JP2001514506A

JP2001514506A - プロテアーゼ阻害剤分析

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Publication number: JP2001514506A
Application number: JP53861898A
Authority: JP
Inventors: ブロンスタイン，イレーナ; ヴォイタ，ジョン; パーマー，ミシェル; ティロトソン，ボニー
Original assignee: Tropix Inc
Current assignee: Tropix Inc
Priority date: 1997-03-07
Filing date: 1998-03-06
Publication date: 2001-09-11
Also published as: EP0972071A4; US6243980B1; CA2283434A1; AU6443498A; US20010031478A1; WO1998039471A1; EP0972071A1

Abstract

(57)【要約】均一及び不均一分析が、１，２−ジオキセタンの化学発光特性を利用して、試料又は標的化合物中のプロテアーゼ阻害活性の決定のために提供される。不均一分析において、問題のプロテアーゼのための開裂部位を有するペプチドが、一つの末端において第一のリガンド結合対の第一のメンバー及び他の末端において第二のリガンドの結合対の第一のメンバーを有して提供される。第一のリガンドの結合対の他のメンバーは表面に結合し、それは表面にペプチド又はプロテアーゼ基質を結合している。ペプチド基質は、プロテアーゼ及び標的化合物又は試料を結合している。基質の開裂は、阻害されないならば起こり、そしていかなる非結合の開裂された断片は除外される。第二のリガンド結合対の第二のメンバーで複合化された酵素が加えられ、そして残留する第二のリガンドの結合対の（非開裂）第一のメンバーのいかなるものにも結合する。非結合複合体は除外され、そして酵素のための１，２−ジオキセタン基質が加えられる。いずれのペプチド基質も開裂されないならば、ジオキセタンは阻害活性を示して化学発光するであろう。均一分析において、同じ基質は、一つの末端に蛍光エネルギー受け入れ部分、及び他の末端に１，２−ジオキセタン又は前駆体を有する。基質がプロテアーゼにより開裂されたならば、ジオキセタン及び蛍光部分は近い物理的関係を有さず、ジオキセタンが分解するときに、エネルギー移行は生じない。開裂が起こらないならば、阻害を示し、ジオキセタンが分解するとき、エネルギーは蛍光部分へ移行し、それはジオキセタンのそれと異なると認められる波長の光を放出する。

Description

【発明の詳細な説明】プロテアーゼ阻害剤分析本発明は、1997年３月７日に提出した米国出願No.60/038,940号の請求優先権に基づく通常の国際出願である。発明の分野本発明は、プロテアーゼ阻害剤を検出するための均一又は不均一分析での化学発光性１，２−ジオキセタン類の使用に関する。背景の議論有害なプロテアーゼ、若しくはヒト免疫欠損ウイルス（ＨＩＶ−１）によりエンコードされる１１−ｋｄプロテアーゼのような、疾患状態を仲介するプロテアーゼを妨害若しくは阻害する新規な治療方法の検証は、ＡＩＤＳの病気進行の遅延のかなめの過程である。レトロウイルスプロテアーゼは、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２ウイルスのウイルスgag-polポリタンパク質の過程において必須である。レトロウイルスポリタンパク質の数個の高度に保存された共通配列が存在し、その一つは、ペンタペプチド（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）−Ｘ−Ｘ’−（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ） −Ｐｒｏからなる。これらのプロテアーゼの阻害活性は、ＨＩＶ感染の進行で妨害されるであろう。ＨＩＶプロテアーゼ活性を阻害することができる医薬が見出されているけれども、新規な阻害剤を見出し、かつ開発を進める必要がある。プロテアーゼ阻害剤の迅速スクリーニングで用いられている現在の方法は、種々な出所からの多くの妨害に付すことである。最も普通の非−同位体的方法は、蛍光分析である。ＨＩＶプロテアーゼの検出のような場合に、蛍光基質は、ペプチドの一つの末端に蛍光ダンシル基、そして別の末端に消光基で標識される。蛍光シグナルの増大は、Matayoshi et al.，1990，Science 247:954-98に記載されているように発光基（emitter）及び消光基（quencher）が分離している事実により、プロテアーゼの開裂で生じる。他の目的のための蛍光基質は、酵素による開裂で蛍光シグナルを発光する末端蛍光発色団基でデザインすることができる。上記の分析方法の両方は、通常、大量の化学、天然製品及びコンビナトリアル系をスクリーニングするためのスループット分析に用いられる。これらの分析は、スクリーニングされる分子の性質に基づく、生物学的成分の自動蛍光に関連する問題を有する傾向がある。多くの化合物及び天然製品抽出物は、分析シグナルが追跡されるとき着色されているか又は蛍光的であり、そして溶液中に存在している。このことは、分析において、検出感度及び分析の有効範囲を制限する妨害をもたらす。この妨害は、酵素の阻害として、容易に解釈することができ、真の正の阻害を決定することを困難にするので偽の正の阻害から真の正の阻害を区別するために、したがって広範囲な追跡分析を必要とする。トロピックスに譲渡されている米国特許5,591,591は、特定のアミノ酸又はペプチドに対するタンパク質分解酵素を有するジオキセタン化合物が、プロテアーゼを含むと考えられる試料に加えられ、そしてジオキセタンを分解し、化学発光をもたらすように、アミノ酸を酵素反応により除去するプロテアーゼの検出のための分析方法を記載している。本発明の要約上記の均一方法へのもう一つ方法は、妨害に付さない、均一又は不均一分析を用いることである。本発明は、ＨＩＶ−１プロテアーゼ活性の高度なスループットスクリーニングのために、化学発光性１，２−ジオキセタン基質を用いる高度に敏感な分析を開発している。本発明は、着色又は蛍光化合物からの妨害に付されず、したがってより敏感であり、そして直接の蛍光酵素分析に比べて、より広範囲の活性範囲を示すより有利な分析を提供する。ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の検出に適合する、この分析は、合成ペプチド基質Ｉ（Ｆａｍ−スペーサ−Ｓｅｒ −Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｒｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−スペーサ−ビオチン）−ＮＨ₂）(この配列は、Ｇａｇ−ポリタンパク質の本来の開裂部位から誘導されている)（Ｆａｍは、ここで、フルオレセインを示すとして用いられている）を用いる。多くの高度なスループットＨＩＶスクリーニング方法は、大量の試薬を用い、より骨の折れる操作を含むものである。本発明の分析は、それは、慣用の２工程移行（two-step transfer）及び拡散捕捉分析（dilution capturea ssay）としても、存在することができるけれども、好都合には、特に高度なスループットスクリーニングのために有用である簡単な単一プレートの終点分析（これは、特に高度なスループットスクリーニングに有用である捕捉されたペプチドのフェムトモルまで以下でも敏感である）として構成されている。この分析は、開裂されたペプチドの鋭敏な検出のための免疫分析構成において、化学発光性１，２−ジオキセタンアルカリホスファターゼ基質を用いる。非開裂ペプチドは、抗−フルオレセインアルカリホスファターゼ複合抗体により認識される。捕捉条件は、開裂されたペプチド濃度に直線応答を保証するように最適化されている。この応答は、開裂生成物のＨＰＬＣ分析に良好に相関している。このＨＩＶ分析は、アセチル−ペプスタチン、既知のＨＩＶ−１阻害剤で、確認されている。この荒削りな分析は、自動化することができ、コストのために効果的な９６ウエル構成中で大量の化合物をスクリーニングするのに用いることができる。別の実施態様において、先行技術よりも、着色又は蛍光の妨害に感受性の低い均一分析が、用いられる。この分析において、同一のペプチドが用いられるが、一つの末端に蛍光又は他の蛍光エネルギー受容体で、かつ他の末端で、ペプチド末端に共有結合した１，２−ジオキセタン標識により標識されている。標的化合物の混合の後、ジオキセタンは、化学的（酵素的若しくは非−酵素的）又は例えば熱の適用若しくはpHの変化のような他の引き金を加えることにより、分解される。ペプチドが開裂しないならば、ジオキセタンは、蛍光エネルギー受容体との近接した物理的相関関係にあり、引き金により、蛍光を助けるエネルギー移行が観察される。この光は、蛍光発光に依存して、フルオロセインのために緑のような特徴的な色を有する。ペプチドが開裂すれば、ジオキセタンそれ自体の化学発光の光、典型的には青色光が観察される。図面の詳細な説明図１その配列がアスパルチルＨＩＶ−１プロテアーゼに対する天然処理部位から誘導される二つの標識されたＨＩＶ−１基質Ｉ及びIIの図解。これら二つのＨＩＶ−１ペプチドとｒｅｃＨＩＶ−１プロテアーゼとの温置は、Kohl，NEetal ．(1988)，Proc．Acad．Sci．USA，85，4684及びBillich SW．et al．(1988)，J .Biol．Chem．263，17905に報告されたようにＴｒｙ−Ｐｒｏ結合間の特異的開裂に導く。これらはMayatoshi et al.に報告された先行技術の基質に対して比較されている。図２ＨＩＶ−１プロテアーゼ分析。工程は、１．予め温置による、ｒｅｃＨＩＶ−１プロテアーゼ、アセチル−ペプスタチン（３）及び／又はスクリーニング化合物のノイトルアビジン被覆プレートへの添加；２．ＨＩＶ−１プロテアーゼペプチドの添加、続いて３７℃で６０分の温置；３．開裂ペプチド断片の洗い出し；４．非開裂結合ペプチドを検出するために抗−フルオレセインアルカリホスファターゼ抗体の添加；次いで５．ＣＳＰＤ／Sapphire IIの添加、そしてＴＲ７１７ルミノメーター（Tropix）で発光された光の測定を含む。図３ＣＳＲＤ基質上のリン酸基は、アルカリホスファターゼで開裂されて、不安定アニオン中間体１を生成する。中間体１は、次いで分解されて４７０nmで長寿命発光を生成する。図４ノイトルアビジン被覆プレート上のＨＩＶ−１プロテアーゼペプチド滴定。１００μｌの希釈ペプチドが種々の密度の被覆ノイトルアビジンウエルに加えられた。プレートは洗浄され、ペプチドは抗−フルオレセインアルカリホスファターゼ複合体で検出され、続いてＣＳＰＤ／Sapphire IIが添加された。光の発光は、ＴＲ７１７マイクロプレートルミノメーター（Tropix）で測定された。図５（Ａ及びＢ）ｒｅｃＨＩＶ−１プロテアーゼによるＨＩＶ−１ペプチド開裂及びノイトルアビジン被覆プレート上での捕捉のＨＰＬＣ分析による比較。３５nMのｒｅｃＨＩＶ−プロテアーゼがエッペンドルフ管中の１０μMのＨＩＶペプチドに加えられ、３７℃で温置された。特異時点で、０．１％ＴＦＡが反応を止めるために加えられ、管は氷の上に置かれた。反応生成物はＨＰＬＣで分析された。注入容量は１００μｌであり、吸光度は４９０nmで監視された。開裂生成物の百分率はピーク面積から計算された。ペプチド捕捉実験のために、１００ μｌの１．５０希釈液がノイトルアビジン（５μg/ml）被覆プレートに加えられ、洗浄工程後、６０分間環境温度で温置され、捕捉されたペプチドは抗−フルオレセインで複合されたアルカリホスファターゼ抗体により検出され、別の洗浄工程、続いてＣＳＰＤ／Sapphire IIが添加された。光の発光はＴＲ７１７ミクロプレートルミノメーター（Tropix）で測定された。図６ｒｅｃＨＩＶ−１プロテアーゼによるＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬＨＩＶ −１プロテアーゼ先行技術基質の加水分解。蛍光発生性ＨＴＶ−１ペプチドIIが９６ウエルプレート中のプロテアーゼ緩衝液pH４．７に加えられた。ｒｅｃＨＩＶ−１プロテアーゼは環境温度で加えられ、直ちにＬＳ５０Ｂ蛍光分光光度計（Perkin Elmer）で１０５分間にわたって読みとられた。励起は３４０ nmであり、発光は４９０nmであった。図７ノイトルアビジン被覆プレート上のＨＩＶ−１プロテアーゼ基質の加水分解及び捕捉。プロテアーゼ緩衝液pH５．５に希釈されたｒｅｃＨＩＶ−１プロテアーゼの希釈液が、０．１μg/mlノイトルアビジンで既に被覆されたウエルに加えられた。１０ピコモルのプロテアーゼ基質が反応を開始するために加えられ、プレートは３７℃で１時間温置された。洗浄工程後、捕捉されたペプチドは、抗−フルオレセインで複合されたアルカリホスファターゼ抗体で検出され、続いて別の洗浄工程、次いでＣＳＰＤ／Sapphire IIが添加された。光の発光は、ＴＲ７１７マイクロプレートルミノメーター（Tropix）で測定された。基質の１００％開裂は、基質１では得られなかった。データはこの現象を反映するように調整された。実際には、検出された背景は異なるだろう。図８ＨＩＶ−１捕捉分析におけるアセチル−ペプスタチンによるｒｅｃＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害。プロテアーゼ緩衝液pH５.５に希釈された２.５ピコモルのｒｅｃＨＩＶ−１プロテアーゼがノイトルアビジン（０．１μg/ml）被覆ウエルに加えられた。ＤＭＳＯ中のアセチル−ペプスタチンの希釈液がウエルに加えられ、続いて５分間予め温置された。２０ピコモルのＨＩＶ−プロテアーゼ基質が加えられ、プレートは３７℃で１時間温置された。洗浄工程後、捕捉されたペプチドは、抗−フルオレセインで複合されたアルカリホスファターゼ抗体で検出された。第二の洗浄工程後、ＣＳＰＤ／Sapphire IIが加えられ、光の発光はＴＲ７１７マイクロプレートルミノメーター（Tropix）で測定された。図９ｒｅｃＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害に対する２５μM（５％ＤＭＳＯ）におけるスクリーニング化合物プレート−１００１。プロテアーゼ緩衝液pH５．５に希釈された２．５ピコモルのｒｅｃＨＩＶ−１プロテアーゼがノイトルアビジン被覆プレートに加えられた。大部分医薬標準からなる化合物スクリーニングプレートからの５μｌが加えられ、５分間予め温置された。２０ピコモルのＨＩＶ−１基質Ｉが加えられ、プレートは３７℃で６０分間温置された。洗浄工程後、捕捉されたペプチドは、抗−フルオレセイン複合アルカリホスファターゼ抗体で検出された。第二の洗浄工程後、ＣＳＰＤ／Sapphire IIが加えられ、光の発光はＴＲ７１７マイクロプレートルミノメーター(Tropix)で測定された。図１０ノイトルアビジン及び抗−ＦＬＡＧＭＩモノクローナル抗体被覆プレート上のＨＩＶＦＬＡＧペプチド滴定。１００μｌの希釈ＨＩＶＦＬＡＧペプチドが種々の密度の予め被覆したノイトルアビジン又は抗ＦＬＡＧＭＩモノクローナル抗体被覆プレートに加えられた。被覆は５μg/mlの全タンパク質濃度を達成するように、与えられた量のノイトルアビジン又は抗−ＦＬＡＧＭＩモノクローナル抗体及びＰＢＳ中のＢＳＡを希釈して達成された。プレートは３７℃ で１時間温置され、続いてＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ／３mMＣａＣｌ₂により３回洗浄した。１００μｌのAvidix−ＡＰの１：２０，０００希釈液が加えられ、室温で１時間温置された。ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＣａＣｌ₂緩衝液中の三回洗浄及び１×Ｔｒｉｓ／１mM ＭｇＣｌ／３mMＣａＣｌ₂ pH９．８による一回洗浄後、１００μｌの即時使用のＣＳＰＤ／Sapphire IIが加えられ、ウエルは室温で３０分間温置された。ルミネセンスは、次いでＴＲ７１７マイクロプレートルミノメーター（Tropix）で測定された。本発明者は、２工程差し替え及び希釈分析とは逆に、単一ウエル（プレート）分析として分析を行なうことを可能にする新規なペプチド捕捉条件を発見した。図１２に示されるように、ｒｅｃＨＩＶ −１による他の分析成分の非特異的開裂が存在しないことを示唆する一工程又は二工程分析として行なわれるとき、信号は相対的に同じである。図１１ｒｅｃＨＩＶ−１プロテアーゼ（５０nM）による加水分解後のノイトルアビジン（５μg/ml）上のＨＩＶＦＬＡＧ及びＨＩＶＦＡＭペプチドの捕捉。５０nM ｒｅｃＨＩＶ−１プロテアーゼがプロテアーゼ緩衝液（０．１mM酢酸ナトリウム、１M ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１mM ＤＴＴ、１mg/ml ＢＳＡ、pH ４．７）中の１μM ＨＩＶＦＬＡＧ又はＨＩＶＦＡＭペプチドに加えた。０．５mMのビオチン及び５単位のエンテロキナーゼが対照管に加えられた。反応は、エッペンドルフ管中で３７℃で１時間行なわれた。全ての管は次いで反応を停止するために氷の上に置かれた。追加の５０nM ｒｅｃＨＩＶ−１プロテアーゼが２個の反応管に加えられ、更に３７℃で３０分間温置された。ＨＩＶＦＬＡＧペプチドを含む管は１：１００（最終１０nM）に希釈され、ＨＩＶＦＡＭペプチド管はプロテアーゼ緩衝液で１：１００，０００（最終０．０１nM）に希釈された。１００μｌがノイトルアビジン被覆ウエル（５μg/ml）に加えられ、室温で１時間温置された。ウエルは、次いで３×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＣａＣｌ₂緩衝液で洗浄された。１００μｌの抗ＦＩＴＣ−ＡＰＦａｂ断片の１：５０００希釈液がＨＩＶＦＡＭペプチド含有ウエルに加えられ、１００μｌの予め複合化された抗−ＦＬＡＧＭＩ抗体（１：１０００）及びヤギ抗マウス−ＡＰ複合体（１：１０，０００）がＨＩＶＦＬＡＧペプチド含有ウエルに加えられた。プレートは室温で追加の時間温置され、次いでＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＣａＣｌ₂で３回及びＴｒｉｓ／ＭｇＣｌ／ＣａＣｌ₂pH９．８で１回洗浄された。１００μLの即時使用のＣＳＰＤ／Sapphire IIがウエルに加えられ、室温で３０分温置された。発光は、次いでＴＲ７１７マイクロプレートルミノメーターで測定された。図１２１００nM ＨＴＶＦＬＡＧペプチドによるｒｅｃＨＩＶ−１プロテアーゼの滴定。希釈ＨＩＶ−１プロテアーゼがプロテアーゼ緩衝液中の１００nMＨＩＶＦＬＡＧペプチドへ加えられた。反応は、エッペンドルフ管又は抗−ＦＬＡＧＭＩモノクローナル抗体（０．１μg/ml）により予め被覆されたウエルで直接のいずれかで行なわれた。温置は３７℃で１時間行なわれ、次いでエッペンドルフ反応生成物はウエルに移され、更に室温で１時間温置された。プレートはＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＣａＣｌ₂緩衝液中で３回洗浄され、Avidix−APの１：２０，０００希釈液の添加が続いた。プレートは更に室温で１時間温置され、ついでＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／ＣａＣｌ₂緩衝液で３回及びＴｒｉｓ／ＭｇＣｌ₂／ＣａＣｌ₂pH９．５で１回洗浄された。１００μｌのＣＳＰＤ／Sapphire TIが加えられ、ウエルは室温で３０分間温置された。発光は、次いでＴＲ７１７マイクロプレートルミノメーター（Tropix）で測定された。図１３アセチル−ペプスタチンによる１２．５nMｒｅｃＨＩＶ−１プロテアーゼの阻害。分析は３７℃で１時間抗−ＦＬＡＧＭＩ抗体（０．１μg/ml）により被覆された１００nM ＨＩＶＦＬＡＧペプチドとの反応からなる。プロテアーゼ緩衝液中のＨＩＶ−ＦＬＡＧペプチド基質に加える前に、アセチル−ペプスタチンの希釈液がｒｅｃＨＩＶ−１酵素と共に５分間予め温置された。全ての添加はZymark Rapidプレート上で行なわれた。プレートは、次いでTecan９６プレート洗浄器でＴＢＳ／3mMＣａＣｌ₂／０．０５％Ｔｗｅｅｎにより４回洗浄された。１００μｌのAvidix−ＡＰ複合体の１：２０，０００希釈液がそれぞれのウエルに加えられ、室温で１時間温置された。プレートは、次いで上記緩衝液で３回、Ｔｒｉｓ／ＭｇＣｌ₂／ＣａＣｌ₂ pH９．８で１回洗浄された。１００μ ｌのＣＳＰＤ／Sapphire IIが加えられ、３０分間温置され、次いで光の発光がＴＲ７１７ルミノメーター（Tropix）で測定された。註：アセチル−ペプスタチンは既知のアスパラギン酸プロテイナーゼ阻害剤であり、報告されたＨＴＶ−１プロテアーゼの阻害剤（Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．85，66123(1988)）である。図１４均一分析のための合成ペプチド。ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤検出にも適応される、このペプチドは、不均一分析で使用されたものと同様に、分子の両末端が誘導体化される。しかし、この場合、一端、好適にはカルボキシ末端は、フルオレセインのようなエネルギー受容蛍光部分で標識され、アミノ末端は、その場でジオキセタン（１４Ｂ）に光酸化されることができる、１，２−ジオキセタン部分前駆体（１４Ａ）で標識されている。ジオキセタンは、必要ならば化学的以外の手段（酵素的又は非酵素的）により引き金が引かれてよい。好適な実施態様の記載標的化合物のための適切な開裂部位を含むペプチド基質は、合成される。このペプチドは、不均一分析において、一つの末端で第一のリガンドの結合対の一つのメンバー、例えばビオチンで、そして他の末端において第二のリガンドの結合対のメンバー、例えばフルオレセインで標識されている。このペプチドは、次いで、プロテアーゼ及び阻害活性のためにスクリーニングされるべき問題の化合物と共に、ウエル中、又は該第一のリガンドの結合対の第二の結合リガンド、例えばアビジン又はストレプトアビジンで被覆された他の固相中で温置される。リガンド結合対メンバーと本発明の基質のペプチドの間のスペーサは、共有結合又は第一若しくは第二のリガンドの結合対又は基質開裂で妨害しない、いかなる共有結合部分であってよい。典型的な配列の中に、Ｃ１〜１２アルキル類、アルキルアミノ類、カルボン酸類、又はいずれかの末端で結合官能性で終了するいかなる中性の部分もある。このスペーサは、水溶性増強置換基（例えば、カルボキシ、スルホキシ、ハロ、など）、又は酵素／抗体の存在が必要ならば、基質を環化するために、架橋剤としてで提供されることができる。温置した後、ウエルを洗浄し、１，２−ジオキセタンのための効果的引き金である、例えばアルカリホスファターゼのような酵素で複合された、該第二の結合リガンド対の第二の結合メンバーと一緒に温置し、洗浄し、クロロ置換ホスファートジオキセタン（ＣＳＰＤ）のような１，２−ジオキセタン基質と一緒に温置し、次いでシグナルを測定する。より大きなシグナルは、阻害剤の存在で検出される。基質として用いられろ１，２−ジオキセタンは、4,931,223:4,931,569:4,952, 707:4,956,477:4,978,614:5,032,381:5,112,960:5,154,772:5,220,005:5,326,88 2:5,380,900:5,336,596:5,543,295:5,582,980:5,605,795:5,625,007:5,654,154 及び5,679,803（これらは、ここに参照として組入れられている）を含む、トロピックスの先行特許のいずれかに記載されているそれらのいずれかであってよい。上記の特許は、不安定な条件又は精巧な装置の助けなしに、種々の生物学的分子の検出を、迅速に実施することができる超感受性の分析でのレポーター分子として用いることができる化学発光性化合物として、１，２−ジオキセタンを開示している。好適な基質は、ＣＳＰＤ、ＡＭＰＤのクロロ−置換対応物、それは、３−（４−メトキシースピロ［１，２−ジオキサン−３，２’−トリシクロ［３．３．１．１^3.7］デカン］４−イル）フェニルホスファートのナトリウム塩である。このジオキセタンは、蛍光発色団基、好適にはフェニル又はナフチルのようなアリール基及び酵素開裂性基、例えばホスファートエステル（これは適当な酵素、例えばアルカリホスファターゼにより開裂するとき、負に荷電した置換基（例えば、オキシアニオン）を形成する）を含む。これは、ジオキセタンを不安定化させ、それによりジオキセタンを分解し、光の放出を伴う二つのカルボニル−含有基を形成させる。化学発光性シグナルを増強させるため、かつシグナル／ノイズ比を改善し、背景シグナルと非常に低いレベルでの正の目的−応答シグナルの間を識別するために、水溶性増強剤が、ジオキセタンの導入の前又はそれに付随して試料に加えてもよい。用いてもよい特定の増強剤は、第４級オニウムのポリマーの塩、例えばポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（Sapphire II、Tropix）又は可能な膜被覆、ツイーン−２０（Tween-20:Sigma）のような中性洗剤、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＢ、Sigma）のようなカチオン性洗剤及びそれらの組み合わせのような、米国特許5,336,596に記載されているそれらのいずれかである。阻害剤の決定のための標的であることができるタンパク質分解酵素のファミリーは、システインプロテアーゼ類カスパーセ類（Caspases）１、２、３、６、７、８カテプシン類（Cathepsin）(Ｂ、Ｈ、Ｓ及びＬ) ヒドラーゼ（Hydrolase）Ｌ−プロテアーゼ類（Ｌ−proteinases）カルパイン（Calpain）インターロイキン変換プロテアーゼ類（Interleukin converting proteases）（ＩＣＥ）セリンプロテアーゼ類ウロキナーゼ（Urokinase）トリプシン（Trypsin）トロンボン（Thrombin）カテプシン（Cathepsin）Ｇアスパラギン酸プロテアーゼ類ＨＩＶ−１及び２ヤプシン（Yapsin）Ｉ及びＹＡＰ３プラスメプシン（Plasmepsin）Ｉ及びII カテプシン（Cathepsin）Ｄ及びＥメタロプロテアーゼ類コラゲナーゼ（Collagenase）ゲラチナーゼ（Gelatinase）Ａ及びＢストロメリシン（Stromelysin）アミノペプチダーゼ（Aminopeptidase）エラスターゼ（Elastase）又は米国特許5.591,591に記載されているそれらのいずれかを含む。分析条件及び特異的プロテアーゼへの適用は、また米国特許5.591,591に列記されている。問題のプロテアーゼにより認識されているいずれのペプチドを用いることも可能である。特異的ペプチド及びプロテアーゼの例は、米国特許5.591,591に列記されている。特に、標的プロテアーゼが特異的である開裂部位を特徴とするペプチドは合成される。得られたペプチドは、短く、かつ慣用の合成手法を用いて容易に調製される。種々のリガンド結合対は、用いられる第一及び第二のリガンド結合対の両方に用いることができる。これらのうち、ペプチドのいずれかの末端での好適な標識は、ビオチン、フルオレセイン(ＦＡＭ)、ＦＬＡＧ、ＨＩＳタグ（６個のヒスチジンアミノ酸配列）及びジゴキシン(Dioxin)(ジゴキシゲニン標識ペプチド)である。これらは、第一の対の他のメンバーにより結合され、好適には固相に結合又は付着され、そのために洗濯及び開裂が起る機会の後に加えられた第二の対の他のメンバーの添加を通しても残留し、他のメンバーは、アルカリホスファターゼ又は引き金としての他の適切な酵素と複合化されている。結合対の同定での基本的制限は、第一の結合対が第二の結合対から区別され、相互作用しないことである。アルカリホスファターゼに加えて、ジオキセタンから酵素的に開裂し得る基をを開裂するに用いることができる他の酵素は、酸ホスファターゼ、エステラーゼ、デカルボキシラーゼ、ホスホリパーゼＤ、β−キシロシダーゼ、β−Ｄ−フルコシダーゼ、チオグルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−クルコシダーゼ、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−フルクトフラノシド、β−Ｄ− グルコシデュロナーゼ、及びトリプシンを含む。診断マーカーを構成する有機部分として特に興味のあるものに加えて、プロテアーゼ酵素もまた、酵素標識として考慮し得る。診断プロテアーゼマーカーの例は、カテプシンＢ(ガン)、カテプシンＧ(気腫、リウマチ様関節炎、炎症)、プラスミノーゲン活性化因子（血栓症、慢性炎症、ガン）及びウロキナーゼ（ガン）を含む。プロテアーゼ検出のための分析は、したがって、種々の生物学的及び商業的方法においてタンパク質を追跡するに必要である。この分析の別の実施態様において、均一な化学発光エネルギー移行分析が、提供される。この方法において、開裂配列ペプチドの一つの末端は、１，２−ジオキセタン又はジオキセタン前駆体を有する。この部分の直接の結合は、ジオキセタンを形成する酸化に引き続き、米国特許出願番号No.08/767,479（ここに参照により組み込まれる）で可能にされている。このペプチドの他の末端は、フルオレセインのようなエネルギー受容蛍光分子、又は米国特許5,004,565及び5,208,1 48（これらは、ここで、参照により組み込まれる）に開示されているそれらのような、種々な同様な蛍光部分のいずれかを有する。このペプチドは、十分に短く (１０アミノ酸残基以下)、そのためにジオキセタンは、蛍光標識と物理的に近接して関連している。酵素の添加、若しくはpHの変更、若しくは熱の適用又は他の引き金により実施することができる、ジオキセタンの引き金を引くことにより、ジオキセタンは、分解し、蛍光部分を励起するエネルギー（次いで開裂が起こらなければ蛍光を発する(プロテアーゼ阻害のための正の試験)）を発する。開裂が起これば、ジオキセタン及び蛍光部分は、もはや近接の物理的関係になく、光は化学発光性ジオキセタンにより発光される。蛍光の波長は、特徴的に顕著にジオキセタンのそれからシフトし、均一分析において容易に区別することができる。エノールエーテル又はジオキセタン標識を用いた均一分析への別の方法は、蛍光受容体の代わりに消光基を用いることである。この構成において、ジオキセタン標識の引き金を引くことにおいて、消光基のために、損傷のないペプチドからの光は存在しないだろう。プロテアーゼよるペプチド基質の開裂が、引き金を引く前に起こるならば、ジオキセタン基からの発光は、引き金を引くことで観察されるだろう。この消光過程は、上述したエネルギー移行過程と同様な距離制限に支配されている。図１４に示された基質のための適切な消光基は、フルオレセイント基の代わりにダブシル基であるに違いない。供与ジオキセタンの発光スペクトルに重なる吸収スペクトルを有するいかなる非−蛍光吸収染料も消光基として用いることができる。この方法での変法は、多くのプロテアーゼに用いることができる。微小なウェル表面へのペプチド基質の直接共有又は疎水性結合は、いくつかのプロテアーゼには必要である。別の方法として、固相上へのペプチドの直接合成は、利点を有することもできる。本発明の不均一分析は、ＨＩＶ−１プロテアーゼの直接阻害に適合する分析に対する参照により、以下に例示されている。この例は、説明のみであり、制限を意図していない。材料及び方法試薬：１．ＨＩＶＦＲＡＧペプチドは、Genemed Synthesis，Inc.により特注合成された。２．抗−ＦＬＡＧＭＩモノクローナル抗体、ＦＬＡＧオクタペプチド、及びエンテロキナーゼは、Eastman Kodak Companyから購入された。ノイトルアビジン被覆プレート：ノイトルアビジン^TMビオチン結合タンパク質（ＰＩＥＲＣＥ）は、ＢｕｐＨ^TM炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液（ＰＩＥＲＣＥ）中に５μg/ml又は０．１μg/mlに希釈され、１mg/ml ＢＳＡ（分画VSigma）及び１００μｌが白色９６ウエル板（Dynatech-Microlitel）に加えられ、３７℃で２時間温置された。ウエルは、次いでＰＢＳ、０．１％(v/v)Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄され、ＰＢＳ、０．１％（v/v）Ｔｗｅｅｎ２０、１mg/ml ＢＳＡで４℃で一夜遮断された。プロテアーゼ分析：ｒｅｃＨＩＶ−ＰＲＩ（アフィニティ精製−ＢＡＣＨＥＭ）は０．１M酢酸ナトリウム、１M ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１mM ＤＴＴ、１m g/mlＢＳＡ、pH４．７又は５．５に希釈され、ノイトルアビジン被覆プレートに加えられた。ｒｅｃＨＩＶ−１阻害剤(アセチル−ペプスタチン(ＢＡＣＨＥＭ)) 、プレート−１００１（Sigma Drug Standards）からの化合物及び／又はＤＭＳＯが加えられ、それぞれＨＩＶ−１ペプチドＩ又はII、（ＦＡＭ−スペーサー− Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−スペーサー−ビオチン（Perkin-Elmer）又は（ＦＬＡＧ−Ｓｅｒ−Ｎｌｅ−Ａｌａ− Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−スペーサー−ビオチン）又はＤＡＢＣＹＬ−ｙ−Ａｂｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−ＩｌｅＶａｌ−Ｇｌｎ−ＥＤＡＮＳ(ＢＡＣＨＥＭ)(先行技術)の添加の前に、５分間予め温置された。反応は、環境温度及び／又は３７℃で行なわれた。ＨＰＬＣ分析のために、反応は、０．１％ＴＦＡで停止され、注入前に氷の上に置かれた。ＢＡＣＨＥＭ蛍光発生性基質による分析は、ＬＳ５０Ｂ蛍光分光光度計（Perkin-Elmer）で直接測定された。捕捉されたビオチン化−フルオレセイン標識ペプチドＩを有するノイトルアビジン被覆分析プレートは、ＰＢＳ、０．１％（v/v）Ｔｗｅｅｎ２０、１mg/ml ＢＳＡで洗浄され、環境温度で抗− フルオレセインアルカリホスファターゼＦａｂ断片（BoeringerMannheim）と共に６０分間温置された。プレートは、ＰＢＳ緩衝液で再び洗浄され、続いて１０ mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１mM ＭｇＣｌ₂ pH９８で洗浄された。１００μｌＣＳＰＤ／Sapphire II^TM用意されたアルカリホスファターゼが加えられ、光の発光は、ＴＲ７１７^Rマイクロプレートルミノメーター（Tropix）で測定された。ＨＰＬＣ分析：ＨＩＶ−１プロテアーゼ基質開裂生成物に関する分析用ＨＰＬＣは、シリーズ２００１ｃポンプ、Perkin-Elmer Pecosphere５Ｃ１８、５μm、４．６mm×１５cm、３０％〜６０％の水（０．１％ＴＦＡ）及びＣＨ₃ＣＮ（０．１％ＴＦＡ）の勾配で、Perkin-Elmer UV/Vis検出器で１０分にわたって１ml ／分で行なわれた。添加及び希釈は、Zymark RapidPlate-96 Pipeting station（Zymark Corp.）で行なわれ、洗浄はTecan ９６ＰＷ洗浄器（Tecan）で行なわれた。本発明者は、新規なＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤を探すために以下に示したような自動化スクリーニング分析を首尾よく開発した。自動化工程我々は、このプロテアーゼ分析が最少試薬使用で終点捕捉分析として構成できることを示した。２００nMのＨＩＶ−１ペプチド基質Ｉ濃度及び２５〜５０nMのｒｅｃＨＩＶ−１プロテアーゼ濃度が、良好な感度及び受容可能なシグナル：ノイズで最適作動濃度であることが示された。Abbott Laboratories，Matayoshi e t al.，Science 247:954-958（1980）により報告された共鳴エネルギー移行分析は、ＨＩＶ−１ペプチドIIのミクロモル量を用いる。この分析は、５分未満の線形検出窓での分析として報告され、我々は、それが自動化するためのロボット分析を困難にする貧弱なシグナル対ノイズ比を有することを見出した。この分析は、最大４のｓ／ｎ比を与えるが、本発明の分析は、ＦＬＡＧ／抗−ＦＬＡＧリガンド結合対を用いるとき、１４０以上のｓ／ｎ比を与える。ビオチン及びフルオレセインのような一般的実験室試薬を用いて、Fournour ，S．et al.，Anal.Che m．69，1746-1752（1997）による代替ＨＩＶペプチド捕捉に基づく分析に記載されたように配列特異性モノクローナル抗体を生成させることを除くことができる。我々はＤＭＳＯが分析によく耐性があることを示した。我々の捕捉分析におけるアセチル−ペプスタチンのＩＣ₅₀はFournour ，S．et al.により報告された０．３μMに比較して２〜３μMであった。本発明は、一般的記載及び特定の例の両方の項目により開示されている。ペプチド部分の同一性、用いられるべき特定のタンパク質分解酵素、増強剤及び増強添加剤、並びに特定の分析構成を含む変法は、発明的能力を用いることなく、当業者には可能であろう。そのような変法は、以下に述べた特許請求の範囲の詳説により除外され変法を除いて、本発明の範囲内である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者パーマー，ミシェルアメリカ合衆国、マサチューセッツ 02174、アーリントン、メドフォード・ストリート 87 (72)発明者ティロトソン，ボニーアメリカ合衆国、マサチューセッツ 02178、ベルモント、ビーチ・ストリート 105、ユニット１

Claims

【特許請求の範囲】１．標的化合物がプロテアーゼ阻害剤としての活性を示すかどうかを決定するための分析を実施するための方法であって、構築物を更に含む環境中で該プロテアーゼ及び該標的化合物を一緒にし(ここで、該環境は、該プロテアーゼが、該プロテアーゼ阻害剤が存在しない場合に、該構築物を開裂するようになっている)、該構築物は、第一の末端において第一のリガンド結合対の第一のメンバーで、かつ第二の末端において第二のリガンド結合対の第一のメンバーで終了するアミノ酸配列を含み(ここで、該第一のリガンド結合対の第一のメンバーは、第二のメンバーが表面に結合している第一のリガンドの結合対の第二のメンバーに結合している)、該プロテアーゼにより開裂された該構築物のいかなる断片をも除去し、ある酵素と複合化した該第二のリガンド結合対の第二のメンバーの複合体を加え、そして該複合体を該第二のリガンド結合対のいかなる該第一のメンバーにも結合させ、いかなる非結合複合体をも除去し、該酵素基質である１，２−ジオキセタンを加え、そしてそれにより放出される化学発光（ここで、該化学発光の発光強度は、該標的化合物によるプロテアーゼ阻害活性の指標である）を観察することを特徴とする方法。２．観察された該化学発光（ここで、観察された化学発光の量は、該化合物により示された阻害活性の程度に相関付けられる）を測定する、請求項１記載の方法。３．該分析が、差し替えなしの単一プレート終点分析である、請求項１記載の方法。４．該表面が、試験プレートの少なくとも一つのウエルの少なくとも一部分である、請求項１記載の方法。５．該第二のリガンド結合対の該第二のメンバーが、抗体である、請求項１記載の方法。６．該第一のリガンド結合対が、ビオチン及び少なくともアビジンのように強固にビオチンに結合する化合物である、請求項１記載の方法。７．該第二のリガンド結合対が、ビオチン及び少なくともアビジンのように強固にビオチンに結合する化合物である、請求項１記載の方法。８．少なくともアビジンのように強固にビオチンに結合する該化合物が、アビジン又はストレプトアビジンである、請求項６記載の方法。９．アビジンのように強固に結合する該化合物が、アビジン又はストレプトアビジンである、請求項７記載の方法。１０．該第一のリガンド結合対の該第一のメンバーが、ビオチンであり、そして該第二のリガンド結合対の該第一のメンバーが、フルオレセインである、請求項１記載の方法。１１．該第二のリガンド結合対が、ＦＬＡＧ及びその抗体である、請求項１記載の方法。１２．該プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、及びメタロプロテアーゼよりなる群から選択される、請求項１記載の方法。１３．該プロテアーゼが、ＨＩＶ−１プロテアーゼ、キャスパーゼ、カテプシン、ヒドロラーゼ、Ｌ−プロテイナーゼ、カルパイン、インターロイキン変換プロテアーゼ、ウロキナーゼ、トリプシン、トロンビン、ＨＩＶ−２プロテアーゼ、ヤプシンＩ、ヤプシン３、プラスメプシンＩ、プラスメプシンIT、コラゲナーゼ、ゲラチナーゼ、ストロメリシン、アミノペプチダーゼ及びエラスターゼよりなる群から選択される、請求項１記載の方法。１４．該プロテアーゼが、ＨＩＶ−１プロテアーゼである、請求項１３記載の方法。１５．標的化合物のプロテアーゼ阻害活性を決定するための分析を実施するためのプロテアーゼ基質であって、該基質が、ポリペプチドを含み、該ポリペプチドが、該プロテアーゼに特異的な開裂部位を含み、該ポリペプチドが、第一の末端に第一のリガンド結合対の第一のメンバー及び他の末端に第二のリガンド結合対の第一のメンバーを有し、ここで該第一のリガンド結合対の該第一のメンバー及び該第二のリガンド結合対の該第一のメンバーが、互いに結合しないことを特徴とする基質。１６．該第一及び第二のリガンド結合対が、独立して、抗原とその抗体、又はビオチンとアビジンのように強固に結合する化合物からなる、請求項１５記載の基質。１７．該基質が、配列：フルオレセイン−スペーサー−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｕ −Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−スペーサー−ビオチン、又はＦＬＡＧ−Ｓｅｒ−Ｎｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｈｙｓ−Ｈｉｓ−スペーサービオチンを有する、請求項１５記載の基質。１８．標的化合物のプロテアーゼ阻害活性の決定のための均一分析であって、構築物を更に含む環境中で該プロテアーゼ及び該標的化合物を一緒にし(ここで、該環境は、該プロテアーゼが、該プロテアーゼが存在しない場合に、該構築物を開裂するようになっている)、該構築物は、２〜２０のアミノ酸のポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、第一の末端において、及び１，２−ジオキセタン又はそれの前駆体（それは、該環境で酸化さてれて、１，２−ジオキサン部分を提供する）である部分で、及び第二の末端において、エネルギーを受け入れる蛍光部分で終了し、該前駆体を、もしそれが存在するならば、１，２−ジオキセタン部分を形成するように酸化し、該１，２−ジオキセタン部分を分解せしめ、そして該環境から発光される光の波長（ここで、該波長は、もしそれが該蛍光発光の波長であるならば、阻害活性の指標であり、該波長は、もしそれが該ジオキセタンの波長であるならば、阻害活性の不在の指標である）を観察することを特徴とする分析。１９．標的化合物のプロテアーゼ阻害活性を決定するための均一分析を実施するための構築物であって、２〜１０のアミノ酸残基を含み、ここで、該ポリペプチドは、該プロテアーゼに特異的な開裂部位を含み、該ポリペプチドは、一つの末端に蛍光エネルギー受け入れ部分又は化学発光消光部分を、及び他の末端に１，２−ジオキセタン又は１，２−ジオキセタン前駆体部分（これは、該分析の過程で１，２−ジオキセタン部分を形成するように酸化されることができる）を有することを特徴とする構築物。２０．プロテアーゼ阻害剤が試料中に存在するかどうかを決定する分析を実施するためのキットであって、一個以上の容器中に、ａ）該プロテアーゼ基質であるペプチド(ここで、該ペプチド基質は、（ｉ）第一のリガンド結合対の第一のメンバー、及び（ii）第二のリガンド結合対の第一のメンバーで標識されている)；及び（ｂ）酵素的に開裂し得る基を含む、化学発光性１，２−ジオキセタン基質（この基質は、該基質から該酵素的に開裂し得る基を開裂する酵素の存在下で、光を生じさせ得る）を含むことを特徴とするキット。２１．該プロテアーゼが、ＨＩＶ−１プロテアーゼである、請求項20記載のキット。２２．該ペプチド基質が、アミノ酸配列：−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｒｙ− Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｖal−Ｇｌｎ−を含む、請求項２１記載のキット。２３．該第二のリガンド結合対の該第一のメンバーが、フルオレセインである、請求項２０記載のキット。２４．該第一のリガンド結合対の該第一のメンバーが、ビオチンである、請求項２０記載のキット。２５．該１，２−ジオキセタンのためのポリマーの第４級オニウム塩強化剤を更に含む、請求項２０記載のキット。２６．該強化剤が、ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリドを含む、請求項２０記載のキット。２７．該第二のリガンド結合対の第二のメンバーで複合化された酵素を更に含む、請求項２０記載のキット。２８．該酵素が、アルカリホスファターゼである、請求項２７記載のキット。