NO164135B - Immunometrisk metode for bestemmelse av et hapten, samt analysesett for utfoerelse av metoden. - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrører en bestemmelse av haptener

ved en metode hvor merket antistoff blir brukt til å måle konsentrasjonen av haptener i biologiske prøver.

Fremgangsmåter for immunobestemmelser er vidt anvendt

til å måle molekyler med spesifikke komponenter i biologiske prøver, spesielt blodprøver fra pasienter for prognostiske, diagnostiske eller andre kliniske formål. For tiden gjør de viktigste immunokjemiske, analytiske metoder bruk av radioaktive isotoper, molekyler med fluorescerende eller bioluminescente egenskaper eller enzymer som fremmer farveforandringer, som bestemmelsessignal. Disse blir hovedsakelig referert til som markør.

Antistoffene (immunoglobulinene) anvendt til immunokjemisk analyse er inntil nylig blitt produsert i form av antisera i dyr (f .eks., kaniner eller sauer) ved immunisering med et antigen, som vanligvis, er selve stoffet som skal analyseres eller en analog til dette, som fremmer produksjonen av antistoffer som gjenkjenner stoffet som skal analyseres.

I tilfellet med små molekyler, kalt haptener, er den sistnevnte tilnærming spesielt viktig, fordi molekyler med molekylvekt mindre enn omtrent 5000 dalton ikke er naturlig immunogene og må bli konjugert til et større bærermolekyl som vanligvis er et protein, f..eks. bovint serumalbumin eller tyroglobulin. Antistoffene tilstede i antisera dannet mot hvert av de konjugerte haptener viser polyvalens; dvs. flere populasjoner av antistoffer er tilstede i antisera, og hver av dem gjenkjenner forskjellige aspekter av molekylkonfigurasjonen til det konjugerte hapten. Antistoffene er derfor forskjellige i spesifisitet. Denne diversiteten av antistoffer tilstede i et gitt antiserum kan av og til være fordelaktig, spesielt når antigenet er et stort protein, idet det forenkler dannelsen av store antistoff-antigenkomplekser som er i stand til presipitering. Imidlertid, hvis rene fremstillinger av spesifikke antistoffer kreves, som i tilfellet med immunometriske bestemmelser, må komplekse fremgangsmåter for rensing anvendes, og hovedsakelig er disse av begrenset effektivitet. Nylig er disse problemer blitt overvunnet ved utvikling av teknikker for produksjon i stor skala av monoklonale hybridom-celler som utskiller et enkelt antistoff med helt spesiell affinitet og spesifisitet for et gitt antigen. Imidlertid er to eller flere antistoffer som gjenkjenner forskjellige aspekter av et hapten med en molekylvekt på mindre enn 2000 dalton (f.eks. stereoider og mange medikamenter) ute av stand til samtidig å binde seg til et enkelt haptenmolekyl, og dette har begrenset anvendelsen av merket antistoff (immunometriske )-immunobestemmelsef for de fleste lavmolekylvekt-forbindelser.

I konvensjonelle immunobestemmelser biir et rent preparat av stoffet som skal analyseres, eller en analog til dette koblet til en passende markør, hvis egenskaper bestemmer den anvendte påvisningsmetode.' For eksempel blir i en radioimmunoassay en radioaktiv isotop anvendt som markør, og den kan kvantifiseres i én væske eller et krystallscintillasjons-spektrometer.

Dette merkede stoff som skal analyseres, eller analog til dette, kan inkubéres ved en fast konsentrasjon med en fast mengde antistoff som gjenkjenner det merkede stoff like godt som selve stoffet som skal analyseres. Konkurranse mellom merket og umerket stoff om antistoffbindingsstedet forekommer derfor, og mengden av merket stoff bundet av antistoffet, vil være omvendt proporsjonal med mengden av ét tilstedeværende umerket stoff. De dannede antistoffbundne komplekser blir separert, f.eks. ved immunoabsorpsjon, fysikalsk-kjemisk adsorpsjon eller presipitasjon av enten antistoffbundne komplekser eller det ubundne stoff som skal analyseres (merket eller umerket). Det antistoff bundne* merkede stoff blir så målt, og en standardkurve blir konstruert fra kjente konsentrasjoner (standarder) av stoffet som skal analyseres. Konsentrasjonen av stoffet som skal analyseres i en ukjent prøve kan avleses fra denne kurven. I tilfellet av immunobestemmelser for små molekyler er den merkede ligand, det merkede stoff som skal analyseres eller et derivat av stoffet (analogt) som kan. være kova-lent bundet til en markør. Det er imidlertid stort sett en grense for antall markører som kan bli bundet til et lite molekyl, og denne er stort sett begrenset av dets størrelse. Videre kan derivatdannelse■av små molekyler eller innføring av markører av relativt stor molekylstørrelse (f.eks. 125I eller et enzym) påvirke affiniteten av antistoffet for det merkede stoff som skal analyseres, i forhold til dets affinitet for umerket stoff, på en slik måte at den begrenser anvendbarheten av spesielle antistoffer, f.eks. antistoffer som gjenkjenner sidekjedederi-vatet, og forårsaker en såkalt broeffekt. Det sistnevnte problem kan overvinnes ved anvendelse av antistoffer (monoklonale eller polyvalente) som viser liten affinitet for sidekjedederi-vatet av haptenet, eller ved å anvende et sidekjedederivat som er forskjellig fra det som ble brukt for å danne antigenet.

Immunometriske bestemmelser involverer anvendelse av merkede antistoffer i stedet for det merkede stoff som skal analyseres og er spesielt anvendbare til målinger av store molekyler, f.eks. proteiner, som har to eller flere adskilte antigensteder, eller epitoper. I denne type bestemmelse blir én eller flere antistoff-populasjoner brukt som "fangende antistoff", som kan bli immobilisert på en fast-fasebærer eller kan bli immunopresipitert med et annet antistoff som er rettet spesifikt mot det. Det sistnevnte er bare mulig hvis "det fangende antistoff" blir dannet i en art som er forskjellig fra "det merkede antistoff". Det "merkede antistoff" er en ren fremstilling av én eller,flere antistoff-populasjoner som fortrinnsvis gjenkjenner en epitop(er) som er forskjellig fra det "fangende antistoff", selv om dette ikke er nødvendig. Under inkubering med standardmengder av analytt, eller

ukjente konsentrasjoner av analytt i biologiske prøver, blir det formet et "sandwich" mellom det "fangende antistoff", analysanten og det "merkede antistoff". Derfor, i. nærvær av over-skuddsmengder av både "fangende" og "merket" antistoff, er mengden av "merket antistoff" festet til et slikt "sandwich" direkte proporsjonal med mengden av det tilstedeværende stoff som skal analyseres, og gir derved grunnlaget for en kvantita-tiv måling.

Immunometriske teknikker tilbyr tallrike fordeler i forhold til konvensjonelle kompetitive immunobestemmelser, f.eks. fjerner de behovet for rene fremstillinger av det merkede stoff som skal analyseres. Anvendelsen av overskuddsreagenser reduserer også nødvendigheten av presisjonspipettering av reagenser, øker reaksjonskinetikk og reduserer derved inkuberingstidene. Imidlertid er det bare nylig at viktigheten av denne teknikken fullt ut er blitt verdsatt, spesielt siden produksjonen av monoklonale antistoffer betraktelig har forenklet problemet med å produsere store mengder antistoffer med helt spesiell

spesifisitet.

Ikke desto mindre er anvendelsen av merket antistoff i immunometriske bestemmelser for lavmolekylvekthaptener blitt begrenset, stort sett fordi det kan være sterisk umulig for mer enn ett antistoff å reagere med et lite molekyl ad gangen.

Et forsøk på å overvinne dette problem har vært gjort ved

å immobilisere haptener konjugert til proteiner (forskjellig

fra dem som er anvendt til antigene formål) til en "fastfase"-bærer, se europeisk patentpublikasjon nrl 0028132. Dette muliggjør en konkurrerende reaksjon for å finne et bindingssted for merket antistoff mellom analytt og proteinkonjugert hapten; se europeisk patentpublikasjon nr. 0028133 og britisk patent-skrift nr. 1550320. Derfor, under betingelser hvor en fast mengde protein-konjugert-hapten og merket antistoff blir anvendt, er mengden av merket antistoff som er i stand til å binde seg til det proteinkonjugerte hapten, omvendt proporsjonalt med mengden av tilstedeværende stoff som skal analyseres, i standarder eller ukjente prøver. Selv om denne type fremgangsmåte gjør det mulig å anvende merkede antistoffer i immunobestemmelser for små molekyler, influerer delvis mengden av proteinkonjugert hapten tilført til systemet på bestemmelsesområdet og sensi-tiviteten, og de relative mengder av proteinkonjugert hapten tilstede i de enkelte prøverør eller kuvetter bestemmer (i stor utstrekning) nøyaktigheten av bestemmelsen. Dette er et spesielt problem fordi effektiviteten av passiv eller aktiv adsorpsjon av proteinmolekyler til fastfase-bærere er upålitelig og vanskelig å kontrollere. Videre trenges store mengder proteinkonjugert hapten, hvis karakteristika kan forandre seg fra forsøk til forsøk.

Problemene ovenfor blir overvunnet ved den foreliggende oppfinnelse, i henhold til hvilken et proteinkonjugert hapten blir fremstilt ved å bruke et protein (f.eks. tyroglobulin) som er forskjellig fra det som ble anvendt til å konjugere haptenet med det formål å danne antistoffer mot haptenet (f.eks. bovint serumalbumin). Det konjugerte hapten kan bli anvendt til affinitetsrensing av underpopulasjoner av antistoffet fra et antiserum som viser liten gjenkjennelse overfor området av haptenet utenom den som er tilstede i det (forskjellige) hapten^ konjugatet mot hvilket antiserumet ble dannet, hvis det samme sidekjede-derivatet blir anvendt. I tillegg kan en forskjellig sidekjede også bli anvendt idet dette vil eliminere binding av antistoffer som gjenkjenner og binder seg til selve sidekjeden. Imidlertid er hovedfunksjonen av det konjugerte hapten å virke som en bærer for haptenet som er fritt til å konkurrere med stoffet som skal analyseres om merket antistoff-bindingssteder i en væskefase, i kraft av det faktum at proteinet (tyroglobulin) kan bli immunokjemisk separert ved et overskudd av antistoffer rettet mot det (f.eks. antityroglobulin-antiserum), og som kan bli festet til en fastfase-bærer. På denne måten blir en fast mengde av proteinkonjugert hapten inkubert sammen med et merket antistoff i nærvær av variable mengder av standarder eller ukjente serum-prøver. Mengden av merket antistoff bundet til det proteinkonjugerte hapten vil være omvendt proporsjonalt med mengden av stoff som skal analyseres i standardene eller ukjente prøver. De proteinkonjugerte haptenmerkede antistoffkomplekser blir spesifikt fjernet fra inkubatene immunokjemisk ved antistoffer mot proteinet. Disse sistnevnte antistoffer kan absorberes til veggene av reaksjons-karet/røret eller koblet til en fast-fasebærer og separert fysikalsk etter en kort inkuberingsperiode.

Oppfinnelsen tilveiebringer følgelig en immunometrisk fremgangsmåte for bestemmelse av et hapten, hvorved det fremstilles en blanding som inneholder (1) haptenet som skal bestemmes, (2) et merket antistoff mot nevnte hapten og (3) et konjugat av nevnte hapten med en makromolekylær haptenbærer, i slike forhold at haptenet (1) og haptenkonjugatet (3) binder

seg til haptenbindingsstedene i det merkede antistoff (2), og mengden av markør som er bundet til det immobiliserte haptenkonjugat (3) bestemmes, og det karakteristiske ved fremgangsmåten er at det anvendes en makromolekylær haptenbærer i haptenkonjugatet (3) som er ulik den haptenbærer som ble anvendt for fremstilling av antistoffet (2), og at haptenkonjugatet (3) omsettes med et overskudd av det immobiliserte antistoff som er spesifikt for den makromolekylære haptenbærer.

Den foreliggende oppfinnelse muliggjør også affinitetsrensing av polyvalente antistoff-populasjoner fra et antiserum som bare gjenkjenner epitoper som er helt spesielle for stoffet som skal analyseres og ikke sidekjede-derivatet av haptenet som skal analyseres. Dette blir oppnådd ved å binde haptenet til et protein (f.eks. tyroglobulin) som er forskjellig fra det som ble anvendt til immuniseringsformål (f.eks. bovint serumalbumin). Tyroglobulinhaptenet blir immobilisert- på f.eks. cyanogenbromid-aktivert Sepharose 4B CL, og antisera dannet mot et haptenkonjugat, f.eks. bovint serumalbumin-hapten, blir inkubert med et annet, immobilisert haptenkonjugat, f.eks. tyroglobulinhapten, slik at antistoffene mot haptenet selv blir selektivt immobilisert. Etter nøye vasking av tyroglobulinhapten-affinitetmatriksen blir antistoffene som,viser størst affinitet for de områder som er felles for haptenet og stoffet som skal analyseres, og ikke sidekjede-derivatet, fjernet fra tyroglobulinhapten-affinitetmatriksen ved konkurranse med overskudd av stoff som skal analyseres, som deretter blir fjernet fra antistoffet ved dialyse eller fysisk adsorpsjon. Dette muliggjør produksjon av antistoffer som har en høy grad av spesifisitet for det hapten det gjelder.

I den foreliggende oppfinnelse kan en hvilken som helst type protein eller syntetisk polypeptid som er i stand til å fremkalle en immunrespons, brukes til å konjugere haptenet.

I tillegg kan en hvilken som helst forbindelse av små molekyler, naturlig eller syntetisk (f.eks. et medikament, hormon eller andre biologisk aktive lavmolekylvekt-forbindelser) måles ved oppfinnelsens teknikk.

Den beskrevne separasj onsmetode (idet man f.eks. bruker immobilisert antityroglobulin-antistoff) kan også anvendes overfor andre proteiner eller syntetiske molekyler og kan utvides til å inkludere andre antistoffsystemer hvor et immobilisert antistoff kan bli brukt til å binde og separere antistoffer rettet mot proteinet brukt til å konjugere haptenet.

Oppfinnelsen tilveiebringer også et analysesett for anvendelse ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, som er karakterisert ved at det inneholder (1) et merket antistoff mot nevnte hapten; (2) et konjugat av nevnte hapten med en makromolekylær bærer forskjellig fra den som ble anvendt ved dannelse av merket antistoff (l); (3) middel for immobilisering av nevnte haptenkonjugat (2); og (4) kalibreringsstandarder for haptenet som skal bestemmes.

Midlet for immobilisering av haptenkonjugatet som anvendes i bestemmelsesmetoden, er fortrinnsvis et antistoff overfor ikke-haptenepitopene av nevnte konjugat som selv er festet til en fast bærer, f.eks. innsiden av et plastrør anvendt i bestemmelsen eller et inert pulver slik som kaolin. Alternativt kan et annet bindeagens slik som avidin anvendes, og i dette tilfelle kan avidin bindes til en fastfase og haptenet kan bli biotinylisert, (dvs. bundet' til biotin)' eller omvendt (haptenet kan være bundet til avidin og fastfasen bli biotinylisert.

Markøren anvendt i den nye metoden kan være en hvilken

som helst markør som vanligvis anvendes i immunometriske og lignende bestemmelsesmetode, f.eks. en radioisotop, et enzym eller et fluorescerende, fosforiserende, luminiserende eller spinn-merket molekyl.

Metoden i henhold til oppfinnelsen kan utføres som

vist skjematisk i fig. 1 i de medfølgende tegninger.

Først blir et stahdardstoff. som skal analyseres, dvs. prøven av- haptenet som skal- bestemmes som har en kjent konsentrasjon, eller et ukjent stoff som skal bestemmes, blandet med protein-koblet hapten og merket antistoff til haptenet (dannet mot et protein som er forskjellig fra det anvendte proteinhapten-k<p>njugat). Det gis også et antistoff overfor proteinet tilstede i protein-haptenkonjugatet immobilisert ved tilsetning til en fast bærer, vist som den indre overflaten av røret (f.eks.

av polystyren) anvendt i bestemmelsen. I løpet av inkubering fester haptenkonjugatet seg til det immobiliserte antistoff. Haptenet i stoffet som skal analyseres og haptenet bundet til den faste bærer konkurrerer om merket antistoff slik at en del av markøren blir immobilisert og resten (som fester seg til haptenet i analysanten) ikke blir det.. Ved avhelling av veeskefasen blir følgelig bare den immobiliserte markør, som kan måles, igjen. Ved å bruke en rekke av stoffer med kjent haptenkonsentrasjon kan en standardkurve for analysert stoff dannes, hvorfra mengden av hapten i en ukjent prøve kan avleses.

Følgende eksempel illustrerer oppfinnelsen.

EKSEMPEL

Duplikate 50ul alikvote mengder av humane serumstandar-der som inneholder kjent mengde progesteron (0, 1, 10,- 30, 100 og 300 nmol/1) ble inkubert (i 10 min ved 20°C) i polysty- ,

125

renrør sammen med 100 ul I-merket monoklonalt anti-progeste-.

ron antistoff (100 000 cpm i bestemmelsesbuffer, dvs. fosfat-bufret saltvann som inneholder fosfat (0,25 nmol/1), 0,9% NaCl, 0,625% Laktose, 0,125% bovint gammaglobulin, 0,05% natriumazid, pH 7,6). Det monoklonale antistoff var blitt produsert mot progesteron-11-hemisuksinat:bovint serumalbumin og renset fra kulturmedium ved protein A-Sepharose-affinitetkromatografi. Alikvote mengder (100 pl) av et progesteron-11-hemisuksinat: bovint tyroglobulinkonjugat (1 nmol/1 i bestemmelsesbuffer)

ble tilsatt til alle unntatt to rør. Disse to rør ble anvendt til å kontrollere ikke-spesifikk binding og inneholdt 50 ul av det laveste progesteron standardserum (0 nmol/1). 1 25I-merket monoklonalt antistoff og bovint tyroglobulin (100 ul, 1 nmol/1 i bestemmelsesbuffer). Etter en videre inkubering (i 30 min ved 20°C) ble 100 ul kaninantibovint tyroglobulin antiserum (1:500 i bestemmelsesbuf fer) tilsatt, til alle rør, som så ble vortex-blandet og inkubert i 30 min ved 20°C. Alikvote mengder (1 ml) av kaolin-esel anti-kanin-antiserum ble tilsatt til alle rør og, etter en videre periode på 30 min ved 20°C ble disse sentrifugert (2000g i 10 min). Supernatanten ble helt av, og resten ble talt i en multikildegammateller. En standardkurve ble dannet, som vist i fig. 2. På denne figuren står B/Bq for den prosentvise binding av standardene (minus ikke-spesifikk binding) sammenlignet med maksimum binding (null standard: BQ) minus ikke-spesifikk binding.

Hvis en lignende bestemmelse ble utført ved å bruke en prøve som inneholder en ukjent mengde progesteron, gjør bestemmelsen av den prosentvise binding (B/Bq) oppnådd for prø-ven, det mulig å avlese konsentrasjonen av progesteron i prøven fra denne kurven.

Claims (3)

1. Immunometrisk fremgangsmåte for bestemmelse av et hapten, hvorved det fremstilles en blanding som inneholder (1) haptenet som skal bestemmes, (2) et merket antistoff mot nevnte hapten og (3) et konjugat av nevnte hapten med en makromolekylær haptenbærer, i slike forhold at haptenet (1) og haptenkonjugatet (3) binder seg til haptenbindingsstedene i det merkede antistoff (2) , og mengden av markør som er bundet til det immobiliserte haptenkonjugat (3) bestemmes, karakterisert ved at det anvendes en makromolekylær haptenbærer i haptenkonjugatet (3) som er ulik den haptenbærer som ble anvendt for fremstilling av antistoffet (2), og at haptenkonjugatet (3) omsettes med et overskudd av det immobiliserte antistoff som er spesifikt for den makromolekylære haptenbærer.

2. Analysesett for anvendelse ved bestemmelse av et hapten ved en fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at det inneholder (1) et merket antistoff mot nevnte hapten, (2) et konjugat av nevnte hapten med en makromolekylær bærer som er ulik den som ble anvendt ved fremstilling av det merkede antistoff (1) , (3) middel for immobilisering av nevnte haptenkonjugat (2) og (4) kalibreringsstandarder for haptenet som skal bestemmes.

3. Analysesett som angitt i krav 2, karakterisert ved at middel (3) for immobilisering av haptenkonjugatet (2) er et antistoff mot nevnte makromolekylære haptenbærer, idet antistoffet er bundet direkte eller indirekte til den faste bærer.