KR20010074986A - 췌장 기능 장애를 검출하기 위한 진단 방법 - Google Patents

췌장 기능 장애를 검출하기 위한 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 췌장 기능 장애를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 췌장 엘라스타제의 모든 동위 효소의 부분 및 합성 아미노산 서열을 특이적 항체를 얻기 위한 항원으로 사용한다. 본 발명은 또한 면역 테스트 방법에 상기 항체를 사용하는 것에 관한 것이다.

Description

췌장 기능 장애를 검출하기 위한 진단 방법{DIAGNOSTIC METHOD FOR DETECTING DISTURBANCES OF THE PANCREAS}
췌장의 기능 장애는 여러 가지 병의 결과일 수 있다. 그것의 진단은 특히 기능적 기준의 측정에 기초를 두어야 한다. 췌장의 가장 흔한 병은 만성적으로 재발하는 췌장염 및 급성 췌장염이다.
만성 췌장염은 더디게 진행하는 병이다. 이 병에서는 정상 췌장 조직이 경화 과정의 범주에서 점차적으로 퇴행 변성된다. 췌장염은 그것의 임상 곤란 증세(복부 통증, 지방변, 체중감소), 췌장의 형태적 변화(석회화, 확장된, 불규칙적으로 제한된 췌관) 및 진행성 외분비 및 내분비 기능 저하(소화불량, 당뇨병)를 특징으로 한다. 만성 췌장염은 서유럽에서 매년 성인 10만 명 당 6 내지 8명의 발생 빈도를 갖는다. 만성 췌장염의 진단은 알콜 소비 증가로 인해 점점 더 빈번해지고 있다.
임상적 및 형태적 현상의 기초를 정하기 위해, 여러 가지 기능적 기준이 정해질 수 있다. 가장 민감한 분석 방법은 분비-세룰라인- 또는 분비-콜레시스토키닌-테스트이다. 그러나, 이러한 테스트는 환자에게 많은 부담을 주고 많은 시간을 필요로 한다. 간접적인 테스트 방법으로는 Lundh-, NBT-PABA- 및 Pancreoauryl 테스트가 사용된다. 혈청 중의 트립신 또는 대변 중의 카이모트립신의 측정은 실제로 중요하다. 이러한 모든 간접적인 테스트 방법은 불충분한 특이성의 단점을 갖는다.
엘라스타제 1의 측정은 모든 이용 가능한 간접적 기능 테스트 중 가장 큰 민감성 및 특이성을 가진 테스트이다(Loeser, C., Therapie & Erfolg 1997; 1:411-413). 이 테스트가 최근에는 실제로 외분비 췌장 기능 진단을 위한 표준으로 사용된다. 이 테스트의 기초는 엘라스타제 1(엘라스타제 1-RIA, Abbott)에 대한 다클론성 항체 또는 단일클론성 및/또는 다클론성 항-엘라스타제-1-항체이다. 상기 항체들은 아미노산 서열 Thr-Met-Val-Ala-Gly-Gly Asp-Ile-Arg 또는 그것의 면역 작용 부분 텝타이드를 포함하는 항원에 의한 면역에 의해 얻어진다(EP 0 547 059 B1)
췌장-엘라스타제는 단백 분해 소화 효소이다. 췌장 진단을 위해 사용되는 파라미터(예컨대, 대변 중의 카이모트립신 활성도)에 비해, 정량적 엘라스타제 측정은 큰 장점을 갖는다. 상기 효소는 췌장에서만 형성되고 장을 통과하는 동안 극도의 안정성을 갖는다. 즉, 엘라스타제의 농도가 췌장의 분비력을 반영한다.
다른 외분비 파라미터에 비한 우월성에도 불구하고, 종래의 엘라스타제 1-ELISA에 의해서는 많은 경우에 그것이 높은 농도로 존재해도 췌장-엘라스타제가 검출되지 않는다.
본 발명은 췌장 기능 장애를 검출하기 위한 진단 방법에 관한 것이다. 적용 분야는 의학 및 약학 산업이다.
본 발명의 목적은 췌장 엘라스타제의 검출을 기초로 췌장 기능 장애를 검출하기 위한 보다 민감한 방법을 개발하는 것이다.
종래의 ELISA에 의해 엘라스타제 1에 반응하지 않는 대변 샘플의 계통적 분석에 의해, 전기 영동 분리 후에 엘라스타제를 포함하는 샘플이 제조되었다. 다른 특성화 시에는 종래의 테스트 항체로는 명확히 검출되지 않는 여러 가지 동위 효소가 상기 단백질로 사용된다. 상기 효소에는 전문 문헌에서 췌장 엘라스타제 1, 2 및 3의 설명에도 반영되는 유전적 다형성이 있다. 분석에 의해 적어도 2개의 동위 효소가 동시에 나타날 수 있는 것도 검출되었다. 또한, 상기 엘라스타제가 췌장 손상에 대한 농도 의존도 면에서 엘라스타제 1과 똑같다는 것도 밝혀졌다.
췌장 엘라스타제 1의 특수한 검출에 국한되는 공지된 해결책과는 달리, 거의 모든 췌장 엘라스타제 동일 형상(isoform)의 검출에 의해, 췌장 엘라스타제 1, 2 및 3이 검출되고, 췌장 기능에 대한 정보력이 현저히 개선될 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명은 통상의 방식이지만, 사용된 특이적 항체가 개별적으로 또는 조합해서 모든 공지된 엘라스타제 동위 효소 또는 이것의 부분 또는 교차 반응하는 합성 서열을 나타내는 것을 특징으로 하는 항-엘라스타제-항체를 만드는 방법에 관한 것이다.
상기 부분은 바람직하게는 펩타이드 합성에 의해 얻어지며, 아미노산 서열은 구조 분석 방법에 의해 먼저 전체 서열로부터 유도되거나 단백질 서열화 후에 검출된다. 펩타이드가 단독으로 항체 도입을 야기시키더라도, 본 발명에 따라 상기 펩타이드가 헤모사이아닌과 같은 통상의 캐리어 물질에 결합되는 것이 바람직한 것으로 나타났다. 본 발명에 따른 펩타이드에 의해 단일클론성 항체 및 다클론성 항체가 형성될 수 있다.
본 발명에 따른 다클론성 항펩타이드항체를 만들기 위해, 집토끼, 기니아피그, 염소, 닭 또는 물고기와 같은 시험용 동물이 공지된 방식으로 펩타이드로 면역된다. 단일클론성 항체를 만들기 위해, 펩타이드가 공지된 방식으로 특이적 B-세포의 도입을 위해 사용된다. 상기 B-세포는 골수종 세포와의 융합 후에, 특이적 단일클론성 항체를 분리하는 세포주에서 공지된 클론화 방법에 따라 배양되는 하이브리도마 세포를 생성한다. 본 발명에 따른 단일클론성 또는 다클론성 항체는 사용된 특이적 에피토프와만 또는 공지된 모든 엘라스타제 동위 효소와 반응한다.
펩타이드
에 대한 항체가 췌장 엘라스타제의 동일 형상과 매우 특이적으로 반응하고, 다른 대변 성분과 비특이적 반응을 하지 않는다.
본 발명의 또다른 대상은 체액 및 대변의 모든 공지된 엘라스타제 동위 효소의 검출 및 정량을 위한 본 발명에 따른 엘라스타제 항체의 용도이다. 따라서, 본 발명은 검출 시스템, 특히 상기 기관의 기능 장애를 검출하기 위한 보조 수단으로서 췌장의 기능을 검출하는 면역 화학적 검출 시스템에 관한 것이다. 이것을 위해, 상기 특이적 항체가 공지된 커플링 방법으로 각각 적합한 캐리어에 흡착적으로 또는 화학적으로 결합될 수 있다. 캐리어로는 박막 또는 입자가 적합하다. 본 발명에 따른 샌드위치 ELISA에 의해 교차 반응성 또는 조합이 다른 에피토프항체를 사용해서 대변 및 혈청 또는 세포질 내의 췌장 엘라스타제가 신속히 그리고 특이적으로 검출되고 정량될 수 있다.
이것은 복부 통증 및 외분비 췌장 기능 부전의 경우 췌장 관련을 진단 또는 제외시키기 위해 사용된다.
췌장 장애의 확실한 진단을 위해, 엘라스타제 1의 검출만으로 충분한 경우도 있다. 이 경우에는 본 발명에 따른 방법이 하기와 같이 적용된다:
인간 엘라스타제 1에 대한 DNA 서열(JP 1987000276-A/6)은 아미노산 서열로 전이된다. 통상의 단백질 구조 프로그램을 사용해서, 잠재적 에피토프 구조를 가진 다수의 아미노산 서열이 식별될 수 있다. 펩타이드
에 대한 항체가 엘라스타제 1을 매우 특이적으로 결합시키고 다른 대변 성분과는 비특이적 반응을 하지 않는 것이 검출될 수 있다.
본 발명은 통상의 방법이지만, 사용되는 특이적 항원이 구조 분석적 방법에 의해 먼저 아미노산 서열로부터 유도되고 화학적으로 합성되는 것을 특징으로 하는 항-엘라스타제-항체를 만드는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 항체를 만들기 위해 상기 합성 펩타이드의 부분을 사용하는 것도 가능하다. 펩타이드가 단독으로 항체 도입을 야기시키더라도, 본 발명에 따라 상기 펩타이드가 헤모사이아닌과 같은 통상의 캐리어 물질에 결합되는 것이 바람직한 것으로 나타났다. 본 발명에 따른 펩타이드에 의해 단일클론성 항체 및 다클론성 항체가 형성될 수 있다.
본 발명에 따른 다클론성 항펩타이드항체를 만들기 위해, 집토끼, 기니아피그, 염소, 닭 또는 물고기와 같은 시험용 동물이 공지된 방식으로 펩타이드로 면역된다. 단일클론성 항체를 만들기 위해, 펩타이드가 공지된 방식으로 특이적 B-세포의 도입을 위해 사용된다. 상기 B-세포는 골수종 세포와의 융합 후에, 특이한 단일클론성 항체를 분리하는 세포주에서 공지된 클론화 방법으로 배양되는 하이브리도마 세포를 생성한다. 본 발명에 따른 단일클론성 또는 다클론성 항체는 사용된 특이적 에피토프와만 또는 성숙한 엘라스타제 1과 반응한다.
본 발명의 또 다른 대상은 체액 및 대변의 엘라스타제 1의 검출 및 정량을 위한 본 발명에 따른 엘라스타제 1-에피토프 특이적 항체의 용도이다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 기관의 기능 장애를 검출하기 위한 보조 수단으로서 췌장의 기능을 검출하는 면역 화학적 검출 시스템에 관한 것이다. 이것을 위해, 상기 특이적 항체는 공지된 커플링 방법으로 각각 적합한 캐리어에 흡착적으로 또는 화학적으로 결합될 수 있다. 캐리어로는 박막 또는 입자가 적합하다. 본 발명에 따른 샌드위치 ELISA에 의해 각각 2개의 상이한 에피토프 항체를 사용해서 대변 및 혈청 또는 세포질 내의 엘라스타제 1이 신속히 그리고 특이적으로 검출되고 정량될 수 있다.
실시예 1 - 성숙한 인간 엘라스타제 1의 정해진 섹션에 대한 특이적 항-펩타이드-항체의 제조
Merrfield에 따른 고체상 합성에 의해 아미노산 서열
을 가진 펩타이드를 합성한다. 상기 펩타이드를 공지된 방법으로 파텔라 조개 헤모사이아닌(KLH)에 결합시킨다(1 mg 펩타이드/mg KLH). 상기 결합체 300 ㎍을 프로인트 보조액을 첨가해서 집토끼 또는 닭의 면역을 위해 사용한다. 3번의 왁친 주사 후에, 동물의 피를 채취한다. 혈청을 얻은 후에 ELISA에서 항혈청의 특이성을 테스트한다. 이것을 위해, 유리 펩타드를 마이크로티터 플레이트의 공동 표면에 흡착시킨다. 항혈청을 가진 공동의 배양 후에, 이것들을 성장시킨다. 기질로서 항 집토끼- 또는 항 닭-POD-결합체 및 TMB를 사용해서, 통상의 방식으로 항원-항체 반응을 검출한다. 각각의 항혈청은 동종 펩타이드와만 반응한다.
실시예 2 - 본 발명에 따른 항체의 특이성 검출
엘라스타제 1-특이성은 Western blot에서 검출할 수 있다. 이것을 위해, 대변으로 부터 얻은 대략 정제된 또는 고도로 정제된 엘라스타제 1를 폴리아크릴아미드겔-전기 영동에 의해 그것의 상대적 몰량에 따라 동반된 불순물로부터 분리시킨다. 겔로 이루어진 단백질 존은 "세미드라이-블로팅"(Semidry-blotting) 장치에 의해 나이트로셀룰로스로 전이된다.
박막과 재현탁된 건조 탈지유와의 유리 결합점의 포화 후에, 1 : 500 희석된 항-펩타이드-항혈청을 가진 박막을 배양시킨다. 비특이적으로 결합된 모든 항체를 제거하기 위해 박막을 강력히 세척한 후에, 포스파타제 -마킹된 항-집토끼-항체를 가진 박막을 배양시킨다. 박막에서 성장 후에 남아있는 특이적으로 결합된 2차 항체는 기질의 첨가 후에 가시화된다. 사용된 샘플에서는 엘라스타제만이 검출된 것으로 나타났다.
실시예 3 - ELISA에서 본 발명에 따른 항체를 사용해서 대변의 엘라스타제 1의 측정
혈청 샘플 또는 대변 샘플 중의 엘라스타제 1을 샌드위치 기술을 기초로 하는 고체상-효소 면역 측정법으로 측정한다. 엘라스타제 1의 에피토프에 대한 다클론성 항체를 탄산염/중탄산염-완충 용액 중에 pH 9.6으로 용해시키고 마이크로티터 플레이트의 웰(well) 내로 넣는다. 4℃에서 12시간 이상 배양 후에, 결합되지 않은 항체를 PBS에 의한 세척에 의해 제거한다. 캐리어 물질의 유리 결합점은 에탄올-아민 및 Tween 20을 함유하는 PBS-완충제에 의해 블로킹된다. 상기 블로킹은 실온에서 90 분 이상 이루어진다. 세척 후에 PBS 중에 희석된 혈청 또는 대변 샘플을 웰 내로 피펫으로 넣는다. 실온에서 60분간의 배양을 세척에 의해 종료한다.바이오틴과 결합된 특이적 다클론성 항체의 제 2 엘라스타제 1을 제 1 항체에 결합된 엘라스타제에 첨가한다.
30분간의 배양 및 세척 공정 후에, 페록시다제-결합된 스트레프타비딘을 가진 바이오틴 마킹된 항체를 검출한다. 마지막 세척 단계에 의해 결합되지 않은 스트레프타비딘을 제거한다. 그리고 나서, 페록시다제에 대한 기질로서 TMB를 거기에 첨가하고 일정한 시간 후에 색 반응을 HCl의 첨가에 의해 중단시킨다. 광학적 밀도의 변동을 측정한다. 색 반응의 세기는 샘플의 엘라스타제 1 농도에 비례한다.
실시예 4 - 췌장-엘라스타제의 동일 형상의 일정 섹션에 대한 특이적 항-펩타이드-항체의 제조
Merrfield에 따른 고체상 합성에 의해 아미노산 서열
을 가진 펩타이드를 합성한다. 상기 펩타이드를 공지된 방법으로 파텔라 조개 헤모사이아닌(KLH)에 결합시킨다(1 mg 펩타이드/mg KLH). 상기 결합체 300 ㎕을 프로인트 보조액을 첨가해서 집토끼 또는 닭의 면역을 위해 사용한다. 3번의 왁친 주사 후에, 동물의 피를 채취한다. 항체를 얻은 후에(단백질 A-컬럼 또는 분획된 침전물을 통한 세척) ELISA에서 그 특이성을 테스트한다. 이것을 위해, 유리 펩타드를 마이크로티터 플레이트의 공동 표면에 흡착시킨다. 동종 또는 이종 항체를 가진 공동의 배양 후에, 이것을 성장시킨다. 기질로서 항 집토끼- 또는 항 닭-POD-결합체 및 TMB를 사용해서, 통상의 방식으로 항원-항체 반응을 검출한다. 각각의 항체는 동종 펩타이드와만 반응한다.
실시예 5 - 본 발명에 따른 항체의 특이성 검출
췌장 엘라스타제의 여러 가진 동일 형상에 대한 항체의 특이성은 Western blot에서 검출할 수 있다. 이것을 위해, 대변 및 췌장액으로부터 얻은 대략 정제된 또는 고도로 정제된 엘라스타제 1를 폴리아크릴아미드겔-전기 영동에 의해 그것의 상대적 몰량에 따라 동반된 불순물로부터 분리시킨다. 겔로 이루어진 단백질 존은 "세미드라이-블로팅"(Semidry-blotting) 장치에 의해 나이트로셀룰로스로 전이된다. 박막과 재현탁된 건조 탈지유와의 유리 결합점의 포화 후에, 예비 희석된 항-펩타이드-항체를 가진 박막을 단독으로 또는 상이하게 조합해서 배양시킨다. 비특이적으로 결합된 모든 항체를 제거하기 위해 박막을 강력히 세척한 후에, 알칼리 포스파타제 -마킹된 항-집토끼-항체를 가진 박막을 이전에 검출된 농도로 배양시킨다. 박막에서 성장 후에 남아있는 특이적 2차 항체는 기질의 첨가 후에 가시화된다. 개별 항체 또는 항체 혼합물을 가진 모든 샘플에서는 엘라스타제가 검출될 수있었으나, 각각의 항체에서 모든 동일 형상이 검출되지 않았다.
실시예 6 - 본 발명에 따른 항체를 사용해서 대변 및 혈청의 췌장-엘라스타제의 측정
혈청, 세포질 또는 대변 중의 엘라스타제를 샌드위치 기술을 기초로 하는 고체상-ELISA에 의해 측정한다. 이것을 위해, 본 발명에 따른 항체를 개별적으로 또는 혼합해서 탄산염/중탄산염-완충 용액 중에 pH 9.6으로 용해시키고 마이크로티터 플레이트의 웰(well) 내로 넣는다. 4℃에서 배양 후에, 결합되지 않은 항체를 PBS에 의한 세척에 의해 제거한다. 캐리어 물질의 유리 결합점은 에탄올아민/Tween PBS-완충제에 의해 블로킹된다. 상기 블로킹은 실온에서 90 분 이상 이루어진다. 세척 후에 PBS 중에 희석된 혈청 또는 대변 샘플을 웰 내로 피펫으로 넣는다. 실온에서 60분간의 배양을 세척에 의해 종료한다. 바이오틴과 결합된 본 발명에 따른 항체 또는 그 혼합물을 검출 항체로 사용한다. 30분간의 배양 및 세척 공정 후에, 페록시다제-결합된 스트레프타비딘을 가진 바이오틴 마킹된 항체를 검출한다. 마지막 세척 단계에 의해 결합되지 않은 스트레프타비딘을 제거한다. 그리고 나서, 기질로서 TMB에 의해 페록시다제 농도를 측정한다. 효소 반응을 종료하기 위해 HCl을 첨가한 후, 광학적 밀도의 변동을 측정한다. 색 반응의 세기는 샘플의 엘라스타제 농도에 비례한다.

Claims (19)

  1. 췌장 기능 장애를 검출하기 위한 진단 방법에 있어서, 환자의 혈청, 분비물 또는 배설물에서 모든 췌장 엘라스타제(동위 효소)의 전체 함량을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 측정을 바람직하게는 면역 시스템에 의해, 아미노산 서열 Thr-Met-Val-Ala-Gly-Gly-Asp-Ile-Arg를 제외하고, 모든 동위 효소를 개별적으로 특이적으로 또는 교차 반응적으로 검출하는 단일클론성 또는 다클론성 항체를 이용해서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 사용된 항체를 아미노산 서열 Thr-Met-Val-Ala-Gly-Gly-Asp-Ile-Arg 또는 그것의 면역 작용 부분 서열을 제외하고, 완전한 엘라스타제 1, 2 및 3 또는 그것의 서브 유닛을 나타내는 항원에 의해 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 아미노산 서열 Thr-Mer-Val-Ala-Gly-Gly-Asp-Ile-Arg을 제외하고, 교차 반응적으로 다수의 엘라스타제를 검출하는 항체를 동물의 면역 후에 도입한 합성 펩타이드를 항원으로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항중 어느 하나에 있어서, 바람직하게는 하기 합성 펩타드를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법:
  6. 제 1항 내지 제 5항에 있어서, 항체를 개별적으로 또는 조합해서 면역 화학적 검출 시스템에 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 2항 내지 제 6항에 따른 항체를 포함해서, 대변 또는 체액을 사용해서 췌장의 병을 진단 및 경과 제어하기 위한 면역 테스트 키트.
  8. 대변 또는 체액 중의 인간 엘라스타제 1과 특이적으로 반응하고 통상의 면역 방법에 의해 펩타이드
    또는 그것의 면역 부분 펩타이드를 척추 동물, 특히 포유 동물 및 새의 면역을 위한 항원으로 사용하는 것을 특징으로 하는 단일클론성 및/또는 다클론성 항체를 얻기 위한 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 유리 펩타이드를 면역 전에 적합한 캐리어 물질, 바람직하게는 헤모사이아닌 또는 알부민에 결합시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8항 및 제 9항에 있어서, 다클론성 항체를 시험용 동물로서 닭을 사용해서 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8항 내지 제 10항중 어느 하나에 따라 제조된 다클론성 항체.
  12. 제 8항 또는 제 9항에 따라 제조된 단일클론성 항체.
  13. 펩타이드 A-V-K-E-G-P-E-Q-V-I-P-I-N.
  14. 펩타이드 Y-T-N-G-P-L-P-D-K-L-Q-Q-A-R.
  15. 펩타이드 R-S-G-C-N-G-D-S-G-G-P-L-N.
  16. 펩타이드 G-P-L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Q.
  17. 적어도 하나의 본 발명에 따른 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 엘라타제 1용 정제- 및 검출 시스템.
  18. 대변 또는 체액을 사용해서 췌장의 질병 및 췌장 섬유증을 진단 및 경과 제어하기 위한 제 17항에 따른 면역 테스트 키트.
  19. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 2개의 상이한 항체(샌드위치-ELISA)를 사용하는 것을 특징으로 하는 면역 테스트 키트.
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