JPH0734014B2 - コラーゲナーゼを定量的に測定するための方法 - Google Patents

コラーゲナーゼを定量的に測定するための方法

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JPH0734014B2
JPH0734014B2 JP3504853A JP50485391A JPH0734014B2 JP H0734014 B2 JPH0734014 B2 JP H0734014B2 JP 3504853 A JP3504853 A JP 3504853A JP 50485391 A JP50485391 A JP 50485391A JP H0734014 B2 JPH0734014 B2 JP H0734014B2
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collagenase
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、侵入プロセスに含まれ、そして腫瘍細胞の転
移に関連するタンパク質分解酵素であるIV型コラーゲナ
ーゼの改良された定量方法を提供する。
発明の背景 固相イムノアッセイ、例えば酵素結合イムノソルベント
アッセイ(エリザ)は1971年の最初の記載(Engvall an
d Perlman,1971;Van Weeman and Schurrs,1971)以来免
疫学的研究に広く使用されてきた。様々なタイプのアッ
セイ法が記載されているが、その全てが抗原または抗体
の固定化を必要とする。通常、ペプチドまたはタンパク
質抗原および抗体と種々のプラスチック、例えばポリス
チレンまたはポリ塩化ビニルとの強い相互作用が固相へ
の固定の基礎を形成する(Leininger等,1966;Catt and
Treager,1967)。エリザにおけるコーティングは、普通
pH9−10の炭酸ナトリウム緩衝液を用いることにより、
希釈抗原または抗体と上記プラスチック表面との接触に
より通常行われる(Hudson and Hay,1980)。
発明の要約 ゼラチンおよびIV型コラーゲンを分解し得る中性メタロ
プロテイナーゼ酵素を捕獲するための固相として天然プ
ロテアーゼ基質が今開示されている。その方法はメタロ
プロテイナーゼ基質が当該酵素を捕獲するため使用され
ている標準的な捕獲アッセイ技術の変法である。
この変形サンドイッチアッセイ(図1)において、ゼラ
チンは固体基質に結合され、そしてプレートは次いで洗
浄されてもよい。当該の可溶性IV型コラーゲナーゼの推
定上の供給源の異なる量が導入される。プレートを次に
洗浄し、そして結合された酵素の量をIV型コラーゲナー
ゼに対するアフィニティー精製化ウサギ抗ペプチド抗
体、次にヤギ抗ウサギパーオキシダーゼ複合体により決
定する。この方法はIV型コラーゲナーゼに対して特異的
であり、その他のマトリックスメタロプロテイナーゼ、
例えば間質コラーゲナーゼまたはストロメリシンとの交
差反応性を示さない。
IV型コラーゲナーゼはヒトおよび動物腫瘍モデルにおい
て転移性の表現型に密接に関連している。固相イムノア
ッセイにおけるこの酵素の検出は転移性疾病に対する患
者のスクリーニングにおいて貴重であろう。記載された
方法はヒト血清または尿試料中のIV型コラーゲナーゼの
存在の検出に使用され得る。開示された診断方法は、罹
患しやすいと考えられる特定の悪性腫瘍に対して高い危
険性のある個人の状態を評価するために使用され得る。
さらに、本明細書に教示された方法は悪性腫瘍の治療を
した、または治療を受けている患者の状態をモニターす
るために使用され得る。
基礎の分解は腫瘍侵入および転移における重要な段階で
ある(Liotta等,1986)。IV型コラゲーナーゼは侵入プ
ロセスに含まれる重要なタンパク質分解酵素である。こ
の酵素はヒトおよびネズミの腫瘍モデルにおいて腫瘍の
転移の可能性に密接に関連しており(Liotta等,1980;Bo
nfil等,1989)、そして増大して転移性発現型の遺伝的
誘導を伴う(Muschel等,1985;Garbisa等,1987)。
生物学基質におけるこの酵素の迅速な検出および定量は
IV型コラーゲナーゼと腫瘍組織の生物学的挙動の相関関
係のさらなる研究を可能にするであろう。
図面の簡単な説明 図1はIV型コラーゲナーゼ基質捕獲イムノアッセイに含
まれる段階の模式図である。最初にエリザプレートはゼ
ラチンで被覆され捕獲相を形成する。試料を次にウエル
中に導入し、そして酵素のゼラチンへの結合が起こる。
ウエルを次に洗浄して非結合物質を除去し、そしてアフ
ィニティー精製化抗IV型コラーゲナーゼペプチド抗体を
導入される。抗原抗体複合体の検出はヤギ抗ウサギ抗体
−西洋ワサビパーオキシダーゼ複合体を用いて行われ
る。
図2は抗ペプチド抗体を生成するために使用されたIV型
プロコラーゲナーゼのアミノ末端(ペプチド1−17)お
よび内部ドメイン(ペプチド472−490)ペプチドのアミ
ノ酸配列を示す。これらの配列は、間質プロコラーゲナ
ーゼ(中段)またはプロストロメリシン(下段)と比較
されているが、ほとんと相同性を示さない。
図3A,3Bおよび3Cは抗IV型コラゲナーゼペプチド抗体の
特徴づけを示す。
図3Aはアフィニティー精製化抗体A472−490の特徴づけ
を示す。エリザプレートウエルはペプチド472−490−BS
A複合体の示された量で被覆された。抗体希釈物は直接
エリザアッセイを用いて試験された。
図3Bはアフィニティー精製化抗体A1−17の特徴づけを示
す。エリザプレートウエルはペプチド1−17−BSA複合
体の示された量で被覆された。抗体希釈物は直接エリザ
アッセイを用いて試験された。
図3Cは競合エリザアッセイを示す。エリザプレートはウ
エルあたりペプチドBSA複合体20ngで被覆された。非複
合ペプチドの抗体結合性に競合する能力は、遊離ペプチ
ドの示された量で適当な抗体を予備保温することにより
試験された。ペプチド1−17およびペプチド472−490の
両方は、これらのアフィニティー精製化抗体が単一特異
性であることを示す完全な逆転を示した。ペプチド1−
17は抗体A472−490結合に対して競合する能力を示さな
かった。同様にペプチド472−490は抗体A1−17結合に対
する競合性を示さなかった。
図4Aおよび4Bはカルシウムイオンおよび温度のゼラチン
捕獲イムノアッセイへの影響を示す。
図4Aはカルシウムイオンの影響を示す。希釈物および洗
浄緩衝液中の5mMのカルシウムの包含は、抗原の供給源
として調製培地を用いた場合に発色の顕著な低下を生じ
た。低濃度のEDTA(10μM)の包含は抗原の検出をわず
かに改良した。より高濃度のEDTAは抗原検出をさらには
改良しなかった。
図4Bは温度の影響を示す。発色は、実験が25℃で行われ
た場合に得られた結果と比較されているように、実験が
4℃で行われた場合に高められた。
図5は基質捕獲イムアッセイの感度を示す。精製化IV型
コラーゲナーゼの連続2倍希釈は基質捕獲イムノアッセ
イ技術を用いて行われた。アッセイはウエルあたり50ng
未満(すなわち、0.3ng/μL)を検出することができ
た。
図7は再現性の評価を示す。調製培地の連続2倍希釈は
基質捕獲イムノアッセイ法で行われた。同一プレート上
で(アッセイ#1およびアッセイ#2)または異なる日
に(アッセイ#3)行われたアッセイにより比較した場
合に同一結果が調製培地試料に対して得られた。
図6は特異性の評価を示す。精製酵素試料の連続2倍希
釈は基質捕獲イムノアッセイ法で行われた。精製ヒト滑
液コラーゲナーゼ(□)および精製ヒトストロメリシン
(■)は試験された高濃度でさえも本アッセイにおいて
反応性を示さなかった。精製ヒトIV型コラーゲナーゼ
(◆)は濃度に依存した反応性を示した。
発明の詳細な説明 悪性腫瘍に罹患している患者の状態および進行の評価に
おいて、体液中のコラーゲナーゼを測定することが望ま
しい。本発明はコラーゲナーゼの定量手段を提供する。
本発明の方法では、非放射標識ゼラチンが結合されてい
る固体基質(または支持体)は、コラーケナーゼの異な
る量に暴露されるか、またはコラーゲナーゼを含むと予
想される試験試料に暴露される。当該のコラーゲナーゼ
に対する抗体は次に基質に適用される。抗体がコラーゲ
ナーゼに結合された後、基質を洗浄する。基質を次に、
当該コラーゲナーゼに結合されている抗体に抗体−パー
オキシダーゼ複合体の結合を引き起こす条件下で第1の
抗体に結合するであろう抗体−パーオキシダーゼ複合体
に暴露される。基質を再び洗浄し、そしてパーオキシダ
ーゼ発色試薬が導入される。既知量のコラーゲナーゼに
結合した基質が試験試料に暴露された基質と比較され
る。
本発明の方法に使用される抗体は天然のモノクローナル
抗体またはポリクローナル抗体のいずれであってもよ
い。抗体の選択は、ゼラチンに結合している間の天然配
置にある当該コラーゲナーゼを抗体が認識する必要性に
よってだけ制限されている。パーオキシダーゼ−抗体複
合体はまた、ポリクローナルであってもモノクローナル
であってもよいが、抗コラーゲナーゼ抗体に対して検出
されなければならない。また、第1の抗体はパーオキシ
ダーゼまたはその他の検出系、例えばアルカリホスファ
ターゼまたは放射性ヨウ素に直接結合され得、その結果
第2の抗体の必要性を解消する。
その他のエリザ試験は公知であるが、本明細書に記載さ
れているようにそれに結合されたゼラチンを有する基質
の使用は試験の改良された感度および特異性を提供す
る。
材料および方法 材料:イムロン(Immulon)TM2平底96ウエル微量滴定プ
レートはダイナテック・ラボラトーリズ社から得られ
た。登録商標エリザメート(BLISAmate)キットシステ
ム(パーオキシダーゼ複合体のためのマイクロウエルエ
リザメート)はカーケガード・アンド・ペリー・ラボラ
トリーズ社から購入され、パーオキシダーゼ標識ヤギ抗
ウサギIgG((H&L,吸着されたヒト血清)が使用され
た。
ゼラチンおよび抗原希釈緩衝液と最初の2回の洗浄のた
めの洗浄緩衝液は10μMはEDTAを含むか、または含まな
い0.05MトリスHCl,0.2M NaCl,pH7.6からなる(TSE緩衝
液)。残りの洗浄液および抗体希釈液はエリザメートキ
ットに入っていた。微量滴定プレートは405nmで登録商
標タイターテック・マルチスキャン・プレート・リーダ
ー(Titertek Multiscan plate reader)でスキャンさ
れた。
抗原供給源: 調製組織培養培地はヒトA2058メラノーマ細胞培養体か
ら得られた。これらの栽培をDMEM中ウシ胎児血清と80%
周密まで増殖させた。次に培地を捨て、そして無血清DM
EMに置き換えた。この培地を24時間後に集めた。登録商
標ソルバール(Sorvall)RT6000中4℃で10分3600rpmで
遠心分離した。上澄みを0.45μフィルターで濾過し、そ
してYM30メンブラン(アミコン)を用いて限外濾過によ
り10倍まで濃縮した。
IV型プロコラーゲナーゼをヒトA2058メラノーマ細胞調
製培地から、ゼラチンアフィニティークロマトグラフィ
ーにより、Stetler−Stevenson等(1989)により記載さ
れたように精製した。精製した酵素を使用するまで−70
℃で貯蔵した。ヒトリュウマチ滑液繊維芽コラーゲナー
ゼおよびストロメリシンの試料はカンザス医学センター
大学のH.Nagase博士により提供された。
合成ペプチド: 免疫感作に用いられた合成ペプチドはtBOCアミノ酸方法
論を用いてバイオサーチ9600ペプチドシンセンサイザー
で製造された。
抗体供給源: 抗体はウシ血清アルブミンにグルタルアルデヒド(0.14
%)で結合された合成ペプチドを用いてニュージーラン
ド白色ウサギ中で増殖させた。最初の2回の免疫感作の
ために、非複合ペプチド0.2mM当量を含むウシ血清アル
ブミン−ペプチド複合体1mlをフロイントの完全アジュ
バント1mlと混合し、そして皮下注射の前に乳化した。
残りの2週間毎の免疫感作のために、ウシ血清アルブミ
ン−ペプチド複合体0.5mlを注射前にフロイントの完全
アジュバント0.5mlと乳化した。
ペプチドアフィニティーカラムの調製および抗ペプチド
抗体のアフィニティー精製: ペプチドアフィニティー樹脂はアフィーゲル10(AffI−
gEL10)(バイオラッド)を製造者の支持に従って用
い、そして各ペプチド2mgを用いて両方のペプチドに対
して調製された。これら樹脂は56℃で30分間ウサギ血清
の熱処理の後、該血清から抗体をアフィニティー精製す
るために使用された。抗体を一晩吸収させた後、カラム
は冷リン酸緩衝液20カラム容量で洗浄され、次いで2ベ
ッド容量の1M酢酸で溶離された。この溶離液は6M NaOH
の添加によりすぐに中和され、次にYM30メンブラン(ア
ミコン)を用いてダイアフロー緩衝液交換が行われた。
「基質捕獲」アッセイ: 水浴中で55℃まで温めることによりゼラチンをTSE緩衝
液中に溶解し、そして室温まで冷却した。この1%ゼラ
チン溶液300μLを微量滴定プレートのウエル中に分注
し、そして37℃で一晩保温した。プレートを逆さにする
ことによりウエルを空にし、そしてプレートを4℃まで
冷却した。ウエルをTSE緩衝液で2回洗浄し、そして抗
原(酵素)溶液150μLを各ウエルに添加した。連続希
釈はTSE緩衝液で行われた。抗原溶液を基質コーティン
グと4℃で1時間平衡化した。次に逆さにすることによ
りウエルを空にし、そしてTSE緩衝液で2回洗浄した。
抗プペチド抗体溶液150μLを次に添加した。抗体希釈
物はエリザメートキットからの希釈剤/ブロッキング溶
液を用いて作成された。最初に抗体を4℃で3時間保温
した。プレートを次に洗浄溶液で2回洗浄した。ヤギ抗
ウサギ−パーオキシダー複合体0.5μg/mL溶液150μLを
添加し、そして4℃で3時間保温した。プレートを2回
洗浄し、最後に洗浄溶液中に5分間浸漬した。次にプレ
ートを空にし、そして発色試薬を添加した。発色は10分
間行われ、プレートをタイターテック・マルチスキャン
・リーダーより405nmでスキャンした。
結果 アフィニティー精製化抗ペプチド抗体はヒトメラノーマ
細胞IV型プロコラーゲナーゼのアミノ末端配列ならびに
カルボキシ末端の159残基から始まる内部ドメインのア
ミノ酸配列に対して調製された。これらのペプチド配列
は、それらが酵素の直接配列決定において得られ(Hohy
ta等,1988;Collier等,1988)、cDNAクローンからの予測
配列において確認され(Collier等,1988)、そして図2
に示されるように、その他の関連メタロプロテイナーゼ
との相同性を示さない領域から誘導されているので、選
択された。アフィニティー精製化抗体は直接エリザなら
びに競合実験を用いて特徴づけられた(図3A−3C)。抗
体はウシ血清または非関連ペプチドと交差反応性を示さ
なかった。
抗IV型プロコラーゲナーゼ抗体およびパーオキシダーゼ
標識複合抗体の最適濃度は酵素供給源おして濃縮メラノ
ーマ細胞調製培地を用いるチェッカーボード分析により
得られた。このデータから1/320の最適希釈がアフィニ
ティー精製化抗体A1−17に対して選択された。抗体A472
−490はこのアッセイ操作において顕著な発色を示さな
かった。この観察をイムノブロット実験において酵素を
検出するための前記抗体A472−490の能力と調和させる
試みにおいて、本発明者等はこの抗体のためのエピトー
プが天然の可溶性酵素配置で利用されないと結論づけ
た。複合抗体濃度は0.5μg/mLで最適であり、そしてこ
の濃度は残りの実験に対して使用された。
IV型コラーゲナーゼは、酵素活性にカルシウムイオンを
必要とする中性メタロプロテイナーゼ酵素である(Liot
ta等,1979;Liotta等,1981)。このアッセイにおいて基
質分解の可能な影響を調べるために、本発明者等はカル
シウムイオンを排除し、そして緩衝液中にこのおよびそ
の他の中性メタロプロテイナーゼの阻害剤であるEDTAを
包含する影響を試験した(図4A)。カルシウムイオンの
排除だけが、全体の発色により評価されるような酵素検
出において顕著な増加を示した。低濃度のEDTA(10μ
M)の包含は、カルシウムを排除しただけの緩衝液に比
べた場合、発色に僅かな増加を示した。温度の影響もま
た評価された。25℃で行われた場合に得られた結果と比
較されるとき、実験が4℃で行われた場合、光学濃度設
定値がより高く、酵素捕獲の効率がより高いことを示し
た(図4B)。
開発されたアッセイの感度は高度に精製されたIV型コラ
ーゲナーゼの試料を用いて試験された。高度に精製され
たIV型コラーゲナーゼの貯蔵溶液5mg/mLの連続希釈物は
基質捕獲法を用いてアッセイされた。図5に示された結
果は、この方法は試料容量が150μLまで制限されてい
る場合に0.3ng/μLに相当する精製IV型コラーゲナーゼ
50ngという少量を検出し得ることを示す。アッセイの特
異性は精製されたヒトリュウマチ滑液繊維芽コラーゲナ
ーゼおよびストロメリシンの試料を用いて試験された。
図6に示されるように、これらの酵素はこの系において
IV型コラーゲナーゼ抗体と交差反応しなかった。アッセ
イの再生性は酵素供給源として調整培地を用いて試験さ
れた(図7)。これらの試験は同一プレート上でのまた
はことなる日に異なるセットの希釈からの結果の比較を
可能にした。これらの結果は、アッセイが高感度である
だけでなく、高度に再現性のあることを示す。
本発明者等はIV型コラーゲナーゼの定量のための再現性
のある高感度アッセイを設計し、そして開発した。アッ
セイ原理は捕獲がこの酵素に対する別の基質、ゼラチン
を用いて行われることを除いて「サンドイッチ」型アッ
セイの原理と実質的に同一である。エリザプレートウエ
ルのゼラチンコーティングは溶液からIV型コラーゲナー
ゼの吸着を可能にする。固定化酵素は次にアフィニティ
ー精製化抗プペチド抗体およびヤギ抗ウサギ抗体−パー
オキシダーゼ複合体の添加により検出される。
この新規方法は抗原(酵素)を捕獲するためのプロテア
ーゼ基質を使用する。この方法は当該酵素ならびにその
他のゼラチン結合性タンパク質の特異的吸着を可能にす
る。これは混合物を単純化し、その中で、酵素が検出さ
れ、そして潜在的に基質を阻害する物質を除去し、それ
により固相上に直接抗原または抗体のコーティングを必
要とする通常のアッセイプロトコルに固有の困難さのい
くつかを排除する。
酵素検出はEDTAを添加して、または添加せずにカルシウ
ムイオンの不在下で高められる。メタロプロテイナーゼ
活性はカルシウムイオンの存在を必要とするので、これ
らの結果は、カルシウムイオンの不在下で見られた改良
された検出が基質(ゼラチン)分解の阻害に起因するこ
とを示唆する。基質分解は切断生成物を生じ、そして捕
獲された酵素はプレートから洗浄され、結果として発色
が消失される。この基質分解作用はまた、アッセイの温
度依存性の研究において観察される。すなわち、より低
い発色がより高いアッセイ温度で得られた。
カルシウムイオンに依存した酵素検出の低下の観察はさ
らに、IV型コラーゲナーゼのゼラチン結合性ドメインが
活性部位と異なり、前者がカルシウム非依存性であり、
そして後者がカルシウム依存性であることを示唆する。
この方法は調整培地中でIV型コラーゲナーゼを検出し
得、そして異なる細胞株により分泌される酵素のレベル
ならびに酵素分泌への種々の薬剤の影響を評価するため
に有用であろう。ヒト血清試料に対する予備的研究(デ
ータは示していない)はこのアッセイが悪性肺癌を有す
る幾人の患者からの試料中にIV型コラーゲナーゼを検出
し得ることを示した。このアッセイは、特定の癌のスク
リーニングならびに治療されている患者の臨床的追跡検
査に有用であること示し得る。
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Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】以下の段階: (1) 非放射標識ゼラチンが結合されている固体支持
    体を、IV型コラーゲナーゼを含むことが予想される体液
    試験試料に暴露し、 (2) 当該コラーゲナーゼに対する抗体に段階(1)
    の生成物を暴露し、 (3) 抗体−パーオキシダーゼ複合体の抗体が当該コ
    ラーゲナーゼに結合されている抗体と反応性であると知
    られている前記複合体に段階(2)の生成物を暴露し、 (4) 段階(3)の生成物をパーオキイダーゼ発色試
    薬に暴露し、そして (5) パーオキシダーゼ発色試薬に応答する発色を観
    察して支持体に結合された第2の抗体の量を決定する、 からなるIV型コラーゲナーゼの検出方法。
  2. 【請求項2】以下の段階: (1) 非放射標識ゼラチンを固体基質に結合し、 (2) 異なる量のIV型コラーゲナーゼまたは当該コラ
    ーゲナーゼを含むことが予想される試験試料に段階
    (1)の基質を暴露し、 (3) 抗原への抗体の結合を高める条件下で当該コラ
    ーゲナーゼに対する公知抗体に段階(2)の生成物を暴
    露し、 (4) 当該コラーゲナーゼに対する抗体に結合するで
    あろう抗体−パーオキシダーゼ複合体に段階(3)の生
    成物を暴露し、 (5) 段階(4)からの生成物をパーオキシダーゼ発
    色試薬に暴露し、そして (6) 既知量の当該コラーゲナーゼを有する基質と試
    験試料における応答を比較する、 からなる体液中のIV型コラーゲナーゼを定量的に検出す
    る方法。
  3. 【請求項3】カルシウムイオンの不在下で行われる請求
    項2記載の方法。
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