JPH06189790A - ソルビトールの測定法およびそのための試薬 - Google Patents
ソルビトールの測定法およびそのための試薬Info
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- JPH06189790A JPH06189790A JP16635791A JP16635791A JPH06189790A JP H06189790 A JPH06189790 A JP H06189790A JP 16635791 A JP16635791 A JP 16635791A JP 16635791 A JP16635791 A JP 16635791A JP H06189790 A JPH06189790 A JP H06189790A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 試料中のソルビトール濃度を正確にしかも
簡便に測定する方法およびそのための試薬を提供する。 【構成】 酢酸菌の細胞膜由来のソルビトール脱水素
酵素、電子伝達体および還元発色性色素を含有する試薬
を使用して、試料中のソルビトール濃度を測定する。
簡便に測定する方法およびそのための試薬を提供する。 【構成】 酢酸菌の細胞膜由来のソルビトール脱水素
酵素、電子伝達体および還元発色性色素を含有する試薬
を使用して、試料中のソルビトール濃度を測定する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、試料中のソルビトール
濃度を測定する測定方法及びその試薬に関する。
濃度を測定する測定方法及びその試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、試料中のソルビトールの測定は、
ガスクロマトグラフィーを用いた方法や補酵素を必要と
するソルビトール脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．１４）
を利用して、補酵素の酸化還元状態を測定することによ
り行われていた。しかし、ガスクロマトグラフィーを用
いる方法は、操作が煩雑であり、しかも高価な機器を必
要とすることから、簡便で安価な測定方法が求められて
いた。また、従来より知られていた補酵素を必要とする
ソルビトール脱水素酵素を用いる方法は、使用する酵素
の基質特異性が不良であるために、試料中の真のソルビ
トール濃度を測定しているかどうかわからないという不
安が指摘されていた。酢酸菌細胞膜由来のソルビトール
脱水素酵素は、基質特異性に優れ、ソルビトール測定に
有用であることは示唆されていたが、簡便な測定法がな
く一般に広く普及するに至っていなかった。
ガスクロマトグラフィーを用いた方法や補酵素を必要と
するソルビトール脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．１４）
を利用して、補酵素の酸化還元状態を測定することによ
り行われていた。しかし、ガスクロマトグラフィーを用
いる方法は、操作が煩雑であり、しかも高価な機器を必
要とすることから、簡便で安価な測定方法が求められて
いた。また、従来より知られていた補酵素を必要とする
ソルビトール脱水素酵素を用いる方法は、使用する酵素
の基質特異性が不良であるために、試料中の真のソルビ
トール濃度を測定しているかどうかわからないという不
安が指摘されていた。酢酸菌細胞膜由来のソルビトール
脱水素酵素は、基質特異性に優れ、ソルビトール測定に
有用であることは示唆されていたが、簡便な測定法がな
く一般に広く普及するに至っていなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、基質
特異性に優れた、酢酸菌細胞膜由来のソルビトール脱水
素酵素を利用し、試料中のソルビトール濃度を正確にし
かも簡便に測定する測定方法およびそのための試薬を提
供することにある。本発明者らは、試料中のソルビトー
ル濃度の測定に際して、酢酸菌細胞膜由来のソルビトー
ル脱水素酵素を利用して、安価で簡便な測定方法の検討
を鋭意努力した結果、以下のような安価で簡便なソルビ
トール測定方法及測定試薬に到達した。
特異性に優れた、酢酸菌細胞膜由来のソルビトール脱水
素酵素を利用し、試料中のソルビトール濃度を正確にし
かも簡便に測定する測定方法およびそのための試薬を提
供することにある。本発明者らは、試料中のソルビトー
ル濃度の測定に際して、酢酸菌細胞膜由来のソルビトー
ル脱水素酵素を利用して、安価で簡便な測定方法の検討
を鋭意努力した結果、以下のような安価で簡便なソルビ
トール測定方法及測定試薬に到達した。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明の要旨は、試料中
のソルビトール濃度を測定する際に、酢酸菌の細胞膜由
来のソルビトール脱水素酵素、電子伝達体及び還元発色
性色素の存在下に測定することを特徴とするソルビトー
ルの測定法並びに酢酸菌の細胞膜由来のソルビトール脱
水素酵素、電子伝達体および還元発色性色素を含有する
ことを特徴とする試料中のソルビトール濃度測定用試薬
に存する。
のソルビトール濃度を測定する際に、酢酸菌の細胞膜由
来のソルビトール脱水素酵素、電子伝達体及び還元発色
性色素の存在下に測定することを特徴とするソルビトー
ルの測定法並びに酢酸菌の細胞膜由来のソルビトール脱
水素酵素、電子伝達体および還元発色性色素を含有する
ことを特徴とする試料中のソルビトール濃度測定用試薬
に存する。
【０００５】本発明において用いられる酢酸菌細胞膜由
来のソルビトール脱水素酵素としては、例えば特開昭５
６−２９９９４号公報に記載されたものを好適に利用で
きる。該酵素の性質の一例は次の通りである。
来のソルビトール脱水素酵素としては、例えば特開昭５
６−２９９９４号公報に記載されたものを好適に利用で
きる。該酵素の性質の一例は次の通りである。
【０００６】（ａ）作用：Ｄ−ソルビトールを脱水素し
て、Ｌ−ソルボースに変換する。 （ｂ）基質特異性：主としてＤ−ソルビトールを脱水素
する。 （ｃ）至適ｐＨ域：ｐＨ４．５±０．５ （ｄ）至適温度域：２５℃±５℃ （ｅ）安定性：ｐＨ５．０、５℃、２４時間放置しても
失活しない。 （ｆ）失活条件：酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中で４５℃
以上に１０分間加熱すると失活する。 （ｇ）阻害：Ｐ−クロロマーキユリベンゾエートによっ
て活性は阻害される。 （ｈ）安定化：Ｄ−ソルビトールの存在によって安定化
される。 （ｉ）分子構造：分子量が約５６，０００のユニット、
約４３，０００のユニットおよび約１６，０００のユニ
ット（それぞれＳＤＳ−ゲル電気泳動法による）の３ユ
ニットから構成される。分子中にフラビン分子およびチ
トクロム分子を補欠分子として有する。 （ｊ）可視部吸収スペクトル：λmax ：４１７ｎｍ、５
２３ｎｍ、５５２ｎｍ。 λmin ：４８１ｎｍ、５４０ｎｍ。 ショルダー：約５３０ｎｍ。 （ｇ）電子受客体：フエリシアニド、２，６−ジクロロ
フエノールインドフエノールまたはフエナジンメトスル
フエート。
て、Ｌ−ソルボースに変換する。 （ｂ）基質特異性：主としてＤ−ソルビトールを脱水素
する。 （ｃ）至適ｐＨ域：ｐＨ４．５±０．５ （ｄ）至適温度域：２５℃±５℃ （ｅ）安定性：ｐＨ５．０、５℃、２４時間放置しても
失活しない。 （ｆ）失活条件：酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中で４５℃
以上に１０分間加熱すると失活する。 （ｇ）阻害：Ｐ−クロロマーキユリベンゾエートによっ
て活性は阻害される。 （ｈ）安定化：Ｄ−ソルビトールの存在によって安定化
される。 （ｉ）分子構造：分子量が約５６，０００のユニット、
約４３，０００のユニットおよび約１６，０００のユニ
ット（それぞれＳＤＳ−ゲル電気泳動法による）の３ユ
ニットから構成される。分子中にフラビン分子およびチ
トクロム分子を補欠分子として有する。 （ｊ）可視部吸収スペクトル：λmax ：４１７ｎｍ、５
２３ｎｍ、５５２ｎｍ。 λmin ：４８１ｎｍ、５４０ｎｍ。 ショルダー：約５３０ｎｍ。 （ｇ）電子受客体：フエリシアニド、２，６−ジクロロ
フエノールインドフエノールまたはフエナジンメトスル
フエート。
【０００７】該酵素は例えば、グルコノバクター属、ア
セトバクター属、セラチア属、プロテウス属、バチルス
属、スタフイロコツカス属、ブレビバクテリウム属、シ
ユードモナス属またはクレブシエラ属に属するＤ−ソル
ビトール脱水素酵素生産菌を培地に培養し、培養物中に
Ｄ−ソルビトール脱水素酵素を生成蓄積せしめ、該培養
物からこれを採取することによって得ることができる。
セトバクター属、セラチア属、プロテウス属、バチルス
属、スタフイロコツカス属、ブレビバクテリウム属、シ
ユードモナス属またはクレブシエラ属に属するＤ−ソル
ビトール脱水素酵素生産菌を培地に培養し、培養物中に
Ｄ−ソルビトール脱水素酵素を生成蓄積せしめ、該培養
物からこれを採取することによって得ることができる。
【０００８】該酵素を製造するに際して用いられる微生
物としては、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃ
ｔｅｒ）属、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロテウス
（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
属、スタフイロコツカス（Ｓｔａｐｈｉｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）属、シユードモナス（Ｐｓｃｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属またはクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属
に属する微生物であってＤ−ソルビトールを脱水素する
ものはいずれでも用いることができる。
物としては、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃ
ｔｅｒ）属、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロテウス
（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
属、スタフイロコツカス（Ｓｔａｐｈｉｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）属、シユードモナス（Ｐｓｃｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属またはクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属
に属する微生物であってＤ−ソルビトールを脱水素する
ものはいずれでも用いることができる。
【０００９】上記の微生物の具体例としては、たとえば
グルコノバクター・サブオキシダンス・バール・アルフ
ア（Ｏ．ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ ｖａｒ．α）ＩＦＯ３
２５４、グルコノバクター・カプシュラツス（Ｇ．ｃｕ
ｐｓｕｌａｔｕｓ）ＩＦＯ３４６２、グルコノバクター
・オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）ＩＦＯ３１８
９、グルコノバクター・インダストリウス（Ｇ．ｉｎｄ
ｕｓｔｒｉｕｓ）ＩＦＯ３２６０、グルコノバクター・
グルコニクス（Ｇ．ｇｌｕｃｏｎｉｃｓ）ＩＦＯ３１７
１、グルコノバクター・セリヌス（Ｇ．ｃｅｒｉｎｕ
ｓ）ＩＦＯ３２６５、グルコノバクター・ジオキシアセ
トニクス（Ｇ．ｄｉｏｘｙａｃｅｔｏｎｕｃｕｓ）ＩＦ
Ｏ３２７１、グルコノバクター・メラノゲネス（Ｇ．ｍ
ｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ）ＩＦＯ３２９２、グルコノバク
ター・リケフアシエンス（Ｇ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）ＩＦＯ１２３８８、アセトバクター・オーランチウ
ス（Ａ．ａｕｒａｎｔｉｕｓ）ＩＦＯ３２４５、アセト
バクター・アセチゲネス（Ａ．ａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ）
ＩＦＯ３２７７、アセトバクター・ランセンス（Ａ．ｒ
ａｎｃｅｎｓ）ＩＦＯ３２９８、アセトバクター・アセ
チ（Ａ．ａｃｅｔｉ）ＩＦＯ３２８１、アセトバクター
・アセンデンス（Ａ．ａｓｃｅｎｄｅｎｓ）ＩＦＯ３１
８８、セラチア・マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅ
ｎｓ）ＩＦＯ３０５２、プロテウス・ブルガリス（Ｐ．
ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＩＦＯ３１６７、バチルス・スブチ
リス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＩＦＯ３０１３、スタフ
イロコツカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＩＦＯ
３０６０、ブレビバクテリウム・アムモニアゲネス
（Ｂ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＩＦＯ１２０７２、
シユードモナス・エルギノサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓ
ａ）ＩＦＯ３４４５、クレブシエラ・ニユーモニエ
（Ｋ．ｐｎｏｕｍｏｎｉａｅ）ＩＦＯ３３１７などが挙
げられる。
グルコノバクター・サブオキシダンス・バール・アルフ
ア（Ｏ．ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ ｖａｒ．α）ＩＦＯ３
２５４、グルコノバクター・カプシュラツス（Ｇ．ｃｕ
ｐｓｕｌａｔｕｓ）ＩＦＯ３４６２、グルコノバクター
・オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）ＩＦＯ３１８
９、グルコノバクター・インダストリウス（Ｇ．ｉｎｄ
ｕｓｔｒｉｕｓ）ＩＦＯ３２６０、グルコノバクター・
グルコニクス（Ｇ．ｇｌｕｃｏｎｉｃｓ）ＩＦＯ３１７
１、グルコノバクター・セリヌス（Ｇ．ｃｅｒｉｎｕ
ｓ）ＩＦＯ３２６５、グルコノバクター・ジオキシアセ
トニクス（Ｇ．ｄｉｏｘｙａｃｅｔｏｎｕｃｕｓ）ＩＦ
Ｏ３２７１、グルコノバクター・メラノゲネス（Ｇ．ｍ
ｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ）ＩＦＯ３２９２、グルコノバク
ター・リケフアシエンス（Ｇ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）ＩＦＯ１２３８８、アセトバクター・オーランチウ
ス（Ａ．ａｕｒａｎｔｉｕｓ）ＩＦＯ３２４５、アセト
バクター・アセチゲネス（Ａ．ａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ）
ＩＦＯ３２７７、アセトバクター・ランセンス（Ａ．ｒ
ａｎｃｅｎｓ）ＩＦＯ３２９８、アセトバクター・アセ
チ（Ａ．ａｃｅｔｉ）ＩＦＯ３２８１、アセトバクター
・アセンデンス（Ａ．ａｓｃｅｎｄｅｎｓ）ＩＦＯ３１
８８、セラチア・マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅ
ｎｓ）ＩＦＯ３０５２、プロテウス・ブルガリス（Ｐ．
ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＩＦＯ３１６７、バチルス・スブチ
リス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＩＦＯ３０１３、スタフ
イロコツカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＩＦＯ
３０６０、ブレビバクテリウム・アムモニアゲネス
（Ｂ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＩＦＯ１２０７２、
シユードモナス・エルギノサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓ
ａ）ＩＦＯ３４４５、クレブシエラ・ニユーモニエ
（Ｋ．ｐｎｏｕｍｏｎｉａｅ）ＩＦＯ３３１７などが挙
げられる。
【００１０】本発明で用いられる電子伝達体としては、
一般にヂアフォラーゼと呼ばれている電子伝達活性を示
す酵素や一般にＰＭＳと呼ばれるフェナジンメタサルフ
ェイト、１−ｍＰＭＳと呼ばれる、１−メトキシ−５−
フェナゾリウムメチルサルフェイトやメルドラブルーが
好適に利用できるが、レドクス反応による電子の受渡し
を行える物質であればいかなるものでも利用できる。
一般にヂアフォラーゼと呼ばれている電子伝達活性を示
す酵素や一般にＰＭＳと呼ばれるフェナジンメタサルフ
ェイト、１−ｍＰＭＳと呼ばれる、１−メトキシ−５−
フェナゾリウムメチルサルフェイトやメルドラブルーが
好適に利用できるが、レドクス反応による電子の受渡し
を行える物質であればいかなるものでも利用できる。
【００１１】本発明で用いられる還元発色性色素として
は、一般にＭＭＴと呼ばれる３−（４、５−ヂメチル−
２−チアゾリル）−２、５−ヂフェニール−２Ｈテトラ
ゾリウムブロミドやＩＮＴと呼ばれる３−（ｐ−ヨード
フェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニ
ル−２Ｈテトラゾリウムクロライド等が好適に利用でき
るが、一般にホルマザン色素と呼ばれている還元発色性
色素であれば利用できる。
は、一般にＭＭＴと呼ばれる３−（４、５−ヂメチル−
２−チアゾリル）−２、５−ヂフェニール−２Ｈテトラ
ゾリウムブロミドやＩＮＴと呼ばれる３−（ｐ−ヨード
フェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニ
ル−２Ｈテトラゾリウムクロライド等が好適に利用でき
るが、一般にホルマザン色素と呼ばれている還元発色性
色素であれば利用できる。
【００１２】酢酸菌細胞膜由来の酵素濃度は特に限定さ
れるものではなく、酵素が少量であってもソルビトール
の測定を実施できる。しかし、好適には、測定時間は５
〜２０分間が適当であるとすると、２０分間で測定を終
了させる為には、０．１単位／ｍｌ〜１００単位／ｍ
ｌ、好ましくは２単位／ｍｌ〜２０単位／ｍｌである。
但し、酵素活性は下記の測定法により、１分間に１μｍ
ｏｌｅのソルビトールを消費し、１μｍｏｌｅのホルマ
ザン色素を生成する酵素活性を１単位とする。 酵素活性測定法 試薬（反応混液） ソルビトール ０．２ Ｍ ＮａＮ3 １０．０ ｍＭ ｌ−ｍＰＭＳ ０．３６ｍＭ ＭＴＴ ０．２４ｍＭ Ｂｒｉｊ−３５ １．０ ％ ＭｃＩｌｖａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ５．０ 操作方法 反応混液 ２．４ｍｌ ５分間、３０℃で加温 酵素溶液 ０．１ｍｌ ５７０ｎｍの吸光度上昇を、試薬ブランクを対照に測定
する。（△０Ｄ５７０／ｍｉｎ） 計 算 単位／ｍｌ＝△０Ｄ５７０／ｍｉｎ×２．５（ｍｌ）×
ｄｆ／（１６．８×１．０（ｃｍ）×０．１（ｍｌ）） １６．８：上記条件でのホルマザン色素のミリモル吸収
係数
れるものではなく、酵素が少量であってもソルビトール
の測定を実施できる。しかし、好適には、測定時間は５
〜２０分間が適当であるとすると、２０分間で測定を終
了させる為には、０．１単位／ｍｌ〜１００単位／ｍ
ｌ、好ましくは２単位／ｍｌ〜２０単位／ｍｌである。
但し、酵素活性は下記の測定法により、１分間に１μｍ
ｏｌｅのソルビトールを消費し、１μｍｏｌｅのホルマ
ザン色素を生成する酵素活性を１単位とする。 酵素活性測定法 試薬（反応混液） ソルビトール ０．２ Ｍ ＮａＮ3 １０．０ ｍＭ ｌ−ｍＰＭＳ ０．３６ｍＭ ＭＴＴ ０．２４ｍＭ Ｂｒｉｊ−３５ １．０ ％ ＭｃＩｌｖａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ５．０ 操作方法 反応混液 ２．４ｍｌ ５分間、３０℃で加温 酵素溶液 ０．１ｍｌ ５７０ｎｍの吸光度上昇を、試薬ブランクを対照に測定
する。（△０Ｄ５７０／ｍｉｎ） 計 算 単位／ｍｌ＝△０Ｄ５７０／ｍｉｎ×２．５（ｍｌ）×
ｄｆ／（１６．８×１．０（ｃｍ）×０．１（ｍｌ）） １６．８：上記条件でのホルマザン色素のミリモル吸収
係数
【００１３】電子伝達体濃度は通常０．０１ｍＭ〜１０
ｍＭ、好適には０．１ｍＭ〜１．０ｍＭである。還元発
色性色素濃度は通常０．０１ｍＭ〜１０．０ｍＭ、好適
には、０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭである。
ｍＭ、好適には０．１ｍＭ〜１．０ｍＭである。還元発
色性色素濃度は通常０．０１ｍＭ〜１０．０ｍＭ、好適
には、０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭである。
【００１４】本発明で用いるソルビトール脱水素酵素
は、細胞膜由来のため、活性測定には非イオン性界面活
性剤を用いるのが望ましい。非イオン性界面活性剤とし
ては、トリトンＸ−１００、Ｂｒｉｊ−３５、アルキル
シュガー類であるＢ−Ｄ−オクチルグルコシド等が利用
できる。必要濃度としては、通常０．０１％〜１０％、
好適には０．１％〜２％である。
は、細胞膜由来のため、活性測定には非イオン性界面活
性剤を用いるのが望ましい。非イオン性界面活性剤とし
ては、トリトンＸ−１００、Ｂｒｉｊ−３５、アルキル
シュガー類であるＢ−Ｄ−オクチルグルコシド等が利用
できる。必要濃度としては、通常０．０１％〜１０％、
好適には０．１％〜２％である。
【００１５】また、必須の成分ではないがアジ化ナトリ
ウム（ＮａＮ3 ）等を添加してもよい。
ウム（ＮａＮ3 ）等を添加してもよい。
【００１６】測定条件は特に限定されるものではない
が、反応時間は５〜３０分間、好ましくは２０分間、反
応温度は２５〜３７℃、好ましくは３０℃、吸光度は５
４０〜６００ｎｍ、好ましくはホルマザン色素の吸収極
大である５７０ｎｍである。
が、反応時間は５〜３０分間、好ましくは２０分間、反
応温度は２５〜３７℃、好ましくは３０℃、吸光度は５
４０〜６００ｎｍ、好ましくはホルマザン色素の吸収極
大である５７０ｎｍである。
【００１７】
【実施例】次に実施例によって本発明を具体的に説明す
る。しかし、本発明はこの実施例に限定されるものでは
ない。 実施例１ （酢酸菌細胞膜由来ソルビトール脱水素酵素の調整）酢
酸菌グルコノバクター・サブオキシダンス・ファー・ア
ルファ（ＩＦＯ３２５４）を酵母エキス、ポリペプトン
を添加した培地で、ソルビトールを誘導物質として３０
℃で通気培養した。培養して得た菌体を集菌し破砕後、
界面活性剤を用いてソルビトール脱水素酵素を細胞膜よ
り可溶化し粗ソルビトール脱水素酵素液を得た。この粗
酵素液をイオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフ
ィーにチャージし夾雑酵素を分離し、ソルビトール脱水
素酵素酵素液を調整した。 （測定）下記のような試薬を調整し、ソルビトールの測
定を実施した。 酢酸菌細胞膜由来ソルビトール脱水素酵素 ５単位／ｍ
ｌ １−メトキシ−５−フェナゾリウムメチルサルフェイト
２９．５ｍＭ ＭＴＴ ０．６ｍＭ 非イオン性界面活性剤（トリトンＸ−１００） ０．４
％ ＮａＮ3 ９．２ｍＭ ＭｃＩｌｖａｉｎ バッファー ｐＨ４．５ 試 料 各濃度（０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍ
Ｍ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ）ソルビトー
ル水溶液 操 作 試薬２．７ｍｌを試験官にとり、３０℃、３分間予備加
温後、各試料０．３ｍｌを分注し、３０℃で２０分間反
応させ、２０分後の５７０ｎｍの吸光度をソルビトール
０ｍＭを対照に測定した。結果を図１に示す。ソルビト
ール濃度にしたがって、吸光度が直線的に上昇している
ことがわかる。
る。しかし、本発明はこの実施例に限定されるものでは
ない。 実施例１ （酢酸菌細胞膜由来ソルビトール脱水素酵素の調整）酢
酸菌グルコノバクター・サブオキシダンス・ファー・ア
ルファ（ＩＦＯ３２５４）を酵母エキス、ポリペプトン
を添加した培地で、ソルビトールを誘導物質として３０
℃で通気培養した。培養して得た菌体を集菌し破砕後、
界面活性剤を用いてソルビトール脱水素酵素を細胞膜よ
り可溶化し粗ソルビトール脱水素酵素液を得た。この粗
酵素液をイオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフ
ィーにチャージし夾雑酵素を分離し、ソルビトール脱水
素酵素酵素液を調整した。 （測定）下記のような試薬を調整し、ソルビトールの測
定を実施した。 酢酸菌細胞膜由来ソルビトール脱水素酵素 ５単位／ｍ
ｌ １−メトキシ−５−フェナゾリウムメチルサルフェイト
２９．５ｍＭ ＭＴＴ ０．６ｍＭ 非イオン性界面活性剤（トリトンＸ−１００） ０．４
％ ＮａＮ3 ９．２ｍＭ ＭｃＩｌｖａｉｎ バッファー ｐＨ４．５ 試 料 各濃度（０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍ
Ｍ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ）ソルビトー
ル水溶液 操 作 試薬２．７ｍｌを試験官にとり、３０℃、３分間予備加
温後、各試料０．３ｍｌを分注し、３０℃で２０分間反
応させ、２０分後の５７０ｎｍの吸光度をソルビトール
０ｍＭを対照に測定した。結果を図１に示す。ソルビト
ール濃度にしたがって、吸光度が直線的に上昇している
ことがわかる。
【００１８】
【発明の効果】本発明によれば、試料中のソルビトール
濃度を正確にしかも簡便に測定することができる。
濃度を正確にしかも簡便に測定することができる。
【図１】ソルビトール濃度と吸光度との関係を示した図
である。
である。
Claims (2)
- 【請求項１】 試料中のソルビトール濃度を測定する際
に、酢酸菌の細胞膜由来のソルビトール脱水素酵素、電
子伝達体及び還元発色性色素の存在下に測定することを
特徴とするソルビトールの測定法。 - 【請求項２】 酢酸菌の細胞膜由来のソルビトール脱水
素酵素、電子伝達体および還元発色性色素を含有するこ
とを特徴とする試料中のソルビトール濃度測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16635791A JPH06189790A (ja) | 1991-06-10 | 1991-06-10 | ソルビトールの測定法およびそのための試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16635791A JPH06189790A (ja) | 1991-06-10 | 1991-06-10 | ソルビトールの測定法およびそのための試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06189790A true JPH06189790A (ja) | 1994-07-12 |
Family
ID=15829891
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16635791A Pending JPH06189790A (ja) | 1991-06-10 | 1991-06-10 | ソルビトールの測定法およびそのための試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06189790A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999020763A1 (fr) * | 1997-10-17 | 1999-04-29 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | D-sorbitol deshydrogenase, genes et utilisation de celle-ci |
-
1991
- 1991-06-10 JP JP16635791A patent/JPH06189790A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999020763A1 (fr) * | 1997-10-17 | 1999-04-29 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | D-sorbitol deshydrogenase, genes et utilisation de celle-ci |
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