JPH047199B2 - - Google Patents
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Description
発明の利用分野
本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド依存性コレステロールデヒドロゲナーゼ
（NAD−CDH）又はニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドリン酸依存性コレステロールデヒド
ロゲナーゼ（以下「NADP−CDH」という。）を
用いてコレステロールを動力学的に測定するコレ
ステロールの定量法を提供するところの臨床検査
分野への利用に関する。 従来技術 従来、酵素によるコレステロール定量法とし
て、遊離又は結合型コレステロールを測定するに
際して、コレステロールオキシダーゼを単独又は
コレステロールエステラーゼとともに使用する方
法が広く用いられている。しかしコレステロール
オキシダーゼを用いる方法は発色系に導くために
パーオキシダーゼ等が必要であり、操作が繁雑で
あること、さらに血中のビリルビン、アスコルビ
ン酸等の影響を受け誤差を生じ易いこと等の欠点
を有している。 本発明者の一人は、これらの欠点を解消する目
的で、先にNAD−CDH又はNADP−CDHを用
いるコレステロールの定量法を開発した（特開昭
58−89200号）。この方法は、操作が簡単であり、
かつ血中のビリルビン、アスコルビン酸等の影響
による誤差を生じない優れた方法ではあるが、ま
だ改良すべき問題点が存在していた。臨床検査の
分野においては、多量のサンプルを短時間にかつ
正確に測定するため、或いは日常使用する試薬、
特に酵素の節約を図るために、初速度測定法或い
はレイトアツセイと称する動力学的コレステロー
ルの定量法が求められるようになつた。 そこで、最近コレステロールオキシダーゼを用
いるコレステロールの動力学的測定法が開発され
た（特開昭58−18080号）。しかし、この方法もコ
レステロールオキシダーゼを用いているので前記
した欠点とは依然として未解決のままであつた。 解決すべき問題点 特開昭58−89200号方法は、いわゆる終点測定
法（エンドポイント法ともいう）を行うには優れ
た方法であるが、動力学的測定法には、このまま
では応用不可能であつた。 そこで本発明者らは、特開昭58−89200号の方
法を改良しNAD−CDH又はNADP−CDHを用
いる動力学的コレステロールの定量法を可能なら
しめるために鋭意検討した。 問題を解決するための手段 ミカエリス・メンテン（Michaelis−Menten）
の理論によれば、酵素のミカエリス定数が最大基
質濃度より著しく大である場合、酵素反応は広い
基質濃度範囲で直線性を示すことが知られてい
る。 特開昭58−89200号に開示された菌株の酵素、
即ちノカルジアspNo.Ch2−１（Nocardia sp No.
Ch2−１）FERM−ＰNo.6217、アルカリゲネス
spNo.４（Alcaligenes sp No.４）FERM−ＰNo.
6216、及びプロテウス・バルガリスIAM1025
（Proteusvulgaris IAM 1025）の産生するNAD
−CDH又はNADP−CDHはいずれもそのKm値
が10-4M／の値であり、このままではKm値が
小さすぎるため、血中コレステロールの定量に必
要な500mg／dl又はそれ以上の濃度のコレステロ
ールの動力学的測定に使用することができなかつ
た。そこで本発明者らは、人工的な手段でNAD
−CDH又はNADP−CDHのKm値を上昇させる
ことを検討した。コレステロールの酵素法による
測定の際に界面活性剤を添加し、使用する酵素を
活性化することは公知である。例えば特開昭58−
89200号においては反応液中に0.27％のトリトン
Ｘ−100が添加されており、特公昭58−18080号で
は１〜10ｇ／（反応液中0.1〜１％）の非イオ
ン系界面活性剤及び付加的に０〜15mM／のコ
ール酸グループ界面活性剤が添加されている。し
かし、この程度の添加では、本発明者らが目的と
したNAD−CDH又はNADP−CDHのKm値のみ
かけの上昇には到底つながらなかつたが、たまた
ま界面活性剤の添加量を通常使用される以上添加
したところ、添加量に比例してNAD−CDH又は
NADP−CDHのKm値が著しく上昇することが
判明した。本発明はこの知見に基づいて完成され
たものである。 作 用 本発明は、NAD−CDH又はNADP−CDHを
用いるコレステロールの終点測定法を、単に酵素
反応時に高濃度の界面活性剤を添加するという簡
単な操作のみで、該測定を動力学的に行うことを
可能ならしめるとともに、その結果として、使用
するNAD−CDH又はNADP−CDHの著しい節
約を生じせしめたものである。 本発明に使用する界面活性剤の種類としては、
ポリオキシエチレン（９、10）ｐ−ｔ−オクチル
フエニルエーテル（商品名：トリトンＸ−100、
片山化学社製品）、ポリオキシエチレン（20）セ
チルエーテル（商品名：Brij58、花王アトラス社
製品）ポリオキシエチレン（23）ドデシルエーテ
ル（商品名：Brij35、花王アトラス社製品）、ポ
リオキシエチレン（10）ラウリルエーテル（シグ
マ社製品）、ポリオキシエチレン（10）セチルエ
ーテル（商品名：Brij56、花王アトラス社製品）、
ポリオキシエチレン（14）ステアリルエーテル
（商品名：エマルゲン320P、花王アトラス社製
品）、ポリオキシエチレン（10）オレイルエーテ
ル（商品名：Brij96、花王アトラス社製品）、ポ
リオキシエチレン（29）オレイルエーテル（商品
名：Brij98、花王アトラス社製品）、ポリオキシ
エチレン（８〜85）Ｐ−ノニルフエニルエーテル
（商品名：エマルゲン903、花王アトラス社製品）、
第２級直鎖アルコールエトキシレート（商品名：
アデカトールSO80、商品名：アデカトール
SO135、商品名：アデカトールLG295−Ｓ、いず
れも旭電化工業社製品）、ノニルフエノールエト
キシレート（商品名：アデカトールNP1100、商
品名：アデカトールNP−700、いずれも旭電化
工業社製品）等の非イオン性界面活性剤があげら
れるが、他の界面活性剤例えばコール酸ソーダを
これら非イオン性界面活性剤と併用して使用する
ことも可能である。 界面活性剤の添加濃度としては、１〜10ｇ／dl
（即ち反応液中１〜10％）が好適である。下限を
１ｇ／dlとしたのは生じた還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（以下「NADH」とい
う。）又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドリン酸（以下「NADPH」という。）に
発色試薬を加え比色定量する場合、測定感度がよ
く、１ｇ／dlの添加でも十分動力学的測定が可能
となるからである。上限を10ｇ／dlとしたのは、
それ以上界面活性剤を添加すると反応剤の粘性が
増し、酵素反応の阻害が大きくなるためである。 本発明はNAD−CDH又はNADP−CDHを使
用し、かつ高濃度の界面活性剤の添加下にコレス
テロールの測定を動力学的に実施するコレステロ
ールの定量法である。酵素反応は次式で示され
る。（なおNADはニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドの略であり、NADPはニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸の略である。） コレステロール＋NAD又はNADP NAD−CDH又はNADP−CDH ――――――――――――――――――→ コレステノン ＋NADH又はNADPH 測定はあらかじめ決めた時間範囲内に少なくと
も２回実施するのがよい。測定時のPHはNAD−
CDH又はNADP−CDHの活性を損なわない全PH
範囲で可能であるが、好ましくはPH６〜10で行う
のがよい。反応によつて生じたNADH又は
NADPHはそのまま紫外部吸収を測定するか又
はインドニトロテトラゾリウムバイオレツト
（INT）、ニトロテトラゾリウムブルー（NTB）
等の発色試薬を用いて比色測定するかいずれを用
いてもよい。但し比色測定の場合、反応時に添加
する界面活性剤の量を少なくできる効果がある。 以下に本発明を試験例、実施例にてより具体的
に説明する。 なお、試験例及び実施例で使用したNAD−
CDH又はNADP−CDHの活性測定法を次に記
す。NAD−CDH又はNADP−CDHの活性測定
法 コレステロールとNAD又はNADPを基質とし
て反応した場合のNADH又はNADPHの生成量
を、340nｍにおける吸光度の増加として、分光
光度計で測定し算出する。即ち、0.1Mトリス塩
酸緩衝液（PH8.6）2.65ml、28nMNAD溶液0.1ml、
１％コレステロール溶液0.05ml及びNAD−CDH
又はNADP−CDH水溶液0.05mlを混合し、30℃
で反応させ、反応開始後１分間の340nｍにおけ
る吸光度の増加を測定する。 対照として上記組成でコレステロールの代わり
に水を用い同様の操作を行い、対照液の340nｍ
における吸光度の増加を試験液のそれから差し引
いて得られた値からNADH又はNADPHの生産
量を求め、これにより試料中のNAD−CDH又は
NADP−CDH活性を算出する。 酵素活性の表示は、PH8.6、30℃の条件下で１
分間に1μmoleのNADH又はNADPHを生成する
に要する酵素量を１単位とした。 試験例 １ 界面活性剤の添加量とNAD−CDH又はNADP
−CDHのKm値の上昇との関係を調べた。 反応試液(a) （組成） NAD−CDH又はNADP−CDH（特開昭58−
89200号に準じて調製） 10U／dl β−NAD（オリエンタル酵母社製品） 0.2ｇ／dl トリトンＸ−100（片山化学社製品） 0.4ｇ／dl トリシン緩衝液（PH8.5） 0.1mol／dl 反応試液(b)及び(c) 反応試液(a)の組成のうちのトリトンＸ−100の
濃度0.4ｇ／dlをそれぞれ3.0ｇ／dl及び10.0ｇ／
dlに変えたものを反応試液(b)及び(c)とする。 上記の各反応試液ａ〜ｃの各１mlを石英セルに
それぞれ取り、30℃に加温したのち、200mg／dl
のコレステロール溶液20μを各石英セルに加え
て反応せしめ経時的に各反応液について340nｍ
の吸光度を求め、ラインウエーバー・バーク
（Line−weaver−Burk）の直線式からそれぞれ
のKm値を求めた。界面活性剤トリトンＸ−100
の添加量とKm値の関係を表１に示す。
チド依存性コレステロールデヒドロゲナーゼ
（NAD−CDH）又はニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドリン酸依存性コレステロールデヒド
ロゲナーゼ（以下「NADP−CDH」という。）を
用いてコレステロールを動力学的に測定するコレ
ステロールの定量法を提供するところの臨床検査
分野への利用に関する。 従来技術 従来、酵素によるコレステロール定量法とし
て、遊離又は結合型コレステロールを測定するに
際して、コレステロールオキシダーゼを単独又は
コレステロールエステラーゼとともに使用する方
法が広く用いられている。しかしコレステロール
オキシダーゼを用いる方法は発色系に導くために
パーオキシダーゼ等が必要であり、操作が繁雑で
あること、さらに血中のビリルビン、アスコルビ
ン酸等の影響を受け誤差を生じ易いこと等の欠点
を有している。 本発明者の一人は、これらの欠点を解消する目
的で、先にNAD−CDH又はNADP−CDHを用
いるコレステロールの定量法を開発した（特開昭
58−89200号）。この方法は、操作が簡単であり、
かつ血中のビリルビン、アスコルビン酸等の影響
による誤差を生じない優れた方法ではあるが、ま
だ改良すべき問題点が存在していた。臨床検査の
分野においては、多量のサンプルを短時間にかつ
正確に測定するため、或いは日常使用する試薬、
特に酵素の節約を図るために、初速度測定法或い
はレイトアツセイと称する動力学的コレステロー
ルの定量法が求められるようになつた。 そこで、最近コレステロールオキシダーゼを用
いるコレステロールの動力学的測定法が開発され
た（特開昭58−18080号）。しかし、この方法もコ
レステロールオキシダーゼを用いているので前記
した欠点とは依然として未解決のままであつた。 解決すべき問題点 特開昭58−89200号方法は、いわゆる終点測定
法（エンドポイント法ともいう）を行うには優れ
た方法であるが、動力学的測定法には、このまま
では応用不可能であつた。 そこで本発明者らは、特開昭58−89200号の方
法を改良しNAD−CDH又はNADP−CDHを用
いる動力学的コレステロールの定量法を可能なら
しめるために鋭意検討した。 問題を解決するための手段 ミカエリス・メンテン（Michaelis−Menten）
の理論によれば、酵素のミカエリス定数が最大基
質濃度より著しく大である場合、酵素反応は広い
基質濃度範囲で直線性を示すことが知られてい
る。 特開昭58−89200号に開示された菌株の酵素、
即ちノカルジアspNo.Ch2−１（Nocardia sp No.
Ch2−１）FERM−ＰNo.6217、アルカリゲネス
spNo.４（Alcaligenes sp No.４）FERM−ＰNo.
6216、及びプロテウス・バルガリスIAM1025
（Proteusvulgaris IAM 1025）の産生するNAD
−CDH又はNADP−CDHはいずれもそのKm値
が10-4M／の値であり、このままではKm値が
小さすぎるため、血中コレステロールの定量に必
要な500mg／dl又はそれ以上の濃度のコレステロ
ールの動力学的測定に使用することができなかつ
た。そこで本発明者らは、人工的な手段でNAD
−CDH又はNADP−CDHのKm値を上昇させる
ことを検討した。コレステロールの酵素法による
測定の際に界面活性剤を添加し、使用する酵素を
活性化することは公知である。例えば特開昭58−
89200号においては反応液中に0.27％のトリトン
Ｘ−100が添加されており、特公昭58−18080号で
は１〜10ｇ／（反応液中0.1〜１％）の非イオ
ン系界面活性剤及び付加的に０〜15mM／のコ
ール酸グループ界面活性剤が添加されている。し
かし、この程度の添加では、本発明者らが目的と
したNAD−CDH又はNADP−CDHのKm値のみ
かけの上昇には到底つながらなかつたが、たまた
ま界面活性剤の添加量を通常使用される以上添加
したところ、添加量に比例してNAD−CDH又は
NADP−CDHのKm値が著しく上昇することが
判明した。本発明はこの知見に基づいて完成され
たものである。 作 用 本発明は、NAD−CDH又はNADP−CDHを
用いるコレステロールの終点測定法を、単に酵素
反応時に高濃度の界面活性剤を添加するという簡
単な操作のみで、該測定を動力学的に行うことを
可能ならしめるとともに、その結果として、使用
するNAD−CDH又はNADP−CDHの著しい節
約を生じせしめたものである。 本発明に使用する界面活性剤の種類としては、
ポリオキシエチレン（９、10）ｐ−ｔ−オクチル
フエニルエーテル（商品名：トリトンＸ−100、
片山化学社製品）、ポリオキシエチレン（20）セ
チルエーテル（商品名：Brij58、花王アトラス社
製品）ポリオキシエチレン（23）ドデシルエーテ
ル（商品名：Brij35、花王アトラス社製品）、ポ
リオキシエチレン（10）ラウリルエーテル（シグ
マ社製品）、ポリオキシエチレン（10）セチルエ
ーテル（商品名：Brij56、花王アトラス社製品）、
ポリオキシエチレン（14）ステアリルエーテル
（商品名：エマルゲン320P、花王アトラス社製
品）、ポリオキシエチレン（10）オレイルエーテ
ル（商品名：Brij96、花王アトラス社製品）、ポ
リオキシエチレン（29）オレイルエーテル（商品
名：Brij98、花王アトラス社製品）、ポリオキシ
エチレン（８〜85）Ｐ−ノニルフエニルエーテル
（商品名：エマルゲン903、花王アトラス社製品）、
第２級直鎖アルコールエトキシレート（商品名：
アデカトールSO80、商品名：アデカトール
SO135、商品名：アデカトールLG295−Ｓ、いず
れも旭電化工業社製品）、ノニルフエノールエト
キシレート（商品名：アデカトールNP1100、商
品名：アデカトールNP−700、いずれも旭電化
工業社製品）等の非イオン性界面活性剤があげら
れるが、他の界面活性剤例えばコール酸ソーダを
これら非イオン性界面活性剤と併用して使用する
ことも可能である。 界面活性剤の添加濃度としては、１〜10ｇ／dl
（即ち反応液中１〜10％）が好適である。下限を
１ｇ／dlとしたのは生じた還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（以下「NADH」とい
う。）又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドリン酸（以下「NADPH」という。）に
発色試薬を加え比色定量する場合、測定感度がよ
く、１ｇ／dlの添加でも十分動力学的測定が可能
となるからである。上限を10ｇ／dlとしたのは、
それ以上界面活性剤を添加すると反応剤の粘性が
増し、酵素反応の阻害が大きくなるためである。 本発明はNAD−CDH又はNADP−CDHを使
用し、かつ高濃度の界面活性剤の添加下にコレス
テロールの測定を動力学的に実施するコレステロ
ールの定量法である。酵素反応は次式で示され
る。（なおNADはニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドの略であり、NADPはニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸の略である。） コレステロール＋NAD又はNADP NAD−CDH又はNADP−CDH ――――――――――――――――――→ コレステノン ＋NADH又はNADPH 測定はあらかじめ決めた時間範囲内に少なくと
も２回実施するのがよい。測定時のPHはNAD−
CDH又はNADP−CDHの活性を損なわない全PH
範囲で可能であるが、好ましくはPH６〜10で行う
のがよい。反応によつて生じたNADH又は
NADPHはそのまま紫外部吸収を測定するか又
はインドニトロテトラゾリウムバイオレツト
（INT）、ニトロテトラゾリウムブルー（NTB）
等の発色試薬を用いて比色測定するかいずれを用
いてもよい。但し比色測定の場合、反応時に添加
する界面活性剤の量を少なくできる効果がある。 以下に本発明を試験例、実施例にてより具体的
に説明する。 なお、試験例及び実施例で使用したNAD−
CDH又はNADP−CDHの活性測定法を次に記
す。NAD−CDH又はNADP−CDHの活性測定
法 コレステロールとNAD又はNADPを基質とし
て反応した場合のNADH又はNADPHの生成量
を、340nｍにおける吸光度の増加として、分光
光度計で測定し算出する。即ち、0.1Mトリス塩
酸緩衝液（PH8.6）2.65ml、28nMNAD溶液0.1ml、
１％コレステロール溶液0.05ml及びNAD−CDH
又はNADP−CDH水溶液0.05mlを混合し、30℃
で反応させ、反応開始後１分間の340nｍにおけ
る吸光度の増加を測定する。 対照として上記組成でコレステロールの代わり
に水を用い同様の操作を行い、対照液の340nｍ
における吸光度の増加を試験液のそれから差し引
いて得られた値からNADH又はNADPHの生産
量を求め、これにより試料中のNAD−CDH又は
NADP−CDH活性を算出する。 酵素活性の表示は、PH8.6、30℃の条件下で１
分間に1μmoleのNADH又はNADPHを生成する
に要する酵素量を１単位とした。 試験例 １ 界面活性剤の添加量とNAD−CDH又はNADP
−CDHのKm値の上昇との関係を調べた。 反応試液(a) （組成） NAD−CDH又はNADP−CDH（特開昭58−
89200号に準じて調製） 10U／dl β−NAD（オリエンタル酵母社製品） 0.2ｇ／dl トリトンＸ−100（片山化学社製品） 0.4ｇ／dl トリシン緩衝液（PH8.5） 0.1mol／dl 反応試液(b)及び(c) 反応試液(a)の組成のうちのトリトンＸ−100の
濃度0.4ｇ／dlをそれぞれ3.0ｇ／dl及び10.0ｇ／
dlに変えたものを反応試液(b)及び(c)とする。 上記の各反応試液ａ〜ｃの各１mlを石英セルに
それぞれ取り、30℃に加温したのち、200mg／dl
のコレステロール溶液20μを各石英セルに加え
て反応せしめ経時的に各反応液について340nｍ
の吸光度を求め、ラインウエーバー・バーク
（Line−weaver−Burk）の直線式からそれぞれ
のKm値を求めた。界面活性剤トリトンＸ−100
の添加量とKm値の関係を表１に示す。
【表】
表１より明らかなように、トリトンＸ−100の
添加量が増加するにつれてNAD−CDH又は
NADP−CDHのKm値も上昇することがわかる。 試験例 ２ 高濃度界面活性剤を添加した場合及び普通に使
われる量の界面活性剤を添加した場合のそれぞれ
において基質の各濃度における直線性を調べた。 反応試液 （組成） NAD−CDH又はNADP−CDH（特開昭58−
89200号に準じて調整） 1.0U／dl β−NAD（オリエンタル酵母社製品） 0.2ｇ／dl トリトンＸ−100（片山化学社製品） ５ｇ／dl トリシン緩衝液（PH8.5） 0.1mol／dl 上記組成の反応試液１mlを各石英セルに取り、
30℃に加温後、各石英セルに200、400、600、800
mg／dlの各濃度のコレステロール溶液20μを加
えて反応し、反応１分、２分後の各反応液の
340nｍにおける吸光度の増加を測定した。さら
に反応試液のうちトリトンＸ−100の濃度を0.4
ｇ／dl及び1.0ｇ／dlにそれぞれ変えて、全く同
じ操作を行い比較した。結果は第１図に示され
る。第１図より明らかのように1.0ｇ／dl及び５
ｇ／dlの界面活性剤の高濃度添加によつてコレス
テロール濃度が少なくとも600mg／dlまでは直線
性が得られることがわかつた。一方通常使用され
ている界面活性剤の濃度即ち0.4ｇ／dlにおいて
は、せいぜい200mg／dlまでの直線性しか得られ
なかつた。 実施例 １ 反応試液 （組成） コレステロールエステラーゼ（天野製薬社製品）
50U／dl β−NAD（オリエンタル酵母社製品） 0.2ｇ／dl トリトンＸ−100（片山化学社製品） ５ｇ／dl トリシン緩衝液（PH8.5） 0.1mol／dl 上記組成の反応試液１ml及び各種血清（コレス
テロール含量150mg／dl、300mg／dl、780mg／dl
及び980mg／dl）の20μをそれぞれ石英セルに
取り30℃で２分間加温後NAD−CDH又はNADP
−CDH1.0U／mlを0.05ml加え、反応開始し、１
分後及び２分後における各反応液について340n
ｍの吸光度を測定した。その結果は第２図中のａ
に示される。この結果から明らかのようにコレス
テロール濃度1000mg／dlまで直線性が得られるこ
とが分る。 実施例 ２ 実施例１に記載した反応試液中、界面活性剤の
トリトンＸ−100に変えてアデカトールSO135（旭
電化工業社製品）を用いる以外は実施例１と同様
に操作し測定した。 その結果は第２図中のｂに示される。基質濃度
1000mg／dlまで直線性を示した。 実施例 ３ 反応試液 （組成） コレステロールエステラーゼ（天野製薬社製品）
50U／dl ジアホラーゼ（天野製薬社製品） 100U／dl β−NAD（オリエンタル酵母社製品） 0.2ｇ／dl ニトロテトラゾリウムブルー（同仁化学社製品）
0.001ｇ／dl トリトンＸ−100（片山化学社製品） ２ｇ／dl トリシン緩衝液（PH7.5） 0.1mol／dl 上記反応試液１ml及び各種血清（コレステロー
ル含量274mg／dl、547mg／dl、821mg／dl及び
1095mg／dlからなる。）の20μをそれぞれ石英
セルに取り30℃、２分間加温後、各々にNAD−
CDH又はNADP−CDH0.5U／mlを0.05mlずつ加
え、１分後、２分後における反応液560nｍの吸
光度を測定した。その結果、第３図中のｃに示さ
れるように基質コレステロール濃度1000mg／dlま
で直線性が得られた。 実施例 ４ 実施例３に記載された反応試液中トリトンＸ−
100をアデカトールNP700（旭電化工業社製品）
に変えて同様に操作した。その結果第３図中ｄに
示されるように基質コレステロール濃度1000mg／
dlまで直線性が得られた。 実施例 ５ 未知コレステロール含量の各種血清試料を用
い、本発明の実施例１（紫外部測定）及び実施例
３（比色測定）の方法に準じてそれら血清中コレ
ステロール含量を測定する（実施例１に準ずる方
法を本発明とし、実施例３に準ずる方法を本発
明とする。）とともに、市販のコレステロール
測定用キツトによる測定結果とも比較した。その
結果は表２に示されるようにいずれの方法もよく
一致した。 なお市販コレステロール測定キツトとしてコレ
ステロールＣテストワコー（和光純薬工業社製
品）を用いた。
添加量が増加するにつれてNAD−CDH又は
NADP−CDHのKm値も上昇することがわかる。 試験例 ２ 高濃度界面活性剤を添加した場合及び普通に使
われる量の界面活性剤を添加した場合のそれぞれ
において基質の各濃度における直線性を調べた。 反応試液 （組成） NAD−CDH又はNADP−CDH（特開昭58−
89200号に準じて調整） 1.0U／dl β−NAD（オリエンタル酵母社製品） 0.2ｇ／dl トリトンＸ−100（片山化学社製品） ５ｇ／dl トリシン緩衝液（PH8.5） 0.1mol／dl 上記組成の反応試液１mlを各石英セルに取り、
30℃に加温後、各石英セルに200、400、600、800
mg／dlの各濃度のコレステロール溶液20μを加
えて反応し、反応１分、２分後の各反応液の
340nｍにおける吸光度の増加を測定した。さら
に反応試液のうちトリトンＸ−100の濃度を0.4
ｇ／dl及び1.0ｇ／dlにそれぞれ変えて、全く同
じ操作を行い比較した。結果は第１図に示され
る。第１図より明らかのように1.0ｇ／dl及び５
ｇ／dlの界面活性剤の高濃度添加によつてコレス
テロール濃度が少なくとも600mg／dlまでは直線
性が得られることがわかつた。一方通常使用され
ている界面活性剤の濃度即ち0.4ｇ／dlにおいて
は、せいぜい200mg／dlまでの直線性しか得られ
なかつた。 実施例 １ 反応試液 （組成） コレステロールエステラーゼ（天野製薬社製品）
50U／dl β−NAD（オリエンタル酵母社製品） 0.2ｇ／dl トリトンＸ−100（片山化学社製品） ５ｇ／dl トリシン緩衝液（PH8.5） 0.1mol／dl 上記組成の反応試液１ml及び各種血清（コレス
テロール含量150mg／dl、300mg／dl、780mg／dl
及び980mg／dl）の20μをそれぞれ石英セルに
取り30℃で２分間加温後NAD−CDH又はNADP
−CDH1.0U／mlを0.05ml加え、反応開始し、１
分後及び２分後における各反応液について340n
ｍの吸光度を測定した。その結果は第２図中のａ
に示される。この結果から明らかのようにコレス
テロール濃度1000mg／dlまで直線性が得られるこ
とが分る。 実施例 ２ 実施例１に記載した反応試液中、界面活性剤の
トリトンＸ−100に変えてアデカトールSO135（旭
電化工業社製品）を用いる以外は実施例１と同様
に操作し測定した。 その結果は第２図中のｂに示される。基質濃度
1000mg／dlまで直線性を示した。 実施例 ３ 反応試液 （組成） コレステロールエステラーゼ（天野製薬社製品）
50U／dl ジアホラーゼ（天野製薬社製品） 100U／dl β−NAD（オリエンタル酵母社製品） 0.2ｇ／dl ニトロテトラゾリウムブルー（同仁化学社製品）
0.001ｇ／dl トリトンＸ−100（片山化学社製品） ２ｇ／dl トリシン緩衝液（PH7.5） 0.1mol／dl 上記反応試液１ml及び各種血清（コレステロー
ル含量274mg／dl、547mg／dl、821mg／dl及び
1095mg／dlからなる。）の20μをそれぞれ石英
セルに取り30℃、２分間加温後、各々にNAD−
CDH又はNADP−CDH0.5U／mlを0.05mlずつ加
え、１分後、２分後における反応液560nｍの吸
光度を測定した。その結果、第３図中のｃに示さ
れるように基質コレステロール濃度1000mg／dlま
で直線性が得られた。 実施例 ４ 実施例３に記載された反応試液中トリトンＸ−
100をアデカトールNP700（旭電化工業社製品）
に変えて同様に操作した。その結果第３図中ｄに
示されるように基質コレステロール濃度1000mg／
dlまで直線性が得られた。 実施例 ５ 未知コレステロール含量の各種血清試料を用
い、本発明の実施例１（紫外部測定）及び実施例
３（比色測定）の方法に準じてそれら血清中コレ
ステロール含量を測定する（実施例１に準ずる方
法を本発明とし、実施例３に準ずる方法を本発
明とする。）とともに、市販のコレステロール
測定用キツトによる測定結果とも比較した。その
結果は表２に示されるようにいずれの方法もよく
一致した。 なお市販コレステロール測定キツトとしてコレ
ステロールＣテストワコー（和光純薬工業社製
品）を用いた。
【表】
発明の効果
本発明によりNAD−CDH又はNADP−CDH
を用いるコレステロールの動力学的測定法が可能
になつたことにより多量のサンプルを短時間にか
つ正確に測定できるとともに、さらに１分析あた
りのコレステロールデヒドロゲナーゼ使用量が終
点測定法の1/10〜1/20になつた。
を用いるコレステロールの動力学的測定法が可能
になつたことにより多量のサンプルを短時間にか
つ正確に測定できるとともに、さらに１分析あた
りのコレステロールデヒドロゲナーゼ使用量が終
点測定法の1/10〜1/20になつた。
第１図は、本発明のコレステロールの定量法に
おけるトリトンＸ−100の添加量と反応の直線性
との関係を表すものであり、第２図は、本発明の
コレステロールの定量法（但しNADHの紫外部
吸収による測定法）における添加した界面活性剤
の種類と反応の直線性の関係を表したものであ
り、第３図は、本発明のコレステロール定量法
（但しNADHを発色剤で発色させ比色定量する測
定法）における添加した界面活性剤の種類と反応
の直線性の関係を表したものである。なお第２図
及び第３図における符号ａ及びｃは界面活性剤の
種類としてトリトンＸ−100を用いた場合を示し、
ｂはアデカトールSO135を用いた場合そしてｄは
アデカトールNP700を用いた場合を示している。
おけるトリトンＸ−100の添加量と反応の直線性
との関係を表すものであり、第２図は、本発明の
コレステロールの定量法（但しNADHの紫外部
吸収による測定法）における添加した界面活性剤
の種類と反応の直線性の関係を表したものであ
り、第３図は、本発明のコレステロール定量法
（但しNADHを発色剤で発色させ比色定量する測
定法）における添加した界面活性剤の種類と反応
の直線性の関係を表したものである。なお第２図
及び第３図における符号ａ及びｃは界面活性剤の
種類としてトリトンＸ−100を用いた場合を示し、
ｂはアデカトールSO135を用いた場合そしてｄは
アデカトールNP700を用いた場合を示している。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド依存
性コレステロールデヒドロゲナーゼ又はニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸依存性コレ
ステロールデヒドロゲナーゼを単独又はコレステ
ロールエステラーゼとともに使用して遊離又は結
合型コレステロールを測定するに際し、非イオン
性界面活性剤を１〜10ｇ／dl添加して該測定を動
力学的に行うことを特徴とするコレステロールの
定量法。 ２ ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド依存
性コレステロールデヒドロゲナーゼ又はニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸依存性コレ
ステロールデヒドロゲナーゼが好気性微生物由来
のものである特許請求の範囲第１項記載のコレス
テロールの定量法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59229290A JPS61108400A (ja) | 1984-10-31 | 1984-10-31 | コレステロ−ルの定量法 |
| EP85307616A EP0183381B1 (en) | 1984-10-31 | 1985-10-22 | Method for the determination of cholesterol |
| DE8585307616T DE3565122D1 (en) | 1984-10-31 | 1985-10-22 | Method for the determination of cholesterol |
| US07/136,522 US4892816A (en) | 1984-10-31 | 1987-12-22 | Method for the determination of cholesterol |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59229290A JPS61108400A (ja) | 1984-10-31 | 1984-10-31 | コレステロ−ルの定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61108400A JPS61108400A (ja) | 1986-05-27 |
| JPH047199B2 true JPH047199B2 (ja) | 1992-02-10 |
Family
ID=16889804
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59229290A Granted JPS61108400A (ja) | 1984-10-31 | 1984-10-31 | コレステロ−ルの定量法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4892816A (ja) |
| EP (1) | EP0183381B1 (ja) |
| JP (1) | JPS61108400A (ja) |
| DE (1) | DE3565122D1 (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5589347A (en) * | 1986-12-18 | 1996-12-31 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Multilayer analysis elements for the determination of total cholesterol |
| DE3817747A1 (de) * | 1988-05-25 | 1989-11-30 | Johannes Dr Med Aufenanger | Verfahren zum bestimmen der relativen mengen aller cholesterinhaltigen lipoproteine in koerperfluessigkeiten |
| US5205988A (en) * | 1989-04-06 | 1993-04-27 | Nihon Bunko Kogyo Kabushiki Kaisha | Apparatus for measuring gaseous aldehyde |
| CA2028625A1 (en) * | 1990-07-05 | 1992-01-06 | Daniel S. Daniel | Ethanol analytical element |
| US5229296A (en) * | 1991-12-30 | 1993-07-20 | Miles Inc. | Use of polymer-copper complex to control interference of biological substances in colorimetric test systems |
| JPH07155196A (ja) * | 1993-12-10 | 1995-06-20 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | 生体成分の測定法 |
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