JPH07313154A - キノン依存性フルクトース脱水素酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 以下の理化学的性質を有するキノン依存性フ
ルクトース脱水素酵素及びその製造方法。作用：Ｄ−フ
ルクトースを酸化してケト−Ｄ−フルクトースを精製す
る酵素反応を触媒する。基質特異性：フルクトースに対
して作用する。最適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：ヘキサシア
ノ鉄(III)酸カリウムを電子受容体としたときはそれぞ
れ5.0、5.0〜7.0である。作用適温の範囲：10〜60℃。
熱安定性：30℃、15分間の処理で約95％の酵素活性を有
する。阻害剤：重金属により阻害される。分子量：約5
7,000、約41,000、約21,500、約16,000である。 【効果】 本発明により、新規キノン依存性フルクトー
ス脱水素酵素及びその製法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、キノン依存性フルクト
ース脱水素酵素及びその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】フルクトースは、果実中の糖分として、
また、食品中の甘味成分として広く使用されており、食
品分析においても主要な分析対象となっている糖であ
る。このフルクトースの定量法としては、フルクトース
の還元性を利用した化学的発色法が用いられたきたが、
試料中の他の還元性物質の影響を受けるなどの問題点が
あり、より特異性の高い分析方法の開発が望まれてい
た。

【０００３】そこで、フルクトースの酵素的定量法が開
発された。この方法は、ヘキソキナーゼによりフルクト
ース−６−リン酸にまず変換し、これにグルコースリン
酸イソメラーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼを作用させ、ＮＡＤＰの還元により定量するとい
う３つの酵素反応を組み合わせた複雑な方法である。最
近になり、フルクトースに特異的に作用し、フルクトー
スの定量にする酵素として、グルコノバクター属に属す
る微生物由来のＤ−フルクトース；フェリチトクローム
酸化還元酵素が見いだされた。この酵素は、１段階の反
応でフルクトースを定量でき、優れた定量用酵素であ
る。

【０００４】Ｄ−フルクトース；フェリチトクローム酸
化還元酵素については、以下のような酵素学的な研究が
なされている。補欠分子族としては、ＦＡＤあるいはＰ
ＱＱとされているが、現状では明確ではない。また、脱
水素酵素反応に関与する蛋白成分としては、分子量78,0
00のサブユニットとフェリチトクロームＣが必要とされ
ている。従って、本酵素の活性の発現には、少なくとも
２つのサブユニットの存在が必要となる〔特公昭60−33
472号公報、J.Bacteriol.,145巻，814-823頁（1981)、M
ethods in Enzymol.,89巻，154-159頁（1982）〕。

【０００５】Ｄ−フルクトース；フェリチトクローム酸
化還元酵素の電子受容体としては、ヘキサシアノ鉄(II
I) 酸カリウム、フェナジンメソサルフェート、ジクロ
ロフェノールインドフェノール、ウルスターブルーが有
効であることが見いだされているが、これ以外について
は、直接反応する電子受容体については、報告されてい
ない。

【０００６】生産菌としては、グルコノバクター・イン
ダストリウスで見いだされているだけで、これ以外の酢
酸菌を含めた微生物から精製された例はない。また、こ
のＤ−フルクトース；フェリチトクローム酸化還元酵素
をフルクトースの定量に利用する例があるが、酸素存在
下で電子受容体と反応させ、還元型電子受容体の増加量
あるいは酸化型電子受容体の減少量又は酸素の減少量を
測定することにより、定量が可能となっている（特公昭
59−35592 号公報）。

【０００７】上記の如く、Ｄ−フルクトース；フェリチ
トクローム酸化還元酵素は、フルクトースの定量用酵素
として優れているが、実用的に使用するには以下のよう
な問題点があった。 （１）精製が困難である。 Ｄ−フルクトース；フェリチトクローム酸化還元酵素の
活性発現には、フルクトースと直接反応し、Ｄ−フルク
トースをケト−フルクトースに酸化する脱水素酵素とこ
の脱水素酵素から電子を受け取り、適当な電子受容体に
受け取った電子を供与するチトクロームＣの２つのタン
パク質が活性発現に必要である。従って、これらの必須
２成分を分離することなく、菌体から精製する必要があ
るため、収量が20％程度と低い。

【０００８】（２）電子受容体の利用性が狭い。 Ｄ−フルクトース；フェリチトクローム酸化還元酵素の
電子受容体としては、ヘキサシアノ鉄(III)酸カリウ
ム、フェナジンメソサルフェート、ジクロロフェノール
インドフェノール、ウルスターブルーが有効であること
が見いだされているが、定量用に使用できるほど安定な
電子受容体としてはフェリシアン化カリウムしかない。
しかし、ヘキサシアノ鉄(III)イオンから酵素反応より
還元されて生じるヘキサシアノ鉄(IV)イオンの定量は、
DUPANOL試薬と反応させて生じるプルシアン・ブルーの6
60nmの吸収を比色法にて定量するが、発色反応に時間が
かかったり、プルシアン・ブルーの発色が不安定なた
め、発色時間を正確に守り比色を実施しないと誤差を生
じやすい。

【０００９】（３）安定性が悪い。 安定化剤としてTriton X-100を添加する必要があり、添
加しても４℃で２週間程度しか初期活性を維持すること
ができない。また、最適温度は25℃と低く、35℃では容
易に失活するため、実際に使用するときには反応温度を
25℃程度と夏には冷却する必要がある。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記諸問題
を解決し、フルクトースと直接かつ選択的に反応するこ
とができる脱水素酵素であるキノン依存性フルクトース
脱水素酵素及びその製法を提供することを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、同じ酢酸
菌由来の脱水素酵素であるアルコール脱水素酵素であっ
ても、該アルコール脱水素酵素を産生する微生物の属や
種によって酵素を構成する蛋白質複合体の分子種や安定
性や基質特異性などに違いがあることを見いだし、実用
的な酵素の開発に成功した（特開昭63−12278号公
報）。

【００１２】本発明者らは、前記公開公報記載の発明に
着目し、フルクトースに作用する脱水素酵素についても
該フルクトース脱水素酵素を産生する微生物の属や種に
よって酵素学的性質について違いがあり、しかも、上記
の問題点を解決できるフルクトース脱水素酵素が存在す
るとの期待から種々の微生物について鋭意検討した。そ
の結果、アセトバクター属及びグルコノバクター属に属
する微生物由来のフルクトース脱水素酵素が、従来報告
されているフルクトース脱水素酵素〔特公昭60−33472
号公報、J.Bacteriol.,145巻，814-823頁（1981)、Meth
ods in Enzymol.,89巻，154-159頁（1982）；以下同
じ〕とは異なり、フェリチトクローム成分を含んでおら
ず、フェリチトクローム成分を欠いていてもヘキサシア
ノ(III)酸カリウムなどの電子受容体と反応可能である
ことを見いだした。

【００１３】また、前記フルクトース脱水素酵素の電子
受容体としてこれまで全く知られていなかった補酵素で
あるユビキノン、特に水溶性であるイソプレン側鎖の無
い又は短いユビキノン、即ち、ユビキノン−０、ユビキ
ノン−１又はユビキノン−２が極めて有効な電子受容体
であることを見いだし、本発明を完成した。即ち、本発
明は、以下の理化学的性質を有するキノン依存性フルク
トース脱水素酵素である。 （ａ）作用：Ｄ−フルクトースを酸化してケト−Ｄ−フ
ルクトースを生成する下記の酵素反応を触媒する。

【００１４】Ｄ−フルクトース＋電子受容体 → ケト
−Ｄ−フルクトース＋還元型電子受容体 〔電子受容体は、ＣｏＱ_n（ユビキノン；ｎは０〜10の
整数を表す）、ベンゾキノン、フェナジンメソサルフェ
ート、２, ６−ジクロロフェノールインドフェノール、
ヘキサシアノ鉄(III)酸カリウムを表す。〕 （ｂ）基質特異性：Ｄ−フルクトースを良好な基質とし
て作用する。フルクトースに対するＫｍ値（ミカエリス
定数）は、30℃、ｐＨ5.0（マクイルベイン氏緩衝液）
で2.1×10^-3Ｍである。 （ｃ）最適ｐＨ：最適ｐＨは、Ｄ−フルクトースを基質
とし、ヘキサシアノ鉄(III)酸カリウムを電子受容体と
したときはｐＨ5.0である。 （ｄ）安定ｐＨ範囲：安定ｐＨ範囲は、ヘキサシアノ鉄
(III)酸カリウムを電子受容体としたときはｐＨ5.0から
7.0である。 （ｅ）作用適温の範囲：10〜60℃である。 （ｆ）熱安定性：30℃、15分間の処理では約95％の酵素
活性を有し、40℃、15分間の処理でも約45％の残存活性
がある。 （ｇ）阻害剤：１mＭの銅、ニッケル、亜鉛などの重金
属により阻害される。 （ｈ）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法
で測定した結果、４つのタンパク質から構成され、それ
ぞれのタンパク質の分子量は約57,000、約41,000、約2
1,500、約16,000である。

【００１５】更に、本発明は、アセトバクター属又はグ
ルコノバクター属に属し、前記キノン依存性フルクトー
ス脱水素酵素を産生する能力を有する微生物を培地に培
養し、培養物から前記キノン依存性フルクトース脱水素
酵素を採取することを特徴とするキノン依存性フルクト
ース脱水素酵素の製造方法である。更に、本発明は、酸
素非存在下でユビキノン−０、ユビキノン−１又はユビ
キノン−３からなる群より選ばれる１つ又は２つ以上の
キノンを電子受容体として脱水素酵素活性を測定するこ
とを特徴とするキノン依存性フルクトース脱水素酵素の
活性の測定方法である。

【００１６】以下、本発明を詳細に説明する。先ず、本
発明の精製酵素であるキノン依存性フルクトース脱水素
酵素（以下「本酵素」とする）の理化学的性質を説明す
ると、以下の通りである。 （１）作用 本酵素は、Ｄ−フルクトースに作用してケト−Ｄ−フル
クトースに酸化する下記の酵素反応を触媒する。

【００１７】フルクトース＋電子受容体 → ケト−Ｄ
−フルクトース＋還元型電子受容体 〔電子受容体は、ＣｏＱ_n（ユビキノン；ｎは０〜10の
整数を表す）、ベンゾキノン、フェナジンメソサルフェ
ート、ジクロロフェノールインドフェノール、ヘキサシ
アノ鉄(III)酸カリウムを表す。〕 （２）基質特異性 本酵素の基質特異性は以下の反応条件で調べた。

【００１８】本酵素（13ユニット／ml）10μLと10mＭの
ヘキサシアノ鉄(III)酸カリウム溶液を含むマクイルベ
イン氏緩衝液（ｐＨ5.0）0.9mlに１Ｍの各基質溶液を0.
1ml加えて30℃でインキュベートする。反応に伴って生
じるヘキサシアノ鉄(IV)イオンを下記の力価の測定法に
記載した方法で定量した。本酵素の基質特異性の例を第
１表に示す。

【００１９】

【表１】

【００２０】本酵素は、Ｄ−フルクトース以外には作用
しない。フルクトースに対するＫｍ値（ミカエリス定
数）は、30℃、ｐＨ5.0（マクイルベイン氏緩衝液）で
2.1×10^-3Ｍである。 （３）最適ｐＨ 本酵素の最適ｐＨは、第１図に示すように、ヘキサシア
ノ鉄(III)酸カリウムを電子受容体としたときはｐＨ5.0
である。 （４）安定ｐＨ範囲 第２図に示すように、本酵素は、安定ｐＨ範囲はｐＨ5.
0から7.0で、25℃、16時間放置後も50％の残存活性〔ヘ
キサシアノ鉄(III)酸カリウムを電子受容体とし、活性
をｐＨ5.0で測定〕を示す。 （５）作用適温の範囲 第３図に示すように、作用温度範囲は10〜60℃で、最適
温度は40℃である。従来のフルクトース脱水素酵素の最
適温度が25℃であるのに対し、本酵素の最適温度は10℃
以上高い。 （６）熱安定性 第４図に示すように、ｐＨ5.0で各温度15分間処理する
と、30℃までの温度では失活せず、40℃で約45％の残存
活性がある。従来の報告されているフルクトース脱水素
酵素では、35℃で失活してしまうのに対し、本酵素は熱
安定性に優れている。 （７）阻害剤 第２表に示すように、１mＭの銅、ニッケル、亜鉛など
の重金属により阻害される。

【００２１】

【表２】

【００２２】（８）分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法で分子量標準蛋
白質としてホスホリラーゼｂ（分子量 94,000)、アルブ
ミン（分子量 67,000)、オボアルブミン（分子量 43,00
0)、カルボニックアンヒドラーゼ（分子量 30,000)、ト
リプシンインヒビター（分子量 20,100)及びα−ラクト
アルブミン（分子量 14,400)を使用し、これら標準蛋白
質と本酵素との相対的泳動度により測定した結果、本酵
素は４つのタンパク質から構成され、それぞれのタンパ
ク質の分子量は約57,000、約41,000、約21,500、約16,0
00である。

【００２３】従来のフルクトース脱水素酵素が、分子量
67,000、50,800、19,700の３成分からなる複合体である
のに対し、本酵素とは分子量、構成成分が異なる。 （９）吸収スペクトル 精製酵素の吸収スペクトルを第５図に示す。第５図中、
（ａ）は本酵素の可視部吸収スペクトルを表し、（ｂ）
は亜二チオン酸ナトリウムの添加による本酵素の還元型
吸収スペクトルを表す。可視部に従来のフルクトース脱
水素酵素で認められたフェリチトクローム成分由来の吸
収極大（553-550nm、523nm、417nm）はなく、フェリチ
トクローム成分を含有していない。 （10）電子受容体 ユビキノン（ＣｏＱ₀ 、ＣｏＱ₁ 、ＣｏＱ₂ 、Ｃｏ
Ｑ₈ 、ＣｏＱ₉ 、ＣｏＱ₁₀など）、ベンゾキノン、フェ
ナジンメソサルフェート、２, ６−ジクロロフェノール
インドフェノール、ヘキサシアノ鉄(III)酸カリウム、
などが本酵素の電子受容体になりうる。ＮＡＤ、ＮＡＤ
Ｐおよび酸素は、本酵素の電子受容体にならない。 （11）力価の測定方法 第３表に示した通り、本酵素、ＣｏＱ₀ 及び基質である
フルクトースを含む組成の反応液を30℃でインキュベー
トし、反応に伴って減少するＣｏＱ₀ の量をＣｏＱ₀ の
吸収極大である268nmの吸光度の経時変化量を分光光度
計で測定することにより、力価を測定する。１μmoleの
フルクトースを１分間に酸化する酵素量を１単位とす
る。比活性は、酵素蛋白質１mg当たりの単位数で表す。

【００２４】

【表３】

【００２５】ヘキサシアノ鉄(III)酸カリウムを電子受
容体としても本酵素の力価を測定することが可能であ
る。第４表の組成の反応溶液を用いて、30℃、2.5分間
反応させた後、Ferricsulfate-Dupanol試薬〔"Methods
in Enzymology" 第５巻、287頁（1962）〕を加えて反応
を停止する。酵素単位の定義は、上記のＣｏＱ₀ を電子
受容体とした場合と同じである。

【００２６】

【表４】

【００２７】次に、本酵素の製造法について説明する。
本発明の酵素を製造するに使用される微生物は、本酵素
を生産できる微生物であれば特に限定はないが、アセト
バクター属又はグルコノバクター属に属する微生物が好
適に使用される。菌株としては、アセトバクター・アセ
チ 1023（FERMBP-2287）、アセトバクター・パスツリア
ヌス IFO 13751、グルコノバクター・ジオキシアセトニ
カス IFO 3273 などが使用できる。

【００２８】本発明で使用する培地としては、通常の微
生物を培養する培地であればよく、特に炭素源としては
グルコースがが好適に使用される。本酵素を生産するこ
とのできる微生物を培養するにあたっては、固体培地を
使用することもできるが、多量の菌体を得るには液体培
地を用いて振盪培養または通気攪拌培養を行うのが好ま
しい。大量培養においては、まず小規模な前培養を行
い、得られた培養物を本培地に接種することが好まし
い。

【００２９】本酵素は菌体内に蓄積されるため、本酵素
の回収、精製のためには、まず、菌体を集めて破砕す
る。本酵素の細胞内の局在性は細胞質膜画分であるた
め、破砕菌体に適当な界面活性剤、例えばトリトン X-1
00などの非イオン界面活性剤を加えることにより該画分
から可溶化する。可溶化された本酵素は、界面活性剤存
在下でジエチルアミノエチル−トヨパール（株式会社東
ソー製、以下「ＤＥＡＥ−トヨパール」という）などの
イオン交換剤を用いたクロマトグラフィーやヒドロキシ
アパタイトを用いたクロマトグラフィー、あるいは、ゲ
ル濾過クロマトグラフィーなどの手段により精製され、
本酵素を得ることができる。

【００３０】可溶化以外にも２層分配法などの手法によ
り破砕した菌体から本酵素を抽出すすことが可能であ
る。細胞質膜から可溶化などの手法により抽出すると、
そのままでは本酵素は不安定で容易に失活するので、界
面活性剤や還元剤やアルコールなどを共存させて、その
後の精製を進めることが望ましい。

【００３１】本酵素の精製の具体例を示すと次のとおり
である。菌体の破砕を機械的処理で行う場合は、フレン
チプレスで20,000psi程度の圧力をかけることによって
ほぼ完全に菌体に破砕される。また、膜画分からの界面
活性剤による可溶化において使用する界面活性剤の濃度
は0.1〜5.0％の範囲が通常である。可溶化された酵素は
既に50％以上の高純度の標品となっているが、更に純度
の高い標品を取得する場合は、特にイオン交換クロマト
グラフィーが有効である。クロマトグラフィーでは、精
製中に酵素蛋白質の凝集を防ぐために、使用する緩衝液
に0.01〜1.0％程度の界面活性剤を含有させておく必要
がある。また、界面活性剤とともに２−メルカプトエタ
ノールなどの還元剤やグリセロールやマンニトールなど
の糖アルコールを緩衝液に加えておくと精製中の酵素の
失活防止に有効である。還元剤の濃度は、１〜10mＭ程
度、糖アルコールの場合には、５〜10％程度である。

【００３２】本酵素は、該酵素を構成する蛋白質部分と
フェリチトクロームとが活性には必要とされない点で、
前記蛋白質部分及びフェリチトクロームを必要とする従
来から知られているフルクトース脱水素酵素と相違して
おり、特にフェリチトクロームが存在しなくとも活性が
発現することは、本酵素の特徴的な性質である。また、
本酵素は、活性の最適温度が40℃と従来のフルクトース
脱水素酵素の最適温度より高く、熱安定性に優れている
点で従来のフルクトース脱水素酵素と明らかに相違して
いる。更に、電子受容体としてユビキノン、特に水溶性
ユビキノンとの反応性が高いことも本酵素の特徴の一つ
である。

【００３３】また、グルコノバクター属に属する微生物
由来のＤ−フルクトース脱水素酵素が知られており（東
洋紡株式会社製、カタログＦＣＤ−３０１）、本酵素と
同様にＤ−フルクトースに対して作用し、ヘキサシアノ
(III)酸鉄を電子受容体として利用できる。しかし、基
質特異性について比較すると、グルコノバクター属に属
する微生物由来のＤ−フルクトース脱水素酵素がグルコ
ン酸に対してＤ−フルクトースの約20％の反応性を示す
のに対して、本酵素は、全くグルコン酸と反応しない。
また、酵素の阻害について前記両酵素を比較すると、グ
ルコノバクター属に属する微生物由来のＤ−フルクトー
ス脱水素酵素は、銅イオンや亜鉛イオンによってほとん
ど活性が阻害されないのに対し、本酵素は、銅イオンや
亜鉛イオンによってほぼ完全にその活性が阻害される点
で顕著な相違がある。

【００３４】以上の結果から、本酵素は新規な酵素と判
断される。

【００３５】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されない。 〔実施例１〕 フルクトース脱水素酵素の精製 グルコース1.5％、ショ糖1.5％、酵母エキス0.5％及び
ポリペプトン0.2％を含むｐＨ6.5の液体培地（以下「Ｙ
ＰＧＳ液体培地」と称する）５mlを30ml容試験管に分注
し、滅菌した後、アセトバクター・パスツリアヌスIFO
13751 を一白金耳接種し、30℃にて24時間往復振盪培養
機上で培養した。この培養液を、前記ＹＰＧＳ液体培地
100mlを分注した500ml容の坂口フラスコに植菌し、30℃
にて24時間往復振盪培養したものを前培養とし、更に５
リットル容ジャーファーメンター中の同培地３リットル
に前記の培養液150mlを接種して0.6リットル／分で通気
し、攪拌しながら30℃にて12時間培養し菌体を得た。

【００３６】この菌体を0.05Ｍリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ6.5）に懸濁し、20,000psiでフレンチプレスを通
し、菌体を破砕したのち、68,000×ｇで60分間超遠心分
離し、膜画分を沈澱として得た。この沈殿を１／20マク
イルベイン氏緩衝液（ｐＨ6.0)に懸濁し、20％トリトン
X-100を最終濃度が1.0％となるように加え、１時間攪
拌した。この液を68,000×ｇで60分間超遠心分離を行
い、本酵素が可溶化された上清を得た。この液を0.1％
トリトン X-100を含む１／20マクイルベイン氏緩衝液
（ｐＨ6.0) で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパールを充填
したカラムに注入し、本酵素を吸着したのち、ｐＨ6.0
からｐＨ4.5までの１／20マクイルベイン氏緩衝液で傾
斜溶出した。ｐＨ5.0付近のマクイルベイン氏緩衝液で
溶出する活性画分を集めて濃縮し、本酵素の精製標品5.
5mgを収率46.4％で得た。精製酵素標品の力価はヘキサ
シアノ鉄(III)酸カリウムを電子受容体として測定した
場合、141単位／mg蛋白質であった。また、本酵素は前
記性質を有していた。

【００３７】〔参考例１〕フルクトースの定量は、第６
図に概略を示す電池セル１を用いて行った。ただし、電
池セルの両極間に外部電源からの電圧を印加せずに使用
した。第６図（ａ）に電池セル全体の概略を示し、第６
図（ｂ）にその断面を示すように、電池セル１は、隔膜
として用いるイオン交換膜（旭硝子製陽イオン交換膜Ｃ
ＭＶ）６によって分離された作用極２と対極４を備え、
作用極２及び対極４には各々カーボンフェルト（日本カ
ーボン製GF-20-5F）３、５が挿入されている。また、作
用極２及び対極４は白金線７を介して電流積算計８に接
続されている。

【００３８】第６図の装置を用い、作用極液としてｐＨ
5.0の0.4Ｍリン酸緩衝液を用い、対極液として0.45Ｍヘ
キサシアノ鉄(III) 酸カリウム溶液（0.04Ｍリン酸緩衝
液ｐＨ7.3）を用いて、１〜20mＭの各濃度のユビキノー
ル誘導体ＣｏＱ₂Ｈ₂溶液の測定を行った。第７図に、各
試料５μｌに対しての測定結果を示す。第７図の横軸は
ＣｏＱ₂Ｈ₂濃度（単位mＭ）であり、縦軸は電流積算計
８による測定電気量（mＣ）である。第７図から明らか
なように、ＣｏＱ₂Ｈ₂濃度と電流積算計による測定電気
量との間には良好な直線関係が得られ、かつ、理論電気
量とも一致し、絶対定量が可能であることが示された。
繰り返し再現性についてはいずれの試料の場合も、10回
繰り返したときの変動係数（以下、ＣＶ値とする）は３
％以内であり優れた再現性を示した。

【００３９】ＣｏＱ₂Ｈ₂の代わりにＣｏＱ₀Ｈ₂又はＣｏ
Ｑ₁Ｈ₂を使用して、上記と同様な試験を行ったところ、
いずれの場合もＣｏＱ₂Ｈ₂と同様な結果が得られた。 〔参考例２〕 フルクトース脱水素酵素の触媒により生
成するＣｏＱ₀Ｈ₂量を指標としたフルクトース量の定量 アセトバクター・パストリアヌス（Acetobacter pasteu
rianus) IFO 13751 から実施例１記載の方法で調製した
フルクトース脱水素酵素を用いて、本発明の方法による
フルクトースの定量を行った。

【００４０】本酵素の反応は以下の通りである。 すなわち、フルクトース脱水素酵素含有溶液（80Ｕ／m
l，0.1％ トリトン X-100を含む50mＭリン酸緩衝液ｐＨ
6.5）５μL、250mＭのＣｏＱ₀溶液８μL、基質として各
種濃度のフルクトース溶液（50mＭリン酸緩衝液ｐＨ6.
5）87μLを混合し、室温で15分放置した溶液５μLを調
製した。

【００４１】第５図の装置を用い、作用極液としてｐＨ
5.0の0.4Ｍリン酸緩衝液を用い、対極液として0.45Ｍヘ
キサシアノ鉄(III)酸カリウム溶液（0.04Ｍリン酸緩衝
液ｐＨ7.3）を用いて、１〜20mＭの各濃度のユビキノー
ル誘導体ＣｏＱ₂Ｈ₂溶液の測定を行った。第８図に結果
を示す。フルクトースの濃度と電流積算計の測定電気量
との間には良好な直線関係が得られた。また、同じ試料
を10回繰り返し測定したときのＣＶ値は1.5％以下と良
好であった。

【００４２】〔参考例３〕 各種市販食品中のフルクト
ースの測定 参考例２と同じ条件で各種市販食品中のフルクトースの
測定を行った。同じ試料について高速液体クロマトグラ
フ法〔（株）島津製作所製液体クロマトグラフ装置ＬＣ
−６Ａ使用、検出器：昭和電工（株）製ShodexRISE−5
1、カラム：旭化成工業（株）製アサヒパックＮＨ₂ Ｐ
−50，4.6mm I.D.×250mm、移動層：70％アセトニトリ
ル溶液、流速：0.8ml／分、カラム温度：室温、注入
量：20μL〕と酵素キット法（ベーリンガー社製Ｆ−キ
ット製品番号716260）による測定を行い比較した。

【００４３】その結果、第５表に示すように良く一致し
た測定結果が得られた。

【００４４】

【表５】

【００４５】

【発明の効果】本発明により、新規キノン依存性フルク
トース脱水素酵素及びその製法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本酵素の最適ｐＨを示す図である。

【図２】本酵素の安定ｐＨ範囲を示す図である。

【図３】本酵素の作用温度範囲を示す図である。

【図４】本酵素の熱安定性を示す図である。

【図５】本酵素の吸収スペクトルを示す図である。

【図６】電池セルの概略図である。

【図７】ＣｏＱ₂Ｈ₂に対する測定結果を示す図である。

【図８】フルクトースに対する測定結果を示す図であ
る。

【符号の説明】

１…電池セル、２…作用極、３，５…カーボンフェル
ト、４…対極、６…隔膜、７…白金線、８…電流積算計

フロントページの続き (72)発明者 川村 吉也 愛知県江南市古知野町古渡132

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の理化学的性質を有するキノン依存
   性フルクトース脱水素酵素。 （ａ）作用：Ｄ−フルクトースを酸化してケト−Ｄ−フ
   ルクトースを生成する下記の酵素反応を触媒する。 Ｄ−フルクトース＋電子受容体 → ケト−Ｄ−フルク
   トース＋還元型電子受容体 〔電子受容体は、ＣｏＱ_n（ユビキノン；ｎは０〜10の
   整数を表す）、ベンゾキノン、フェナジンメソサルフェ
   ート、２, ６−ジクロロフェノールインドフェノール、
   ヘキサシアノ鉄(III)酸カリウムを表す。〕 （ｂ）基質特異性：Ｄ−フルクトースを良好な基質とし
   て作用する。フルクトースに対するＫｍ値（ミカエリス
   定数）は、30℃、ｐＨ5.0（マクイルベイン氏緩衝液）
   で2.1×10^-3Ｍである。 （ｃ）最適ｐＨ：最適ｐＨは、Ｄ−フルクトースを基質
   とし、ヘキサシアノ鉄(III)酸カリウムを電子受容体と
   したときはｐＨ5.0である。 （ｄ）安定ｐＨ範囲：安定ｐＨ範囲は、ヘキサシアノ鉄
   (III)酸カリウムを電子受容体としたときはｐＨ5.0から
   7.0である。 （ｅ）作用適温の範囲：10〜60℃である。 （ｆ）熱安定性：30℃、15分間の処理では約95％の酵素
   活性を有し、40℃、15分間の処理でも約45％の残存活性
   がある。 （ｇ）阻害剤：銅、ニッケル、亜鉛などの重金属により
   阻害される。 （ｈ）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法
   で測定した結果、４つのタンパク質から構成され、それ
   ぞれ約57,000、約41,000、約21,500、約16,000である。
2. 【請求項２】 アセトバクター属又はグルコノバクター
   属に属し、請求項１記載のキノン依存性フルクトース脱
   水素酵素を産生する能力を有する微生物を培地に培養
   し、培養物から前記キノン依存性フルクトース脱水素酵
   素を採取することを特徴とするキノン依存性フルクトー
   ス脱水素酵素の製造方法。
3. 【請求項３】 酸素非存在下でユビキノン−０、ユビキ
   ノン−１又はユビキノン−３からなる群より選ばれる１
   つ又は２つ以上のキノンを電子受容体として脱水素酵素
   活性を測定することを特徴とするキノン依存性フルクト
   ース脱水素酵素の活性の測定方法。