JPH0661279B2 - 蛍光発生基質およびそれを用いたタンパク質分解酵素の検出方法 - Google Patents

蛍光発生基質およびそれを用いたタンパク質分解酵素の検出方法

Info

Publication number
JPH0661279B2
JPH0661279B2 JP30093690A JP30093690A JPH0661279B2 JP H0661279 B2 JPH0661279 B2 JP H0661279B2 JP 30093690 A JP30093690 A JP 30093690A JP 30093690 A JP30093690 A JP 30093690A JP H0661279 B2 JPH0661279 B2 JP H0661279B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
peptide
gln
protease
substrate
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP30093690A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH03172196A (ja
Inventor
グラント・エイ・クラフト
エドマンド・ディ・マタヨシ
ギャリー・ティ・ワング
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Abbott Laboratories
Original Assignee
Abbott Laboratories
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbott Laboratories filed Critical Abbott Laboratories
Publication of JPH03172196A publication Critical patent/JPH03172196A/ja
Publication of JPH0661279B2 publication Critical patent/JPH0661279B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • G01N2333/16—HIV-1, HIV-2

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、タンパク質分解酵素活性の検出および測定法
に関する。さらに詳しくは、タンパク質分解酵素活性の
検出および測定のための蛍光発生fluorogenic）アッセ
イ法、およびそれに用いる蛍光発生基質に関する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題） レトロウイルスは、動物やヒトに種々の疾患を引き起こ
す一本鎖ＲＮＡ含有ウイルスの１科を構成している［バ
イス（R.Weiss）ら、ＲＮＡチューマー・バイラスィズ
（ＲＮＡTumor Viruses）（コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハ
ーバー、ＮＹ、１９８５）］。これらウイルス群はＤＮ
Ａ媒体を介して増殖し、ＤＮＡ媒体はウイルスにコード
された逆転写酵素により合成される。他のクラスの陽鎖
(positive-strand)ＲＮＡウイルスと同様、レトロウイ
ルスのタンパク質も、最初は大きなポリタンパク質前駆
体として合成され、これが後に翻訳後開裂によりプロセ
シングされる。レトロウイルスの内部構造タンパク質、
複製酵素およびエンベロープ糖タンパク質は、それぞれ
gag遺伝子、pol遺伝子およびenv遺伝子によりコードさ
れている。該ウイルスの多いシストロン性メッセンジャ
ーＲＮＡ（mRNA）が翻訳されると、２つの前駆体ポリタ
ンパク質、すなわち構造カプシドタンパク質を含むＰｒ
gag、および構造タンパク質と複製酵素の両方を含む読
み抜けタンパク質であるＰｒgag−polが合成される。en
v遺伝子産物は、別にスプライスされたmRNA転写物から
前駆体ポリタンパク質として翻訳される。レトロウイル
スはまた、小さな１０〜１２キロダルトン（kd）のプロ
テアーゼをもコードしている。このプロテアーゼは、ニ
ワトリレトロウイルスの場合にＰｒgagのＣ末端部とし
て合成される他は、一般にＰｒgag−pol前駆体の一部と
して発現される［オロツラン（Ｓ．Oroszlan）＆コープ
ランド（T.Copeland），Curr.Top.Microbiol.Immunol．
１１５、２２１（１９８５）］。
レトロウイルスのプロテアーゼは、ＰｒgagおよびＰｒg
ag-pol前駆体ポリタンパク質の両方の特異的開裂部位で
のプロセシングにあずかる。この開裂は、ウイルス粒子
の集合中、または集合後に起こると思われ、ヒト免疫不
全ウイルス（ＨＩＶ）およびマウス白血病ウイルスの場
合には感染性ウイルス粒子の成熟に必要であることが示
されている［クローフォード（S.Crawford）ら、J.Viro
l．５３、８９９（１９８５）；カトー（I.Katoh）ら、
Virology１４５、２８４（１９８５）；コール（N.E.Ko
hl）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ、８５、４６８４
（１９８８）］。従って、ＡＩＤＳに関しては、ＨＩＶ
プロテアーゼ活性を抑制することが抗ウイルス剤を設計
する上での重要な目標となってきており、タンパク質分
解活性を検出することもまた同時に薬物療法をモニター
し疾患を診断するのに重要である。
レトロウイルスのタンパク質分解活性を測定するために
種々の技術がすでに用いられており、たとえば、ウエス
タンブロット法によるgagポリタンパク質およびその開
裂産物の分析［カトーら、Nature、３２９、６５４（１
９８７）；シールマイヤー（S.Seelmeier）ら、Proc.Na
tl.Acad・Sci．８５、６６１２（１９８８）；ギアム
（C.Z.Giam）ら、J.Biol.Chem．２６３、１４６１７
（１９８８）；シュナイダー（J.Schneider）ら、Cel
l、５４、３６３（１９８８）；ハンセン（j.Hansen）
ら、ＥＭＢＯ・Ｊ．７、１７８５（１９８８）；グレー
ブズ（M.C.Graves）ら、Proc.Natl.Acad.Sci．８５、２
４４９（１９８８）］、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）法［ビリッヒ（S.Billich）ら、J.Biol.Ch
em.２６３、１７９０５（１９８８）；ダーク（P.L.Dar
ke）ら、J.Biol.Chem.２６４、２３０７（１９８９）；
ダークら、Biochem.Biophys.Res.Comm．１５６、２９７
（１９８８）；リチャーズ（A.D.Richards）ら、ＦＥＢ
Ｓ Lett２４７、１１３（１９８９）；ミーク（T.D.Me
ek）ら、Proc.Natl.Acad.Sci，８６、１８４１（１９８
９）；ナット（R.F.Nutt）ら、Proc.Natl.Acad.Sci．８
５、７１２９（１９８８）；クラウスリッヒ（H.G.Krau
sslich）ら、Proc.Natl.Acad.Sci．８６、８０７（１９
８９）；ムア（M.L.Moore）ら、Biochem.Biophys.Res.C
omm.１５９、４２０（１９８９）］または合成ペプチド
開裂断片の薄層電気泳動分析［コルター（M.Kolter）
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.８５、４１８５（１９８
８）；コルターら、J.Biol.Chem.２６４、３４２８（１
９８９）］が挙げられる。しかしながら、これらの方法
は比較的時間がかかるため、多数のプロテアーゼインヒ
ビターをスクリーニングし特徴付けをするには実用的で
ない。これらの方法はまた、プロテアーゼ反応動力学の
連続的な測定ができないため、酵素研究の正確さという
点でも欠点がある。
分子内共鳴エネルギー移動を加水分解酵素活性の測定に
適用する可能性は、ほぼ２０年前に示されている［ラッ
ト（S.A.Latt）ら、Anal.Biochem.５０、５６（１９７
２）；カーメル（A.Carmel）ら、ＦＥＢＳLett３０、
（１９７３）］しかしながら、それ以降、プロテアーゼ
アッセイに該方法（類似の消光(quenching)／開裂法）
を使用することは実用に限界があった［ヤロン(A.Yaro
n)ら、Anal.Biochem.９５、２２８（１９７９）および
その中の文献；パーソン（A.Persson）ら、Anal.Biolch
em.８３、２９６（１９７７）；ニシノ（N.Nishino）
ら、J.Biol.Chem.２５５、３４８２（１９８０）；デイ
ラップ（C.Deyrup）ら、Anal.Biochem.１２９、５０２
（１９８３）；フィリッポバ（I.Yu.Filippova）ら、Bi
oorg.Khim.１２、１１７２（１９８６）；ポール(J.Poh
l)ら、Anal.Biochem.１６５、９６（１９８７）；ポラ
ック（S.J.Pollack）ら、J.Am.Chem.Soc.１１１、５９
６１（１９８９）］。
（課題を解決するための手段） 本発明は、ペプチドに結合した蛍光ドナーおよび消光ア
クセプターからなり、該ペプチドは該蛍光ドナーと消光
アクセプターとの間で分子内共鳴エネルギー移動が行な
われるに充分な立体構造を有し、該ペプチドはウイルス
性プロテアーゼにより開裂し得ることを特徴とする新規
な蛍光発生基質に関する。一般に、該ペプチドは該蛍光
ドナーと該消光アクセプターとを約１００オングストロ
ーム未満の距離にて分離している。蛍光ドナーはペプチ
ドのＣ末端に、消光アクセプターはペプチドのＮ末端に
結合してよいし、またその逆であってもよい。
本発明の新規な基質は、試料中のウイルス性プロテアー
ゼの存在または活性を検出するためのアッセイにおいて
有利に用いることができる。そのようなアッセイにおい
て、試料と本発明の蛍光発生基質とを混合すると、試料
中に目的酵素が存在している場合には該酵素は本発明の
基質を開裂し、蛍光ドナーと消光アクセプターとを分離
する。ついで、得られる蛍光放出を検出ないし測定する
ことができる。
本発明の基質はまた、プロテアーゼインヒビターの活性
を検出するために有利に用いることができる。そのよう
なアッセイにおいて、インヒビター、プロテアーゼおよ
び本発明の蛍光発生基質を混合する。酵素インヒビター
の有効性は、酵素が基質を加水分解するのを抑制される
度合により示される。
本発明の新規な基質は、基質の加水分解により引き起こ
された蛍光ドナーの蛍光放射を連続的にモニターするこ
とを可能にする。動力学的分析に必要な反応速度の決定
が簡単かつ正確であるため、これらのアッセイにより、
高速液体クロマトグラフィーまたは電気泳動法を用いた
従来のアッセイ法に比べて多くの利点が得られる。本発
明の基質は、ヒト免疫不全ウイルスのプロテアーゼおよ
びニワトリ骨髄芽球ウイルス（ＡＭＶ）のプロテアーゼ
の存在または抑制を検出するのに特に有用である。
１１kdのプロテアーゼ［ヒト免疫不全ウイルス−１（Ｈ
ＩＶ−１）によりコードされている］は、ウイルスのポ
リタンパク質のプロセシングおよび感染性ウイルスのそ
の後の成熟に必要である。それゆえ、プロテアーゼ活性
の抑制は、ＡＩＤＳの治療の主要な目標である。ＨＩＶ
プロテアーゼの酵素学および抑制に関する綿密な研究を
容易にするため、本発明では分子内蛍光エネルギー移動
に基づく新規なアッセイ法を記載する。
本発明は、ＨＩＶやラウス肉腫ウイルス関連ＡＭＶなど
によってコードされているようなレトロウイルスプロテ
アーゼのための新規な蛍光アッセイを提供する。本発明
のアッセイでは新規な蛍光発生プロテアーゼ基質を用
い、該基質はペプチドが蛍光ドナーと消光アクセプター
を結合している構造を有する。一般に、蛍光ドナーおよ
び消光アクセプターは、それぞれペプチドのＣ末端およ
びＮ末端で結合している。本発明に適した蛍光ドナーと
しては、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体、
Ｎ−（２−アミノペンチル）−３−アミノ−2,7−ジス
ルホ−1,8−ナフタルイミド二カリウム塩（ルシファー
イエロー）およびその誘導体、５−（（２−アミノエチ
ル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮ
Ｓ）、クマリンおよびクマリン誘導体、およびそれらの
等価物が挙げられるが、これらに限られるものではな
い。本発明に適した消光アクセプターとしては、2,4−
ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、４−（４−ジメチルアミ
ノフェニル）アゾベンゼンスルホン酸（ＤＡＢＳＹ
Ｌ），４−（４−ジメチルアミノフェニル）アゾ安息香
酸（ＤＡＢＣＹＬ）およびその等価物が挙げられるが、
これらに限られるものではない。本発明には実質的にあ
らゆる蛍光団および消光アクセプターを用いることがで
きるが、所定の蛍光発生プロテアーゼ基質に用いるため
の特定のドナー／アクセプターの組合わせは、エネルギ
ー移動効率が最適となるように選択する。
ペプチドが蛍光ドナー／消光アクセプターの対を結合さ
せる仕方は、該蛍光ドナー（たとえば、ＥＤＡＮＳ）と
該消光アクセプター（たとえば、ＤＡＢＣＹＬ）との間
での分子内共鳴エネルギー移動のために該ドナーの固有
の蛍光が劇的に減少するようなものにする。分子内共鳴
エネルギー移動は約１００オングストロームを越える距
離では微々たるものになるので、ペプチド構造がプロテ
アーゼのような酵素により開裂されて最初の基質の蛍光
ドナー−ペプチド断片から蛍光消光アクセプター−ペプ
チド断片が放出された後は、蛍光団の全蛍光量子収量が
回復される。ドナー／アクセプターの組合わせを結合す
るペプチド構造は、ドナーとアクセプターとの間に必要
な距離を提供し、かつ所望のプロテアーゼのための適当
な開裂部位を有するものであればいかなるペプチドであ
ってもよい。
プロテアーゼ反応の連続的な検出または測定のための本
発明の蛍光発生プロテアーゼ基質の具体例としては、下
記式： （基質Ｉ） および式： （基質II） で示される化合物が挙げられる。
基質Ｉ中のペプチド配列は、Ser−Gln−Asn−Try−Pro
−Ile−Val−Glnのオクタペプチドであり、これはＨＩ
Ｖプロテアーゼによる天然に存在するgag p17/gagp24開
裂部位に対応する。ＨＩＶプロテアーゼは、Try−Proペ
プチド結合にて該ペプチドを開裂する。基質IIに用いた
ペプチド配列（Ser−Val−Val−Try−Pro−Val−Val−G
ln）は、ＨＩＶプロテアーゼの活性部位に存在するかも
しれない対称性を利用して設計したものである。しかし
ながら、この配列は、ＡＭＶプロテアーゼに一層適した
基質であることがわかった。これはＡＭＶプロテアーゼ
の天然の基質配列ではないが、ＡＭＶポリタンパク質で
種々の開裂部位を調べた結果に基づき、高Val含量は基
質効率を高めるであろうことが予測される［コープラン
ドおよびオロツラン、ペプタイズ：シンセシス、ストラ
クチャー・アンド・ファンクション（Peptides:Synthes
is,Structure and Function）、リッチ（D.H.Rich）お
よびグロス（E.Gross）編（ピアス、ロックフィール
ド、ＩＬ、１９８２）、４９７〜５００頁］。このかさ
高いアクセプターの結合により、基質が立体的に妨害さ
れないように、ＤＡＢＣＹＬ基とＮ末端Serとの間にγ
−アミノ酪酸（gaba）スペーサーを挿入した。
本発明の基質を用いれば、蛍光強度の連続的な増加によ
り、酵素のタンパク質分解活性を経時的にモニターする
ことができる。酵素がペプチドを開裂するにつれ、蛍光
団が連続的かつ増加して放出されるからである。さら
に、この増加は蛍光発生基質の加水分解速度と一次相関
を有する。というのは、開裂された基質各１モルに対し
て新たに生成したドナー−ペプチド断片１モルが存在す
るため、全蛍光は正味の強度により増加するからであ
る。この現象は、有利にも感度が高く定量的なアッセイ
法の基礎となることがわかった。その際、タンパク質分
解反応速度は、蛍光の変化を経時的に検出することによ
り決定することができる。加えて、本発明の蛍光発生基
質は、酵素インヒビターの存在下での酵素活性を決定す
るためにも用いることができる。それゆえ、本発明の新
規な基質は、タンパク質分解酵素インヒビターの既存の
ライブラリーおよび微生物発酵ビール、並びに新規な合
成酵素インヒビターなどを含む種々の源からの化合物を
迅速かつ大スケールでスクリーニングするために有利に
用いることができる。
簡単に説明すると、化合物の抑制能は下記方法により決
定することができる。プロテアーゼ（たとえば、ＨＩＶ
プロテアーゼ）、プロテアーゼ抑制化合物（たとえば、
ペプスタチン、アセチルペプスタチンなど、これらに限
られない）および本発明の蛍光発生基質（たとえば、基
質Ｉ）を混合して反応混合物を生成する。一般に、アッ
セイ反応は緩衝溶液を用いて行い、反応は実質的に完了
するまで進行させる。プロテアーゼによる蛍光発生基質
の加水分解は、分光蛍光計を用いた定常状態蛍光により
モニターする。蛍光強度の測定値は連続的に得られ、接
続したマイクロコンピューターで直接記録する。つい
で、蛍光基質の加水分解速度を直線回帰分析から計算す
る。このアッセイにおいては、蛍光発生基質の加水分解
速度はプロテアーゼ濃度に正比例する。反応混合物から
プロテアーゼ抑制化合物を除くことにより、酵素活性に
よる蛍光強度の変化の速度を決定することができる。本
発明により実質的にあらゆるプロテアーゼを検出するこ
とができる。以下の説明で使用するプロテアーゼは、ハ
ンセンら、ＥＭＢＯ Ｊ．７、１７８５（１９８８）；
ミークら、Proc.Natl.Acad.Sci.８６、１８４１（１９
８９）；およびナットら、Proc.Natl.Acad.Sci.８５、
７１２９（１９８８）の記載の従って製造することがで
きる。
蛍光分子内共鳴エネルギー移動法の成功は、適当なドナ
ー／アクセプターのエネルギー移動対を選択したことに
基づいている。ドナーとアクセプターとの間のエネルギ
ー移動効率を最適にすることにより、完全基質中のドナ
ー化合物の残留蛍光を最小になり、その結果、基質が開
裂したときに蛍光シグナルの大きな変化が得られる。こ
の特徴は、全基質の極めて小部分の加水分解から反応速
度の決定を可能とするものであり、このことは初期反応
速度を評価するために非常に望ましいことである。
一つの好ましいドナー／アクセプター対としてのＥＤＡ
ＮＳおよびＤＡＢＣＹＬの選択は、数多くの考慮に基づ
いて行ったものである。第一に、ＥＤＡＮＳの蛍光放出
とＤＡＢＣＹＬの強い可視吸収バンドとの間に非常に大
きなスペクトルの重複があり、そのためエネルギー移動
が非常に効率的である。
第二に、ＥＤＡＮＳなどの比較的寿命の長い蛍光ドナー
を使用することは、ドナー残基とアクセプター残基との
拡散による分子内共鳴エネルギー移動の増加が有意とな
るため、残留する基質蛍光の抑制が改善されることにな
る。たとえば、基質ＩおよびIIにおいて、最大ドナー／
アクセプター分離距離(R)は約２９オングストロームで
あると思われる（伸張されたオクタペプチドの立体配置
を想定して）。Ｒ0（５０％エネルギー移動効率のフェ
ルスター（Foerster）距離は、このドナー／アクセプタ
ー対については３３オングストロームであると推定され
た。それゆえ、ＲはＲ0よりも小さく、Ｒ＜Ｒ0の距離に
対してはＲが減少するにつれエネルギー移動効率は急速
に増加する。基質Ｉの末端の相対分子内拡散係数を５×
１０-7cm2／秒［ハース（E.Haas）ら、Biopolymers１
７、１１（１９７８）］と仮定すると、ドナー蛍光の２
０倍消光はＲ＝０．６１Ｒ0で達成され、６５倍消光は
Ｒ＝０．５Ｒ0で達成されるであろう。ドナーおよびア
クセプターは、ＥＤＡＮＳの励起状態にある寿命の間に
互いに約１３オングストローム移動し得る。
Ｒ0は、配向因子に関して０．６７の値を用いて推定し
た。このことは、ドナーおよびアクセプター双極子がド
ナーの励起状態の寿命中に相対配向の動的なランダム化
を受けているときには妥当である［共鳴エネルギー移動
の計算法についてはストライアー（L.Stryer）、Ann.Re
v.Biochem.４７、８１９（１９７８）を参照］。この仮
定は、ペプチドへのＤＡＢＣＹＬ結合およびＥＤＡＮＳ
結合のかなりの可撓性、およびペプチド自体の可撓性の
ため妥当であると思われる。ドナーの量子収量の値(Q)
である0.13は、基質断片Pro−Ile−Val−Gln−ＥＤＡＮ
Ｓについて測定した収量に基づき、１Ｎ硫酸中のキニン
サルフェート［Ｑ＝０．５４６；デマス（J.N.Demas）
ら、J.Phys.Chem.７５、９９１（１９７１）］と比較し
て用いた。
第三に、ＥＤＡＮＳの検出能は、中位に良好な量子収
量、光漂白に対する妥当な安定性、およびスペクトルの
吸収バンドと放出バンドとが大きく分離していることを
含む幾つかの因子により高められる。第１図は、ＥＤＡ
ＮＳの吸収スペクトルおよび技術的蛍光スペクトル、並
びにＤＡＢＣＹＬ吸収スペクトルを示す。第１図は、Ｅ
ＤＡＮＳの蛍光スペクトルとＤＡＢＣＹＬの吸収スペク
トルとが重複していることを示しており、その結果、ド
ナー／アクセプター対として効率的なエネルギー移動度
が可能となる。第１図にＥＤＡＮＳの吸収スペクトルを
入れたのはスペクトルの吸収バンドと放出バンドとが大
きく分離していることを示すためであり（ストークス
（Stokes）シフトは１００ナノメータ以上）、その結
果、低濃度のＥＤＡＮＳを検出することが可能となり、
さらにアッセイの感度が高められる。
第四に、ＨＩＶプロテアーゼのための蛍光発生基質中に
用いるのに適しているような疏水性ペプチドを可溶化す
るには、ＥＤＡＮＳが水中に可溶であることは特に有益
である。
第五に、ＤＡＢＣＹＬの可視吸収バンドが充分に分離し
ていることは、基質の精製および定量、並びにタンパク
質分解により生成した基質断片の分析を容易にする。Ｄ
ＡＢＣＹＬが非蛍光であるという事実によってもまた、
ＥＤＡＮＳ蛍光の検出能が改善される。というのは、カ
ットオフフィルターまたは非常に広いバンド通過モノク
ロメータースリットまたはフィルターを用いてＥＤＡＮ
Ｓ蛍光を測定することができるからである。原則とし
て、蛍光性のアクセプターを利用することも可能であ
り、感光アクセプターの蛍光が時間に依存して減少して
いくのをモニターすることにより反応速度を得ることが
できる。しかしながら、実際問題としては、この方法に
より匹敵する感度を得ることは困難である。というの
は、(1)消光アクセプターが有意に直接励起することな
くドナーが励起し得、さらに(2)アクセプターおよびド
ナーの蛍光スペクトルが互いに充分に分離しているよう
なドナー／アクセプター対を用いる必要があるからであ
る。
本発明においては、蛍光基質中に比較的大きなペプチド
を用いた場合でさえも、レトロウイルスのプロテアーゼ
活性をアッセイするために分子内共鳴エネルギー移動を
有効に用いることができる。分子内共鳴エネルギー移動
アッセイの簡単さ、迅速さ、および正確さにより、本ア
ッセイを容易に多くの用途および態様に適用することが
できる。
本発明の基質は、酵素学的研究、およびプロテアーゼイ
ンヒビターとしての価値を有する化合物の特徴付けに特
に有用である。大スケールのスクリーニング用として
は、分子内共鳴エネルギー移動アッセイは容易に９６ウ
エル蛍光プレートリーダーのような自動化態様とするこ
とができる。分子内共鳴エネルギー移動法はまた、レト
ロウイルスプロテアーゼの基質特異性要件に関する研究
にも有用である。というのは、必要とされるのは、ドナ
ー基とアクセプター基とが酵素／基質相互反応を乱すの
を最小にするように位置していることだけであり、有効
なドナー／アクセプター対を実質的にあらゆるペプチド
配列または巨大分子とともに用いることができるからで
ある。
つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明す
るが、本発明はこれらに限られるものではない。
実施例１ 蛍光発生基質の調製： 蛍光発生基質Ｉを下記のようにして調製した。蛍光ドナ
ーはＥＤＡＮＳであり、消光アクセプターはgabaスペー
サーを介して結合したＤＡＢＣＹＬであった。
基質ＩおよびIIのオクタペプチドであるSer−Gln−Asn
−Tyr−Pro−Ile−Val−GlnおよびSer−Val−Val−Tyr
−Pro−Val−Val−Gln（マルチプル・ペプチド・システ
ムズ（Multiple Peptide Systems）、サンジエゴ、Ｃ
Ａ）を、それぞれ該オクタペプチドのアミノ末端および
カルボキシル末端とのＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＮＡＳの
通常の縮合化学を用いて誘導体化した。
(a)ＤＡＢＣＹＬ−gaba−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイ
ミドの調製： ４−（ｐ−ジメチルアミノフェニル−アゾ）安息香酸
（dabcyl−ＯＨ）（沸騰水中の対応ナトリウム塩（シグ
マ、セントルイス、ＭＯから入手可能）の溶液に充分な
量のpH4.0の緩衝液を加えて調製）をジメチルホルムア
ミド（ＤＭＦ）中に溶解し、各1.3当量のジシクロヘキ
シルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびＮ−ヒドロキシス
クシンイミド（ＮＨＳ）を加えた。薄層クロマトグラフ
ィー（ＴＬＣ）により反応完了が示された後、この混合
物を濃縮し、塩化メチレンでトリチュレートして不溶性
の副生成物であるN,N′−ジシクロヘキシル尿素（ＤＣ
Ｕ）を除いた。この塩化メチレン溶液を濃縮してほぼ純
粋なＤＡＢＣＹＬ−ＮＨＳを得た。この物質をＤＭＦ中
に溶解し、1.2当量の４−アミノ酪酸（gaba）を加え、
ついで1.2当量のトリエチルアミンを加えた。反応が完
了するまで（ＴＬＣ）により示される）、この混合物を
室温にて撹拌した。ＤＭＦを蒸発させ、残渣をメタノー
ル／塩化メチレン混合物から再結晶させて実質的に純粋
なＤＡＢＣＹＬ−gaba−ＯＨを得た。
ＤＡＢＣＹＬ−gaba−ＯＨ（２．０ｇ、５．６ミリモ
ル）を乾燥ＤＭＦ（３００ml）中に溶解した。この溶液
にＮＨＳ（０．８ｇ、１．２当量）およびＤＣＣ（１．
４ｇ、１．２当量）を加えた。室温にて一夜撹拌した
後、ＴＬＣにより反応が完了したことが示された。固体
物質を濾過した。この濾液を濃縮し、残渣を塩化メチレ
ンで２回洗浄して残留するＤＣＵを除いた。ついで、こ
の塩化メチレン溶液をシリカカラム上のクロマトフラフ
ィーにかけ（溶出液としてEtOAcを使用）、純粋なＤＡ
ＢＣＹＬ−gaba−ＮＨＳ（１．５８ｇ）を得た。
(b)ＤＡＢＣＹＬ−gaba−Ser−Gln−Asn−Tyr−Pro−Il
e−Val−Glnの調製： ペプチドSer−Gln−Asn−Tyr−Pro−Ile−Val−Gln（４
９．０mg、０．０４６ミリモル）を乾燥ＤＭＦ（５０m
l）中に溶解し、この溶液にトリエチルアミン（約０．
２ml、過剰量）を加えた。ついで、この溶液に約１．２
当量のＤＡＢＣＹＬ−gaba−ＮＨＳを加えた。室温にて
一夜撹拌した後、溶媒を蒸発させ、残渣を塩化メチレン
でトリチュレートした。濾過すると、実質的に純粋な生
成物（６０mg）が暗赤色固体として得られた。
(c)ＤＡＢＣＹＬ−gaba−Ser−Gln−Asn−Tyr−Pro−Il
e−Val−Gln−ＥＤＡＮＳの調製： ＤＡＢＣＹＬ−gaba−Ser−Gln−Asn−Tyr−Pro−Ile−
Val−Gln（５０．０mg、０．０３９ミリモル）を乾燥Ｄ
ＭＦ（５０ml）中に溶解した。この溶液に１．５当量の
５−（２−アミノエチルアミノ）−１−ナフタレンスル
ホン酸ナトリウム塩（ＥＤＡＮＳ、シグマ）、１．５当
量のＮＨＳ、および１．５当量んお１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
（ＥＤＣ；シグマ）を加えた。室温にて一夜撹拌した
後、この混合物を濃縮し、残渣をジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）／水混合物中に再溶解し、ＨＰＬＣ精製に
供した。
ＨＰＬＣの条件はつぎのようであった。(i)ライニン（R
ainin）Ｃ−８逆相カラム（２１×２５０mm）；および
(ii)溶媒Ａ（１００％水と１０mM酢酸ナトリウム［NaOA
c］、pH５）を用いた溶媒勾配を１０分間、ついで６０
％溶媒Ｂ（９０％水性アセトニトリルと１０mM NaOAc、
pH５）への直線勾配を６０分間。一般に、二重チャネル
（dual-channel）ＵＶ−ＶＩＳデテクターを用いた場合
には、所望のＨＰＬＣピークは２６０nmでの吸収値に対
する４９０nmでの吸収値の比は大体１であり、これは所
望の生成物に特徴的なものである。所望の生成物を含む
フラクションを集め、濃縮した。残渣をＤＭＦで処理
し、濾過して酢酸ナトリウムを除いた。ついでＤＭＦ濾
液を蒸発乾固させ、残渣を塩化メチレンおよびヘキサン
で処理した。濾過すると結晶性の暗赤色の固体（４９．
０mg）が得られた。
実施例２ ＨＩＶプロテアーゼインヒビターのスクリーニングのた
めの蛍光発生アッセイ： インヒビター化合物（ペプスタチン、シグマ）をＤＭＳ
Ｏ中に溶解し、小アリコートをさらにＤＭＳＯで試験に
必要な最終濃度を３０倍に希釈した。このインヒビター
溶液（２０μｌ）を激しく回転撹拌しながら緩衝溶液
（３８０μｌ；０．１Ｎ ＮａＯＡｃ、１Ｍ塩化ナトリ
ウム、１mMエチレンジアミン四酢酸、１mMジチオスレイ
トールおよび１．０mg／mlウシ血清アルブミン［ＢＳ
Ａ］にゆっくりと加え、インヒビターの水溶液を得た。
この緩衝インヒビター溶液を室温にて貯蔵し、水に難溶
解性の化合物の時間依存性凝集を最小にするため、数時
間以内に使用に供した。
プロテアーゼ（ＨＩＶプロテアーゼ）を上記緩衝溶液
（さらに１０％ＤＭＳＯを含有）で希釈してプロテアー
ゼ溶液（６．７nM；７３ng/ml）を得た。このプロテア
ーゼ溶液を氷上で貯蔵した。
激しく回転撹拌しながら緩衝液で基質（純粋なＤＭＳＯ
中に４８０μＭ）を２０倍に希釈することにより、蛍光
発生基質Ｉ溶液（２４μＭ；ＤＡＢＣＹＬ−gaba−Ser
−Gln−Asn−Tyr−Pro−Ile−Val−Gln−Ａｓｎ−Ｔｙ
ｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−ＥＤＡＮＳ）を
調製した。この基質溶液もまた室温にて貯蔵した。
アッセイ反応は蛍光マイクロセル（３mm）中（たいてい
の蛍光計において１２０μｌの全試料容量が適当であ
る）で行った。酵素溶液（２０μｌ）をインヒビター溶
液（８０μｌ）とマイで直接混合した。このマイクロセ
ルを、３０℃にて少なくとも１分間、蛍光計セルホルダ
ー中に置いた。ついで、前以て温めた基質溶液（２０μ
ｌ、３０℃）をマイクロセルに加え、反応混合物の蛍光
強度を時間の関数として記録した。反応混合物の完全な
温度平衡を確実にするため、最初の２分間のデータは無
視した。その後の５分〜８分における蛍光強度の変化速
度を直線回帰により決定した。観察された速度は、単位
モル当たりに開裂された基質のモル数に正比例した。そ
れゆえ、抑制（％）は１００×（１−（インヒビターの
存在下での速度）／（インヒビターの不在下での速
度））として計算した。
実施例３ プロテアーゼの蛍光発生アッセイ： プロテアーゼおよび本発明の蛍光発生基質を含有する反
応混合物についても、蛍光強度の経時的な変化速度を測
定した。このアッセイは、インヒビター化合物を用いな
かった他は実質的に実施例２に記載の方法に従って行っ
た。
実施例４ 蛍光発生基質のＨＰＬＣ分析： 蛍光発生基質およびその反応生成物のＨＰＬＣ分析を下
記のようにして行った。
当該技術分野でよく知られた方法に従い、ダイオードア
レイ吸収および蛍光デテクターを備えたヒューレットパ
ッカード１０９０Ｍシステム（Hewlett Packard１０９
０Ｍsystem）上で、pH値が５未満のブラウンリー（Brow
nlee）２５０×４．６mmＣ８シリカカラムか、または。
pH範囲が２〜８のハミルトン（Hamilton）５０×４．１
mmＰＲＰ３ポリマーカラムのいずれかを用い、基質断片
の分析的ＨＰＬＣおよび単離を行った。水／アセトニト
リル勾配を用い、０．１％トリフルオロ酢酸（pH約
２）、１０mM酢酸ナトリウム（pH４．９）または１０mM
TrisＨＣＬ（pH８）のいずれかを含有させてpHを変化
させた。
この検出システムでは、蛍光および幾つかの吸光度波長
についてのクロマトグラム、並びにすべてのピークの吸
収スペクトルを同時に得ることができた。蛍光（３４０
nmで励起、４９０nmで放出）および４７５nmでの吸光度
シグナル（それぞれＥＤＮＡＳ基およびＤＡＢＣＹＬ基
から生成する）を用いて、基質の加水分解によって生成
した断片をモニターし定量した。
蛍光および４７５nmでの吸光度についてのクロマトグラ
ムを第２図および第３図を重ねて示す。第２図は、ＨＩ
Ｖプロテアーゼを加える前の蛍光発生基質Ｉのものであ
り、第３図は、実施例２に記載した条件下でＨＩＶプロ
テアーゼで2.5時間加水分解した後の基質Ｉの生成物の
ものである。
基質Ｉのモル蛍光増大もまた、加水分解反応が完了する
前の時間でＨＩＶプロテアーゼ／基質Ｉ反応混合物のＨ
ＰＬＣ分析により評価した。第２図の蛍光および４７５
nm吸光度クロマトグラム上のピークを積分すると、親組
成物である基質Ｉに対してPro−Ile−Val−Gln−ＥＤＡ
ＮＳペプチド断片の蛍光量子収量が明らかに３３倍増大
していた。しかしながら、アッセイ条件下で得られた４
０倍の増大値が一層正確であるように思われる。という
のは、このＨＰＬＣは同様のpH（４．９）にて行ったも
のではあったが、アセトニトリル／水溶媒系で行ったか
らである。アセトニトリル／水媒体はプローブの光物理
学的性質およびペプチドの立体配置を変化させ、このこ
とが今度は分子内共鳴エネルギー移動による消光の度合
に影響を与える。
プロテアーゼによる蛍光発生基質の酵素開裂が特異的で
あり定量的であるという証拠は、以下の方法で得られ
た。まず、ＨＩＶプロテアーゼとともに2.5時間インキ
ュベートした後の反応生成物のＨＰＬＣ分析は、53.5′
における最初のペプチド溶出の完全な消失、およびそれ
と同時に36.4′および47.2′の保持時間にかける新たな
２種の分子種の出現を示していた（第３図）。この結果
は、蛍光発生基質が単一の結合部で定量的に開裂された
ことを示唆していた。36.4、ピークは非消光ＥＤＡＮＳ
蛍光団に特徴的な蛍光収量を示しており、47.2′分子種
は非蛍光であり４７５nm吸光度クロマトグラム上に存在
していた。クロマトグラフィーの間にオンラインで得ら
れた各ピークについての吸収スペクトルにより、各ピー
クがＥＤＡＮＳ（36.4′）、ＤＡＢＣＹＬ（47.2′）お
よびＥＤＡＮＳ＋ＤＡＢＣＹＬ（53.5′）に対応するこ
とが確認された。
ＨＰＬＣにより単離した基質Ｉの開裂生成物はまた、ア
ミノ酸分析に供した。36.4′に溶出した断片は、Pro−I
le−Val−Gln−ＥＤＡＮＳであると同定された。47.224
に溶出した断片はＤＡＢＣＹＬ−Ser−Gln−Asn−Tryで
あると同定された。この分析により、基質Ｉのタンパク
質加水分解はTry−Pro結合で特異的に起こったことが確
認された。加えて、これら２つの蛍光団−標識テトラペ
プチド断片を独立に合成したところ、それらの逆相ＨＰ
ＬＣ上での保持時間は、基質特異的開裂生成物であると
予測されたＨＩＶプロテアーゼ放出断片のものと区別す
ることができなかった。
実施例５ ペプスタチンによるＨＩＶプロテアーゼの抑制： ペプスタチンによるＨＩＶプロテアーゼの抑制をも、本
発明の新規な蛍光発生基質を用いて調べた。ペプスタチ
ンは多くの細胞性アルパラギン酸プロテイナーゼの強力
なインヒビターであり、ＨＩＶプロテアーゼのインヒビ
ターであることが報告されている［シールマイアーら、
Proc.Natl.Acad.Sci.８５、６６１２（１９８８）；ギ
アムら、J.Biol.Chem.２６３、１４６１７（１９８
８）；シュナイダーら、Cell５４、３６３（１９８
８）；ハンセンら、ＥＭＢＯ Ｊ．７、１７８５（１９
８８）；ダークら、J.Biol.Chem.２６４、２３０７（１
９８９）；リチャーズら、ＦＥＢＳ Lett２４７、１１
３（１９８９）；ナットら、Proc.Natl.Acad.Sci.８
５、７１２９（１９８８）；クラウスリッヒら、Proc.N
atl.Acad.Sci.８６、８０７（１９８９）］。
本実施例では、pH４．７、３０℃でのペプスタチンによ
るＨＩＶプロテアーゼの抑制の測定を説明する。反応は
実質的に実施例２に記載した方法に従って行った。
３つの濃度の基質Ｉ（１０μＭ、３３μＭおよび１２９
μＭ）からデータを得、ペプスタチン濃度（nM）と１／
Ｖ（反応速度；分）nM）のディクソンプロットでプロッ
トした［ディクソン（Ｍ．Dixon）、Biochem.J.５５、
１７０（１９５３）、参考のため本明細書中に引用す
る］。このデータを第４図に示す。３つの直線の交差点
から１７ナノモルの抑制定数（Ｋｉ）が得られ、これ
は、たいていのアスパラギン酸プロテアーゼに対してそ
うであるように、ペプスタチンが非常にＨＩＶプロテア
ーゼの強力なインヒビターであることを示していた。
第５図に示すようにペプスタチン濃度（nM）と基質濃度
／Ｖ（分／nM）とでコーニッシュ−ボーデン（Cornish-
Bowden）の方法［コーニッシュ−ボーデン、Biochem.J.
１３７、１４３（１９７４）］によりプロットしたデー
タからは平行な直線が得られ、ペプスタチンによるプロ
テアーゼの抑制が全く競合的であることを示していた
（３３μＭの基質Ｉ濃度についてのデータは１０μＭの
基質Ｉ濃度についてのデータとほぼ一致したので、明瞭
のため省いた）。
実施例６ ＡＭＶプロテアーゼの蛍光発生アッセイ： 蛍光発生基質II（ＤＡＢＣＹＬ−gaba−Ser−Val−Val
−Try−Pro−Val−Val−Gln−ＥＤＡＮＳ）はＡＭＶプ
ロテアーゼの有効な基質であることがわかったので、こ
の酵素のインヒビターを同定し特徴付けるために有用で
ある。このアッセイは実質的に実施例３に記載の方法に
従って行った。
ＡＭＶプロテアーゼ（モレキュラー・ジェネティック・
リソースィズ（Molecular Genetic Resources）、タン
パ、ＦＬ）は、基質Ｉに対するよりも基質IIに対して少
なくとも５０倍活性であった。逆に、ＨＩＶプロテアー
ゼは基質II（３．４μＭ）よりも基質Ｉ（３．４μＭ）
を１０倍速く開裂した。このアッセイではペプスタチン
はＡＭＶプロテアーゼをかなり弱く抑制し、ＩＣ50（５
０％抑制を引き起こすインヒビターの濃度）はpH６で約
４０マイクロモル（μＭ）であった。
実施例７ 種々の蛍光発生基質の調製： 蛍光団および色原体消光剤（chromogenic quencher）の
両者の選択は、本発明のウイルス性プロテアーゼ蛍光団
−消光剤基質の設計を成功させるためのポイントであっ
た。最適なスペクトルの重複、すなわち蛍光ドナーの放
出が消光アクセプターの吸収と重複することが、バック
グラウンド蛍光を最小にするため、それゆえアッセイの
最大の動的範囲を得るために望ましいことであった。ア
クセプターおよびドナーの水性緩衝液中での溶解度もま
た考慮に入れた。これらのことを考慮に入れて、消光剤
としてＤＡＢＣＹＬを、蛍光団としてＥＤＡＮＳを選択
した。
ＨＩＶプロテアーゼおよびＡＭＶプロテアーゼの種々の
開裂部位に対応する一連のペプチドを、Ｎ末端側はＤＡ
ＢＣＹＬ基で、Ｃ末端側はＥＤＡＮＳで官能化して一連
の蛍光団−消光剤プロテアーゼ基質を生成した。これら
基質の調製は、実質的に実施例１に記載の方法に従って
行った。この方法においては、アゾ型の色原体をアセチ
ル４−アミノ酪酸結合を介してペプチドのＮ末端に結合
させた。
別法として、４−メチルアミノ酪酸のスルファミド（ma
da）結合を用いることもできた。対応するＮ標識試薬で
あるＤＡＢＣＹＬ−mada−ＮＨＳは以下のようにして調
製した。
(a)Ｎ−メチル−Ｎ−［４−（４′−ジメチルアミノフ
ェニル）アゾ−ベンゼンスルホニル］−γ−アミノ酪酸
（ＤＡＢＣＹＬ−mada−ＯＨ）の調製： γ−メチルアミノ酪酸（１．０ｇ、過剰量、アルドリッ
チ・ケミカル）を水（５０ml）中に溶解し、この溶液を
炭酸ナトリウムを用いてpH１０に調節した。ジメトキシ
エタン（３０ml）中の４−（４′−ジメチルアミノフェ
ニル）アゾ−ベンゼンスルホニルクロライド（０．８５
ｇ、２．６３ミリモル、シグマ）の溶液を加えた。この
混合物を一夜還流した。冷却後、この混合物を濃縮し、
残渣をシリカゲルカラム上のクロマトグラフィーにかけ
溶媒として２０％MeOH/EtOAcを用いて赤色の固体生成物
（０．７５mg）を得た。
(b)Ｎ−メチル−Ｎ−［４−（４′−ジメチルアミノフ
ェニル）アゾ−ベンゼンスルホニル］−γ−アミノ酪酸
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＤＡＢＣＹＬ−mada−
ＮＨＳ）の調製： Ｎ−メチル−Ｎ−［４−（４′−ジメチルアミノフェニ
ル）アゾ−ベンゼンスルホニル］−γ−アミノ酪酸（Ｄ
ＡＢＣＹＬ−mada−ＯＨ、０．７５ｇ、１．９ミリモ
ル）を乾燥ジメトキシエタン（５０ml）中に懸濁した。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．３ｇ、２．８ミリ
モル）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（０．４
５ｇ、２．２ミリモル）を加えた。ＴＬＣにより反応が
完了したことが示された後、混合物を濾過してＤＣＵ副
生成物を除いた。濾液を濃縮乾固し、残渣を塩化メチレ
ンで２回トリチュレートした。ついで、得られた溶液を
EtOAcを溶媒として用いたシリカゲルカラム上のクロマ
トグラフィーにかけて所望の生成物ＤＡＢＣＹＬ−mada
−ＮＨＳ（０．９０ｇ）を得た。
ついで、実質的に上記実施例１に記載の方法に従い、ペ
プチド配列および蛍光ドナーを結合させた。
かくして実施例１および実施例７に記載の方法に従って
調製した種々の蛍光発生プロテアーゼ基質を第１表にま
とめて示す。
実施例８ 蛍光発生基質に対するプロテアーゼ活性： 実質的に実施例３に記載の方法に従い、種々の蛍光発生
基質に対するＨＩＶプロテアーゼおよびＡＭＶプロテア
ーゼの活性を試験した。その結果を第１表にまとめて示
す。これらの化合物のうち、ＤＡＢＣＹＬ−gaba−Ser
−Gln−Asn−Tyr−Pro−Ile−Val−Gln−ＥＤＡＮＳを
もっと詳しく調べた。この化合物は、ＨＩＶプロテアー
ゼによっては極めて有効に開裂されるが、ＡＭＶプロテ
アーゼによっては開裂されないことがわかった。この化
合物はTyr−Pro結合において特異的に開裂されて蛍光シ
グナルを生成し、酵素活性を連続的にモニターすること
が可能になった。酵素の動力学的測定により、ミカエリ
ス−メンテンの反応速度定数（Ｋｍ）が１０３μＭであ
り、酵素反応の最大速度（Ｖmax）が４７nM／分である
ことが示された。第１表中の他の化合物の酵素活性につ
いては、表記のように定性的にのみ決定した。基質Ｖお
よびVIはＨＩＶプロテアーゼによって開裂されたが、基
質Ｉほどには有効に開裂されなかった。基質VIIは基質
Ｉよりも有効な基質であることがわかった（Ｋｍ＝５．
９μＭ、Vmax＝１．８nM／分）。
実施例９ 水溶解性の改善された蛍光発生ドナー／アクセプター基
質： ＥＤＡＮＳの負の荷電によりＤＡＢＣＹＬ／ＥＤＡＮ
Ｓ、ドナー／アクセプター基質に水性媒体中での所望の
溶解度が付与されるであろうことが予想されたが、溶解
度は制限因子であった。第１表中の化合物IIIおよびIV
の酵素活性は、これら化合物の溶解度が低いために測定
しなかった。
基質の溶解度を上昇させるために２つの方法をとった。
すなわち、ドナー基またはアクセプター基を修飾するこ
と、およびペプチドを修飾することである。
第一の方法では、荷電をより多く有する蛍光団または色
原体をＥＤＡＮＳまたはＤＡＢＣＹＬの代わりに用い
た。この目的のため、ルシファーイエロー型の蛍光団で
あるＮ−（２−アミノペンチル）−３−アミノ−2,7−
ジスルホ−1,8−ナフタルイミド二カリウム塩を用い
た。この分子中の２つのイオン性スルホン酸基により溶
解度を所望通りに上昇させることができた。
この蛍光団を用いて２つの化合物、ＤＡＢＣＹＬ−gaba
−Ser−Gln−Asn−Tyr−Pro−Ile−Val−Gln−ルシファ
ーイエロー型蛍光団およびＤＡＢＣＹＬ−gaba−Val−S
er−Phe−Asn−Phe−Pro−Gln−Ile−Thr−Leu−ルシフ
ァーイエロー型蛍光団を調製した。これらの基質は、実
質的に実施例１に記載の方法に従って調製した。
実質的に実施例３に記載の方法に従ってアッセイを行っ
たところ、これら両方の化合物がＨＩＶプロテアーゼ活
性であることが示された。データの示すところによる
と、対応するＥＤＡＮＳ基質のNaOAc（pH４．７）中で
の溶解度が約１５０μＭであるのと比較して、ＤＡＢＣ
ＹＬ−gaba−Ser−Gln−Asn−Tyr−Pro−Ile−Val−Gln
−ルシファーイエロー型蛍光団のNaOAc(pH4.7）中での
溶解度の上限は３５０μＭまたはそれ以上であった。
pH４．７の緩衝液中では、ルシファーイエロー化合物は
４４０nmにおいて最大励起を、５２０nmにおいて最大放
出を示し、一方、ＤＡＢＣＹＬの最大吸収はpH４．７に
おいて約４７０nmにおいて認められた。それゆえ、最適
なプロテアーゼ基質調製物を得るためには、ＤＡＢＣＹ
Ｌアクセプター基の代わりに、ルシファーイエロー型蛍
光団ともっと最適に重複するスペクトルを有する色原体
消光剤を用いるべきである。
溶解度を高める第二の方法は、開裂部位から最も遠い末
端部に極性アミノ酸を付加することによりペプチド配列
を修飾することであった。その例としては、His−Ser−
Gln−Asn−Tyr−Pro−Ile−Val−Gln−His（ヒスチジン
が溶解度を高める）、またはArg−Val−Ser−Phe−Asn
−Phe−Pro−Gln−Ile−Thr−Arg（アルギニンが溶解度
を高める）などが挙げられる。これらのペプチドを含有
する基質は、実質的に実施例１に記載の方法に従って調
製した。
本発明の発明概念が、他の酵素のための蛍光発生基質の
製造、並びにそのような基質の種々の蛍光アッセイ法中
での使用または試薬またはアッセイキットの製造に適用
可能であることは、当業者には明らかであろう。本発明
は、ウイルス性プロテアーゼの存在の検出に用いるため
の、蛍光ドナーと消光アクセプターとの間の分子内共鳴
エネルギー移動を利用した蛍光発生基質の製造を教示す
るものである。本明細書に示した態様は例示として示し
たもので本発明を制限することを意図したものではな
く、本発明の範囲内ですべての等価物を包含することを
意図するものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタ
レン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）の吸収スペクトル
および技術的蛍光スペクトル、および４−（４−ジメチ
ルアミノフェニル）アゾ安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）の吸
収スペクトルを示すグラフ； 第２図は、ＨＩＶプロテアーゼを添加する前の蛍光発生
基質ＤＡＢＣＹＬ−gaba−Ser−Gln−Asn−Tyr−Pro−I
le−Val−Gln−ＥＤＡＮＳ（基質Ｉ）の蛍光および４７
５nmでの吸光度を示すクロマトグラム； 第３図は、ＨＩＶプロテアーゼによるタンパク質加水分
解の基質Ｉの生成物の蛍光および４７５nmでの吸光度を
示すクロマトグラム； 第４図は、ペプスタチンによるＨＩＶプロテアーゼ活性
の抑制をペプスタチン濃度と反応速度の逆数とのディク
ソンプロットにより示したグラフ； 第５図は、ペプスタチンにしょるＨＩＶプロテアーゼ活
性の抑制をペプスタチン濃度と基質濃度／反応速度との
コーニッシュ−ボーデンプロットにより示したグラフで
ある。

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】(a)ペプチド、 (b)該ペプチドに結合した蛍光ドナー、および (c)該ペプチドに結合した消光アクセプターからなり、
    該ペプチドは該蛍光ドナーと該消光アクセプターとの間
    で分子内共鳴エネルギー移動が行なわれるに充分な立体
    構造を有し、該ペプチドはウイルス性プロテアーゼによ
    る酵素開裂部位を有することを特徴とする、蛍光発生基
    質。
  2. 【請求項２】該蛍光ドナーと該消光ドナーとが、約１０
    ０オングストローム未満の距離で離れている、請求項
    (1)に記載の蛍光発生基質。
  3. 【請求項３】該蛍光ドナーが、フルオレセインおよびフ
    ルオレセイン誘導体；Ｎ−（２−アミノペンチル）−３
    −アミノ−2,7−ジスルホ−1,8−ナフタルイミド二カリ
    ウム塩およびその誘導体；５−（（２−アミノエチル）
    アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸；およびクマリン
    およびクマリン誘導体よりなる群から選ばれたものであ
    る、請求項(1)に記載の蛍光発生基質。
  4. 【請求項４】該消光アクセプターが、2,4−ジニトロフ
    ェニル；４−（４−ジメチルアミノフェニル）アゾベン
    ゼンスルホン酸；および４−（４−ジメチルアミノフェ
    ニル）アゾ安息香酸およびその誘導体よりなる群から選
    ばれたものである、請求項(1)に記載の蛍光発生基質。
  5. 【請求項５】該ペプチドが、 Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln； Ser-Val-Val-Try-Pro-Val-Val-Gln； Val-Ser-Phe-Asn-Phe-Pro-Gln-Ile-Thr-Leu； Ser-Gln-Asn-Try-Met-Ile-Val-Gln； Ile-Arg-Gln-Ala-Asn-Phe-Leu-Gly-Leu； Ala-Thr-Leu-Asn-Phe-Pro-Ile-Ser-Gln-Glu； Thr-Ala-Thr-Ile-Met-Met-Gln-Arg-Gly-Glu； Thr-Phe-Gln-Ala-Tyr-Pro-Leu-Arg-Gln-Ala； His-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-His；および Arg-Val-Ser-Phe-Asn-Phe-Pro-Gln-Ile-Thr-Arg； よりなる群から選ばれたものである、請求項(1)に記載
    の蛍光発生基質。
  6. 【請求項６】式： かまたは式： で示される蛍光発生基質。
  7. 【請求項７】該蛍光ドナーが該ペプチドのＣ末端に結合
    しており、該消光アクセプターが該ペプチドのＮ末端に
    結合している、請求項(1)に記載の蛍光発生基質。
  8. 【請求項８】該ウイルス性プロテアーゼがヒト免疫不全
    ウイルスのプロテアーゼである、請求項(1)に記載の蛍
    光発生基質。
  9. 【請求項９】該ウイルス性プロテアーゼがニワトリ骨髄
    芽球症ウイルスのプロテアーゼである、請求項(1)に記
    載の蛍光発生基質。
  10. 【請求項１０】試料中のウイルス性プロテアーゼの存在
    または活性を検出するためのアッセイ法であって、(a)
    該試料を、蛍光発生基質であって (i)ペプチド、 (ii)該ペプチドに結合した蛍光ドナー、および (iii)該ペプチドに結合した消光アクセプターからな
    り、該ペプチドは該蛍光ドナーと該消光アクセプターと
    の間で分子内共鳴エネルギー移動が行なわれるに充分な
    立体構造を有することを特徴とする蛍光発生基質と混合
    することにより、目的酵素により該基質を開裂させて該
    蛍光ドナーおよび該消光アクセプターを分離させ、つい
    で (b)該蛍光ドナーの蛍光放出を検出する ことを特徴とする方法。
  11. 【請求項１１】基質の加水分解による該蛍光ドナーの蛍
    光放出を連続的に検出する工程をさらに含む、請求項(1
    0)に記載のアッセイ法。
  12. 【請求項１２】プロテアーゼがヒト免疫不全ウイルスの
    プロテアーゼであり、該蛍光発生基質が式： で示される化合物である、請求項(10)に記載のアッセイ
    法。
  13. 【請求項１３】プロテアーゼがニワトリ骨髄芽球症ウイ
    ルスのプロテアーゼであり、該蛍光発生基質が式： で示される化合物である、請求項(10)に記載のアッセイ
    法。
  14. 【請求項１４】プロテアーゼインヒビターの活性を検出
    するためのアッセイ法であって、 (a)該インヒビターを、プロテアーゼ、および蛍光発生
    基質であって (i)ペプチド、 (ii)該ペプチドに結合した蛍光ドナー、および (iii)該ペプチドに結合した消光アクセプターからな
    り、該ペプチドは該蛍光ドナーと該消光アクセプターと
    の間で分子内共鳴エネルギー移動が行なわれるに充分な
    立体構造を有することを特徴とする蛍光発生基質と混合
    することにより、該酵素により該基質を開裂させて該蛍
    光ドナーおよび該消光アクセプターを分離させ、ついで (b)該蛍光ドナーの蛍光放出を検出する ことを特徴とする方法。
  15. 【請求項１５】基質の加水分解による該蛍光ドナーの蛍
    光放出を連続的に検出する工程をさらに含む、請求項(1
    4)に記載のアッセイ法。
JP30093690A 1989-11-03 1990-11-05 蛍光発生基質およびそれを用いたタンパク質分解酵素の検出方法 Expired - Lifetime JPH0661279B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US43150189A 1989-11-03 1989-11-03
US431501 1989-11-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH03172196A JPH03172196A (ja) 1991-07-25
JPH0661279B2 true JPH0661279B2 (ja) 1994-08-17

Family

ID=23712215

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP30093690A Expired - Lifetime JPH0661279B2 (ja) 1989-11-03 1990-11-05 蛍光発生基質およびそれを用いたタンパク質分解酵素の検出方法

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP0428000A1 (ja)
JP (1) JPH0661279B2 (ja)
CA (1) CA2029123A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010248156A (ja) * 2009-04-17 2010-11-04 Genolac Bl:Kk 新規リンカーを用いた抗菌剤および診断薬

Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0751225B1 (en) * 1990-10-15 2001-03-28 Tecnogen S.C.P.A. Process for the identification of proteolytic activities and/or inhibitors thereof
GB9310978D0 (en) * 1993-05-27 1993-07-14 Zeneca Ltd Compounds
US6482655B1 (en) * 1993-07-23 2002-11-19 University Of Utah Research Foundation Immunoassay procedure utilizing fluorogenic tracer antigens
US6576419B1 (en) 1993-07-23 2003-06-10 University Of Utah Research Foundation Assay procedure using fluorogenic tracers
PT1921169E (pt) * 1993-11-12 2012-05-23 Phri Properties Inc Sondas de hibridação para detecção de ácidos nucleicos, troncos universais, métodos e estojos
JP4043535B2 (ja) * 1994-06-21 2008-02-06 サントリー株式会社 ペプチド基質並びにこれを用いるプロテイナーゼａ活性およびビールの泡安定性の測定方法
US5605809A (en) * 1994-10-28 1997-02-25 Oncoimmunin, Inc. Compositions for the detection of proteases in biological samples and methods of use thereof
US5625048A (en) 1994-11-10 1997-04-29 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
US5777079A (en) * 1994-11-10 1998-07-07 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
US5843658A (en) * 1995-03-10 1998-12-01 Hamamatsu Photonics K.K. Method of measuring oligonucleotide decomposing activity
US6008373A (en) * 1995-06-07 1999-12-28 Carnegie Mellon University Fluorescent labeling complexes with large stokes shift formed by coupling together cyanine and other fluorochromes capable of resonance energy transfer
AU6754196A (en) * 1995-08-25 1997-03-19 Rational Drug Design Laboratories Novel fluorescent substrate for assaying activity of hepatitis c virus ns3 serine protease
EP1019528B1 (en) * 1996-01-04 2003-10-29 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno Method for assaying proteolytic enzymes using fluorescence-quenched substrates
US6803188B1 (en) 1996-01-31 2004-10-12 The Regents Of The University Of California Tandem fluorescent protein constructs
US6900304B2 (en) 1996-01-31 2005-05-31 The Regents Of The University Of California Emission ratiometric indicators of phosphorylation
WO1997040065A2 (en) 1996-04-24 1997-10-30 Peptide Therapeutics Limited Substrates and inhibitors of proteolytic enzymes
US5912137A (en) * 1996-07-16 1999-06-15 The Regents Of The University Of California Assays for protein kinases using fluorescent
US5925558A (en) * 1996-07-16 1999-07-20 The Regents Of The University Of California Assays for protein kinases using fluorescent protein substrates
DE69731960T2 (de) * 1996-09-24 2005-12-15 Cadus Pharmaceutical Corp. Verfahren und zusammensetzungen für die identifizierung von receptor effectoren
DE19639450A1 (de) * 1996-09-25 1998-04-09 Deutsches Krebsforsch Verfahren zum diagnostischen Nachweis von Apoptose in Zellen
US5853992A (en) * 1996-10-04 1998-12-29 The Regents Of The University Of California Cyanine dyes with high-absorbance cross section as donor chromophores in energy transfer labels
AU4904397A (en) * 1996-10-17 1998-05-11 Chiron Corporation Protease regulator screening assay
US5998204A (en) * 1997-03-14 1999-12-07 The Regents Of The University Of California Fluorescent protein sensors for detection of analytes
US6197928B1 (en) 1997-03-14 2001-03-06 The Regents Of The University Of California Fluorescent protein sensors for detection of analytes
CN1254383A (zh) 1997-05-01 2000-05-24 美国3M公司 基于染料二聚作用的生荧光蛋白水解酶底物
KR100575407B1 (ko) * 1998-01-09 2006-05-03 미네소타 마이닝 앤드 매뉴팩춰링 캄파니 효소 특이적 절단성 폴리뉴클레오티드 기질 및 이의 분석방법
US6495664B1 (en) 1998-07-24 2002-12-17 Aurora Biosciences Corporation Fluorescent protein sensors of post-translational modifications
DE19840545A1 (de) * 1998-08-28 2000-03-09 Jerini Biotools Gmbh Festphasengebundene Peptide mit intramolekularem Fluoreszenz-Energie-Transfer zur Identifizierung von Substraten und Inhibitoren von Proteasen
GB9904401D0 (en) * 1999-02-25 1999-04-21 Fluorescience Ltd Assay method
US6410255B1 (en) 1999-05-05 2002-06-25 Aurora Biosciences Corporation Optical probes and assays
CA2374215C (en) 1999-05-28 2011-05-24 Virco N.V. New mutational profiles in hiv-1 reverse transcriptase correlated with phenotypic drug resistance
AU2001296211B2 (en) * 2000-05-03 2005-09-22 Expressive Constructs, Inc. A device for detecting bacterial contamination and method of use
US20030096315A1 (en) 2000-05-03 2003-05-22 Sanders Mitchell C. Device for detecting bacterial contamination and method of use
BR0115132A (pt) 2000-10-20 2004-06-15 Virco Bvba Perfis mutacionais em transcriptase reversa de hiv-1 correlacionados com resistência à droga fenotìpica
DE10117430A1 (de) * 2001-04-06 2002-10-10 Nicole Marme Hochempfindlicher und hochspezifischer Enzymnachweis mit einer Nachweisgrenze bis in den femtomolaren Bereich
JP3829252B2 (ja) 2001-06-08 2006-10-04 独立行政法人理化学研究所 蛍光蛋白質
JP2005501248A (ja) * 2001-08-23 2005-01-13 キュー・ティ・エル・バイオシステムズ・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 生物学的分子を検出および定量するためのバイオセンシングプラットホーム
ES2302860T3 (es) 2001-11-08 2008-08-01 Tibotec Pharmaceuticals Ltd. Ensayo de proteasas para la monitorizacion terapeutica de farmacos.
CA2474458A1 (en) 2002-01-31 2003-08-07 Mitchell C. Sanders Method for detecting microorganisms
GB0208989D0 (en) * 2002-04-19 2002-05-29 Amersham Biosciences Uk Ltd Methods for measuring enzyme activity
GB2398123B (en) * 2002-04-19 2005-03-02 Amersham Biosciences Uk Ltd Methods for measuring enzyme activity
AU2003251732B2 (en) 2002-07-01 2008-09-18 Tibotec Pharmaceuticals Ltd. New mutational profiles in HIV-1 reverse transcriptase correlated with phenotypic drug resistance
ATE432506T1 (de) 2002-07-01 2009-06-15 Tibotec Pharm Ltd Mutationsprofile bei mit phänotypischer medikamentenresistenz korrelierter hiv-1-protease
WO2004087942A2 (en) * 2003-01-31 2004-10-14 Ethicon, Inc. Method for detecting escherichia coli
US7727752B2 (en) 2003-07-29 2010-06-01 Life Technologies Corporation Kinase and phosphatase assays
DE602004011105T2 (de) 2003-11-03 2008-12-18 Ethicon, Inc. Verfahren, peptide und biosensoren mit eignung zum nachweis eines breiten spektrums von bakterien
US8227621B2 (en) 2005-06-30 2012-07-24 Li-Cor, Inc. Cyanine dyes and methods of use
CA2621137C (en) * 2005-09-02 2014-07-29 Visen Medical, Inc. Biocompatible n,n-disubstituted sulfonamide-containing fluorescent dye labels
US7998717B2 (en) 2005-12-02 2011-08-16 Pacific Biosciences Of California, Inc. Mitigation of photodamage in analytical reactions
US8834846B2 (en) 2010-05-06 2014-09-16 Bruker Biospin Corporation Fluorescent NIRF activatable probes for disease detection
US8834847B2 (en) 2010-08-12 2014-09-16 Pacific Biosciences Of California, Inc. Photodamage mitigation compounds and systems
JP6510747B2 (ja) * 2013-08-02 2019-05-08 東洋ビーネット株式会社 プロテアーゼ活性測定法
JP2019532301A (ja) * 2016-07-15 2019-11-07 イ，ジフン 血液凝固因子検出のための化学発光バイオセンサー
JP2019068869A (ja) * 2019-02-18 2019-05-09 東洋ビーネット株式会社 プロテアーゼ活性測定法
CN111896504A (zh) * 2020-06-17 2020-11-06 山东省医学科学院基础医学研究所 一种新型冠状病毒Mpro蛋白酶靶点药物筛选试剂盒及其应用
US11603552B2 (en) 2020-07-20 2023-03-14 Mesa Photonics, LLC Method for pathogen identification

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0046742B1 (en) * 1980-08-25 1984-06-27 KabiVitrum AB Peptide substrates for determination of protease activity
CA1273552A (en) * 1985-12-23 1990-09-04 Michael J. Heller Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization assays
US4822746A (en) * 1986-06-25 1989-04-18 Trustees Of Tufts College Radiative and non-radiative energy transfer and absorbance modulated fluorescence detection methods and sensors
GB8820887D0 (en) * 1988-09-06 1988-10-05 Atomic Energy Authority Uk Detecting selected species
DE3842197A1 (de) * 1988-12-15 1990-06-21 Hoechst Ag Rasch spaltbares substrat fuer die hiv-protease

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010248156A (ja) * 2009-04-17 2010-11-04 Genolac Bl:Kk 新規リンカーを用いた抗菌剤および診断薬

Also Published As

Publication number Publication date
CA2029123A1 (en) 1991-05-04
EP0428000A1 (en) 1991-05-22
JPH03172196A (ja) 1991-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH0661279B2 (ja) 蛍光発生基質およびそれを用いたタンパク質分解酵素の検出方法
US5976822A (en) Method and reagent for monitoring apoptosis and distinguishing apoptosis from necrosis
Matayoshi et al. Novel fluorogenic substrates for assaying retroviral proteases by resonance energy transfer
Wang et al. Design and synthesis of new fluorogenic HIV protease substrates based on resonance energy transfer
JP3645566B2 (ja) 蛍光エネルギー伝達基質
EP1675960B1 (en) Method of detecting protease activity
US5843681A (en) Dioxetane compounds for the chemiluminescent detection of proteases, methods of use and kits therefore
Zhang et al. Dissociative inhibition of dimeric enzymes. Kinetic characterization of the inhibition of HIV-1 protease by its COOH-terminal tetrapeptide
US4640893A (en) Novel rhodamine derivatives as fluorogenic substrates for proteinases
US7879574B2 (en) Compositions for the detection of enzyme activity in biological samples and methods of use thereof
EP0046742B1 (en) Peptide substrates for determination of protease activity
JP2001514506A (ja) プロテアーゼ阻害剤分析
US20030108862A1 (en) Direct binding assay for identifying inhibitors of HCV polymerase
CA2627628A1 (en) Novel fluorescent dyes and uses thereof
JPH03118449A (ja) ヒト血清アルブミンの検出及び測定法
JPH0411199B2 (ja)
JP4065931B2 (ja) 染料二量体化に基づく蛍光発生プロテアーゼ基質
JPS6126558B2 (ja)
Krafft et al. [6] Synthetic approaches to continuous assays of retroviral proteases
US20090258381A1 (en) Methods for Determining the Cleavability of Substrates
JPS6117956A (ja) 新規な尿中カリクレイン測定用基質
US4894438A (en) Synthetic peptidic substrate for determination of trypsin and α1
EP1157984A2 (en) Trypsin substrate and diagnostic device, and method of using same
Yonezawa et al. Determination of pepstatin-sensitive carboxyl proteases by using pepstatinyldansyldiaminopropane (dansyl-pepstatin) as an active site titrant
Sato Development of Novel Doubly Labelled Peptide Probes with Identical Fluorophores for Protease Activity Measurement