオリゴマーを合成するための方法であ って、 保護基及び塩基を有し、そしてヌクレオモノマー又はオリゴマーにカップリング できるホスフィット又はホスフェート基をさらに有する保護されたオリゴマーシ ントン（ｓｙｎｔｈｏｎ）を合成し；前記オリゴマーシントンをアクセプターヌ クレオモノマ−又はアクセプターオリゴマーにカップリングし；前記保護基を除 去し；そして 所望するオリゴマーが合成されるまで、必要により前記サイクルをくり返す段階 を含んで成る方法。 １１３．前記カップリング段階が、Ｈ−ホスホネート、アミジット又はトリエス テル化学を用いて達成される請求の範囲第１１１項記載の方法。 １１４．前記カップリングホスフィット又はホスフェート基が、Ｈ−ホスホネー ト、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノーメチルホスホンアミジット、Ｎ，Ｎ−ジエ チルメチルアミノーホスホンアミジット、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−β− シアノエトキシホスフィン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−メトキシホスフィ ン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ−β−シアノエトキシホスフィン、Ｎ，Ｎ−モルホ リノ−β−シアノエトキシホスフィン、 Ｎ，Ｎ−モルホリノ−メトキシホスフィン、２−クロロフェニルホスフェート、 ４−クロロフェニルホスフェート、２，４−ジクロロフェニルホスフェート、２ −クロロフェニルトリホスフェート、４−クロロフェニルチオホスフェート、２ ，４−ジクロロフェニルトリホスフェート及び ２，４−ジブロモフェニルホスフェートから成る群から選択される請求の範囲第 １１１項記載の方法。 １１５．請求の範囲第１項記載の誘導体化されたオリゴマーを合成するための方 法であって、 少なくとも１種の５−ヨードウラシル、５−ヨードシトシン又はＮ４−保護−５ −ヨードシトシン複素環状物を含むオリゴマーと、Ｒ２Ｈとを、前記５−ヨード ウラシル、５−ヨードシトシン又はＮ４−保護−５−ヨードシトシンをその対応 する５−Ｒ２置換の複素環状物に転換するためにＰｄ触媒の存在下で反応せしめ ることを含んで成る方法。 １１６．請求の範囲第１項記載の誘導体化されたオリゴマーを合成するための方 法であって、 塩基として５−ヨードウラシル又はＮ４−保護−５−ヨードシトシン及び保護基 を有する保護された前駆体ヌクレオモノマーシントンを合成し； 前記保護された前駆体ヌクレオモノマーシントンをアクセプターヌクレオモノマ ー又はアクセプターオリゴマーにカップリングし；前記保護基を除去し； 前記オリゴマーが合成されるまで必要に応じ、前記サイクルをくり返し；そして ５−位でＲ２（請求の範囲第１項記載のＲ２と同じである）を有する誘導体に、 前記オリゴマーにおける前駆体ヌクレオモノマーシントンを誘導体化する段階を 含んで成る方法。 １１７．遺伝子発現を阻害するその能力について候補体アンチセンスオリゴマー を評価するための方法であって、前記候補体アンチセンスオリゴマーを、（ａ） 前記侯補体アンチセンスオリゴマーのための標的配列を含む遺伝子の発現のため の標的ベクター及び（ｂ）検出可能なタンパク質をコードする対照遺伝子（前記 標的配列を含まない）の発現のための対照ベクターと共に組換え宿主細胞中にマ イクロインジェクトすることを含んで成る方法。 １１８．前記標的ベクターが細胞当たり約２〜４個のコピーで注入され、そして 前記対照ベクターが細胞当たり約３０〜５０個のコピーで注入される請求の範囲 第１１７項記載の方法。 １１９．前記検出可能なタンパク質がクロラムフェニコールアセチルトランスフ ェラーゼ、ルシフェラーゼ又はβ−ガラクトシダーゼである請求の範囲第１１７ 項記載の方法。 １２０．前記宿主細胞が哺乳類細胞である請求の範囲第１１７項記載の方法。 １２１．（ａ）アンチセンスオリゴマーのための標的配列を含む遺伝子のための 発現システムを含む標的ベクター、（ｂ）検出可能なタンパク質のための発現シ ステムを含む対照ベクター、及び（ｃ）候補体アンチセンスオリゴマーによりマ イクロインジェクトされた宿主細胞。 １２２．核酸を増幅するための方法であって、請求の範囲第１項記載のオリゴマ ーと標的核酸を含むサンプルとを混合し；前記オリゴマーを前記標的核酸により ハイブリダイズし；そして 前記標的核酸をＰＣＲ又はＬＣＲにより増幅する段階を含んで成る方法。 １２３．核酸を増幅するための方法であって、請求の範囲第３項記載のオリゴマ ーと標的核酸を含むサンプルとを混合し；前記オリゴマーを前記標的核酸により ハイブリダイズし；そして 前記標的核酸をＰＣＲ又はＬＣＲにより増幅する段階を含んで成る方法。 １２４．前記オリゴマーがアンチセンスオリゴマーである請求の範囲第１項記載 のオリゴマー。 １２５．前記オリゴマーがアンチセンスオリゴマーである請求の範囲第３項記載 のオリゴマー。 １２６．前記オリゴマーが三重らせん状オリゴマーである請求の範囲第１項記載 のオリゴマー。 １２７．前記オリコマーが三重らせん状オリゴマーである請求の範囲第３項記載 のオリゴマー。
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