JPH1080272A - 雑種細胞系の使用方法 - Google Patents
雑種細胞系の使用方法Info
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- JPH1080272A JPH1080272A JP9192727A JP19272797A JPH1080272A JP H1080272 A JPH1080272 A JP H1080272A JP 9192727 A JP9192727 A JP 9192727A JP 19272797 A JP19272797 A JP 19272797A JP H1080272 A JPH1080272 A JP H1080272A
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- cell line
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6448—Elastases, e.g. pancreatic elastase (3.4.21.36); leukocyte elastase (3.4.31.37)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 血清および糞便中のエラスターゼ1を測定す
るに充分な感度を有し、急性および慢性の両方の膵炎の
診断のためにヒトエラスターゼ1を測定することが可能
なテスト方法を開発すること。 【解決手段】 抗エラスターゼ1抗体を調製するために
用いる、申請番号 ECACC90 121 90 6 を有する雑種細胞
系の使用方法、これから得られる抗エラスターゼ1抗
体、および該抗体を少なくとも1種類含む免疫学的テス
トキット。
るに充分な感度を有し、急性および慢性の両方の膵炎の
診断のためにヒトエラスターゼ1を測定することが可能
なテスト方法を開発すること。 【解決手段】 抗エラスターゼ1抗体を調製するために
用いる、申請番号 ECACC90 121 90 6 を有する雑種細胞
系の使用方法、これから得られる抗エラスターゼ1抗
体、および該抗体を少なくとも1種類含む免疫学的テス
トキット。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、雑種細胞系の使用
方法、該方法により得られる抗体及びこの抗体を用いる
テストキットに関する。
方法、該方法により得られる抗体及びこの抗体を用いる
テストキットに関する。
【0002】
【従来の技術】膵臓の炎症性疾患の症例は工業国におい
て増加し続けている(W.Rosch,Deutsches Arzteblatt 8
4: C-397-398, 1987)。この種の疾患は一般的に間欠性
の経過を辿り、最終的には腺の完全な欠損に至る。急性
の発作(episodes)は酷い腹痛および悪心により認識さ
れるが、中間相では、通常患者は痛みが引くのを経験す
る。これらの疾患は、特徴の無い消化系の愁訴を伴うだ
けなので、それを認識することは困難である。そこで、
全ての消化系の不調に対して慢性膵臓疾患の疑いが持た
れる。
て増加し続けている(W.Rosch,Deutsches Arzteblatt 8
4: C-397-398, 1987)。この種の疾患は一般的に間欠性
の経過を辿り、最終的には腺の完全な欠損に至る。急性
の発作(episodes)は酷い腹痛および悪心により認識さ
れるが、中間相では、通常患者は痛みが引くのを経験す
る。これらの疾患は、特徴の無い消化系の愁訴を伴うだ
けなので、それを認識することは困難である。そこで、
全ての消化系の不調に対して慢性膵臓疾患の疑いが持た
れる。
【0003】現在まで、膵炎の検査室的診断において
は、血清アミラーゼレベルの測定が通常用いられてき
た。しかし、血清アミラーゼの上昇は、他の腹腔内の炎
症、例えば腸穿孔、おたふくかぜ、または腎不全によっ
ても起こる。さらに、血清アミラーゼレベルの上昇はモ
ルヒネの投与後にも観察され得る。他の検査室的診断と
しては、急性膵炎において上昇する、クレアチニンクリ
アランスに対するアミラーゼの比率の測定による診断が
可能である。残念なことに、急性膵炎により上昇したア
ミラーゼ値は急速に正常化するので、患者の3人に1人
の割合で、疾患にかかった48時間後にはすでに正常値
が測定される(J. A. Eckfeldt ら, Arch. Pathol. La
b. Med.109:316-319, 1985)。
は、血清アミラーゼレベルの測定が通常用いられてき
た。しかし、血清アミラーゼの上昇は、他の腹腔内の炎
症、例えば腸穿孔、おたふくかぜ、または腎不全によっ
ても起こる。さらに、血清アミラーゼレベルの上昇はモ
ルヒネの投与後にも観察され得る。他の検査室的診断と
しては、急性膵炎において上昇する、クレアチニンクリ
アランスに対するアミラーゼの比率の測定による診断が
可能である。残念なことに、急性膵炎により上昇したア
ミラーゼ値は急速に正常化するので、患者の3人に1人
の割合で、疾患にかかった48時間後にはすでに正常値
が測定される(J. A. Eckfeldt ら, Arch. Pathol. La
b. Med.109:316-319, 1985)。
【0004】リパーゼの測定は別の診断法の可能性を提
示する。しかしながら、リパーゼまたはアミラーゼのど
ちらの測定も、慢性膵炎を検知するには適していない。
従来、この疾患は、糞便中の膵臓酵素であるキモトリプ
シンの活性を測定することによって、不十分に立証され
てきただけである。この測定方法の欠点は、膵臓により
排出されるキモトリプシンの一部しか検出できず、しか
もその一部のものも非常に広範な彷徨変異を免れないこ
とである(Goldberg ら, Gut 10:477-483, 1969)。この
ことが正常値の測定を極端に困難にしている。
示する。しかしながら、リパーゼまたはアミラーゼのど
ちらの測定も、慢性膵炎を検知するには適していない。
従来、この疾患は、糞便中の膵臓酵素であるキモトリプ
シンの活性を測定することによって、不十分に立証され
てきただけである。この測定方法の欠点は、膵臓により
排出されるキモトリプシンの一部しか検出できず、しか
もその一部のものも非常に広範な彷徨変異を免れないこ
とである(Goldberg ら, Gut 10:477-483, 1969)。この
ことが正常値の測定を極端に困難にしている。
【0005】A. Sziegoleit の論文(Biochem. J. 219:
735-742, 1984)に記されているように、膵臓エラスタ
ーゼ1(E1)、別名プロテアーゼEは膵臓だけで形成
され、そして消化液と共に十二指腸内に分泌される。糞
便中の前記酵素のレベルはキモトリプシン活性よりも実
質的に良好に膵臓の外分泌機能を表すことから、既述の
欠点を避けるために、糞便中のエラスターゼ1のレベル
を測定する試みが既に行われている(A. Sziegoleit
ら, Clin. Biochem. 22:85-89, 1989)。
735-742, 1984)に記されているように、膵臓エラスタ
ーゼ1(E1)、別名プロテアーゼEは膵臓だけで形成
され、そして消化液と共に十二指腸内に分泌される。糞
便中の前記酵素のレベルはキモトリプシン活性よりも実
質的に良好に膵臓の外分泌機能を表すことから、既述の
欠点を避けるために、糞便中のエラスターゼ1のレベル
を測定する試みが既に行われている(A. Sziegoleit
ら, Clin. Biochem. 22:85-89, 1989)。
【0006】また、血清中のE1を測定することによっ
て急性膵炎を検知できることも見いだされている(A. S
ziegoleit ら, Clin. Biochem. 22:79-83, 1989)。
て急性膵炎を検知できることも見いだされている(A. S
ziegoleit ら, Clin. Biochem. 22:79-83, 1989)。
【0007】現在までのところ、他の酵素と異なり、E
1は腸を通過する際に分解されないか、単に非実質的に
分解されると考えられている。従って、糞便中の前記酵
素のレベルは膵臓の外分泌機能の程度を示す。さらにま
た、この酵素は急性膵臓疾患相においては血流にも入
る。
1は腸を通過する際に分解されないか、単に非実質的に
分解されると考えられている。従って、糞便中の前記酵
素のレベルは膵臓の外分泌機能の程度を示す。さらにま
た、この酵素は急性膵臓疾患相においては血流にも入
る。
【0008】血清エラスターゼ1を測定するための放射
免疫学的テストが既に利用されている(A. Murata ら,
Enzyme 30:29-37, 1983; エラスターゼ−1−RIA−
キット, Abbott Diagnostic)。
免疫学的テストが既に利用されている(A. Murata ら,
Enzyme 30:29-37, 1983; エラスターゼ−1−RIA−
キット, Abbott Diagnostic)。
【0009】しかし、そのような放射性物質による測定
(放射免疫検定;RIA)は、放射性試薬が限られた安
定性しか有しないために、連続的に再合成される必要が
あるという欠点を有している。さらに、放射性物質は注
意深く貯蔵しなければならず、また、放射性物質の測定
には特別に訓練された人間および特別な試験器材が必要
である。加えて、このテストを用いて糞便中のE1レベ
ルを測定することは不可能であるか、もしくは不十分に
しか可能ではない。
(放射免疫検定;RIA)は、放射性試薬が限られた安
定性しか有しないために、連続的に再合成される必要が
あるという欠点を有している。さらに、放射性物質は注
意深く貯蔵しなければならず、また、放射性物質の測定
には特別に訓練された人間および特別な試験器材が必要
である。加えて、このテストを用いて糞便中のE1レベ
ルを測定することは不可能であるか、もしくは不十分に
しか可能ではない。
【0010】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、血清および糞便中のエラスターゼ1を測定するに充
分な感度を有し、急性および慢性の両方の膵炎の診断の
ためにヒトエラスターゼ1を測定することが可能なテス
ト方法を開発することである。
は、血清および糞便中のエラスターゼ1を測定するに充
分な感度を有し、急性および慢性の両方の膵炎の診断の
ためにヒトエラスターゼ1を測定することが可能なテス
ト方法を開発することである。
【0011】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、この目
的はアミノ酸配列 Thr-Met-Val-Ala-Gly-Gly-Asp-Ile-
Arg を有するエピトープに対する抗体により達成され
る。驚くべきことに、ヒトエラスターゼ1のこのエピト
ープに対する抗体は、標識酵素を選択的に認識し、それ
により他の抗原を識別することが判明した。
的はアミノ酸配列 Thr-Met-Val-Ala-Gly-Gly-Asp-Ile-
Arg を有するエピトープに対する抗体により達成され
る。驚くべきことに、ヒトエラスターゼ1のこのエピト
ープに対する抗体は、標識酵素を選択的に認識し、それ
により他の抗原を識別することが判明した。
【0012】従って本発明はまた、慣用法により抗エラ
スターゼ抗体を調製するための、抗原として予め定義さ
れたエピトープを用いることを特徴とする方法にも関す
る。本発明によれば、このエピトープの一部および断片
が免疫応答を引き起こすならば、それらを抗体の免疫お
よび調製のために用いることも可能である。そのような
断片は、合成によっても、エラスターゼ1の化学的およ
び/または生物学的な分解によっても得ることができ
る。本発明の方法においては、必要に応じてスペーサー
を用いてペプチドあるいはペプチドの一部を担体に結合
することが適切であることが判明した。適切な担体は当
業者には公知であり、それらは例えば合成膜材もしくは
天然膜材、ポリサッカライド、ペプチドまたはタンパク
質である。アルブミンならびにヘモシアニンが特に好ま
しい。用いられるスペーサーも当業者には公知である。
本発明によれば、前記エピトープまたはその断片を用い
て、選択的モノクローナル抗体および選択的ポリクロー
ナル抗体を共に得ることが可能である。本発明による好
ましい抗体はパラフィン包埋した薄い切片を認識するこ
とができる。
スターゼ抗体を調製するための、抗原として予め定義さ
れたエピトープを用いることを特徴とする方法にも関す
る。本発明によれば、このエピトープの一部および断片
が免疫応答を引き起こすならば、それらを抗体の免疫お
よび調製のために用いることも可能である。そのような
断片は、合成によっても、エラスターゼ1の化学的およ
び/または生物学的な分解によっても得ることができ
る。本発明の方法においては、必要に応じてスペーサー
を用いてペプチドあるいはペプチドの一部を担体に結合
することが適切であることが判明した。適切な担体は当
業者には公知であり、それらは例えば合成膜材もしくは
天然膜材、ポリサッカライド、ペプチドまたはタンパク
質である。アルブミンならびにヘモシアニンが特に好ま
しい。用いられるスペーサーも当業者には公知である。
本発明によれば、前記エピトープまたはその断片を用い
て、選択的モノクローナル抗体および選択的ポリクロー
ナル抗体を共に得ることが可能である。本発明による好
ましい抗体はパラフィン包埋した薄い切片を認識するこ
とができる。
【0013】本発明による抗体を含有する抗血清は、実
験動物を高純度のヒトエラスターゼ1または該酵素の断
片で免疫することにより得ることができる。その際、実
験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギまたはウ
マは慣用法により免疫されるので、ポリクローナル抗体
を含有する抗血清が得られ、該抗血清から慣用法により
本発明による抗体を得ることもできる。本発明による好
ましい抗体はパラフィン包埋した薄い切片を認識するこ
とができる。
験動物を高純度のヒトエラスターゼ1または該酵素の断
片で免疫することにより得ることができる。その際、実
験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギまたはウ
マは慣用法により免疫されるので、ポリクローナル抗体
を含有する抗血清が得られ、該抗血清から慣用法により
本発明による抗体を得ることもできる。本発明による好
ましい抗体はパラフィン包埋した薄い切片を認識するこ
とができる。
【0014】好ましい実施態様において、本発明による
エピトープを用いた G. Kohler および C. Milstein (N
ature 256:495-497, 1975) の方法により、モノクロー
ナル抗体を適切に得ることができる。
エピトープを用いた G. Kohler および C. Milstein (N
ature 256:495-497, 1975) の方法により、モノクロー
ナル抗体を適切に得ることができる。
【0015】従って、本発明のさらなる目的は、E1と
特異的に結合し得るモノクローナル抗体である。そのよ
うな抗体は以下の手順により得られる。マウスまたはラ
ットを高純度のE1あるいは本発明により用いられるエ
ピトープで免疫し、該免疫動物の脾臓由来のBリンパ球
を骨髄腫細胞と融合し、形成された雑種細胞をクローニ
ングして、E1と結合し得る抗体を分泌する雑種細胞を
クローニングおよび培養することにより、それらにより
形成されるモノクローナル抗体が得られる。
特異的に結合し得るモノクローナル抗体である。そのよ
うな抗体は以下の手順により得られる。マウスまたはラ
ットを高純度のE1あるいは本発明により用いられるエ
ピトープで免疫し、該免疫動物の脾臓由来のBリンパ球
を骨髄腫細胞と融合し、形成された雑種細胞をクローニ
ングして、E1と結合し得る抗体を分泌する雑種細胞を
クローニングおよび培養することにより、それらにより
形成されるモノクローナル抗体が得られる。
【0016】それ自身は免疫グロブリンをまったく産生
しない細胞系を用いることが特に好ましい。
しない細胞系を用いることが特に好ましい。
【0017】本発明により得られるモノクローナル抗体
はE1特異性であり、E1以外の物質とは反応しない。
本発明によるモノクローナル抗体はパラフィン包埋した
薄い切片を認識し得ることが好ましい。
はE1特異性であり、E1以外の物質とは反応しない。
本発明によるモノクローナル抗体はパラフィン包埋した
薄い切片を認識し得ることが好ましい。
【0018】本発明による好ましい抗体は、ヨーロピア
ン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャー
ズ(the European Collection of Animal Cell Culture
s:ECACC)、ワクチン・リサーチ・アンド・プロ
ダクション・ラボラトリー( Vaccine Research and P
roduction Laboratory)、パブリック・ヘルス・アンド
・ラボラトリ・サービス(Public Health and Laborato
ry Service)、センター・フォー・アプライド・マイク
ロバイオロジー・アンド・リサーチ(Center for Appli
edMicrobiology and Research, Porton Down, GB Salis
bury, Wiltshire SP4 OJG)に1990年12月21日に
申請され、申請番号 90 121 90 6および 90 121 90 7
が与えられている雑種細胞系から入手可能である。これ
らの細胞系から得られる抗体は共に、パラフィン包埋し
た薄い切片を認識することができる。
ン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャー
ズ(the European Collection of Animal Cell Culture
s:ECACC)、ワクチン・リサーチ・アンド・プロ
ダクション・ラボラトリー( Vaccine Research and P
roduction Laboratory)、パブリック・ヘルス・アンド
・ラボラトリ・サービス(Public Health and Laborato
ry Service)、センター・フォー・アプライド・マイク
ロバイオロジー・アンド・リサーチ(Center for Appli
edMicrobiology and Research, Porton Down, GB Salis
bury, Wiltshire SP4 OJG)に1990年12月21日に
申請され、申請番号 90 121 90 6および 90 121 90 7
が与えられている雑種細胞系から入手可能である。これ
らの細胞系から得られる抗体は共に、パラフィン包埋し
た薄い切片を認識することができる。
【0019】本発明の別の目的は、本発明によるE1特
異性抗体をE1の定性的および/または定量的な測定に
使用することである。それによって、この抗体を用いて
体液もしくは糞便中のエラスターゼ1を特異的に検出す
ることが可能である。従って、本発明はまた、本発明に
よる抗体を含むテストキット、特に体液および/または
糞便を用いて慢性膵炎、急性膵炎および膵繊維症を診断
ならびに経過観察するための免疫学的テストキットにも
関する。適切な体液は血液、血漿および血清である。
異性抗体をE1の定性的および/または定量的な測定に
使用することである。それによって、この抗体を用いて
体液もしくは糞便中のエラスターゼ1を特異的に検出す
ることが可能である。従って、本発明はまた、本発明に
よる抗体を含むテストキット、特に体液および/または
糞便を用いて慢性膵炎、急性膵炎および膵繊維症を診断
ならびに経過観察するための免疫学的テストキットにも
関する。適切な体液は血液、血漿および血清である。
【0020】間接法、競合法およびサンドイッチ法を用
いる種々のELISAが、血液、血漿、血清または糞便
中のE1を検出するために実験に取り入れられた。しか
し、サンドイッチ法を用いたELISAが大量の試料の
迅速な診断に最も適していることが判明した。これは、
サンドイッチ法を用いたELISAが計算できない他の
血清因子から独立しているためである。この目的のため
には、前記酵素エラスターゼ1の異なるエピトープに対
する、少なくとも2種類の異なるモノクローナル抗体が
必要である。
いる種々のELISAが、血液、血漿、血清または糞便
中のE1を検出するために実験に取り入れられた。しか
し、サンドイッチ法を用いたELISAが大量の試料の
迅速な診断に最も適していることが判明した。これは、
サンドイッチ法を用いたELISAが計算できない他の
血清因子から独立しているためである。この目的のため
には、前記酵素エラスターゼ1の異なるエピトープに対
する、少なくとも2種類の異なるモノクローナル抗体が
必要である。
【0021】血清または糞便中の酵素の値の変化は、例
えばそのようなテストにより明示することができ、特に
膵臓の状態が変化した場合にはそれらの変位の出現によ
り明示され得る。
えばそのようなテストにより明示することができ、特に
膵臓の状態が変化した場合にはそれらの変位の出現によ
り明示され得る。
【0022】免疫検定法の原理に基づく測定方法は広範
に発達してきた。これらの測定方法の利点には、精密度
および迅速性(非常な信頼性および試料処理)並びに
(ナノグラム単位の)微量の物質を検出し得る可能性が
包含される。この測定を行うために、ホモジニアスおよ
びヘテロジニアスな相の両方を用いた種々の変法が可能
である。ヘテロジニアスな相を用いた実施態様において
は受容体の一つを担体に結合する。サンドイッチ法にお
いては、例えば第一の抗体を受容体、あるいは別名キャ
ッチャー(catcher)として担体に結合し、そしてテス
ト溶液を添加し、それによってテスト溶液中の測定すべ
き抗原が選り出されて抗体と結合する。次に、前記抗原
もしくは前記抗原と受容体との複合体と特異的に反応す
る第二の標識抗体を添加する。そして、標準溶液(単
離、精製したヒトエラスターゼ1)を補助として、第二
の抗体を標識することにより抗原の量を測定することが
できる。
に発達してきた。これらの測定方法の利点には、精密度
および迅速性(非常な信頼性および試料処理)並びに
(ナノグラム単位の)微量の物質を検出し得る可能性が
包含される。この測定を行うために、ホモジニアスおよ
びヘテロジニアスな相の両方を用いた種々の変法が可能
である。ヘテロジニアスな相を用いた実施態様において
は受容体の一つを担体に結合する。サンドイッチ法にお
いては、例えば第一の抗体を受容体、あるいは別名キャ
ッチャー(catcher)として担体に結合し、そしてテス
ト溶液を添加し、それによってテスト溶液中の測定すべ
き抗原が選り出されて抗体と結合する。次に、前記抗原
もしくは前記抗原と受容体との複合体と特異的に反応す
る第二の標識抗体を添加する。そして、標準溶液(単
離、精製したヒトエラスターゼ1)を補助として、第二
の抗体を標識することにより抗原の量を測定することが
できる。
【0023】本発明の別の好ましい実施態様において
は、第一の抗体を、膜、薄葉紙または流れ(flowing)
構造の担体マトリックスに受容体として結合するので、
この抗体はELISA免疫プレートの凹凸の通常の床部
とならず、かわりにマトリックスと結合して存在する。
好ましいマトリックスは、イオン交換基を有する特別な
態様の微小孔性平面膜あるいは中空繊維膜である。微小
孔性の平面膜、例えばポウル社(Pall Corp., New Jers
ey, USA)から市販されている膜等が、この目的のため
に好適に用いられる。本発明により用いられる中空繊維
膜も市場で入手でき、例えばセプラカー社(Sepracor
Inc. Mass., USA)から市販されている。このような担
体材料を用いて、特に迅速かつ簡単な検出法を開発する
ことができる。
は、第一の抗体を、膜、薄葉紙または流れ(flowing)
構造の担体マトリックスに受容体として結合するので、
この抗体はELISA免疫プレートの凹凸の通常の床部
とならず、かわりにマトリックスと結合して存在する。
好ましいマトリックスは、イオン交換基を有する特別な
態様の微小孔性平面膜あるいは中空繊維膜である。微小
孔性の平面膜、例えばポウル社(Pall Corp., New Jers
ey, USA)から市販されている膜等が、この目的のため
に好適に用いられる。本発明により用いられる中空繊維
膜も市場で入手でき、例えばセプラカー社(Sepracor
Inc. Mass., USA)から市販されている。このような担
体材料を用いて、特に迅速かつ簡単な検出法を開発する
ことができる。
【0024】上記した一般的原理につては種々の変法が
可能である。例えば、3種の受容体を用い、3種の受容
体の内の1種をヘテロジニアスな相に存在させ、他の2
種の受容体を溶解して測定することが可能である。2種
の可溶性受容体の内の1種を標識し、もう一方は標識し
ない。次に、可溶性受容体は非標識受容体に向けられ
る。
可能である。例えば、3種の受容体を用い、3種の受容
体の内の1種をヘテロジニアスな相に存在させ、他の2
種の受容体を溶解して測定することが可能である。2種
の可溶性受容体の内の1種を標識し、もう一方は標識し
ない。次に、可溶性受容体は非標識受容体に向けられ
る。
【0025】本発明によるE1特異性抗体を免疫検定法
の原理に基づくE1の選択的定量的測定のために使用す
る際には、少なくとも2種の異なる受容体と共にインキ
ュベートする。両方の受容体、例えば2種のモノクロー
ナル抗体はE1特異性でなければならず、如何なる場合
においても異なるエピトープ(結合部位)と結合する必
要がある。
の原理に基づくE1の選択的定量的測定のために使用す
る際には、少なくとも2種の異なる受容体と共にインキ
ュベートする。両方の受容体、例えば2種のモノクロー
ナル抗体はE1特異性でなければならず、如何なる場合
においても異なるエピトープ(結合部位)と結合する必
要がある。
【0026】2種の受容体の内の1種を固相に結合す
る。固相との結合は当業者に公知の常法により行われ
る。さらに、可溶性の形態で存在する少なくとも1種の
他の受容体が用いられる。
る。固相との結合は当業者に公知の常法により行われ
る。さらに、可溶性の形態で存在する少なくとも1種の
他の受容体が用いられる。
【0027】該他の受容体は標識を有している。多種の
受容体を用いる際には、その内の1種類だけが標識を有
する。受容体の標識は、当業者に公知の常法により行わ
れる。本発明によるテストキットにおける標識は慣用
法、特に放射性標識、ビオチン結合(ビオチン/アビジ
ン)、計測可能な反応を起こす酵素、または化学発光化
合物あるいは蛍光化合物により行われる。酵素による標
識は特に好ましく、とりわけパーオキシダーゼまたはフ
ォスファターゼによる標識が好ましい。特別な実施態様
においては、酵素による標識がこの抗体の第二酵素増幅
システムへの導入をも可能にする(C. J. Stanley; F.
Paris; A. Plumb; A. Webb; A. Johansson, American
Biotechnology Laboratory: May-June 1985; C. H. Sel
f, J. Immunol. Meth., 1985)。
受容体を用いる際には、その内の1種類だけが標識を有
する。受容体の標識は、当業者に公知の常法により行わ
れる。本発明によるテストキットにおける標識は慣用
法、特に放射性標識、ビオチン結合(ビオチン/アビジ
ン)、計測可能な反応を起こす酵素、または化学発光化
合物あるいは蛍光化合物により行われる。酵素による標
識は特に好ましく、とりわけパーオキシダーゼまたはフ
ォスファターゼによる標識が好ましい。特別な実施態様
においては、酵素による標識がこの抗体の第二酵素増幅
システムへの導入をも可能にする(C. J. Stanley; F.
Paris; A. Plumb; A. Webb; A. Johansson, American
Biotechnology Laboratory: May-June 1985; C. H. Sel
f, J. Immunol. Meth., 1985)。
【0028】本法の特に好ましい実施態様においては、
E1と非特異的に結合し得る受容体、または好ましくは
E1と特異的に結合し得る受容体のどちらかを固相に結
合させる。固相と結合したこの受容体は、次に、測定さ
れるE1を含む溶液、および可溶性の形態で存在しかつ
標識された、E1と特異的に結合し得る抗体と共にイン
キュベートされる。
E1と非特異的に結合し得る受容体、または好ましくは
E1と特異的に結合し得る受容体のどちらかを固相に結
合させる。固相と結合したこの受容体は、次に、測定さ
れるE1を含む溶液、および可溶性の形態で存在しかつ
標識された、E1と特異的に結合し得る抗体と共にイン
キュベートされる。
【0029】固相に結合した受容体がE1と非特異的に
結合し得る場合には、E1だけでなく他の抗原も固相と
複合体を形成する。E1と特異的に結合し得る第二の抗
体は、それにも拘らずE1とだけ複合体を形成するの
で、E1分子だけが特に標識抗体を有し、他の抗原は標
識されない。固相を液相から分離した後に、このように
して標識物を計測することでE1の内容量を測定するこ
とができる。
結合し得る場合には、E1だけでなく他の抗原も固相と
複合体を形成する。E1と特異的に結合し得る第二の抗
体は、それにも拘らずE1とだけ複合体を形成するの
で、E1分子だけが特に標識抗体を有し、他の抗原は標
識されない。固相を液相から分離した後に、このように
して標識物を計測することでE1の内容量を測定するこ
とができる。
【0030】E1と特異的に結合し得る第一の受容体が
固相に固定されている場合には、E1だけが特異的に固
相に結合する。可溶性のE1特異性の第二の受容体また
は抗体と共にインキュベートする間に、該抗体もE1だ
けと反応する。従って他の抗原は固相と殆ど結合しない
ために、この方法は非常に特異的であり、それにより非
常に精密な測定が可能である。これにより、E1は選択
的に固相と結合し;他の抗原は溶液中に留まる。さら
に、E1と結合し得る可溶性の標識抗体はE1と複合体
を形成する。固相を液相から分離した後で、標識物によ
りE1の内容量を再度非常に精密に測定することができ
る。特に好ましい実施態様においては、第三の抗体を添
加してさらに選択性を高める。第三の抗体は標識された
第二の抗体に向かう。
固相に固定されている場合には、E1だけが特異的に固
相に結合する。可溶性のE1特異性の第二の受容体また
は抗体と共にインキュベートする間に、該抗体もE1だ
けと反応する。従って他の抗原は固相と殆ど結合しない
ために、この方法は非常に特異的であり、それにより非
常に精密な測定が可能である。これにより、E1は選択
的に固相と結合し;他の抗原は溶液中に留まる。さら
に、E1と結合し得る可溶性の標識抗体はE1と複合体
を形成する。固相を液相から分離した後で、標識物によ
りE1の内容量を再度非常に精密に測定することができ
る。特に好ましい実施態様においては、第三の抗体を添
加してさらに選択性を高める。第三の抗体は標識された
第二の抗体に向かう。
【0031】当業者に公知の、3種類の受容体を用いる
別の変法も、E1に特異的に結合し得る抗体を用いるこ
とができる。このことは、当業者には明かなことであ
り、これ以上ここに述べる必要はない。
別の変法も、E1に特異的に結合し得る抗体を用いるこ
とができる。このことは、当業者には明かなことであ
り、これ以上ここに述べる必要はない。
【0032】本発明による方法を実施するために用いら
れる抗体の少なくとも1種類はモノクローナル抗体であ
ることが好ましい。好ましい実施態様においては、モノ
クローナル抗体だけが受容体として用いられる。E1に
特異的に結合し得る抗体は固相に結合して存在するか、
または可溶性の標識された受容体または可溶性の標識さ
れない受容体として存在することができる。この受容体
は好ましくはモノクローナル抗体である。用いられる全
ての受容体がモノクローナル抗体であることが特に好ま
しい。
れる抗体の少なくとも1種類はモノクローナル抗体であ
ることが好ましい。好ましい実施態様においては、モノ
クローナル抗体だけが受容体として用いられる。E1に
特異的に結合し得る抗体は固相に結合して存在するか、
または可溶性の標識された受容体または可溶性の標識さ
れない受容体として存在することができる。この受容体
は好ましくはモノクローナル抗体である。用いられる全
ての受容体がモノクローナル抗体であることが特に好ま
しい。
【0033】本発明の方法並びにテストキットは自動分
析システムに特に適しており、とりわけバイオセンサー
に基づくシステム、及びチップテクノロジー(chip tec
hnology)を利用するシステムに適している。
析システムに特に適しており、とりわけバイオセンサー
に基づくシステム、及びチップテクノロジー(chip tec
hnology)を利用するシステムに適している。
【0034】
【実施例】以下の例により本発明をさらに詳細に説明す
る。 (例1) a) 高純度E1によるモノクローナル抗体の調製 高純度ヒトE1[ヒト膵臓からの製造は、S. Sziegolei
t, “ヒト膵臓由来のコレステロール結合タンパク質の
精製および特性付け”, Biochem. J. 207:573-582, 19
82、に記載されている]をPBS中に溶解し、等量のフ
ロインドアジュバントと混和した。全ての場合におい
て、この混合液100μgを6〜8週齢のBalb/c マウ
スの腹腔内および皮下に注射した。これらの注射を3〜
4週間の間隔で2度反復した。この試験計画では、脾臓
摘出の3日前に、PBSに溶解した100μgの高純度
E1を、高純度E1で免疫したマウスの静脈内に注射し
た。
る。 (例1) a) 高純度E1によるモノクローナル抗体の調製 高純度ヒトE1[ヒト膵臓からの製造は、S. Sziegolei
t, “ヒト膵臓由来のコレステロール結合タンパク質の
精製および特性付け”, Biochem. J. 207:573-582, 19
82、に記載されている]をPBS中に溶解し、等量のフ
ロインドアジュバントと混和した。全ての場合におい
て、この混合液100μgを6〜8週齢のBalb/c マウ
スの腹腔内および皮下に注射した。これらの注射を3〜
4週間の間隔で2度反復した。この試験計画では、脾臓
摘出の3日前に、PBSに溶解した100μgの高純度
E1を、高純度E1で免疫したマウスの静脈内に注射し
た。
【0035】約1億個の免疫マウス脾臓由来細胞を5千
万個の骨髄腫細胞[X 63-Sp8-653,これは免疫グロブリ
ンをまったく生合成しない細胞系であり、サルク研究所
の細胞配布センター(Salk Institute, Cell Distribut
ion Center, San Diego CA 92112, USA)から入手可能
である]と、ポリエチレングリコール(MG 3400)の存
在下で融合させた。融合細胞を、各々24の陥凹を含む
8つのプレートに播種した。これらの陥凹はそれぞれ、
ピポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有
する栄養培地中に、同系の免疫マウス由来の脾臓細胞を
5千万個含んでいた。
万個の骨髄腫細胞[X 63-Sp8-653,これは免疫グロブリ
ンをまったく生合成しない細胞系であり、サルク研究所
の細胞配布センター(Salk Institute, Cell Distribut
ion Center, San Diego CA 92112, USA)から入手可能
である]と、ポリエチレングリコール(MG 3400)の存
在下で融合させた。融合細胞を、各々24の陥凹を含む
8つのプレートに播種した。これらの陥凹はそれぞれ、
ピポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有
する栄養培地中に、同系の免疫マウス由来の脾臓細胞を
5千万個含んでいた。
【0036】10〜14日後に、ELISA、ウエスタ
ーン・ブロット、凍結切片およびパラフィン切片によ
り、これらの融合細胞(雑種細胞)の抗体含有上澄み液
の高純度ヒトE1に対する特異性をテストした。E1だ
けに対するモノクローナル抗体を得るために、その上澄
み液がE1以外の抗原に対する抗体を含有しない雑種細
胞を2回クローニングした。
ーン・ブロット、凍結切片およびパラフィン切片によ
り、これらの融合細胞(雑種細胞)の抗体含有上澄み液
の高純度ヒトE1に対する特異性をテストした。E1だ
けに対するモノクローナル抗体を得るために、その上澄
み液がE1以外の抗原に対する抗体を含有しない雑種細
胞を2回クローニングした。
【0037】b) 免疫原性ペプチドによるモノクロー
ナル抗体の調製 アミノ酸配列 Thr-Met-Val-Ala-Gly-Gly-Asp-Ile-Arg
を有するペプチドを、メリフィールド(Merrifield)に
よる固相合成により調製し、上記の如く、このペプチド
を6〜8週齢の Balb/c マウスに注射した。上記の手順
により、糞便および血清の双方から得られたヒトエラス
ターゼ1に対して高い特異性を有するモノクローナル抗
体を得た。
ナル抗体の調製 アミノ酸配列 Thr-Met-Val-Ala-Gly-Gly-Asp-Ile-Arg
を有するペプチドを、メリフィールド(Merrifield)に
よる固相合成により調製し、上記の如く、このペプチド
を6〜8週齢の Balb/c マウスに注射した。上記の手順
により、糞便および血清の双方から得られたヒトエラス
ターゼ1に対して高い特異性を有するモノクローナル抗
体を得た。
【0038】E1特異性モノクローナル抗体を用いた血
漿中のE1の測定 (例2)血漿中のE1をELISAにより測定した。こ
の目的のために、例1により得られたE1特異性モノク
ローナル抗体をpH7.2でPBSに溶解し、そして担
体としてのポリスチレン上に不動化させた。洗浄工程の
後に、希釈したE1含有血漿または血清を添加した。血
漿または血清は、PBS、5mmol のEDTAおよび0.
2%のツイーン(Tween)20を含有する緩衝液で希釈
した。
漿中のE1の測定 (例2)血漿中のE1をELISAにより測定した。こ
の目的のために、例1により得られたE1特異性モノク
ローナル抗体をpH7.2でPBSに溶解し、そして担
体としてのポリスチレン上に不動化させた。洗浄工程の
後に、希釈したE1含有血漿または血清を添加した。血
漿または血清は、PBS、5mmol のEDTAおよび0.
2%のツイーン(Tween)20を含有する緩衝液で希釈
した。
【0039】PBSおよび0.2%ツイーン20による
洗浄工程の後、抗体に結合したE1を、やはりE1に結
合しかつ0.2%ツイーン20を含有するpH7.2のP
BSに溶解したフォスファターゼとカップリングしたポ
リクローナル抗体と共に室温で1時間インキュベートし
た。別の洗浄ステップの後、p−ニトロフェニルリン酸
・2ナトリウム・6水和物を添加して、モノクローナル
抗体がE1と反応した反応容器中で光学密度の変化を測
定した。
洗浄工程の後、抗体に結合したE1を、やはりE1に結
合しかつ0.2%ツイーン20を含有するpH7.2のP
BSに溶解したフォスファターゼとカップリングしたポ
リクローナル抗体と共に室温で1時間インキュベートし
た。別の洗浄ステップの後、p−ニトロフェニルリン酸
・2ナトリウム・6水和物を添加して、モノクローナル
抗体がE1と反応した反応容器中で光学密度の変化を測
定した。
【0040】2種類の異なるE1特異性抗体を用いた血
漿中のE1の測定 (例3)E1に対するモノクローナル抗体を例2に記載
の如く担体に固定した。洗浄工程の後、E1を含有する
血清または血漿を前記モノクローナル抗体と共に、例2
に記載の条件下でインキュベートした。別の洗浄工程の
後、本発明による第二のE1特異性モノクローナル抗体
によりE1の結合を検出した。この第二のE1特異性抗
体はパーオキシダーゼと共有結合していた。洗浄工程お
よびパーオキシダーゼの基質としてのABTSの添加の
後に、光学密度の変化を測定した。
漿中のE1の測定 (例3)E1に対するモノクローナル抗体を例2に記載
の如く担体に固定した。洗浄工程の後、E1を含有する
血清または血漿を前記モノクローナル抗体と共に、例2
に記載の条件下でインキュベートした。別の洗浄工程の
後、本発明による第二のE1特異性モノクローナル抗体
によりE1の結合を検出した。この第二のE1特異性抗
体はパーオキシダーゼと共有結合していた。洗浄工程お
よびパーオキシダーゼの基質としてのABTSの添加の
後に、光学密度の変化を測定した。
【0041】(例4)手順は、酵素の替わりにビオチン
を第二のE1特異性抗体にカップリングした以外は、例
3に記載の如く行った。基質を添加する前に、パーオキ
シダーゼ−アビジン複合体またはパーオキシダーゼ−ス
トレプトアビジン複合体を添加した。これにより選択さ
れたE1の測定では、E1だけの極めて特異的な測定が
可能となった。溶液中に含有される他の抗原は、本発明
によるE1測定を妨げない。
を第二のE1特異性抗体にカップリングした以外は、例
3に記載の如く行った。基質を添加する前に、パーオキ
シダーゼ−アビジン複合体またはパーオキシダーゼ−ス
トレプトアビジン複合体を添加した。これにより選択さ
れたE1の測定では、E1だけの極めて特異的な測定が
可能となった。溶液中に含有される他の抗原は、本発明
によるE1測定を妨げない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 // C07K 16/18 C12N 5/00 B (C12P 21/08 C12R 1:91) (71)出願人 597102440 HAINERWEG 10, 6301 WET TENBERG 2, GERMANY (72)発明者 シェーファース、ハンス ドイツ連邦共和国、6301 ヴェッテンベル ク 2、ハイネルヴェーク 10 (72)発明者 シェーファース−ボルヒェル、ウルスラ ドイツ連邦共和国、6301 ヴェッテンベル ク 2、ハイネルヴェーク 10 (72)発明者 ジーゴライト、アンドレアス ドイツ連邦共和国、6306 ラングゲンス、 オイレンヴェーク 3
Claims (5)
- 【請求項1】 抗エラスターゼ1抗体を調製するために
用いる、申請番号 ECACC 90 121 90 6 を有する雑種細
胞系の使用方法。 - 【請求項2】 抗エラスターゼ1抗体を調製するために
用いる、申請番号 ECACC 90 121 90 7 を有する雑種細
胞系の使用方法。 - 【請求項3】 申請番号 ECACC 90 121 90 6 および EC
ACC 90 121 90 7 を有する雑種細胞系から得られる、抗
エラスターゼ1抗体。 - 【請求項4】 請求項3に記載の抗体を少なくとも1種
類含む免疫学的テストキット。 - 【請求項5】 体液および/または糞便を用いて慢性膵
炎、急性膵炎および膵繊維症の診断ならびに経過観察す
るための、請求項4に記載の免疫学的テストキット。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4023972.1 | 1990-07-28 | ||
DE4023972 | 1990-07-28 | ||
DE4107765A DE4107765A1 (de) | 1990-07-28 | 1991-03-11 | Pankreas-elastase-1-spezifischer antikoerper, ein verfahren zu seiner gewinnung und ein testkit der solche antikoerper enthaelt |
DE4107765.2 | 1991-03-11 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP91512166A Division JPH05508770A (ja) | 1990-07-28 | 1991-07-28 | 膵臓エラスターゼ1特異性抗体、その獲得方法および該抗体を含有するテストキット |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH1080272A true JPH1080272A (ja) | 1998-03-31 |
Family
ID=25895430
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP91512166A Pending JPH05508770A (ja) | 1990-07-28 | 1991-07-28 | 膵臓エラスターゼ1特異性抗体、その獲得方法および該抗体を含有するテストキット |
JP9192727A Withdrawn JPH1080272A (ja) | 1990-07-28 | 1997-07-17 | 雑種細胞系の使用方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP91512166A Pending JPH05508770A (ja) | 1990-07-28 | 1991-07-28 | 膵臓エラスターゼ1特異性抗体、その獲得方法および該抗体を含有するテストキット |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0547059B1 (ja) |
JP (2) | JPH05508770A (ja) |
AT (1) | ATE128734T1 (ja) |
AU (1) | AU646476B2 (ja) |
CA (1) | CA2088354C (ja) |
DE (2) | DE4107765A1 (ja) |
DK (1) | DK0547059T3 (ja) |
ES (1) | ES2080955T3 (ja) |
GR (1) | GR3018483T3 (ja) |
WO (1) | WO1992002630A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002515454A (ja) * | 1998-05-20 | 2002-05-28 | エラスムス ユニフェルシテイト ロッテルダム | 炎症または掻痒の予防または治療方法および手段 |
JP2006226795A (ja) * | 2005-02-16 | 2006-08-31 | Tokyo Univ Of Science | 急性膵炎の診断マーカー |
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---|---|---|---|---|
ATE153695T1 (de) * | 1990-11-26 | 1997-06-15 | Akzo Nobel Nv | Verfahren zur herstellung von antikörpern |
DE19923892A1 (de) | 1998-09-08 | 2000-03-09 | Privates Inst Bioserv Gmbh | Diagnostisches Verfahren zur Erkennung einer Pankreasfunktionsstörung |
EP1112496B1 (de) * | 1998-09-08 | 2006-07-05 | Bioserv Analytik und Medizinprodukte GmbH | Diagnostisches verfahren zur erkennung einer pankreasfunktionsstörung |
GB9908458D0 (en) * | 1999-04-13 | 1999-06-09 | Queen Mary & Westfield College | Enzyme |
DE10157336B4 (de) * | 2000-11-24 | 2007-07-19 | Bioserv Analytik Und Medizinprodukte Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines Testsystems und Diagnoseverfahren zur Erkennung von Pankreasfunktionsstörungen |
DE10101792B4 (de) * | 2001-01-17 | 2004-03-18 | Vivotec Biomedical Technologies Gmbh | Verfahren zum Nachweis von Pankreaskarzinom oder chronischer Pankreatitis und Verwendung von Antikörpern |
CN111044723A (zh) | 2018-10-12 | 2020-04-21 | 谢鲍生物科技股份公司 | 含有胰弹性蛋白酶-1-特异性的抗体以及样品准备装置的新型测试试剂盒 |
WO2023100910A1 (ja) * | 2021-11-30 | 2023-06-08 | 株式会社Lsiメディエンス | 糞便中エラスターゼ1を測定する方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5925183B2 (ja) * | 1978-07-05 | 1984-06-15 | ダイナボット株式会社 | エラスタ−ゼ−1の測定方法 |
JP2617299B2 (ja) * | 1986-09-17 | 1997-06-04 | ダイナボット 株式会社 | エラスターゼ1の免疫学的測定方法 |
-
1991
- 1991-03-11 DE DE4107765A patent/DE4107765A1/de not_active Withdrawn
- 1991-07-28 ES ES91912932T patent/ES2080955T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-28 CA CA002088354A patent/CA2088354C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-07-28 WO PCT/DE1991/000606 patent/WO1992002630A1/de active IP Right Grant
- 1991-07-28 AT AT91912932T patent/ATE128734T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-07-28 AU AU81002/91A patent/AU646476B2/en not_active Ceased
- 1991-07-28 EP EP91912932A patent/EP0547059B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-28 JP JP91512166A patent/JPH05508770A/ja active Pending
- 1991-07-28 DK DK91912932.0T patent/DK0547059T3/da active
- 1991-07-28 DE DE59106634T patent/DE59106634D1/de not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-12-20 GR GR950403623T patent/GR3018483T3/el unknown
-
1997
- 1997-07-17 JP JP9192727A patent/JPH1080272A/ja not_active Withdrawn
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002515454A (ja) * | 1998-05-20 | 2002-05-28 | エラスムス ユニフェルシテイト ロッテルダム | 炎症または掻痒の予防または治療方法および手段 |
JP2006226795A (ja) * | 2005-02-16 | 2006-08-31 | Tokyo Univ Of Science | 急性膵炎の診断マーカー |
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Publication number | Publication date |
---|---|
GR3018483T3 (en) | 1996-03-31 |
JPH05508770A (ja) | 1993-12-09 |
EP0547059B1 (de) | 1995-10-04 |
CA2088354C (en) | 1999-09-28 |
DE59106634D1 (de) | 1995-11-09 |
EP0547059A1 (de) | 1993-06-23 |
ATE128734T1 (de) | 1995-10-15 |
DE4107765A1 (de) | 1992-01-30 |
CA2088354A1 (en) | 1992-01-29 |
WO1992002630A1 (de) | 1992-02-20 |
DK0547059T3 (da) | 1996-02-19 |
AU646476B2 (en) | 1994-02-24 |
AU8100291A (en) | 1992-03-02 |
ES2080955T3 (es) | 1996-02-16 |
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