JPH0687796B2 - α−アミラーゼ活性測定方法 - Google Patents
α−アミラーゼ活性測定方法Info
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- JPH0687796B2 JPH0687796B2 JP8432488A JP8432488A JPH0687796B2 JP H0687796 B2 JPH0687796 B2 JP H0687796B2 JP 8432488 A JP8432488 A JP 8432488A JP 8432488 A JP8432488 A JP 8432488A JP H0687796 B2 JPH0687796 B2 JP H0687796B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はα−アミラーゼ活性測定方法に係り、特に、α
−アミラーゼ活性を高感度でかつ高精度に測定すること
ができる方法に関する。
−アミラーゼ活性を高感度でかつ高精度に測定すること
ができる方法に関する。
［従来の技術］ 急性すい炎、耳下腺炎等の診断のために、血清や尿中の
α−アミラーゼ活性を測定する手法がある。
α−アミラーゼ活性を測定する手法がある。
α−アミラーゼ活性測定用基質として、従来はでんぷん
が用いられてきたが、精度の点で難点があった。このた
め、でんぷんに代って、近年、マルトペンタオース
（G5）に代表されるマルトオリゴ糖がアミラーゼ活性測
定基質として採用されつつある。即ち、α−アミラーゼ
の共役酵素として、α−グルコシダーゼを用いると、次
の方法によってα−アミラーゼの活性を測定することが
できる。
が用いられてきたが、精度の点で難点があった。このた
め、でんぷんに代って、近年、マルトペンタオース
（G5）に代表されるマルトオリゴ糖がアミラーゼ活性測
定基質として採用されつつある。即ち、α−アミラーゼ
の共役酵素として、α−グルコシダーゼを用いると、次
の方法によってα−アミラーゼの活性を測定することが
できる。
ここで生成したグルコース（G1）は、例えばグルコース
オキシダーゼ／パーオキシダーゼ／色素系又はヘキソキ
ナーゼ／ホスホグルコムターゼ／グルコース−６−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ/NADH系等により定量され、
α−アミラーゼ活性が測定される。
オキシダーゼ／パーオキシダーゼ／色素系又はヘキソキ
ナーゼ／ホスホグルコムターゼ／グルコース−６−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ/NADH系等により定量され、
α−アミラーゼ活性が測定される。
また、最近になって、還元末端のグルコースにアグリゴ
ンとしてパラニトロフェノール等のフェノール系化合物
を導入し、アグリゴンを遊離させてそのスペクトル吸収
を測定することにより、α−アミラーゼ活性を測定する
方法も提案されている（特公昭57-53079）。
ンとしてパラニトロフェノール等のフェノール系化合物
を導入し、アグリゴンを遊離させてそのスペクトル吸収
を測定することにより、α−アミラーゼ活性を測定する
方法も提案されている（特公昭57-53079）。
［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、前述のマルトオリゴ糖をアミラーゼ活性
測定基質として用いる場合には、試料である血清や尿中
に内因性のグルコースやマルトースが存在するため、そ
の影響を受け、測定誤差が生じることになる。このた
め、マルトオリゴ糖を基質として用いる場合には、試料
中のグルコース等を予めヘキソナーゼ等を用いて処理す
る必要があった。
測定基質として用いる場合には、試料である血清や尿中
に内因性のグルコースやマルトースが存在するため、そ
の影響を受け、測定誤差が生じることになる。このた
め、マルトオリゴ糖を基質として用いる場合には、試料
中のグルコース等を予めヘキソナーゼ等を用いて処理す
る必要があった。
一方、特公昭57-53079の方法において、アグリゴンとし
てフェノール系化合物を用いた場合には、遊離した発色
基は試料中に共存する種々の物質によって作用を受け、
吸光度が変動しやすくなり、その結果、測定精度が劣る
場合があった。
てフェノール系化合物を用いた場合には、遊離した発色
基は試料中に共存する種々の物質によって作用を受け、
吸光度が変動しやすくなり、その結果、測定精度が劣る
場合があった。
このように、従来のα−アミラーゼ活性測定方法は、い
ずれも操作性や測定精度等に問題を有するものであっ
た。
ずれも操作性や測定精度等に問題を有するものであっ
た。
本発明者らは、これら従来技術の問題点を解決するべ
く、鋭意研究を行なった結果、内因性のグルコースやマ
ルトースの影響を受けず、かつ、精度の高い吸光度の測
定が可能なα−アミラーゼ活性測定用基質及びそれを用
いたα−アミラーゼ活性測定方法を見出し、先に特許出
願を行なった（特願昭61-277702。以下「先願」とい
う。）。
く、鋭意研究を行なった結果、内因性のグルコースやマ
ルトースの影響を受けず、かつ、精度の高い吸光度の測
定が可能なα−アミラーゼ活性測定用基質及びそれを用
いたα−アミラーゼ活性測定方法を見出し、先に特許出
願を行なった（特願昭61-277702。以下「先願」とい
う。）。
先願の発明は、下記一般式（IV）で表わされるマルトオ
リゴ糖と試料とをグルコシダーゼの共存下に接触させ、
遊離する単糖類又はその誘導体を測定することにより、
試料中のα−アミラーゼ活性を測定することを特徴とす
る。
リゴ糖と試料とをグルコシダーゼの共存下に接触させ、
遊離する単糖類又はその誘導体を測定することにより、
試料中のα−アミラーゼ活性を測定することを特徴とす
る。
Ａ−Gn−Ｂ ……（IV） （式中、Ｂはグルコース以外の単糖類又はその誘導体を
表わし、Ａ、Ｇ、ｎは後掲の一般式（Ｉ）のものと同一
のものを表わす。） 即ち、先願の方法は、具体的には上記一般式（IV）のマ
ルトオリゴ糖から、試料中のα−アミラーゼ、グルコシ
ダーゼの作用により遊離するフルクトース等をマンニト
ールデヒドロゲナーゼやソルビトールデヒドロゲナーゼ
とNADH共存下で反応させてNADの生成量を見るものであ
る。このような先願の方法によりα−アミラーゼ活性を
安定にかつ精度良く測定することが可能となるが、先願
の方法は退色反応を利用するものであり、発色反応によ
るものに比べると感度や精度が若干劣るという難点があ
った。
表わし、Ａ、Ｇ、ｎは後掲の一般式（Ｉ）のものと同一
のものを表わす。） 即ち、先願の方法は、具体的には上記一般式（IV）のマ
ルトオリゴ糖から、試料中のα−アミラーゼ、グルコシ
ダーゼの作用により遊離するフルクトース等をマンニト
ールデヒドロゲナーゼやソルビトールデヒドロゲナーゼ
とNADH共存下で反応させてNADの生成量を見るものであ
る。このような先願の方法によりα−アミラーゼ活性を
安定にかつ精度良く測定することが可能となるが、先願
の方法は退色反応を利用するものであり、発色反応によ
るものに比べると感度や精度が若干劣るという難点があ
った。
本発明は上記先願の問題点を解決し、発色反応により、
容易に、高精度、高感度でかつ安定に、α−アミラーゼ
活性を測定することができる方法を提供することを目的
とする。
容易に、高精度、高感度でかつ安定に、α−アミラーゼ
活性を測定することができる方法を提供することを目的
とする。
［課題を解決するための手段］ 本発明のα−アミラーゼ活性測定方法は、下記一般式
（Ｉ）で表わされるマルトオリゴ糖を含む基質と試料と
をグルコシダーゼの共存下に接触させ、遊離するフルク
トースを更にフルクトースデヒドロゲナーゼと接触させ
ることにより、試料中のα−アミラーゼ活性を発色反応
により測定することを特徴とする。
（Ｉ）で表わされるマルトオリゴ糖を含む基質と試料と
をグルコシダーゼの共存下に接触させ、遊離するフルク
トースを更にフルクトースデヒドロゲナーゼと接触させ
ることにより、試料中のα−アミラーゼ活性を発色反応
により測定することを特徴とする。
Ａ−Gn−Ｆ ……（Ｉ） （式中Ａは、 又は を、Ｆはフルクトースを、Ｇはグルコースを、ｎは３〜
７の整数をそれぞれ表わす。ただし、（II）式又は（II
I）式において、R1〜R4は水素原子、低級アルキル基又
は（CH2）yCOOM（ｙは0.1又は２、Ｍは水素原子又はア
ルカリ金属を表わす。）、を、X1〜X4は酸素原子又はイ
オウ原子をそれぞれ表わす。） 以下、本発明を詳細に説明する。
７の整数をそれぞれ表わす。ただし、（II）式又は（II
I）式において、R1〜R4は水素原子、低級アルキル基又
は（CH2）yCOOM（ｙは0.1又は２、Ｍは水素原子又はア
ルカリ金属を表わす。）、を、X1〜X4は酸素原子又はイ
オウ原子をそれぞれ表わす。） 以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のα−アミラーゼ活性測定方法で、測定用基質と
して用いる前記一般式（Ｉ）で表わされるマルトオリゴ
糖の、非還元末端であるＡは、未置換グルコースでも良
いし、グルコースの４位及び／又は６位を置換したもの
でも良い（即ち、前記一般式（II））。更にグルコース
の４位と６位が一緒になってアルキレン橋を形成してい
るものでも良い（即ち、前記一般式（III））。
して用いる前記一般式（Ｉ）で表わされるマルトオリゴ
糖の、非還元末端であるＡは、未置換グルコースでも良
いし、グルコースの４位及び／又は６位を置換したもの
でも良い（即ち、前記一般式（II））。更にグルコース
の４位と６位が一緒になってアルキレン橋を形成してい
るものでも良い（即ち、前記一般式（III））。
このように、一般式（Ｉ）において、Ａは無修飾（未置
換）及び修飾（置換）されたグルコースを含むものであ
る。Ａが無修飾のグルコースの場合でも、本発明の基質
は従来の基質に比べて、はるかに精度よくα−アミラー
ゼ活性を測定し得るものであるが、下記の理由により修
飾グルコースであることが好ましい。
換）及び修飾（置換）されたグルコースを含むものであ
る。Ａが無修飾のグルコースの場合でも、本発明の基質
は従来の基質に比べて、はるかに精度よくα−アミラー
ゼ活性を測定し得るものであるが、下記の理由により修
飾グルコースであることが好ましい。
即ち、マルトオリゴ糖からなる基質において、非還元末
端がグルコースそのものであると、α−アミラーゼ活性
測定時に使用する共役酵素であるグルコシダーゼが一部
の非還元末端のグルコースを切断し、α−アミラーゼ活
性測定に誤差を与えてしまう場合があるのである。
端がグルコースそのものであると、α−アミラーゼ活性
測定時に使用する共役酵素であるグルコシダーゼが一部
の非還元末端のグルコースを切断し、α−アミラーゼ活
性測定に誤差を与えてしまう場合があるのである。
修飾された非還元末端としては、前記一般式（II）又は
（III）において、下記第１表（ａ）、（ｂ）に示すよ
うな置換基を導入したものが例示される。
（III）において、下記第１表（ａ）、（ｂ）に示すよ
うな置換基を導入したものが例示される。
一般式（Ｉ）において、還元末端となるＦはフルクトー
スである。フルクトースは入手が容易である上に、反応
性等にも優れ、本発明に有効である。
スである。フルクトースは入手が容易である上に、反応
性等にも優れ、本発明に有効である。
また、一般式（Ｉ）において、Ａ−Gnは、具体的にはマ
ルトペンタオース（G5）、マルトオクタノース（G8）等
が挙げられる。これらのうち、G5〜G8は水溶性に優れる
うえに２種のアイソエンザイムの作用を均等に受ける可
能性が高いため、基質として好ましい。
ルトペンタオース（G5）、マルトオクタノース（G8）等
が挙げられる。これらのうち、G5〜G8は水溶性に優れる
うえに２種のアイソエンザイムの作用を均等に受ける可
能性が高いため、基質として好ましい。
本発明のα−アミラーゼ活性測定用基質としては、一般
式（Ｉ）で表わされる化合物が、次の構造式（Ｖ）で表
わされる化合物であることが最も好ましい。
式（Ｉ）で表わされる化合物が、次の構造式（Ｖ）で表
わされる化合物であることが最も好ましい。
以下において、上記構造式（Ｖ）の化合物を、IPG7Fと
略すことがある。
略すことがある。
このような一般式（Ｉ）で示されるマルトオリゴ糖を用
いて、本発明の方法により試料中のα−アミラーゼ活性
を発色反応により測定する方法について以下に説明す
る。
いて、本発明の方法により試料中のα−アミラーゼ活性
を発色反応により測定する方法について以下に説明す
る。
体液中の試料に、基質及び共役酵素としてα−グルコシ
ダーゼを加えると、下記のように反応が進む（なお、以
下においては一般式（Ｉ）の具体例として一般式（Ｖ）
で示されるIPG7Fを用いる）。
ダーゼを加えると、下記のように反応が進む（なお、以
下においては一般式（Ｉ）の具体例として一般式（Ｖ）
で示されるIPG7Fを用いる）。
ここで遊離したフルクトースを、例えば下記又はの
方法により定量する。
方法により定量する。
遊離したフルクトースをフルクトースデヒドロゲナー
ゼ（FDH）、フェナジンメトサルファイト（PMS）及びニ
トロブルーテトラゾリウム（NTB）共存下で反応させる
ことにより、ホルマザンを生成させ、その吸光度の変化
により、フルクトースの量が測定できる。
ゼ（FDH）、フェナジンメトサルファイト（PMS）及びニ
トロブルーテトラゾリウム（NTB）共存下で反応させる
ことにより、ホルマザンを生成させ、その吸光度の変化
により、フルクトースの量が測定できる。
（なお、NTBの他、MTT（３−（4,5−ジメチル−２−チ
アゾリル）−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムブ
ロミド）又はINT（３−（ｐ−ロドフェニル）−２−
（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−2H−テトラゾ
リウムクロライド）を用いることもできる。） 遊離したフルクトースをフルクトースデヒドロゲナー
ゼ（FDH）、フェナジンメトサルファイト（PMS）又はジ
アフォラーゼと４−アミノーアンチピリン（４−AA）及
びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロ
ピル）−トルイジン（EHSPT）、更にパーオキシダーゼ
の共存下で反応させることにより、キノン系色素の変化
により、フルクトースの量が測定できる。
アゾリル）−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムブ
ロミド）又はINT（３−（ｐ−ロドフェニル）−２−
（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−2H−テトラゾ
リウムクロライド）を用いることもできる。） 遊離したフルクトースをフルクトースデヒドロゲナー
ゼ（FDH）、フェナジンメトサルファイト（PMS）又はジ
アフォラーゼと４−アミノーアンチピリン（４−AA）及
びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロ
ピル）−トルイジン（EHSPT）、更にパーオキシダーゼ
の共存下で反応させることにより、キノン系色素の変化
により、フルクトースの量が測定できる。
［作用］ 一般式（Ｉ）で表わされるマルトオリゴ糖は、試料中の
α−アミラーゼ及び共役酵素のα−グルコシダーゼとグ
ルコアミラーゼにより切断されてフルクトースを生じ
る。このフルクトースをフルクトースデヒドロゲナーゼ
で定量することにより、試料中のα−アミラーゼ活性を
発色反応により高感度かつ高精度に測定できる。
α−アミラーゼ及び共役酵素のα−グルコシダーゼとグ
ルコアミラーゼにより切断されてフルクトースを生じ
る。このフルクトースをフルクトースデヒドロゲナーゼ
で定量することにより、試料中のα−アミラーゼ活性を
発色反応により高感度かつ高精度に測定できる。
しかして、上記の方法によれば、 発色物であるホルマザンが水に対する溶解性が低いた
めシャープな染料が可能になる。
めシャープな染料が可能になる。
感度が高いため、少ない時間でしかもシャープな像を
作らせることができる。
作らせることができる。
また、上記の方法によれば、 特殊な装置を必要としない。
高感度に測定が可能なため、使用する検体の量を大幅
に減じることができる。
に減じることができる。
先願の方法に比べ、測定条件の多少のズレがあったと
しても測定値にあまり大きな誤差を与えない。
しても測定値にあまり大きな誤差を与えない。
等の効果が奏される。
［実施例］ 以下、製造例及び実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明する。
説明する。
製造例１ IPG7Fの製造 市販のG729.5gにピリジン140mlと無水酢酸140mlを加
え、室温で48時間反応させることにより、パーアセテー
ト化G751.8gを得た。得られたパーアセテート化G725.0g
をクロロホルム165mlに溶かし、10℃以下で30％HBr−酢
酸と２時間反応させることにより、パーアセテート化G7
ブロマイド24.5gを得た。このパーアセテート化G7ブロ
マイドをベンゼン中、Hg(CN)26.7g、ベンジルアルコー
ル33mlと２時間還元反応させることにより、パーアセテ
ート化G7ベンジルグリコシドを得た。次いで、パーアセ
テート化G7ベンジルグリコシドをメタノール中、ナトリ
ウムメトキシドで室温加水分解することにより、ベンジ
ルグリコシド化G719.9gを得た。
え、室温で48時間反応させることにより、パーアセテー
ト化G751.8gを得た。得られたパーアセテート化G725.0g
をクロロホルム165mlに溶かし、10℃以下で30％HBr−酢
酸と２時間反応させることにより、パーアセテート化G7
ブロマイド24.5gを得た。このパーアセテート化G7ブロ
マイドをベンゼン中、Hg(CN)26.7g、ベンジルアルコー
ル33mlと２時間還元反応させることにより、パーアセテ
ート化G7ベンジルグリコシドを得た。次いで、パーアセ
テート化G7ベンジルグリコシドをメタノール中、ナトリ
ウムメトキシドで室温加水分解することにより、ベンジ
ルグリコシド化G719.9gを得た。
ベンジルグリコシド化G719.9gをDMF中、ベンズアルデヒ
ドジメチルアセタール14.8gとｐ−トルエンスルホン酸
触媒下85〜90℃で４時間反応を行なうことにより、非還
元末端4,6-O−ベンジリデン，ベンジルグリコシド化G7
を得た。
ドジメチルアセタール14.8gとｐ−トルエンスルホン酸
触媒下85〜90℃で４時間反応を行なうことにより、非還
元末端4,6-O−ベンジリデン，ベンジルグリコシド化G7
を得た。
非還元末端4,6-O−ベンジリデン，ベンジルグリコシド
化G7を、ピリジン100ml、無水酢酸100mlと室温で48時間
反応させ、非還元末端4,6−Ｏ−ベンジリデン，ベンジ
ルグリコシド化G7パーアセテート26.2gを得た。非還元
末端4,6-O−ベンジリデン，ベンジルグリコシド化G7パ
ーアセテート26.2gを、ジオキサン370ml中で、KOH180g
とともに塩化ベンジル180mlと105〜110℃で６時間反応
させることにより、非還元末端4,6-O−ベンジリデンパ
ーベンジル化G7を得た。更に、非還元末端4,6-O−ベン
ジリデンパーベンジル化G7を、アセトン750ml、1N-HC
160ml中、湯浴上で還流させ、ベンジリデンをはずすこ
とにより、非還元末端4,6−OHパーベンジル化G77.6gを
得た。
化G7を、ピリジン100ml、無水酢酸100mlと室温で48時間
反応させ、非還元末端4,6−Ｏ−ベンジリデン，ベンジ
ルグリコシド化G7パーアセテート26.2gを得た。非還元
末端4,6-O−ベンジリデン，ベンジルグリコシド化G7パ
ーアセテート26.2gを、ジオキサン370ml中で、KOH180g
とともに塩化ベンジル180mlと105〜110℃で６時間反応
させることにより、非還元末端4,6-O−ベンジリデンパ
ーベンジル化G7を得た。更に、非還元末端4,6-O−ベン
ジリデンパーベンジル化G7を、アセトン750ml、1N-HC
160ml中、湯浴上で還流させ、ベンジリデンをはずすこ
とにより、非還元末端4,6−OHパーベンジル化G77.6gを
得た。
この非還元末端4,6−OHパーベンジル化G77.6gにBaO23.1
g、Ba(OH)2・8H2O9.4gとともにヨウ化メチル84mlをDMF24
0ml中で光遮断下、48時間室温にて反応させ、非還元末
端4,6-O−メチルパーベンジル化G7を得、非還元末端4,6
-O−メチルパーベンジル化G7を、メタノール／酢酸エチ
ル中でPdによる室温、常圧接触還元を行なうことによ
り、非還元末端4,6−ジ−Ｏ−メチル化G71.2gを得た。
g、Ba(OH)2・8H2O9.4gとともにヨウ化メチル84mlをDMF24
0ml中で光遮断下、48時間室温にて反応させ、非還元末
端4,6-O−メチルパーベンジル化G7を得、非還元末端4,6
-O−メチルパーベンジル化G7を、メタノール／酢酸エチ
ル中でPdによる室温、常圧接触還元を行なうことによ
り、非還元末端4,6−ジ−Ｏ−メチル化G71.2gを得た。
次に、この非還元末端4,6−ジ−Ｏ−メチル化G7を10％w
/vの溶液とし、これにしょ糖液４％w/vを等量混合し、
バチルス・オーベンシス起源のサイクロデキストリング
ルカノトランスフェラーゼを添加し、37℃、pH6.0の条
件下で16時間静置し、反応させた。16時間後、この反応
液をカラムクロマトグラフィ法で精製したところ、IPG7
F0.12gが得られた。
/vの溶液とし、これにしょ糖液４％w/vを等量混合し、
バチルス・オーベンシス起源のサイクロデキストリング
ルカノトランスフェラーゼを添加し、37℃、pH6.0の条
件下で16時間静置し、反応させた。16時間後、この反応
液をカラムクロマトグラフィ法で精製したところ、IPG7
F0.12gが得られた。
実施例１ α−アミラーゼ活性測定例 下記の各試薬を下記濃度となるように、50mM−PIPESバ
ッファー（pH7.0）に溶解し、試薬Ｉを調整した。
ッファー（pH7.0）に溶解し、試薬Ｉを調整した。
試薬Ｉ 製造例１で得られた基質（IPG7F） :1.03mM/l NaCl ： 1.03mM/l NaCl2 ： 0.1mM/l グルコアミラーゼ ： 25.75U/ml α−グルコシダーゼ： 164.8U/ml 別に、下記の各試薬を下記濃度となるように200mM−Mac
Ilvaineバッファー（pH4.5）にて溶解し、試薬IIを調整
した。
Ilvaineバッファー（pH4.5）にて溶解し、試薬IIを調整
した。
試薬II フルクトースデヒドロゲナーゼ（FDH）： 75 U/ml フェナジンメトサルファイト（PMS）： 0.3 mM/l ニトロブルテトラゾリウム（NTB）： 0.75mM/l 試薬I:970μｌに、α−アミラーゼ活性が100,200,300及
び400mU/mlをそれぞれ含む検体血清30μｌを加え、37℃
で10分間正確に加温した。次に、試薬II:2000μｌを加
え、37℃で５分間正確に加温後、660nmで吸光度を測定
した。
び400mU/mlをそれぞれ含む検体血清30μｌを加え、37℃
で10分間正確に加温した。次に、試薬II:2000μｌを加
え、37℃で５分間正確に加温後、660nmで吸光度を測定
した。
その結果、第１図に示す通り、いずれの濃度でも良好な
直線関係が得られていることから、本発明の方法によれ
ば、α−アミラーゼ活性の安定かつ高精度な測定が可能
であることが認められる。
直線関係が得られていることから、本発明の方法によれ
ば、α−アミラーゼ活性の安定かつ高精度な測定が可能
であることが認められる。
実施例２ α−アミラーゼ活性測定例 下記の各試薬を下記濃度となるように100mM−MacIlavai
neバッファー（pH4.5）で溶解し、試薬IIIを調整した。
neバッファー（pH4.5）で溶解し、試薬IIIを調整した。
試薬III フルクトースデヒドロゲナーゼ（FDH） :100 U/ml １−メトキシ−フェナジンメトサルファイト ： 0.4mM/l ４−アミノアンチピリン（４−AA） ： 10 mM/l 別に、下記試薬を下記濃度となるように、1.5％ドデシ
ル硫酸ナトリウム（SDS）を含む200mM−TESバッファー
（pH7.5）にて溶解し、試薬IVを調整した。
ル硫酸ナトリウム（SDS）を含む200mM−TESバッファー
（pH7.5）にて溶解し、試薬IVを調整した。
パーオキシダーゼ :6 U/ml Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−トルイジン（EHSPT） :7.5mM/l 実施例１で調整した試薬1:970μｌに、α−アミラーゼ
活性が100,200,300および400mU/mlをそれぞれ含む検体
血清30μｌを加え、37℃で10分間正確に加温した。次
に、試薬III:1000μｌを加え、37℃で５分間正確に加温
した。更に、試薬IV:1000μｌを加えて37℃で５分間正
確に加温後、550nmで吸光度を測定した。
ル）−トルイジン（EHSPT） :7.5mM/l 実施例１で調整した試薬1:970μｌに、α−アミラーゼ
活性が100,200,300および400mU/mlをそれぞれ含む検体
血清30μｌを加え、37℃で10分間正確に加温した。次
に、試薬III:1000μｌを加え、37℃で５分間正確に加温
した。更に、試薬IV:1000μｌを加えて37℃で５分間正
確に加温後、550nmで吸光度を測定した。
その結果、第２図に示す通り、いずれの濃度でも良好な
直線関係が得られていることから、本発明の方法によれ
ば、α−アミラーゼ活性の安定かつ高精度な測定が可能
であることが認められる。
直線関係が得られていることから、本発明の方法によれ
ば、α−アミラーゼ活性の安定かつ高精度な測定が可能
であることが認められる。
［発明の効果］ 以上詳述した通り、本発明のα−アミラーゼ測定方法に
おいては、測定用基質として、一般式（Ｉ）に示すマル
トオリゴ糖を含むものを用いる。このマルトオリゴ糖
は、試料中のα−アミラーゼ及び共役酵素のグルコシダ
ーゼにより切断されてフルクトースを生じ、これにより
定量が可能となるが、その際、糖の還元末端にフルクト
ースを転位させてあるので、試料中に含まれる内因性グ
ルコースやマルトース等の影響を受けることがない。こ
のため、このような測定用基質を用いる本発明のα−ア
ミラーゼ活性測定方法によれば、α−アミラーゼ活性の
安定かつ高精度な測定を容易に行なうことが可能とされ
る。
おいては、測定用基質として、一般式（Ｉ）に示すマル
トオリゴ糖を含むものを用いる。このマルトオリゴ糖
は、試料中のα−アミラーゼ及び共役酵素のグルコシダ
ーゼにより切断されてフルクトースを生じ、これにより
定量が可能となるが、その際、糖の還元末端にフルクト
ースを転位させてあるので、試料中に含まれる内因性グ
ルコースやマルトース等の影響を受けることがない。こ
のため、このような測定用基質を用いる本発明のα−ア
ミラーゼ活性測定方法によれば、α−アミラーゼ活性の
安定かつ高精度な測定を容易に行なうことが可能とされ
る。
しかも、遊離したフルクトースをフルクトースデヒドロ
ゲナーゼと接触させることにより、発色反応にて、高感
度、高精度に、かつ効率的に測定を行なうことが可能と
される。
ゲナーゼと接触させることにより、発色反応にて、高感
度、高精度に、かつ効率的に測定を行なうことが可能と
される。
第１図及び第２図はそれぞれ実施例１及び実施例２で得
られた吸光度の測定結果を示すグラフである。
られた吸光度の測定結果を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 織田 信博 東京都新宿区西新宿３丁目４番７号 栗田 工業株式会社内 (72)発明者 佐藤 茂 東京都新宿区西新宿３丁目４番７号 栗田 工業株式会社内
Claims (1)
- 【請求項１】下記一般式（Ｉ）で表わされるマルトオリ
ゴ糖を含む基質と試料とをグルコシダーゼの共存下に接
触させ、遊離するフルクトースを更にフルクトースデヒ
ドロゲナーゼと接触させることにより、試料中のα−ア
ミラーゼ活性を発色反応により測定することを特徴とす
るα−アミラーゼ活性測定方法。 Ａ−Gn−Ｆ ……（Ｉ） （式中Ａは、 又は を、Ｆはフルクトースを、Ｇはグルコースを、ｎは３〜
７の整数をそれぞれ表わす。ただし、（II）式又は（II
I）式において、R1〜R4は水素原子、低級アルキル基又
は（CH2）yCOOM（ｙは０、１又は２、Ｍは水素原子又は
アルカリ金属を表わす。）、を、X1〜X4は酸素原子又は
イオウ原子をそれぞれ表わす。）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8432488A JPH0687796B2 (ja) | 1988-04-06 | 1988-04-06 | α−アミラーゼ活性測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8432488A JPH0687796B2 (ja) | 1988-04-06 | 1988-04-06 | α−アミラーゼ活性測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01256399A JPH01256399A (ja) | 1989-10-12 |
| JPH0687796B2 true JPH0687796B2 (ja) | 1994-11-09 |
Family
ID=13827332
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8432488A Expired - Fee Related JPH0687796B2 (ja) | 1988-04-06 | 1988-04-06 | α−アミラーゼ活性測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0687796B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5043436A (en) * | 1986-11-20 | 1991-08-27 | Kurita Water Ind., Ltd. | Substrate for measurement of alpha-amylase activity |
| JP2002119298A (ja) * | 2000-10-16 | 2002-04-23 | Toyobo Co Ltd | イヌリン測定方法 |
| JP4775268B2 (ja) * | 2007-01-10 | 2011-09-21 | 栗田工業株式会社 | 澱粉を用いる紙の製造方法 |
-
1988
- 1988-04-06 JP JP8432488A patent/JPH0687796B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01256399A (ja) | 1989-10-12 |
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