DE60213771T2

DE60213771T2 - Morpholinobildgebung und therapie

Info

Publication number: DE60213771T2
Application number: DE60213771T
Authority: DE
Inventors: J. Donald Brookline HNATOWICH; Mary Southborough RUSCKOWSKI; Guozheng Worcester LIU
Original assignee: University of Massachusetts UMass
Current assignee: University of Massachusetts UMass
Priority date: 2001-03-30
Filing date: 2002-04-01
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2022-04-02
Also published as: ATE335515T1; DE60213771D1; EP1372741A2; EP1372741B1; US20030003102A1; US6899864B2; WO2002078638A2; AU2002303181A1; EP1372741A4; WO2002078638A3

Description

Diese Anmeldung basiert auf den US-Provisional-Patentanmeldungen mit der Seriennummer 60/279,809, eingereicht am 30. März 2001 und 60/341,794, eingereicht am 21. Dezember 2001.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Kit zum Ansteuern eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels auf einen Zielort in einem Säuger sowie die Verwendung dieses Kits zur Herstellung eines Medikaments zum Diagnostizieren oder Behandeln eines pathologischen Zustands in einem mehrstufigen Verfahren unter Verwendung eines Kits, enthaltend ein komplementäres Paar von Morpholino-Oligomeren in Form von Einfachsträngen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Ziel von Forschung betreffend Ansteuerung (targeting) von Wirkstoffen ist es, die Wirksamkeit von therapeutischen Wirkstoffen zu erhöhen, indem diese direkt zu den angesteuerten Orten des Tumors befördert werden und so eine wirksamere Dosis an diesen Zielorten ermöglichen und dadurch Nebenwirkungen, die nicht mit dem Tumor assoziiert sind, verringern. Ein weiteres Ziel ist es, eine absolute Anreicherung des therapeutischen Mittels am Zielort zu erreichen, wodurch das Ziel-/Nicht-Ziel-Verhältnis erhöht wird.
Verschiedene Ansteuerungsvektoren, umfassend diagnostische oder therapeutische Mittel, die mit einer Ansteuerungseinheit zur selektiven Lokalisierung konjugiert sind, sind seit langem bekannt. Beispiele für Ansteuerungsvektoren umfassen diagnostische Mittel oder Konjugate von Ansteuerungseinheiten als therapeutische Mittel, wie z.B. Antikörper oder Antikörperfragmente, zell- oder gewebespezifische Peptide, Hormone und andere Rezeptor-bindende Moleküle. Beispielsweise wurden Antikörper gegen unterschiedliche mit pathologischen oder normalen Zellen assoziierte Determinanten sowie gegen mit pathogenen Mikroorganismen assoziierte Determinanten, bereits zur Detektion und Behandlung einer großen Vielfalt von pathologischen Zuständen oder Schädigungen benutzt. In diesen Verfahren ist der ansteuernde Antikörper direkt mit einem geeigneten Detektionsmittel oder therapeutischen Mittel konjugiert, wie z.B. beschrieben in Hansen et al., U.S.-Patent Nr. 3,927,193 und Goldenberg, U.S.-Patente Nrn. 4,331,647, 4,348,376, 4,361,544, 4,468,457, 4,444,744, 4,460,459, 4,460,561, 4,624,846 und 4,818,709.
Eines der Probleme, die in direkten Ansteuerungsverfahren auftreten, ist, dass ein relativ kleiner Anteil der Konjugate tatsächlich an den Zielort bindet, während die Mehrheit der Konjugate im Umlauf verbleibt und in der einen oder anderen Weise die Funktion des ansteuernden Konjugats beeinträchtigt. Andere Probleme umfassen hohen Hintergrund und niedrige Auflösung, wenn ein diagnostisches Mittel verabreicht wird und Knochenmarkstoxizität oder systemische Nebenwirkungen, wenn ein therapeutisches Mittel an eine langzirkulierende Ansteuerungseinheit gebunden ist.
Pretargeting-Verfahren (Verfahren zum vorherigen Ansteuerung) wurden entwickelt, um das Ziel- zu Hintergrundverhältnis des Detektionsmittels oder des therapeutischen Mittels zu erhöhen. Beispiele für Pretargeting und Biotin-/Avidin-Methoden werden z.B. in Goodwin et al., U.S.-Patent Nr. 4,863,713; Goodwin et al., J. Nucl. Med. 29: 226 (1988); Hnatowich et al., J. Nucl. Med. 28: 1294 (1987); Oehr et al., J. Nucl. Med. 29: 728 (1988); Klibanov et al., J. Nucl. Med. 29: 1951 (1988); Sinitsyn et al., J. Nucl. Med. 30: 66 (1989); Kalofonos et al., J. Nucl. Med. 31: 1791 (1990); Schechter et al., Int. J. Cancer. 48: 167 (1991); Paganelli et al., Cancer Res. 51: 5960 (1991); Paganelli et al., Nucl. Med. Commun. 12: 211 (1991); Stickney et al., Cancer Res. 51: 6650 (1991) und Yuan et al., Cancer Res. 51: 3119 (1991) beschrieben.
In Pretargeting-Verfahren wird eine primäre Ansteuerungsspezies (die nicht an ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel gebunden ist), umfassend eine erste Ansteuerungseinheit, die an den Zielort bindet und eine Bindungsstelle, die zur Bindung einer anschließend verabreichten zweiten Ansteuerungseinheit zur Verfügung steht, in vivo an einen Zielort angesteuert. Sobald eine ausreichende Anreicherung der primären Ansteuerungsspezies erreicht ist, wird eine zweite Ansteuerungsspezies verabreicht, umfassend ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel sowie eine zweite Ansteuerungseinheit, die die zur Verfügung stehende Bindungsstelle der primären Ansteuerungsspezies erkennt.
Ein erläuterndes Beispiel der Pretargeting-Verfahren ist die Verwendung eines Biotin-(Strept)Avidinsystems zum Verabreichen eines zytotoxischen Radioantikörpers auf einen Tumor. Im ersten Schritt wird ein monoklonaler Antikörper zur Ansteuerung eines tumorassoziierten Antigens mit Avidin (oder Biotin) konjugiert und einem Patienten verabreicht, der einen Tumor hat, der durch diesen Antikörper erkannt wird. Im zweiten Schritt wird das therapeutische Mittel mittels an ihn gebundenen Biotins (oder Avidins) durch das Antikörper-Avidin-(oder -Biotin-)-Konjugat, welches den Tumor vorher ansteuert (pretargeting), aufgenommen. Allerdings traten Schwierigkeiten in der Anwendbarkeit des Biotin-Avidin- oder (Strept)Avidin-Systems während dem Pretargeting auf. Vor allem neigen radiomarkierte Biotine, wenn sie nicht richtig aufgebaut sind, dazu, von Plasmabiotinidase abgebaut zu werden. Des Weiteren, wenn konjugiert mit Antikörpern, können Strept/Avidin und Avidin Anti-Strept/Avidin-Antikörper in einem Patienten hervorrufen. Schließlich können die potenziellen Wirkungen von endogenem Biotin während des Pretargeting in vivo zum Verschwinden eines Auftretens der Biotinbindung wegen Sättigung mit Biotin führen. Das passierte z.B., als ein Strept/Avidin-konjugierter Antikörper, lokalisiert in einem Xenotransplantat einer nackten Maus mit Biotin gesättigt wurde. Rusckowski et al., Cancer 80: 2699–705 (1997). Eine Drei-Stufen-Strategie, einbeziehend die Verabreichung von biotinyliertem monoklonalem Antikörper, von Avidin, gefolgt von radiomarkiertem Biotin, verringert einige der Nachteile; allerdings wird das Verfahren als komplex für bildgebende Verfahren angesehen und es adressiert nicht die Immunogenität.
Ein weiteres anerkanntes Beispiel für Pretargeting-Verfahren bezieht die Verwendung des bispezifischen Antikörper-Hapten-Erkennungssystems ein, das ein radiomarkiertes Hapten und einen bispezifischen Antikörper an Stelle von (Strept)Avidin und Biotin benutzt. Barbet, J. et al., Cancer Biother. Radiopharm. 14: 153–166 (1999); Karacay, H. et al., Bioconj. Chem. 11: 842–854 (2000); Gautherot, E. et al., J. Nucl. Med. 41: 480–487 (2000); Lubic, S. P. et al., J. Nucl. Med. 42: 670–687 (2001); Gestin, J. F. et al., J. Nucl. Med. 42: 146–153 (2001). Das Hapten ist oftmals ein Koordinationskomplex, z.B. Indium-DTPA. Der bispezifische Antikörper ist das Produkt einer Verbindung aus zwei Antikörpern oder Antikörperfragmenten gegen separate Determinanten, das Hapten und einen Tumormarker, wie z.B. ein karzinoembryonisches Antigen. Zusätzlich zu der Notwendigkeit zur Herstellung bispezifischer Antikörper, kann dieser Ansatz an niedrigeren Affinitäten leiden. Die Affinität eines Antikörpers zu seinem Hapten, insbesondere zu einem monovalenten, ist Größenordnungen geringer als die von (Strept)Avidin zu Biotin. Mathematisches Modelling hat gezeigt, dass eine hohe Affinität zwischen Antikörper und seinem Hapten ein wichtiger bestimmender Faktor für Pretargeting ist. Zhu, H. et al., J. Nucl. Med. 39: 65–76 (1998).
Als eine Alternative zu dem Biotin-Avidin- und den bispezifischen Antikörper-Hapten-Systemen zum Pretargeting, wurden Einfachstränge von Oligomeren, wie z.B. Peptid-Nukleinsäuren (PNA) verwendet. Die Einfachstränge von Oligomeren binden spezifisch an die Einfachstränge ihrer komplementären Oligomere durch in vivo Hybridisierung. Zuerst wird an eine Ansteuerungseinheit gebundene einsträngige PNA einem Patienten verabreicht, dem schließt sich die Verabreichung der einfachsträngigen komplementären PNA, die mit einem diagnostischen Mittel radiomarkiert ist, an. Ein Beispiel dieser Methode ist in Rusckowski et al., Cancer 80: 2699–705 (1997) beschrieben. Ein optionaler Zwischenschritt kann diesem Zwei-Stufen-Verfahren durch Verabreichung eines Aufreinigungsmittels zugefügt werden. Die Aufgabe des Aufreinigungsmittels ist es, zirkulierende primäre Konjugate, die nicht an den Zielort gebunden sind, zu entfernen. Dies ist von Griffiths et al., im US-Patent Nr. 5,958,408 offenbart.
Chemische Modifizierungen des Rückgrats dieser einfachsträngigen Oligomere zur Anknüpfung von Radionukleotiden sind gewöhnlicherweise notwendig, um eine erhöhte Nukleasestabilität zu erreichen, und um Protein-Bindungsaffinitäten zu reduzieren. Der Einfluss von drei speziellen chemischen Modifikationen einer 18mer Phosphorthioat-DNA, die Markieren mit ^99mTc ermöglicht, wurde in vitro und in vivo in Mäusen verglichen. Zhang, Y. M. et al., Eur. J. Nucl. Med. 27: 1700–1707 (2000). Während herausgefunden wurde, dass die Assoziationsgeschwindigkeitskonstante für die Hybridisierung unabhängig von der Markierungsmethode ist, wurden sowohl die zellulären Anreicherungen in Kultur als auch das pharmakokinetische Verhalten des Radiomarkers in normalen Mäusen stark durch die Markierungsmethode beeinflusst.
Diese in vivo Eigenschaften der Oligomere können möglicherweise durch Veränderung ihrer Kettenlänge und/oder ihrer Basensequenz beeinflusst werden. Denkbar ist, dass die Pharmakokinetik eines Oligomers in nützlicher Art und Weise modifiziert werden kann, wenn der Einfluss der Kettenlänge und der Basensequenz verstanden wird. Trotz dieser Möglichkeit (und wie auch im Falle der chemischen Modifikationen) blieben diese zusätzlichen Einflüsse bislang fast vollständig unerforscht. Zum Teil mag dies zurückzuführen sein auf die Einschränkungen auf diese Parameter durch die Applikation. Z.B. wird angenommen, dass Antisense-Chemotherapie üblicherweise durch die Hybridisierung eines kurzen einfachsträngigen Oligomers, das eine zu der angezielten mRNA komplementäre Basensequenz hat, effektiv ausgeführt werden kann. Hnatowich, D. J., J. Nucl. Med. 40: 693–703 (1999). Die Basensequenz, und in gewissem Ausmaß auch die Kettenlänge, sind somit auf solche festgelegt, die die gewünschte Hybridisierung gewährleisten. Nichtsdestotrotz existieren Kombinationen von Basen, die Aufmerksamkeit erregt haben. Ein Beispiel ist das Vorhandensein eines G-Quartetts (d.h. vier Guaninbasen in einer Reihe) entweder in Phosphodiester oder Phosphorthioat-DNAs. Shafter, R. H. et al., Biopoly. (Nucleic Acid Sci.) 56: 209–227 (2001). Zumindest im Falle dieser chemischen Formen von DNA bildet sich durch das Stapeln der Guaninbasen eine spezielle dreidimensionale Quadruplexstruktur der Oligonukleotide. Diese Struktur ist offensichtlich verantwortlich für eine Vielzahl von sequenzspezifischen Effekten, die signifikant für eine Vielzahl von biologischen Prozessen sind. Shafter, R. H. et al., Biopoly (Nucleic Acid Sci.) 56: 209–227 (2001). Ein anderes Beispiel ist das CpG-Motiv, eine Cytosinbase, direkt gefolgt von einem Guanin, das sich als immunostimulatorisch gezeigt hat. Zhao, Q. et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7: 495–502 (1997). Die Einflüsse dieser Sequenzen, falls vorhanden, auf die Pharmakokinetik müssen noch bewiesen werden.
Eine Vielzahl von anderen publizierten Berichten betreffend die in vivo Einflüsse der Oligomerkettenlänge und -sequenz ist erschienen. Es zeigte sich, dass zur Zytotoxizität einer Zelllinie für Phosphordiester-DNAs, vollständig bestehend aus Guanin- und Thymidinbasen, mindestens eine Kettenlänge von 20 Basen notwendig ist, und die Zytotoxizität verschwand mit Einführen von Adenin oder Cytosin, egal an welchem Ende. Morassutti, C. et al., Nuclesides & Nucleotides 18: 1711–1716 (1999). Die Effizienz mit der PNAs Transkription und Genexpression in Zellen auslösen, wurde als optimal bei einer Kettenlänge von 16 bis 18 Basen bestimmt. Wang, G. et al., J. Mol. Biol. 313: 933–940 (2001). Homogenisate aus Rattenleber wurden ex vivo verwendet, um den Metabolismus einer Serie von Phosphorthioat-DNAs mit verschiedener Kettenlänge und Basensequenz zu ermittlen. Crook, R. M. et al., J. Pharm. Exp. Therapeutics 292: 140–149 (2000). Alle Oligomere wurden vor allem durch 3'Exonukleasen abgebaut, wobei die Geschwindigkeit des Metabolismus sich mit erhöhter Kettenlänge erhöhte. Die Geschwindigkeit und das Ausmaß des Nukleasemetabolismus hingen ebenfalls insoweit von der Basensequenz ab, als pyrimidinreiche Oligonukleotide instabiler waren. Diese bestimmte Untersuchung war insoweit unüblich, als der Einfluss von Stereoisomerie ebenfalls untersucht wurde. Es wurde herausgefunden, dass die Metabolismusgeschwindigkeit für eines der Diastereoisomere schneller war als für das andere und Mischungen mit mittleren Geschwindigkeiten abgebaut wurden. Schließlich beschreibt ein kürzlich erschienener Bericht den Einfluss der Basensequenz auf die Reaktivität der Phosphordiesterbindung in RNAs. Kaukinen, U. et al., Nucl. Acids Res. 30: 468–474 (2002).
Trotz der vielen Vorteile gegenüber den Strept/Avidin-Biotin- und bispezifischen Antikörper-Haptensystemen, existieren einige wenige Einschränkungen bei der Verwendung dieser Oligomere für Pretargeting. Diese Einschränkungen schließen schlechte Spezifität, mögliche Unlöslichkeit in wässrigen Lösungen und hohe Kosten ein.
Es existiert weiterhin der Bedarf für ein verbessertes Kit und Verfahren für in vivo Ansteuerung zum Transport eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels zu einem Zielort in einem Säuger, welches spezifischer, erschwinglicher und preiswerter ist und eine höhere zielspezifische Aufnahme und niedrigere Aufnahme in normalen Geweben gewährleistet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein Kit zur Verfügung zu stellen und eine Verwendung dieses Kits für die Herstellung eines Medikaments zum Ansteuern eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels in einem Säuger, welches aus relativ preiswerten Edukten hergestellt werden kann, und hierbei höhere Spezifität, Stabilität und vorhersehbares Ansteuern und/oder wünschenswertere Antigen-Antikörper-Wirkungen als gewöhnliche und andere bekannte Kits und Methoden bereitstellt.
Es ist eine weitere Aufgabe eine alternative Verwendung zum Tumor-Lokalisieren/zum Abbilden von Tumoren bereitzustellen, bei dem zum schrittweisen Ansteuern ein Paar aus einfachsträngigen Morpholino-Oligomeren (MORFs, wie unten definiert) an Stelle von Strept/Avidin-Biotin, Peptidnukleinsäuren und anderen Oligomeren verwendet wird, wobei eine radiomarkierte Ansteuerungseinheit stark an die primäre targetspezifische Bindungsstelle innerhalb des Ziels bindet und dabei ein gutes Tumor- zu Nicht-Tumor-Verhältnis für Abbildungszwecke bereitstellt.
Diese und andere Aufgaben werden gelöst, in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, durch Bereitstellung eines Kits zum Ansteuern eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels in einem Säuger, umfassend: (A) Ein erstes Konjugat, umfassend eine Ansteuerungseinheit und ein Morpholino-Oligomer, wobei die Ansteuerungseinheit selektiv an eine primäre, zielspezifische Bindungsstelle des Zielorts oder an eine vom Zielort gebildete oder mit dem Zielort assoziierte Substanz bindet; (B) gegebenenfalls ein Aufreinigungsmittel, und (C) ein zweites Konjugat, umfassend ein komplementäres Morpholino-Oligomer und ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel.
Die Ansteuerungseinheit aus Schritt (a) umfasst bevorzugt einen Antikörper, besonders einen humanisierten Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment eines humanisierten Antikörpers. Ein solcher humanisierter Antikörper ist ein antikarzinoembryonischer Antigen-Antikörper (CEA). Die Ansteuerungseinheit ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, kleinen Peptiden, Polypeptiden, Enzymen, Hormonen, Stereoiden, Cytokinen, Neurotransmittern, Oligomeren, Vitaminen und Rezeptor bindenden Molekülen.
In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung, wird, wie oben beschrieben, ein Kit bereitgestellt, wobei die Länge des Morpholino-Oligmers und seines komplementären Morpholino-Oligomers mindestens etwa sechs Basen bis etwa hundert Basen beträgt. Zusätzlich können das Morpholino-Oligomer und sein komplementäres Morpholino-Oligomer ein 15mer, ein 18mer oder ein 25mer sein. Die Ansteuerungseinheit ist an ein 15mer, ein 18mer oder ein 25mer eines Morpholino-Oligomers gebunden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Aufreinigungsmittel ein anti-idiotypischer Antikörper oder ein Antigen-bindendes Antikörperfragment.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das therapeutische Mittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antikörperfragmenten, Wirkstoffen, Toxinen, Nukleasen, Hormonen, Immunomodulatoren, Chelatoren, Borverbindungen, photoaktiven Mitteln oder Farbstoffen und Radionukliden.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das diagnostische Mittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Radionukliden, Farbstoffen, Kontrastmitteln, fluoreszierenden Verbindungen oder Molekülen und verstärkenden Mitteln, verwendbar in magnetischem Resonanz-Abbilden (MRI).
Die vorliegende Erfindung betrachtet eingehend die Ansteuerungsmethode zum Transportieren eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels zu einem Zielort in einem Säuger, umfassend: (a) Verabreichung eines ersten Konjugats an den Säuger, umfassend eine Ansteuerungseinheit und ein Morpholino-Oligomer, wobei besagte Ansteuerungseinheit selektiv an eine primäre zielspezifische Bindungsstelle eines Zielorts oder an eine Substanz, gebildet von oder assoziiert mit besagtem Zielort, bindet; (b) gegebenenfalls Verabreichung eines Aufreinigungsmittels an den Säuger, und Ermöglichen, dass das Aufreinigungsmittel nicht lokalisierte erste Konjugate aus der Zirkulation entfernt; und (c) Verabreichung eines zweiten Konjugats an diesen Säuger, umfassend ein komplementäres Morpholino-Oligomer und ein diagnostisches Mittel oder therapeutisches Mittel, wobei das komplementäre Morpholino-Oligomer sein Morpholino-Olimgomer-Komplement im ersten Konjugat bindet und dabei ein Ansteuern des therapeutischen oder diagnostischen Mittels auf den Zielort bewirkt.
Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden an Hand der folgenden detaillierten Beschreibung und beigefügten Ansprüche deutlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. A. UV-Absorptionsspektrum von MORF15 (0,025 μg/μL) und nativem MN14 (0,5 μg/μL). B. Größenausschluss-HPLC-UV-Chromatogramme von MN14-MORF15 (linkes Spektrum) und MN14-MORF18 (rechtes Spektrum) bei 280 nm. C–D. Absorptionen bei 280 und 265 nm aufgetragen gegen das Gewicht von nativem MN14 (C) und nativem MORF15 (D).
2. UV-Größenausschluss-HPLC-Profile (260 nm) von nicht gekuppeltem nativem cMORF18 (A), MAG₃-gekuppeltem cMORF18 (B) und Radioaktivitätsprofil von ^99mTc-markiertem MAG₃-cMORF18 (C).
3. UV-Größenausschluss-HPLC-Profile (260 nm) von MN14-MORF18 (A) und Radioaktivitätsprofile von markiertem cMORF18, zugefügt zu MN14-MORF18, bei Gewichtsverhältnissen von 0,04 μg/25μg (B) bzw. 0,25 μg/25μg (C). Ebenfalls wird das Radioaktivitätsprofil von markiertem cMORF18, zugefügt zu nativem MN14 als Kontrolle gezeigt. (D). Das Ausmaß des MN14-Bindens verringert sich, wenn das Gewicht des markierten cMORF18 sich erhöht.
4. Größenausschluss-Radioaktivitäts-HPLC-Profile von Urin, erhalten nach 3 h, nachdem eine Kontrollmaus nur markiertes cMORF18 (A) erhalten hatte und einer Testmaus, die sowohl MN14-MORF18 als auch markiertes cMORF18 erhalten hatte (B). Ebenfalls werden Radiochromatogramme gezeigt, auf derselben Achse wie Plasma, erhalten nach 3 h von einer Kontrollmaus (C) und einer Testmaus (D). Die Ergebnisse zeigen, dass Radioaktivität im Urin vor allem als markiertes cMORF18 vorhanden ist, während in Plasma signifikante Mengen an Radioaktivität in Plasma nur in den Testmäusen vorhanden sind, und da nur als markierter cMORF18-MN14-MORF18-Komplex.
5. Ganzkörperaufnahmen der Front von LS174T-Tumor-tragenden nackten Mäusen mit einer Gamma-Kamera, gemacht nach 3 h (A) und 24 h (C) und eine Aufnahme, erhalten bei einer Wiederholungsstudie bei 3 h mit vorheriger Urinentnahme. In jedem Bild befinden sich das Testtier auf der linken und das Kontrolltier auf der rechten Seite.
6. Größenausschluss-HPLC-Radiochromatogramme von ^99mTc-markiertem cMORF15, cMORF18 und cMORF25 und MORF15, MORF18, und MORF25.
7. Bioverteilung von ^99mTc-markiertem cMORF15, cMORF18, und cMORF25 und MORF15, MORF18 und MORF25 bei 0,5, 1 und 3 h. *Körper = Radioaktivität des ganzen Körpers minus Urin und Niere.
8. Ganzkörperaufnahmen mittels Scintigraph, gleichzeitig erhalten von LS174T-Tumor tragenden nackten Mäusen 3 h nach Injektion. Das Kontrolltier erhielt nur ^99mTc-MORF15 (rechtes Bild), das Tier mit 15mer Pretargeting erhielt MN14-MORF15 und anschließend ^99mTc-cMORF15 (mittleres Bild) und die Tiere mit 18mer Pretargeting erhielten MN14-MORF18 und im Anschluss ^99mTcMORF18 (linkes Bild). Die Tumoren befinden sich jeweils im rechten Schenkel.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wenn nicht anders spezifiziert, heißt „ein" oder „eine" oder „einer" so viel wie „ein/e/r oder mehrere".
Die vorliegende Erfindung stellt ein Kit und die Verwendung des Kits zur Herstellung eines Medikaments zum in vivo Ansteuern eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels in einem Säuger (bevorzugt Menschen) bereit, umfassend (A) ein erstes Konjugat, umfassend eine Ansteuerungseinheit und ein Morpholino-Oligomer, wobei die Ansteuerungseinheit selektiv an eine primäre, zielspezifische Bindungsstelle des Zielorts oder an eine vom Zielort gebildete oder mit dem Zielort assoziierte Substanz bindet; (B) gegebenenfalls ein Aufreinigungsmittel; und (C) ein zweites Konjugat, umfassend ein komplementäres Morpholino-Oligomer und ein diagnostisches Mittel oder therapeutisches Mittel.
Die Ansteuerungseinheit kann z.B. ein Antikörper oder ein Antigen bindendes Antikörperfragment sein. Bevorzugt sind die monoklonalen Antikörper (Mabs) auf Grund ihrer hohen Spezifitäten. Sie können schnell durch nun als gewöhnlich angesehene Verfahren zur Immunisierung von Säugern mit immunologener Antigenherstellung, Fusionierung von Immun-Lymph- oder Milzzellen mit einer unsterblichen Myelomzelllinie und Isolation von spezifischen Hybridomklonen hergestellt werden. Eher ungewöhnliche Verfahren für die Herstellung monoklonaler Antikörper, sind ebenfalls in Erwägung zu ziehen, wie z.B. Fusionen verschiedener Spezien und gentechnische Manipulationen von hypervariablen Regionen, da es vor allem die Antigenspezifität der Antikörper ist, die ihren Nutzen in der vorliegenden Erfindung bewirkt. Der Fachmann versteht, dass neuere Techniken zur Herstellung von Monoklonalen ebenfalls verwendet werden können, z.B. menschliche Monoklonale, interspezies Monoklonale, chimäre (z.B. Mensch/Maus) Monoklonale, genetisch veränderte Antikörper und ähnliche.
Antikörperfragmente, die nützlich in der Erfindung sind, schliessen F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, Fv und ähnliche, einschließlich Hybridfragmente ein. Bevorzugte Fragmente sind Fab', F(ab')₂, Fab und F(ab)₂. Ebenfalls nützlich sind jegliche Unterfragmente, die die hypervariable Antigen-bindende Region eines Immunglobulins beibehalten und die eine Größe haben, die ähnlich oder kleiner als ein Fab'-Fragment ist. Dies schließt genetisch veränderte oder rekombinante Antikörper und Proteine ein, ob einsträngig oder mehrsträngig, die einen Antigen-bindenden Ort enthalten und ansonsten in vivo im Wesentlichen in der selben Weise als Ansteuerungsvehikel funktionieren wie natürliche Immunoglobulinfragmente. Diese Einfachstränge bindenden Moleküle sind offenbart in US-Patent Nr. 4,946,778.
Fab'-Fragmente können leicht durch reduktive Spaltung von F(ab')₂-Fragmenten hergestellt werden, die wiederum durch Pepsinverdauung von intaktem Immunoglobulin unter reduzierenden Bedingungen oder durch Spaltung von F(ab')₂-Fragmenten hergestellt werden können, die aus vorsichtiger Papainverdauung von ganzem Immunoglobulin resultieren. Die Fragmente können ebenfalls durch Gentechnologie hergestellt werden.
Es sollte vermerkt werden, dass Mischungen von Antikörpern und Immunoglobulin-Klassen, genauso wie Hybrid-Antikörper, verwendet werden können. Multispezifische, einschließlich bispezifische und hybridische Antikörper und Antigen bindende Antikörperfragmente, sind nützlich in der vorliegenden Erfindung. Bispezifische und hybridische Antikörper sind fähig, spezifisch an mindestens ein Epitop auf der Markersubstanz oder an einen Bestandteil des zweiten Konjugats zu binden. Diese Antikörper umfassen bevorzugt mindestens zwei verschiedene im Wesentlichen monospezifische Antikörper oder Antikörperfragmente, die zumindest an mindestens ein Epitop auf der Markersubstanz binden, die gebildet wird von oder in Verbindung steht mit den Krebszellen und mit wenigstens einem Epitop eines Bestandteil des zweiten Konjugats. Multispezifische Antikörper und Antikörperfragmente mit zweifachen Spezifitäten können analog zu den Anti-Tumor-Markerhybriden, offenbart in US-Patent Nr. 4,631,544, dessen Inhalt hiermit durch Referenz vollständig eingeschlossen ist, hergestellt werden. Andere Techniken zur Herstellung von Hybridantikörpern sind offenbart z.B. in US-Patenten Nr. 4,474,893 und 4,479,895 und in Milstein et al., Immunol. Today 5: 299, (1984).
Ebenfalls bevorzugt sind Antikörper mit einer spezifischen Immunoreaktivität zu einer Markersubstanz, gebildet von oder assoziiert mit Krebszellen von mindestens 60% und einer Kreuzreaktivität zu anderen Antigenen oder Nicht-Ansteuernden-Substanzen von weniger als 35%. Ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch Tumororte durch Binden an Antigene ansteuert, die von dem Tumor gebildet werden oder mit dem Tumor assoziiert sind, ist besonders bevorzugt.
Antikörper gegen Tumorantigene sind bekannt. Z.B. wurden Antikörper und Antikörperfragmente, die spezifisch Marker binden, die gebildet von oder assoziiert mit Tumoren sind, offenbart, u.a. in Hansen et al., US-Patent Nr. 3,927,193 und Goldbergs US-Patenten Nrn. 4,331,647, 4,348,376, 4,361,544, 4,468,457, 4,444,744, 4,818,709 und 4,624,846. Besonders vorteilhaft werden Antikörper gegen ein Antigen z.B. eines gastrointestinalen, Lungen-, Brust-, Prostata-, Ovarien-(Eierstock-), testikularen (Hoden-), Gehirn- oder lymphatischen Tumors, eines Sarkoms oder Melanoms verwendet.
Die Antikörper und Antigen-bindenden Fragmente, die nützlich in den Verfahren der vorliegenden Erfindung sind, können an den Partner des Bindungspaares durch eine Vielzahl von Verfahren von chemischer Konjugation, die im Stand der Technik bekannt sind, konjugiert sein. Viele dieser Verfahren sind in den oben zitierten US-Patenten und Patentanmeldungen offenbart. Siehe auch Childs et al., J. Nucl. Med. 26: 293 (1985).
Ein nützlicher monoklonaler Antikörper in der vorliegenden Erfindung ist MN-14, ein CEA-Antikörper der zweiten Generation, NP-4, der eine zehnfach größere Affinität zu CEA hat als die Version der ersten Generation. Hansen et al., Cancer 71: 3478–85 (1993).
MN-14 internalisiert langsam, was es geeignet für den Ansteuerungsansatz macht, und wurde chimärisiert und humanisiert. Leung et al., US-Patent Nr. 5,874,540.
Andere Ansteuerungseinheiten, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können ebenfalls Nicht-Antikörperspezien sein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, kleinen Peptiden, Polypeptiden, Enzymen, Hormonen, Stereoiden, Cytokinen, Neurotransmittern, Oligomeren, Vitaminen und Rezeptor-bindenden Molekülen, die bevorzugt Markersubstanzen binden, die gebildet werden von oder in Verbindung stehen mit dem Zielort.
Morpholino-Oligomere (hier „Morpholinos" or „MORFs") binden und inaktivieren ausgewählte RNA-Sequenzen. Diese Oligomere sind zusammengesetzt aus vier verschiedenen Morpholino-Untereinheiten, wobei jede von diesen eine der vier genetischen Basen (A, G, C, T oder U) enthält, die mit einem sechsgliedrigen Morpholinring verknüpft sind. Diese Untereinheiten, als 15–25mere, sind untereinander in einer spezifischen Anordnung durch nichtionische Phosphordiamidat-Verknüpfungen innerhalb der Untereinheiten verbunden, wobei ein Morpholino-Oligomer erhalten wird. Sie können bessere Antisense-Eigenschaften zeigen als es DNA, RNA und deren Analoga mit fünfringigen Ribose- oder Deoxiribose-Rückgrateinheiten haben, die durch ionische Verknüpfung verbunden sind. Summertons Arbeit bezüglich Morpholinos ist in US-Patenten Nr. 5,142,047 und 5,185,444 offenbart. Morpholinos sind kommerziell von Gene Tools, LLC., Corvallis, Oregon erhältlich.
Da Morpholinos direkt zum Ziel transportiert werden, sind sie effektive Werkzeuge für genetische Studien und Validierungsprogramme betreffend die Ansteuerung von Wirkstoffen. Sie sind vollkommen stabil gegenüber Nukleasen. Ein steiferes MORF-Rückgrat könnte einen verbesserten Zugang während der Formung des Duplex bieten, wenn man dies mit einem Peptidrückgrat oder mit dem üblicheren Zuckerrückgrat vergleicht. Verglichen mit PNAs sind Morpholinos preiswerter und löslicher in wässrigen Lösungen, und sie bieten besser voraussagbares Ansteuern und eine höhere Wirksamkeit in RNA-Bindungsaffinitäten.
In der vorliegenden Erfindung wird ein Morpholino-Oligomer (hier MORF), welches an einen ansteuernden Antikörper gebunden ist, in vivo mit dem komplementären MORF (hier cMORF) hybridisiert, welches an ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel gebunden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Länge des MORFs und seines komplementären Morpholinos (cMORFs) zwischen 6 Basen und etwa 100 Basen, z.B. MORF15 und cMORF15 (15mer), MORF18 und cMORF18 (18mer) oder MORF25 und cMORF25 (25mer).
Die MORFs, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, schließen ein 15mer (5'-Äquivalent TGT-ACG-TCA-CAA-CTA-Linker-Amin (hier MORF15) und TAG-TTG-TGA-CGT-ACA-Linker-Amin (hier komplementäres MORF oder cMORF15)), ein 18mer (5'-Äquivalent CGG-TGT-ACG-TCA-CAA-CTA-Linker-Amin (hier MORF18) und TAG-TTG-TGA-CGT-ACA-CCC-Linker-Amin (hier komplementäres MORF18 oder cMORF18)) und ein 25mer (5'-Äquivalent T-GGT-GGT-GGG-TGT-ACG-TCA-CAA-CTA-Linker-Amin (hier MORF25) und TAG-TTG-TGA-CGT-ACA-CCC-ACC-ACC-A-Linker-Amin (hier komplementäres MORF25 oder cMORF25)) ein.
Die Struktur des Morpholino-Oligomers (Summerton and Weller, Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 7: 187–95, 1997), das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist unten stehend gezeigt:
B = Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin/Uracil
Im Stand der Technik bekannte Aufreinigungsmittel können in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Wenn das erste Konjugat z.B. Avidin oder Streptavidin umfasst, kann Biotin als Aufreinigungsmittel verwendet werden. Alternativ können, wenn das erste Konjugat Biotin umfasst, Avidin oder Streptavidin als Aufreinigungsmittel verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Aufreinigungsmittel ein Antikörper, der an die Bindungsstelle der Ansteuerungseinheit bindet, wobei die Ansteuerungseinheit ein Antikörper, ein Antigen-bindendes Antikörperfragment oder eine Nicht-Antikörper-Ansteuerungseinheit sein kann. In einem besonders bevorzugten Verfahren ist das Aufreinigungsmittel ein monoklonaler Antikörper, der anti-idiotypisch zum monoklonalen Antikörper des Konjugats, welches im ersten Schritt verwendet wird, ist, wie es beschrieben wird in US-Anmeldung Seriennr. 08/486,166. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist das Aufreinigungsmittel mit mehreren Kohlenhydratresten substituiert, wie z.B. Galaktose, was es ermöglicht, das Aufreinigungsmittel durch Asialoglycoprotein-Rezeptoren in der Leber, schnell aus dem Kreislauf zu entfernen.
Eine physiologische Lösung der Ansteuerungsspezies wird vorteilhafterweise in sterile Ampullen abgemessen, z.B. zu einer Dosierungseinheit von etwa 1,0–500 mg der Ansteuerungsspezies/Ampulle, und die Ampullen werden gasdicht verschlossen und bei niedrigen Temperaturen gelagert oder lyophilisiert, gasdicht verschlossen und gelagert.
Variationen und Modifikationen dieser Zubereitungen werden für den Fachmann schnell ersichtlich werden abhängig von den individuellen Bedürfnissen des Säugers oder des Behandlungssystems, ebenso wie von den Variationen in der Form, in der die Radioisotope bereitgestellt oder zugänglich gemacht werden können.
Verabreichungswege schließen intravenöse, intraarterielle, intrapleurale, intraperitonale, intrathecale, subkutane Verabreichung oder Verabreichung durch Perfusion ein.
Verfahren, die nützlich zur inneren Detektion oder Behandlung von Tumoren oder anderen Schädigungen sind, wie z.B. kardiovaskuläre Schädigungen (Blutgerinnsel, Embolien, Infarkte, etc.), infektiöse Krankheiten, entzündliche Krankheiten und Autoimmunkrankheiten, sind offenbart in US-Patent Nr. 4,782,840, US-Patent Nr. 4,932,412 und US-Patent Nr. 5,716,595. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um die Verfahren, die in diesen Referenzen offenbart sind, zu verbessern. Die vorliegende Erfindung kann auch in Kombination mit intraoperativen Sonden, endoskopischen und laparoskopischen Verwendungen, und in Verfahren zur Abbildung normaler Organe praktiziert werden. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können in anderen Verfahren verwendet werden, die für den Fachmann ersichtlich sind.
Beispiele für therapeutische Mittel schließen Antikörper, Antikörperfragmente, Wirkstoffe, Toxine, Nukleasen, Hormone, Immunomodulatoren, Chelatoren, Borverbindungen, photoaktive Mittel oder Farbstoffe und Radionuklide ein.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist das cMORF konjugiert mit einer bifunktionalen-Chelat-bildenden Verbindung, die wiederum mit einem Isotop radiomarkiert ist. Eine Chelat-bildende Verbindung wird radiomarkiert, bevor sie an ein Protein, ein Polypeptid oder ein Oligonukleotid konjugiert wird (preconjugation labeling), die diesen harschen Bedingungen nicht standhalten. Beispiele für Chelat-bildende Verbindungen können Hydrazin-Nikotinamid (HYNIC), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan N,N',N'',N'''-Tetraessigsäure (DOTA) und Mercaptoacetyl-glycylglycylglycin (MAG₃) einschließen. Eine bevorzugte bifunktionale Chelat-bildende-Verbindung, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein N-Hydroxysuccinimidyl-Derivat von Acetyl-S-geschütztem Mercaptoacetyl-Triglycin (NHS-MAG₃). NHS-MAG₃ wird nach dem Verfahren von Winnard, P. et al., Nucl. Med. Biol. 24: 425–32 (1997) synthetisiert. Die Konjugation von einfachsträngigen Morpholino-Oligomeren mit NHS-MAG₃ wurde wie in Mardirossian, G. et al., Nucl. Med. Biol. 38: 907–13 (1997) beschrieben, durchgeführt.
Als therapeutische Mittel nützliche Radionuklide, die im Wesentlichen durch Betapartikel-Emission zerfallen, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, P-32, P-33, Sc-47, Fe-59, Cu-64, Cu-67, Se-75, As-77, Sr-89, Y-90, Mo-99, Rh-105, Pd-109, Ag-111, I-125, I-131, Pr-142, Pr-143, Pm-149, Sm-153, Tb-161, Ho-166, Er-169, Lu-177, Re-186, Re-188, Re-189, Ir-194, Au-198, Au-199, Pb-211, Pb-212 und Bi-213. Maximale Zerfallsenergien für nützliche Betapartikel-emittierende Nuklide sind bevorzugt 20–5.000 keV, weiter bevorzugt 100–4.000 keV und besonders bevorzugt 500–2.500 keV.
Als therapeutische Mittel nützliche Radionuklide, die im Wesentlichen durch Augerteilchen-Emission zerfallen, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111, Sb-119, I-125, Ho-161, Os-189m und Ir-192. Maximale Zerfallsenergie dieser Radionuklide ist bevorzugt weniger als 1.000 keV, weiter bevorzugt weniger als 100 keV und besonders bevorzugt weniger als 70 keV.
Als therapeutische Mittel nützliche Radionuklide, die im Wesentlichen unter Generierung von Alphapartikeln zerfallen, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213 und Fm-255. Zerfallsenergien von nützlichen Alphapartikel-emittierenden Radionukliden sind bevorzugt 2.000–9.000 keV, weiter bevorzugt 3.000–8.000 keV und besonders bevorzugt 4.000–7.000 keV.
Metalle, als Komplexe, die als Teil eines photodynamischen Therapieverfahrens nützlich sind, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, Zink, Aluminium, Gallium, Lutetium und Palladium.
Radionuklide, die nützlich sind in Therapien, die auf Neutronen-Einfangverfahren basieren, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, B-10, Gd-157 und U-235.
Nützliche diagnostische Mittel schließen ein, sind aber nicht limitiert auf Radionuklide, Farbstoffe (so wie der Biotin-Steptavidinkomplex), Kontrastmittel, fluoreszierende Verbindungen oder Moleküle und verstärkende Mittel (z.B. paramagnetische Ionen) für magnetisches Resonanz-Abbilden (MRI). US-Patent-Nr. 6,331,175 beschreibt die MRI-Technik und die Herstellung von Antikörpern, die an ein MRI-verstärkendes Mittel konjugiert sind. Bevorzugt sind die diagnostischen Mittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Radionukliden, verstärkenden Mitteln verwendbar in magnetischem Resonanz-Abbilden und fluoreszierenden Verbindungen.
Als diagnostische Mittel nützliche Radionuklide, die verwendet werden in Positronemissions-Tomographie schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf F-18, Mn-51, Mn-52m, Fe-52, Co-55, Cu-62, Cu-64, Ga-68, As-72, Br-75, Br-76, Rb-82m, Sr-83, Y-86, Zr-89, Tc-94m, In-110, I-120 und I-124. Die gesamten Zerfallsenergien von nützlichen Positron-emittierenden Radionukliden sind bevorzugt weniger als 2.000 keV, weiter bevorzugt unter 1.000 keV und besonders bevorzugt, weniger als 700 keV.
Metalle, die nützlich in diagnostischen Mitteln unter Verwendung von magnetischen Resonanz-Abbildungstechniken sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Gadolinium, Mangan, Eisen, Chrom, Kupfer, Kobalt, Nickel, Dysprosium, Rhenium, Europium, Terbium, Holmium und Neodym.
Radionuklide, nützlich als diagnostische Mittel unter Verwendung von Gammastrahlen-Detektion schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Cr-51, Co-57, Co-58, Fe-59, Cu-67, Ga-67, Se-75, Ru-97, Tc-99m, In-111, In114m, I-123, I-125, I-131, Yb-169, Hg-197 und Tl-201. Zerfallsenergien von nützlichen Gammastrahlen emittierenden Radionukliden sind bevorzugt 20–2.000 keV, weiter bevorzugt 60–600 keV und besonders bevorzugt 100–300 keV.
Die erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden im Weiteren durch Beispiele, die Aspekte der Erfindung im Detail zeigen, veranschaulicht. Diese Beispiele zeigen spezifische Elemente der Erfindung, sind aber nicht darauf ausgelegt, den Geltungsbereich hierauf zu limitieren.
Beispiele
Materialien und Methoden
Die MORFs, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden von Gene Tools, LLC. (Corvallis, Oregon) erhalten. Sie schließen ein ein 15-mer (5'-Äquivalent TGT-ACG-TCA-CAA-CTA-Linker-Amin (hier MORF15) und TAG-TTG-TGA-CGT-ACA-Linker-Amin (hier komplementäres MORF15 oder cMORF15)), ein 18-mer (5'-Äquivalent CGG-TGT-ACG-TCA-CAA-CTA-Linker-Amin (hier MORF18) und TAG-TTG-TGA-CGT-ACA-CCC-Linker-Amin (hier komplementäres MORF18 oder cMORF18)) und ein 25-mer (5'-Äquivalent T-GGT-GGT-GGG-TGT-ACG-TCA-CAA-CTA-Linker-Amin (hier MORF25) und TAG-TTG-TGA-CGT-ACA-CCC-ACC-ACC-A-Linker-Amin (hier komplementäres MORF25 oder cMORF25)). Der Linker, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist H₂N-CH₂-CH(CH₂CH₂)₂N-COCH₂CH₂-CO-. Die Molekulargewichte liegen im Bereich von 5090 bis 8568 Dalton. Die cMORFs wurden gelegentlich mit einer Biotingruppe am 3'-Ende an Stelle des Amin bezogen.
Streptavidin-beschichtete magnetische Beads (BioMag, Streptavidin Ultra-Load, Polysciences Inc Warrington, PA); 1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC) (Pierce, Rockford, IL); das Gel (Bio-Gel P-4 Gel, Medium) zur Trennung (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) und das Sephadex-G100-Harz (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) wurden bezogen und verwendet, wie erhalten. Alle anderen Chemikalien sind analysenrein und wurden ohne weitere Aufreinigung verwendet. Das ^99mTc-Pertechnetat wurde von einem ⁹⁹Mo-^99mTc-Generator (Dupont, Billerica, MA) eluiert.
Die bifunktionale Chelat-bildende Verbindung, N-Hydroxysuccinimidyl-Derivat von Acetyl-S-geschütztem Mercaptoacetyl-triglycin (NHS-MAG₃) wurde nach dem Verfahren von Winnard, P. et al., Nucl. Med. Biol. 24: 425–32 (1997) synthetisiert. Die Struktur wurde durch Elementaranalyse, Protonen-NMR und Massenspektroskopie bestätigt. Zu 0,97 ml einer 0,225 M Natriumhydroxydlösung wurden 50 mg Triglycin (264 μmol) und 10 μl einer frisch zubereiteten 50 mM Dinatriumethylentriamin-Tetraessigsäurelösung (EDTA) zugefügt. Diese Lösung wurde durch einen 0,2 μm-Filter gefiltert, um Amin-enthaltende Dispersionsteilchen zu entfernen. Eine Lösung aus 90 mg (390 μmol) von S-Acetylthioglycolsäure-N-hydroxysuccinimidester (SATA) in 340 μl Dimethylformamid (DMF; getrocknet über Molekularsieb) wurde hergestellt und tropfenweise zu einer gerührten Triglycinlösung zugegeben. Nach 15 min Rühren bei Raumtemperatur wurde die nicht wässrige Lösung mit einem augenscheinlichen pH von 8,9 auf einen augenscheinlichen pH von etwa 2,7 (gemessen mit einem Glas-Elektronen-pH-Meter) durch Zufügen von 37,6 μl einer 6 M Salzsäure angepasst. Ein anfänglicher pH von etwa 8,9 wurde ausgewählt, um das Amin am Triglycin zu deprotonieren (pK 7,9; Fasman, G. D. [Hrsg.] 1976, CRC Handbook of Biochemistry and Molcular Biology, Dritte Ausg., Bd. I, S 321, CRC Press, Boca Raton, FL) ohne dabei extrem basische pH-Werte zu erreichen, bei denen die Acetylgruppe am SATA hydrolysieren kann. Der pH-Wert wurde so schnell wie möglich erniedrigt, um Hydrolyse der Acetylgruppe zu minimieren.
Eine Lösung von 60 mg (290 μmol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 3,6 ml trockenem DMF wurden schnell zu einer gerührten Triglycin/SATA-Lösung zugefügt (augenscheinlicher pH von etwa 5,0). Die Lösung wurde innerhalb von 2 min trüb, da Dicyclohexylharnstoff auszufallen begann. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur im Dunkeln für 2–4 Std. gerührt und dann auf –20°C für eine zusätzliche Stunde gekühlt, um ein komplettes Ausfallen hervorzurufen. Nach Zentrifugieren bei 4°C, 2500 g für 15 min, wurde der klare Überstand entfernt.
Auf Grund des in der DMF-Lösung enthaltenen Wassers wurde die NHS-MAG₃-Zubereitung in dieser Form immer innerhalb von 24 Stunden nach Herstellung verwendet. Für Lanzeitlagerung wurde die NHS-MAG₃-Wasser/DMF-Lösung in 15–30 min mit einem Rotationsverdampfer (Rotavapur-R, Buchi, Schweiz) bis fast zur Trockenheit evaporiert, und wurde dann innerhalb 1 Std. mit einem Lyophilisator (Virtis, Gardenier, NY) zur Trockenheit lyophilisiert. Nach Trocknung auf diese Weise kann NHS-MAG₃ auf unbestimmte Zeit bei Raumtemperatur in einem Exsikkator aufbewahrt werden. Wenn das trockene pulverisierte NHS-MAG₃ zur Konjugation verwendet wird, wird ein willkürlicher Wert von 50 Gew.-% für seine Reinheit angenommen.
Größenausschluss-HPLC-Analysen (SE) wurden auf einer Superose-12-Säule (HR10/30, Amersham Pharmacia Biotech) mit 0,10 mol/L Phosphatpuffer, pH 7,0, als Eluent, bei einer Flussrate von 0,6 mL/min durchgeführt. Um die Peak-Fraktionen zu identifizieren und quantifizieren, wurde in-line-UV-Absorption bei 260 nm und Radioaktivitäts-Detektoren erwendet. Die Ausbeute an Radioaktivität wurde routinemäßig bestimmt.
Beispiel 1 Kupplung von MN-14 mit MORF15 und MORF18
Eine Lösung des Anti-CEA IgG-Antikörper MN-14 der Maus (IgG₁-Untertyp, Molekulargewicht 150 kDa) wurde bei einer Konzentration von 1000 μg/83 μL in phosphatgepuffertem Salin (pH 7,0–7,2) hergestellt und wurde mit entweder MORF15 (500 μg/250 μL) oder MORF18 (600 μg/250 μL) in 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES), pH 5,0, in Anwesenheit von 1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) in Wasser (1000 μg/50 μL) konjugiert. Die o.g. Mischung wurde bei Raumtemperatur für mindestens eine Stunde inkubiert.
Aufreinigung wurde auf einer 0,7 × 20 cm Sephadex-G100-Säule mit 0,05 mol/L Phosphatpuffer, pH 7,0, als Eluent durchgeführt. Die Konzentrationen der wiedergewonnenen Fraktionen wurden bezüglich MN14 durch UV-Absorption bei 280 nm unter Verwendung des Absorptionskoeffizienten von 1,4 μL/μg abgeschätzt.
Die Antikörper-MORF-Konjugate wurden hinsichtlich der Antikörperkonzentration und MORF-Gruppe pro Molekül charakterisiert. Vorher wurden Gruppen pro Molekül durch Zufügen von anwachsenden Mengen des radiomarkierten cMORF zu dem konjugierten Antikörper abgeschätzt, gefolgt von Größenausschluss-HPLC-Analysen zur Feststellung des Sättigungspunkts durch einen Shift im Radioaktivitätprofil im Vergleich zu dem von freiem cMORF. (Liu, G. et al., J. Nucl. Med. 43: 384–391 (2002)). In der vorliegenden Untersuchung wurde eine alternative und genauere Methode unter Verwendung von UV-Absorption angewendet. Die separaten Absorptionsprofile von nativem MN14, freiem MORF15 und freiem MORF18 wurden zuerst innerhalb von 200 bis 300 nm unter Verwendung eines scannenden UV-Spektrophotometers (U-2000, Hitachi Instruments, Inc, Danbury, CT) gemessen. Demnach wurde bestimmt, dass die maximale Absorption von MN14 bei 280 nm liegt, während die von beiden MORFs 265 nm ist. Da das MORF-konjugierte MN14 auch nach Aufreinigung Spuren von freiem MORF enthält, wurden die Messungen während der HPLC-Trennung durchgeführt. Demnach wurden Standardkurven durch HPLC-Dual-UV-Analyse aufgenommen, bei der die Absorption von nativem MN14 und nativem MORF15, sowohl bei 280 nm als auch bei 265 nm gemessen wurde. Unter der Annahme, dass die Absorptionskoeffizienten von MN14 und MORF nach der Konjugation sich nicht verändern, wurde die Konzentration von MN14 und der MORF- Gruppen pro Molekül durch Messen der Absorption beider Wellenlängen während der HPLC-Analyse des konjugierten Antikörpers berechnet. Die Konzentration von MN14 und der MORF-Gruppen pro MN14 in jeder MN14-MORF-Probe wurde entsprechend der folgenden Gleichungen berechnet:
H²⁸⁰ = H²⁸⁰ _MN14 + H²⁸⁰ _MORF
H²⁶⁵ = H²⁶⁵ _MN14 + H²⁶⁵ _MORF
H²⁸⁰ _MN14 = k²⁸⁰ _MN14W_MN14
H²⁸⁰ _MORF = k²⁸⁰ _MORFW_MORF
H²⁶⁵ _MN14 = k²⁶⁵ _MN14W_MN14
Konzentration von MN14 = WMN14/angewendetes Volumen Gleichung 3 MORF-Nummer pro MN14 = (WMORF/MMORF)/(WMN14/MMN14) Gleichung 4
Wobei H die Peak-Höhe in Absorptionseinheiten (AU) ist, W ist das Gewicht (μg), M ist das Molekulargewicht (Da) und k ist die Steigung der Standardkurve (AU/μg).
1A zeigt die Profile bei 280 nm, erhalten durch HPLC-Analyse der konjugierten und aufgereinigten MN14-MORF15 (linkes Spektrum) und MN14-MORF18 (rechtes Spektrum), die in dieser Untersuchung verwendet wurden. Die Chromatogramme bei 265 nm sind im Grunde dieselben, abgesehen von kleinen Differenzen in der Peak-Höhe (Daten nicht gezeigt). In beiden Kanälen sind einige kleine Peaks vorhanden. Diejenigen, die sich auf der linken Seite des Haupt-Peaks befinden, sind Verunreinigungen mit höherem Molekulargewicht, möglicherweise auf Grund von Quervernetzungen, während die auf der rechten Seite von freiem MORF herrühren.
Die UV-Spektren von sowohl MN14 als auch MORF15 sind in 1B gezeigt. Die Überlappung des Peaks von MORF15 bei 265 nm und des Peaks von MN14 bei 280 nm ist klar gezeigt. Nichtsdestotrotz ist es möglich, das Gewicht von MORF und das Gewicht von MN14 in der Probe von MORF-konjugiertem MN14 genau durch Messung der Absorption bei beiden Wellenlängen und durch Kalkulation der Gewichte von sowohl MORF als auch MN14 im Protein-Peak, unter Verwendung der Gleichungen 1 und 2 zu bestimmen. 1C und 1D zeigen Standardabsorptionskurven für natives MN14 und natives cMORF15. Beide Kurven sind zumindest innerhalb des untersuchten Bereichs linear (d.h. 0–100 μg für MN14 und 0–10 μg für MORF), mit Steigungen von 0,00104 AU/μg und 0,00073 AU/μg für MN14 und 0,01022 AU/μg und 0,01816 AU/μg für MORF15 bei 280 nm bzw. 265 nm. Die Standardkurven für MORF18 und MORF25 (nicht gezeigt) sind mit Steigungen von 0,00738 und 0,00749 AU/μg und 0,01287 und 0,01314 AU/μg für MN14 und MORF15 bei 280 nm bzw. 265 nm sehr ähnlich. Mit den Gleichungen 1, 2 und 4 wurden die MORF-Gruppen pro MN14 für die MN14-MORF15- und MN14-MORF18-Konjugate, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, berechnet, und als identisch mit jeweils 0,28 ± 0,1 und 0,27 ± 0,1 Gruppen pro Molekül bestimmt. Die Konzentration der konjugierten Antikörper wurde ebenfalls unter Verwendung der Gleichungen 1, 2 und 3 berechnet.
Beispiel 2 Kupplung von cMORF15 und cMORF18 an NHS-MAG₃
Die Konjugation von cMORF15 und cMORF18 mit NHS-MAG₃ wurde erreicht wie beschrieben in Mardirossian, G. et al., J. Nucl. Med. 38: 907–13 (1997) und Wang, Y. et al., Bioconj. Chem. 12: 807–816 (2001). NHS-MAG₃-Pulver (410 μg) wurde sowohl mit cMORF15 als auch mit cMORF18 (880 μg/200 μL) in 0,2 M HEPES, pH 8, konjugiert. Fünfzig Mikroliter HEPES wurden zu der resultierenden Mischung zugefügt und 4 Stunden inkubiert. cMORFs (880 μg) wurden in 250 μl 0,2 M HEPES-Puffer (pH 8,0) gelöst und in einer Ampulle, enthaltend 1150 μg festes NHS-MAG₃ zugefügt. Nach Vortexen wurde die Mischung für mindestens 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Das molare Verhältnis von MORF18 zu NHS-MAG₃ war etwa 1:20. Die inkubierte Lösung wurde auf einer 0,7 × 20 cm P4-Säule mit einem Eluenten aus 0,25 M Ammoniumacetatpuffer, pH 5,2, getrennt. Die Konzentration der wiedergewonnenen Fraktion in Bezug auf cMORF wurde durch UV-Absorption bei 265 nm unter Verwendung eines Absorptionskoeffizienten von 31 μL/μg abgeschätzt. Die Peak-Fraktionen wurden durch UV-Spektrometrie bei 265 nm identifiziert und in einem Gefrierschrank bei –20°C aufbewahrt.
Die Kupplungsmischung wurde auf einer P4-Säule (0,7 × 20 cm; BioRad, Melville, NY) unter Verwendung von Ammoniumacetat (0,25 M, pH 5,2) als Eluent aufgereinigt. Die cMORF15-MAG₃- und cMORF18-MAG₃-Peaks wurden durch UV-Absorption bei 260 nm unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 31,1 μL/μg bestimmt.
Beispiel 3 Radiomarkieren von cMORF15-MAG₃ und cMORF18-MAG₃
Fünfundzwanzig Mikroliter von cMORF15-MAG₃ und cMORF18-MAG₃ (0,25 M Ammoniumacetat, pH 5,2) wurden mit 6 μL Natriumtartratlösung (50 mg/ml frisches Natriumtartrat in 0,5 M Natriumhydrogencarbonat, 0,25 M Ammoniumacetat, 0,18 Ammoniumhydroxid, pH 9,2) gemischt. Dem folgte das Zufügen von 20 μL von etwa 5 mCi des ^99mTc-Pertechnetat-Generator-Eluenten. Schließlich wurden 2 μL Zinn(II)-Chlorid (1 μg/μL in 10 mM HCl; Sigma) schnell durch Schütteln zugefügt. Die Konjugate wurden verschlossen und für 20–30 min in ein kochendes Wasserbad gestellt.
Nach 5–15 min bei Raumtemperatur wurden die markierten cMORFs-MAG₃ auf einer P4-Säule (0,7 × 20 cm) mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7, als Eluent aufgereinigt. Der Peak wurde durch Zählen der Fraktionen in einem Dosierungseichgerät identifiziert. Das aufgereinigte Produkt wurde durch Größenausschluss-HPLC unter Verwendung einer Superose-12 (Pharmacia Piscataway, NJ) analysiert. 1 zeigt ein Größenausschluss-HPLC-Radiochromatogramm, in dem die Peak-Zeiten für cMORF18-MAG₃-^99mTc und cMORF15-MAG₃-^99mTc 30,8 min bzw. 31,2 min waren.
Qualitätssicherung von markiertem cMORF18
2 zeigt UV-Chromatogramme von nativem cMORF18 (2A) und MAG₃-gekuppeltem cMORF18 (1B), und ein Radiochromatogramm von ^99mTc-MAG₃-cMORF18 (2C). Die Markierungseffizienz von markiertem-cMORF18 war zwischen 40–60%. Die Radioaktivitätsrückgewinnung von markiertem-cMORF18 aus der HPLC war immer über 90%. Die Retentionszeit von sowohl nativem als auch gekuppeltem-cMORF18 ist 29,5 Minuten, allerdings zeigt Letzteres eine kleine Schulter mit einer Retentionszeit von etwa 28 Minuten (möglicherweise eine Folge der Ausbildung von einem MAG₃-cMORF18-Dimer durch Disulfidbindungen). Das radiomarkierte-cMORF18 zeigte eine etwas längere Retentionszeit von 31,1 Minuten.
Hybridisierungsvermögen von ^99mTc-markiertem-cMORF18
Binden an Beads ist eine geeignete Methode zur Bestimmung der Hybridisierung zwischen einem Oligomer und seinem Komplementär. Mardirossian, G. et al., J. Nucl. Med. 38: 907–13 (1997) und Wang, Y. et al. Bioconj. Chem. 12: 807–816 (2001). Nach Optimierung der Hybridisierungsbedingungen wurde die Hybridisierungsbefähigung von radiomarkiertem-cMORF18 auf Streptavidin-beschichteten magnetischen Beads bestimmt.
Die Beads (300 μl) wurden dreimal mit 200 μl des Waschpuffers gewaschen (20 mmol/L Tris-Puffer-0,5 mol/l Natriumchlorid, pH 8,2). Die Beads wurden im Reaktionsgefäß (tube) unter Verwendung eines magnetischen Abscheiders (MPC, Dynal, A. S., Lake Success, NY) zurückbehalten. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Beads in 200 μl des Waschpuffers suspendiert, 1,0 μg Biotin-MORF18 wurde zugefügt und 15 Minuten später wurden die Beads wiederum dreimal gewaschen mit jeweils 200 μl des Waschpuffers. Nach Resuspension in 200 μl Waschpuffer wurde 2 μl radiomarkiertes-MORF18 (0,02 μg cMORF18) zugegeben. Nach 1 h Inkubieren bei konstantem Schütteln wurden die Beads getrennt, dreimal gewaschen und gezählt in einem NaI(TI)-Plattenzähler (well counter). Der Überstand und die Waschlösungen wurden vereinigt und gezählt. Das gleiche Verfahren wurde simultan ebenfalls mit zwei Kontrollgruppen, einer ohne Biotin-MORF18 und einer, bei der Biotin-MORF18 mit Biotin-cMORF18 substituiert wurde, durchgeführt.
Unter den Bedingungen der Bead-Studie haben 90,2 ± 0,9% (n = 3) der markierten-cMORF18 an MORF18-Beads gebunden im Vergleich zu nur 0,4 ± 0,1% und 0,3 ± 0,1% (n = 3) der markierten-cMORF18 im Falle von jeweils Blindkontrolle und der Biotin-cMORF18-Kontrolle. Die Radioaktivität auf den Beads in der Studiengruppe ist deshalb ein Ergebnis der Hybridisierung von markiertem-cMORF18 an MORF18 auf den Beads. Diese Hybridisierungsergebnisse von ^99mTc-MAG₃-cMORF18 (18mer) an MORF (18mer) auf Beads stimmt mit früheren Ergebnissen bezüglich der Hybridisierung auf Beads von einem ^99mTc-MAG₃-MORF (15mer) an cMORF (15mer) überein (Mang'era, K. O. et al. Eur. J. Nucl. Med. 28: 1682–1689 (2001).
Der einfache Peak der für markiertes-cMORF18 durch HPLC (2c) erhalten wird und die Tatsache, dass mindestens 90% der Radioaktivität an sein Komplementär in der Bead-Studie bindet, zeigt, dass Kupplung mit NHS-MAG₃, Aufreinigung auf der P4-Säule, Markierung mit ^99mTc und erneute Aufreinigung auf der P4-Säule ein zufriedenstellend radiomarkiertes-cMORF18 zur Verfügung stellt.
Abschätzung von MORF18-Gruppen pro Molekül auf gekuppeltem-MN14
Nach Kupplung kann das MORF18 auf MN14 nicht durch UV-Absorption detektiert werden. Um die Anzahl der MORF18-Gruppen auf MN14 abzuschätzen, wurde eine Serie von Aliquots bestehend aus aufgereinigten, radiomarkierten-cMORF18 (4, 25, 50, 150 μl bei 0,01 μg/μl) zu 50 μl MN14-MORF18 (0,5 μg/μl) zugefügt, bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert und durch SE HPLC analysiert. Eine Kontrollstudie wurde identisch durchgeführt mit 4 μl (0,01 μg/μl) radiomarkiertem-cMORF18, welches zu nativem MN14 zugefügt wurde. Unter Verwendung von SE HPLC kann die an MN14 gebundene Radioaktivität direkt durch die Verschiebung zu höheren Molekulargewichten von markiertem cMORF18 zu markiertem cMORF18-MN14-MORF18 (frühere Retentionszeiten) im Radioaktivitätsprofil detektiert werden.
3 zeigt ein HPLC-Profil erhältlich durch die Hybridisierung von MN14-konjugiertem MORF18 mit markiertem cMORF18. Die Rückgewinnung der Radioaktivität war über 90%. Das UV-Chromatogramm von MN14-MORF18 ist als Referenz gezeigt (3A) zusammen mit dem Radioaktivitätsprofil einer Mischung von 50 μl (25 μg) von nativem MN14 und 4 μl (0,04 μg) markiertem cMORF18 (3D). Wenn anstelle von nativem MN14 dasselbe Gewicht von markiertem cMORF18 zum selben Gewicht von MN14-MORF18 zugefügt wird, wird eine Verschiebung von mindestens 80% zu höherem Molekulargewicht offensichtlich (3B). Die verbleibenden 20% bestehen aus zwei Peaks, einer mit einer Retentionszeit, die mit markiertem cMORF18 korrespondiert, und der andere mit derselben Retentionszeit wie ein hybridisierter Duplex von MORF18 und markiertem cMORF18 (Messwerte hier nicht gezeigt). Demnach sind die zwei Peaks möglicherweise jeweils ein Ergebnis aus freiem markiertem cMORF18 und markiertem cMORF18 hybridisiert an freies MORF18, welches während der Aufreinigung der MN14-Herstellung nicht entfernt wurde. Dass 80% des markierten cMORF18 an MN14 bindet, zeigt, dass MORF18 erfolgreich an den Antikörper gekuppelt wurde und dass es immer noch befähigt ist, zu hybridisieren. Natives MN14 bindet ^99mTc-MAG₃-cMORF18 nicht (3D).
3 zeigt ebenso Radiochromatogramme einer Mischung aus 25 μl (0,25 μg) markiertem cMORF18 und 50 μl (25 μg) MN14-MORF18 (3C). Mehr als die Hälfte der Radioaktivität ist unter diesen Bedingungen nicht hybridisiert. Erhöhungen der Dosierung von markiertem cMORF18 auf 50 μl oder 150 μl erhöht die relative Größe des Peaks aus freiem ^99mTc-MAG₃-cMORF18, da die MORF18-Moleküle auf MN14 gesättigt werden.
Beispiel 4 Bioverteilung von markiertem-cMORF in normalen CD-1-Mäusen
Zwölf normale CD-1-Mäuse (30–35 g) erhielten jeweils 1,5 μg (3,7 MBq) von markiertem-cMORF18 durch Injektion in die Schwanzvene. Vier Mäuse wurden jeweils nach 0,5, 1,0 und 3,0 h getötet. Die Mäuse wurden seziert, der Urin wurde vorsichtig entfernt und die Organe wurden entfernt und gewogen. Die Radioaktivität in jedem Organ wurde gezählt in dem NaI(T1)-Zähler (well counter) zusammen mit Blutproben bekannten Volumens und einem Aliquot des Injizierten. Die im Kadaver verbleibende Radioaktivität wurde mittels eines Dosierungs-Eichgerät (dose calibrator) gemessen.
Tabelle 1 listet die Bioverteilungsergebnisse von ^99mTc in den normalen CD-1-Mäusen zu drei Zeitpunkten, 0,5, 1,0 und 3,0 h nach Injektion von ^99mTc-cMORF18, auf. Die Radioaktivität des gesamten verbleibenden Körpers (nicht einschließend den Urin) war 23%, 12% und 7% ID jeweils zu diesen Zeitpunkten.
Es fand keine signifikante Aufnahme in die Leber, in den Dünndarm und den Dickdarm statt, ein Zeichen dafür, dass markiertes-cMORF18 fast ausschließlich durch die Nieren ausgeschieden wird. Die höchste Radioaktivität war durchweg in den Nieren bei 6 bis 7% ID/g. Nach 0,5 h war das Niveau im Blut (0,7% ID/g) relativ hoch, aber nach 1 h war es sowohl im Blut als auch in alle anderen Organen, ausgeschlossen der Niere, < 0,2% ID/g.
Tabelle 1 Bioverteilung von ^99mTc-cMORF18 in normalen Mäusen (% ID/g) (n = 4)
Beispiel 4 Bioverteilung von markiertem cMORF18 in nackten Mäusen mit Tumor
Bioverteilungsmessdaten in Tabelle 2 zeigen, dass mit Ausnahme der Nieren die Radioaktivität sich vorwiegend im Tumor akkumuliert mit Werten von 1,7 bis 1,8% ID/g und dass die Radiomarkierung im Tumor während dieser Zeitdauer zurückgehalten wurde. Die Radioaktivitätsniveaus im ganzen Körper der Testtiere war 14% und 11% ID bei 3 h und 24 h, während die Werte für die Kontrolltiere 7% und 5% waren (in allen Fällen wurde der radioaktive Urin entfernt).
Tabelle 2 Bioverteilung von ^99mTc-cMORF18 in LS174T-tumorhaltigen nackten Mäusen (% ID/g) (n = 4)
4 zeigt HPLC-Radiochromatogramme von Urin bei 3 h erhalten von einem Kontrolltier (4A) und von einem Testtier (4B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Radioaktivität im Urin von intaktem markiertem cMORF18 vorkommt (2C) und dass daher markiertes cMORF stabil in vivo ist.
4 zeigt ebenfalls Radiochromatogramme vom Plasma eines Kontrolltieres (4C) und eines Testtieres (4D) bei 3 h. Da die Radioaktivitätniveaus zu niedrig waren zur Messung mit dem Inline-Radioaktivitätsdetektor, wurden Fraktionen aus der HPLC gesammelt zur Messung in einem NaI(TI)-Plattenzähler (well counter). In der Abbildung wurden die Achsen angepasst, so dass die Retentionszeiten für alle Kanäle vergleichbar sind. Für das Kontrolltier ist kein Radioaktivitätspeak im Plasma vorhanden (4C), wohingegen das Radiochromatogramm von Plasma des Testtieres bei gleichem Maßstab (4D) nur einen Radioaktivitätspeak zeigt, der mit seiner Retentionszeit zur markiertem cMORF18 korrespondiert, das an MN14-MORF18 hybridisiert (3B). Die höhere Radioaktivität im Blut der Testtiere im Vergleich zu der Kontrolle (Tabelle 2) zeigt, dass eine beträchtliche Menge des radiomarkierten Antikörpers sich immer noch in der Zirkulation innerhalb der Testtiere 48 h nach Injektion des markierten cMORF18 (wie erwartet für einen IgG-Antikörper) befand. In Abwesenheit des Antikörpers klärte sich das markierte cMORF18 schnell, wie in den Kontrolltieren gezeigt wurde.
Beispiel 5 Vorheriges Ansteuern (pretargeting) von markiertem cMORF18 in LS174T-tumorhaltigen nackten Mäusen
Der LS174T-Tumor wurde erhalten von der American Type Culture Collection und wurde in dem minimal erforderlichen Medium gezüchtet (Gibco, Grand Island, NY). Die Zellen wurden von der Kulturflasche durch Trypsinierung entfernt und dann mit dem Kulturmedium gewaschen. Nackte Mäuse mit LS174T-Tumor wurden bereitgestellt wie beschrieben im Protokoll offenbart von Rusckowski et al., Cancer 80: 2269–705 (1997).
10⁶ LS174T-Darmtumorzellen wurden jeweils acht nackten Mäusen (25–30 g) in einen Schenkel injiziert. Nach 14 Tagen, wenn die Tumoren nicht größer als 1 cm in jeglicher Dimension waren, erhielten die Hälfte der Tiere jeweils 50 μg von MN14-MORF18. Nach 48 Stunden erhielten die Mäuse in beiden Gruppen 1,0 μg von markiertem-cMORF18 (7,4–8,9 MBq) per Schwanzvene. Nach 3 und 24 Stunden nach Injektion des markierten-cMORF18 wurden die Tiere narkotisiert mit Ketamin und Xylazin und frontal (anteriorly) vermessen mittels Abbildens mit einem großen Bildfeld einer Szintillationskamera (Elscint, Hackensack, NJ). Direkt nach der bildgebenden Messung nach 24 h wurden die Mäuse getötet und die Bioverteilung des Radiomarkers wurde bestimmt wie beschrieben.
In einer identischen Wiederholungsstudie wurde die bildgebende Messung nach Tötung nach 3 h durchgeführt und nach Entfernung der größten Menge des Urins mit einer Spritze. Urin und Plasmaproben von Mäusen, die nach 3 h getötet wurden, wurden mittels SE HPLC analysiert, im ersteren Fall unter Verwendung von Inline-Radioaktivitätsdetektion und im letzteren Fall durch Sammeln der Fraktionen zur Vermessung in einem NaI(T1)-Plattenzähler (well counter).
5 zeigt Abbildungen des ganzen Körpers nach 3 h (5A) und 24 h (5C) nach Injektion von markiertem cMORF18 in die tumorigen Mäuse, die 48 h früher mit MN14-MORF18 injiziert wurden. Der Tumor in dem Testtier (linker in jedem Element) ist im Vergleich zum Kontrolltier, das kein MN14-MORF18 erhalten hat (rechtes in jedem Element) klar zu erkennen. In den frühen Bildern (5A), tritt die Radioaktivität in der Blase deutlich und im störenden Ausmaß hervor. Nach 24 h hingegen (5C) hat sich die Urinaktivität verringert, so dass das Bild nun klar den Tumor zusammen mit den Nieren zeigt. Eine Wiederholungsstudie nach 3 h (5B) mit bildgebenden Verfahren wurde durchgeführt nach Entfernung des Urins. Nur die Nieren und der Tumor sind zu diesem Zeitpunkt deutlich zu sehen. In allen drei Bildern ist in den Kontrolltieren kein Tumor sichtbar.
Beispiel 6 Der Einfluss der Kettenlänge und der Basensequenz der ^99mTc-Morpholinos auf das Pharmakokinetische Verhalten in Mäusen.
Pharmakokinetik von markiertem cMORF15, cMORF18, cMORF25 und MORF15, MORF18, MORF25
Zwölf normale CD-1-Mäuse mit einem Gewicht von 30–40 g (Charles River, Wilmington, MA) erhielten jeweils 0,3 μg (50–70 μCi) des markierten cMORFs durch Injektion in die Schwanzvene. Vier Mäuse wurden jeweils nach 0,5, 1 und 3 Stunden getötet. Die Radioaktivität wurde in jedem Organ und im Blut gezählt mit einem NaI(T1)-Plattenzähler (well counter), zusammen mit Aliquots des Injizierten. Die im Kadaver verbleibende Radioaktivität wurde in einem Dosierungs-Eichgerät (dose calibrator) gemessen.
Qualitätskontrolle von allen sechs markierten cMORFs wurde mittels HPLC und unter Verwendung von Beads durchgeführt. 6 zeigt HPLC-Radiochromatogramme von allen sechs markierten MORFs und cMORFs, die in jedem Fall einen einfachen Peak mit relativen Retentionszeiten zeigen, die die leichten Unterschiede im Molekulargewicht wiederspiegeln (jeweils 33,5, 32,3 und 29,9 Minuten für MORF25, MORF18 und MORF15, und jeweils 31,3, 31,0 und 30,5 Minuten für cMORF25, cMORF18 und cMORF15. Die Wiedergewinnung war in jedem Fall größer als 90%. Die Hybridisierung von jedem ^99mTc-markierten (c)MORF an das jeweilige biotinylierte Komplementär, das auf Streptavidin-Beads immobilisiert ist, war in allen Fällen im Wesentlichen quantitativ (Messwerte nicht gezeigt).
Tabelle 4 und 5 zeigen die Bioverteilungen in ID%/gm von ^99mTc bei 0,5, 1,0 und 3 Stunden nach Verabreichung von markierten cMORFs und MORFs an normale Mäuse. 7 zeigt in histographischer Form dieselben Bioverteilungsresultate, allerdings in ID%/Organ. Für alle 6 cMORFs ist die Radiomarkierung nach 0,5 Stunden immer noch in der Zirkulation vorhanden, wie gezeigt durch die relativ hohen Werte in Blut und Muskel. Die schnelle Aufklärung von der Zirkulation ist ebenso in allen Fällen durch die Abnahme dieser Radioaktivitätsniveaus nach 1 h gezeigt. Nach 1 h sind die einzigen Organe mit hohen Radioaktivitätsniveaus die Nieren, dies gilt für alle sechs cMORFs. Interessanterweise kann der Einfluss der Kettenlänge nur im Falle von cMORFs gezeigt werden, wo die Nierenniveaus zu allen Zeitpunkten mit ansteigender Kettenlänge deutlich ansteigen. Zum Beispiel steigen die Nierenwerte gemessen nach 3 h von cMORF15 zu cMORF25 jeweils von 1,7 zu 13,5 ID%, sie bleiben allerdings im Wesentlichen konstant bei 4,5 und 5,6 ID% für MORF15 zu MORF25. Im Falle von cMORF25 enthalten die Nierenniveaus zu diesem Zeitpunkt 80% der Radioaktivität des ganzen Körpers. Die Anwesenheit von hohen Radioaktivitätsniveaus nur in den Nieren stimmt mit den Ergebnissen früherer Studien überein, bei denen ^99mTc-markierte MORFs schnelle und fast vollständige Klärung durch die Nieren zeigen. Mang'era, K., et al., Eur. J. Nucl. Med. 28: 1682–1689 (2001) und Liu G. et al., J. Nucl. Med. 43: 384–391 (2002). Tabelle 4 Bioverteilung von ^99mTc-cMORFs in normalen Mäusen (ID%/g, n = 4)

* erhalten von Liu, G. et al., J. Nucl. Med. 43: 384–391 (2002).

Tabelle 5 Bioverteilung von ^99mTc-MORFs in normalen Mäusen (ID%/g, n = 4)
Vorheriges Ansteuern (pretargeting) unter Verwendung von MN14-MORF15 und markiertem cMORF15
Die Bioverteilung in ID% pro Organ und die Ziel-zu-Nicht-Ziel-Verhältnisse bei 3 Stunden nach Verabreichung des radiomarkierten cMORF15 oder cMORF18 an tumortragende Tiere, die MN14-MORF15 oder MN14-MORF18 jeweils 48 Stunden früher erhielten, sind in Tabelle 6 gezeigt. Ebenfalls sind die Ergebnisse der Verabreichung von radiomarkiertem cMORF15 an Kontrolltiere, die den Antikörper nicht erhalten haben, gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen die Überlegenheit von Pretargeting mit cMORF15-^99mTc gegenüber Pretargeting mit cMORF18-^99mTc. Nach 3 Stunden ist die Bioverteilung von cMORF15-^99mTc in tumortragenden nackten Mäusen bei Pretargeting (Tabelle 6) fast dieselbe wie in normalen CD-1-Mäusen (Tabelle 4), in beiden zeigt sich eine geringe Aufnahme in alle anderen Organe außer Nieren und Darm. Es ist ebenfalls kein großer Unterschied in der Radioaktivität zwischen Pretargeting mit 15mer und 18mer in allen Organen außer den Nieren. Die Aufnahme von Radioaktivität in die Niere von Pretargeting mit MN14-MORF18-cMORF18-^99mTc ist fast zweifach so groß wie die Radioaktivitätsaufnahme in den Nieren von Pretargeting mit MN14-MORF15/cMORF15-^99mTc. Da die Aufnahme in den Tumor ebenfalls höher ist für Pretargeting mit dem 15mer, werden die Verhältnisse von tumorigem zu normalem Gewebe in allen Pretargeting-Fällen mit dem 15mer verbessert. Leichte Unterschiede in den MORF-Gruppen pro Antikörper (0,28 vs. 0,27) und verabreichten Dosierungen (14 μg vs. 13 μg) zwischen diesen zwei gleichzeitig durchgeführten Pretargeting-Studien sollte diese Beobachtungen nicht beeinflusst haben. Tabelle 6 Bioverteilung von radiomarkiertem cMORF15 oder cMORF18 nach 3 Stunden in tumortragenden Mäusen
Die Kontrolltiere erhielten nur ^99mTc-cMORF15, die mit dem 15mer vorher angesteuerten Tiere erhielten MN14-MORF15 gefolgt von ^99mTc-cMORF15, die mit dem 18mer vorher angesteuerten Tiere erhielten MN14-MORF15 gefolgt von ^99mTc-cMORF18 ((ID%/organ, n = 4)
Bildgebende Studien von LS174T-tumortragenden nackten Mäusen
8 zeigt beispielhaft Abbildungen des ganzen Körpers erhalten nach sowohl einer tumortragenden Maus, vorher angesteuert (pretargeted) mit MN14-MORF15 und einer tumortragenden Maus, vorher angesteuert mit MN14-MORF18 3 Stunden nach Injektion von ^99mTc-cMORF15 bzw. ^99mTc-cMORF18. Sowohl die Tiere als auch die Kontrolle wurden gleichzeitig abgebildet. Die geringeren Radioaktivitätsniveaus in der Niere zeigen eine deutliche Verbesserung der Bilder im Falle von dem Tier, das zuvor mit cMORF15-^99mTc angesteuert wurde (pretargeted) im Vergleich zu dem Tier, das vorher mit cMORF18-^99mTc angesteuert wurde.

Claims

Ein Kit zum in vivo Ansteuern eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels auf einen Zielort umfassend: (a) ein erstes Konjugat umfassend eine Ansteuerungseinheit und ein Morpholino-Oligomer, wobei die Ansteuerungseinheit selektiv an eine primäre, zielspezifische Bindungsstelle des Zielortes oder an eine vom Zielort gebildete oder mit dem Zielort assoziierte Substanz bindet; (b) gegebenenfalls ein Aufreinigungsmittel; und (c) ein zweites Konjugat umfassend ein komplementäres Morpholino-Oligomer und ein diagnostisches Mittel oder therapeutisches Mittel.
Kit nach Anspruch 1, wobei die Ansteuerungseinheit einen humanisierten Antikörper oder ein antigen-bindendes Fragment eines humanisierten Antikörpers umfasst.
Kit nach Anspruch 2, wobei der humanisierte Antikörper ein antikarcinoembryonischer Antigen-Antikörper (CEA) ist.
Kit nach Anspruch 1, wobei die Ansteuerungseinheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, kleinen Peptiden, Polypeptiden, Enzymen, Hormonen, Steroiden, Cytokinen, Neurotransmittern, Oligomeren, Vitaminen und rezeptorbindenden Molekülen.
Kit nach Anspruch 1, wobei die Länge des Morpholino-Oligomers und/oder des komplementären Morpholino-Oligomers mindestens etwa 6 Basen bis etwa 100 Basen ist.
Kit nach Anspruch 1, wobei das Morpholino-Oligomer und/oder das komplementäre Morpholino-Oligomer ein 15-mer, 18-mer oder 25-mer ist.
Kit nach Anspruch 1, wobei das Aufreinigungsmittel ein anti-idiotypischer Antikörper oder ein antigenbindendes Antikörperfragment ist.
Kit nach Anspruch 1, wobei das therapeutische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antikörperfragmenten, Wirkstoffen, Toxinen, Nukleasen, Hormonen, Immunomodulatoren, Radiometallchelaten, Borverbindungen, photoaktiven Mitteln oder Farbstoffen und Radionukliden.
Kit nach Anspruch 8, wobei (a) das Radionuklid im Wesentlichen durch Betateilchenemission zerfällt und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus P-32, P-33, Sc-47, Fe-59, Cu-64, Cu-67, Se-75, As-77, Sr-89, Y-90, Mo-99, Rh-105, Pd-109, Ag-111, I-125, I-131, Pr-142, Pr-143, Pm-149, Sm-153, Tb-161, Ho-166, Er-169, Lu-177, Re-186, Re-188, Re-189, Ir-194, Au-198, Au-199, Pb-211, Pb-212 und Bi-213; oder (b) das Radionuklid im Wesentlichen durch Augerteilchenmission zerfällt und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111, Sb-119, I-125, Ho-161, Os-189m und Ir-192; oder (c) das Radionuklid im Wesentlichen durch Alphateilchenemission zerfällt und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213 und Fm-255.
Kit nach Anspruch 1, wobei das therapeutische Mittel in der photodynamischen Therapie oder in Neutronen-Einfangreaktionsverfahren verwendet wird.
Kit nach Anspruch 10, wobei die photodynamische Therapie Metallkomplexe verwendet und die Metallkomplexe ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Zink-, Aluminium-, Gallium-, Lutetium- und Palladiumkomplexen.
Kit nach Anspruch 10, wobei die Neutronen-Einfangreaktionsverfahren ein Radionuklid verwenden, dass ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus B-10, Gd-157 und U-235.
Kit nach Anspruch 1, wobei das diagnostische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Radionukliden, Farbstoffen, Kontrastmitteln, fluoreszierenden Verbindungen oder Molekülen und verstärkenden Mitteln verwendbar in magnetischem Resonanz-Abbilden (MRI).
Kit nach Anspruch 13, wobei das diagnostische Mittel (a) ein radioaktives Nuklid ist, dass in Positronenemission verwendbar ist, und das Radionuklid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus F-18, Mn-51, Mn-52m, Fe-52, Co-55, Cu-62, Cu-64, Ga-68, As-72, Br-75, Br-76, Rb-82m, Sr-83, Y-86, Zr-89, Tc-94m, In-110, I-120 und I-124; oder (b) ein Metallion ist, dass in magnetischen Resonanzabbildungstechniken verwendbar ist, und wobei das Metallion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gadolinium-, Mangan-, Eisen-, Chrom-, Kupfer-, Kobalt-, Nickel-, Dysprosium-, Rhenium-, Europium-, Terbium-, Holmium- und Neodynium-Ionen; oder (c) ein radioaktives Nuklid ist, dass in Gammastrahlendetektion verwendbar ist, und wobei das radioaktive Nuklid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cr-51, Co-57, Co-58, Fe-59, Cu-67, Ga-67, Se-75, Ru-97, Tc-99m, In-111, In-114m, I-123, I-125, I-131, Yb-169, Hg-197 und Tl-201.
Verwendung von: (a) einem ersten Konjugat umfassend eine Ansteuerungseinheit und ein Morpholino-Oligomer, wobei besagte Ansteuerungseinheit selektiv an eine primäre zielspezifische Bindungsstelle eines Zielortes von einem Säuger oder an eine Substanz gebildet von oder assoziiert mit besagtem Zielort bindet; (b) gegebenenfalls einem Aufreinigungsmittel; und (c) einem zweiten Konjugat umfassend ein komplementäres Morpholino-Oligomer und ein diagnostisches Mittel oder therapeutisches Mittel, bei der Herstellung eines Medikaments zur Anwendung in einer in vivo zielgerichteten Methode zum Transportieren eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels zu besagtem Zielort.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Medikament geeignet ist für intravenöse, intraarterielle, intrapleurale, intraperitoneale, intrathecale, subkutane Verabreichung oder Verabreichung durch Perfusion.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei der Zielort ein Tumor oder eine andere Schädigung, ein infektiöser Krankheitsort, ein entzündlicher Krankheitsort, oder ein autoimmuner Krankheitsort ist.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Medikament in einer Form geeignet für Verabreichung in Verbindung mit Endoskopie, Laparoskopie, normalen Organabbildungen oder mit einer intraoperativen Probe ist.
Kit nach Anspruch 3, wobei der antikarcinoembryonische Antigen-Antikörper ein anti-MN14-Antikörper ist.