JPS6364746B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生体液中の物質を定量的に測定するた
めの均一系分析方法に関する。詳しくは酵素を標
識した抗原あるいは抗体を用い、抗原抗体反応を
行なわせ、会合の結果生ずる酵素活性の変化を主
として光学的に測定し、それより目的の抗原ある
いは抗体を定量する均一系の分析方法に関する。
なお、本発明における会合とは物質が酵素の周辺
に局在的に酵素活性に変化をおよぼす程度に集ま
ることをいう、例えば生物学的反応である免疫学
的凝集反応あるいは凝集素による凝集反応や化学
的架橋反応による凝集反応をいう。

従来から免疫学的手法により抗原抗体反応を利
用し生体液中の物質を測定する方法は種々考えら
れてきた。例えば古くは毛細管沈降法、免疫比濁
法、ネフエロメトリツクイムノアツセイ、ラテツ
クス凝集法、シングルラジアルイムノデイヒユー
ジヨン等直接沈降あるいは凝集を測定する方法や
近くはラジオイムノアツセイ、あるいは謂以エン
ザイムイムノアツセイのように抗原あるいは抗体
に標識を施し微量の成分を正確に測定することが
開発され盛に利用されている。しかしこれらの方
法はいずれも一長一短があり感度に問題があつた
りまたは操作が煩雑であつたり放射性物質の処理
に問題があるなど通常の臨床検査の場においては
不便なものである。

本発明者等は上述の観点から種々研究を重ねた
結果抗原あるいは抗体に標識された酵素が単独の
場合と抗原抗体反応で会合が起つた場合とで酵素
活性に違いが現われ会合の進むに伴つて酵素活性
が増加することを発見し本発明を完成した。本発
明に従つて標的物質とその物質に特異的結合性を
有する受容体のいずれか一方に酵素を結合させた
ものを用い、会合していない標的物質と受容体で
は酵素活性が阻害されるような基質の濃度で、標
的物質と受容体との会合反応を行なわせ、その結
果生ずる酵素活性の変化から標的物質を分析定量
する方法が提供される。

本発明は上述の通り免疫学的会合による酵素活
性が会合の度合により定量的に増加することに基
づき会合が全くない状態ではその酵素活性が阻害
され発現しないような基質濃度を選ぶことにより
均一分析方法を可能にした。

本発明による酵素活性の変化は極めて鋭敏で、
非常に僅かの会合物質の量的変化に比例して起る
ので生体成分中の微量物質の定量が可能である。
本発明の方法は抗原抗体反応を酵素を用いて均一
系で測定する面から見れば従来のホモジニアスエ
ンザイムイムノアツセイと類似の方法と考えられ
るが、従来のものは抗原抗体反応により基質が酵
素の活性部位に結合できなくなるという立体障害
を利用して均一系の測定を可能にしたものである
のに対し、本発明の方法は会合による酵素活性の
発現に対する変化に基づいている点で反応機構を
全く異にする新規な方法である。よつて従来不可
能であつた高分子抗原を低分子の基質を用いて測
定することも可能となつた。酵素活性の変化は酵
素標識抗体に標的物質である抗原が１分子結合し
た時点より始まり、凝集反応あるいは会合の進行
に対して酵素活性の変化も大きくなるためポリエ
チレングリコール等の反応促進剤を加えることは
測定時間の短縮に有効である。

本発明に用いられる酵素には種々の酵素が考え
られ、それらより適当な酵素を選ぶことは研究者
としてさほど困難ではない。たとえばペルオキシ
ダーゼは好適な酵素の一つである。

また、本発明の酵素活性の測定方法は公知の方
法が使用できるが、ペルオキシダーゼについては
基質として至適濃度より過剰かつ遊離の酵素を完
全に阻害する濃度の過酸化物、たとえば過酸化水
素または過酸化尿素を用い、水素供与体としてフ
エノール類たとえばフエノール、パラクロロフエ
ノールなどを、またそのフエノールに対応する酸
化縮合剤としてたとえば４−アミノアンチピリン
を用い発色の吸光度を測定して行なうことができ
る。この方法は本発明に適用できる最も有効な方
法である。

酵素標識抗原あるいは抗体の調製には公知の試
薬が使用できる。たとえば、グルタルアルデヒ
ド、カルボジイミド、ビスマレイド、２個の異な
る官能基を有する試薬等があり、また、ペルオキ
シダーゼの糖鎖を過沃素酸で酸化してアルデヒド
基にする方法も有効である。これらの試薬を用い
抗原あるいは抗体の反応性を保つた状態で酵素を
標識する。

本発明の測定の対象となる標的物質はその分子
量に制限はないが、標的物質の種類に応じて多数
の測定の方法がある。以下例としてそのいくつか
を示すが、本発明はこれに制限されるものではな
い。

１ 競合反応の利用 (i) 低分子抗原を酵素標識抗原を用いて測定する
場合： 抗原分子上に認識し得る１コの抗原決定基をも
つ抗原たとえばステロイドホルモン、各種薬剤等
は酵素１分子に抗原２分子以上を結合した酵素標
識抗原を調製する。

標的物質すなわち標的抗原とその抗体にさらに
酵素標識抗原を加え競合的に凝集反応を起させる
と、標的抗原の量の函数として酵素活性が測定さ
れるので標準曲線を用い標的抗原の量を定量する
ことができる。この場合酵素標識抗原は多価抗原
と同様の働きをする。

(ii) 高分子抗原を酵素標識抗原を用いて測定する
場合： 蛋白質のように高分子の抗原の場合は同一抗原
上に認識し得る抗原定基が複数個あるので酵素に
結合する抗原は１分子以上であればよい。この場
合も１−(i)と同様の操作で競合反応を起させると
標的抗原を測定することができる。

２ 非競合反応の利用 (i) 高分子抗原を酵素標識抗体を用いて測定する
場合： 認識し得る２つ以上の抗原決定基をもつものは
これらを標的抗原として測定するときはこの抗原
に対する抗体に酵素を標識する。標的抗原と酵素
標識抗原との間に凝集反応を起させると抗原抗体
間に立体的な結合が進行して凝集の度合が大きく
なり酵素活性が大きく変化する。従つてこの酵素
活性の変動から標的抗原を測定することができ
る。この場合には均一系であるにも拘わらず、競
合反応による測定ではない。

(ii) 抗体を測定する場合： 低分子抗原に対する抗体は１−(i)、高分子抗原
に対する抗体は１−(ii)の酵素標識抗原を用いて未
知量抗体との間に凝集反応起させ、その結果生ず
る酵素活性の変化から抗体量を測定することがで
きる。

抗原抗体の凝集反応はその一方の量を変化させ
ると両者の比が最適比を得るために他方の量は必
然的に変化する。この性質を利用して酵素標識抗
体に標識をしていない抗体を加えることにより標
的抗原の測定範囲を変えることができる。すなわ
ちあらかじめ酵素標識抗体に適当な既知量の抗体
を加えておき、その混合液を標的抗原に加え抗原
抗体反応を行なわせ酵素活性を測定すると添加し
た未標識抗体が多い程測定範囲が標的抗原の高濃
度側に移動する。これによつて検体を希釈するこ
となく通常の濃度範囲の測定系に合せて測定する
ことができる。

既知量の酵素標識抗体を用い非競合的に抗原と
反応させる場合、抗原過剰域では凝集反応が起こ
りにくく、酵素活性の変化が小さくなる。このこ
とは測定する物質の存在する範囲が広い場合、た
とえばα−フエトプロテインの血中濃度測定のよ
うな場合には、測定可能な範囲に検体を希釈しな
くてはならない不便さを生じる。このような場合
には、既知量の酵素標識抗体と未知量抗原を反応
させ、反応終了後に既知量の未標識抗体を加え、
更に反応を行なうと広い範囲にわたる測定が可能
になる。次に実施例によりさらに詳しく本発明を
説明する。

実施例 １ 牛血清アルブミン（以下BSAという）の競合
的均一系測定 ａ 西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下HRPと
いう）標識BSAの調製： HRP5mgをナカネ等の方法（The J.of
Histochem.＆Cytochem.、22−12、1084〜
1091、1974）によりその糖鎖をアルデヒド基化
しその３mgと結晶化BSA（シグマ社製品）５mg
をPH9.5炭酸緩衝液中で25℃において２時間反
応後、セフアデツクスＧ−200カラムを用いて
分画し酵素標識抗原を得た。

ｂ BSAの測定： 5.4％のポリエチレングリコール6000（以下
PEGという）を含む食塩加リン酸緩衝液（PH
7.0、以下PBSという）で調製したBSAの希釈
系列より0.05mlをそれぞれ試験管にとり、１−
ａ）で調製した酵素標識抗原0.02mlをそれぞれ
に加え、次いでBSA抗体（ダコ社製品）0.02ml
を加えて37℃において15分間反応後、0.5mM4
−アミノアンチピリン、50mMフエノール、
35mM過酸化水素からなる基質呈色液2.5mlを
加え、37℃において５分間反応後、波長500nm
により吸光度を測定する。結果を第１図に示
す。この結果よりBSA濃度が高くなるほど競
合的に凝集反応が低下し、酵素活性が減少する
ことが明らかで、抗原濃度による標準曲線が得
られた。

実施例 ２ α−フエトプロテイン（以下AFPという）の
非競合的均一系測定 ａ 抗AFP抗体Ｆ（ab′）₂画分の調製： 西等の方法（Cancer Res.、30、2507〜
2513、1970）により臍帯血清より抽出し精製し
たAFPをフロイントの完全アジユバントと等
量混合し、ウサギに免疫して抗AFPウサギ血
清を得た。この抗血清よりエベレイ等の方法
（J.Solid−phase Biochem.、２、45〜78、
1977）によつて抗体を精製した。0.1M酢酸緩
衝液（PH4.5）に対して透析した抗体に２％重
量のペプシン（ベーリンガー社製品）を加え37
℃において48時間消化した後、セフアデツクス
Ｇ−200カラムを用いて抗AFP抗体Ｆ（ab′）₂画
分を得た。

ｂ マレイミド基導入HRPの調製： 実施例１−ａ）の方法に準じてHRP9mgとテ
トラメチレンジアミン15mgを結合させ、アミノ
基を導入したHRPを得た。このアミノ基導入
HRP2.3mgに北川らの方法（臨床化学、６巻、
３号、178−186、1978）によりメターマレイミ
ドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル（ピアスケミカル社製品）1.8mgを加
え30℃において30分間反応させた後、セフアデ
ツクスＧ−25カラムを用いて分画しマレイミド
基を導入したHRPを得た。

ｃ 酵素標識抗体の調製： ２−ａ）で調製した抗体Ｆ（ab′）₂に最終濃度
12.5mMの２−メルカプトエチルアミンを加え
90分間反応後セフアデツクスＧ−25カラムを用
いて分画して得られた抗体Fab′6mgに実施例２
−ｂ）で調製したマレイミド基導入HRP1.5mg
を加え37℃において30分間反応後、室温で一夜
静置した。これをセフアデツクスＧ−200カラ
ムを用いて分画し酵素標識抗体を得た。

ｄ AFPの測定： PBSで調製したAFPの希釈系列より0.05mlを
それぞれ試験管にとり、10％のPEGを含む
PBS0.02mlと実施例２−ｃ）で調製した酵素標
識抗体0.02mlをそれぞれに加え37℃において15
分間反応させた後、実施例１−ｂ）と同じ基質
呈色液2.5mlを加え、37℃において５分間反応
後、波長500nmにより吸光度を測定した。

測定結果を第２図に示す。この結果より
AFP濃度が高くなるほど非競合的に凝集反応
が進み、酵素活性が増加することを示す標準曲
線が得られ、均一系非競合反応によつて高感度
で特異的な分析方法が確立された。

実施例 ３ 測定範囲の調整 PBSで調製したAFPの希釈系列より0.05mlをそ
れぞれ試験管にとり、10％のPEGをPBS0.02mlを
それぞれに加える。実施例２−ｂ）で調製した酵
素標識抗体と抗AFPウサギ血清のPBS希釈液を
等量混合した溶液0.04mlを上記反応液それぞれに
加え15分間反応後、実施例１−ｂ）と同様の方法
で酵素活性を測定した。

加えた抗血清の量と測定範囲の関係を第３図に
示す。酵素標識抗体にあらかじめ未標識抗体を加
えておくことにより測定範囲が変化することがあ
きらかとなり、生体成分の通常濃度範囲に測定系
を合わせることが可能となつた。

実施例 ４ 測定範囲の拡大 実施例３と同様のPEGを含むAFPの希釈系列
それぞれに実施例２−ｂ）で調製した酵素標識抗
体0.02mlを加え37℃において15分間反応させた。
反応液それぞれに抗AFP血清0.02mlを加え、更に
15分間反応後、実施例１−ｂ）と同様の方法で酵
素活性を測定した。

抗体を後から加えた場合と加えない場合の標準
曲線を第４図に示す。この結果より後から抗体を
加えた場合測定範囲が広くなることが明らかにな
つた。

上述の通り本発明は生体液中の微量成分を均一
系で正確に測定する新規な測定方法であり、その
応用範囲は広く極めて有用である。さらに付言す
れば本発明における酵素活性に変化をおよぼす会
合反応は抗原抗体凝集反応に限定されるものでは
ない。また酵素活性の測定には比色ばかりでなく
螢光による方法も含まれる。

【図面の簡単な説明】

第１図はBSAの競合的均一系測定による標準
曲線を示す。第２図はAFPの非競合的均一系測
定による標準曲線を示す。第３図は酵素標識抗体
に予め抗AFP血清を加え、測定に用いた場合の
標準曲線を示す。図中の数字は抗血清の希釈倍数
を示す。第４図は酵素標識抗体と抗原の反応後、
抗AFP血清を加え、更に反応した場合の標準曲
線A_b ⁺と抗AFP血清を加えない場合の標準曲線
A_b ^-を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 標的物質とその物質に特異的結合性を有する
   受容体のいずれか一方に酵素を結合させたものを
   用い、会合していない標的物質と受容体では酵素
   活性が阻害されるような基質の濃度で、標的物質
   と受容体との会合反応を行なわせ、その結果生ず
   る酵素活性の変化から標的物質を分析定量する方
   法。 ２ 酵素としてペルオキシダーゼを用い、ペルオ
   キシダーゼの活性を基質として過剰の過酸化物、
   水素供与体としてフエノール類、このフエノール
   類に対する酸化縮合剤を用いて測定することから
   なる特許請求の範囲第１項記載の方法。