JP3486413B2 - 前立腺特異抗原の免疫検定法 - Google Patents

前立腺特異抗原の免疫検定法

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、癌免疫検定法の分野に関する。より詳細に
は、前立腺特異抗原（PSA）の新たな免疫検定法を提示
する。また、PSA用の免疫検定法においてキャリブレー
タまたは対照として使用できる、PSAとα１−抗キモト
リプシン（ACT）との複合体に似た、PSA−抗PSA複合体
も提示する。さらに、PSAに対するポリクロナール抗体
を、PSAがACTに結合することでマスクされるエピトープ
と結合するものおよびこのようなエピトープと結合しな
いものに分別する方法を提示する。
発明の背景 前立腺特異抗原（PSA）については、M.C.WangらがInv
est Urol.17巻159頁（1979年）で最初に記述した。こ
れは前立腺上皮の分泌物であり、前立腺癌細胞によって
も産生される。PSAは、プロテアーゼ活性を有する分子
量33,000〜34,000ダルトンの糖蛋白モノマーであると解
析されている（M.C.Wangらによる前掲文献およびY.Ban
らによるBiochem Biophys Res Commun.123巻482頁
（1984年））。最近では、同抗原のアミノ酸配列が報告
され（W.K.WattらによるProc Natl Acad Sci USA,8
3巻3166頁（1986年））、PSAの遺伝子がクローンされて
いる（A.LundwallによるBiochem Biophys Res Commu
n.161巻1151頁（1989年））。栗山らによる酵素免疫検
定法の開発によって、悪性および良性の前立腺疾患患者
ならびに正常男性のかなりの部分の血中で、低濃度のPS
Aを検出することが可能になった（栗山らによるCancer
Res.40巻4658頁（1980年））。
PSA試験は、前立腺癌の手術または薬物による治療後
の患者で、悪性疾患または良性疾患を検出するのに大い
に役立ちうる（P.H.LangeらによるUrolgy,33巻（補遺
６）13頁（1989年６月）;C.S.KillianらによるCancer
Res.45巻886頁（1985年））。治療してもPSAの上昇が続
く場合、あるいは治療後のPSAベースラインが上昇する
のであれば、疾患の再発または残留を示している（M.K.
BrawerらによるUrology,33巻（補遺５）11頁（1989＝年
５月）;J.K.SiddalらによるEur Urol.12巻１号３頁（1
986年）;T.A.StameyらによるＮ Engl Ｊ Med.317巻9
09頁（1987年）;P.H.LangeらによるＪ Urol.141巻873
頁（1989年）;T.A.StameyらによるＪ Urol.141巻1076
頁（1989年）;T.A.StameyらによるＪ Urol.141巻1084
頁（1989年）;T.A.StameyらによるＪ Urol.141巻1088
頁（1989年）;D.W.ChanらによるClin Chem.33巻1916頁
（1987年））。
PSA検査単独では、一般集団におけるスクリーニング
手順としても疾患の段階決定の指針としても推奨できな
い。その代わり、前立腺癌患者の管理における補助的検
査としては広く受け入れられている（栗山らによるＪ
Natl Cancer Inst.68巻99頁（1982年）;T.A.Stameyら
によるＮ Engl Ｊ Med.317巻909頁（1987年）;P.H.L
angeらによるＪ Urol.141巻873頁（1989年）;T.A.Stam
eyらによるＪ Urol.141巻1076頁（1989年）;T.A.Stame
yらによるＪ Urol.141巻1084頁（1989年）;T.A.Stamey
らによるＪ Urol.141巻1088頁（1989年）;D.W.Chanら
によるClin Chem.33巻1916頁（1987年）;J.E.Oesterli
ngらによるＪ Urol.139巻766頁（1988年））。
血清PSA濃度の測定は、現在では前立腺癌患者の診断
に広く使用されているが、血清PSA濃度の上昇は良性前
立腺肥大症でも前立腺の外科的外傷に派生しても報告さ
れている（DuffyによるAnn Clin Biochem（1989年）;
BrawerらによるUrology Suppl（1989年））。
1992年２月６日に公開されたH.LiljaらによるPCT特許
出願WO 92/01936号「遊離および複合前立腺特異抗原
（PSA）のアッセイ」では、遊離PSAならびにプロテイナ
ーゼインヒビター複合体としてのPSAの免疫検定法を開
示している。遊離PSAおよびPSA複合体は、２種類以上の
モノクロナール抗体を採用した非競合的免疫検定法によ
り測定する。この発明はさらに、問題のPSAプロテアー
ゼインヒビター複合体がα１−抗キモトリプシン（AC
T）、α１−プロテアーゼインヒビター（API）またはα
２−マクログロブリンのいずれかで形成されることを特
徴とする。さらに、この発明は、遊離PSA、PSAプロテイ
ナーゼインヒビター複合体およびその両者の総PSAに対
する比を、前立腺癌患者の診断に応用することを特徴と
する。
同特許出願では、３種類のモノクローナル抗体（以
下、「MAB」という）を開示している。ACTとPSAとの複
合体（以下、「PSA−ACT複合体という）および遊離PSA
は、MAB 2E9および2H11とされた。MAB 5A10は遊離PSA
を認識するが、PSA−ACT複合体を認識しない。MAB 2E9
は、免疫ブロット上の遊離PSAおよびPSA−ACT複合体を
容易に識別した唯一の抗PSA MABである。抗PSA MAB
2E9、2H11または5A10のいずれも、互いに結合して固相
結合PSAになるのを有意に阻止しなかった。
ヒト血清の非競合的免疫検定法において様々なMABを
組み合わせて使用することで、遊離PSAおよびPSA−ACT
複合体の双方を測定することにより臨床的特異度が上昇
すること、また遊離PSA/総PSA比および遊離PSA/PSA−AC
T複合体比が良性前立腺肥大症患者と前立腺癌患者とで
は有意に異なることを同出願は明らかにした。
遊離PSAに特異なMABおよびPSA−ACT複合体に反応する
MABは、たとえばCanAg Diagnostics AB（スウェーデ
ン イェテボリ）などから市販されている。自社MABを
様々な組み合わせで使用した場合の阻害試験および容量
反応関係を分析したCanAg Diagnostics ABは、PSA分
子上に少なくとも９種類の主要抗原決定基があることに
気づいた。そのMAB決定エピトープの１つの基は、複合
体化していないPSAおよびPSA−ACT複合体の双方上で曝
露され、またそのMAB決定エピトープのもう１つの基は
遊離PSAでのみ曝露された（CanAg Diagnostics AB、N
ilssonらによる「PSAのエピトープマッピング、およびP
SAの様々なイソ型決定のための分析法の開発」、および
同表題の要約、要約P38、J.Tumor Marker Oncology、
第10回ヒト腫瘍マーカー国際会議、1993年９月８〜11
日、於ドイツ、ボン）。
PSAの競合的放射免疫検定法は市販されている（たと
えば、Yang Laboratories,Inc.（ワシントン州ベルビ
ュー）のPROS−CHECK PSA）。PROS−CHECK PSAは、PS
Aに対するポリクロナールウサギ抗体、ならびに125I標
識したPSAを使用する。現在は、２種類のPSA非競合的サ
ンドイッチ免疫検定法が上市されている。その１種類
は、PSAに特異な２セットのMABを使用するもので、
（１）１セットのMAB（「捕捉抗体」）は固相に結合し
てサンプル中のPSAを捕捉し、（２）もう１セットのMAB
（「プローブ抗体」）は標識されて遊離溶液の形にあっ
て、捕捉されたPSAと結合してこれを検出する。これら
の検定法は、本書では「MONO検定法」と呼ばれる。一般
に、これらのMABのPSAとの結合は、ACTがPSAに結合して
も妨げられない。すなわち、一般にこれらのMABは遊離P
SAともPSA−ACT複合体とも結合できるわけである。この
ような検定法の例としては、Hybritech Tamdem−Ｅお
よびTandem−Ｒ PSAアッセイ（Hybritech、カリフォル
ニア州ラホラ）がある。
第２タイプのサンドイッチ検定法では、固相ではPSA
に特異なMABを、またプローブ抗体としてPSAに対するポ
リクロナール抗体を使用する。一般にこれらの検定法で
は、MABは遊離PSAとPSA−ACT複合体の双方と結合するこ
とができる。これに対してポリクロナール抗体のプール
には、遊離PSAおよびPSA−ACT複合体の双方と結合でき
る抗体、ならびに遊離PSAとは結合するがPSA−ACT複合
体とは結合できない抗体が入っている。後者の場合、こ
れらの抗体が結合したエピトープは、ACTがPSAに結合す
ると阻止される。この種の検定法の例としては、Abbott
IMx PSA Assay（本出願人）およびACSTM PSA ass
ay（Ciba−Corning Diagnostics Corporation、マサ
チューセッツ州イーストワルポール）がある。
第２の種類のサンドイッチ検定法はPSA−ACT複合体よ
りも遊離PSAのほうを優先的に検出することがわかって
いる（ここではこの現象を「バイアス」と呼ぶ）。他
方、一部のMONO検定法にはそのようなバイアスはない。
B.BluesteinらによるJ.Tumor Marker Oncology,7巻４
号41頁（1992年）を参照。
良性前立腺肥大症（BPH）患者の血清中にはPSA−ACT
複合体よりも遊離PSAのほうが多くあることがわかって
いる。他方、前立腺癌患者の血清中では遊離PSAよりもP
SA−ACT複合体のほうが多い。（H.LiljaらによるClin.C
hem.37巻1618頁（1991年）;U.StenmanらによるCancer
Res.51巻222頁（1991年）;H.LiljaらによるCancer Sup
pl.70巻230頁（1992年）;A.ChristenssonらによるJ.Uro
logy,150巻100頁（1993年））。
発明の要約 本発明は１つの態様として、サンプル中のPSAを検出
して定量するための新しいMOLY検定法およびMONO検定法
を提示する。これらの方法では遊離PSAとは結合するがP
SAとACTの複合体（「PSA−ACT複合体」）とは結合しな
いHEPSA抗体でサンプルを処理する。検定法にHEPSA抗体
を加えることで、これらの検定法におけるバイアスが減
るかもしくは排除される。これらの検定法を実施するた
めのキットも提示する。
本発明のもう１つの態様として、PSAとHEPSA抗体の複
合体（「PSA−HEPSA抗体複合体」）を提示するが、これ
はPSA−ACT複合体に似ている。この複合体は、PSA免疫
検定法のキャリブレーターまたは対照あるいはその両者
として有用である。
本発明のさらに別の態様として、ポリクロナール抗体
をPSAに分別して、PSAとACTの結合によってマスクされ
るエピトープ（「隠れるエピトープ」）を結合する抗
体、およびこのようなエピトープと結合しない抗体を含
有する分画を得る方法を提示する。同様に、このような
分別に有用なアフィニティーカラムも提示する。
本発明の上記の態様は一般に遊離状態または結合分子
と複合体を形成した状態で存在することのできるあらゆ
る被検体に適用できる。
図面の簡単な説明 図１は、PSA検定のための従来の方法（パートＡ）と
本発明の方法（パートＢ）を比較し、HEPSA抗体によっ
て遊離PSAおよびPSA−ACT複合体に対する検定法の特異
度が改変されたことを示している。
図２は、PSA上の隠れるエピトープと隠れないエピト
ープに対するポリクロナール抗体を獲得する方法を示し
ている。
発明の詳細な説明 ここでいう「抗体」とは、ポリクロナール抗体および
モノクロナール抗体、免疫グロブリン全長ならびに免疫
グロブリンの抗原結合フラグメントを含む。これらのフ
ラグメントの例としては、Fab、Ｆ（ab'2）およびFvが
ある。このようなフラグメントは、当該技術分野で既知
の方法により作製できる。
ここでいう「HE抗体」または「αHE」とは、標的抗原
（「被検体」）との結合が当該被検体に別の分子（「結
合分子」）が結合することで妨げられるような抗体のこ
とである。「非HE抗体」または「αnHE抗体」とは、被
検体への結合が当該被検体と結合分子が結合することで
妨げられない抗体のことをいう。被検体に結合分子が結
合することでマスクされる被検体上のエピトープのこと
を「隠れるエピトープ」（「HE」）という。同様に、被
検体に結合分子が結合することでマスクされない被検体
上のエピトープのことを「隠れないエピトープ」（「nH
E」）という。「α被検体」または「αＡ」とは、αHE
であれαnHEであれ、被検体に対する固体のことをい
う。
被検体は生体サンプルで見られる抗原であることが好
ましく、また当該サンプルに内在性のものであることが
好ましい。結合分子は当該サンプルに内在性のものであ
ることが好ましく、またしばしば被検体を伴う。結合分
子および被検体は蛋白であることが望ましい。被検体の
例としては血清プロテアーゼが、その結合分子としては
血清プロテアーゼインヒビターが挙げられる。血清プロ
テアーゼおよびそのインヒビター（括弧内）としては、
たとえばプロテインＣ（プロテインＣインヒビター）、
エラスターゼ（抗トリプシン）、カテプシンＧ（AC
T）、PSA（ACT）、PSA（α２−マクログロブリン）、ト
ロンビン（抗トロンビンIII）、C1−エステラーゼ（C1
−インヒビター）、ｔ−PA（PA I−１）、uPA（PA I−
１）、プラスミン（α２−抗プラスミン）、PSA（α１
−プロテアーゼインヒビター）、およびPSA（プロテイ
ンＣインヒビター）がある。「PA I−１」とは、プラス
ノーゲン活性化因子インヒビター１型のことである。
「ｔ−PA」とは、組織プラスミノーゲン活性化因子のこ
とである。「uPA」とは、尿中プラスミノーゲン活性化
因子のことである。当業者であれば、結合分子は血清プ
ロテアーゼでもよく、被検体は血清プロテアーゼインヒ
ビターでもよいことがわかるだろう。
「MOLY検定法」とは、捕捉抗体がMABで、プローブ抗
体がポリクロナール抗体である、あるいはその逆である
ような免疫検定法のことをいう。
本発明は、試験サンプル中にある被検体の免疫検定法
を開示する。サンプルは、一般的には生体サンプルであ
る。生体サンプルとしては、血液、血清、前立腺液、精
液、尿、リンパ液、髄液がある。
サンプルに結合分子と結合しない被検体（これら未結
合の被検体を、ここでは「遊離被検体」ともいう）およ
び結合分子と複合体を形成する被検体（「複合形成被検
体」または「被検体−結合分子複合体」）を含有する場
合には、被検体用のMOLY検定法および一部のMONO検定法
はバイアスを呈し、複合体形成被検体のないサンプルで
は複合体形成被検体のあるサンプルよりも読み取り度が
高くなる。たとえば被検体検出に使用したポリクローナ
ル抗体の一部が遊離被検体とは結合できるが複合体形成
被検体とは結合できない場合に、このようなことが生じ
うる。
本発明者は、反応混合液に遊離HE抗体を加えることで
被検体用のMOLY検定法および一部のMONO検定法で見られ
るバイアスを是正できるのを発見した。遊離HE抗体を加
えることを除いては、特定被検体用のMOLY検定法および
MONO検定法は、この種の検定法の技術分野で既知の方法
に従って実施することができる。さらに、サンプル中の
被検体がサンプルを固相とインキュベートしたときに固
相に直接結合できるのであれば、捕捉抗体は必要ない。
プローブ抗体および捕捉抗体は、当該分野で既知の方法
に従って作製することができる。プローブ抗体は、当該
技術分野で既知の方法を使って、化学発光標識、蛍光標
識、酵素および放射標識などで標識することができ、採
用した標識に応じて検定法を設定する。発光標識した免
疫測定法の例は、W.G.WoodらによるEur.J.Clin.Chem.Cl
in.Biochem.29巻787頁（1991年）に載っている。HE抗体
および非HE抗体は、既知の方法、たとえば以下に述べる
HEPSA抗体および非HEPSA抗体の作製に使用する方法を使
って作製できる。HE抗体は、以下に述べるようにモノク
ロナール抗体もしくは特異的ポリクロナールHE抗体であ
ることが望ましい。
そこで本発明の１つの態様として、生体サンプル中の
被検体のためのサンドイッチ非競合的免疫検定法を提示
する。捕捉抗体（「αnHE」）は、当該被検体の隠れな
いエピトープに向けられたもので、固相に付着して、生
体サンプル中に存在するかもしれない被検体を捕捉す
る。生体サンプルを加えながら、あるいは加えた後、捕
捉抗体をHE抗体（「αHE」）とインキュベートする。あ
るいは、αHEを捕捉抗体に曝露する前にサンプルとイン
キュベートしてもよい。αHEはMABであることが望まし
い。十分な時間インキュベートして、｛（αnHE）（被
検体）（αHE）｝の複合体が形成されるようにする。次
いで、固相に結合していなかった試薬を反応混合液から
すべて取り除く。これには、当該技術分野で既知の洗浄
手段によって行う。たとえば、未結合試薬を水性媒体に
溶解して固相から洗い流し、固相には｛（αnHE）（被
検体）（αHE）｝複合体だけを残す。
次いで、ポリクロナール抗被検体抗体（「α被検
体＊」）を加える。α被検体＊は、できれば検出用に標
識したもの、たとえば酵素標識、放射標識、蛍光標識ま
たは化学発光標識したものが好ましい。
反応混合液を十分な時間インキュベートして、｛（α
nHE）（被検体）（αHE）（α被検体＊）｝複合体およ
び｛（αnHE）（被検体）（結合分子）（α被検
体＊）｝複合体を形成する。｛（αNHE）（被検体）
（αHE）（α被検体＊）｝複合体では、αHEとα被検体
＊の双方が複合体中の被検体に結合している点を注意す
ること。サンプル中に結合分子が存在するならば、別の
複合体、すなわち｛（αnHE）（被検体）（結合分子）
（α被検体＊）｝の複合体も形成されることがある。
次いで、未結合試薬を分離する。標識したα被検体＊
を検出して、固相上に｛（αnHE）（被検体）（αHE）
（α被検体＊）｝および｛（αnHE）（被検体）（結合
分子）（α被検体＊）｝の複合体が形成されていること
を検出する。サンプル中に被検体が存在しなければ、こ
れらの複合体は生じない。これらの複合体の存在量は、
サンプル中の被検体濃度に正比例する。あるいは、残っ
ている未結合の標識α被検体＊の存在量を定量すれば、
この量はサンプル中に存在する被検体の量に反比例す
る。
上記の検定形式は、バイアスを呈するMONO検定法でも
使用することができる。MONO検定法では、α被検体＊を
標識したαnHE（すなわち「αnHE＊」）とするだけで、
それ以外は上記の方法をそのまま適用することができ
る。
捕捉抗体がポリクロナール抗体でプローブ抗体がMAB
の場合には、捕捉抗体をα被検体またはαnHEにし（αn
HEはたとえば以下に述べる分別方法でポリクロナール抗
体から分別することができる）、またプローブ抗体をα
nHE＊にする以外は上記の方法をそのまま適用できる。
捕捉抗体のα被検体にαHEのサブ集団が含まれる場合に
は、上記の検定手順によって得られる｛（αHE）（被検
体）（αHE＊）｝の追加複合体もある。
これまでに述べたことでは、被検体上に１つしかHEが
ないと仮定している。しかし、特定のαHEが被検体上の
全HEをマスクしない場合には、被検体上の他のHE部位に
向けた追加HE抗体を使用することになる。
当業者であれば、プローブ抗体が標識してある別の分
子によって特異的に結合されうるのであれば、プローブ
抗体は標識を要しないことがわかるだろう。さらに、被
検体を固相に直接結合できれば、捕捉抗体を使用する必
要はない。
本特許出願では、上記の検定法を実施するための検定
用キットも提示する。検定用キットには、未標識HE抗体
の入った容器、また当該被検体に対する捕捉抗体が入っ
ている別の容器があることが望ましく、これらの抗体は
非HEに対するものであることが好ましく、またMABであ
ればさらに好ましく、最も望ましいのは固相に結合した
ものである。未標識HE抗体は、捕捉抗体またはプローブ
抗体と同じ容器に入っていても別の容器に入れてもよ
い。MOLY検定法のためには、キットにはこの他に被検体
に対するプローブポリクロナール抗体で、できれば検出
用に標識されている抗体が入っている容器、ならびに抗
体上の標識と反応して信号を発生する試薬が入っている
容器がある。たとえば、ポリクロナール抗体はアルカリ
ホスファターゼなどの酵素で標識することができ、それ
と反応する試薬は酵素基質となる。アルカリホスファタ
ーゼの場合、４−メチルウンベリフェリリン酸（MUP）
が便利なことがわかっており、その反応については以下
の例IIで述べる。あるいは、プローブ抗体はモノクロナ
ール抗体で、捕捉抗体がポリクロナール抗体でもよい。
このような場合、モノクロナールプローブ抗体は非HE抗
体であるのが好ましい。MONO検定法のためには、プロー
ブ抗体および捕捉抗体は被検体に対するMABとする。プ
ローブMABおよび捕捉MABは非HE抗体であることが好まし
い。上記のキットでは、抗体は溶液、例えば緩衝液で、
免疫検定法の有害作用をもたらさないものに入っている
ことが好ましい。上記のキットには、さらにキャリブレ
ーターの入った容器（１ないし複数）または対照の入っ
た容器（１ないし複数）あるいはその両者を追加するこ
ともできる。被検体検定のためのキャリブレーターおよ
び対照には、以下に述べるように遊離被検体、被検体−
HE抗体の複合体、あるいは被検体−結合分子の複合体が
入っていることが望ましい。
発明の好ましい実施例では、被検体はPSAで、結合分
子はACTである。PSAに対するHE抗体は、遊離PSAとは結
合するがPSA−ACT複合体とは結合しない抗体である。こ
れらの抗体をここでは「HEPSA抗体」と呼ぶ。対応する
比HE抗体のことは「非HEPSA抗体」と呼ぶ。
HEPSA抗体（および非HEPSA抗体）を得る方法は、当該
技術分野で既知のものである。たとえば、H.Liljaらに
よる前掲のPCT特許出願WO 92/01936号、またCanAg Di
agnostics AB、Nilssonらによる「PSAのエピトープマ
ッピング、およびPSAの様々なイソ型決定のための分析
法の開発」、および同表題の要約（前掲）で述べられて
いる。HEPSA抗体の例としては、（１）WO 92/01936号
に記載のMAB 5A10、（２）K.Petterssonらによる「早
期前立腺癌と良性前立腺肥大症の判別を向上させるため
のPSAに関する免疫蛍光法の開発」（第15回臨床化学国
際会議、於オーストラリア メルボルン、1993年11月14
〜19日）に述べられているMAB 9B10（同論文ではMAB
H117およびH50についても述べている）、（３）CanAg
Diagnostics AB（スウェーデン イェーテボリ）から
市販されているMAB PSA6、PSA30、PSA17、PSA19、PSA2
0、およびPSA25がある。米国特許出願08/094,901号（19
93年７月22日出願）でM.MatikainenらはMAB 5A10およ
び9B10の双方と、これらの生産および特徴について開示
している。そこでは、これらのMABを分泌するハイブリ
ドーマはそれぞれ5A10E7F11H4および9B10A9H3と名付け
られている。これらのハイブリドーマは1993年３月12日
に公衆衛生研究部応用微生物学研究センターの欧州動物
細胞培養コレクション（ECACC）（Porton Down,Salisb
ury,Wiltshire SP4 0JG、英国）に寄託され、それぞ
れ93031201および93031202のECACC受託番号を付され
た。上記の出発物および特許出願をここで引用して本書
の一部ととする。
このように本発明では特にPSA検定法に有用な３つの
発明、すなわちHEPSA抗体を用いた新しいPSA検定法、特
異的ポリクロナールHEPSA抗体および隠れないエピトー
プ用の抗体の選択方法、ならびにPSA−ACT複合体に似て
いるPSA−HEPSA抗体複合体を提供する。最初の２つの発
明では、従来技術のMOLY検定法で見られるバイアスを回
避するかもしくは減らす。最後の発明はMONOおよびMOLY
の双方のPSA検定法のキャリブレーターまたは対照ある
いはその両者として有用である。第２の方法で選択した
特異的ポリクロナール非HEPSA抗体は、PSA用のMOLY免疫
検定法でも（プローブ抗体または捕捉抗体のいずれかと
して、あるいは両者として）、非競合的免疫検定法でも
（捕捉抗体として）利用できる。他方、HEPSA抗体は遊
離PSAに特異な検定法で使用することもできれば、先に
述べたようにバイアスをもたらしやすいPSA免疫検定法
（MOLYまたはMONOのいずれでも）でこのようなバイアス
を緩和または排除するために利用することができる。
本出願においては、PSA、ACTおよびHEPSA抗体と非HE
PSA抗体を使って本発明を説明する。ただし、当業者で
あれば、本発明をいかなる被検体、結合分子、およびHE
抗体と非HE抗体にも応用できることがわかるだろう。
I.新しいPSA免疫検定法 図１では、従来のPSA MOLY検定法（パートＡ）およ
び本発明のPSA MOLY検定法（パートＢ）を比較して、H
EPSA抗体が遊離PSAおよびPSA−ACT複合体に特異な検定
法をいかに改良するかを示している。
パートＡは、バイアスを生じやすい従来のMOLY検定法
を示している。パートＢに工程B1が追加される点を除け
ば、パートＡの手順とパートＢの手順は同じである。
パートＡの手順は次のとおりである。
工程A1:PSA分子上の隠れないエピトープ（nHE1と命
名）に特異な非HE抗体（αnHE1）を固相に結合させる。
遊離PSAまたはPSA−ACT複合体のいずれかを含有するサ
ンプルを固相に結合したαnHE1と反応させると、遊離PS
AおよびPSA−ACT複合体の双方が、nHE1エピトープを通
じて排他的に結合できる。他方、その後に他の抗体と反
応するために遊離PSA上でHEがいまだに利用できる。
工程A2:その後、HEに特異な標識抗体（αHE＊）およ
び非HE2に特異な抗体（αnHE2＊）の双方を含有する標
識したPSAに対するポリクロナール抗体（「標識ポリク
ロナール」）を追加すると、両方のタイプの抗体が遊離
PSAに結合する。それに対して、HEはPSA−ACT複合体中
のACTによってマスクされるので、同じ標識ポリクロナ
ールは隠れないエピトープnHE2とのみ結合できる。これ
らの標識ポリクロナールは、検出の目的で標識に接合さ
れている。標識の例としては、当該技術分野で既知の化
学発光標識、放射標識および酵素標識がある。この実施
例では、標識は酵素である。未結合の試薬を、例えば当
該技術分野で既知の方法を使って固相から洗い流すなど
して固相から取り除く。
工程A3:引続き固相に酵素基質を加えると酵素産物が
信号を発生するので、それをモニターする。２つの標識
ポリクロナールと結合している遊離PSAは、１つの標識
ポリクロナールとしか結合していないPSA−ACT複合体に
比べ信号を２倍発生し、このために遊離形式のPSAにつ
いてプラス方向のバイアス（数値のずれ）をもたらす。
パートＢは本発明の検定法を示したもので、パートＡ
で述べた検定法にさらに未標識HEPSA抗体を加えており
（工程B1）、それによって検定法にバイアスが生じなく
なっている。
パートＢの工程は次のとおりである。
工程B1:サンプルを未標識HEPSA抗体（αHE）で事前処
理する。この抗体は遊離PSA上のHEとは反応するが、PSA
−ACT複合体とは結合しない。あるいは、未標識αHEを
工程B2または工程B3で追加してもよい。
工程B2:パートＡのようにしてαnHE1抗体に結合した
固相にサンプルを加える。
工程B3:さらに、HEを認識する標識抗体（αHE＊）お
よび非HEを認識する抗体（αnHE2＊）を含有する標識ポ
リクロナールを加えると、遊離PSAおよびPSA−ACT複合
体の双方にαnHE2＊が結合する。αHE＊は遊離PSAともP
SA−ACT複合体とも結合できない。これは、HEが遊離PSA
中の未標識αHEで、またPSA−ACT複合体中のACTでそれ
ぞれマスクされているからである。
工程B4:基質を加え、信号をモニターする。遊離PSAお
よびPSA−ACT複合体のいずれもαnHE2＊としか結合して
いないので、双方が等しい信号を発生する。そのため、
検定でPSA−ACT複合体に比べて遊離PSAにバイアスが生
じることがない。
固相の材料は、免疫検定法に使用する材料であれば何
でもよい。天然材料、合成材料、天然材料を合成修飾し
たものが使える。たとえば、多糖類（たとえば紙、セル
ロース、セルロース誘導体［酢酸セルロースやニトロセ
ルロース］などのセルロース材料）、シリカ、ガラス繊
維、無機材料（不活性化アルミニウム、けい藻土、ある
いは塩化ビニル、塩化ビニル−プロピレン共重合体、塩
化ビニル−酢酸ビニル共重合体などの重合体でできた多
孔性高分子マトリックス中に均一に拡散した微粉砕した
他の無機材料、天然布地（たとえば木綿）および合成布
地（たとえばナイロン）、多孔性ゲル（シリカゲル、ア
ガロース、デキストラン、ゼラチン）、高分子フィルム
（たとえばポリアクリルアミド）、磁性粒子、微量定量
プレート、ポリスチレンチューブ、蛋白結合膜、アガロ
ース、セファデックス（Pharmacia Fine Chemicals,I
nc.、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）、Trisacr
yl（Pointet−Girard、フランス）、シリコン粒子、多
孔性繊維マトリックスなどである。固相は合成微粒子が
好ましく、直径0.1〜10ミクロンのポリスチレン、塩化
ビニルまたはラテックスでできた合成微粒子が望まし
い。
II.被検体に対するポリクロナール抗体の分別方法 本発明は、被検体に対するポリクロナール抗体を分別
してそれぞれHE抗体および非HE抗体を含有する分画をも
たらす方法も提示する。被検体に対するポリクロナール
抗体は、当該技術分野で既知の方法を使って産生でき
る。たとえば、ウサギ、ラット、ヤギ、マウス、等々の
宿主動物に被検体またはそのフラグメントを単独である
いは必要に応じて適当な担体に接合させて注入し、抗体
反応を引き起こして抗体を生み出すことができる。
この方法では、HE部位を結合分子またはHE抗体のいず
れかでマスクされた被検体（「マスクされた被検体」）
に対してポリクロナール抗体を曝露する。マスクされた
被検体と結合し、しかも溶出できる抗体は、遊離被検体
および被検体−結合分子の複合体の双方と結合する非HE
抗体である。したがって、遊離状態であるいは複合体の
形であっても、被検体を検出するための非HE抗体を使っ
た免疫検定法ではバイアスが生じない。こうして得られ
た非HE抗体は、MOLY免疫検定法でも（プローブ抗体また
は捕捉抗体、あるいはその両者として）、競合的免疫検
定法でも（捕捉抗体として）使用することができる。他
方、マスクされた被検体と結合しないポリクロナール抗
体はHE抗体である。HE抗体は、遊離被検体に特異な検定
法で使用するか、もしくは前述のようにバイアスの生じ
る被検体検定法（MOLY免疫検定法であれMONO免疫検定法
であれ）に加えてそのようなバイアスを緩和もしくは解
消するのに利用できる。
前述の分別は、アフィニティークロマトグラフィーを
利用して行うのが好ましい。マスクされた被検体は、結
合分子、HE抗体、または非抗体と架橋するのが好まし
い。架橋は、当該分野で既知の方法もしくは当業者であ
れば知っているその改良法により行うことができる。分
子の架橋の方法を開示している文献の例としては、T.H.
JiによるMethods in Enzymology91巻580頁（1983
年）;S.S.Wongらによる「Biocatalyst Design for S
tability and Specificity」（M.E.Himmel、G.Gerogi
ou編、American Chemical Society、ワシントンDC（1
993年））第22章266〜282頁;M.N.Guptaによる同書第26
章307〜326頁；「Chemical Reagent for protein M
odification」第２版（R.L.Lundblad、CRC Press、ボ
ストン）がある。これらの発表文献は、引用して本書の
一部とする。
こうして得られた複合体は、固相に直接結合するか、
もしくは固相上に固定化したHE抗体などの結合剤を利用
して固相に結合し、アフィニティークロマトグラフィー
で利用してHE抗体を選択するのが好ましい。アフィニテ
ィークロマトグラフィーの一般的方法、たとえば抗体お
よび固相の準備、およびその手順は、当該技術分野で既
知のものであり、たとえば、Bio−Rad Bulletin 1099「Immunoaffinity Chromatography with Affi
nity Supports」（1990年）;Pharmacia LKB Biotech
nology「Affinity Chromatography,Principles ＆ M
ethods」（1993年）；および「分子生物学の方法」第10
巻「Immunochemical Protocos」（M.M.Manson編）89〜
91頁（1992年）；「Immunochemistry in Practice」
のA.Johnstoneらによる第10章202〜232頁（Sietific P
ublications、オックスフォード、1982年）；および「C
urrent Opinion in Biotechnology）」第２巻「蛋白
分離用アフィニティークロマトグラフィー（Affinity
Chromatography for Protein Isolation）」のW.H.S
coutenによる37〜43頁（1991年）を参照されたい。これ
らの公表文献は本願中で引例とする。
図２に、例としてPSA、ACTおよびHEPSA抗体を使ってH
E抗体および非HE抗体にポリクロナール抗体を分別する
３種類の方法を示している。この方法は次のとおりであ
る。
パートA:ACTを使ったPSAとの結合 ACTを、臭化シアン活性化セファロース−4B（Pharmac
ia LKB Biotechnology、スウェーデンから市販）など
の固相に抱合させる。精製したPSAをACTと反応させて、
隠れるエピトープ（HE）をマスクするPSA−ACT複合体が
生成する。この複合体を化学的架橋によりさらに安定さ
せることもできる。PSAに対するポリクロナール抗体をP
SA−ACT−固相とインキュベートすると、HEPSA抗体は未
結合である。隠れていないエピトープに特異なHEPSA抗
体、たとえばnHE1およびnHE2は結合し、低pHなどの標準
的方法で溶出できる。こうして、ポリクロナール抗PSA
抗体がHEPSA抗体および非HEPSA抗体に分離される。
パートB:HEPSA抗体（αHE）を使ったPSAとの結合 HEPSA抗体（αHE）を、臭化シアン活性化セファロー
ス−4Bなどの固相に抱合させる。精製したPSAをαHEと
反応させて、隠れているエピトープ（HE）をマスクする
PSA−αHE複合体を生成する。この複合体を化学的架橋
によりさらに安定させることもできる。PSAに対するポ
リクロナール抗体をPSA−αHE−固相とインキュベート
すると、ポリクロナールHEPSA抗体は固体相に結合しな
い。他方、ポリクロナール非HEPSA抗体は結合し、低pH
などの標準的方法で溶出できる。特定のαHEがPSA上のH
Eすべてをマスクしない場合には、他のHE部位に向けた
追加のHE抗体を同時に、あるいは好ましくは順次分画カ
ラムで使用することができる点に注目されたい。
パートC:非HEPSA抗体（αnHE1）を使ったPSAとの結合と
その後のHEPSA抗体（αHE）を使ったHEのブロック 隠れていないエピトープ１（nHE1）に向けた非HEPSA
抗体（αnHE1）を、臭化シアン活性化セファロース−4B
などの固相に抱合させる。精製したPSAをαnHE1と反応
させて、PSA−αnHE1複合体を生成する。HEPSA抗体（α
HE）をPSA−αnHE1と反応させて、隠れているエピトー
プ（HE）をマスクする複合体を精製する。この複合体を
化学的架橋によりさらに安定させることもできる。PSA
に対するポリクロナール抗体を固相−αnHE1−PSA−αH
Eとインキュベートすると、HEおよびnHE1に対する抗体
は固相に結合しない。nHE1以外の隠れないエピトープに
対する非HEPSA抗体は固相に結合し、低pHなど標準的な
方法で溶出できる。固相に結合しない抗体は、方法Ａま
たはＢによってさらに分離することができる。こうし
て、ポリクロナール抗PSA抗体はHEPSA抗体、nHE1に対す
る抗体、およびnHE1以外のnHEに分離される。特定のαH
EがPSA上のHEすべてをマスクしない場合には、他のHE部
位に向けた追加のHE抗体を同時に、あるいは好ましくは
逐次分画カラムで使用することができる点に注目された
い。
III. PSA検定のキャリブレーターおよび対照として有
用な被検体−HE構成の複合体 本発明では、被検体の検定におけるキャリブレーター
および対照として役立つ被検体−HE抗体の複合体も提示
する。この複合体は、被検体に過剰なHE抗体を加えるこ
とで生成できる。HE抗体は、被検体の２倍から100倍多
いことが好ましく、10倍多いことがより望ましい。ある
いは、被検体をHE区隊に架橋することができる。前述の
被検体と結合分子の架橋方法が、被検体とHE抗体の架橋
にも同じく適用できる。複合体は、リン酸緩衝食塩水、
トリス−HCl、またはHEPESなどの不活性緩衝液中に保存
するのが好ましい。貯蔵温度は２〜25℃が望ましい。pH
は５〜９が望ましい。被検体の検定でキャリブレーター
または対照の役もなす被検体とその結合分子の架橋複合
体も、同じようにして生成できる。
以下に、本発明の実施例を示すが、これらに限定され
るものではない。
実施例 実施例Ｉ 新しいPSA検定方法 以下の実験は、IMx PSA Assay用試薬を使用し、IMx
PSA Assay添付書の手順に従ってIMx 機器（本出願
人）で実施したが、本発明では遊離PSAとは結合するがP
SA−ACT複合体とは結合しないMAB 9B10または5A10（前
述）０〜20μg/mLを追加含有する検定用希釈剤を使用し
た点のみ異なる。IMx PSA Assay試薬としては次のも
のがある。（１）遊離PSAおよび複合体化PSA（すなわち
ACTと複合体を形成したPSA）の双方と結合し捕捉する捕
捉抗体MAB H50で被覆された微粒子（「抗PSA被覆微粒
子」）、および（２）検出用にアルカリホスファターゼ
で標識されたPSAに対するヤギポリクロナール抗体（プ
ローブ抗体として働く）（「ヤギポリクロナール抗PSA:
アルカリホスファターゼ抱合体」または「プローブポリ
クロナール抗体」）。
前立腺患者から採取した血清試料を試験サンプルとし
た。
IMx 機器の説明、操作および一般手順は、Barnesら
によるJ.Clin.Imm.14巻２号115〜119頁（1991年）およ
びEP−Ａ−288,793;LudingtonらによるClin.Chem.34巻
９号1726〜1732頁（1988年）に記載されている。反応セ
ルの構成要素はClin.Chem.34巻９号1727頁の図２（ａ）
に示されている。この場合、反応方法は微粒子酵素免疫
検定法（MEIA）のものと同じで以下のとおりである。
（１）IMx 機器のプローブ／電極アセンブリで、サン
プル、抗PSA被覆微粒子および検定希釈剤を反応セルの
インキュベーションウェルに入れる。この反応混合液を
インキュベートしている間に、サンプル中の遊離PSAお
よび複合体化PSAが抗PSA被覆微粒子と結合して抗体−抗
原複合体を形成する。MAB 9B10が次いで抗PSA被覆微粒
子と結合しているPSA（ACTと複合体を形成していない）
と結合して、抗体−抗原−抗体複合体を形成する。
（２）反応混合液のアリコートをIMx 機器のガラス繊
維マトリックスに移す。微粒子はガラス繊維マトリック
スと不可逆的に結合する。
（３）マトリックスを洗浄して未結合物質、たとえば血
清蛋白、検定希釈剤、および微粒子に結合していないMA
B 9B10を除去する。
（４）ヤギポリクロナール抗PSA:アルカリホスファター
ゼ接合体をマトリックスに加え、抗体−抗原−抗体複合
体に結合させる。
（５）マトリックスを洗浄して未結合物質を除去する。
（６）基質である４−メチルウンベリフェリルリン酸
（MUP）をマトリックスに加えると、表面結合アルカリ
ホスファターゼが非蛍光発生MUPを４−メチルウンベリ
フェロン（MU）に変換し、その蛍光をIMx 機器のMEIA
光学アセンブリで測定する。
上記の検定の工程は別々に行ったが、サンプルの代わ
りに遊離PSAを含有するキャリブレーターおよび対照を
同時に使用した。サンプル（すなわちパネル）の読取り
値をキャリブレーターから読み取って（表１）、PSA値
を求めたところ、表２および表３に報告するとおりにな
った。
上記の表から、検定における遊離MAB 9B10の量が増
えるとキャリブレーション曲線の信号が減り、サンプル
パネル値が高くなることがわかる。MAB 9B10がパネル
の値に及ぼす影響は、10μg/ml付近で飽和するようであ
る。上記の実験を、MAB 9B10の代わりにMAB 5A10を使
って繰り返し行ったが、同じ様な結果が出た。
次の実験では、前記の検定希釈剤中のMAB 9B10が10
μg/mlという飽和レベルを使って、遊離PSAと複合体PSA
の間のバイアスを実証した。遊離PSAを含有するサンプ
ルを精製したACTと混和して、複合体を形成させた。複
製PSAおよびACTはマルモ大学のHans Lilja博士から入
手した。PSAおよびACTの精製ならびにPSAとACTの複合体
の生成はすでに述べられているとおりである（A.Christ
enssonらによるEur.J.Biochem.194巻755〜763頁（1990
年））。精製した***PSAを7.5％ウシ血清アルブミンお
よび0.05％アジ化ナトリウムを含有するpH7.0の0.1Mリ
ン酸緩衝液に入れ、これに100モル倍過剰の精製ACTを混
和した。PSAの対照サンプルをACTの代わりに緩衝液と混
和した。これらのサンプルを35℃で一晩インキュベート
した。インキュベートした後に、これらの試料をIMx P
SA Assayに以下の修正を施した方法でで検定した。
a.Abbott IMx PSA Assay（修正なし） b.Abbott IMx PSA Assayおよび9B10の入った検定希
釈剤（すなわち検定希釈剤に10μg/mLの9B10を添加） c.Abbott IMx PSA AssayおよびMAB H50プローブ抗
体ならびにMAB H117捕捉抗体（すなわちH117被覆微粒
子および標識H50を使用） 前述のようにして検定を行った。表４に、遊離PSAサ
ンプルおよびACTを添加したPSAサンプルで得られたPSA
の量を示す。PSA対照に比べて、ACTを含有するサンプル
で検出されたPSAの量が少ない場合、バイアスが生じて
いるのを示す。
表４のデータから、MONO検定法（MAB H50をプローブ
抗体とし、MAB H117を捕捉抗体とする）にはバイアス
がないことがわかる。それに対して、MOLY検定法（Abbo
tt IMx PSA Assay）では36.8％のバイアスが見ら
れ、この検定法に遊離MAB 9B10を加えるとそのバイア
スが劇的に減少することがわかる。
MONO検定法でMAB H50を捕捉抗体として、MAB H117
をプローブ抗体として利用して前記の実験を繰り返し行
った。このようなMONO検定法でもバイアスが生じ、また
検定希釈剤に遊離9B10を加えるとそのバイアスを無くす
ことができるのがわかった。
実施例II キャリブレーターおよび対照として有用なPSA−HE抗体
複合体 HEPSA抗体をPSAと混和するとPSA−HEPSA抗体複合体が
形成され、そこでは隠れるエピトープはPSA−ACT複合体
と同様にブロックされる。この物質を、PSA検定でキャ
リブレーターまたは対照として利用することができる。
***PSAをpH7.4の0.01Mリン酸緩衝食塩水に入れたも
のを10倍過剰にある9B10と混和し、１〜８℃で一晩イン
キュベートする。インキュベートした後、PSA−HEPSA抗
体複合体をIMx PSAキャリブレーター希釈剤で、０、
２、10、30、60および100ng/mLに希釈する。これらのキ
ャリブレーターをIMx PSA Assayで使って、PSA上のHE
をマスクすることでPSA−ACT複合体を模倣する。
実施例III PSA HEおよびPSA非HEに対するポリクロナール抗体を選
択するための遊離PSAへのHE抗体の架橋 本実施例では、前記図２のパートＢで示した分別方法
の実行について説明する。方法を説明するのにMAB 5A1
0を使用するが、これの代わりにどのようなHEPSA抗体で
も、たとえばMAB 9B10などを使用することができる。
最初の工程では、製造業者の推奨事項に従って臭化シ
アン活性化セファロース−4Bに5A10を架橋させる。（Af
finity Chromatography Principles and Methods、
Pharmacia LKB Biotechnology、スウェーデン、23〜3
0頁（1993年））。
その手順は次のとおりである。
アフィニティーカラム用の5A10を0.1Mリン酸水素ナト
リウム（Na2HPO4）と混和し、pHを9.0に調整する。それ
から5A10を臭化シアン活性化セファロース−4Bゲルと、
ゲル1mLに対して5A10を2mgの割合で混ぜる。混合液を静
かに振盪させながら２〜８℃で一晩インキュベートす
る。
5A10をセファロースゲルに結合支えた後、ゲルを0.1M
Na2HPO4（pH8.0）で洗浄して未結合リガンドを除き、
それから1Mエタノールアミン（pH8.0）と２〜８℃で混
和して、ゲル中に残っている活性基をブロックする。ゲ
ルを蒸留水または脱イオン水で洗浄してから、0.1M酢酸
ナトリウム緩衝液と1M NaCl（pH4.0）、および0.1M N
a2HPO4と1M NaCl（pH8.0）で交互に２回洗浄する。カ
ラムにPBS溶液（0.01M NaHPO4、0.15M NaCl、pH7.2）
を充填して洗浄し、次いで0.1Mグリシン、0.1M NaCl、
pH2.5で溶出する。それからカラムを0.1％アジ化ナトリ
ウムを含有するpH7.2のPBSで洗浄する。5A10のアフィニ
ティーカラムは２〜８℃で保存する。
手順の次の工程では、PSAをセファロース4B−5A10に
結合させてから、化学的架橋によって5A10−PSA複合体
を安定させる。PSAが5A10に結合すると、PSA上のHEがブ
ロックされるので、HEは他のHEPSA抗体と結合できな
い。架橋剤としてジメチルパレミデート（DMP）を使っ
て不溶性蛋白を架橋する手順については、すでに述べら
れている（C.SchneiderらによるJ.Biol.Chem.25巻10766
〜10769頁（1982年））。
その手順は次のとおりである。
カラムからセファロース4B−5A10ゲルを取り除き、そ
れをメスシリンダーに入れる。ゲルが落ち着いたなら
ば、残留緩衝液を除く。パックされたゲル1mLにつき精
製PSA10mgを、0.01Mリン酸緩衝液（pH7.4）中で最初の
濃度が2mg/mLで加える。三角フラスコに移し、静かに振
盪させながら２〜８℃で一晩インキュベートする。
一晩インキュベートした後に、ブフナー漏斗で10容の
0.2Mトリエタノールアミン、pH9.0（TEA）でゲルを２回
洗浄する。ゲルをビーカーに移し、TEA中に入った40mM
DMP（pH9.0）５部を加える。室温で振盪させながら１
時間インキュベートする。ブフナー漏斗を使って10〜20
容のTEA（pH9.0）および10〜20容の0.01Mリン酸緩衝食
塩水（pH7.4％）および0.02％アジ化ナトリウムで洗浄
する。
このプロセスの最終工程では、以下のような標準的ア
フィニティー手順でセファロース4B−5A10PSAカラム上
のPSAに対するポリクロナール抗体を精製する。
抗PSAポリクロナール抗体をカラム緩衝液（0.01Mリン
酸緩衝食塩水、pH7.4）で1:1希釈する。（ポリクロナー
ル抗体の例としては、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、マウスお
よびラットのポリクロナール抗体が挙げられる。）サン
プルをゆっくりとカラムに注入する。カラムに結合しな
かった蛋白を採集する。この分画にはHE抗体が入ってい
る。カラムをカラム緩衝液で洗浄し、280nmで光学密度
をモニターする。吸光度がベースラインまで下がったな
らば、結合している非HE抗体を0.1Mグリシン−HCl（pH
2.5）で素早く溶出させる。分画を等容の0.1Mトリス−H
Cl（pH8.5）に採集し、素早くpHを中性に調整する。精
製したHE抗体および非HE抗体の双方を希望する緩衝液に
対して透析し、0.2ミクロンの滅菌フィルターを通して
濾過してから２〜８℃で保存する。あるいは、抗体は凍
結させてもよい。
本明細書で言及するあらゆる公表文献および特許出願
は、個別に引例として指示した場合と同様に、本明細書
に参照として引用とする。
前述の発明は、明確にしてわかりやすくする目的で図
や例を使ってある程度詳しく述べたが、当業者の技術の
範囲内で様々な修正や変更を施すことも添付の請求の範
囲に入るものであることは明らかである。ここに示す基
本的発明に対する明らかな変更を可能にする今後の技術
の進歩も請求の範囲に入る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｔ (72)発明者 キング，キヤロル・エー アメリカ合衆国、イリノイ・60035、ハ イランド・パーク、キヤベル・アベニユ ー・1514 (72)発明者 アレクサンダー，デブラ・ビー アメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガ ーニー、ホースシユー・レーン・17577 (72)発明者 スミス，アラン・エイチ アメリカ合衆国、イリノイ・60099、ジ オン、ウエスト・タルマツジ・10831 (72)発明者 オマロー，スーザン・ビー アメリカ合衆国、イリノイ・60517、ウ ツドブリツジ、ホルシー・ドライブ・ 6415 (56)参考文献 特開 昭63−148994（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−112599（ＪＰ，Ａ) 特開 昭52−108019（ＪＰ，Ａ) 特表 昭63−503480（ＪＰ，Ａ) 国際公開92／001936（ＷＯ，Ａ１) 米国特許4689323（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/543 501 G01N 33/566 G01N 33/574 A61K 39/395

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】生体サンプル中の被検体（「Ａ」）を検出
    もしくは定量するための免疫検定法であり、該被検体は
    該サンプル中に遊離体の形（「遊離被検体」）でまたは
    結合分子と結合して被検体と結合分子との複合体の形
    （「｛（Ａ）（結合分子）｝」）で存在することがで
    き、この方法は、 （ａ）被検体の特定クラスのエピトープに特異な抗体
    （「αHE」）、被検体の別のクラスのエピトープに特異
    な捕捉抗体（「αnHE」）、および被検体に特異なプロ
    ーブ抗体（「αＡ＊」）に被検体を接触させ、ただしプ
    ローブ抗体がポリクロナール抗体であれば被検体はプロ
    ーブ抗体よりも前に捕捉抗体に接触させ、 （ｂ）被検体に結合するαＡ＊の有無または量とサンプ
    ル中の被検体の有無または量を関連づけるか、あるいは
    未結合αＡ＊の量をサンプル中の被検体の有無または量
    と関連づける工程から成り、 ただしαnHEは遊離被検体および｛（Ａ）（結合分
    子）｝の双方と結合でき、 αHEは遊離被検体とは結合できるが｛（Ａ）（結合分
    子）｝とは結合できない免疫検定法。
  2. 【請求項２】プローブ抗体がポリクロナール抗体であ
    る、請求項１に記載の免疫検定法。
  3. 【請求項３】捕捉抗体がモノクロナール抗体である、請
    求項１に記載の免疫検定法。
  4. 【請求項４】さらに、固相からサンプルと未結合αHEを
    分離してから固相にαＡ＊を加え、次いで未結合αＡ＊
    を分離して固相に結合しているαＡ＊を検出する工程を
    含んで成る、請求項１に記載の免疫検定法。
  5. 【請求項５】プローブ抗体が、遊離被検体とは結合する
    が｛（Ａ）（結合分子）｝とは結合しない抗体、ならび
    に被検体および｛（Ａ）（結合分子）｝の双方と結合す
    る抗体とを含んで成るポリクロナール抗体の集団であ
    る、請求項２に記載の免疫検定法。
  6. 【請求項６】αHEがMABである、請求項１に記載の免疫
    検定法。
  7. 【請求項７】被検体がPSAであり、結合分子がACTであ
    る、請求項１に記載の免疫検定法。
  8. 【請求項８】αHEを9B10、5A10、PSA6、PSA30、PSA17、
    PSA19、PSA20、PSA25から成るMABの群から選択する、請
    求項７に記載の免疫検定法。
  9. 【請求項９】プローブ抗体がMAB H50であり、捕捉抗体
    がMAB H117である、請求項７に記載の免疫検定法。
  10. 【請求項１０】サンプル中被検体の検定を実施するため
    のキットで、被検体はサンプル中に遊離被検体の形で
    も、あるいは結合分子と結合して複合体を形成した被検
    体−結合分子複合体の形でも存在でき、 （ａ）遊離被検体と結合できるが被検体−結合分子複合
    体とは結合できない該被検体の特異な抗体（αHE）、 （ｂ）遊離被検体および被検体−結合分子複合体の双方
    と結合できる、該被検体の別のクラスのエピトープに特
    異な捕捉抗体（αnHE）、および （ｃ）該被検体に特異なプローブ抗体（αＡ＊）を含ん
    で成るキット。
  11. 【請求項１１】被検体がPSA、結合分子がACT、捕捉抗体
    およびαHEがMAB、プローブ抗体がポリクロナール抗体
    である、請求項10に記載のキット。
  12. 【請求項１２】さらに、αHEに結合した被検体の複合体
    を含有する容器を含んで成る、請求項10に記載のキッ
    ト。
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