ES2302860T3 - Ensayo de proteasas para la monitorizacion terapeutica de farmacos. - Google Patents
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Abstract
Método para determinar la potencia inhibidora de un inhibidor del VIH en una muestra biológica, que comprende: i) utilizar una muestra biológica de un paciente; ii) proporcionar una molécula bioactiva en la que la molécula bioactiva es una proteasa del VIH; iii) proporcionar un reactivo para la molécula bioactiva en el que el reactivo es un sustrato para la proteasa del VIH, siendo R-E(EDANS)-S-Q-N-Y-P-I-V-Q-K(DABCYL)-R-OH; iv) añadir la muestra biológica, la molécula bioactiva y el reactivo para una molécula bioactiva a un contenedor; v) determinar una señal; vi) relacionar la señal de v) con una curva patrón de referencia preparada con al menos una referencia.
Description
Ensayo de proteasas para la monitorización
terapéutica de fármacos.
Los ensayos cualitativos y cuantitativos son de
gran importancia en diferentes campos de las ciencias de la vida.
La presente invención se refiere al uso de ensayos biológicos para
determinar la cantidad o la concentración de un principio activo
presente en una muestra. En particular, el ensayo enzimático de la
presente invención determina la cantidad o la concentración de
inhibidores de proteasas, incluyendo inhibidores de proteasas
retrovirales tales como inhibidores de proteasas del virus de la
inmunodeficiencia humana, en una muestra.
La monitorización terapéutica de fármacos
desempeña un importante papel en el seguimiento de la eficacia de
tratamientos. Con el fin de alcanzar un efecto terapéutico, los
fármacos que actúan como inhibidores enzimáticos deben
administrarse en dosificaciones que proporcionen inhibición
suficiente de la enzima implicada. Las herramientas de diagnóstico
se han desarrollado para monitorizar el efecto terapéutico de
fármacos en un paciente a una determinada concentración.
Los ensayos de monitorización actuales para los
inhibidores del VIH (virus de la inmunodeficiencia humana, VIH) se
basan en técnicas tales como la cromatografía de capa fina (CCF),
cromatografía líquida de alta presión (HPLC), espectrometría de
masas (EM) y cromatografía de
líquidos-espectrometría de masas
(LC-EM) [Ther. Drug Monit. 2001, 23(4), 380;
J. Chromatogr. B Biomed Sci. Appl (2001), 758(2), 129; J.
Chromatogr. B Biomed Sci. Appl (2000), 740(1), 43]. Aunque
estos métodos pueden monitorizar simultáneamente varios inhibidores
en una única muestra del paciente, estos ensayos no proporcionan
una medición de la inhibición de la enzima diana. Leela y
cols. informan de que los métodos actuales para determinar los
inhibidores del VIH no están disponibles de manera rutinaria en un
laboratorio clínico y que se necesita un ensayo simplificado, menos
tedioso y que todavía necesita desarrollarse. [Ann. Pharmacother.
2001, 35(6), 745].
El uso de enzimas para monitorizar
concentraciones del fármaco se describió en por ejemplo los
documentos US 4.918.001, US 4.546.076, US 5.576.177 y WO 99/54734.
La última publicación de patente da a conocer el uso de alfileres
recubiertos que se insertan en una disolución. Por ejemplo, si los
alfileres están recubiertos con un sustrato, entonces la proteasa y
finalmente el inhibidor están presentes en la disolución. Con la
inserción de los alfileres comienza la reacción y la extracción de
los alfileres del vaso de reacción para la reacción enzimática. El
documento US 4.546.076 da a conocer el uso de un ensayo enzimático
para monitorizar la concentración de antibióticos
\beta-lactámicos presentes en una muestra. El
documento US 4.918.001 describe un ensayo para medir la
concentración de inhibidores de proteasas endógenos.
Se han descrito métodos en los que se mide la
actividad proteasa residual presente en una muestra de paciente
[véase por ejemplo el documento EP148193; Ther. Drug Monit. 2001,
23(2), 93]. La actividad enzimática residual es una medición
del efecto farmacológico y el cumplimiento del paciente. Este tipo
de ensayo proporciona información sobre si la ruta se inhibe
suficientemente. No se obtiene información con respecto al nivel de
dicho fármaco en la muestra. Este tipo de ensayo solamente puede
usarse para monitorizar de manera rutinaria si la enzima diana es
accesible fácilmente de manera no invasiva y si está presente en
dicha muestra en cantidades suficientes para permitir una reacción
enzimática. Por tanto, este enfoque no puede usarse fácilmente para
detectar inhibidores de proteasas del VIH presentes en una muestra
de paciente tal como suero, puesto que la proteasa del VIH no está
presente en cantidades suficientes en suero.
El uso de sustratos fluorescentes para medir la
actividad de proteasas del VIH se describió en por ejemplo
Matayoshi y cols. [Science 1990, 247, 954], Tyagi y
cols. [Anal. Biochem. 1992, 200(1), 143], Toth y
cols. [Int. J. Pept. Protein Res. 1990, 36(6), 544] y
Wang y cols. [Tetrahedron 1990, 31(45), 6493] y en
varias publicaciones de patentes [véanse por ejemplo los documentos
WO99/67417; EP428000, EP518557]. Estas descripciones describen cómo
determinar el efecto de inhibidores sobre la proteasa del VIH. Estos
ensayos son útiles para la detección de alto rendimiento. Mientras
que en las estrategias de alto rendimiento se realiza una detección
positiva negativa, es decir inhibición o no, los ensayos clínicos
necesitan proporcionar una medición de la eficacia terapéutica con
el fin de permitir al facultativo sacar conclusiones relacionadas
con el tratamiento. En ensayos de detección se conoce la
concentración del compuesto en investigación, sin embargo, en
muestras clínicas se desconoce la concentración del compuesto.
En vista de la individualización del tratamiento
del paciente, existe una necesidad de un enfoque flexible para
determinar la cantidad o la concentración de un principio activo en
una muestra biológica. Además, existe una necesidad de un ensayo
que también pueda explicar el efecto de metabolitos de fármacos
sobre la molécula bioactiva. Por tanto se preparó la presente
invención, que comprende añadir la molécula bioactiva a una muestra
biológica y medir la actividad de la molécula bioactiva. En vista de
la importancia de determinar la concentración de fármacos libres y
unidos a proteína, la presente invención introduce un procedimiento
de separación para satisfacer esta necesidad.
La presente invención se refiere a un método
bioanalítico mejorado para determinar concentraciones de fármacos
presentes en una muestra de paciente. Más específicamente, el método
se refiere a un ensayo de fluorescencia para cuantificar la
potencia inhibidora de una muestra biológica. El método puede usarse
en un enfoque integrado con respecto a los resultados de unión,
modelado terapéutico de fármacos de técnicas bioanalíticas con
pruebas de resistencia y datos farmacológicos.
La invención se refiere a un método para
determinar la potencia inhibidora de un inhibidor del VIH en una
muestra biológica, que comprende: i) utilizar una muestra biológica
de un paciente; ii) proporcionar una molécula bioactiva en la que
la molécula bioactiva es una proteasa del VIH; iii) proporcionar un
reactivo para la molécula bioactiva en el que el reactivo es un
sustrato para la proteasa del VIH, siendo
R-E(EDANS)-S-Q-N-Y-P-I-V-Q-KDABCYL)-R-OH;
iv) añadir la muestra biológica, la molécula bioactiva y el
reactivo para una molécula bioactiva a un contenedor; v) determinar
una señal; vi) relacionar la señal de v) a una curva patrón de
referencia preparada con al menos una referencia.
Según la presente invención una "muestra
biológica" incluye cualquier muestra derivada de un organismo, es
decir un ser humano o un animal, que comprende opcionalmente un
principio activo. Una muestra biológica incluye, pero no se limita
a sangre, suero, plasma, saliva, líquido cefalorraquídeo, eyaculado,
lavado ductal mamario y pelo. Una muestra biológica incluye además
muestras obtenidas a partir de frascos de cultivo, pocillos y otros
tipos de contenedores. Dicha muestra biológica puede comprender uno
o más principios activos.
Una "molécula bioactiva" usada en la
presente invención incluye moléculas bioactivas de tipo natural o
versiones recombinantes de las mismas. Las versiones recombinantes
pueden incluir mutaciones indicativas de la resistencia a uno o más
principios activos, pueden incluir resto(s)
fluorescente(s) o de extinción de fluorescencia o pueden ser
un constructo de fusión. La molécula bioactiva puede usarse junto
con sustratos o ligandos marcados con el fin de proporcionar un
ensayo homogéneo (por ejemplo transferencia de energía por
resonancia de fluorescencia, FRET; transferencia de energía por
resonancia bioluminiscente, BRET). Una molécula bioactiva de la
presente invención significa cualquier molécula biológica que
muestra por ejemplo actividad enzimática, por ejemplo proteasa del
VIH, transcriptasa inversa del VIH, proteasa del VHC (VHC, virus de
la hepatitis C), polimerasa del VIH,
metalo-proteinasas de matriz, renina, trombina;
actividad de unión u otro tipo de interacción. Una molécula
bioactiva puede proporcionarse en una disolución por ejemplo, una
disolución tamponada.
Un "reactivo" para una molécula bioactiva
incluye sustratos para enzimas; ligandos para receptores. Un
reactivo incluye además, cofactores, anticuerpos, aptámeros etc. En
una realización el reactivo es un sustrato para la proteasa del VIH
o un sustrato para la proteasa del VHC. En un aspecto de la
invención, la conversión de dicho sustrato en la molécula bioactiva
puede monitorizarse usando fluorescencia. El reactivo puede
proporcionarse en una disolución. Los ejemplos de disoluciones
incluyen tampones, disolventes orgánicos, disoluciones tamponadas
completadas con disolventes orgánicos.
Un "principio activo" significa cualquier
compuesto, incluyendo un compuesto químico, fármaco, anticuerpo,
ligando, compuesto antisentido, aptámero, ribozima, péptido, péptido
no natural, proteína, APN (ácido péptidonucleico) y ácidos
nucleicos o una composición que incluye al menos un compuesto. Ésta
comprende además los compuestos tal como se administran y sus
metabolitos. Los metabolitos pueden generarse en condiciones
fisiológicas. Tal como se usa en la presente invención, el nivel de
un principio activo significa la cantidad o la concentración de
dicho principio activo en dichas muestra. El principio activo
presente en la muestra biológica puede diferir del principio activo
en la referencia. En estas circunstancias, la potencia inhibidora de
la muestra biológica es igual a una cantidad o una concentración de
principio activo derivada de una curva patrón de referencia. La
cantidad puede expresarse como, por ejemplo, g, ml, mol. La
concentración puede expresarse por ejemplo como ml/ml, g/l, M y
similares.
Una "matriz" según la presente invención
incluye una disolución, un tampón, una muestra biológica que incluye
pero no se limita sangre, plasma, suero, saliva, líquido
cefalorraquídeo, eyaculado, lavado ductal mamario u homogeneizados
tisulares o una muestra biológica completada además con un
tampón.
Un "contenedor" tal como se usa en la
invención incluye pero no se limita a un vaso, un pocillo, una
cubeta, un recipiente, etc. Los compuestos o líquidos pueden
mezclarse en dicho contenedor. De manera adecuada, la determinación
se realiza en dicho contenedor. El contenedor puede ser una entidad
separada por ejemplo una cubeta de cuarzo o puede estar dispuesta
en un formato múltiple tal como por ejemplo una placa de 16
pocillos, una placa de 96 pocillos, una placa de 384 pocillos.
Una "señal" significa cualquier salida
generada mediante el ensayo biológico que incluye fluorescencia,
polarización de fluorescencia, fluorescencia resuelta en el tiempo,
luminiscencia, luminiscencia resuelta en el tiempo, absorbancia,
radiactividad, mecanismos de transferencia de energía por
resonancia, magnetismo. En un aspecto, la salida se genera durante
el ensayo. Los ejemplos de señales incluyen unidades de
fluorescencia relativa, absorbancia y similares. La señal puede ser
generada haciendo reaccionar la molécula bioactiva con el reactivo
para la molécula bioactiva. Una señal puede determinarse al final de
un periodo de incubación definido previamente, por ejemplo tras 10
minutos. Una señal puede monitorizarse continuamente. Esto incluye
que a intervalos de tiempo regulares se registra una señal. Este
intervalo de tiempo regular incluye por ejemplo intervalos de
tiempo definidos previamente, por ejemplo, cada 10 segundos, cada 5
segundos y similares. Una señal puede convertirse en una razón de
señales. Los ejemplos de tales razones incluyen la razón de una
señal generada mediante una muestra biológica con respecto la señal
generada en una reacción control. Una señal puede convertirse en
variables cinéticas que incluyen la velocidad inicial, velocidad
máxima, velocidad media.
Una "referencia" significa un principio
activo que se utiliza para preparar la curva patrón de referencia.
La referencia es un único compuesto o una mezcla de al menos dos
compuestos. Dicha referencia puede estar presente en una matriz
idéntica a la de la muestra biológica. Dicha referencia no necesita
ser necesariamente el mismo principio activo que está presente en
la muestra biológica. En un enfoque, el compuesto utilizado como
referencia es el mismo que el principio activo presente en la
muestra biológica.
Un "ensayo biológico" significa un ensayo
que se basa en la determinación de los efectos biológicos generados
mediante una molécula bioactiva, incluyen la determinación de una
reacción enzimática, una interacción
receptor-ligando, actividad ADN polimerasa,
actividad transcriptasa inversa, actividad integrasa, interacciones
antígeno-anticuerpo y similares.
"Relacionar" significa que la señal
determinada se compara con una curva patrón de referencia, curva a
partir de la que puede convertirse la señal en una medición de la
inhibición o en un nivel de compuesto de referencia.
La "curva patrón de referencia" incluye
pero no se limita a una curva en la que la señal se traza frente a
la medición de inhibición. Dicha medición de inhibición puede
expresarse como un porcentaje. La curva patrón de referencia
incluye además curvas en las que la señal se traza frente a una
concentración de referencia o una cantidad de referencia. Una curva
patrón de referencia también puede construirse trazando una razón,
por ejemplo una razón de la señal determinada con la muestra
biológica con respecto a la señal determinada con el control,
frente a un nivel de un principio activo. De manera adecuada, dicha
curva patrón de referencia se ha preparado según el procedimiento
de la presente invención en particular como las etapas i) a v)
enumeradas. En la preparación de una curva patrón de referencia se
usa una referencia en lugar de una muestra biológica, en la etapa
i). Sin embargo, la molécula bioactiva y el reactivo para una
molécula bioactiva son idénticos a los usados para el análisis de
la muestra biológica. El "valor correspondiente" incluye la
señal, la actividad, el porcentaje de inhibición, el nivel de
principio activo presente en la referencia basándose en la
determinación de la referencia en la curva patrón de referencia.
Dicho nivel puede expresarse como una concentración (por ejemplo
Molar, g/l, g/g etc.) o como una cantidad (mol, g, ml, mg,...).
La "potencia inhibidora" puede expresarse
como un porcentaje de inhibición, como un nivel de principio activo,
es decir una cantidad o una concentración de principio activo. Este
es un objeto de la presente invención, que el principio activo
presente en la muestra biológica puede diferir del principio activo
utilizado para establecer una curva patrón de referencia. Si el
principio activo utilizado para preparar la curva patrón de
referencia difiere del principio activo en la muestra biológica, la
potencia inhibidora de la muestra biológica puede relacionarse con
una cantidad equivalente del principio activo utilizado para
preparar la curva patrón de referencia. En tal caso, la potencia
inhibidora puede expresarse como un nivel de fármaco, es decir la
señal generada mediante una muestra biológica se relacionará con un
nivel de fármaco correspondiente. En una realización, el principio
activo utilizado para preparar la curva patrón de referencia es el
mismo que el principio activo presente en la muestra biológica. En
este último caso, la potencia inhibidora es equivalente al nivel del
principio activo en la muestra biológica.
En la determinación de la potencia inhibidora de
un principio activo en una muestra biológica, las etapas i) a iii)
pueden colocarse en cualquier orden. En la etapa iv), los
componentes respectivos pueden añadirse en diferentes órdenes. Por
ejemplo, si una actividad proteasa se determina según los métodos de
la presente invención, se necesitan tres componentes, una muestra
biológica, una proteasa y un sustrato para la proteasa. Estos tres
componentes pueden mezclarse en cualquier orden, siempre que para el
fin de la presente invención, la reacción se inicie con o bien la
molécula bioactiva o bien el reactivo para la molécula bioactiva.
Por ejemplo, la muestra biológica puede añadirse en primer lugar al
reactivo de la molécula bioactiva. En este procedimiento, la
reacción se inicia añadiendo la molécula bioactiva a la mezcla y la
determinación posterior de la señal. Esta claro que también la
muestra biológica puede añadirse en primer lugar a la molécula
bioactiva. En este enfoque, la reacción se inicia mediante la
adición del reactivo para la molécula bioactiva. Estará claro para
el experto en la técnica que en el procedimiento anterior en lugar
de añadir la muestra biológica a cualquiera de la molécula
bioactiva o el reactivo de la molécula bioactiva, también puede
realizarse lo inverso. Por ejemplo, la molécula bioactiva puede
añadirse a la muestra biológica, después de lo cual se completa la
mezcla de reacción con un reactivo de la molécula bioactiva.
Puede determinarse una señal en blanco. Esto
significa una reacción sin molécula bioactiva, por ejemplo la
enzima, o sin reactivo para la molécula bioactiva. Para estos fines,
la molécula bioactiva o el reactivo para la molécula bioactiva
puede sustituirse por un tampón. Dicha señal en blanco puede
restarse de la señal determinada cuando se prepara la curva patrón
de referencia o cuando se determina la potencia inhibidora de un
principio activo en una muestra biológica. Dicha señal en blanco
representa la señal generada mediante el reactivo sin interacción
con la molécula bioactiva o reactivo para la molécula bioactiva.
Puede determinarse una señal de control. Dicha
señal de control se obtiene cuando no está presente ningún
principio activo en la muestra biológica o en la matriz para
preparar la curva patrón de referencia. Dicha señal de control
puede usarse como un valor al 100%. Alternativamente dicha señal de
control puede usarse para obtener razones de las señales generadas
con las muestras biológicas o con las referencias para preparar la
curva patrón de
referencia.
referencia.
Según un enfoque, la muestra biológica se trata
con un disolvente, tal como un disolvente orgánico que incluye
metanol, etanol, para obtener un extracto que comprende principios
activos. El extracto, es decir la disolución que comprende
principios activos, se transfiere posteriormente a un contenedor.
Posteriormente, en el caso del VIH, puede determinarse la potencia
inhibidora midiendo la actividad de la proteasa del VIH tras
completar el contenedor con la proteasa y un sustrato para la
proteasa. Tanto el extracto como la muestra biológica pueden
necesitar dilución antes del ensayo. En un aspecto, la muestra
biológica o el extracto pueden diluirse para obtener una señal que
oscila desde aproximadamente el 30% hasta aproximadamente el 70% de
la señal de control, de manera interesante desde aproximadamente el
40% hasta aproximadamente el 60% de la señal de control.
La proteasa puede ser una forma de tipo natural
o contener una o más mutaciones. Esas mutaciones pueden influir en
la actividad proteasa. En una realización puede utilizarse una
proteasa del VIH mutante. Por ejemplo, la proteasa del VIH puede
comprender una o más mutaciones seleccionadas de las lista que
consiste en mutaciones en la posición de aminoácido 3, 10, 20, 24,
32, 33, 35, 36, 37, 46, 47, 50, 53, 54, 57, 58, 63, 70, 71, 72, 73,
77, 82, 84, 88, 89 ó 90 frente a la proteasa del VIH de tipo natural
(número de registro Genbank K 03455). La proteasa puede estar
presente en una disolución tamponada. Se usa una disolución
tamponada para mantener el pH de la disolución constante durante la
reacción y puede completarse además con iones para ajustar la
fuerza iónica del tampón y puede completarse además con, por
ejemplo, antioxidantes, agentes quelantes metálicos, detergentes,
cofactores o disolventes. Los ejemplos de tampones incluyen tampón
citrato, tampón fosfato, tampón acetato. La proteasa puede estar
presente en una concentración que oscila desde aproximadamente 1
picomolar hasta aproximadamente 10 micromolar, de manera adecuada
que oscila desde aproximadamente 1 nanomolar hasta aproximadamente 1
micromolar, durante el ensayo biológico.
El sustrato también puede proporcionarse en una
disolución, una disolución tamponada, un disolvente orgánico o
mezclas de los mismos. En un enfoque, puede usarse el mismo tampón
para preparar la disolución de la proteasa y la disolución de
sustrato. La actividad enzimática puede medirse usando, por ejemplo,
un sustrato fluorogénico, cromogénico o fluorogénico extinguido.
Otros métodos para medir interacciones entre una molécula bioactiva,
su reactivo y un principio activo se conocen en la técnica y pueden
basarse, por ejemplo, en FRET, BRET. En estos últimos enfoques, uno
o ambos de los compuestos que interaccionan pueden marcarse mediante
una molécula fluorescente. La interacción da como resultado una
transferencia por resonancia de la longitud de onda excitada. Los
sustratos que son de interés en vista de la presente invención
incluyen los compuestos que incluyen un resto seleccionado del
grupo que consiste en
7-amino-4-metilcumarina,
7-amino-4-carbamoilcumarina,
paranitroanilida, beta-naftilamida, aminobenzoílo,
tetrametilrodamina, EDANS, DANSYL, fluoresceína o DABCYL. El
sustrato puede contener una estructura peptídica derivada de las
proteínas del VIH que incluyen gag, proteasa, transcriptasa
inversa, integrasa, p17, p24 o combinaciones de las mismas. De
manera interesante, dicha estructura peptídica contiene de 2 a 30
aminoácidos, de manera de adecuada de 3 a 15 aminoácidos, de manera
más adecuada de 3 a 10 aminoácidos. Los ejemplos de tales
estructuras incluyen las secuencias
S-Q-N-T-P-I-V-N,
S-Q-N-Y-P-I-V-W-L
ó
S-Q-N-Y-P-I-V-Q-K,
en las que los aminoácidos se representan por su código de una letra
(Practical Biochemistry, 5ª edición, Ed. Wilson & Walker,
Cambridge University Press, Cambridge, 2000, pág. 313). Una
estructura interesante comprende la secuencia de aminoácidos
P-I-V. Otra estructura interesante
comprende la tétrada
Y-P-I-V. Un
sustrato interesante es
AR-V-Y-F(NO_{2})-E-A-Nle(Nle,
norleucina). También pueden usarse sustratos de autoextinción
(documento WO 99/50579). Los sustratos interesantes para medir la
proteasa del VIH incluyen los que comprenden combinaciones de
DABCYL y EDANS en una estructura peptídica; o la combinación de
restos de aminobenzoílo y nitrofenilo en una estructura peptídica.
En el caso de que se determine la proteasa del VHC, los sustratos
pueden diseñarse basándose en la secuencia de las proteínas del VHC.
Sustratos interesantes incluyen:
(7-metoxicumarin-4-il)acetil
(Mca)-D-D-I-V-P-C-S-M-S-(2,4-dinitrofenil,
Dnp) K y
Mca-D-D-I-V-P-C-S-M-K(Dnp)-R-R
(J. Virol. Meth. 1999, 80, 77-84), éster
Ac-D-T-E-D-V-V-P(Nva)-O-4-fenilazofenílico
(Ac, acetilo) (Nva, norvalina) (Anal. Biochem. 1999, 270,
268-275), sustratos fluorogénicos depsipeptídicos
extinguidos internamente basándose en la transferencia de energía
por resonancia entre la pareja donador/aceptor ácido
5-[(2'-aminoetil)amino]naftalenosulfónico/ácido
4-[[4'-(dimetilamino)fenil]azo]benzoico.
Sustratos interesantes para la proteasa del virus de la hepatitis C
se basan en la transferencia de energía por resonancia de sustratos
depsipeptídicos (Anal. Biochem. 1996, 240, 60-67).
Durante el ensayo biológico, el sustrato puede estar presente en una
concentración que oscila desde aproximadamente 1 nanomolar hasta
aproximadamente 500 milimolar, de manera interesante que oscila
desde aproximadamente 1 micromolar hasta aproximadamente 100
milimolar, de manera más interesante desde aproximadamente 10
micromolar hasta aproximadamente 1 milimolar.
El método de determinación puede realizarse a
temperatura ambiente evitando la necesidad de una infraestructura
de incubación de temperatura controlada. Temperatura ambiente
incluye temperaturas en el intervalo de desde aproximadamente 17ºC
hasta aproximadamente 30ºC. En un enfoque, esta oscila desde
aproximadamente 20ºC hasta aproximadamente 26ºC. En un enfoque, la
reacción se lleva a cabo a aproximadamente 25ºC. Sin embargo, los
ensayos también pueden realizarse a otras temperaturas por ejemplo
en el intervalo de aproximadamente 30ºC hasta aproximadamente 45ºC,
en una realización entre aproximadamente 35 hasta aproximadamente
40ºC o a aproximadamente 37ºC.
El periodo de incubación puede ser de hasta 1
día. En un enfoque, el periodo de incubación es corto y oscila
desde aproximadamente 15 segundos hasta aproximadamente 2 horas, de
manera interesante dicho periodo oscila desde aproximadamente 30
segundos hasta aproximadamente 60 minutos. Durante dicho periodo de
incubación la señal puede controlarse. Dicha señal puede
controlarse continuamente, en intervalos de tiempo definidos
previamente o en un único intervalo de tiempo.
El volumen durante la incubación puede ser de
hasta 10 ml. Un volumen interesante oscila desde aproximadamente 10
\mul hasta 5 ml, de manera adecuada desde aproximadamente 20
\mul hasta aproximadamente 2 ml, de manera más adecuada desde
aproximadamente 25 \mul hasta aproximadamente 500 \mul. En una
placa de microtitulación, un volumen interesante oscila desde
aproximadamente 25 \mul hasta aproximadamente 300 \mul.
La señal de la muestra biológica puede
compararse con los datos en una curva patrón de referencia. Dicha
curva patrón de referencia puede obtenerse midiendo las señales de
una variedad de muestras de referencia cada una comprendiendo una
concentración de fármaco definida. Dicha referencia puede estar
presente en una matriz tal como una disolución, un tampón, un
disolvente orgánico y similares. En un aspecto, la referencia está
presente en la misma matriz que la muestra biológica. Dicha curva
patrón de referencia puede prepararse usando diferentes
referencias, conteniendo cada una el mismo principio activo pero a
concentración diferente. Dicha curva patrón de referencia puede
preparase usando al menos una referencia, de manera adecuada al
menos dos referencias, cada una teniendo una concentración
diferente de principio activo; de manera más adecuada al menos tres
referencias, teniendo cada una una concentración diferente de
principio activo. En un aspecto, la curva patrón de referencia se
prepara usando de 4 a 8 referencias diferentes del mismo principio
activo, cada una teniendo una concentración diferente. El principio
activo utilizado para obtener una curva patrón de referencia puede
ser el mismo que el principio activo presente en la muestra
biológica. Con el uso de una curva patrón de referencia, el método
de la presente invención hace posible relacionar la señal generada
con una concentración o cantidad específica del principio activo
presente en la muestra. Esta curva patrón de referencia puede
prepararse usando cualquier compuesto o mezcla de compuestos. Por
consiguiente, la potencia inhibidora de un principio activo en una
muestra biológica es una medición de la capacidad inhibidora total
de una muestra biológica independientemente de los principios
activos presentes e independientemente de su modo de interacción.
Para los inhibidores enzimáticos dicho modo de interacción incluye
inhibición irreversible o inhibición reversible, incluyendo
inhibición competitiva, no competitiva,
anti-competitiva, de unión fuerte o mixta. Basándose
en una curva patrón de referencia de este tipo, puede determinarse
una estimación del nivel de principio(s) activo(s)
presente(s) en una muestra biológica, independientemente del
conocimiento de la naturaleza de los principios activos. Este
enfoque puede ser útil, por ejemplo, para la toxicología indicando
que una ruta bioquímica dada está bloqueada con un equivalente de un
principio activo conocido.
Los ejemplos de compuestos que pueden analizarse
según los métodos de la presente invención incluyen sulfato de
dextrano, suramina, polianiones, CD4 soluble,
PRO-542, BMS-806, T20, T1249,
5-hélice, D-péptido
ADS-J1, AMD 3100, AMD-3465,
AMD7049, AMD3451, TAK 779, SHC-C(SCH351125),
SHC-D, PRO-140, RPR103611, foscarnet
y profármacos, AZT, 3TC, DDC, DDI, D4T, Abacavir, FTC, DAPD, dOTC,
DPC 817, PMEA, PMPA (tenofovir), nevirapina, delavirdina,
efavirenz, 8 y 9-Cl TIBO (tivirapina), lovirida,
TMC-125, dapivirina, MKC-442, UC781,
UC782, capravirina, DPC961, DPC963, DPC082, DPC083, calanolida A,
SJ-1366, TSAO, TSAO 4''-desaminado,
MV150, MV026048, SP1093V, PD126338,
RO-5-3335, K12, K37, L708906,
L731988, S-1360, amprenavir y profármaco GW433908
(VX-175, fosamprenavir), ritonavir, nelfinavir,
saquinavir, indinavir, lopinavir, palinavir, BMS186316, atazanavir,
DPC 681, DPC 684, tipranavir, AG1776, mozenavir, GS3333,
KNI-413, KNI-272, L754394, L756425,
LG-71350, PD161374, PD173606, PD177298, PD178390,
PD178392, PNU140135, TMC-114, ácido maslínico,
U-140690, castanospermina, desoxinojirimicina,
CGP64222. Estos compuestos también pueden estar incluidos en un
kit. De manera adecuada, si se utiliza la proteasa del VIH, el
principio activo puede seleccionarse de la lista que comprende:
amprenavir, fosamprenavir, ritonavir, nelfinavir, saquinavir,
indinavir, lopinavir, palinavir, BMS186316, atazanavir, DPC681,
DPC684, tipranavir, AG1776, mozenavir, GS3333,
KNI-413, KNI-272, L754394, L756425,
LG-71350, PD161374, PD173606, PD177298, PD178390,
PD178392, PNU140135, TMC-114.
Con el uso de este ensayo puede realizarse la
monitorización de las cinéticas de reacción a tiempo real. Con el
uso de este enfoque pueden calcularse las variables en estado
constante, por ejemplo la velocidad inicial (Practical
Biochemistry, 5ª edición, Ed. Wilson & Walker, Cambridge
University Press, Cambridge, 2000, capítulo 7, pág.
357-402). En una realización, la reacción se para
antes de la determinación de la señal. Esto es una determinación en
el punto final. Una reacción puede pararse añadiendo un agente que
incluye un disolvente orgánico, detergente, ácido, base o cambios
de temperatura. La salida, por ejemplo, de fluorescencia puede
volver a calcularse con respecto a parámetros que describen la
reacción, por ejemplo la velocidad inicial o con respecto
mediciones de inhibición, por ejemplo el porcentaje de inhibición o
el porcentaje de actividad residual.
El ensayo también puede usarse para determinar
simultáneamente 2 o más principios activos, presentes en una
muestra biológica, seleccionados como diana frente a 2 o más
moléculas bioactivas. Para este fin, 2 o más sustratos diferentes
pueden usarse, cada uno de los cuales puede medirse
independientemente. Basándose en 2 o más curvas patrón de
referencia, pueden cuantificarse los dos o más principios activos.
Por ejemplo, la potencia inhibidora de la muestra biológica que
comprende tanto un inhibidor de proteasas del VHC como un inhibidor
de proteasas del VIH, puede determinarse en un único pocillo, usando
dos sustratos diferentes. Un sustrato es específico para la proteasa
del VIH y otro sustrato es específico para la proteasa del VHC.
Una ventaja adicional del presente método es que
permite determinar la cantidad de principios activos unidos a las
proteínas plasmáticas. Muchos compuestos se unen fuertemente a
proteínas, limitando su eficacia terapéutica. Los inhibidores de
proteasas del VIH pueden unirse a proteínas. Un ejemplo de un
inhibidor de proteasas del VIH que se une a proteínas es la
\alpha-glucoproteína ácida (AAG). La muestra puede
tratarse para separar los principios activos unidos a proteínas de
los libres. Esta separación puede realizarse mediante filtración.
La filtración puede realizarse usando geles por ejemplo filtración
en gel, filtros, papeles de filtro, usando placas de
microtitulación especiales. Otras técnicas están disponibles en la
técnica, tales como diálisis, calentamiento, precipitación,
centrifugación, anticuerpos y otros medios conocidos por el experto
en la técnica. También pueden usarse combinaciones de dichas
técnicas para separar el principio activo unido a proteína del no
unido. La diferenciación de la fracción libre con respecto a la
unida a proteínas puede ser importante para compuestos que se
someten a la unión a proteínas y en condiciones en las que la
concentración de proteínas o la concentración de una proteína
particular varía con el tiempo en un fluido corporal. El
conocimiento de la distribución de los compuestos entre libres y
unidos puede ser importante para evaluar un tratamiento,
especialmente si solamente el principio activo es accesible a su
diana.
Puesto que la molécula bioactiva se añade a la
mezcla de reacción, la molécula bioactiva no necesita estar
presente necesariamente en la muestra. El método de la presente
invención proporciona además un ensayo para los casos en los que la
molécula bioactiva no es accesible fácilmente o está presente en una
concentración demasiado baja en un fluido biológico como por
ejemplo suero, que puede contener inhibidores del VIH, pero
solamente una cantidad muy baja, si acaso alguna de la proteasa.
Alternativamente, el método puede usarse tras la eliminación de la
muestra biológica la molécula bioactiva correspondiente o tras la
inactivación de la molécula bioactiva. Estos últimos enfoques
pueden ser valiosos en los casos en los que la concentración de
dicha molécula bioactiva varía entre individuos. La eliminación o la
inactivación puede conseguirse mediante diferentes métodos que
incluyen pero no se limitan a precipitación mediante disolventes
orgánicos, sales, detergentes, cambios de pH o desnaturalización
térmica.
En un enfoque, el ensayo de la presente
invención es homogéneo, tiene un tiempo de renovación corto y
facilita el procesamiento paralelo de múltiples muestras. El ensayo
de la presente invención puede llevarse a cabo en un formato basado
en cubeta o en un formato de múltiples pocillos, por ejemplo una
placa de microtitulación.
El ensayo se diseña de tal modo que determina la
presencia, es decir el nivel de principios activos que inhiben la
enzima en muestras biológicas y es especialmente adecuado para
monitorizar principios activos en individuos en tratamiento así
como en individuos sometidos a ensayos clínicos. La determinación de
la concentración puede proporcionar pruebas de si la dosificación
del compuesto es los suficientemente alta para proporcionar un
efecto terapéutico.
La presente descripción también se refiere a un
kit que comprende una molécula bioactiva, un reactivo para dicha
molécula bioactiva y opcionalmente un principio activo. La molécula
bioactiva, el reactivo y el principio activo pueden estar presentes
en contenedores separados. La molécula bioactiva, el reactivo y el
principio activo pueden estar liofilizados. El kit puede
completarse además con un contenedor que comprende un tampón para
la reacción enzimática. Dicho tampón puede proporcionarse como un
polvo liofilizado. Si el kit está compuesto por los componentes
liofilizados, dicho kit puede completarse además con una o más
soluciones para la disolución de dichos polvos liofilizados. El kit
puede contener uno o más contenedores que comprenden uno o más
principios activos. El contenedor que comprende el principio
activo, necesario para preparar una curva patrón de referencia,
puede contener opcionalmente la proteasa o el sustrato para la
proteasa.
Otro nivel de complejidad en enfermedades como
el cáncer y el VIH es la aparición frecuente de resistencia al
tratamiento. Estos últimos estados requieren una monitorización
frecuente de los niveles de fármaco junto con la prueba de
resistencia. Por tanto, se han desarrollado métodos que monitorizan
las alteraciones fenotípicas en la población de viriones del VIH
que circulan en el paciente (por ejemplo, el documento WO 97/27480).
Otros ensayos de fenotipado incluyen los descritos en Witvrouw
(documento WO 01/57245), Virologic (documento WO97/27319) y
Bioalliance (documento WO 02/38792). El Antivirogram® (documento
WO97/27480) calcula la susceptibilidad farmacológica de la
población vírica cuando se compara con las cepas de "tipo
natural". En este servicio de prueba, la concentración de
fármaco que inhibe el crecimiento del virus en el 50% (CI_{50}) se
determina in vitro. La razón de CI_{50} del virus en una
muestra de sangre de un paciente con respecto a la CI_{50} del
virus de "tipo natural" es el cambio en la susceptibilidad
farmacológica del virus en ese paciente. Una alternativa para los
ensayos fenotípicos en los que el material que porta el paciente se
hace crecer en condiciones in vitro, es el genotipado. Los
ensayos de genotipado calculan la aparición de resistencia basándose
en las variaciones de secuencias. Una mejora con respecto a los
ensayos genotípicos se denomina fenotipado virtual (documento WO
01/79540) en el que el genotipo de un virus de un paciente se
compara con una colección de genotipos presentes en una base de
datos y para los que se almacenan los fenotipos correspondientes en
una base de datos. Estos ensayos proporcionan una determinación
precisa del efecto farmacológico y la aparición de resistencia del
virus en un paciente, pero no se proporciona información sobre los
niveles de fármaco circulantes. Por tanto, es un aspecto de la
presente invención unir las determinaciones del nivel de fármaco,
según los métodos de la presente invención, con la prueba de
resistencia. La unión de la determinación de los niveles de fármaco
con la prueba de resistencia puede proporcionar una prueba adicional
de la eficacia del tratamiento.
La concentración plasmática mínima o la
concentración mínima puede ser crítica durante el tratamiento de
enfermedades o estados en los que la diana farmacológica se somete
a modulación con el fin de superar el efecto farmacológico.
Ejemplos de este último fenómeno se encuentran en las enfermedades
infecciosas como VIH, infecciones bacterianas y cáncer. Por
ejemplo, la presencia de fármacos genera presión mutacional sobre la
proteasa del VIH para que escape del tratamiento farmacológico y la
concentración insuficiente de inhibidor facilita tal escape. La
determinación del nivel de fármaco en un paciente y el uso de este
valor para determinar el nivel mínimo pueden ser importantes para
obtener dosificaciones lo suficientemente altas para proporcionar
una combinación terapéuticamente eficaz.
La concentración de un principio activo,
determinada usando el procedimiento de la presente invención, puede
usarse en modelos farmacológicos para proporcionar estimaciones de
parámetros farmacocinéticos que describen el perfil farmacológico
en un individuo. Con el uso de modelos farmacocinéticos de
poblaciones, el nivel de fármaco mínimo puede determinarse a partir
de una única muestra de un paciente. Se supone que un gran grupo de
pacientes infectados por VIH reciben el mismo fármaco
antirretroviral en la misma dosis tres veces al día. El perfil
concentración plasmática promedia-tiempo del fármaco
en la población de pacientes puede parecer tal como se muestra en
la figura 1 (línea en negrita). Sin embargo, debido a la
variabilidad interindividual de los procesos farmacocinéticos
(absorción, distribución, eliminación), las curvas individuales
pueden diferir de los perfiles típicos, tal como se ejemplifica
mediante la línea de puntos. Si se trazan todas las curvas
individuales, pueden cubrir un intervalo marcado por las barras
verticales. Si sobre la misma gráfica, se proporcionan
concentraciones eficaces mínimas (CEM) (una línea discontinua
horizontal da un ejemplo, figura 1), también cubrirán el mismo
intervalo. La concentración de fármaco en una fracción de los
pacientes puede disminuir por debajo de su CEM y esto reduce el
resultado terapéutico y posiblemente conduce a la resistencia al
fármaco. El nivel mínimo de un paciente individual puede usarse
posteriormente para calcular el nivel de fármaco requerido para
alcanzar dosis terapéuticamente eficaces durante el intervalo de
dosificación.
Los métodos y resultados de la presente
invención, por ejemplo la concentración de un fármaco, pueden usarse
para determinar parámetros farmacológicos del fármaco en un
individuo, incluyendo niveles mínimos (C_{t}), concentración
máxima (C_{max}), el área bajo la curva (AUC), velocidad de
eliminación, etc. Por tanto, el nivel determinado puede entrar en
un modelo farmacocinético de poblaciones y pueden calcularse las
variables farmacocinéticas tales como C_{t}, C_{max}, AUC
(documento WO 02/23186). Estas variables farmacológicas pueden
usarse para calcular por ejemplo la posible toxicidad de una dosis
determinada, el tiempo de exposición a un fármaco (por ejemplo en
caso de compuestos radioquímicos) o la concentración mínima
encontrada.
Con el fin de obtener un tratamiento eficaz, la
exposición de un individuo a un fármaco, por ejemplo la
concentración mínima, AUC, debe superar un cierto nivel. Este nivel
se determina mediante la naturaleza de la población del virus. La
razón de la exposición al fármaco (nivel mínimo, AUC, otros) con
respecto a la resistencia al fármaco (resistencia, CI_{50},
CI_{90}, otros) predice el éxito del tratamiento. Esta razón puede
expresarse como el IQ (cociente inhibidor) (IQ =
C_{t}/CI_{50}.). Este valor de IQ puede normalizarse
adicionalmente para obtener un valor ajustado de la unión a
proteínas (IQ normalizado, NIQ). Un enfoque para obtener este valor
ajustado es determinar la C_{t} media para una población y la
CI_{50} para un principio activo para una cepa de referencia, es
decir una cepa de VIH de laboratorio de referencia. El cociente de
estos últimos dos valores da
(C_{t}/CI_{50})_{referencia}. El IQ normalizado se
proporciona mediante el cociente:
[(C_{t}/CI_{50})]_{paciente}/[(C_{t}/CI_{50})]_{referencia}.
En una realización, la presente invención
proporciona un método para determinar el cociente inhibidor (IQ),
en el que el nivel mínimo se basa en el nivel del principio activo
presente en una muestra biológica determinado según los métodos
descritos en el presente documento. El IQ puede normalizarse
adicionalmente.
La invención proporciona además un método de
diseño de un tratamiento, comprendiendo el método: determinar el
nivel de un principio activo presente en una muestra biológica según
los métodos descritos en el presente documento, determinar el nivel
mínimo para dicho principio activo, volver a calcular la
dosificación para dicho principio activo usando un modelo cinético
de poblaciones para conseguir niveles de principio activo que
superan la dosis mínima eficaz durante el intervalo de
dosificación.
En un desarrollo adicional, la concentración
encontrada en la muestras de un paciente puede transmitirse
electrónicamente a un servidor en el que se determinan los valores
farmacocinéticos mediante métodos basados en poblaciones. Estos
valores, es decir datos farmacocinéticos y niveles de fármaco pueden
unirse a los datos de resistencia para proporcionar una medición
integrada de la eficacia del tratamiento. La información
proporcionada puede usarse además para diseñar un tratamiento con
el fin de conseguir suficiente efecto clínico. Estos datos, tras el
procesamiento, pueden transferirse de nuevo, por ejemplo al
facultativo responsable.
El ensayo puede usarse para analizar niveles de
fármaco en animales y estudios farmacocinéticos en animales.
En un aspecto, la presente invención se refiere
a un método de determinación de la potencia inhibidora de una
muestra biológica, comprendiendo el método: (a) obtener una muestra
biológica, proporcionar un contenedor que comprende una molécula
bioactiva diana, añadir la muestra biológica a dicho contenedor para
obtener una mezcla, añadir un reactivo de la molécula bioactiva a
la mezcla y determinar una señal, (b) relacionar la señal a una
curva patrón de referencia preparada con al menos una muestra de
referencia, en el que la muestra de referencia tiene la misma
matriz que la muestra biológica, completándose opcionalmente la
matriz con un principio activo a una concentración definida y en el
que la señal de la muestra de referencia se ha determinado según
(a).
El procedimiento de ensayo puede usarse para
monitorizar interacciones entre la enzima, el sustrato y el
inhibidor, pero igualmente también entre receptor y ligando;
receptor y antagonista; receptor y agonista; antígeno y anticuerpo.
Para el análisis de principios activos que interaccionan con
moléculas de receptor, se prefieren ligandos en vez de sustratos
para el método de análisis de la presente invención.
En una realización, el ensayo de la presente
invención añade a la técnica un ensayo flexible, rápido, fácil de
normalizar, económico y homogéneo para monitorizar niveles de
fármaco en muestras de pacientes usando una enzima. Pueden llevarse
a cabo múltiples ensayos en paralelo y puede limitarse la variación
entre laboratorios proporcionando kits que contienen los elementos
necesarios para realizar la reacción.
Figura 1: Concentración plasmática de principio
activo (mg/l) en función del tiempo. CEM es la concentración eficaz
mínima. El tiempo se expresa en horas. La concentración plasmática
de fármaco debe variar entre la CEM y el nivel tóxico.
Figura 2: Monitorización de la escisión del
sustrato mediante la proteasa del VIH en tiempo real en un lector de
fluorescencia en placas de microtitulación. Cada cuadrado (A1 a H10)
representa las curvas de progreso de la fluorescencia (eje Y) en
función del tiempo (eje X). El ensayo se llevó a cabo tal como se
describe en la parte experimental. La pendiente de cada curva
representa la velocidad inicial de la reacción enzimática. La fila A
contiene muestras control sin inhibidor. Las columnas 1 y 2
contienen extractos de suero de perro a los que se les añadieron
adiciones conocidas de una concentración diferente del compuesto 1
utilizado para generar una curva de calibración. Las columnas 3 y 4;
5 y 6; 7 y 8; 9 y 10, contienen suero de perro al que se le añadió
adiciones conocidas de 100 nM, 10 nM, 10.000 nM, y 1.000 nM del
compuesto 1, 2 y 3 respectivamente. Las filas B a H contienen
diluciones del suero al que se le añadieron adiciones conocidas tal
como se indica en la derecha. Las diluciones varían desde 1:120
(fila B) hasta 1:1 (fila H). Véase el ejemplo 1 para los
detalles.
Figura 3: Velocidad inicial de escisión del
sustrato calculada usando una regresión lineal mediante un programa
para lectores de placas. La escisión del sustrato se monitorizó en
tiempo real en un lector de fluorescencia de placas de
microtitulación. Se usaron los extractos de suero de perro a los que
se les añadieron adiciones conocidas de concentraciones diferentes
del compuesto 1. Las unidades de fluorescencia relativa (UFR, eje Y)
se monitorizaron en función del tiempo (segundos, eje X).
Figura 4: Cálculo de una curva patrón de
referencia, los datos ilustran además la precisión del método
titulado. Sa: muestra; concentración en nM; Valores: en (UFR/min.) x
1000; StDev (desviación estándar): en (UFR/min.) x 1000; CV%:
coeficiente de variación; Valor medio: valor medio en (UFR/min.) x
1000; Razón: razón del valor medio de SaOX con respecto al valor
medio de Sa01. X es de 2 a 8 (véase la figura).
Figura 5. Curva patrón de referencia típica que
relaciona la concentración de inhibidor en nM (eje X) con la razón
de la muestra de prueba en comparación con una muestra control
(expresada como una razón de valores UFR, eje Y).
Figura 6: Cálculo de la concentración de
analito. El cálculo del analito se realiza automáticamente mediante
el programa para lectores de placas. La concentración se calculó
para el analito presente en las columnas 9 y 10 en la figura 2. Los
datos muestran que puede necesitarse diluir las muestras antes del
análisis. En el presente caso, una dilución entre 6 y 60 es óptima.
(StDev = desviación estándar; Result. Aj. = resultado ajustado para
la dilución).
Figura 7: Exactitud y precisión del método. Se
realizaron cinco experimentos independientes en cinco fechas
diferentes para evaluar la exactitud y la reproducibilidad del
método.
Exp.: experimento. El error de cada
determinación se muestra en paréntesis y representa la diferencia
entre la concentración de inhibidor medida y la concentración de
inhibidor a la que se le añade adiciones conocidas en %.
El presente ejemplo y los dibujos adjuntos
ilustran la presente invención. Su fin ilustrativo no se construye
como limitativo del alcance de la invención.
Se usaron los siguientes compuestos en el
presente análisis
(3R,3aS,6aR)-hexahidrofuro[2,3-b]furan-3-il-N-[(1S,
2R)-3-[[(4-aminofenil)sulfonil](2-metilpropil)amino]-2-hidroxi-1-(fenilmetil)propil]-carbamato, (compuesto 1, CAS 206361-99-1); (3R,3aS,6aR)-hexahidrofuro[2,3-b]furan-3-il-N-[(1S,2R)-3-[(1,3-benzodioxol-5-ilsulfonil)(2-metil-
propil)amino]-2-hidroxi-1-(fenilmetil)propil]-carbamato (compuesto 2, CAS 333798-27-9) y (3R,3aS,6aR)-hexahidrofuro[2,3-b]furan-3-il-N-[(1S,2R)-2-hidroxi-3-[[(4-metoxifenil)sulfonil](2-metilpropil)amino]-1-(fenilmetil)pro-
pil]-carbamato (compuesto 3, CAS 206362-00-7). El método de la presente invención también puede usarse con otras sulfonamidas tal como se describe en la patente estadounidense 5.843.946. Se añadieron adiciones conocidas del compuesto 1 de inhibidor de PR VIH a cuatro alícuotas de suero de perro normal, hasta una concentración final de 10, 100, 1.000 y 10.000 nM (denominado más adelante como muestras de analito) respectivamente. Se usaron otras 8 alicuotas de suero de perro para generar una curva patrón de referencia. A estas 8 alicuotas se les añadió adiciones conocidas de una concentración diferente del compuesto 1 desde 0 hasta 100 nM. Por tanto, se usó el compuesto 1 como referencia para preparar una curva patrón de referencia. Se precipitaron las proteínas séricas en todas las muestras, usando metanol (MeOH) al 66% (v/v). A una parte de la muestra sérica se le añadieron dos partes de MeOH, se mezcló y se centrifugó a 16.100 g durante 30 min. Se recuperó el sobrenadante y pudo almacenarse durante al menos 2 semanas a -20ºC antes del ensayo. Se utilizan 60 \mul para el ensayo con cubetas o se utilizan 24 \mul para el ensayo con lector de placas. Se prepararon antes del ensayo seis diluciones en serie de 1:2 a 1:120 de los extractos, obtenidos a partir de las muestras de analito. Se utilizó para la dilución el extracto de metanol de suero de perro normal sin inhibidor.
2R)-3-[[(4-aminofenil)sulfonil](2-metilpropil)amino]-2-hidroxi-1-(fenilmetil)propil]-carbamato, (compuesto 1, CAS 206361-99-1); (3R,3aS,6aR)-hexahidrofuro[2,3-b]furan-3-il-N-[(1S,2R)-3-[(1,3-benzodioxol-5-ilsulfonil)(2-metil-
propil)amino]-2-hidroxi-1-(fenilmetil)propil]-carbamato (compuesto 2, CAS 333798-27-9) y (3R,3aS,6aR)-hexahidrofuro[2,3-b]furan-3-il-N-[(1S,2R)-2-hidroxi-3-[[(4-metoxifenil)sulfonil](2-metilpropil)amino]-1-(fenilmetil)pro-
pil]-carbamato (compuesto 3, CAS 206362-00-7). El método de la presente invención también puede usarse con otras sulfonamidas tal como se describe en la patente estadounidense 5.843.946. Se añadieron adiciones conocidas del compuesto 1 de inhibidor de PR VIH a cuatro alícuotas de suero de perro normal, hasta una concentración final de 10, 100, 1.000 y 10.000 nM (denominado más adelante como muestras de analito) respectivamente. Se usaron otras 8 alicuotas de suero de perro para generar una curva patrón de referencia. A estas 8 alicuotas se les añadió adiciones conocidas de una concentración diferente del compuesto 1 desde 0 hasta 100 nM. Por tanto, se usó el compuesto 1 como referencia para preparar una curva patrón de referencia. Se precipitaron las proteínas séricas en todas las muestras, usando metanol (MeOH) al 66% (v/v). A una parte de la muestra sérica se le añadieron dos partes de MeOH, se mezcló y se centrifugó a 16.100 g durante 30 min. Se recuperó el sobrenadante y pudo almacenarse durante al menos 2 semanas a -20ºC antes del ensayo. Se utilizan 60 \mul para el ensayo con cubetas o se utilizan 24 \mul para el ensayo con lector de placas. Se prepararon antes del ensayo seis diluciones en serie de 1:2 a 1:120 de los extractos, obtenidos a partir de las muestras de analito. Se utilizó para la dilución el extracto de metanol de suero de perro normal sin inhibidor.
Para el ensayo con lector de placas se usaron
las siguientes condiciones: se preparó el tampón de acetato de
sodio (NaOAc) 50 mM, pH 4,5, ditiotreitol (DTT) 2 mM, cloruro de
sodio (NaCl) 200 mM, Tween 20 al 0,01%. El sustrato estaba presente
a una concentración final de 20 \muM en el tampón anterior. El
sustrato usado se basa en un sustrato natural para la proteasa del
VIH. Contiene una porción (P_{4}-P_{4}') de la
proteína p17-p24 gag.
R-E(EDANS)-S-Q-N-Y-P-I-V-Q-K(DABCYL)-R-OH
solamente presenta baja fluorescencia, sin embargo la fluorescencia
aumenta tras la escisión mediante la proteasa del VIH del enlace
Y-P (Science, 1989, 247, 954-958).
La enzima, proteasa del VIH-1 de tipo natural,
estaba presente en el tampón anterior (NaOAc 50 mM, pH 4,5, DTT 2
mM, NaCl 200 mM), Tween 20 al 0,01%) a una concentración final de
4-5 nM. Debe apreciarse que también pueden usarse
otras formas de proteasa del VIH, incluyendo las formas mutantes de
la proteasa.
El ensayo se realiza a temperatura ambiente
(TA). Se administraron 88 \mul de tampón (que contiene la enzima)
y se añadieron 24 \mul de extracto de suero o dilución de extracto
de suero, usando un pipeteador de múltiples canales. Se inició la
reacción añadiendo 88 \mul de tampón que contenía sustrato y se
monitorizó con el tiempo el aumento de fluorescencia (figura 2). Se
preparó la curva patrón de referencia según este método usando esta
vez 24 \mul de referencia. La reacción control que consistía en
suero extraído estaba desprovista de cualquier inhibidor de
proteasas. La velocidad inicial de la escisión del sustrato, que se
calculó mediante el programa para lectores de placas para cada
pocillo (figura 3) era inversamente proporcional a la concentración
del inhibidor. La velocidad inicial de la muestra control
proporcionó una señal del 100% y se usó para determinar la razón
con respecto la muestras a partir de la curva patrón de referencia
así como a partir de muestras de analito, que contenían un inhibidor
(razón señal de muestra/señal de control).
Se monitorizó la tasa inicial del aumento de
fluorescencia para cada dilución del compuesto 1 (figura 2, columnas
1 y 2) para proporcionar una curva patrón de referencia (figuras 4,
5). La curva patrón de referencia une la razón (señal de
muestra/señal de control) a la concentración de fármaco para cada
dilución del compuesto 1. La medición de inhibición, expresada como
una razón, proporciona una estimación de la concentración del
compuesto 1 correspondiente. Por ejemplo, la concentración de
inhibidor en la muestra de analito que está presente en las
columnas 9 y 10 en la figura 2, puede calcularse usando un programa
para lectores de placas tal como se muestra en la figura 6. Para el
cálculo final se promediaron las dos concentraciones que dieron la
razón más próxima a 0,5. La concentración calculada resultante era
de 1.109 nM, comparable con la concentración real en esta muestra -
1.000 nM. Obsérvese que la curva patrón de referencia puede
prepararse usando cualquier inhibidor de proteasas o mezclas de los
mismos.
Aunque el ensayo anterior no discrimina entre
los diferentes inhibidores de proteasas del VIH, proporciona una
determinación fidedigna y precisa de la inhibición de proteasas del
VIH y simultáneamente el nivel de la actividad inhibidora en la
muestra biológica. Este formato de ensayo determina la cantidad
total del inhibidor de proteasas presente en una muestra biológica.
Además, el ensayo puede proporcionar una prueba sobre el porcentaje
del inhibidor unido a proteína tal como se da como ejemplo en el
ejemplo 3.
La determinación de la concentración de
inhibidor tal como se describe en el ejemplo 1, se realizó en cinco
días diferentes para evaluar la precisión y la exactitud. Los
resultados se presentan en la figura 7.
El principio de la presente invención puede
usarse para cualquier tipo de compuesto que interfiera con una
molécula bioactiva. Será evidente que el experto en la técnica
conocerá diferentes enfoques de realización de la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La extracción de metanol se usa comúnmente para
la determinación de concentraciones de inhibidor de PR VIH en suero
humano mediante LC-EM. Se precipitan las proteínas
séricas con MeOH al 75%. Puesto que la alta concentración de
metanol puede interferir con los ensayos basados en enzimas, se
reduce la concentración de MeOH utilizada para la extracción de
inhibidores hasta el 66%. Se realizó la siguiente prueba para
comparar la extracción de MeOH al 66% y MeOH al 75%. Se prepararon
mezclas del compuesto 1 y 2 a las concentraciones de 9 \muM y 0,9
\muM y se extrajeron con MeOH al 66 y 75% tal como se describió en
el ejemplo 1. Los resultados se resumen en la tabla 1. "Ext"
significa extracción en la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Según múltiples estudios la mayoría de los
inhibidores de PR VIH están muy unidos a proteína plasmática (por
ejemplo el 90-99% para amprenavir, nelfinavir,
saquinavir y ritonavir y aproximadamente el 60% para indinavir
(IDV)). Puesto que la unión a proteína afecta a la potencia
farmacológica, se desarrolló un método simple para la determinación
de la concentración de fármaco unido a proteína frente al no unido.
Se usó el siguiente protocolo para medir la concentración de fármaco
no unido:
A 550 \mul de suero humano normal se le
añadieron adiciones conocidas del inhibidor de proteasas
SC-52151 a una concentración final de 1 \muM. Se
usó una alicota 50 \mul para la determinación de la concentración
de inhibidor total tal como se describió en el ejemplo 1. Se usó
SC-52151 para generar una curva de calibración.
Se cargaron 500 \mul de muestra de suero a la
que se le añadieron adiciones conocidas en un microconcentrador
microcon-10 y se centrifugó a 5000 x g, a
temperatura ambiente durante 5 min. Se extrajo el flujo a través de
la fracción (\sim10% de la carga, 50 \mul) con metanol al 66%
según el protocolo descrito en el ejemplo 1. El filtrado contiene
la fracción no unida de los inhibidores de proteasas. Se prepararon
diferentes diluciones de extracto de metanol y se realizó el ensayo
en lectores de placas de microtitulación para determinar la
concentración de fármaco libre o la no unida tal como se describió
en el ejemplo 1. Como en el caso de la concentración de inhibidor
total (ejemplo 1), la concentración de fármaco no unido está
presente como una actividad inhibidora equivalente a la
concentración de fármaco de referencia (en este caso la actividad
inhibidora equivalente a una concentración de
SC-52151 en nM derivada de la curva de
calibración).
Usando los métodos de la presente invención,
puede determinarse la razón de la concentración de fármaco total
frente al libre y expresarse como un porcentaje.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración de indinavir libre (36,5%)
concuerda con los datos presentes en la bibliografía (40%). En
suero humano, los inhibidores de proteasas del VIH están unidos
principalmente a \alpha-glucoproteína ácida. La
concentración de fármaco libre determinada en estos experimentos es
inversamente proporcional a la constante de unión del fármaco a
\alpha-glucoproteína ácida. K_{a} es la
constante de unión.
<110> Tibotec Pharmaceuticals Ltd.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ENSAYO DE PROTEASAS PARA LA
MONITORIZACIÓN TERAPÉUTICA DE FÁRMACOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> TIP 031 seq listing
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/331117
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
08-11-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sustrato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gln Asn Thr Pro Ile Val Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sustrato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Trp Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sustrato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sustrato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ile Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sustrato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Ile Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sustrato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Arg Val Tyr Phe Glu Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sustrato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Asp Ile Val Pro Cys Ser Met Ser
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sustrato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Asp Ile Val Pro Cys Ser Met Lys Arg
Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sustrato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Thr Glu Asp Val Val Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sustrato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Glu Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Lys
Arg}
Claims (14)
1. Método para determinar la potencia inhibidora
de un inhibidor del VIH en una muestra biológica, que comprende: i)
utilizar una muestra biológica de un paciente; ii) proporcionar una
molécula bioactiva en la que la molécula bioactiva es una proteasa
del VIH; iii) proporcionar un reactivo para la molécula bioactiva en
el que el reactivo es un sustrato para la proteasa del VIH, siendo
R-E(EDANS)-S-Q-N-Y-P-I-V-Q-K(DABCYL)-R-OH;
iv) añadir la muestra biológica, la molécula bioactiva y el reactivo
para una molécula bioactiva a un contenedor; v) determinar una
señal; vi) relacionar la señal de v) con una curva patrón de
referencia preparada con al menos una referencia.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
la proteasa del VIH comprende al menos una mutación.
3. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que la señal es fluorescencia.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que el contenedor es un pocillo en una
placa de múltiples pocillos.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que la muestra biológica se diluye
antes de añadirla al contenedor.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2 que comprende, en el que antes de la etapa
iv) la fracción unida a proteína y la fracción no unida a proteína
del principio activo en la muestra biológica se separan.
7. Método según la reivindicación 6, en el que
la fracción unida a proteína y la fracción no unida a proteína del
principio activo en la muestra biológica se separa a través de un
procedimiento seleccionado de precipitación, filtración, diálisis y
centrifugación.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que la muestra biológica comprende un
inhibidor reversible.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que la referencia para determinar la
curva patrón de referencia tiene la misma matriz biológica que la
muestra biológica.
10. Método según cualquier reivindicación 1 ó 2,
en el que la potencia inhibidora se expresa como la concentración de
fármaco o como una cantidad de fármaco.
11. Método según la reivindicación 10, que
comprende además determinar un nivel mínimo de un inhibidor del VIH
en un individuo usando un modelo farmacocinético de poblaciones.
12. Método según la reivindicación 11, que
comprende además determinar el cociente inhibidor de un inhibidor
del VIH en una muestra biológica, usando el nivel mínimo del
inhibidor del VIH en un individuo.
13. Método según la reivindicación 11, que
comprende además diseñar un tratamiento, determinando el nivel
mínimo de un inhibidor del VIH en un individuo, volviendo a calcular
la dosificación para el inhibidor del VIH usando un modelo cinético
de poblaciones, consiguiendo los niveles de inhibidor del VIH
superar la dosis eficaz mínima durante el intervalo de dosis.
14. Método para determinar la potencia
inhibidora de un inhibidor del VIH en una muestra biológica,
comprendiendo el método: (a) utilizar una muestra biológica de un
paciente, proporcionar un contenedor que comprende una proteasa del
VIH, añadir la muestra biológica a dicho contenedor para obtener una
mezcla, añadir
R-E(EDANS)-S-Q-N-Y-P-I-V-Q-K(DABCYL)-R-OH
de la proteasa del VIH a la mezcla y determinar una señal de
fluorescencia, (b) relacionar la señal con una curva patrón de
referencia preparada con al menos una muestra de referencia, en el
que la muestra de referencia tiene la misma matriz que la muestra
biológica, completándose opcionalmente la matriz con un inhibidor
del VIH a una concentración definida y en el que la señal de la
muestra de referencia se ha determinado según (a).
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