JPH0566222A

JPH0566222A - 物質の分析方法

Info

Publication number: JPH0566222A
Application number: JP25598291A
Authority: JP
Inventors: Norio Hagi; 規男萩
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1991-09-09
Filing date: 1991-09-09
Publication date: 1993-03-19

Abstract

(57)【要約】【目的】標識抗体を使用して、一度の操作で多種の物質
を同時に分析することが可能であり、しかもＢ／Ｆ分離
操作等が不要で担体への標識抗体の非特異的吸着に起因
する精度低下の恐れのない分析方法を提供する。【構成】検出可能な標識物質と結合した分析されるべき
物質に対する一価性抗体を試料と混合して液体クロマト
グラフィ−に供し、溶出する分析されるべき物質と前記
抗体との免疫複合体に関連する標識物からのシグナルを
測定することを特徴とする物質の分析方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、試料中に存在する免疫
グロブリンやリポ蛋白質等の物質を、標識物質と結合し
た一価性抗体及び液体クロマトグラフィ−の手法を用い
て分析する方法に関する。詳しくは、免疫反応による特
異性と、液体クロマトグラフィ−の簡便さを組み合わせ
た、血清等の種々の物質が混在した試料中の特定の物質
の量を分析するための方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】一般に、血清や尿等の生体試料に含有さ
れる、蛋白質等の微量物質を分析するため、ＥＩＡ（En
zyme Immuno Assay ）、ＲＩＡ（Radio Immuno Assay）
と呼ばれる免疫測定や液体クロマトグラフィ−が行われ
ている。

【０００３】免疫測定においては、例えば、まず分析さ
れるべき物質に対する適当な担体に固定化された抗体
（固定化抗体）と試料を混合することで試料中の分析さ
れるべき物質を担体上に固定化する。次に検出可能な標
識物質と結合した分析されるべき物質に対する抗体（標
識抗体）をこれと混合し、担体上に、抗体−分析される
べき物質−標識抗体からなる免疫複合体を形成させる。
そして、この免疫複合体中の標識物質量を測定するので
ある。

【０００４】免疫測定方法おいて、標識物質が測定され
ない場合には、試料中に分析されるべき物質は存在しな
いものと分析され、標識物質が測定された場合には、結
果を基にその量（濃度）を分析することが可能である。

【０００５】一方、液体クロマトグラフィ−において
は、例えば分析されるべき物質に対して親和性を有する
ゲル、イオン交換ゲル又は分子篩ゲル等を充填したカラ
ムを使用し、これに試料を供し、カラムからの溶出物を
例えば紫外線の吸収を手掛かりに測定する。この方法に
おいて、予想された溶出シグナルが測定されない場合に
は、試料中に分析されるべき物質は存在しないものと分
析され、溶出シグナルが測定された場合には、ピ−クの
高さや幅、面積等を基にその量（濃度）を分析すること
が可能である。

【０００６】

【従来技術の課題】ＥＩＡやＲＩＡ等の免疫測定方法に
よれば、正確に分析されるべき物質の有無やその量（濃
度）を知ることが可能である。しかしながらこの方法
は、一の物質に対して向けられたものである。即ち、同
時に多種の物質について分析を行うには、固定化及び標
識化抗体としてそれぞれの測定されるべき物質に対する
抗体を使用しなければならず、例えば二種類の物質の分
析に、４種類以上の抗体を仕様しなけれがならない等、
なお改善されるべき点がある。

【０００７】また免疫測定においては、担体に分析され
るべき物質を固定化し、標識物質抗体を混合した後、未
結合の標識抗体を分離するためのＢ／Ｆ（結合:Bound／
遊離:Free ）分離と呼ばれる操作が必要である点や、実
験誤差を最小限度に止めるため、先のＢ／Ｆ分離操作等
を厳密に行い、更には担体への標識抗体の非特異的吸着
を防止しなければならないのである。

【０００８】一方液体クロマトグラフィ−による分析
は、操作が簡便であり、分析されるべき物質が多種であ
っても、それらを分離し得るならば一回の操作でこれら
を分析し得るという特徴を有している。しかし、免疫測
定方法に比較した場合感度が低く、試料が血清等の多く
の物質を含むものである場合、この夾雑物により分析感
度が低下する傾向がある。特に複数の分析されるべき物
質が類似した性質を有している場合には、その量（濃
度）はおろか、その有無の分析も難しくなる。例えば、
分子篩クロマトグラフィ−を使用する場合、多種の分析
されるべき物質が類似した分子量を有している場合には
その分離は困難となる。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、血清等の
多くの物質を含む生体試料に対し、簡便な一回の操作で
多種の物質を分析し得る方法について鋭意検討を行った
結果、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、検出
可能な標識物質と結合した分析されるべき物質に対する
一価性抗体を試料と混合して液体クロマトグラフィ−に
供し、溶出する分析されるべき物質と前記抗体との免疫
複合体に関連する標識物からのシグナルを測定すること
を特徴とする物質の分析方法である。以下、本発明を詳
細に説明する。

【００１０】本発明において使用する一価性抗体は、抗
原に対する抗体価が一価の抗体であり、言い換えれば、
抗原との結合部位を一つ有するものである。一価性抗体
を使用することにより、標識抗体が２以上の分析される
べき物質と結合して巨大分子を形成することを防止でき
る。しかも、一価性抗体は通常の抗体と比較して低分子
であるため、後に説明する、形成された免疫複合体と未
反応の標識抗体の分離が正確になる。

【００１１】一価性抗体は、例えば免疫グロブリンＧ
（ＩｇＧ）等をペプシン、パパイン等の酵素及び／又は
ジチオスレイト−ル、メルカプトエタノ−ル等の還元剤
で処理することで調製できる。また、他のクラスに属す
るＩｇを使用する場合にも、同様の処理を行えば良い。

【００１２】本発明において抗体は、試料中の分析され
るべき物質との免疫反応に先立って一価性に変換されて
いれば良い。即ち、例えば試料中の分析されるべき物質
が還元剤等により影響を受け難い物質である場合には、
試料と二価性抗体を混合し、還元剤等を添加しても良
い。

【００１３】抗体は、Ｉｇクラス又はサブクラスに制限
無く使用できる。ここで、分析されるべき物質と免疫複
合体（分析されるべき物質と抗体が結合して形成され
る）の分子量の差を小さくすることが好ましく、このた
めには例えばパパインやペプシン等で処理した抗体断片
を使用すると良い。

【００１４】また抗体は、分析感度を高めるために、分
析されるべき物質に対して高い親和性を有していること
が好ましい。更に抗体は、均一な性質を有していること
がより高感度の測定を達成するために好ましい。例えば
モノクロ−ナル抗体等は、比較的高い親和性を有するも
のを調製し易く、かつ、完全に均一な性質を有してお
り、特に好ましい。なお、分析されるべき物質に対する
ポリクロ−ナル抗体は、当該物質をマウス、ヤギ、ウサ
ギ、ヒツジ等の哺乳動物に免疫することにより調製する
ことが可能であり、モノクロ−ナル抗体については、例
えばケ−ラ−らの方法（Nature,256巻、p495〜，1975
年）に従って調製することができる。

【００１５】本発明では、検出可能な標識物質と結合し
た一価性の抗体（標識抗体）を使用する。検出可能な標
識物質とは、例えば特定波長での光吸収や光発光を光学
的手段により検出し得る吸光物質、発光物質、蛍光物質
や、放射線測定により検出し得る放射性同位元素、それ
自体は直接検出できない（し難い）ものの、その量に相
関した変化を生じさせることのできる、例えばＡＴＰ等
の高エネルギ−物質（そのエネルギ−を与えることで、
他の物質に発光等を生じさせることが可能）又は酵素等
の生理活性物質（他の物質に作用することで、当該他の
物質を物質を蛍光物質等に変換することが可能）等であ
る。

【００１６】中でも、検出操作に先立って特別の準備が
必要なく、被爆等の恐れがなく、分子量が小さく、簡便
に光学的に検出し得るフルオレセイン、４メチルウンベ
リフェロン等の蛍光物質が好ましい。

【００１７】一価性抗体と標識物質との結合は、例えば
石川ら（酵素免疫測定法、第３版、医学書院）に記載さ
れたような通常の方法に従えば良い。

【００１８】標識抗体を試料と混合する操作は、単に標
識抗体を試料に添加すれば良い。しかし、標識抗体がそ
の生理学的活性等を消失する恐れのある試料について
は、試料中の分析されるべき物質が免疫学的に変性しな
い範囲で調整しても良い。

【００１９】試料に特別の制限はないが、その一例を記
載すれば、血清、尿、汗等の生体液の他、細胞培養液、
河川から採取された汚濁液等が例示できる。また試料に
ついては、本発明に先立って特別の前処理を実施する必
要はないが、例えば不溶性物質塊等が懸濁している場合
には、これらを遠心分離や膜分離処理に供して除去して
おくことが後の操作を簡便にするために好ましい。

【００２０】標識抗体と試料を混合した後、この混合液
を液体クロマトグラフィ−に供する前に、標識抗体と試
料中の分析されるべき物質が十分に反応するよう、時間
を置くと良い。放置する時間は、温度や使用する抗体の
親和性等により適宜決定することが可能であり、親和性
が高い抗体を使用することで短時間で実施できるが、場
合によっては放置の必要がないこともある。本発明者の
知見によれば、混合液が 4から10のpH範囲である場合に
は、0 からい60℃条件下で 1分から24時間放置すれば十
分である。

【００２１】なお、本発明では常に一種類の標識抗体を
使用する必要はなく、２種以上の分析されるべき物質に
対しては２種以上の標識抗体を同時に使用しても良い。
この場合、分析されるべき物質が後の液体クロマトグラ
フィ−で分離可能であれば同一の標識物質が使用でき、
これらの分離が難しく又は分離できない恐れ等がある場
合には、２種以上の異なる標識物質を使用すれば良い。

【００２２】以上の操作を終了した段階で、混合液中に
は、分析される物質が試料中に存在しなかった場合を除
き、標識物質を含む免疫複合体が生じる。

【００２３】本発明において液体クロマトグラフィ−
は、分析されるべき物質と複合体を形成した標識抗体と
複合体を形成していない標識抗体を分離し得るものであ
れば制限はない。ここで、液体クロマトグラフィ−は、
分析されるべき物質が２種以上ある場合には、これらを
も分離し得るものであることが好ましい。例えば、分析
されるべき物質の分子量が異なるのであれば、分子篩ク
ロマトグラフィ−を採用すれば良く、イオン価的に異な
るのであれば、イオン交換クロマトグラフィ−を採用す
れば良い。より具体的には、分析されるべき物質がＩｇ
ＧとＩｇＭのような場合、その分子量の差を利用するこ
とでこれらを分離し得るから、分子篩クロマトグラフィ
−を採用することが例示でき、アポ蛋白質とリポ蛋白質
を同時に分析する場合、イオン交換クロマトグラフィ−
又は分子篩クロマトグラフィ−を採用することが例示で
きる。

【００２４】しかしながら一方で、先に記載した通り、
２種以上の分析されるべき物質を同時に分析する場合に
であってこれらを完全に分離し得ない場合等には、それ
ぞれに対する標識抗体として異なる標識物質と結合した
ものを使用し、後にそれぞれの標識物質に対する検出操
作を行えば良い。

【００２５】以上に説明した液体クロマトグラフィ−に
おいて使用するゲルは、それぞれの目的に応じたゲルで
あれば良い。即ち、分子篩クロマトグラフィ−を採用す
る場合には分子篩用のゲル等を使用すれば良い。好まし
くは蛋白質成分の吸着を防止できる親水性ゲルを使用す
る。またゲルを平衝化する緩衝液は、好ましくは試料と
標識抗体の混合液と類似したpH等を有するものが好まし
い。

【００２６】一般に、高速液体クロマトグラフィ−と呼
ばれる手法によれば、通常の液体クロマトグラフィ−に
比較してより短期間に、より正確な分離を実現すること
が可能である。従って本発明においても高速液体クロマ
トグラフィ−を採用することが好ましい。

【００２７】液体クロマトグラフィ−に混合液を供する
と、時間の経過と共にゲルを充填したカラム内で少なく
とも遊離の標識抗体と免疫複合体を形成した標識抗体が
分離され、カラム外へ溶出される。

【００２８】溶出液中の標識物質を検出は、標識物質の
性質に従って適宜行えば良い。例えば標識物質が特定波
長において吸光を示す物質であれば、当該特定波長にお
ける吸光度を測定すれば良い。本発明においては、溶出
液を一定量ずつ取得した後に検出操作を行っても良い
が、高感度の分析を行うには、溶出液を直接分取するこ
となく検出操作を行うことが好ましい。

【００２９】本発明において、２種以上の分析されるべ
き物質を同時に分析するために２種以上の異なる標識と
結合した標識抗体を使用した場合には、前記したように
してその１種の標識物質を検出し、同時に又は後に他の
標識物質を検出すれば良い。例えば、それぞれ２の異な
る波長において吸光を示す異なる標識物質を使用した場
合には、励起光として白色光を使用し、溶出液透過光を
二分割する等すれば同時に２の異なる波長における吸光
度を測定することができる。

【００３０】標識物質として、例えば酵素等の、直接的
には光学的に検出できないものを使用した場合には、例
えば溶出液を一旦分取した、基質等を添加した後に検出
を行えば良い。

【００３１】この標識物質の検出の結果、測定されるべ
き物質に関連するシグナルが検出されない、即ち遊離の
標識抗体しか認められないのであれば、試料中に測定さ
れるべき物質が存在しないことが示される。具体的に、
例えば分子篩クロマトグラフィ−を採用した場合、予想
される溶出時間付近で標識物質が検出されないのであれ
ば、試料中に分析されるべき物質が存在しないことが示
される。

【００３２】一方、分析されるべき物質に関連するシグ
ナルが検出された場合には、その結果を、既知量の分析
されるべき物質について同様の操作を実施した場合の結
果と比較することにより、試料中の測定されるべき物質
の量（濃度）を知ることが可能である。ここで分析され
るべき物質に関連するシグナルとは、具体的には当該物
質と標識抗体から形成される免疫複合体に関連する標識
物質からのシグナルである。しかしながら、遊離の標識
抗体に関連するシグナルを測定することで免疫複合体に
関連する標識物質からのシグナルを知ることができる場
合、即ち使用した標識物質からのシグナルの全量が明確
である場合には、遊離の標識抗体に関連するシグナルを
測定することと免疫複合体に関連する標識物質からのシ
グナルを測定することは同一である。なお、既知量の分
析される物質について同様の操作を実施した場合の結果
を得る場合には、同量の同一標識抗体を使用する。

【００３３】

【実施例】以下に本発明を更に詳細に説明するために実
施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。

【００３４】実施例１免疫グロブリンＧの分析−１ＦＩＴＣと結合した、抗マウスＩｇＧヤギ抗体Ｆ（ａｂ
´）2 （IMMUNOSEARCH社製、以下ＦＩＴＣ標識抗体とす
る）を使用して、試料（精製マウスＩｇＧ又はマウス血
清）中のＩｇＧ量を分析した。5 μl のＦＩＴＣ標識抗
体と50μl の試料及び1 μl のβメルカプトエタノ−ル
（和光純薬（株）製）を混合し、室温で2 時間放置し
た。またこのとき、比較のためにβメルカプトエタノ−
ルを添加せずに放置する操作も別途行った。

【００３５】この混合液の1 μl を、リン酸緩衝液（pH
7.0）で平衝化した分子篩ゲル充填したカラム（東ソ−
（株）製、TSK gel G4000SW 、内径0.75cm×長さ60cm）
に供した。なお、混合液を添加後、カラムにはリン酸緩
衝液（pH 7.0）緩衝液を供した。

【００３６】カラムからの溶出液中の標識物について、
280nm の吸光度及び励起波長490nmでの520nm の蛍光強
度を同時に測定した。結果を図１及び図２に示す。

【００３７】図１、図２からは、（１）精製マウスＩｇ
Ｇ又はマウス血清自体は吸光度を有するものの、蛍光強
度を示さないこと、（２）試料として精製マウスＩｇＧ
又はマウス血清のいずれを使用した場合でも、βメルカ
プトエタノ−ルを添加しなかった場合（標識抗体が一価
性抗体ではない場合）には、マウスＩｇＧと結合した標
識物質からのシグナルと遊離の標識抗体からのシグナル
の分離が不完全であること及び（３）試料として精製マ
ウスＩｇＧ又はマウス血清のいずれを使用した場合で
も、βメルカプトエタノ−ルを添加した場合には、標識
抗体が一価性抗体に変換されるため、遊離の標識抗体か
らのシグナルがマウスＩｇＧと結合した標識抗体からの
シグナルと明確に分離し得ることが分かる。

【００３８】（１）からは、自然に発生する520nm の蛍
光はなく、本分析においてはバックグラウンドを考慮し
た補正等を行う必要がないことが分かる。（２）及び
（３）からは、一価性抗体を使用した場合には、標識抗
体の分子量が小さくなるため、遊離の標識抗体からのシ
グナルと免疫複合体からのシグナルの区別を明確にする
ことができ、特にマウスＩｇＧのように分子量15万ダル
トン程度の低分子の分析においては分析精度を高くでき
ることが分かる。また、一価性抗体を使用した場合に
は、標識抗体が２以上の分析されるべき物質と結合し、
予想以上の高分子画分からシグナルが得られる可能性を
排除できる。

【００３９】実施例２免疫グロブリンＧの分析−２ＦＩＴＣと結合させた、抗マウスＩｇＧヤギ抗体（ａｂ
´）2 （IMMUNOSEARCH社製、以下ＦＩＴＣ標識抗体とす
る）を使用して、試料（精製マウスＩｇＧ）中のＩｇＧ
量を分析した。

【００４０】5 μl のＦＩＴＣ標識抗体と50μl の試料
及び1 μl のβメルカプトエタノ−ル（和光純薬（株）
製）を混合し、室温で40、80、390 分又は3 日間放置し
た。

【００４１】この混合液の1 μl を、リン酸緩衝液（pH
7.0）で平衝化した分子篩ゲル充填したカラム（東ソ−
（株）製、TSK gel G4000SW 、内径0.75cm×長さ60cm）
に供した。なお、混合液を添加後、カラムにはリン酸緩
衝液（pH 7.0）緩衝液を供した。

【００４２】カラムからの溶出液について、280nm の吸
光度及び励起波長490nm での520nmの蛍光強度を同時に
測定した。結果を図３及び図４に示す。

【００４３】図３、４からは、本実施例で採用した試料
と標識抗体の混合条件においては、40分の放置で十分な
免疫反応が生じていることが分かる。

【００４４】

【発明の効果】本発明によれば、血液や血清等の試料に
含まれる多種の物質を対象として、一度にこれらを分析
する方法が提供される。即ち、分析しようとする物質に
対する一価性の標識抗体を予め調製しておき、これを試
料と混合し、液体クロマトグラフィ−に供することによ
り、一度に多種の物質についての分析を行うことができ
る。

【００４５】本発明では、標識抗体として一価性抗体を
使用するため、一の標識抗体が二以上の分析されるべき
物質と結合した結果、カラムからの溶出液からのシグナ
ルが３以上出現することがなく、分析されるべき物質を
より正確に定量することも可能である。分子量の小さい
一価性抗体を使用することで、特に液体クロマトグラフ
ィ−として分子篩クロマトグラフィ−を採用した場合、
分析されるべき物質と結合した標識抗体と遊離の標識抗
体との分離が容易かつ明確にされるから、本発明の分析
方法は正確な分析を実現する。断片化された一価性抗体
の使用は、より正確な分析を実現する。これは、標識抗
体と分析されるべき物質と標識抗体との複合体を比較し
た場合、分子量の差を大きくできるためである。

【００４６】かりに、多種の測定されるべき物質の分子
量が類似したものである場合にも、異なる標識物質と結
合した標識抗体を使用し、標識物質の検出を標識物質ご
とに実施することで、なお、正確な分析を実施すること
が可能である。

【００４７】また、試料と標識抗体を混合した後の放置
時間については、一般に高い親和性を有するモノクロ−
ナル抗体を使用することにより、短い時間で済ませるこ
とが可能であるから、本発明は迅速性という面でも優れ
た分析方法である。また一般にモノクロ−ナル抗体は均
一性が高いから、これを用いて既知量の分析されるべき
物質について操作を行い、その結果と未知量の分析され
るべき物質を含む試料についての操作の結果を比較すれ
ば、高精度の分析も可能である。

【００４８】本発明によれば、免疫グロブリンのクラス
（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭ）のそれ
ぞれを分析することが可能であるが、特定の物質に対し
て高い親和性を有し、他の物質に対する交差反応性が低
い、という特徴を有する抗体を使用することにより、そ
のサブクラスの分析も可能である。また例えばＩｇＧと
ＩｇＭに共通する鎖に対する標識抗体を使用すれば、両
者を同時に分析することも可能である。

【００４９】従来リポ蛋白質の分析において、イオン交
換クロマトグラフィ−や分子篩クロマトグラフィ−によ
りＨＤＬ、ＬＤＬ等の分離・分析が行われている（原一
郎ら編、血漿リポタンパク、講談社サイエンティフィッ
ク、1983年）が、その中のアポ蛋白質については別途分
析しなければならなかった（Denise Polacekら、LIPID
S、16巻 No.2 、p927、1981年）。本発明によれば、ア
ポ蛋白質に対する標識抗体を使用することにより、リポ
蛋白質及びアポ蛋白質のそれぞれについて、同時に分析
することが可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例１の結果中２８０ｎｍの吸光度
測定の結果を示すものである。図中、ａはマウスＩｇＧ
についての結果を、ｂはマウス血清についての結果を、
ｃはＦＩＴＣ標識抗体についての結果を、ｄはマウスＩ
ｇＧとＦＩＴＣ標識抗体を混合した場合の結果を、ｅは
はマウス血清とＦＩＴＣ標記抗体を混合した場合の結果
を、ｆはＦＩＴＣ標識抗体にβメルカプトエタノ−ルを
添加した場合の結果を、ｇはマウスＩｇＧとＦＩＴＣ標
識抗体の混合物にβメルカプトエタノ−ルを添加した場
合の結果を、ｈはマウス血清とＦＩＴＣ標識抗体の混合
物にβメルカプトエタノ−ルを添加した場合の結果をそ
れぞれ示す。図中、βＭＥはβメルカプトエタノ−ルの
溶出ピ−クを示し、矢印はカラムに試料を添加した位置
を示している。

【図２】図２は、実施例１の結果中、励起４９０ｎｍに
おける５２０ｎｍの蛍光強度を示すものである。図中、
ａはマウスＩｇＧについての結果を、ｂはマウス血清に
ついての結果を、ｃはＦＩＴＣ標識抗体についての結果
を、ｄはマウスＩｇＧとＦＩＴＣ標識抗体を混合した場
合の結果を、ｅははマウス血清とＦＩＴＣ標記抗体を混
合した場合の結果を、ｆはＦＩＴＣ標識抗体にβメルカ
プトエタノ−ルを添加した場合の結果を、ｇはマウスＩ
ｇＧとＦＩＴＣ標識抗体の混合物にβメルカプトエタノ
−ルを添加した場合の結果を、ｈはマウス血清とＦＩＴ
Ｃ標識抗体の混合物にβメルカプトエタノ−ルを添加し
た場合の結果をそれぞれ示す。図中、ＡはＦＩＴＣ標識
抗体の溶出ピ−クを示し、ＡＣはＦＩＴＣ標識抗体を含
む免疫複合体の溶出ピ−クを示し、Ｂはβメルカプトエ
タノ−ルにより断片化されたＦＩＴＣ標識抗体の溶出ピ
−クを示し、ＢＣは断片化されたＦＩＴＣ標識抗体を含
む免疫複合体の溶出ピ−クを示し、矢印はカラムに試料
を添加した位置を示している。

【図３】図３は実施例２の結果中、２８０ｎｍの吸光度
測定の結果を示すものである。図中、ａは試料を混合し
た直後の場合の、ｂは試料を混合した後４０分後の場合
の、ｃは試料を混合した後８０分後の場合の、ｄは試料
を混合した後３９０分後の場合の、ｅは試料を混合した
後３日後の場合の結果をそれぞれ示す。図中、βＭＥは
βメルカプトエタノ−ルの溶出ピ−クを示し、矢印はカ
ラムに試料を供した位置を示している。

【図４】図４は実施例２の結果中、４９０ｎｍにおける
５２０ｎｍの蛍光強度を示している。図中、ａは試料を
混合した直後の場合の、ｂは試料を混合した後４０分後
の場合の、ｃは試料を混合した後８０分後の場合の、ｄ
は試料を混合した後３９０分後の場合の、ｅは試料を混
合した後３日後の場合の結果をそれぞれ示す。図中、Ｂ
はβメルカプトエタノ−ルにより断片化されたＦＩＴＣ
標識抗体の溶出ピ−クを示し、ＢＣは断片化されたＦＩ
ＴＣ標識抗体を含む免疫複合体の溶出ピ−クを示し、矢
印はカラムに試料を添加した位置を示している。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】検出可能な標識物質と結合した分析される
べき物質に対する一価性抗体を試料と混合して液体クロ
マトグラフィ−に供し、溶出する分析されるべき物質と
前記抗体との免疫複合体に関連する標識物からのシグナ
ルを測定することを特徴とする物質の分析方法。
【請求項２】更に、既知量の測定されるべき物質を含む
試料について同様の操作を行った測定結果と得られた測
定結果を比較する操作を含む、請求項１に記載の物質の
分析方法。
【請求項３】分析されるべき物質が免疫グロブリンであ
る、請求項１に記載の物質の分析方法。
【請求項４】分析されるべき物質がリポ蛋白質である、
請求項１に記載の物質の分析方法。
【請求項５】液体クロマトグラフィ−が分子篩クロマト
グラフィ−である、請求項１に記載の物質の分析方法。
【請求項６】抗体がモノクロ−ナル抗体である、請求項
１に記載の物質の分析方法。
【請求項７】抗体が、断片化された一価性抗体である、
請求項１に記載の物質の分析方法。