JP2768473B2 - Ｎａｄｈオキシダーゼの製造法 - Google Patents
Ｎａｄｈオキシダーゼの製造法Info
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- JP2768473B2 JP2768473B2 JP25737488A JP25737488A JP2768473B2 JP 2768473 B2 JP2768473 B2 JP 2768473B2 JP 25737488 A JP25737488 A JP 25737488A JP 25737488 A JP25737488 A JP 25737488A JP 2768473 B2 JP2768473 B2 JP 2768473B2
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- nadh oxidase
- nadh
- oxidase
- enzyme
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（以下、NADHと略す）を酸化して過酸化水素又は水を
生成する酵素反応に関与するNADHオキシダーゼを微生物
を用いて製造する方法に関するものであり、本発明の方
法によれば、活性の安定なNADHオキシダーゼを効率よく
製造することができる。
ド（以下、NADHと略す）を酸化して過酸化水素又は水を
生成する酵素反応に関与するNADHオキシダーゼを微生物
を用いて製造する方法に関するものであり、本発明の方
法によれば、活性の安定なNADHオキシダーゼを効率よく
製造することができる。
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、NAD
と略す）は、生体内で行われる種々の脱水素酵素反応の
補酵素であり、それらの酵素の中には工業的に有用な光
学活性化合物、反応中間体等の製造に好適に用いうるも
のが少なくない。目的とする酵素を反応素子として酵素
リアクターに用いる場合、反応当量のNADを使用するこ
とは高価なNADを使い捨てにすることになり実用的方法
とはなりえない。従って、反応系に投入するNAD量を反
応当量より減少し、生成したNADHを系内で再生する必要
がある。再生方法としては酵素的方法及び化学的方法が
知られているが、種々の欠点を有している［ジヤーナル
・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテイー（Journa
l of American Chemical Society）、107巻、第6999−7
008ページ、1985年等参照］。例えば、再生反応速度の
低さ、再生応用に用いた基質−生成物と目的反応の生成
物の分離、再生反応基質の価格等の問題がある。これら
の問題のいくつかは分子状酸素を直接の電子受容体とし
てNADHを酸化することにより解決することができる。NA
DHオキシダーゼはNADHを分子状酸素を用いて酸化しNAD
を再生するのに有用な酵素である。
と略す）は、生体内で行われる種々の脱水素酵素反応の
補酵素であり、それらの酵素の中には工業的に有用な光
学活性化合物、反応中間体等の製造に好適に用いうるも
のが少なくない。目的とする酵素を反応素子として酵素
リアクターに用いる場合、反応当量のNADを使用するこ
とは高価なNADを使い捨てにすることになり実用的方法
とはなりえない。従って、反応系に投入するNAD量を反
応当量より減少し、生成したNADHを系内で再生する必要
がある。再生方法としては酵素的方法及び化学的方法が
知られているが、種々の欠点を有している［ジヤーナル
・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテイー（Journa
l of American Chemical Society）、107巻、第6999−7
008ページ、1985年等参照］。例えば、再生反応速度の
低さ、再生応用に用いた基質−生成物と目的反応の生成
物の分離、再生反応基質の価格等の問題がある。これら
の問題のいくつかは分子状酸素を直接の電子受容体とし
てNADHを酸化することにより解決することができる。NA
DHオキシダーゼはNADHを分子状酸素を用いて酸化しNAD
を再生するのに有用な酵素である。
従来の技術 従来より分子状酵素を電子受容体としてNADHを酸化す
るNADHオキシダーゼとしては、ラクトバチルス・プラン
タラム（Lactobacillus plantarum）由来のもの［アグ
リカルチユラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリ
ー（Agricaltural and Biological Chemistry）25巻、
第876ページ、1961年］、ストレプトコッカス・フアエ
カリス（Streptococcus faecalis）由来のもの［ジヤー
ナル・オブ・パイオロジカル・ケミストリー（Jouranl
of Biological Chemistry）、237巻、第2647ページ、19
62年］、アコレプラズマ・ライドラウイ（Acholeplasma
laidlawii）由来のもの［ヨーロピアン・ジヤーナル・
オブ・バイオケミストリー（European Jouranl of Bioc
hemistry）、120巻、第329ページ、1981年］、バチルス
・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のもの
［ジヤーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of
Biochemistry）、98巻、第1433ページ、1985年］、ロ
イコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mese
nterojdes）由来のもの［ジヤーナル・オブ・バイオケ
ミストリー（Jouranl of Biochemistry）、97巻、第127
9ページ、1985年］等が報告されている。
るNADHオキシダーゼとしては、ラクトバチルス・プラン
タラム（Lactobacillus plantarum）由来のもの［アグ
リカルチユラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリ
ー（Agricaltural and Biological Chemistry）25巻、
第876ページ、1961年］、ストレプトコッカス・フアエ
カリス（Streptococcus faecalis）由来のもの［ジヤー
ナル・オブ・パイオロジカル・ケミストリー（Jouranl
of Biological Chemistry）、237巻、第2647ページ、19
62年］、アコレプラズマ・ライドラウイ（Acholeplasma
laidlawii）由来のもの［ヨーロピアン・ジヤーナル・
オブ・バイオケミストリー（European Jouranl of Bioc
hemistry）、120巻、第329ページ、1981年］、バチルス
・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のもの
［ジヤーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of
Biochemistry）、98巻、第1433ページ、1985年］、ロ
イコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mese
nterojdes）由来のもの［ジヤーナル・オブ・バイオケ
ミストリー（Jouranl of Biochemistry）、97巻、第127
9ページ、1985年］等が報告されている。
しかしながら、これらの技術において知られているNA
DHオキシダーゼは、該微生物の培養がむずかしく大量調
製が困難である（アコレプラズマ・ライドラウイ等）、
菌体内膜画分に存在するため大量調製がむずかしく、さ
らに菌体内含量の向上に困難である（バチルス・メガテ
リウム等）、熱安定性が弱く、長期にわたる活性の保持
を期待しえない（ロイコノストック・メセンテロイデス
等）等の欠点を有している。
DHオキシダーゼは、該微生物の培養がむずかしく大量調
製が困難である（アコレプラズマ・ライドラウイ等）、
菌体内膜画分に存在するため大量調製がむずかしく、さ
らに菌体内含量の向上に困難である（バチルス・メガテ
リウム等）、熱安定性が弱く、長期にわたる活性の保持
を期待しえない（ロイコノストック・メセンテロイデス
等）等の欠点を有している。
本発明者らは、工業的生産に適したNADHオキシダーゼ
について広く検索した結果、アルカリ性領域に至適生育
pHを有する通性嫌気性細菌が、温度安定性にすぐれたNA
DHオキシダーゼを生産することを見出し本発明を完成す
るに到った。なお、本発明において「通性嫌気性菌」と
は、嫌気性菌のうち酸素の存在下でも非存在下でも生育
しうるものをいう。
について広く検索した結果、アルカリ性領域に至適生育
pHを有する通性嫌気性細菌が、温度安定性にすぐれたNA
DHオキシダーゼを生産することを見出し本発明を完成す
るに到った。なお、本発明において「通性嫌気性菌」と
は、嫌気性菌のうち酸素の存在下でも非存在下でも生育
しうるものをいう。
発明の要旨 本発明によれば、アルカリ性領域に至適生育pHを有す
る通性嫌気性のNADHオキシダーゼ生産菌を嫌気的又は好
気的に培地で培養し、該培養物よりNADHオキシダーゼを
採取することを特徴とするNADHオキシダーゼの製造法が
提供される。
る通性嫌気性のNADHオキシダーゼ生産菌を嫌気的又は好
気的に培地で培養し、該培養物よりNADHオキシダーゼを
採取することを特徴とするNADHオキシダーゼの製造法が
提供される。
発明の具体的説明 本発明に使用する、NADHオキシダーゼ生産菌株は、好
アルカリ性通性嫌気性細菌に属し、NADHオキシダーゼ生
産能を有するものであればいかなる菌株でもよく、また
これらの変異株であってもよい。そして、これらの性質
を有する菌株の好適具体例としては、例えば、アグリカ
ルチユラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー
（Agricaltural and Biological Chemistry）第51巻、
第2271−2275ページ（1987）に記載されているEp01株が
あげられる。本菌株はアルカリ性にpHを調節した堆肥に
集積、分離されたものであり、同文献によれば次のよう
な菌学的性質を有するものである。
アルカリ性通性嫌気性細菌に属し、NADHオキシダーゼ生
産能を有するものであればいかなる菌株でもよく、また
これらの変異株であってもよい。そして、これらの性質
を有する菌株の好適具体例としては、例えば、アグリカ
ルチユラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー
（Agricaltural and Biological Chemistry）第51巻、
第2271−2275ページ（1987）に記載されているEp01株が
あげられる。本菌株はアルカリ性にpHを調節した堆肥に
集積、分離されたものであり、同文献によれば次のよう
な菌学的性質を有するものである。
（１） 形態 （ａ） 細胞の形及び大きさ：桿菌、（0.3〜0.6）×
（1.5〜2.5）μｍ （ｂ） 多形性の有無：無 （ｃ） 運動性：なし （ｄ） 胞子：耐熱性胞子あり （ｅ） グラム染色：培養のごく初期には陽性 （ｆ） 抗酸性：陰性 （２） 各培地における生育 （ａ） 肉汁寒天培地：生育せず （ｂ） ゼラチン：液化せず （３） 生理学的性質 （ａ） 生育の範囲:pH7.0で生育せず、pH8.5〜10.0
を至適とする。40℃付近を至適とする。
（1.5〜2.5）μｍ （ｂ） 多形性の有無：無 （ｃ） 運動性：なし （ｄ） 胞子：耐熱性胞子あり （ｅ） グラム染色：培養のごく初期には陽性 （ｆ） 抗酸性：陰性 （２） 各培地における生育 （ａ） 肉汁寒天培地：生育せず （ｂ） ゼラチン：液化せず （３） 生理学的性質 （ａ） 生育の範囲:pH7.0で生育せず、pH8.5〜10.0
を至適とする。40℃付近を至適とする。
（ｂ） オキシダーゼ：陰性 （ｃ） カタラーゼ：陰性 （ｄ） 発酵可能な糖:D−キシロース、Ｄ−アラビノ
ース、Ｄ−リボース、Ｄ−グリコース、Ｄ−マンノー
ス、Ｄ−フルクトース、アミグダリン、エスクリン、サ
リシン、マルトース、サッカロース、セロビオース、ト
レハロース、可溶性でん粉、ペクチン、キシラン （ｅ） ３％食塩存在下で生育 （４） その他の性質 （ａ） 細胞壁成分：メソジアミノピメリン酸含有 （ｂ） チトクローム：チトクロームａ、ｂ、ｃ、ｄ
を含有せず。
ース、Ｄ−リボース、Ｄ−グリコース、Ｄ−マンノー
ス、Ｄ−フルクトース、アミグダリン、エスクリン、サ
リシン、マルトース、サッカロース、セロビオース、ト
レハロース、可溶性でん粉、ペクチン、キシラン （ｅ） ３％食塩存在下で生育 （４） その他の性質 （ａ） 細胞壁成分：メソジアミノピメリン酸含有 （ｂ） チトクローム：チトクロームａ、ｂ、ｃ、ｄ
を含有せず。
（ｃ） キノン：メナキノン、ユビキノン含有せず。
（ｄ） DNA中グアニン、シトシン含有 （GC含量） 35.9％ （ｅ） 細胞脂肪酸組成：アンテイン 23.7％ （嫌気培養時） イソブランチド35.4％ 直鎖 37.2％ （ｇ） 嫌気及び好気培養時にキシラナーゼを生成。
以上の諸性質を「バージーズ・マニユアル・オブ・シ
ステマテイク・バクテリオロジー（Bergey′s Manual o
f Systematic Bacteriology）」第２巻（1986年）より
検索した。好アルカリ性バチルス属（Bacillus）とは、
グラム染色陽性、胞子形成、好気での生育、多様な炭水
化物への生育等、性質を同じくするものが多いが、カタ
ラーゼ陰性、運動性陰性、肉汁寒天での生育を示さない
等の性質を異にする。チトクロム、キノンを含まないこ
ともバチルス属への帰属を示さない。クロスリジウム属
（Clostridium）とも菌体脂肪酸組成、好気での生育等
合致しない点があり、これら既存の属には帰属されない
新菌株の可能性がある。従って、本発明においては未同
定菌Ep01株とのみ称呼することとする。なお、本菌株は
工業技術院微生物工業技術研究所に微生物受託番号 微
工研菌寄第10096号（FERMP−10096）として寄託されて
いる。
ステマテイク・バクテリオロジー（Bergey′s Manual o
f Systematic Bacteriology）」第２巻（1986年）より
検索した。好アルカリ性バチルス属（Bacillus）とは、
グラム染色陽性、胞子形成、好気での生育、多様な炭水
化物への生育等、性質を同じくするものが多いが、カタ
ラーゼ陰性、運動性陰性、肉汁寒天での生育を示さない
等の性質を異にする。チトクロム、キノンを含まないこ
ともバチルス属への帰属を示さない。クロスリジウム属
（Clostridium）とも菌体脂肪酸組成、好気での生育等
合致しない点があり、これら既存の属には帰属されない
新菌株の可能性がある。従って、本発明においては未同
定菌Ep01株とのみ称呼することとする。なお、本菌株は
工業技術院微生物工業技術研究所に微生物受託番号 微
工研菌寄第10096号（FERMP−10096）として寄託されて
いる。
本発明に使用する微生物菌体の培養に使用しうる培地
の栄養源である窒素源としては、例えば、アンモニア、
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム等の無機窒素化合物を単独でもしくは混合して用いる
ことができる。また、無機塩金属塩としては、例えばリ
ン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリ
ウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄等
が用いられる。以上のような無機栄養源の他に、コーン
ステイープリカー、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養
源を加えてもよい。さらに、炭素源として例えば、グル
コース、キシロース、マンノース、フルクトース、アル
トース、シユークロース、セロビオース、キシラン等を
培地に添加することができる。
の栄養源である窒素源としては、例えば、アンモニア、
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム等の無機窒素化合物を単独でもしくは混合して用いる
ことができる。また、無機塩金属塩としては、例えばリ
ン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリ
ウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄等
が用いられる。以上のような無機栄養源の他に、コーン
ステイープリカー、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養
源を加えてもよい。さらに、炭素源として例えば、グル
コース、キシロース、マンノース、フルクトース、アル
トース、シユークロース、セロビオース、キシラン等を
培地に添加することができる。
前述したNADHオキシダーゼ生産菌を上記の如き組成の
培地で培養するにあたり、培養温度は通常約20〜約50
℃、好ましくは約35〜約45℃の範囲内で適当である。ま
た、培養中のpHは約pH7.5以上のアルカリ性領域であれ
ば厳密に限定されるものではないが、一般には８〜10.
5、好ましくは8.5〜10.0の範囲内とするものが有利であ
る。培養中のpHは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、アンモニア炭酸ナトリウム等のアルカリを培地に添
加することにより至適範囲内となるよう調整するのが好
都合である。培養時間は通常３〜24時間、好ましくは５
〜20時間程度とすることができる。培養は通気攪拌、振
盪等の好気的条件下で行なうことができ、或いは無酸素
嫌気的条件下で行ってもよい。
培地で培養するにあたり、培養温度は通常約20〜約50
℃、好ましくは約35〜約45℃の範囲内で適当である。ま
た、培養中のpHは約pH7.5以上のアルカリ性領域であれ
ば厳密に限定されるものではないが、一般には８〜10.
5、好ましくは8.5〜10.0の範囲内とするものが有利であ
る。培養中のpHは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、アンモニア炭酸ナトリウム等のアルカリを培地に添
加することにより至適範囲内となるよう調整するのが好
都合である。培養時間は通常３〜24時間、好ましくは５
〜20時間程度とすることができる。培養は通気攪拌、振
盪等の好気的条件下で行なうことができ、或いは無酸素
嫌気的条件下で行ってもよい。
嫌気的条件下での培養を行う場合には、還元銅カラム
で酸素を除去した窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガ
ス、又はそれらの混合物等の酸素不含ガス雰囲気や、培
地の酸化還元単位を低下させて嫌気性菌の生育を容易に
するチタニウム（III）クエン酸、ジチオナイト等の還
元剤の添加等、偏性嫌気性菌の培養に際し通常用いられ
る手法［例えば山里、宇田川、児玉、森地編、「微生物
の分離法」Ｒ＆Ｄプランニング（1986年刊）246〜274
頁、等参照］の中から、本菌の生育至適とするアルカリ
性領域において効力を有し、かつ本願の生育に悪影響を
及ぼさない条件であれば、それを適用することができ
る。
で酸素を除去した窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガ
ス、又はそれらの混合物等の酸素不含ガス雰囲気や、培
地の酸化還元単位を低下させて嫌気性菌の生育を容易に
するチタニウム（III）クエン酸、ジチオナイト等の還
元剤の添加等、偏性嫌気性菌の培養に際し通常用いられ
る手法［例えば山里、宇田川、児玉、森地編、「微生物
の分離法」Ｒ＆Ｄプランニング（1986年刊）246〜274
頁、等参照］の中から、本菌の生育至適とするアルカリ
性領域において効力を有し、かつ本願の生育に悪影響を
及ぼさない条件であれば、それを適用することができ
る。
さらに、菌体取得にいたるまでの培養はその全段階を
嫌気条件下又は好気条件下の一条件下でのみ行う必要は
なく、培養途中で嫌気条件から好気条件に、あるいは好
気条件から嫌気条件に変更することにより、両者の条件
を組み合わせて培養するのもまた好ましい方法である。
嫌気条件下又は好気条件下の一条件下でのみ行う必要は
なく、培養途中で嫌気条件から好気条件に、あるいは好
気条件から嫌気条件に変更することにより、両者の条件
を組み合わせて培養するのもまた好ましい方法である。
かくして培養される菌体は、NADHオキシダーゼをその
菌体内に含有しているので、取得菌体を例えば超音波処
理、酵素処理、ホモジナイズ等の通常用いられる手段に
て破砕し、得られる無細胞抽出液を、塩析、イオン交換
クロマトグラフイー、ゲル濾過等のそれ自体公知の分
離、精製方法［例えば日本生化学会編 生化学実験講座
第１巻「タンパク質の化学Ｉ分離精製」東京化学同人
刊、１〜334頁；掘尾武一、山下仁平編「蛋白質・酵素
の基礎実験法」南江堂刊１〜379頁等参照］により、NAD
Hオキシダーゼを採取することができる。
菌体内に含有しているので、取得菌体を例えば超音波処
理、酵素処理、ホモジナイズ等の通常用いられる手段に
て破砕し、得られる無細胞抽出液を、塩析、イオン交換
クロマトグラフイー、ゲル濾過等のそれ自体公知の分
離、精製方法［例えば日本生化学会編 生化学実験講座
第１巻「タンパク質の化学Ｉ分離精製」東京化学同人
刊、１〜334頁；掘尾武一、山下仁平編「蛋白質・酵素
の基礎実験法」南江堂刊１〜379頁等参照］により、NAD
Hオキシダーゼを採取することができる。
本発明により得られるNADHオキシダーゼの酵素化学的
及び理化学的性質は次のとおりである。
及び理化学的性質は次のとおりである。
（１） 作用：本酵素は以下の反応式で示される如くNA
DHを酸化してNADと過酸化水素を生成する。
DHを酸化してNADと過酸化水素を生成する。
NADH＋H+＋O2→NAD+＋H2O2 （２） 至適pH:リン酸緩衝液、Tris緩衝液、炭酸緩衝
液を用いて測定したところ、本酵素は7.0付近に至適pH
を有していた（添付の第１図参照）。
液を用いて測定したところ、本酵素は7.0付近に至適pH
を有していた（添付の第１図参照）。
（３） 至適温度及び熱安定性：リン酸緩衝液（pH7.
0）を用いて測定したところ、本酵素は約37℃に至適温
度を有していた（添付の第２図参照）。
0）を用いて測定したところ、本酵素は約37℃に至適温
度を有していた（添付の第２図参照）。
（４） 温度安定性：本酵素を上記（３）にて用いたと
同じ緩衝液に懸濁し37℃にて保存し活性の温度安定性を
調べたところ、100時間経過後も０時間におけると略々
同等の活性を有していた。一方、既に知られているロイ
コノストック・メセンテロイデス（Louconostoc Mesert
eroides）は、ジヤーナル・オブ・バイオケミストリー
（Journal of Biochemistry）第97巻、1285頁（1985）
の第7B図に記載されているごとく、30℃では60分後も活
性を保つものの、40℃では約60％、50℃では０％に活性
が低下し、安定性が劣ることがわかる。
同じ緩衝液に懸濁し37℃にて保存し活性の温度安定性を
調べたところ、100時間経過後も０時間におけると略々
同等の活性を有していた。一方、既に知られているロイ
コノストック・メセンテロイデス（Louconostoc Mesert
eroides）は、ジヤーナル・オブ・バイオケミストリー
（Journal of Biochemistry）第97巻、1285頁（1985）
の第7B図に記載されているごとく、30℃では60分後も活
性を保つものの、40℃では約60％、50℃では０％に活性
が低下し、安定性が劣ることがわかる。
（５） 一価陽イオンの要求：無細胞菌体抽出液を50mM
Tris緩衝液にて透析して得た酵素液のNADHオキシダー
ゼ活性を100とした場合、該酵素液に20mM濃度となるよ
うにK+、Na+、NH4 +を添加したときの活性はそれぞれ、3
10、180、310であった。
Tris緩衝液にて透析して得た酵素液のNADHオキシダー
ゼ活性を100とした場合、該酵素液に20mM濃度となるよ
うにK+、Na+、NH4 +を添加したときの活性はそれぞれ、3
10、180、310であった。
（６） NADHオキシダーゼは無細胞抽出液を100,000×
ｇで１時間超遠心処理した上清画分に存在する。
ｇで１時間超遠心処理した上清画分に存在する。
なお、本酵素の定性的分析は、NADHの340nmの吸光の
減少もしくはNADH共存時の酸素の吸収を酸素電極又はマ
ノメーターにより観測することにより行なった。また、
本酵素の活性測定は次のように行うことができる。すな
わち、50mM緩衝液1.9ml、酵素液0.05mlからなる反応液
を指定する温度にて予め保持した後、5mM NADH0.05ml
を加え反応を開始し、340nmにおける吸光の減少を測定
する。酵素活性は１分間に１μmolのNADHを酸化する酵
素量を１単位とした。
減少もしくはNADH共存時の酸素の吸収を酸素電極又はマ
ノメーターにより観測することにより行なった。また、
本酵素の活性測定は次のように行うことができる。すな
わち、50mM緩衝液1.9ml、酵素液0.05mlからなる反応液
を指定する温度にて予め保持した後、5mM NADH0.05ml
を加え反応を開始し、340nmにおける吸光の減少を測定
する。酵素活性は１分間に１μmolのNADHを酸化する酵
素量を１単位とした。
発明の効果 以上に述べた本発明によれば、アルカリ性領域に至適
生育pHを有するNADHオキシダーゼ生産菌を使用するた
め、培養時に雑菌汚染の恐れの少ないNADHオキシダーゼ
生産菌から、温度安定性等の優れたNADHオキシダーゼを
容易に生産することができる。
生育pHを有するNADHオキシダーゼ生産菌を使用するた
め、培養時に雑菌汚染の恐れの少ないNADHオキシダーゼ
生産菌から、温度安定性等の優れたNADHオキシダーゼを
容易に生産することができる。
実 施 例 次に実施例をあげて本発明のNADHオキシダーゼの製造
法をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例
に何ら限定されるものではない。
法をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例
に何ら限定されるものではない。
実施例１ K2HPO41g、硝酸アンモニウム2g、MgSO4・7H2O200mg、
MnSO4・7H2O5mg、FeSO4・7H2O5mg、CaCl2・2H2O700mg、
酵母エキス3g、ポリペプトン300mg、キシラン10g及びレ
サズリン1mgを蒸留水900mlに溶解し、90mlずつ100ml容
血清ビンに分注した。煮沸脱気し、還元銅カラムを通過
して調製した無酸素窒素ガスを通気後ブチルゴム栓をか
ぶせ、アルミキャップにて封じ120℃15分殺菌を行なっ
た。この培地に120℃、15分減菌済みの10％炭酸ナトリ
ウム水溶液（pH10.6）を10ml添加し、培地のpHを10とし
た。さらに、還元剤としてサイエンス（Science）第194
巻1165−1166頁記載のA.J.B.Zehnder ＆ K.Wuhrmann
らの方法に準じて調製したチタニウム（III）クエン酸
溶液を最終濃度0.13mMとなるように添加した。本培地に
好アルカリ性菌Ep01株（微工研菌寄第10096号）を接種
し、40℃、20時間静置培養を行なったものを種培養液と
した。
MnSO4・7H2O5mg、FeSO4・7H2O5mg、CaCl2・2H2O700mg、
酵母エキス3g、ポリペプトン300mg、キシラン10g及びレ
サズリン1mgを蒸留水900mlに溶解し、90mlずつ100ml容
血清ビンに分注した。煮沸脱気し、還元銅カラムを通過
して調製した無酸素窒素ガスを通気後ブチルゴム栓をか
ぶせ、アルミキャップにて封じ120℃15分殺菌を行なっ
た。この培地に120℃、15分減菌済みの10％炭酸ナトリ
ウム水溶液（pH10.6）を10ml添加し、培地のpHを10とし
た。さらに、還元剤としてサイエンス（Science）第194
巻1165−1166頁記載のA.J.B.Zehnder ＆ K.Wuhrmann
らの方法に準じて調製したチタニウム（III）クエン酸
溶液を最終濃度0.13mMとなるように添加した。本培地に
好アルカリ性菌Ep01株（微工研菌寄第10096号）を接種
し、40℃、20時間静置培養を行なったものを種培養液と
した。
キシラン10gをグルコース10gに変えた他は同組成の培
地450mlを500ml容血清ビンに分注し、同様の操作を行な
い120℃、15分殺菌後、10％炭酸ナトリウム水溶液50m
l、チタニウム（III）クエン酸溶液を最終濃度0.13mMと
なるように添加した。前記種培養液10mlを接種し、40
℃、24時間静置培養した。培養終了後培養液100mlを、
1,000×g,20分遠心し得られた菌体を50mM Tris塩酸緩
衝液に懸濁後、遠心集菌し洗浄菌体を得た。この菌体を
同上緩衝液5mlに懸濁後、超音波処理により菌体を破壊
し、遠心分離して得られた上澄を粗酵素液とし、NADHオ
キシダーゼ活性を測定したところ、0.25単位1mlであっ
た（１単位は１分間に１μmoleのNADHを酸化する酵素量
を示す）。
地450mlを500ml容血清ビンに分注し、同様の操作を行な
い120℃、15分殺菌後、10％炭酸ナトリウム水溶液50m
l、チタニウム（III）クエン酸溶液を最終濃度0.13mMと
なるように添加した。前記種培養液10mlを接種し、40
℃、24時間静置培養した。培養終了後培養液100mlを、
1,000×g,20分遠心し得られた菌体を50mM Tris塩酸緩
衝液に懸濁後、遠心集菌し洗浄菌体を得た。この菌体を
同上緩衝液5mlに懸濁後、超音波処理により菌体を破壊
し、遠心分離して得られた上澄を粗酵素液とし、NADHオ
キシダーゼ活性を測定したところ、0.25単位1mlであっ
た（１単位は１分間に１μmoleのNADHを酸化する酵素量
を示す）。
実施例２ キシラン10gの代わりにグルコース10gを、さらにレサ
ズリンを含有しない他は実施例１に記述したと同じ培地
90mlを500ml容三角フラスコに分注し120℃、15分殺菌す
る。別途加熱滅菌した10％炭酸ナトリウム水溶液を添加
し、pHを10に調製したのち、実施例１記載の種培養液5m
lを接種し、30℃、20時間振盪培養を行なった。培養終
了後、培養液100mlより遠心分離して得られた菌体を5ml
の50mMトリス塩酸緩衝液に懸濁し、超音波破砕し、遠心
分離して得られた上澄を粗酸素液とした。その活性は0.
18単位1mlであった。
ズリンを含有しない他は実施例１に記述したと同じ培地
90mlを500ml容三角フラスコに分注し120℃、15分殺菌す
る。別途加熱滅菌した10％炭酸ナトリウム水溶液を添加
し、pHを10に調製したのち、実施例１記載の種培養液5m
lを接種し、30℃、20時間振盪培養を行なった。培養終
了後、培養液100mlより遠心分離して得られた菌体を5ml
の50mMトリス塩酸緩衝液に懸濁し、超音波破砕し、遠心
分離して得られた上澄を粗酸素液とした。その活性は0.
18単位1mlであった。
第１図は本発明により得られるNADHオキシダーゼの至適
pHを示すグラフであり、 第２図は本発明により得られるNADHオキシダーゼの至適
温度を示すグラフである。
pHを示すグラフであり、 第２図は本発明により得られるNADHオキシダーゼの至適
温度を示すグラフである。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】アルカリ性領域に至適生育pHを有する通性
嫌気性のNADHオキシダーゼ生産菌（Ep01株）を培地で培
養し、培養物よりNADHオキシダーゼを採取することを特
徴とするNADHオキシダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25737488A JP2768473B2 (ja) | 1988-10-14 | 1988-10-14 | Ｎａｄｈオキシダーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25737488A JP2768473B2 (ja) | 1988-10-14 | 1988-10-14 | Ｎａｄｈオキシダーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02107186A JPH02107186A (ja) | 1990-04-19 |
| JP2768473B2 true JP2768473B2 (ja) | 1998-06-25 |
Family
ID=17305502
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25737488A Expired - Lifetime JP2768473B2 (ja) | 1988-10-14 | 1988-10-14 | Ｎａｄｈオキシダーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2768473B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4963209B2 (ja) * | 2006-10-10 | 2012-06-27 | 学校法人慶應義塾 | 新規過酸化水素生成型ｎａｄｈオキシダーゼ |
| JP5115708B2 (ja) | 2008-01-17 | 2013-01-09 | 学校法人慶應義塾 | 新規過酸化水素生成型ｎａｄｈオキシダーゼ及びそれをコードするｄｎａ |
-
1988
- 1988-10-14 JP JP25737488A patent/JP2768473B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02107186A (ja) | 1990-04-19 |
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