JPH05502299A - コラーゲナーゼを定量的に測定するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コラ−ゲナーゼを定量的に測定するための方法発明の分野 本発明は、侵入プロセスに含まれ、そして腫瘍細胞の転移に関連するタンパク質 分解酵素である■型コラーゲナーゼの改良された定量方法を提供する。

発明の背景 固相イムノアッセイ、例えば酵素結合イムノソルベントアッセイ（エリザ）は１ ９７１年の最初の記載（Ｂｎｇｖａｌｌ　ａｎｄ　Ｐｅｒｌｍａｎ、　１９７１ ；　Ｖａｎ　ＷｅｅＩｌｌａｎ　ａｎｄ　５ｃｈｕｒｒｓ、１９７１）以来免疫 学的研究に広く使用されてきた。様々なタイプのアッセイ法が記載されているが 、その全てが抗原または抗体の固定化を必要とする。通常、ペプチドまたはタン パク質抗原および抗体と種々のプラスチック、例えばポリスチレンまたはポリ塩 化ビニルとの強い相互作用が固相への固定の基礎を形成する（　Ｌｅｊｎｉｎｇ ｅｒ等、１９６６；　Ｃａｔｔ　ａｎｄ　Ｔｒｅａｇｅｒ、１９６７）　。ｘリ ザにおけるコーティングは、普通ｐＨ９−１０の炭酸ナトリウム緩衝液を用いる ことにより、希釈抗原または抗体と上記プラスチック表面との接触により通常行 われる（Ｈｕｄｓａｎ　ａｎｄ　Ｈａｙ。

１９８０）。

発明の要約 ゼラチンおよび■型コラーゲンを分解し得る中性メタロプロテイテーゼ酵素を捕 獲するための固相として天然プロテアーゼ基質が全開示されている。その方法は メタロブロティナーゼ基質が当該酵素を捕獲するために使用されている標準的な 捕獲アッセイ技術の変法である。

この変形サンドイッチアッセイ（図１）において、ゼラチンは固体基質に結合さ れ、そしてプレートは次いで洗浄されてもよい。当該の可溶性■型コラーゲナー ゼの推定上の供給源の異なる量が導入される。プレートを次に洗浄し、そして結 合された酵素の量を■型コラーゲナーゼに対するアフィニティー精製化ウサギ抗 ペプチド抗体、次にヤギ抗つサギパーオキシダーゼ複合体により決定する。この 方法は■型コラーゲナーゼに対して特異的であり、その他のマトリックスメタロ ブロティナーゼ、例えば間質コラ−ゲナーゼまたはストロメリシンとの交差反応 性を示さない。

■型コラーゲナーゼはヒトおよび動物腫瘍モデルにおいて転移性の表現型に密接 に関連している。面相イムノアッセイにおけるこの酵素の検出は転移性疾病に対 する患者のスクリーニングにおいて貴重であろう。記載された方法はヒト血清ま たは尿試料中の■型コラーゲナーゼの存在の検出に使用され得る。開示された診 断方法は、罹患しやすいと考えられる特定の悪性腫瘍に対して高い危険性のある 個人の状態を評価するために使用され得る。

さらに、本明細書に教示された方法は悪性腫瘍の治療をした、または治療を受け ている患者の状態をモニターするために使用され得る。

基膜の分解は腫瘍侵入および転移における重要な段階である（　Ｌｉｏｔｔａ等 、　１９８６）。■型コラーゲナーゼは侵入プロセスに含まれる重要なタンパク 質分解酵素である。

この酵素はヒトおよびネズミの腫瘍モデルにおいて腫瘍の転移の可能性に密接に 関連しており（Ｌｉａｔｔａ等、　１９８０；Ｂｏｎｆｉｌ等、　１９８９）　 、そして増大して転移性発現型の遺伝的誘導を伴う（Ｍｕｓｃｈｅｌ等、　１９ ８５；　Ｇａｒｂｆａａ等、　１９８７）。

生物学基質におけるこの酵素の迅速な１検出および定量は■型コラーゲナーゼと 腫瘍組織の生物学的挙動の相関関係のさらなる研究を可能にするであろう。

図面の簡単な説明 図１は■型コラーゲナーゼ基質捕獲イムノアッセイに含まれる段階の模式図であ る。最初にエリザプレートはゼラチンで被覆され捕獲相を形成する。試料を次に ウェル中に導入し、そして酵素のゼラチンへの結合が起こる。ウェルを次に洗浄 して非結合物質を除去し、そしてアフィニティー精製化抗■型コラーゲナーゼペ プチド抗体が導入される。

抗原抗体複合体の検出はヤギ抗ウサギ抗体−西洋ワサビパーオキシダーゼ複合体 を用いて行われる。

図２は抗ペプチド抗体を生成するために使用された■型プロコラーゲナーゼのア ミノ末端（ペプチド１−１７）および内部ドメイン（ペプチド４７２−４９０） ペプチドのアミノ酸配列を示す。これらの配列は、間質プロコラ−ゲナーゼ（中 段）またはプロストロメリシン（下段）と比較されているが、はとんと相同性を 示さない。

図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは抗■型コラーゲナーゼペプチド抗体の特徴づけを示す 。

図３人はアフィニティー精製化抗体Ａ４７２−４９０の特徴づけを示す。エリザ プレートウェルはペプチド４７２−４９０−ＢＳＡ複合体の示された量で被覆さ れた。抗体希釈物は直接エリザアッセイを用いて試験された。

図３Ｂはアフィニティー精製化抗体Ａｌ−１７の特徴づけを示す。エリザプレー トウェルはペプチドｌ−１７−ＢＳＡ複合体の示された量で被覆された。抗体希 釈物は直接エリザアッセイを用いて試験された。

図３０は競合エリザアッセイを示す。エリザプレートはウェルあたりペプチドＢ ＳＡ複合体２０ｎｇで被覆された。

非複合ペプチドの抗体結合性に競合する能力は、遊離ペプチドの示された量で適 当な抗体を予備保温することにより試験された。ペプチド１−１７およびペプチ ド４７２−４９０の両方は、これらのアフィニティー精製化抗体が単一特異性で あることを示す完全な逆転を示した。ペプチド１−１７は抗体Ａ４７２−４９０ 結合に対して競合する能力を示さなかった。同様にペプチド４７２−４９０は抗 体Ａ１−１７結合に対する競合性を示さなかった。

図４人および４Ｂはカルシウムイオンおよび温度のゼラチン捕獲イムノアッセイ への影響を示す。

図４Ａはカルシウムイオンの影響を示す。希釈物および洗浄緩衝液中の５ｍＭの カルシウムの包含は、抗原の供給源として調整培地を用いた場合に発色の顕著な 低下を生じた。低濃度のＥＤＴＡ　（１０ＢＭ）の包含は抗原の検出をわずかに 改良した。より高濃度のＥＤＴＡは抗原検出をさらには改良しなかった。

図４Ｂは温度の影響を示す。発色は、実験が２５℃で行われた場合に得られた結 果と比較されているように、実験が４℃で行われた場合に高められた。

図５は基質捕獲イムノアッセイの感度を示す。精製化■型コラーゲナーゼの連続 ２倍希釈は基質捕獲イムノアッセイ技術を用いて行われた。アッセイはウェルあ たり５０ｎｇ未満（すなわち、０．３ｎｇ／μＬ）を検出することができた。

図６は再現性の評価を示す。調整培地の連続２倍希釈は基質捕獲イムノアッセイ 法で行われた。同一プレート上で（アッセイ＃ｌおよびアッセイ＃２）または異 なる日に（アッセイ＃３）行われたアッセイにより比較した場合に同一結果が調 整培地試料に対して得られた。

図７は特異性の評価を示す。精製酵素試料の連続２倍希釈は基質捕獲イムノアッ セイ法で行われた。精製ヒト滑液コラ−ゲナーゼ（ロ）および精製ヒトストロメ リシン（■）は試験された高濃度でさえも本アッセイにおいて反応性を示さなか った。精製ヒト■型コラーゲナーゼ（◆）は濃度に依存した反応性を示した。

発明の詳細な説明 悪性腫瘍に罹患している患者の状態および進行の評価において、体液中のコラ− ゲナーゼを測定することが望ましい。本発明はコラ−ゲナーゼの定量手段を提供 する。

本発明はゼラチンに固体基質を暴露してそれに結合されたゼラチンを有する基質 を提供する。該基質は次に当該コラ−ゲナーゼの異なる量に暴露されるか、また はコラ−ゲナーゼを含むと予想される試験試料に暴露される。

当該のコラ−ゲナーゼに対する抗体は次に基質に適用される。抗体がコラ−ゲナ ーゼに結合された後、基質を洗浄する。基質を次に、当該コラ−ゲナーゼに結合 されている抗体に抗体−パーオキシダーゼ複合体の結合を引き起こす条件下で第 １の抗体に結合するであろう抗体−パーオキシダーゼ複合体に暴露される。基質 を再び洗浄し、そしてパーオキシダーゼ発色試薬が導入される。既知量のコラ− ゲナーゼに結合した基質が試験試料に暴露された基質と比較される。

本発明の方法に使用される抗体は天然のモノクローナル抗体またはポリクローナ ル抗体のいずれであってもよい。抗体の選択は、ゼラチンに結合している間の天 然配置にある当該コラ−ゲナーゼを抗体が認識する必要性によってだけ制限され ている。パーオキシダーゼ−抗体複合体はまた、ポリクローナルであってもモノ クローナルであってもよいが、抗コラーゲナーゼ抗体に対して検出されなければ ならない。また、第１の抗体はパーオキシダーゼまたはその他の検出系、例えば アルカリホスファターゼまたは放射性ヨウ素に直接結合され得、その結果第２の 抗体の必要性を解消する。

その他のエリザ試験は公知であるが、本明細書に記載されているようにそれに結 合されたゼラチンを有する基質の使用は試験の改良された感度および特異性を提 供する。

材料および方法 材料ニイムロン（Ｉｍｍｕｌｏｎ）Ｔ　Ｍ　２平底９６ウ工ル微量滴定プレート はダイナチック・ラボラトリーズ社から得られた。登録商標エリザメート（ＥＬ ＩＳＡｍａｔｅ）、キットシステム（パーオキシダーゼ複合体のためのマイクロ ウェルエリザメート）はカーケガード・アンド・べり−・ラボラトリーズ社から 購入され、パーオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩ　ｇＧ　（Ｈ＆Ｌ、吸着された ヒト血清）が使用された。

ゼラチンおよび抗原希釈緩衝液と最初の２回の洗浄のための洗浄緩衝液は１０μ ＭのＥＤＴＡを含むか、または含まない０．０５ＭトリスＨＣＩ、０．２Ｍ　Ｎ ａＣ１、ｐＨ７，６からなる（ＴＳＢ緩衝液）。残りの洗浄゛　液および抗体希 釈液はエリザメートキットに入っていた。

微量滴定プレートは４０５ｎｍで登録商標タイターテブク・マルチスキャン・プ レート・リーダー（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　ＭｕＩＨａｃａｎ　ｐｌａｔｅ　ｒｅａ ｄｅｒ）でスキャンされた。

抗原供給源： 調整組織培養培地はヒトＡ２０５８メラノーマ細胞培養体から得られた。これら の細胞をＤＭＥＭ中ウシ胎児血清と８０％周密まで増殖させた。次に培地を捨て 、そして無血清ＤＭＥＭに置き換えた。この培地を２４時間後に集めた。登録商 標ツルバール（Ｓｏｒｖａｌｌ）　ＲＴ　６０００中４℃で１０分３６００ｒｐ ｍで遠心分離した。上澄みを０．４５μフイルターで濾過し、モしてＹＭ３０メ ンプラン（アミコン）を用いて限外濾過により１０倍まで濃縮した。

■型プロコラーゲナーゼをヒトＡ２０５Ｂメラノーマ細胞調整培地から、ゼラチ ンアフィニティークロマトグラフィーにより、５ｔｅｔｌｅｒ−３ｔｅｖｅｒ＋ ｓｏｎ等（１９８９）により記載されたように精製した。精製した酵素を使用す るまで一７０°Ｃで貯蔵した。ヒトリュウマチ滑液繊維芽コラーゲナーゼおよび ストロメリシンの試料はカンザス医学センター大学のＨ，Ｎａｇａｓｅ博士によ り提供された。

合成ペプチド： 免疫感作に用いられた合成ペプチドはｔ　ＢＯＣアミノ酸方決方法論いてパイオ サ−千９６００ペプチドシンセサイザーで製造された。

抗体供給源： 抗体はウシ血清アルブミンにグルタルアルデヒド（０，１４％）で結合された合 成ペプチドを用いてニューシーラント白色ウサギ中で増殖させた。最初の２回の 免疫感作のために、非複合ペプチド０．２ｍＭ当量を含むウシ血清アルブミン− ペプチド複合体１ｍｌをフロイントの完全アジュバント１ｍｌと混合し、そして 皮下注射の前に乳化した。残りの２週間毎の免疫感作のために、ウシ血清アルブ ミン−ペプチド複合体０．５ｍｌを注射前にフロイントの完全アジュバント０． ５ｍｌと乳化した。

ペプチドアフィニティーカラムの調製および抗ペプチド抗体のアフィニティー精 製： ペプチドアフィニティー樹脂はアフィーゲル１０　（Ａｆｆ［−ｇ［！Ｌ　１０ ）　（バイオラッド）を製造者の指示に従って用い、そして各ペプチド２ｍｇを 用いて両方のペプチドに対して調製された。これらの樹脂は５６℃で３０分間ウ サギ血清の熱処理の後、該血清から抗体をアフィニティー精製するために使用さ れた。抗体を一晩吸収させた後、カラムは冷リン酸緩衝液２０カラム容量で洗浄 され、次いで２ベツド容量の１Ｍ酢酸で溶離された。この溶離液は６Ｍ　ＮａＯ Ｈの添加によりすぐに中和され、次にＹＭ３０メンプラン（アミコン）を用いて ダイアフロー緩衝液交換が行われた。

「基質捕獲」アッセイ： 水浴中で５５℃まで温めることによりゼラチンをＴＳＥ緩衝液中に溶解し、そし て室温まで冷却した。この１％ゼラチン溶液３００μＬを微量滴定プレートのウ ェル中に分注し、そして３７℃で一晩保温した。プレートを逆さにすることによ りウェルを空にし、そしてプレートを４°Ｃまで冷却した。ウェルをＴＳＥ緩衝 液で２回洗浄し、そして抗原（酵素）溶液１５０μＬを各ウェルに添加した。連 続希釈はＴＳＥ緩衝液で行われた。抗原溶液を基質コーティングと４°Ｃで１時 間平衡化した。次に逆さにすることによりウェルを空にし、モしてＴＳＥ緩衝液 で２回洗浄した。抗ペプチド抗体溶液１５０μＬを次に添加した。抗体希釈物は エリザメートキットからの希釈剤／ブロッキング溶液を用いて作成された。最初 に抗体を４℃で３時間保温した。プレートを次に洗浄溶液で２回洗浄した。ヤギ 抗つサギーパーオキシダーゼ複合体０．５μｇ／ｍＬ溶液１５０μＬを添加し、 そして４℃で３時間保温した。プレートを２回洗浄し、最後に洗浄溶液中に５分 間浸漬した。次にプレートを空にし、そして発色試薬を添加した。発色は１０分 間行われ、プレートをタイターチック・マルチスキャン・リーダーにより４０５ ｎｍでスキャンした。

結　果 アフィニティー精製化抗ペプチド抗体はヒトメラノーマ細胞■型プロコラーゲナ ーゼのアミノ末端配列ならびにカルボキシ末端の１５９残基から始まる内部ドメ インのアミノ酸配列に対して調製された。これらのペプチド配列は、それらが酵 素の直接配列決定において得られ（）Ｉｏｈｙｔａ等、１９１３３；　Ｃｏ１１ ｉｅｒ等、　１９８８）　、ｃＤＮＡクローンからの予測配列において確認され （Ｃｏ１１ｉｅｒ等、１９８８）、そして図２に示されるように、その他の関連 メタロプロテイナーゼとの相同性を示さない領域から誘導されているので、選択 された。アフィニティー精製化抗体は直接エリザならびに競合実験を用いて特徴 づけられた（図３Ａ−３Ｃ）。抗体はウシ血清または非関連ペプチドと交差反応 性を示さなかった。

抗■型プロコラーゲナーゼ抗体およびパーオキシダーゼ標識複合抗体の最適濃度 は酵素供給源として濃縮メラノーマ細胞調整培地を用いるチェッカーボード分析 により得られた。このデータから１／３２０の最適希釈がアフィニティー精製化 抗体Ａｌ−１７に対して選択された。

抗体Ａ４７２−４９０はこのアッセイ婦作において顕著な発色を示さなかった。

この観察をイムノプロット実験において酵素を検出するための前記抗体Ａ４７２ −４９０の能力と調和させる試みにおいて、本発明者等はこの抗体のためのエピ トープが天然の可溶性酵素配置で利用されないと結論づけた。複合抗体濃度は０ ．５μｇ　／　ｍＬで最適であり、そしてこの濃度は残りの実験に対して使用さ れた。

■型コラーゲナーゼは、酵素活性にカルシウムイオンを必要とする中性メタロプ ロテイナーゼ酵素である（Ｌｉｏｔｔａ等、　１９７９；　Ｌｉｏｔｔａ等、　 １９８１）　、このアッセイにおいて基質分解の可能な影響を調べるために、本 発明者等はカルシウムイオンを排除し、そして緩衝液中にこのおよびその他の中 性メタロプロテイナーゼの阻害剤であるＥＤＴＡを包含する影響を試験した（Ｉ Ｉ４Ａ）。カルシウムイオンの排除だけが、全体の発色により評価されるような 酵素検出において顕著な増加を示した。低濃度のＥＤＴＡ（１０μＭ）の包含は 、カルシウムを排除しただけの緩衝液に比べた場合、発色に顕著な増加を示した 。

温度の影響もまた評価された。２５℃で行われた場合に得られた結果と比較され るとき、実験が４℃で行われた場合、光学濃度測定値がより高く、酵素捕獲の効 率がより高いことを示した（図４Ｂ）。

開発されたアッセイの感度は高度に精製された■型コラーゲナーゼの試料を用い て試験された。高度に精製された■型コラーゲナーゼの貯蔵溶液５ｍｇ／ｍＬの 連続希釈物は基質捕獲法を用いてアッセイされた。図５に示された結果は、この 方法は試料容量が１５０μＬまで制限されている場合に０．３ｎｇ／μＬに相当 する精製■型コラーゲナーゼ５０ｎｇという少量を検出し得ることを示す。アッ セイの特異性は精製されたヒトリュウマチ滑液繊維芽コラーゲナーゼおよびスト ロメリシンの試料を用いて試験された。図６に示されるように、これらの酵素は この系において■型コラーゲナーゼ抗体と交差反応しなかった。アッセイの再現 性は酵素供給源として調整培地を用いて試験された（図６）。これらの試験は同 一プレート上でのまたはことなる日に異なるセットの希釈からの結果の比較を可 能にした。これらの結果は、アッセイが高感度であるだけでなく、高度に再現性 のあることを示す。

本発明者等は■型コラーゲナーゼの定量のための再現性のある高感度アッセイを 設計し、そして開発した。アッセイ原理は捕獲がこの酵素に対する別の基質、ゼ ラチンを用いて行われることを除いて「サンドイッチ」型アブセイの原理と実質 的に同一である。エリザプレートウェルのゼラチンコーティングは溶液から■型 コラーゲナーゼの吸着を可能にする。固定化酵素は次にアフィニティー精製化抗 ペプチド抗体およびヤギ抗ウサギ抗体−パーオキシダーゼ複合体の添加により検 出される。

この新規方法は抗原（酵素）を捕獲するためのプロテアーゼ基質を使用する。こ の方法は当該酵素ならびにその他のゼラチン結合性タンパク質の特異的吸着を可 能にする。これは混合物を単純化し、その中で、酵素が検出され、そして潜在的 に基質を阻害する物質を除去し、それにより固相上に直接抗原または抗体のコー ティングを必要とする通常のアッセイプロトコルに間有の困難さのいくつかを排 障する。

酵素検出はＥＤＴＡを添加して、または添加せずにカルシウムイオンの不在下で 高められる。メタロブロティナーゼ活性はカルシウムイオンの存在を必要とする ので、これらの結果は、カルシウムイオンの不在下で見られた改良された検出が 基質（ゼラチン）分解の阻害に起因することを示唆する。基質分解は切断生成物 を生じ、そして捕獲された酵素はプレートから洗浄され、結果として発色が消失 される。この基質分解作用はまた、アッセイの温度依存性の研究において観察さ れる。すなわち、より低い発色がより高いアッセイ温度で得られた。

カルシウムイオンに依存した酵素検出の低下の観察はさらに、■型コラーゲナー ゼのゼラチン結合性ドメインが活性部位と異なり、前者がカルシウム非依存性で あり、そして後者がカルシウムイオンであることを示唆する。

この方法は調整培地中で■型コラーゲナーゼを検出し得、そして異なる細胞株に より分泌される酵素のレベルならびに酵素分泌への種々の薬剤の影響を評価する ために有用であろう。ヒト血清試料に対する予彎的研究（データは示していない ）はこのアッセイが悪性肺癌を存する織入の患者からの試料中に■型コラーゲナ ーゼを検出し得ることを示した。このアッセイは、特定の癌のスクリーニングな らびに治療されている患者の臨床的追跡検査に有用であること示し得る。

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Ｍ、Ｐ、、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、工、Ｍ、に、、ａｎｄ　Ｌｉｏｔｔａ、Ｌ、Ａ 、（１９Ｂ９）　ＴｈｅＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｙｐｅ　 ＩＶ　ＣｏｌｌａｇＣｏｌｌａ　Ｐｒｏｅｎｚｙｍｅ。

５ｅｑｕａｎｃｅ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍａｊｏｒ 　Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　Ｐｒｏｄｕｃｔｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　Ｏｒｇａｎｏｒ ａｅｒｃｕｒｉａｌ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈａｍ、　 ２６４゜１コ５コ。

Ｖａｎ　Ｗａａｎｍａｎ、Ｂ、に、ａｎｄ　５ｃｈｏｒｒｓ、Ａ、Ｈ，Ｗ、Ｍ、 、（１９７１）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｕｓｉｎｇ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｅｎｚ ｙｍｅ　ｃｏｎコｕｇａｔａ、　ＦＥＢＳ　Ｌａｔｔ、１５゜２３２゜ 図　１ Ｅ２２２２２Ｓ１　ｌ利との甚ごＶフ−〒＜　〉？”図　２ ７ミノ　ｆ鴇　（へＣア千ド　１−１７）ＹＰＬＤ　ＡＡＲＧＩ：ＤＴ　フ＃。

スシ口〆リシ〉図３Ａ ツーティ〉γキ友／Ｐ、　（ツ） 、１　１　１０　１００　１０００ コーチづ〉７°°字友陣・（す） 図　５ 要　約　書 図ら マドｌ”ｔ　７又メ？Ｏフ０ロ子イす−ｔ“　’／’ｌ　１ｗ＋９　）補正書の 翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）請　求　の　範　囲 １．　固体支持体に結合されているが、ただし放射標識されていないゼラチンに 結合された■型コラーゲナーゼを含有する組成物。

λ　固体支持体が微量滴定プレートである請求項１記載の組成物。

＆　以下の段階： （１）　ゼラチンが結合されている固体支持体を、■型コラーゲナーゼを含むこ とが予想される体液試験試料に暴露し、 （２）　当該コラ−ゲナーゼに対する抗体に請求項１記載の生成物を暴露し、 （３）抗体−バーオキシダーゼ複合体の抗体が当該コラ−ゲナーゼに結合されて いる抗体と反応性であると知られている前記複合体に段階（２）の生成物を暴露 し、（４）　段階（３）の生成物をパーオキシダーゼ発色試薬に暴露し、そして （５）　パーオキシダーゼ発色試薬に応答する発色を観察して支持体に結合され た第２の抗体の量を決定する、からなる■型コラーゲナーゼの検出方法。

４、　以下の段階。

（１）　ゼラチンを固体基質に結合し、（２）　異なる量の■型コラーゲナーゼ または当該コラ−ゲナーゼを含むことが予想される試験試料に段階（１）の基質 を暴露し、 （３）抗原への抗体の結合を高める条件下で当該コラ−ゲナーゼに対する公知抗 体に段階（２）の生成物を暴露し、（４）　当該コラ−ゲナーゼに対する抗体に 結合するであろう抗体−バーオキシダーゼ複合体に段階（３）の生成物を暴露し 、 （５）段階（４）からの生成物をパーオキシダーゼ発色試薬に暴露し、そして （６）　既知量の当該コラ−ゲナーゼを有する基質と試験試料における応答を比 較する、 ＆　ゼラチンが非放射標識ゼラチンである請求項４記載の方法。

６、　カルシウムイオンの不在下で行われる請求項５記載の方法。

国際調査報告 １−１＋＋、ｌｌ・＋、ＨＩ　Ａ＋＋ｋ　ＩＩ−区わ゛ＰＣＴ／ＩＪＳ９１１０ ０５２１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．固体支持体に結合されているゼラチンに結合されたコラーゲナーゼを含有す る組成物。 ２．コラーゲナーゼが精製されたポリペプチドである請求項１記載の組成物。 ３．固体支持体が微量滴定プレートである請求項１記載の組成物。 ４．以下の段階： （１）ゼラチンが結合されている固体支持体を、ＩＶ型コラーゲナーゼを含むこ とが予想される体液試験試料に暴露し、 （２）当該コラーゲナーゼに対する抗体に請求項１記載の生成物を暴露し、 （３）抗体−パーオキシダーゼ複合体の抗体が当該コラーゲナーゼに結合されて いる抗体と反応性であると知られている前記複合体に段階（２）の生成物を暴露 し、（４）段階（３）の生成物をパーオキシダーゼ発色試薬に暴露し、そして （５）パーオキシダーゼ発色試薬に応答する発色を観察して支持体に結合された 第２の抗体の量を決定する、からなるＩＶ型コラーゲナーゼの検出方法。 ５．以下の段階： （１）ゼラチンを固体基質に結合し、 （２）異なる量のコラーゲナーゼまたは当該コラーゲナーゼを含むことが予想さ れる試験試料に段階（１）の基質を暴露し、 （３）抗原への抗体の結合を高める条件下で当該コラーゲナーゼに対する公知抗 体に段階（２）の生成物を暴露し、（４）当該コラーゲナーゼに対する抗体に結 合するであろう抗体−パーオキシダーゼ複合体に段階（３）の生成物を暴露し、 （５）段階（４）からの生成物をパーオキシダーゼ発色試薬に暴露し、そして （６）既知量の当該コラーゲナーゼを有する基質と試験試料における応答を比較 する、 からなる体液中のコラーゲナーゼを定量的に検出する方法。