JPH04500009A - 遺伝子機能の多価リプレッサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子機能の多価リプレッサー １、分野 この発明は、ウィルス遺伝子発現の分野に関するものであって、より具体的には ＨＴＬＶ〜■のｒｅｘ（ピリオンタンパク質発現の調節因子）遺伝子、およびＨ Ｉ　ｖ−Ｉ　のｒｅｖのようなその他のレトロウィルス種におけるこれと同等な 遺伝子の表現型の発現に関するものである。

２、発明の背景 ウィルス、特にヒト免疫不全１型ウイルス（ＨＩＶ−１）またはヒト白血病Ｉ型 ウィルス（ＨＴ　Ｌ　Ｖ−１）のようなヒト・レトロウィルスは、極めて重篤な 疾患の原因となる因子である。ＨＩＩＩの場合の後天性免疫不全症候群（ＡＩＤ Ｓ）、およびＨＴＬＶ−Ｉの場合の成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）および熱帯性症 れん性バラペプシスとして知られる非ガン状態がこれに該当する。ＨＴＬＶ−Ｉ Ｉは、病因掌上、ある種の異型Ｔ細胞毛状細胞性白血病に関連している。どちら のウィルス群も、ＤＮＡウィルスと同様に、その複製周期が遺伝子発現の「早期 」相および「後期」相に分かていれる。遺伝子発現の「早期」相は調節タンパク 質の発現によって特徴付けられるが、「後期」相では構造タンパク質が合成され る。

ＨＴＬＩＩゲノムは、Ｔａｘと呼ばれるウィルス転写の活性化因子を暗号化して いる。ＨＩＩＩにおいてＴａｘに相当するものはＴａｔと呼ばれる。Ｔａｘおよ びＴａｔは、主としてウィルス遺伝子発現のためのレトロウィルスＬＴＲ（末端 反復配列）に作用するようである。またＨＴＬｖ−ＩはＲｅｘと呼ばれるウィル ス構造遺伝子発現の活性化因子を暗号化している。機能的なＲｅｘタンパク質は 、スプライスされていないウィルスｍＲＮＡの感染細胞の核から細胞質への移送 を増大するのに働く。これらのｍＲＮＡ種は、そこでウィルスのゲノムを組立て 、構造タンパク質を暗号化する。

ヒト免疫不全１型ウイルス（ＨＩＶ−１）は、Ｒｅｖと呼ばれる相同タンパク質 を暗号化している。ｒｅｖ遺伝子生産物は、ＨＴＬＶ−１系におけるＲｅｘと同 様にＨＩＶ〜１の構造タンパク質の発現に絶対に必要である。

これに関してその根底に存在している理由は、ｒｅｖ遺伝子の生産物（および他 のウィルス種におけるこれに対応する生産物）が、感染細胞におけるウィルスｍ ＲＮＡ転写物をスプライスする様式の選択に対して劇的な効果を有していること である。ＲｅｖおよびＲｅｘの場合、この効果は転写後調節、即ち完全鎖長のｍ ＲＮＡ転写物の細胞質への移送促進によって達成され、それによってＨＩＶ−１ のＧａｇおよびＥｎｖのようなウィルス構造タンパク質の発現が開始され、それ にと同時に調節タンパク質の発現が抑制され（例えばＲｅｘについては、Ｍ、ヒ ダ力ら、ＥＭＢ○・ジャーナル、７巻、［１９８８年］、５１９頁参照］、また は調節される（例えばＲｅｖについては、Ｍ、Ｈ，７リムら、ネーチャー、３３ ５巻、［１９８８年］、１８１頁参照）。したがってＲｅｖは、ウィルス調節タ ンパク質（ＴａｔおよびＲｅｖ等）を暗号化している完全にスプライスされたＨ ＩＶ−１ｍＲＮＡの発現には必要でない。

ＨＩＶ−１における上記の誘導選択性は、Ｒｅｖ機能に必要なＲｅｖ応答要素（ ＲＲＥ）と呼ばれるＲＮＡ標的配列に起因する。ＲＲＥは、ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺 伝子内に存在する巨大な２３４ヌクレオチドＲＮＡの二次構造と一致している。

ＨＴＬＶ−１におけるこれと同等の構造は、Ｒｅｘ応答要素（ＲｅｘＲＥまたは ＲＲＸ）と呼ばれる。Ｒｅｖは、配列に特異的な態様でＲＮＡの核放出を調節す ることが判明した最初のタンパク質であろうと思われる。

Ｒｅｘを例にとって説明すれば、ＨＴＬＶ−１ｇａｇおよびｅｎＶ遺伝子発現の 調節の際のＲｅｘタンパク質の完全な機能には、少なくとも３種類の機能的に異 なった活性要素、即ち、核および核小体局在化（細胞質のすべてのタンパク質合 成部位から核へ移送され、その核小体領域で濃縮される能力）、ウィルスＲＮＡ 　（複数）におけるＲｅｘＲＥ　（ＲＲＸ）配列の特異的認識（直接的または間 接的な）およびＲｅｘＲＥ配列を含む部分的にスプライスされたウィルスｍＲＮ Ａ種の核小体から細胞質への放出を実質上仲介しているこの調節タンパク質の、 現在なお未知の活性であるＲｅｘエフェクター活性が必要である。

これらの完全なＲｅｘ機能の要素活性を備えているＲｅｘタンパク質（即ち、機 能的ドメイン）における構造局在化に関してこの発明以前に知られていることは 、Ｒｅｘのアミン末端の最初の２０アミノ酸でプラスに荷電しているペプチドド メインが核小体局在化に必要であるということだけである（Ｈ，シオミら、セル 、５５巻、［１９８８年］、１９７〜２０９頁）。

上記のように、ＨＴＬＶ−Ｉに対するｒｅｘ遺伝子生産物およびＨＩＶ−１に対 するｒｅｖ遺伝子生産物は、いずれもウィルスの複製に必要である（例えばＨＩ Ｖについては、Ｅ、ターライリガーら、ジャーナル・オブ・ピロロジー、６２巻 、［１９８８年］、６５５頁参照）。ＲｅｘおよびＲｅｖの決定的な重要性は、 それらがその−次構造の相違にもかかわらず、機能的に関連しており、またＨＴ ＬＶ−Ｉ　Ｒｅｘは他のウィルス種、即ちＨＩＶ−１でもその機能を発揮できる 事実によって強調される（Ｌ、リムスキーら、ネーチャー、３３５巻、［１９８ ８年コ、７３８頁コ。即ち、たとえ−ＲｅｖおよびＲｅｘがヌクレオチドおよび アミノ酸水準でなんら有意な相同性を共有せず、 −ＲＲＥのヌクレオチド配列、およびそのステム構造およびループ構造がＨＴＬ Ｖ−１のＲｅｘＲＥ　（ＲＲＸ）と異なっており、−ＲｅｘおよびＲｅｖタンパ ク質の二次構造のコンピューターによる予測がなんら有意な相似性を示さず、− Ｒｅｖタンパク質が結合するのと同じように、Ｒｅｘタンパク質がＲＲＥの同一 部分へ結合しないようであっても、それにもかかわらず、ＨＩＩＩ系で、Ｒｅｖ タンパク質をＲｅｘタンパク質で置き換えることが可能であり、さらにごく最近 ＨＩＶ−２Ｒｅｖ　（Ｒｅｖ２）をＨＴＬＶ−Ｉ　ＲｅｘおよびＨＩＶ−１Ｒｅ ｖで置き換えることができ、また類似のＨＴＬＶ−ＩＩ調節タンパク質をＨＴＬ Ｖ−Ｉ　Ｒｅｘで置き換えできることが判明した。この相補性は、例えば機能的 なＲｅｘタンパク質をトランスで提供することによってｒｅｖ欠損型ＨＩＶ−１ プロウイルスを十分救援し得るものである。これに反して、ｒｅｘ欠損型ＨＴＬ Ｖ−１プロウイルスを機能的なＲｅｖタンパク質によって救援する逆置換はでき ないようである。即ち、この点に関して完全な対称性はない。この互換性の欠如 に対する原理はまだ解明されていないが、恐ら（は標的ＲＮＡ配列認識に必要な これらのタンパク質の機能的な態様の相違に関連するのであろう。

調節タンパク質における突然変異は、優性な負の表現型を有する遺伝子生産物を 野生型機能へ産生し得る（Ｉ　ヘルスコビッツ、ネーチャー、３２９巻［１９８ ７年Ｌ　３１７頁）。関連のない数種のウィルスで最近発見されたトランス優性 リプレッサーとして知られる少数の優性な負の突然変異体タンパク質の一群は、 新しい型の抗ウィルス剤であると言われる。遺伝子分析では、負の突然変異は遺 伝子機能の低下もしくは喪失を起こすものである。優性な負の突然変異体は、変 異されなかった（即ち、野生型配列を有する）同一遺伝子の異なったコピーが好 適に機能することを防止するものである。これに反して、劣性の負の突然変異は 野生型の相手をそのように抑制しない。また優性突然変異の幾つかは、その変異 体と野生型遺伝子が同一染色体（ＤＮＡまたはＲＮＡ分子）上に位置している場 合に限り、野生型遺伝子を抑制する。この場合、この抑制型突然変異を「シス− 作用型」であると言う。一方、ある優性突然変異では、対応する野生型遺伝子が 離れた染色体上に存在している場合でもこれを抑制し得る。この型を「トランス −作用型」優性突然変異、または一層簡単にトランス優性突然変異として分類す る。

これらの所謂トランス優性遺伝子の幾つかは、真核生物またはヘルペスウィルス の転写因子の遺伝子に関連して報告された（１．Ａ。

ホープおよびに、ストラール、セル、４６巻、［１９８６年］、８８５頁、Ｒ， ゲンツら、サイエンス、２４３巻、［１９８９年］、１６９５頁、Ｓ、Ｊ、）リ ーインバーグら、ジーンズ・アンド・デベロップメント、２巻、［１９８８年コ 、７１８頁、Ａ、　Ｄ、フリートマンら、ネーチャー、３３５巻、［１９８８年 ］、４５２頁）。すなわち、単純ヘルペスウィルス・トランス−活性化因子ＶＰ １６のある種の欠失変異体は過発現されるとＶＰ１６機能を抑制し、それによっ て正常な許容細胞でのＨ５Ｖ−１の複製を阻止する。またレトロウィルスに関し 、例えばＨＴＬＶ−ＩＩのＴａｘタンパク質について（Ｗ、ワックスマンら、サ イエンス、２３５巻、［１９８７年］、６７４頁）、またこの発明の優先臼当日 以後において、ＨＩＶ−１ｔａｔ遺伝子（Ｍ、グリーンら、セル、５８巻、［１ ９８９年］、およびｇａｇ遺伝子（Ｄ、ト０）ら、セル、５９巻、［１９８９年 ］、１１３頁）についてトランス優性突然変異体が報告された。

これら２つの調節タンパク質の構成および機能における相違点から、Ｒｅｘ構造 をＲｅｖタンパク質またはその既知の突然変異体の構造と比較しても、ウィルス タンパク質のトランス優性リプレッサーを産生し得る突然変異体を選択する指針 は全く提供されないことが分かる。

上記の概念の治療適用の意味は、遺伝子操作によって優性な負の突然変異を作り 出し、それによって得られた遺伝子が、それが発現されると、野生型機能の活性 を破壊する突然変異体の調節タンパク質を暗号化していることによって、有害遺 伝子生産物の生産もしくは過生産を抑制することであろう（■　ヘルスコビッツ 、ネーチャー、３２９巻、［１９８７年］、２１９頁）。このようにウィルス感 染、例えばレトロウィルス感染状態では、不可欠な調節遺伝子に類似の抑制因子 、例えばｒｅｖまたはｒｅｘ遺伝子の抑制因子を組み立てることによって、対応 するウィルス機能のトランス優性リプレッサーを提供することは極めて望ましい ように思われる。この研究方法、即ち１９８８年に最初に提案されたウィルス感 染処置のための研究方法（Ｄ、バルチモア、ネーチャー、３３５巻、［１９８８ 年］、３９５頁コは「細胞内免疫」に必要な手段を提供するはずである。

３　発明の要旨 ＨＴＬＶ−１ｒｅｘ遺伝子および対応するＨＩＶ−１ｒｅｖ遺伝子の遺伝子操作 による優性転換体を作成した。その生産物は、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴ　Ｌ　Ｖ−Ｉ Ｉ、またはＨＩＶ−１の複製をそれぞれ阻止した。またｒｅｘまたはｒｅｖ遺伝 子の遺伝子操作によるこれらの優性転換体の幾つかの生産物は、ＨＴＬＶ−Ｉ　 （および若干のＨＴＬＶ−ＩＩ　例）オヨＵＨＩ　Ｖ−１（Ｊ６ヨＵ若千（ｒ） ＨＩ　Ｖ−２およびＳＩＶ例）の複製を双方とも阻止した。

この成績は、１種類以上のウィルス種で作用するウィルス性リプレッサー生産物 、即ち１種類以上のウィルス種の機能的に等価な遺伝子の表現型発現を抑制する トランス優性な遺伝子生産物が生じることを報告した最初のものであろうと思わ れる。

このようにこの発明は、１種類以上のウィルス種の機能的に等価な遺伝子の表現 型発現をトランス優性に抑制し、それによって１種類以上のウィルス種の複製を 阻止するタンパク質を暗号化している遺伝子、特に以下に報告するｐｃＲｅｘＭ ２、ｐｃＲｅｘＭ７およびｐｃＲｅｘＭ８、Ｍ６、Ｍ７およびＭ１３、およびｐ Ｍｌｏにおける突然変異遺伝子に関するものである。

コノ発明はまた、ＨＴＬＶ−１および／またはＨＴＬＶ−ＩＩのｒｅｘ遺伝子の 表現型発現をトランス優性に抑制するタンパク質を暗号化している遺伝子、なら びにＨＩ　ＩＩおよび／またはＨＩ　Ｖ−２および／またはＳＩＶのｒｅｖ遺伝 子の表現型発現をトランス優性に抑制するタンパク質を暗号化している遺伝子に 関するものであって、特に以下に報告するｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐ ｃＲｅｘＭ８、ｐｃＲｅｘＭ１７およびｐｃＲｅｘ１３Δ１５、ｐＭ１０１ｐΔ ９／１４、ｐΔ１０／１４．９Ｍ２１．９Ｍ２２、ｐＭ２７．９Ｍ２８、ｐＭ２ ９およびｐＭ３２、およびＭ６、Ｍ７およびＭ２Ｓにおける突然変異体遺伝子に 関するものである。

この発明はまた、好適な発現系から対応する野生型遺伝子を単離し、この遺伝子 を好適なりローニング系へ加え、所望の突然変異を該遺伝子へ導入し、所望の突 然変異を保有するクローンから、生じた突然変異遺伝子を回収することを含むこ れらの遺伝子の生産方法に関する。この発明はまた、好適な発現系および増幅系 で上記の突然変異遺伝子を発現し、これを増幅して、発現した生産物を回収する ことを含む上記のタンパク質の生産方法に関する。

この発明はまた、１種類以上のウィルス種の機能的に等価な遺伝子の表現型発現 をトランス優性に抑制し、それによって１種類以上のウィルス種の複製を阻止す るタンパク質、特に以下に報告するｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７およびｐｃ ＲｅｘＭ８、Ｍ６、Ｍ７およびＭ２Ｓ、およびｐＭｌｏの突然変異体タンパク質 に関するものである。

コノ発明はまた、ＨＴＬＶ−Ｉ　およＵ／＊たはＨＴＬＶ−ＩＩ　（Ｄｒｅｘ遺 伝子の表現型発現をトランス優性に抑制するタンパク質、およびＨＩＶ−１およ び／またはＨＩｖ−２および／またはＳＩｖのｒｅｖ遺伝子の表現型発現をトラ ンス優性に抑制するタンパク質に関するものであって、特に以下に報告するｐｃ ＲｅｘＭ２、ｐ　ｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ８、ｐｃＲｅｘＭ１７およびｐｃ Ｒｅｘ１３Δ１５、ｐＭｌｏ、］）Δ９／１４、ｐΔ１０／１４．９Ｍ２１．９ Ｍ２２、ｐＭ２７．９Ｍ２８、ｐＭ２９およびｐＭ３２、およびＭ６、Ｍ７およ びＭ２Ｓの突然変異体タンパク質に関する。

またこの発明は、生体内または生体外で、上記の遺伝子を標的哺乳動物細胞へ機 能的な状態で送達するのに好適な形で含んでいるベクター、例えばレトロウィル スベクターまたはプラスミドベクターに関する。

またこの発明は、上記の遺伝子またはタンパク質を、所望の予防的または治療的 効果を達成する好適な形で、例えば患者の身体から採取し、再挿入する前に生体 外で処理した細胞の形で、製薬上許容し得る担体または希釈剤とともに含有する 医薬組成物に関する。

またこの発明は、上記の遺伝子またはタンパク質を、所望の予防的または治療的 効果を達成するのに好適な形で、例えば患者の体から採取し、再挿入する前に生 体外で処理した細胞の形で、そのような処置を必要とする対象へ投与することを 含んでなるウィルス感染の処置方法に関する。

「処置」の語は、ウィルス感染の予防的および治療的処置の意味であって、ここ で「治療的」とはウィルス感染を潜伏段階で安定化させることを含む。

またこの発明は、ここに定義した遺伝子、タンパク質およびＤＮＡセグメントの 医薬品としての使用に関する。

またこの発明は、機能的な断片または誘導体、即ち機能的に等価である断片また は誘導体の形の上記の遺伝子およびタンパク質に関する。「機能的な断片または 誘導体」の語は、インタクトな突然変異遺伝子またはタンパク質の薬理学的活性 と質的に同一で、量的に同一または異なった、即ちインタクトな突然変異遺伝子 またはタンパク質の薬理学的活性より一層強いかまたは弱い、例えば約１％〜約 １００００％、特に約１０％〜約１０００％の薬理学的活性を有する断片または 誘導体を意味する。

またこの発明は、本明細書に示した遺伝子、タンパク質およびＤＮＡセグメント から誘導され、トランス優性（即ち、上記の突然変異体ＲｅｘまたはＲｅｖタン パク質で、主としてＲＮＡ結合ドメイン）を真似ることができる低分子量の抑制 因子または中和モノクローナル抗体のような抑制因子に関する。ここで低分子量 とは約１０ｋＤ以下の分子量、ことに約１ｋＤ以下の分子量を意味する。

この発明はさらに、以下に挙げる諸態様に関する。

−第１および第２ドメインを含んでなるＨＩＶ−Ｉ　Ｒｅｖ機能のトランス優性 リプレッサー。ここで第１ドメインは野生型ＨＩＶ−Ｉ　Ｒｅｖの特異的結合機 能を実質上保有し、第２ドメインは野生型ＨＩＶ−Ｉ　Ｒｅｖの活性化機能を保 有せず、また第２ドメインは１またはそれ以上の突然変異体によって野生型ＨＩ Ｖ−ＩＲｅｖから修飾されたものであり、好ましくは第１ドメインは野生型Ｒｅ ｖのおよそのアミノ酸位置１０〜およそのアミノ酸位置６８からなり、修飾され た第２ドメインは野生型Ｒｅｖのおよそのアミノ酸位置６８〜およそのアミノ酸 位置９０から誘導され、ことに上記の１またはそれ以上の突然変異は、野生型Ｒ ｅｖのおよそのアミノ酸位置６８とおよそのアミノ酸位置９０の間、好ましくは 約７８〜約８６の間、特に約７８〜約８３または約８４の間で起こるミスセンス 変異または欠失変異であって、野生型ＨＩＶ−１Ｒｅｖの第１ドメインの特異的 結合機能は、実質上機能的に残存し、特に以下に報告するリプレッサーｐＭ１０ 、ｐＭ２１、ｐＭ２２、ｐＭ２７、ｐＭ２８．９Ｍ２９およびｐＭ３２、および 機能的なその断片または誘導体である。

−野生型ＨＩＶ−Ｉ　Ｒｅｖの特異的結合機能を実質上保有する第１ドメインを 含んでいるＨＩＶ−Ｉ　Ｒｅｖ機能のトランス優性リプレッサー。このトランス 優性リプレッサーは野生型ＨＩＶ−ＩＲｅｖの活性化機能を有せず、好ましくは 第１ドメインは野生型Ｒｅｖのおよそのアミノ酸位置１０〜およそのアミノ酸位 置６８を含んでおり、トランス優性リプレッサーは野生型Ｒｅｖのおよそのアミ ノ部位１ｔ６８〜少なくともおよそのアミノ部位１９０を欠いている、特に以下 に報告するリプレッサーｐΔ９／１４およびｐΔ１０／１４、または機能的なそ の断片または誘導体である。

−ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｒｅｘタンパク質の機能のトランス優性リプレッサーを暗号化 しているＤＮＡセグメント。このリプレッサーは、Ｒｅｘタンパク質のエフェク ター活性を有する野生型Ｒｅｘタンパク質のペプチドドメインにおいて、少なく とも１種類のトランス優性な負の突然変異によってＲｅｘタンパク質の野生型か ら修飾されたものであり、このリプレッサーは、Ｒｅｘタンパク質の野生型形態 の核小体局在化活性を実質上保有しており、好ましくは野生型Ｒｅｘタンパク質 のペプチドドメインが、およそのアミノ酸位置５９〜およそのアミノ酸位置１２ １、特に５９．６０．６４．６５．１１９．１２０および１２１のアミノ酸位置 の任意の１つに含んでいるＤＮＡセグメント、特に下記の突然変異体ｒｅＸ遺伝 子、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ１３、およびＨＴＬＶ−Ｉ　Ｒｅｘタンパク質機能のトラン ス優性な抑制を示すその変異体および誘導体の何れかを含んでいるＤＮＡセグメ ント。

−野生型形態から、好ましくはＨＩＶ−１ｒｅｖタンパク質の機能またはＨＴＬ Ｖ−ＩＩ　Ｒｅｘタンパクの機能の何れかの抑制能を保有するように修飾された ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｒｅｘタンパク質機能の対応するトランス優性リプレッサー。

−（ｉ）−Ｒｅｘタンパク質によって認識される調節応答要素、および少なくと も１個の未使用のスプライス部位（即ち、スプライス認識配列によって結合され 、ただし該ｍＲＮＡからスプライスされたものではない領域またはイントロン） を含んでいるｍＲＮＡを暗号化しているＤＮＡセグメント、−発現すると、核か らのｍＲＮＡの放出を誘発するタンパク質生産物を生産することが可能なｒｅｘ 遺伝子を暗号化しているＤＮＡセグメント、 −ｒｅｘ遺伝子を暗号化しているＤ　Ｎ　ＡセグメントおよびｍＲＮＡを暗号化 しているＤＮＡセグメントによって形質転換され、ｒｅｘ遺伝子のタンパク質生 産物発現能およびｍＲＮＡ発現能を保有する宿主を含んでなる遺伝子系を提供し 、（ｉｉ）　この遺伝子系の細胞を含んでいる培養を、Ｒｅｘタンパク質の特異 的抑制因子であることが疑われる因子が細胞へ侵入するような条件下で、該因子 と接触させ、（ｉｉｉ）　未使用のスプライス部位を含んでいるｍ　ＲＮ　Ａの 核からの放出に対するこの因子の効果を測定し、（ｉｖ）　スプライス部位を使 用したｍＲＮＡのスプライス形態の核からの放出に対する該因子の効果を測定し 、それによって未使用のスプライス部位を含んでいるｍＲＮＡの放出が低下し、 それと同時にｍＲＮＡのスプライス形態が低下しなければ、該因子がＨＴＬＶ− １ｒｅｘ遺伝子の活性またはｒｅｘ遺伝子生産物の活性の特異的な抑制因子、即 ち、Ｒｅｘタンパク質ニヨッテ認識サレす、好まＬ＜はＨＴＬＶ−１，ＨＴＬＶ −ＩＩおよびＨＩＶ−１から選ばれたウィルスのｍＲＮＡから誘導されたｍＲＮ Ａ調節要素であることを示す 段階を含んでなるＲｅｘタンパク質の遺伝子活性化機能の特異的抑制因子の同定 方法。

一未使用のスプライス部位を含んでいるｍＲＮＡで暗号化された第１タンパク質 の生産水準を測定することによって、好ましくは未使用のスプライス部位を含ん でいるｍＲＮＡの放出の低下を検出し、ｍ　ＲＮ　Ａのスプライス形態で暗号化 された第２タンパク質の生産水準を測定することによって、好ましくはｍＲＮＡ のスプライス形態の放出の増大を検出する上記の同定方法。

−調節応答要素およびスプライス部位を含んでいるｍＲＮＡが、ＲｅｘおよびＴ ａｘタンパク質のコード領域、完全なｅｎｖ遺伝子、Ｒｅｘ応答要素および３” 　ＬＴＲ全体を含んでいるＨＴＬＶ−１プロウイルスの３′末端を含んでなるプ ラスミド、好ましくは下記に説明するプラスミドｐｇＴＡＸ−ＬＴＲによって暗 号化されており、好ましくはｒｅｘ遺伝子をプラスミドｐＲｅｘへ提供すること からなる上記の同定方法。

−プラスミドｐｇＴＡＸ−ＬＴＲ。

−Ｒｅｘタンパク質によって認識される調節応答要素を含んでいるｍＲＮＡ、お よび少なくとも１個の未使用のスプライス部位を暗号化しているＤＮＡセグメン ト、 一発現されると、核からのｍＲＮＡの放出を誘発するタンパク質生産物を生産す ることが可能なｒｅｘ遺伝子を暗号化しているＤＮＡセグメント、 −ｒｅｘ遺伝子を暗号化しているＤＮＡセグメント、およびｍＲＮＡを暗号化し ているＤＮＡセグメントによって形質転換された細胞であって、ｒｅｘ遺伝子の タンパク質生産物発現能およびｍＲＮＡ発現能を保有する宿主細胞を含有する容 器を含んでなる上記の同定方法によってＲｅｘタンパク質の遺伝子活性化機能の 特異的抑制因子を同定するためのスクリーニング用試薬キット。

−ＨＩ　Ｖ−１、ＨＴＬＶ−１，またはＨＴＬＶ−ＩＩウィルスのうちの１つを 複製する能力を有する細胞へ上記のＤＮＡセグメントを導入して、該ＤＮＡセグ メントを発現し、ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｒｅｘ機能のトランス優性リプレッサーを生産 することを含むこれらのウィルスの複製を抑制する方法。

−ＨＩＶ−１で感染した細胞へＨＩｖ−Ｉ　Ｒｅｖ機能のトランス優性リブレツ ーを導入することを含むＨＩＶ−１、ＨＩ　Ｖ−２およびＳＩＶ、特にＨＩＶ− １の複製の抑制方法。

４、図面の説明 ［４，１］　５．１および６．１項のための図面第１図：ＨＴＬＶ−Ｉ　ｒｅｘ のヌクレオチドおよびアミノ酸配列［オリゴヌクレオチドによって置換されたア ミノ酸位置（１）（アミノ酸位置８７．８８．８９）および（２）（アミノ酸位 置９４）、およびアミノ酸位置８２．９０，９１．９７を番号で示した］。

完全配列は５６７個のヌクレオチドを含んでおり、１８９個のアミノ酸を暗号化 している。

第１Ａ図・ＨＴＬＶ−Ｉ　ｒｅｘ遺伝子へ導入した２９ケ所の突然変異の位置ｃ ＨＴＬＶ−１ｒｅｘ遺伝子は１８９個のアミノ酸タンパク質を暗号化している。

部位特異的突然変異誘発法を用い、特定のアミノ酸残基でミスセンス置換を導入 しく枠で囲んで示す）、ｒｅｘ遺伝子内の位置にしたがってそれぞれ命名した。

第２Ａ図：Ｒｅｘ免疫沈降 Ｒｅｘ免疫沈降後、３０種のｒｅｘ突然変異体のうち７種のＳＤＳ／ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動分析（ｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ８ 、ｐｃＲｅｘＭ１３、ｐｃＲｅｘＭ１４、ｐｃＲｅｘＭ１７およびｐｃＲｅｘ１ ３Δ１５は、なおＲｅｘタンパク質を生産していることが判る）。

Ａ、ｐｇｔａｔ　（Ｒｅｘ抗体の陰性対照）Ｂ、ｐｃＲｅｘ Ｃ，ｐｃＲｅｘＭ２ Ｄ、ｐｃＲｅｘＭ７ Ｅ、ｐｃＲｅｘＭ８ Ｆ、ｐｃＲｅｘＭ１３ Ｇ、ｐｃＲｅｘＭ１４ Ｈ，ｐｃＲｅｘＭ１７　（このレーンにおける低分子量は、恐らく例えばリン酸 化によるこのタンパク質の修飾の変化に起因するものであろう） １、ｐｃＲｅｘ１３Δ１５ 第２Ｂ図：突然変異体の生物学的表現型第２Ａ図関連、Ｔａｔ免疫沈降後。

Ａ、ｐｇｔａｔ十ｐＸＦ３ Ｂ、ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ Ｃ，ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ Ｄ、ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘＭ２ Ｅ、ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘＭ７ Ｆ、ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘＭ８ Ｇ、ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘＭ１３ Ｈ，ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘＭ１４ １、ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘＭ１７ Ｌ　ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ１３Δ１５第２Ｃ図・第２Ｂ図関連（幾つかのＲｅ ｘ突然変異体、即ちｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ８、ｐｃＲ ｅｘＭ１４、ｐｃＲｅｘＭ１７およびｐｃＲｅｘ１３Δ１５は、野生型Ｒｅｘよ りもトランス優性である） Ａ、ｐｇｔａｔ＋ｐＸＦ３＋ｐＸＦ３ Ｂ、ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲ，ｅｘ＋ｐＸＦ３Ｃ，ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐｃＲ ｅｘＭ２Ｄ、ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐｃＲｅｘＭ７Ｅ、ｐｇｔａｔ十ｐｃＲ ｅｘ＋ｐｃＲｅｘＭ８Ｆ、ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐｃＲｅｘＭ１３Ｇ、ｐｇ ｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐｃＲｅｘＭ１４Ｈ，ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐｃＲｅ ｘＭ１７１、ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐｃＲｅｘ１３Δ１５第２Ｄ図：第２Ｂ 図関連（幾つかのＲｅｘ突然変異体、即ちｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐ ｃＲｅｘＭ８およびｐｃＲｅｘＭ１３は、野生型Ｒｅｖよりも部分的にトランス 優性である）Ａ、ｐｇｔａｔ＋ｐＸＦａ＋ｐＸＦ３ Ｂ、ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐＸＦ３Ｃ０ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐｃＲｅ ｘＭ２Ｄ、ｐｇｔａｔ十ｐｃＲｅｖ＋ｐｃＲｅｘＭ７Ｅ、ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅ ｖ＋ｐｃＲｅｘＭ８Ｆ、ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐｃＲｅｘＭ１３Ｇ、ｐｇｔ ａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐｃＲｅｘＭ１４Ｈ，ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐｃＲｅｘ Ｍ１７１、ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐｃＲｅｘ１３Δ１５第３図：組み立てら れたＲｅｘ突然変異体第４図：ｒｅｘ暗号配列を突然変異誘発するために合成さ れた２９種のオリゴヌクレオチド配列 ［４，２］　５．２および６２項のための図面第５図：ＨＩＶ−１ｒｅｖ遺伝子 へ導入された突然変異の位置。

ＨＩＶ−１ｒｅｖ遺伝子は予測した配列で示される１１６個のアミノ酸タンパク 質を暗号化している。ｒｅｖの２つの暗号エキソン間の境界を示す（Ｓ　Ｐ）。

オリゴヌクレオチドの指令による突然変異誘発によって、集中発生させた点変異 （ｐＭ）を導入した（枠で囲って示した残基）。これらの突然変異は、Ｒｅｖ内 のそれぞれの位置によって、最もＮ−末端をｐＭｌ、最もＣ−末端をｐＭｌ４と 命名した。導入された突然変異は、すべて２〜４個の隣接アミノ酸に影響を与え 、すべて（ｐＭ７を除いて）独特のＢｇｌｌＩ部位をｒｅｖ遺伝子配列へ導入し た。これらの導入部位は、それに続くＮ−およびＣ−末端の欠失（ｐΔ）変異体 の組み立てを促進した。ｐΔ変異体は欠失の範囲によって命名されミ例えばｐΔ １１／１４は導入したｐＭｌｌおよびｐＭ１４突然変異の間を欠失している。

第５ＡＩｍ：ＨＩＶ−１　ｒｅｖ遺伝子へさらに導入されたミスセンスおよび欠 失変異の位置（−は欠失したアミノ酸）。

第６図・ｐｃＲＥＶのＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列。

第７図：突然変異部位Ｍ１〜Ｍ１４に対応するＤＮＡ配列。

第８図：ＨＩＶ−１ｒｅｖおよびｔａｔのトランス−活性化因子の免疫沈降。

第９図　ＨＩＶ−１プロウイルスの救援検定。

第１０図：間接免疫蛍光法によるＲｅｖおよび選ばれたＲｅｖ突然変異体の亜細 胞位置測定。

第１１Ａおよび１１８図：Ｒｅｖ突然変異体の優性な負の表現型分析。

第１２図：　Ｒｅｖ機能の競合抑制。

第１２Ａ図・ＨＩＶ−１ｒｅｖ）ランス−活性化因子のドメイン構造。１１６個 のアミノ酸の完全鎖長タンパク質は、ウィルスのｅｎｖ遺伝子と極めて符合する イントロンによって分割された２つのエキソンによって暗号化されている。「結 合」および「活性化」ドメインは、それぞれ（およそ）２３〜５６および７８〜 ８３の残基を含んでおり、ハツチング枠で囲って示す。Ｓはスプライス部位。

ＮＬは、ｒＡｒｇに富んだＪ　ＲＮＡ結合モチーフによってかなりの独自性を共 有している核局在化に重要な高塩基性領域。

［４，３］　５．３および６．３項のための図面第１３図。

（Ａ）ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｒｅｘタンパク質のアミノ酸配列および導入された２５ケ 所の点変異の個々の位置。それぞれ枠組みで囲ったアミノ酸を暗号化しているヌ クレオチドを除き、アスパラギン酸−ロイシン−ジペプチドを暗号化したオリゴ ヌクレオチドで、枠組みのまま置き換えた。

（Ｂ）Ｒｅｘ応答性ｐｇＴＡＸ−ＬＴＲ発現ベクターの構造。Ｈｉ　ｎ　ｄ　Ｉ ＩＩ部位〔マツプ位置５０１３（Ｍ、セイキら、プロシーディングズ・オブ・ザ ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８０巻、 ［１９８３年］、３６１８〜３６２２頁）］から３’　ＬＴＲまでのＣＲ−Ｉ　 ＨＴＬＶ−Ｉプロウィルスの３゛末端を、ｐ　Ｂ　Ｃ１２／ＣＭＶ発現ベクター へ挿入した。この断片は、Ｔａｘの２つの暗号エキソン（白枠）、完全なｅｎｖ 遺伝子、およびＲｅｘＲＥ　（ＲＲＸ）を含んだＨＴＬＶ−１の３’　ＬＴＲの 全体を含んでいる（Ｓ、Ｍ、ハンリーら、ジーンズ・アンド・デベロップメント 、３巻、［１９８９年］、１５３４〜１５４４頁）Ｃ 第１４図。

（Ａ）ＲｅｘはｐｇＴＡＸ−ＬＴＲベクターによってＨＴＬＶ−Ｉ　Ｅｎｖタン パク質の発現を活性化する（ＲｅｖまたはＩ　Ｌ−２は活性化しない）。ＣＯ８ 細胞の亜集密的培養を、ｐｇＴＡＸ−ＬＴＲとｐＲＥＸ　（Ｌ、リムスキーら、 ネーチャー、［１９８８年コ、７３８頁）　、ｐＲＥＶ　（Ｍ、Ｈ、マリムら、 ネーチャー、３３５巻、［１９８８年］、１８１〜１８３頁）、またはｐＣＭＶ −ＩＬ−２（Ｂ、Ｒ，カレン、セル、４６巻、［１９８６年コ、９７３〜９８２ 頁）で、同時トランスフェクトした。最終レーンは、ｐｇＴＡＸ−ＬＴＲの存在 なしでｐＲＥＸで細胞をトランスフェクトしたものである。Ｅｎｖタンパク質生 産を免疫沈降およびゲル電気泳動法によって分析した。分子量既知の標準の移動 を左側に示した。

（Ｂ）　ｒｅｘ突然変異体のＲｅｘ機能分析。２５種のｒｅｘ突然変異体（Ｍｌ 〜Ｍ１８およびＭ２１〜Ｍ２７と命名（第１３Ａ図参照）、Ｍｌ９およびＭ２Ｏ と命名した突然変異体は組み立てなかった）をｐ　Ｂ　Ｃ１２／ＣＭＶ発現ベク ターへ挿入した後、それぞれｐｇＴＡＸ−ＬＴＲと同時トランスフェクトし、実 施例１２に記載したように、培養をＲｅｘ特異的ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｅｎｖタンパク 質発現について分析した。

第１５図：　ｐｇＴＡＸ−ＬＴＲと、不活性な（Ｍｌ、Ｍ２、Ｍ６、Ｍｌ、Ｍｌ ３）、または損傷された（Ｍｌ５）Ｒｅｘ突然突然変異体ツクターｔ＝ハ野生ｆ ｉ　ｐ　ＲＥ　Ｘ−１ｐＲＥＶおよびｐＣＭＶ−ＩＬ−２ベクターで同時トラン スフェクトしたＣＯ８細胞におけるＨＴＬＶ−Ｉ　Ｅｎｖ、ＴａｘおよびＲｅｘ タンパク質の免疫沈降による同時分析。（Ａ）はＥｎｖ生産、（Ｂ）はＴａｘ生 産、（Ｃ）は野生型および突然変異体Ｒｅｘタンパク質生産。

第１６図：ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｒｅｘ突然変異体の免疫蛍光法による亜細胞的位置確 認。野生型、Ｍ６、ＭｌおよびＭ１３Ｒｅｘタンパク質は発現細胞の核小体およ び核に局在している。これとは対照的にＭＩ　Ｒｅｘタンパク質は細胞質でのみ 検出されるが、Ｍ２タンパク質は細胞全体にわたって分布している。Ｍ１５突然 変異体は発現細胞の核に局在しているが、野生型Ｒｅｘタンパク質とは対照的に 核小体から排除されるようである。

第１７図： （Ａ）ｒｅｘ突然変異体の野住型Ｒｅｘタンパク質機能の抑制能の分析。各培養 をｐｇＴＡＸ−ＬＴＲ，ｐＲＥＸと、何れか１つのＲｅｘ突然変異体（レーン１ 〜６）　、ｐＲＥＸ　（レーン７）、ｐＲＥＶ（レーン８）、またはｐＣＭＶ− ＩＬ−２（レーン９）で同時トランスフェクトした。ＨＴＬＩＩ　Ｅｎｖ生産を 第１４図と同様に分析した。

（Ｂ）ＨＴＬＶ−Ｉ　ｒｅｘ　トランス優性突然変異体は、ＨＩ　Ｖ−Ｉ　Ｒｅ ｖタンパク質の機能を抑制する。細胞をｐｇＴＡＴ、ｐＲＥＶと、ｐＢＣ／ＣＭ Ｖ−Ｉ　Ｌ−２、またはＭ６、Ｍｌ、Ｍ１３トランス優性Ｒｅｘ突然変異体で同 時トランスフェクトさせ、先端を切り取られた７２アミノ酸の形のＴａｔタンパ ク質のＲｅｖ誘導生産について検定した（レーン２）。Ｍ６、Ｍｌ、Ｍｌ３（レ ーン３〜５）はＨＩＶ−Ｉ　Ｒｅｖタンパク質を完全に抑制し、Ｔａｔタンパク 質の完全鎖長の８６アミノ酸の形だけが検出された。

（Ｃ）ＨＴＬＶ−Ｉのトランス優性Ｒｅｘ突然変異体は、Ｒｅｖ欠損型ＨＩ　Ｖ −１プロウイルスの複製のＲｅｘ救援を阻止する。グラフに示した倍数だけそれ ぞれ過剰のＭｌ、Ｍ６、Ｍｌ、Ｍ１３突然変異体の存在で、ｒｅｖ欠損型ＨＩ　 Ｖ−１プロウイルスプラスミドとｐＲＥＸで細胞を同時感染させた。ＨＩＶ−１ ｐ２４　Ｇａｇタンパク質の上清濃度を測定した。

５、詳細な説明 この発明を実施する際に用いる方法および技術は、従来技術既知のものである。

使用すルウイルス種は、ＨＴＬＶ−ＩＳＨＴＬＶ−ＩＩ、ＳＩＶ、ＨＩＶ−１、 ＨＩＶ−２のような、分類学上、明瞭なウィルス種を意味する。この発明は、特 にレトロウィルスの分野、とりわけヒト・レトロウィルスに関する。

その発現を抑制することがこの発明の最終目的である遺伝子は、好ましくはプロ ウィルスを活性化して、感染性粒子、例えばＨＩＶ−１およびＨＩ　Ｖ−２のｒ ｅｖのような感染粒子へと成熟をもたらす機能のような好ましくない特性を暗号 化している遺伝子である。

本明細書で使用するｒｅｖおよびＲｅｖとは、特に特定しない限り、それぞれＨ ＩＶ−１ｒｅｖおよびＨＩＶ−Ｉ　Ｒｅｖを意味する。したがってＨＩＶ−２の ようなその他のウィルス種のこれに対応するｒｅｖおよびＲｅｖの場合は、それ ぞれｒＨＩＶ−２ｒｅｖ　（ｒｅｖ２）ＪおよびｒＨＩＶ−２Ｒｅｖ　（Ｒｅｖ ２）Ｊ等のように特定して示す。

本明細書で特にその製法を説明しない場合、出発物質、または試薬として使用す る化合物、ベクター、細胞系等は、既知で一般に入手可能なものであり、あるい は既知で一般に入手可能な材料から通常の方法で入手し得、または既知で一般に 入手可能な材料から通常の方法でそれと等価のものを生産し得るものである。例 えばＲｅｘ遺伝子はＨＴＬＶ−１の任意の単離物から、そしてＲｅ　ｖ遺伝子は ＨＩＶ−１の任意の単離物から回収し得、ｐｇＴＡＸ−ＬＴＲは、例えばＨＵＴ １０２またはＭＴＩから回収し得る。別法として、遺伝暗号にしたがって遺伝子 を化学合成により作り出し、必要なアミノ酸配列を有するタンパク質を生産し得 る。ＲｅｘまたはＲｅｖ機能のトランス優性リプレッサーは、標準的な組み換え ＤＮＡ法、またはペプチド合成のための標準的な化学的方法、またはこれら方法 の組み合わせによって生産され、それらはすべて通常の方法である。

［５，１］ この発明の一態様は、ＨＴＬＶ−ＩにおけるＲｅｘ機能のトランス優性リプレッ サー、特に機能的に等価な、ただし構造的には無関係なＨＩＶ−１におけるＲｅ ｖ機能に対しても同様に有効であるＨＴＬＶ−１におけるＲｅｘ機能のトランス 優性リプレッサーに関する。

具体的には、修飾したｒｅｘ暗号配列を組み立て、これを発現させて、上記の特 性を有することを発見した。

「オリゴヌクレオチドの指令による生体外突然変異誘発系、見解２」　［アマ− ジャム、英国（１９８８年）、コードＲＰＮ、１５２３）］　（以下、「アマ− ジャム・プロトコール」と略称する）にしたがい、購入可能な突然変異誘発系を 用いて野生型ｒｅｘ暗号配列（第１図参照）を変化させた。目的の発現ベクター の組み立ては（１）ｒｅｘ暗号配列を保有するバクテリオファージＭ１３ベクタ ーの作成、 （２）ｒｅｘ暗号配列の突然変異誘発、（３）突然変異遺伝子の嘩乳動物発現プ ラスミドへの再クローン化 により、逐次、尾部形成段階を実施した。

欠失変異体１つを含んだ突然変異体３０種を組み立てた。２９種の部位特異的突 然変異の位置および性質を第３図に示す。突然変異誘発に使用した対応するオリ ゴヌクレオチドを第４図に挙げた。これらはすべてＢｇｌＩＩ制限部位を保有し ている。

ｒｅｘ暗号配列をプラスミドｐｃＲｅｘ　（ｐＲＥＸ）から単離した（Ｌ、リム スキーら、ネーチャー、３３５巻、［１９８８年コ、７３８頁）。野生型ｒｅｘ 遺伝子のだめの他の供給源も入手可能である。このように、例えばＨＴＬＶ−Ｉ のｇａｇ％　ｐｏｌＳｅ）１ｖおよびｔａｘ遺伝子について報告された類似の方 法（Ｂ、に、デおよびＡ、スリニバサン、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、 １７巻、５号、［１９８９年コ、２１４２頁）によって、ＨＵＴ　１０２（ＴＩ Ｂ１６２）およびＭＴ２　（Ｊ、Ｇ、ソドロスキーら、サイエンス、２２５巻、 ［１９８４年コ、３８１頁、１．ミヨシら、ネーチャー、２９４巻、［１９８１ 年’Ｉ、７７０頁、■、マンザリら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナ ル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８０巻、［１９８３ 年］、１５７４頁）のような株化したＨＴＬＶ−１感染細胞系の全ゲノムがら、 例えばポリメラーゼ連鎖反応を利用してｒｅｘ遺伝子をクローン化し得る。

ｔａｔおよびｒｅｖ暗号配列を、プラスミドｐｇＴａ　ｔおよびｐｃＲｅｖ　（ Ｍ、Ｈ，７リムら、ネーチャー、３３５巻、［１９８８年］、１８１頁）から単 離した。別法として、それらは例えばλＨＸＢＺ　（エイズ・リサーチ・アンド ・リファレンス・リアシエント・プログラム（１９８９年６月、ＮＩＨ）、カタ ログ番号７０）のようなＨＩＶプロウィルスクローンから単離し得る。

得られた各種のｒｅｘ遺伝子の生物学的活性を、ＣＯ８細胞におけるさまざまな 遺伝子発現によるＨＩＩＩ　ｒｅｖおよびＨＴＬＶ−Ｉ　ｒｅｘ遺伝子生産物の 作用に対し感度の高い検定により試験した（グルラマンら、セル、２３巻、［ｌ 　９８１年Ｅ、１７５頁）。

またウィルス構造タンパク質の合成が開始されると、ＲｅｖおよびＲｅｘタンパ ク質は、何れも先端が切り取られた形のＨＩＶ−ＩＴａｔ調節タンパク質の生産 を誘導する（Ｍ、Ｈ，マリムら、ネーチャー、３３５巻、［１９８８年］、１８ １〜１８３頁、Ｌ、リムスキーら、ネーチャー、３３５巻、［１９８８年コ、７ ３８〜７４０頁）。ゲノムＨＩＶ−１ｔａｔ遺伝子を機能的な）（ＩＶ−１ｒｅ ｖ遺伝子またはＨＴＬＶ−Ｉ　ｒｅｘ遺伝子と一緒に同時発現すると、Ｔａｔの 先端が切り取られた７２アミノ酸鎖長のエキ７２１個形を暗号化したスプライス されてないｔ　ａ　ｔｍＲＮＡの細胞質発現をもたらす。機能的なＲｅｖまたは Ｒｅｘタンパク質が存在しない場合は、Ｔａｔエキソン２個形に対応する８６ア ミノ酸の完全鎖長のＴａｔタンパク質の発現を起こす。このようにｒｅｖまたは ｒｅｘ機能の活性トランスリプレッサーの存在は、７２アミノ酸のＴａｔタンパ ク質の生産の低下または消滅をもたらす。この相違は、免疫沈降分析によって容 易に可視化することができる。

第２Ｃ図に示したように、３０種の突然変異体のうちの６種の、即ちｐｃＲｅｘ Ｍ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ８、ｐｃＲｅｘＭ１４、ｐｃＲｅｘＭ１７ およびｐｃＲｅｘ１３Δ１５は、トランス優性なＲｅｘリプレッサーを有してい ることが判明した。またｐｃＲｅｖの場合でも（第２Ｄ図参照）、これと同一の 様式、即ちｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ８、および部分的に ｐｃＲｅｘＭ１３て認められ、トランス優性はＨＴＬＶ−１遺伝子に限定された ものではなく、幾つかの変異体では、両方の遺伝子に対してトランス優性であり 、即ちこの特別な例としてｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅ’ｘＭ７およびｐｃＲｅｘ Ｍｇが挙げられることが判明した。

最初に得られた幾つかの結果から、最も成功した突然変異はアミノ酸位置８７〜 ９４の間に局在していることが判り、したがっておよそのアミノ酸位置８２〜お よそのアミノ酸位置９７の間に存在しているｒｅｘ／ｒｅｖ遺伝子の部分は、ト ランス優性なＲｅｘ／Ｒｅｖリプレッサーの操作に特別の意味を有するものであ るようであり、さらに試験の結果から、Ｒｅｘタンパク質に対する突然変異の好 ましい位置の範囲は一層広（、即ち、少なくともＮ−末端に近いアミノ酸位置２ ２からＣ−末端に向かってアミノ酸位置１０１まてに存在し得ることが分かった 。

［５，２コ さらにＨＩＶ−１におけるＲｅｖ機能に焦点を合わせた研究で、トランス優性な ｒｅｖリプレッサーが発見された。これらの幾つかは少なくともＨＴＬＩＩまた はＨＴ　Ｌ　ｖ−ｏにおけるＲｅｘ機能を抑制する可能性があるが、ここでは試 験しなかった。

これに反してこれらの幾つかは、少なくともＨＩ　Ｖ−２およびＳＩ　Ｖ、、、 。におけるＲｅｖ機能を同様に抑制することが判明した。

膨大な突然変異分析によって、トランス活性化に不可欠と思われるｒｅｖ内の少 な（ともさらに２つの異なった機能的ドメインの輪郭が明らかになった。これら のドメインは、Ｒｅｖタンパク質をその好適な標的基質へ向かわせる「結合ドメ イン」と、結合反応の機能的な結果である転写活性化を発揮させる「活性化ドメ イン」からなるものと想定される。

したがってｒｅｖ内の２つの機能的ドメインは、Ｒｅｖタンパク質を、その細胞 標的へ向かわせると思われる結合ドメインと、構造タンパク質ＧａｇおよびＥｎ ｖを暗号化している、不完全にスプライスされたＲＮＡ　（複数）の核放出を可 能にする活性化ドメインであると定義した。Ｒｅｖの活性化ドメインの突然変異 は、Ｒｅｖ機能のトランス優性な抑制因子として作用する欠損型Ｒｅｖタンパク 質の発現をもたらす。そのような突然変異体が、培養においてトランスフェクト された細胞で発現すると、ＨＩＶ−１の複製を著しく抑制し、したがって５１項 で得られた突然変異体と同様にトランス優性である。

この第２の′研究に関する詳細な情報は、後述する６、２項からも明白である。

それによって発見されたトランス優性な突然変異体はｐＭｌｏ、ｐΔ９／１４、 ｐΔ１０／１４（実施例４〜１１参照）、およびｐＭ２１、ｐＭ２２、ｐＭ２７ 、ｐＭ２８、ｐＭ２９、ｐＭ３２（実施例１１ａおよびｌｌｂ参照）であり、こ こでｐＭｌｏはＨｌｌｌ　ｒｅｖ遺伝子機能の抑制に有効であるばかりでなく、 ＨＩＶ−２ｒｅｖおよびＳＩＶ□ｃ　ｒｅｖ遺伝子機能の抑制にもまた有効であ る。

上記の９種類のトランス優性な突然変異体のうち、好ましいものはｐＭ１０Ｓｐ Ｍ２１、ｐＭ３２であって、特に］）ＭＩＯが好ましい。

［５，３］ ５．１項と同様にＨＴＬＶ−ＩにおけるＲｅｘ機能に焦点を合わせたもう一つの 研究でも、トランス優性なｒｅｘリプレッサーが発見され、それによってＲｅｘ 活性の検出を可能とする方法が開発された。この検出方法は、他のウィルスまた は宿生細胞機能を一般に妨害することなく、Ｒ’ｅ　ｘ機能の特異的抑制因子を 同定するのに有用である。このＲｅｘ抑制因子の検出方法は、調節要素、例えば ＲｅｘＲＥ　（ＲＲＸ）を含むｍＲＮＡのスプライスされない形を暗号化してい るＲｅｘ応答住「リポータ−」遺伝子を含む遺伝子系を利用する。この系では、 Ｒｅｘ機能を提供するタンパク質が、このスプライスされていないｍＲＮＡを細 胞核から細胞質へ放出するのを誘導する。Ｒｅｘ機能が存在しない場合は、この ｍＲＮＡは上記のように細胞質へ放出される前にスプライスされる。この遺伝子 系を含んだ細胞が、Ｒｅｘ機能の抑制因子であると疑われる因子と接触すると、 この因子によるＨＴＬＶ−Ｉ　Ｒｅｘ機能の特異的抑制は、この特有なｍＲＮＡ のスプライスされない形の核放出の減少によって示されるが、同じｍＲＮＡのス プライスされた形の核放出の減少を伴わない。この方法は、例えばＨＴＬＶ−Ｉ 　Ｒｅｘタンパク質の化学的抑制因子（例えば突然変異体ＲｅｘまたはＲｅｖタ ンパク質中のトランス優性なドメインを真似ることができる抑制因子、例えば低 分子量の化学的抑制因子）およびＲｅ　ｘ　’）ブレッサーとして作用するＲｅ ｘのトランス優性な突然変異体形を検出するのに有用である。

ｒｅｘ遺伝子のトランス優性な負の突然変異を同定するため、Ｒｅｘタンパク質 の直線状配列の全体にわたってさまざまな部位で２または３個のアミノ酸セグメ ントを変化させる一連の点突然変異を再び作成し、これらの突然変異体の中で数 個のＨＴＬＶ−Ｉ　Ｒｅｘタンパク質機能のトランス優性リプレッサーを同定し た。そのうちの幾つかは、ＨＴＬＶ−ＩＩ　Ｒｅｘおよび／またはＨＩＶ−１Ｒ ｅｖタンパク質機能を追加的にトランス優性に抑制し、したがってこれらは、５ １項で発見された幾つかの突然変異体と同様に、１ウィルス種の機能的に等価な 遺伝子の表現型発現を抑制した。

したがってこの発明はまた、前記の３項で示した数段階からなるＲｅｘタンパク 質の遺伝子活性化機能の特異的な抑制因子を同定する方法に関する。前述のよう に、ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｒｅ、ｘタンパク質はＨＩＶ−Ｉ　Ｒｅｖタンパク質の機能 を置き換えることができる。そのうえＲｅｘはまた、類似のＨＴＬＶ−ＩＩ調節 タンパク質を置き換えできることが分かった。このように、Ｒｅｘによって認識 される応答要素と少なくとも１個の好適な未使用のスプライス部位とを保有する 、これら３種のウィルスの少なくとも何れか１つに由来するｍＲＮＡをこの方法 に使用することができる。

好ましくは応答要素およびスプライス部位を含んでいるｍＲＮＡは、Ｒｅｘおよ びＴａｘタンパク質のコード領域、完全なｅｎｖ遺伝子、Ｒｅｘ応答要素Ｒｅｘ ＲＥ　（ＲＲＸ）および３’　ＬＴＲ全体からなるＨＴＬＩＩプロウィルスの３ ”末端を含んだプラスミドによって暗号化されている。そのようなプラスミドの 例は、ｐｇＴＡＸ−ＬＴＲである。野生型ｒｅｘ遺伝子コピーに対する突然変異 体ｒｅｘ遺伝子のコピー比を調節する必要がある突然変異体分析では、便宜上、 ｐｇＴＡＸ−ＬＴＲ上のｒｅｘ遺伝子を劣性の負の突然変異によって失活させ、 ｐＲＥＸと命名された別のプラスミドで活性ｒｅｘ遺伝子をこの系に提供する。

然しなから、例えば化学物質を試験する場合は、この系に必要なｍＲＮＡとして 、活性ｒｅｘ遺伝子が同一のプラスミドまたは別のベクターＩ）ＮＡで提供され るはずである。またこの活性ｒｅｘ遺伝子は、この発明に使用した株とは別のＨ ＴＬＶ−１株から単離された天然配列の変異体を含んでいるかもしれず、あるい は発現して、上記のｍＲＮＡの核からの放出を誘導することを含め、Ｒｅｘタン パク質の遺伝子活性化機能を提供するタンパク質生産物を生産することができる 何か別のｒｅｘ遺伝子の突然変異体形であるかもしれない。

またレトロウィルスの機能的ゲノム全体を暗号化したＤＮＡセグメントをこの遺 伝子系の一部として使用することによって、上に挙げた遺伝子系の要素を提供す ることもできる。これは感染細胞へ適用できる。然し、安全性の理由と便宜性の ため、この遺伝子系は好ましくは感染性ウィルスを生産することはできない。こ のことは、どの感染性ウィルスの生産にも不可欠な、少なくとも１ウイルス活性 の発現から、ある遺伝子要素の使用を防止する遺伝的欠損系へ設計することによ って達成される。これは、例えば少なくとも１ウイルス遺伝子の一部をその系か ら省くことにより、あるいはその他の突然変異により達成し得る。

好ましくはｒｅｘ遺伝子によって、またｍＲＮＡを暗号化したＤＮＡセグメント によって形質転換された宿主細胞の例として、前記のプラスミドベクターでトラ ンスフェクトされたＣＯ８細胞が挙げられる。即ち、本明細書で用いる「形質転 換」の語は、「トランスフェクション」の語を包含し、感染性因子、特にウィル スを暗号化しているベクターＤＮＡを含んだ遺伝子の形質転換を示す。トランス フェクションの後、そのようなベクターは、ついで培養中の少数の形質転換細胞 から感染性ウィルス粒子によって他の多数の細胞へ広がることができ、それによ って対象遺伝子を発現する大量の宿主細胞試料を提供する。しかもこの遺伝子系 における宿主細胞の形質転換は、安定な組み立て物を生じる必要はなく、安定な 遺伝子発現系、もしくは一過性の遺伝子発現系を利用して、必要なｍＲＮＡおよ びｒｅｘ遺伝子を提供すればよい。したがって多くの既知の発現系が、この発明 方法による抑制因子の同定に使用し得る。

この方法では、未使用のスプライス部位を含んだｍ　ＲＮ　Ａの放出が減少する が、それと−緒にこのｍＲＮＡのスプライス形の放出が減少しなければ、その因 子が、ＨＴＬＶ−１ｒｅｘ遺伝子活性またはｒｅｘ遺伝子生産物活性の特異的な 抑制因子であることを示す。

この発明方法を使用することによって特異的な抑制因子であることが判明した化 学因子の場合、その作用形式は、原則としてｍＲＮＡの転写または翻訳の特異的 な抑制を含み得る。然しなから一層可能性のある作用形式は、核小体の局在化、 Ｒｅｘ応答要素の認識またはＲｅｘエフェクター機能等を含んだＲｅｘタンパク 質活性の１またはそれ以上の特異的な抑制である。

都合よいことに、未使用のスプライス部位を含んだｍＲＮＡの核放出の減少は、 第１タンパク質の生産水準を測定することによって検出され、この第１タンパク 質は未使用のスプライス部位を含むｍＲＮＡによって暗号化されている（即ち、 ｍＲＮＡのスプライスされていない形態だけがこの第１タンパク質を暗号化して いる）。そしてｒｒ、　ＲＮ　Ａのスプライスされた形の核放出の増大は第２タ ンパク質の生産水準を測定することによって検出され、この第２タンパク質は、 このｍＲＮＡのスプライスされた形によって暗号化されている。

好ましくはこのｍＲＮＡはスプライスされない形で、ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｅｎｖタン パク質を暗号化している。このｍＲＮＡをスプライスすると、もう一つのＨＴＬ Ｖ−１タンパク質であるＴａｘを暗号化した一層短いｍＲＮＡが生じる。例えば 実施例１２および１３において、ＲｅｘＲＥ　（ＲＲＸ）要素を保有しているス プライスされないｍＲＮＡの核放出は、Ｅｎｖタンパク質の発現によって検出さ れる。さらに、Ｒｅｘ機能の抑制から生じたスプライスされないｍＲＮＡのその ような放出の抑制は、Ｅｎｖタンパク質生産の減少によって検出される。然しな からこの減少は、ある因子のウィルスまたは宿主に対するある種の一般的な毒性 から生じたものかも知れないから、ｒｅｘ遺伝子機能の特異的な抑制は、Ｅｎｖ 発現の減少と同時に、ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｔａｘタンパク質の生産が減少しないこと を反映しているｍＲＮＡのスプライスされた形の放出の減少が起こらないことに よって示される。したがって好ましくはＨＴＬＶｉ　Ｅｎｖ、ＴａｘおよびＲｅ ｘタンパク質発現の同時分析を実施する。

例えば実施例１２および１３では、ＥｎｖおよびＴａｘタンパク質の発現を、好 適な抗体との免疫沈降と、それによって生じた沈降物の電気泳動分析によって測 定する。別法として、例えばＲｅｘ機能の特異的抑制について試料の大規模スク リーニングのため、ＥｎＶおよびＴａｘについて、例えば酵素結合免疫検定法Ｃ ＥＬＩＳＡ）、またはスプライス形およびスプライスされない形の発現をもたら す何か一層都合よい別の生産物を提供する遺伝子操作によるｍＲＮＡの変形等が 挙げられる。例えばｍＲＮＡを変化させて、エシェリキア・コリーβ−ガラクト シダーゼのような、加水分解すると発色する無色の基質の添加によって検出でき る酵素を暗号化することも可能である。ｅｎｖ遺伝子の代わりにこの酵素の遺伝 子を挿入すると、スプライスされていないｍＲＮＡ形態はこの酵素を生産するが 、スプライスされた形態はこれを生産しない。また別の類似の都合のよい指示遺 伝子を、スプライスされた１ｎＲＮＡ形でこれを発現できるように（例えばＴａ ｘ配列へ融合することによって）ｍＲＮＡに暗号化することができる。迅速かつ 効率的な大量スクリーニングのために上記の方法をさらに変更することは、当業 者にとって容易に明らかなことであろう。

この発明のもう一つの態様は、上記の方法によってＲｅｘタンパク質の遺伝子活 性化機能の特異的抑制因子を同定するため、前記３項に挙げた構成要素を含んで なる因子スクリーニング用試薬キットに関する。このキットは、所望により、さ らに下記の任意の構成要素、即ち、細胞培養に使用する培地、リポータ−ｍＲＮ Ａのスプライスされた形またはスプライスされない形の何れかの核放出水準を、 このｍＲＮＡのスプライスされた形およびスプライスされない形のタンパク質生 産物を、例えば核酸ハイブリッド形成によって直接的に、あるいは例えば免疫学 的検出によって間接的に測定するのに使用する試薬、およびこの発明方法の実施 の際に、このキットの上記の任意の構成要素を使用するための指示書を含む。

各種のｒｅｘ遺伝子突然変異体を、優性な負の突然変異についてスクリーニング するのに上記の方法を使用した。これらのｒｅｘ遺伝子突然変異体を、この発明 のＲｅｘ抑制因子検出系でプラスミドｐｇＴＡＸ−ＬＴＲと同時発現させると、 ５．１項と同様に、Ｒｅｘタンパク質の５９〜６０位、６４〜６５位、および１ １９〜１２１位でアミノ酸置換を含んだ１種の突然変異が認められた。これらは ＲｅＸ機能を欠いているばかりでなく、野生型Ｒｅｘタンパク質機能のトランス 優性リプレッサーとしても作用し、また野生型Ｒｅｖタンパク質機能のトランス 優性リプレッサーとしても作用するタンパク質を生じた。

またこの突然変異分析では、Ｒｅｘアミノ酸位置５〜７および１４〜１５でＲｅ Ｘ機能を欠いた置換を含んでいる第２の型の負の突然変異体を生じた。これらの 変異体タンパク質は細胞核へ好適に標的指向せず、トランス優性でもなかった。

さらにＲｅｘアミノ酸位置１４１〜１４３に置換を有する単一な突然変異体Ｒｅ ｘで例示される第３の型の負の突然変異体は、部分的なＲｅＸ機能を保有してお り、核へ標的指向したが、核の核小体領域内に局在化できなかった。この変異体 タンパク質もまた、ＨＴＬＶ−Ｉ　ＲｅＸ機能のトランス優性リプレッサーでは なかった。これらの結果から、核小体局在化活性は、アミノ末端で確認されたプ ラスに荷電した残基（Ｈ。

シオミら、セル、５５巻、［１９８８年］、１９７〜２０９頁）以外の配列を含 み得る可能性が生じた。しかもこの知見は、Ｒｅｘタンパク質突然変異体がＲｅ Ｘ機能のトランス優性リプレッサーとして作用するには、変異体が、核標的指向 活性ばかりでなく、Ｒｅｘタンパク質の明白な核小体局在化活性を保有すること が必要であり得ることを示唆している。

またここで、Ｒｅｘ突然変異体に関するこれらの知見は、核および核小体標的指 向に関与している第１ドメインと、エフェクター活性に関与している第２ドメイ ンからなる少なくとも２つの機能的に異なったペプチドドメインのＲｅｘタンパ ク質内のおよその範囲を特定する。核標的指向性が不十分であるＲｅｘ突然変異 体は、先に核小体局在化シグナルとして機能することが判明したＲｅｘのアミノ 末端で、プラスに荷電しているペプチドドメインに位置している。組み換えＤＮ Ａ手技によって、アミノ末端の２０アミノ酸を含んでいるペプチドを他のタンパ ク質へ付着させると、このドメインはＲｅｘで観察されたのと同様の形式で、そ のタンパク質の核標的指向性および核小体局在化を何れも誘導した（Ｈ，シオミ ら、［１９８８年］、前掲）。このように、たとえＲｅｘアミノ酸位置１４１〜 １４３における突然変異体が核へ標的指向するにしても、核の核小体領域に局在 化できないことから、この変異体が核小体局在化に必要な領域にあるようには思 われない。この突然変異体における変化は、むしろアミノ末端ドメインでのＲｅ ｘ核小体の局在化機能に、例えば適当なタンパク質の折り畳みを妨害することを 介して間接的に影響するらしいと考えるのが最も妥当であろう。

機能的に明白なＲｅｘの第２主要ドメインは、アミノ酸５９〜６０（チロシンー イソロイシン）、６４〜６５（チロシン−トリプトファン）、および１１９〜１ ２１（スレオニン−フェニルアラニン−ヒスチジン）を包含する。これらの離れ た部位をそれぞれの位置で変化させると（Ｍ６、Ｍ７およびＭ１３突然変異体） 、生物学的活性を欠き、それと同時にトランス優性な抑制特性を現すＲｅｘタン パク質の生産をもたらす。ＲｅＸ機能に対して効果を示さない５種類の異なった 突然変異は、Ｒｅｘタンパク質の直線状配列において、Ｍ６およびＭ７領域をＭ １３領域から分離し、これら２つの離れた領域でのこの機能的ドメイン内の相互 作用が、適当なタンパク質の折り畳みを必要とするらしいことを示す。即ち、Ｒ ｅｘエフェクター機能にとって最も決定的なこれら２つのアミノ酸領域を包含し ているＲｅｘタンパク質の完全な直線状部分は、Ｒｅｘタンパク質のエフェクタ ー機能に寄与しているようであり、したがってこのドメインを突然変異させるこ とはＲｅｘのトランス優性リプレッサーの生産を意味する。

この知見は、ｍＲＮＡでＲｅｘＲＥ　（ＲＲＸ）の認識に必要な活性が位置して いるＲｅｘのドメインを指摘しない。したがってＲｅＸ機能のトランス優性リプ レッサーとして作用するために、突然変異体ｒｅｘタンパク質がＲｅｘＲＥへの 結合能を（直接的または間接的に）保有しなければならないのか、あるいはＲｅ ｘによって認識される何か他のウィルス認識の要素への結合能を保有しなければ ならないのかは分からない。

この発明のもう一つの態様は、ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｒｅｘタンパク質機能のトランス 優性リプレッサーを暗号化しているＤＮＡセグメントおよびそのようなトランス 優性リプレッサーに関する。このリプレッサーは、Ｒｅｘタンパク質のエフェク ター活性へマイナスに影響する少なくとも１つの突然変異によってＲｅｘタンパ ク質の野生型形態から修飾されたタンパク質である。このリプレッサーはまた、 Ｒｅｘタンパク質の野生型形態の核小体局在化活性を実質上保育している。特に このリプレッサーの負の突然変異は、野生型Ｒｅｘタンパク質のおよそのアミノ 酸位置５９からおよそのアミノ酸位置１２１までを含んでいるペプチドドメイン 、より詳細には下記に示す５９．６０．６４．６５．１１９．１２０および１２ １の任意の位置にあるアミノ酸に影響を与えるものである。Ｒｅｘリプレッサー を暗号化しているＤＮＡセグメントを例示すれば、下記の突然変異体ｒｅｘ遺伝 子、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ２Ｓの何れか、およびＨＴＬＶ−Ｉ　Ｒｅｖタンパク質機能 のトランス優性な抑制を示すその変異体および誘導体である。

このＤＮＡセグメントの配列は、ＨＴＬＶ−１の任意の単離体のＲｅｘ遺伝子（ Ｌ、リムスキーら、ネーチャー、３３５巻、［１９８８年］、７３８〜７４０頁 、Ｍ、セイキら、サイエンス、２２７巻、［１９８５年］、１２２７〜１２２９ 頁）から誘導され、または化学的合成によって作り出される。Ｒｅｘ機能のトラ ンス優性リプレッサーは、標準的な組み換えＤＮＡ法、またはペプチド合成のた めの標準的な化学的方法、またはこれらの方法の組み合わせによって作成される 。これらの方法はすべて遺伝子操作技術で周知の方法である。

ここでＲｅｘタンパク質のエフェクター活性にマイナスに影響する突然変異を例 示する。然しこれらと同一のアミノ酸位置またはこれに近接した位置に限局して 、タンパク質構造に効果を生じるように設計された他の型の突然変異でも、この 発明によるＨＴＬＶ−ＩＲｅｘタンパク質機能のトランス優性な抑制を示すＲｅ ｘの変異体および誘導体を生産する可能性は極めて高い。そのような限局的な欠 損は、例えば単一アミノ酸の欠失または挿入、または化学的または構造的に類似 したアミノ酸の置換等である。これに反して、−暦法範囲な欠失または挿入、ま たは２次構造（例えば、β−シート領域内のプロリン）を破壊する置換は、タン パク質の折り畳みに対する影響を介してタンパク質の固有部分に効果を及ぼす可 能性が高い。したがってＲｅｘエフェクター機能に必要なドメイン内の与えられ た位置で起こるそのような突然変異は、Ｒｅｘタンパク質の野生型形態の核小体 局在化活性を実質上保有する突然変異体Ｒｅｘタンパク質を生産することはあり 得ない。

上記の５．３項のトランス優性Ｒｅｘ突然変異体を、Ｒｅｖ機能抑制について同 様に試験し、これらの変異体がＨＩＶ−Ｉ　Ｒｅｖのリプレッサーでもあること が判明した。この型のトランス優性ＲｅＸ突然変異体の抗ウィルス作用の可能性 をＨＩ　Ｖ−１複製の抑制検定を用いて証明した。

また既述したように、たとえＨＴ　Ｌ　Ｖ−Ｈ内の対応する応答要素のヌクレオ チド配列が、ＨＴＬＶ−１内のＲｅｘＲＥ　（ＲＲＸ）のヌクレオチド配列と若 干具なったステム構造およびループ構造を有シテイルトシテモ、ＨＴＬＶ−Ｉ　 Ｒｅｘが類似体ＨＴＬＶ（Ｉ　Ｈａタンパク質に機能的に置き換わり得ることが この研究で判明した。

したがってこの発明はさらに１、ＨＩＶ−１、ＨＴＬＶ−１およびＨＴ　Ｌ　Ｖ −ＩＩウィルスのうちの１つを複製する複製能を有する細胞へ、Ｒｅｘ機能のト ランス優性リプレッサーを暗号化した上記のＤＮＡセグメントを導入することか らなるこれらのウィルスの複製の抑制方法に関する。この細胞はまた、トランス 優性リプレッサーを生産するＤＮＡセグメントの発現能を有する。この細胞は１ またはそれ以上のこれらのウィルスによって予め感染したものであってもよく、 あるいはこの細胞は１またはそれ以上のこれらのウィルスに未感染の標的細胞で あってもよい。

上述の遺伝子系の好ましい態様として、Ｒｅｘ応答性リポータ−プラスミドｐｇ ＴＡＸ−ＬＴＲを作成した（第１３Ｂ図）。要約すれば、ｐｇＴＡＸ−ＬＴＲベ クターは、ＨＴＬＶ−Ｉ　ｅｎｖ遺伝子によって分けられたｔａｘ遺伝子の２つ のタンパク質暗号エキソンと、ＲｅｘＲＥ　（ＲＲＥ）を含んだ完全なＨＴＬＶ −Ｉ　３°　ＬＴＲを含んでいる。これらのＨＴＬＶ−Ｉ配列の発現は、ヒト・ シトメガロウイルスの即時早期領域によって促進され、追加的なポリアデニル化 配列はラット・プレプロインスリン遺伝子の３′領域（ＢＲ，カレン、セル、４ ６巻、［１９８６年］、９７３〜９８２頁）によって提供される。このベクター は、Ｒｅｘが存在する場合だけＥｎｖを生産するが、Ｒｅｘが存在しても、しな くてもＴａｘを合成する。このベクターは、Ｒ，ｅ　ｘ翻訳開始コドンと一致す る５ｐｈ１部位に突然変異を導入しているため、それ自身はＲｅｘを生産しない 。Ｒｅｘが存在しないと、ｐｇＴＡＸ−ＬＴＲは、ｅｎｖ配列のすべてを事実上 火いているこのベクターから、スプライスされたｍＲＮＡ種の翻訳を反映したＴ ａＸタンパク質を生産する。然しｐｇＴＡＸ−ＬＴＲをｒｅｘ発現プラスミドｐ ＲＥＸと同時トランスフェクトすると、ＨＴＬＶ＝Ｉ　Ｅｎｖタンパク質の合成 が活性化される。この６２〜６８ｋＤタンパク質は、抗ＨＴＬＶ−１エンベロー プ・モノクローナル抗体０５αとの免疫沈降による立証によって容易に確認され る（Ｓ　マツツタら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ− ・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８３巻、［１９８６年］、２６７２ 〜２６７６頁）（第１４Ａ図、レーンｌ）。これとは対照的に、ｐＲＥＸをｐＲ ＥＶ　（レーン２）またはｐＣＭＶ−ＩＬ−２（レーン３）の何れかで置き換え ても（これらはそれぞれＨＩＶ−Ｉ　Ｒｅ、ｖタンパク質およびヒト・ＩＬ−２ ポリペプチドを暗号化している）　、ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｅｎｖタンパク質は検出さ れない。同様に、ｐｇＴＡＸ−ＬＴＲの存在なしでは、細胞をｐＲＥＸでトラン スフェクトしてもＥｎｖタンパク質は同定されなかった（レーン４）。

このように上記の遺伝子系では、ｐｇＴＡＸ−ＬＴＲによるＨＴＬＶ−Ｉ　Ｅｎ ｖ発現は、野生型Ｒｅｘタンパク質の遺伝子活性化機能を保有するタンパク質の 存在によって特異的に誘導される。ＲｅＸ機能を保有するタンパク質を提供する 遺伝子を含んだ系で、因子との接触がＲｅＸ機能を抑制するなら、その因子がＲ ｅＸ機能を提供する遺伝子または遺伝子生産物の発現と無関係なあるウィルス活 性もしくは細胞活性に影響する場合を除いて、即ち、因子がその遺伝子またはそ の生産物の特異的抑制因子でない場合を除いて、ＴａＸタンパク質は生産され続 ける。したがって実施例１２および第１５図に示したように、ＲｅＸ機能の特異 的な抑制因子を同定する典型的な方法は、ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｅｎｖ、Ｔａｘおよび Ｒｅｘタンパク質発現の同時分析を都合よく含んでいる。

第１５図および下記に示すトランス優性リプレッサーによってＲｅＸ機能が特異 的に抑制される場合、ＨＴＬＶ−Ｉ　ＴａＸタンパク質の生産が明らかに増大す ることは注目し得る。これは恐らく、ＲｅＸ機能を欠くためにスプライシング前 は放出されなかったＥｎｖｍＲＮＡが、スプライスされた形で核放出の増大を来 した結果であろう。然し原則的に、ＲｅＸ機能の特異的抑制因子はｍＲＮＡのス プライシングを防止し得るが、スプライスされないＲＮＡの放出を誘導し得ない 。したがってＲｅＸ機能の特異的な抑制因子を同定するこの方法は、現状では、 ＴａＸタンパク質を生産するスプライスされたｍＲＮＡの核放出の減少がない場 合に限り必要である。

この系の使用方法を実施例１２に例示した。この突然変異分析では、Ｍ１３バク テリオファージで、オリゴヌクレオチドの指令による突然変異誘発を再び使用し 、２５ケ所の別々の部位でｒｅｘ遺伝子の１次配列を変化させた（第１３Ａ図） 。特徴的なりｇｌＩＩ制限部位を同様に含んでいる枠組みにしたオリゴヌクレオ チド２重ラセンの挿入によって、四角で囲ったアミノ酸を、ジペプチドアスパラ ギン酸−ロイシンで置き換えた。ついでこれらのｒｅｘ突然変異体をそれぞれｐ 　Ｂ　Ｃｌ　２／ＣＭＶ真核性発現ベクターへ挿入しくＢ。

Ｒ，カレン、セル、４６巻、［１９８６年］、９７３〜９８２頁）、ＤＮＡ配列 決定によって突然変異を証明した。

ｐｇＴＡＸ−ＬＴＲベクターで同時トランスフェクトすることにより、ｒｅｘ突 然変異体の生物活性をそれぞれ測定した。これらのｒｅｘ突然変異体のうちの１ ９種は野生型の表現型を示したが、５種類の突然変異体（Ｍｌ、Ｍ２、Ｍ６、Ｍ ｌおよびＭｌ３）は明瞭なｅｎｖ遺伝子活性化作用を欠いており、１突然変異体 （Ｍｌ５）は部分的な機能だけを示した（第１４Ｂ図）。つぎにＣＯ８細胞をこ れら６種のｒｅｘ欠損型突然変異体およびｐｇＴＡＸ−ＬＴＲベクターで同時ト ランスフェクトし、ついで実施例１２に示したようにＨＴＬＶ−Ｉ　ＥｎｖＳＴ ａｘおよびＲｅｘタンパク質発現の同時分析を実施した（第１５Ａ−Ｃ図参照） 　。ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｅｎｖは、野生型Ｒｅｘタンパク質（第１５Ａ図、レーン７ ）または部分的に活性なＭ１５１５突然変異第１５Ａ図、レーン６）の存在した 場合にのみ検出されたが、４０ｋＤ　Ｔａｘタンパク質はすべての培養で検出さ れた（第１５Ｂ図）。このようにＭｌ、Ｍ２、Ｍ６、ＭｌおよびＭ１３１３突然 変異観察されたｅｎｖ遺伝子発現の欠如は、トランスフェクトされたｃｏｓｉ＠ 養におけるこれらのタンパク質の非特異的な毒性効果というより、むしろＲｅｘ 生物学的活性の特異的な喪失に起因するものである。また突然変異体Ｒｅｘタン パク質は何れもこれらの培養で確認され、すべての変異体が安定した形で発現す ることが判明した（第１５Ｃ図）。Ｍ２、Ｍ６およびＭ１３１３突然変異野生型 Ｒｅｘタンパク質と区別し難いパターンで移動しく第１５Ｃ図、レーン２．３． ５．７）、一方、ＭｌおよびＭ１５タンパク質は、一層小さい見掛けの分子量を 示しくレーン４および６）　、Ｍｌ突然変異体は、電気泳動でタンパク質の二重 線を生じた（レーン１）。Ｍｌ、ＭｌおよびＭ１５１５突然変異おけるタンパク 質コード領域の配列決定では、導入した特異的な突然変異以外には何らの変化も 見いだせなかった。したがってこれらのサイズの見掛は上の相違に関する生化学 的な根拠は、これらの変異体タンパク質の翻訳後プロセシングの変化を反映して いるのであろうと思われる。

野生型Ｒｅχタンパク質と同様に、生物学的に不活性なＭ６、ＭｌまたはＭ１３ Ｒｅｘ突然変異体でトランスフェクトした細胞のイン・サイチュ免疫蛍光染色で は（詳細は実施例１２参照）、発現細胞の核小体および核への正常な標的指向性 が認められた（第１６図）。コントラストを強めると、Ｍ１変異体タンパク質は 細胞質区画でのみ検出可能であったが、Ｍ２　Ｒｅｘ変異体は細胞全体にほぼ均 質な形で分布していた。ＭｌおよびＭ２変異体が、核小体局在化のシグナルとし て機能する、プラスに荷電したペプチドドメイン内にだけ存在している塩基性ア ミノ酸残基を変化させる事実は、これらの知見と一致する。部分的に活性なＭ１ ５突然変異は変異体Ｒｅｘタンパク質の核局在化のパターンをもたらすが、野生 型ＲｅＸタンパク質とは異なり、Ｍ１５タンパク質は核の核小体領域内へさらに 局在化せず、実際はＭｌ５は核小体から排除されるようである（第１６図）。こ れらの成績は、Ｎ−末端で塩基性アミノ酸から離れている残基がＲｅｘの核小体 局在化に関与し、もしくは寄与し得ることを示唆している。

また野生型ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｒｅｘタンパク質および野生型ＨＩＶ−Ｉ　Ｒｅｖタ ンパク質の生物学的活性に対するｒｅｘ突然変異体の阻止能を測定した（第１７ 図）。ｃｏｓｍ胞をｐｇＴＡＸ−ＬＴＲおよびＤＲＥＸで同時トランスフェクト すると（パネルＡ）　、Ｍ６、ＭｌおよびＭ１３変異体の１０倍モル過剰は優性 な負の表視型を示し、野生型Ｒｅｘタンパク質の活性を著しく抑制した（レーン ３〜５）。これと対照的にＭｌ、Ｍ２およびＭ１５タンパク質は、野生型タンパ ク質の作用を変化しないので、劣性の負の突然変異体として作用した（レーン１ ．２．６）。同様にＨＩ　Ｖ−１のＲｅｖタンパク質は、Ｒｅｘタンパク質（レ ーン８）およびＩＬ−２（レーン９）の作用を妨害しなかった。

つぎにトランス優性なＲｅｘ突然変異体のＨＩＶ−１系におけるＲｅｖ機能に対 する阻止能を測定した（第１７Ｂ図）。ＣＯ８細胞においてｐｇＴＡＴおよびお よびｐＲＥＶで同時トランスフェクトすると、Ｍ６、ＭｌまたはＭｌ３　Ｒｅｘ 突然変異体の１０倍モル過剰はＴａｔタンパク質の７２アミノ酸形の発現が減少 することによって立証されるＲｅｖタンパク質の作用の抑制を示した（レーン３ ．４．５）。またこれらのトランス優性Ｒｅｘ突然変異体のＨ１ｖ−１ウイルス 複製阻止能を検討した（第１７Ｃ図）。Ｒｅｘおよび段階的な量のトランス優性 なＲｅｘ変異体の存在で、Ｒｅｖ欠損型ＨＩ　Ｖ−１プロウィルスｐＨＸＢ２− Ｂａｍ−ｐ３　（Ｌ　リムスキーら、ネーチャー、３３５巻、［１９８８年コ、 ７３８頁）の複製を、これらのプラスミドによるＣＯ８細胞のトランスフェクシ ョンにより検討した。培養上清中のＨＩＶ−１ｐ２４　Ｇａｇタンパク質の合成 水準によって分かるように、トランス優性なＲｅｘ突然変異体（Ｍ６、Ｍｌおよ びＭｌ３）は投与量に比例するＨＩＩＩ複製の抑制を生じた。これとは対照的に 、ｒｅｘの劣性の負のＭ１１突然変異はＨＩＶ−１の複製に対して有意な効果を 示さなかった。

これと同時に、実施例１２および１３の各種のｒｅｘ突然変異体に関するこれら の知見から、異なった活性を有する少なくとも２つの異なった構造ドメインのＲ ｅｘタンパク質内のおよその境界が判明した。即ち、１つのドメインはＭｌおよ びＭ２突然変異によって特定され、Ｎ−末端に位置し、アミノ酸５〜７および１ ４〜１５を含み、タンパク質を核へ標的指向させ、それから核小体へ標的指向さ せする役割を果たしているよってある。このプラスに荷電しているドメインはま た、直接ＲｅｘＲＥ　（ＲＲＸ）へ、あるいはこのＲＮＡ要素へ直接接触する他 のタンパク質へのＲｅｘ結合に関与し得る。上述の第２ドメインはＲｅｘエフェ クター機能にとって不可欠であり、したがって突然変異して、トランス優性なリ プレッサーを生産することができる。

以上の５．１．５２および５３項の知見を要約すれば（ａ）　決定的な調節タン パク質（ＲｅｘおよびＲｅｖのような）を突然変異することによってウィルス抑 制因子を生産する一般に適用可能な原則を発見した。

（ｂ）　この原則は複数のウィルス種に作用する突然変異体調節タンパク質の生 産に適用可能なようである。

（ｃ）　組み立てて、同定した特異的にトランス優性な突然変異体は −ＨＴＬＶ−１ｒｅｘ遺伝子機能の抑制に有効なＨＴＬＶ−ＩＲｅＸ突然変異体 −ｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ８）ｐｃＲｅｘＭ１７および ｐｃＲｅｘ１３Δ１５（５，１項および実施例１〜３参照）、 −Ｍ６、ＭｌおよびＭｌ３（５，３項および実施例１２〜１３参照）、 −ＨＩＶ−１ｒｅｖ遺伝子機能の抑制に有効なＨＩＶ−Ｉ　Ｒｅｖ突然変異体 −Ｉ）Ｍｌｏ、ｐΔ９／１４およびｐΔ１０／１４　（５，２項および実施例４ 〜１１参照）、 −ｐＭ２１、ｐＭ２２、ｐＭ２７、］）Ｍ２８、］）Ｍ２９および９Ｍ３２（５ ，２項および実施例１１ａ〜１１ｂ参照）、−ＨＴＬＶ−Ｉ　ｒｅｘ遺伝子機能 の抑制に有効で、ＨＩＶ−１ｒｅＶ遺伝子機能の抑制にも有効なＨＴＬＶ−Ｉ　 Ｒｅｘ突然変異体−ｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７およびｐｃＲｅｘＭ８　（ ５゜１項および実施例３参照）、 −Ｍ６、ＭｌおよびＭｌ３　（５，３項および実施例１２〜１３参照）、 −ＨＴＬＶ−Ｉ　、ｒｅｘおよびＨＴＬＶ−ＩＩ　ｒｅｘおよびＨＩＶ−１ｒｅ ｖ遺伝子機能の抑制に有効なＨＴＬＶ−Ｉ　Ｒｅｘ突然変異体−Ｍ６、Ｍｌおよ びＭｌ３　（５，３項および実施例１２〜１３参照）、 −ＨＩＶ−１ｒｅｖ遺伝子機能の抑制に有効で、ＨＩＶ−２ｒｅｖおよび５ＩＶ ａ、、ｒｅｖ遺伝子機能の抑制にも有効なＨＩ　Ｖ−ＩＲｅｖＲｅｖ突然 変異体１０　（５，２項および実施例１１ｂ参照）と結論する。

６、実施例 以下に実施例をあげてこの発明を説明する。これらの実施例は単に発明を説明す るためのものであって、発明の範囲を限定するもの［実施例１］ トランス優性ＨＴＬＶ−Ｉ　ｒｅｘ遺伝子の組み立て（１）　ｒｅｘ暗号配列の バクテリオファージＭ１３　ＲＦ−ＤＮＡへのクローン化 ｐｃＲｅｘ　ＤＮＡ　５μｇを、制限酵素インキュベーション緩衝液（１０ｍＭ ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭ　ＭｇＣ１□、５０ｍＭＮａＣ１ ，１ｍＭ　ジチオトレイトール）２０μｌ中で、制限酵素ＨＩｎｄＩＩＩおよび ＥｃｏＲＩ各１０単位で３７℃で３時間処理した。反応混合物を、１μｇ／ｍｌ 臭化エチジウム含有１％アガロースゲル（シーケムＦＭＣ社、ロックランド、Ｍ Ｅ、米国）へ直接負荷し、トリス−酢酸緩衝液（Ｔ、マニアチスら、モレキュラ ー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル［１９８２年コ、コールド・ スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク、１５６頁）中、５０Ｖ、 ２５ｍＡで４時間電気泳動を行った。

分離したＤＮＡを３６６ｎｍのＵＶランプで可視化し、１．５ｋｂのｒｅｘ断片 を含有する好適なゲル切片を切り出した。このゲル切片をトリス−はう酸緩衝液 ５００μｍを含有する透析バッグへ加えた（マニアチス、１５６頁）。ＤＮＡを 緩衝液へ電気泳動溶出し、−２０℃でエタノール沈殿させた。

バクテリオファージＭ１３ｍｐ１０　ＲＦ−ＤＮＡ　５μｇを制限酵素ＨＩｎｄ ＨＩおよびＥｃｏＲ４で処理し、同様に１％アガロースゲルから７．２ｋｂのベ クターＭ１３断片を単離した。

ライゲーション緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）、１０ｍＭＭ ｇＣ１２，１０ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭ　ＡＴＰ）２０μｍ中で、ファ ージＤＮＡ　２００ｎｇおよびｃＲｅｘ　ＤＮＡ１μｇをＴ４−ＤＮＡ−リガー ゼ１単位と混合し、１６℃で１５時間インキュベートした。この反応混合物を直 接使用して、エシェリキア・コリＴＧＩ株を形質転換し、培養した（アマ−ジャ ム・プロトコール、１６〜１８頁）。

好適なファージプラークのＤＮＡを制限酵素ＨＩｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩに よるエンドヌクレアーゼ切断によって検査し、ついでトリス−酢酸緩衝液中、１ ０μｇ／ｍ１臭化エチジウム含有１％アガロースゲルにより分析的ゲル電気泳動 を行った。ｒｅｘ暗号配列を保有していたバクテリオファージを同定し、これを ｍｌ）１０ｒｅｘと命名した。

大規模生−ブロトコール（アマ−ジャム・プロトコール、２４〜２５頁）を使用 して１本鎖ｍｐｌＯｒｅｘ　ＤＮＡを単離した。

（２）　ｍｐｌ　０　ｒ　ｅ　ｘ中のｒｅｘ暗号配列の突然変異誘発突然変異誘 発の必要条件として、好適な１本鎖ＤＮＡ分子の合成が必要であった。２９種類 のオリゴヌクレオチドを作成しく第４図参照）、結局３０種の突然変異体が得ら れた。そのうち、下記の７種のオリゴヌクレオチドから、トランス優性な表現型 の点で好結果であることが分かった突然変異体が直接または間接的に（実施例２ 参照）得られた。

（１）５°−ＴＧ　ＧＡＣＡＧＡ　ＧＴＣＴＴＡ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＧＡＴ　Ａ ＣＣＣＡＧ　ＴＣＴ　−３’ｇｌＩＩ （２）５’　−ＡＣＴＡＴ　ＧＴＴ　ＣＧＧ　ＣＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＡＴＣＧ ＴＣＡＣＧ　ＣＣＣ−３′ｇｌＩＩ （３）　５’　−ＣＣＴＡＣＡＴＣＧＴＣＡＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＴＧＧ　ＣＣ Ａ　ＣＣＴ　ＧＴＣ−３゜ｇｌＩＩ （４）　５°−ＴＣＧ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＣＴＣ丁ＴＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＴＴＡ 　ＴＣＣＣＴＣＧＡ　−３゜ｇｌＩＩ （５）５°−ＡＧ　ＣＴＣＴＡＣＡＧＴ　ＴＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＣＴＣＧＡＣ ＴＣＣＣＣＴ　−３’ｇｌＩＩ （６）５°−ＧＴ　ＴＣＣＴＴＡ　ＴＣＣＣＴＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＣＣＴ　ＣＣ Ｔ　ＴＣＣＣＣＡ　−３’ｇｌＩＩ （７）　５’　−ＣＴ　ＣＣＴ　ＴＣＣＣＣＡ　ＣＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＡ　ＣＣ Ｔ　ＣＴＡ　ＡＧＡ　ＣＣＣ−３゜ｇｌＩＩ オリゴヌクレオチド（１）は、Ｒｅｘタンパク質のアミノ酸残基フェニルアラニ ン（アミノ酸位置３０）、フェニルアラニン（アミノ酸位置３１）およびセリン （アミノ酸位置３２）を、アミノ酸ロイシン（アミノ酸位置３０）、アスパラギ ン酸（アミノ酸位置３１）およびロイシン（アミノ酸位置３２）で置き換えてい る。

オリゴヌクレオチド（２）は、Ｒｅｘタンパク質のアミノ酸残基アラニン（アミ ノ酸位置５８）およびチロシン（アミノ酸位置５９）を、アミノ酸アスパラギン 酸（アミノ酸位置５８）およびロイシン（アミノ酸位置５９）で置き換えている 。

オリゴヌクレオチド（３）は、Ｒｅｘタンパク質のアミノ酸残基プロリン（アミ ノ酸位置６３）およびチロシン（アミノ酸位置６４）を、アミノ酸アスパラギン 酸（アミノ酸位置６３）およびロイシン（アミノ酸位置６４）で置き換えている 。

オリゴヌクレオチド（４）は、Ｒｅｘタンパク質のアミノ酸残基チロシン（アミ ノ酸位置８７）、セリン（アミノ酸位置８８）およびセリン（アミノ酸位置８９ ）を、アミノ酸ロイシン（アミノ酸位置８７）、アスパラギン酸（アミノ酸位置 ８８）およびロイシン（アミノ酸位置８９）で置き換えている。

オリゴヌクレオチド（５）は、Ｒｅｘタンパク質のアミノ酸残基ロイシン（アミ ノ酸位置９０）およびセリン（アミノ酸位置９１）を、アミノ酸アスパラギン酸 （アミノ酸位置９０）およびロイシン（アミノ酸位置９１）で置き換えている。

オリゴヌクレオチド（６）は、Ｒｅｘタンパク質のアミノ酸残基セリン（アミノ 酸位置９４）を、アミノ酸ロイシンで置き換えている。

オリゴヌクレオチド（７）は、Ｒｅｘタンパク質のアミノ酸残基アルギニン（ア ミノ酸位置１００）およびグルタミン酸（アミノ酸位置１０１）を、アミノ酸ア スパラギン酸（アミノ酸位置１００）およびロイシン（アミノ酸位置１０１）で 置き換えている。

すべてのオリゴヌクレオチドは、ｒｅｘ暗号配列の枠内にＢｇｌＩＩ制限部位を 導入しである。

オリゴヌクレオチドは、β−シアノ−エチルホスホアミダイト化学を使用したア プライド・バイオシステムズ３８０Ａ・シンセサイザーで固体支持体により合成 した。精製は、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、ついで主要生産 物を溶出およびエタノール沈殿することによって行った。ＡＴＰおよびポリヌク レオチドキナーゼを使用するオリゴヌクレオチドのリン酸化をアマーンヤム・プ ロトコール（１３頁）の記載にしたがって実施した。オリゴヌクレオチドの指令 による突然変異誘発反応をアマーンヤム・プロトコール（１３〜１６頁）にした がって実施した。ついでこれを形質転換し、エシェリキア・コリＴＧＩ株から平 板培養した（アマ−ジャム・プロトコール１６〜１８頁）。異なったプラークの ＤＮＡを、酵素ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩを使用する制限エンドヌクレアーゼ 分析によってスクリーニングした。

７種の突然変異のすべてから、ｒｅｘ暗号配列に導入された突然変異を保有して いる１クローンが確認された。これらのクローンをｍｐ　１０　ｒ　ｅ　ｘＭ２ 、ｍｐｌｏｒｅｘＭ７、ｍｐ　１０　ｒ　ｅ　ｘＭ８、ｍｐ　１０　ｒ　ｅ　ｘ Ｍｌ　３、ｍｐｌｏｒｅｘＭ１４、ｍｐｌｏｒｅｘＭ１６およびｍｐｌｏｒｅｘ Ｍ１７と命名した。さらにもう一つのクローンｍｐｌｏｒｅｘＭ１５を、欠失変 異体の組み立てに使用した（実施例２参照）。

（３）突然変異ｒｅｘ遺伝子の哺乳動物発現プラスミドへの再クローン化 突然変異させたｒｅｘ遺伝子をバクテリオファージＭ１３ベクターから起原種の 発現プラスミドへ戻した。ｐｃＲｅｘ　ＤＮＡ　５μｇを制限エンドヌクレアー ゼＨＩｎｄＩＩ１１０単位およびＥｃｏＲｌ　１０単位と３７℃で３時間インキ ュベートした。反応混合物を１０μｇ／ｍｌ臭化エチジウム含有１％アガロース ゲルへ直接負荷し、トリス−酢酸緩衝液中、５０Ｖ、２５ｍＡで４時間電気泳動 を行った。好適なケル切片から、Ｈｒ　ｎ　ｄＩＩＩ−Ｅ　ｃ　ｏＲＩベクター 断片を電気泳動溶出し、エタノール沈殿した。

（２）で得られた突然変異体５μｇを同様に処理して、ｒｅｘ暗号配列を含んだ 断片を単離した。

単離したベクター断片２００ｎｇおよび単離したｒｅｘ配列１μｇを、Ｔ４−Ｄ ＮＡ−リガーゼ１単位の存在でライゲーション緩衝液２０μｍに別々に混合し、 １６℃で１５時間インキュベートした。

得られた反応混合物を直接使用して、エシェリキア・コリＨＢＩＯ１株を形質転 換した。制限エンドヌクレアーゼＨＩｎｄＩＩＩ、Ａｓｐ７１８およびＢｇｌＩ Ｉを使用して、異なった細菌コロニーのＤＮＡを分析し、これを１％アガロース ゲルで分析的ゲル電気泳動に掛けた。このようにしてｒｅｘ遺伝子を保有してい ることを確認したプラスミドを、それぞれｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐ ｃＲｅｘＭ３、ｐｃＲｅｘＭ１３、ｐｃＲｅｘＭ１４．ｐｃＲｅｘＭ１５、ｐｃ ＲｅｘＭ１６およびｐｃＲｅｘＭ１７と命名した。

［実施例２コ ｒｅｘ暗号配列中の欠失変異の組み立てｐｃＲｅｘＭ１３　ＤＮＡ　５μｇを制 限酵素ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩそれぞれ１０単位で処理した。ベクター主鎖 およびｒｅｘ暗号配列の５′部分を含んでいる大きい方のＤＮＡ断片を前記と同 様に単離した。これと並行してｐｃＲｅｘＭ１５　ＤＮＡ　５μｇを類似の方法 で処理し、ｒｅｘ暗号配列の３°部分を含んでいる小さい方のＤＮＡ断片を単離 した。

単離したｐｃＲｅｘＭ１３　ＤＮＡ断片２００ｎｇを、単離したｐｃＲｅｘＭ１ ５　ＤＮＡ断片１μｇと混合し、Ｔ４−ＤＮＡリガーセ１単位の存在でライゲー ション緩衝液２０μｌ中、１６°Ｃて１５時間インキュベートした。この操作の 結果、アミノ酸位置８７．８８および８９がクローンｐ　ｃ　Ｒｅ　ｘ　Ｍ　１ ３と同一てあり、アミノ部位ｆｔ９０〜９４を欠失しているｒｅｘ暗号配列を得 た。

ついで反応混合物を直接使用して、エンエリキア・コリＨＢＩＯ１株を形質転換 した。異なったクローンのＤＮＡを、酵素ＨＩ　ｎ　ｄＩＩＩ、Ａｓｐ７１８お よびＢｇｌＩＩを使用する制限エンドヌクレアーゼ消化によりスクリーニングし た。陽性であったクローンを同定し、これをｐｃＲｅｘ１３Δ１５と命名した。

［実施例３コ 生物学的活性 （ａ）突然変異体遺伝子の嘩乳動物細胞における生物学的活性ｒｅｘ野生型遺伝 子および各突然変異体ｒｅｘ遺伝子発現ベクター０．２５μｇを、ゲノムｔａｔ Ｏランスー活性化因子）発現ベクターｐｇｔａｔ　（Ｍ、Ｈマリムら、ネーチャ ー、３３５巻、［１９８８年］、１．８１頁）０．２５μｇと混合し、これをカ レンが報告したようにＣｏｓ細胞細胞間時トランスフェクトした（Ｂ、Ｒ。

カレン、メソッズ・イン・エンジモロジー、１５２巻、［１９８７年］、６８４ 〜７０３頁）。６０時間のトランスフェクン３ン後、培養を３５３−ンステイン ３００μＣｉ／ｍｌで３時間標識し、ＨＩＶ−１ＴａｔおよびＨＴＬＶ−Ｉ　Ｒ ｅｘタンパク質の発現を免疫沈降分析により分析した。カレンが報告したように 、Ｔａｔのアミノ酸残基１〜６１に対する家兎抗ペプチド抗体、およびＲｅｘの アミノ酸残基１７３〜１８９に対する家兎抗ペプチド抗体をこの実験に使用した （Ｂ、Ｒカレン、ジャーナル・オブ・ピロロジー、６２巻、［１９８８年：ｌ、 ２４９８〜２５０１頁）。沈降したタンパク質をＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲ ルで分離し、オートラジオグラフィーにより可視化した。

ベクターｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ８、ｐｃＲｅｘＭ１４ 、ｐｃＲｅｘＭ１７およびｐｃＲｅｘ１３Δ１５に暗号化されているｒｅｘ遺伝 子は、この検定系で、ｒｅｘ作用に対する負の表現型を生じたが（第２Ｂ図、レ ーンＤ、Ｅ、Ｆ、Ｈ，ＩおよびＫ）、対照（レーンＢおよびＣ）およびその他の 突然変異体（レーンＧ）は正の表現型を生じた。

これらの表現型で負のＲｅｘ突然変異体クローンは、すべて上記のポリクローナ ル抗Ｒｅｘ抗体によって認識されるＲｅｘ特異的なタンパク質を生産することが できる（第２Ａ図、レーンＣ−ＥおよびＧ−１参照）。これに対して、クローン ｐｃＲｅｘＭ１６における突然変異はＲｅｘ特異的抗体によ、って検出不可能な タンパク質を生じた。このことはタンパク質の半減期の短縮（成績は示さず）に 起因するものであると信じられる。

（ｂ）　ｐ　ｃ　Ｒｅ　ｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ８、ｐｃＲｅ　 ｘ　Ｍ　１３、ｐｃＲｅｘＭ１４、ｐｃＲｅｘＭ１７およびｐｃＲｅｘ１３Δ１ ５による野生型ＨＩＶ−１ｒｅｖおよび／またはＨＴＬＶ−１ｒｅｘ機能のトラ ンス優性な抑制前記と同一の実験装置を使用して、野生型ＲｅｖおよびＲｅｘタ ンパク質の機能をトランスで抑制するｒｅｘ突然変異体の抑制能を検討した。ゲ ノムｔ　ａ、　を発現ベクターｐｇｔａｔ　Ｏ，２５μｇ、野生型ｒｅｖ　（ｐ ｃＲｅｖ）または野生型ｒｅｘ（ｐｃｒ’ｅｘ）発現プラスミド０．２５μｇ１ および各ｒｅｘ突然変異体発現プラスミドの過剰量（５μｇ）を別々に混合し、 これらをＣｏｓ細胞へトランスフェクトした。突然変異体の野生型Ｒｅｖまたは Ｒｅｘ機能に対する影響を、上記のＴａｔ特異的免疫沈降法によって測定した。

この実験の結果から、６種のｒｅｘ突然変異体、ｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ ７、ｐｃＲｅｘＭ８、ｐ　ｃ　Ｒｅ　ｘ　Ｍ　１４、ｐｃＲｅｘＭ１７およびｐ ｃＲｅｘ１３Δ１４は、野生型ｒｅｘ依存性トランスー活性化の抑制能を有する ことが判明した（第２Ｃ図、レーンＣ，Ｄ、ＥＳＧ、Ｈ，Ｉ）　。このうち４種 のｒｅｘ突然変異体ｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ８、および ｐｃＲｅｘＭ１３（部分的に）は野生型ｒｅｘ依存性トランスー活性化作用の抑 制能を有していたが（第２Ｄ図、レーンＣ，Ｄ、−ＥＳＦ）　、ある種の突然変 異体、即ちこの場合、ｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７およびｐｃＲｅｘＭ３は 、野生型ｒｅｘおよび野生型ｒｅｖ依存性トランスー活性化をともに抑制するこ とができた。

この実験系では、上記のｒｅｘ突然変異体によるＲｅｖおよび／またはＲｅｘ機 能のトランス優性な抑制を、タンパク質レベルで証明した。

また実施例１〜３の成績は、ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｒｅｘタンパク質に２つの機能的ド メインが存在することを示しているようである。アミノ末端の方向へ向けて、Ｒ ｅｖおよびＲｅｘタンパク質双方に対してトランス優性である２つの突然変異体 が存在する［ｐｃＲｅｘＭ７（アミノ酸位置５８．５９）およびｐｃＲｅｘＭ８ 　（アミノ酸位置６３．６４）コ。Ｒｅｘタンパク質だけにトランス優性な突然 変異体を含んでいる第２のクラスターは、暗号配列の中央部に位置している。核 局在化シグナルと突然変異体７および８からなるクラスターの開に位置している 追加的なｒｅｖ／ｒｅｘ）ランス優性な変異体は第３の機能的ドメインの一部で あるか、さもなければ導入されたアミノ酸変化がタンパク質の３次構造を妨害し て、その結果、観察されるトランス優性な表現型を生じたのかもしれない。

口６，２］ ［実施例４］ Ｒｅｖで集中発生した点変異および欠失変異Ｒｅｖタンパク質は生体内でセリン の位置でリン酸化され、生として細胞核へ局在化し、その核小体で濃縮される。

下記の突然変異分析は、Ｒｅｖ機能のこの特性関連を、他のどの因子よりＨＩＶ −１構造遺伝子発現のトランス−活性化因子として指摘する。

テーラ−らが報告したオリゴヌクレオチド指令による突然変異誘発を再び使用し て、集中発生する点変異（ｐＭ）をＨＩＶ−Ｉ　ＲｅＶのＨＸＢ−３株へ導入し た（テーラ−ら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、１３巻、［１９８５年コ 、８７６５〜８７８５頁）。具体的にはバタテリオファージＭ１３突然変異誘発 系（アマージャム社、アーリントンハイツ、ＩＬ、米国）を使用して、発現ベク ターｐｃＲＥＶ（ｖリムら、ネーチャー、３３５巻、［１９８８年］、１８１〜 １８３頁）によって暗号化された完全鎖長のｃＤＮＡコピーｒｅｘへ標的指向ヌ クレオチド置換を導入した。ｐｃＲＥＶのＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を 第６図に示す。

集中発生する一連の点変異をＲｅｖへ導入しく第５図、Ｍ１〜Ｍ１４）、クロー ン化し、ジデオキシヌクレオチド配列決定システム（ストラタジーン、う・ジヨ ウ、ＣＡ、米国）を使用してその配列を確定した。突然変異は、Ｒｅｖ全体にわ たってほぼ均等に配置され、その中にある１１個のセリン残基へそれぞれ標的指 向することができた。変化したヌクレオチドに下線を付して、各突然変異（ｐ。

Ｍ１〜ｐＭ１４）およびそれを囲むＤＮＡ配列を第７図に示す。

注目した大部分の突然変異は、第５図で四角で囲んだ残基を置き換えて、アスパ ラギン酸（Ａｓｐ）およびロイシン（Ｌｅｕ）のコドンを生じた。各突然変異は 、Ｒｅｖ内のその位置にしたがい、例えばＮ−末端に最も近い突然変異をｐＭｌ 、Ｃ−末端に最も近い突然変異をｐＭｌ４と命名した。

種々のｐＭ突然変異体の正確な構造を第７図に示した。突然変異の大半は２つの コドンだけに影響したが、この一般法則の例外として、Ｍ４およびＭ２Ｓは３個 のコドンに影響を与え、またＭ６は４個のコドンに影響を与えた。多くの場合、 アミノ酸置換はアミノ酸２個のミスセンス変異から起こったが、ｐＭ６の場合は 、ＡｓｐおよびＬｅｕがアルギニン残基４２個を置換し、それによってアミノ酸 ２個の欠失を生じた。ｐＭ４お町び９Ｍ１３は、何れももとのＲｅｖで観察され なかった近接したアミノ酸１個の置換を追加的に含んでいた。ｐＭ４では２３位 のチロシンのアスパラギン酸置換を含み、９Ｍ１３では１０９位のイソクイシン がバリンに置換された。これらの追加的な変化は、突然変異誘発プロトコールに 使用した１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー内の１塩基エラーから起こ ったものである。

２つの隣接したセリン残基の単一な欠失によって組み立てられたｐＭ７を除いて 、すべての点変異は独特なりｇｌＩＩ部位の生成を生じた（第５図参照）。Ｂｇ ｌＩＩ部位はすべて同一の読み取り枠へ挿入され、それによってそれに伴うＲｅ ｖのＮ−末端およびＣ−末端の欠失変異（ｐΔ）の組み立てを促進した。ｐΔ変 異体は欠失の位置によって命名され、例えばｐΔ１１／１４は導入したｐＭｌｌ および９Ｍ１４突然変異の間に欠失を有する。

［実施例５〕 Ｒｅｖ突然変異体の発現 親シトメガロウイルスの即時早期プロモーターに基づ（ベクターｐ　Ｂ　Ｃ１２ ／ＣＭＶ　（Ｂ、　Ｒ，カレン、セル、４６巻、［１９８６年］、９７３〜９８ ２頁）を陰性対照として使用した。またこの実験では、ゲノムｔａｔ遺伝子発現 ベクターｐｇＴＡＴおよび分泌されたアルカリ性ホスファターゼ遺伝子発現ベク ターｐＢｃ１２／Ｒ５Ｖ／５ＥＡＰを使用した（マリムら、前掲、およびバーシ ャーら、シーン、６６巻、　［１９８８年］、１〜１０頁）。

発現ベクターｐｃＲＥＶを修飾して、ｐＭおよびｐΔｒｅｖ変異体を発現した。

修飾したｐｃＲＥＶをｐｇＴＡＴとともにＣＯ８細胞へ同時トランスフェクトす ることからなる定性的検定を再び使用だ（マリムら、前掲、およびマリムら、ネ ーチャー、３３８巻、［１９８９年］、２５４〜５７頁）。具体的には、カレン が報告したように（メソッズ・イン・エンジモロジー、１５２巻、［１９８７年 ］、６８４〜７０３頁’）　、ｐｇＴＡＴ　０．２５μｇと、野生型、またはＤ ＥＡＥ−デキストランおよびクロロキンで修飾したｐｃＲＥＶ発現ベクター０． ２５μｇを使用するＤＮＡ依存性トランスフェクションによって、ＣＯ８細胞培 養（３５ｍｍ）を同時トランスフェクトした。

６０時間のトランスフェクション後、培養を［３５Ｓ］−システィンおよび［３ ２ｐ］−無機リン酸塩（［３２Ｐ〕−Ｐ　ｉ）で同時標識した（マリムら、　［ １９８８年］、前掲、およびノ＼ウノく−ら、ジャーナル・オブ・ピロロジー、 ６２巻、［１９８８年］、４８０１〜０４頁）。ついで細胞をＲＩＰＡ緩衝液で 溶解し、家兎ポリクローナル抗ペプチド抗血清を使用する免疫沈降分析により、 培養中のｒｅｖおよびｔａｔ発現の相対水準を検定した（マリムら、［１９８８ 年］、前掲、およびカレンら、ジャーナル・オブ・ピロロジー、６２巻、［１９ ８８年］、２４９８〜２５０１頁）。より具体的には、Ｒｅｖアミノ酸残基１〜 ２０　（ＲＥＶＩ／２０）に対する抗血清をｐＭ５およびｐＭ６によって暗号化 された変異体タンノ々り質の免疫沈降に使用し、またＲｅｖアミノ酸残基２７〜 ５１　（ＲＥＶ２７１５１）に対する抗血清を残りすべての変異体タンノ々り質 の免疫沈降に使用した。ｔａｔ発現の免疫沈降分析は、Ｔａｔアミノ酸残基１〜 ５１　（ＴＡＴＩ／６１）に対する家兎ポリクローナル抗ペプチド抗血清を使用 して実施した。

免疫沈降したタンパク質を、１４％不連続５ＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動 によって分解し、オートラジオグラフィーにより可視化した。これらの実験の結 果を第８図に示す。既知タンノ（り質分子量マーカーの相対移動度を図の右側に 示す。

［３５Ｓ］−システィンおよび［３２Ｐ］−Ｐｉ標議した培養の抗−Ｒｅｖ抗血 清による免疫沈降をそれぞれ第８Ａおよび８０図番二示す。

［３ＳＳ］−システィン標識培養の免疫沈降では、大半のミスセンス（ｐＭ）変 異体で野生型に匹敵する強度および移動度を示すノくンドを生じた（第８Ａ図、 レーン１〜１４）。この一般法則のｆＺＩＩ外として、変異体ｐＭ６では僅かに 早い移動度を示す強Ｌ％／＜ンドを生じ（Ｍ、〜１８ｋＤ）、ｐＭｌでは著しく 遅い移動度を示す微弱なノくンドを生じた。

抗Ｔａｔ抗血清を使用するｔａｔ発現の免疫沈降分析（ま、モデル指示薬として ｐｇＴＡＴを使用するｒｅｖ機能の定性的検定を提供した。前述のようにｒｅｖ が存在しないと、８６アミノ酸（ａ　ａ）のエキソン２個形ｔａｔタン、＜り質 をもっばら暗号化して（Ｘる完全にスプライスされた細胞質性ｔａｔｍＲＮＡが 発現する。然しｒｅｖが存在すると、ｐｇＴＡＴは、先端を切り取られたエキソ ２１個形の７２ａａ鎖長のタンパク質を暗号化しているスプライスされないｔａ ｔｍＲＮＡの細胞質発現を誘導する。

第８図で、野生型ｒｅｖは１９キロダルトン（ｋ　Ｄ）の相対分子質量（Ｍ、） で移動し、容易に検出されるが（レーンＯ）、ｔａｔの８６ａａ形および７２ａ ａ形はそれぞれ１５．５ｋＤおよび１４ｋＤで移動する。模擬トランスフェクト 培養は、これらの検定条件下で何ら特異的な信号を生じないが（マリムら、前掲 ）、第８Ｂ図を精査した結果、突然変異体発現ベクターでトランスフェクトした 培養でも、組立て体指示薬ｐｇＴＡＴで同時トランスフェクトした培養でも、ど ちらもｔａｔタンパク質合計に匹敵する量を合成することが判明した。この成績 から、どの変異体Ｒｅｖタンパク質もトランスフェクト細胞に対して有毒でない ことが示唆される。

またこの分析は、Ｒｅｖの５種のミスセンス変異体および２種の欠失変異体が不 活性であることを示したが（レーン４〜７．１０．１６．２０）、その他のＲｅ ｖ突然変異体はすべて完全に７２ａａＴａｔ発現を誘導できることが判った。４ 種の不活性なミスセンス変異体はアミノ酸残基２３と５６の間（Ｍ４〜Ｍ７）で 集中発生したが、第５の不活性変異体（ｐＭｌｏ）は２つの完全に機能的な突然 変異体によって分離され、残基７８および７９に影響を与える。

ＲｅｖのＮ−末端に近い４残基（ｐΔ１／２）またはＣ−末端に近い２１残基（ ｐΔ１１／１４）の欠失は、ｒｅｖ機能に対して殆どまたは全く効果がなかった 。これとは対照的に残基９と１７の間の追加的な配列の欠失（ｐΔ１／３）はｒ ｅｖ機能の喪失を生じた。

［実施例６］ ｒｅｖ突然変異体のトランス−活性化能ｒｅｖ突然変異体のトランス−活性化能 を一層厳密に評価するため、ＨＩ　Ｖ−１の複製欠損型ｒｅｖ変異体をトランス で救援するｒｅｖ突然変異体の救援能を試験した。この分析の目的のため、ベク ターｐＨＩＶ−１ΔｒｅｖのｒｅｖＨＩＶ−１プロウイルス［ファインバーブら によってｐＨＸ８２Ｂａｍ−ｐ３と命名された（セル、４６巻、　［１９８６年 コ、８０７〜１７頁］を使用した。このプロウィルスは、ｒｅｖの第２暗号エキ ソンのアミノ酸位置５９に該プロウィルスの複製を不可能にするフレーム・シフ ト変異を含んでおり、即ち、ＣＯ８細胞へトランスフェクトしたとき、ＨＩＶ− １ｒｅｖ発現がトランスで可能なベクターとの同時トランスフェクトがないと、 機能的なＲｅｖタンパク質を産生できない（リムスキーら、ネーチャー、３３５ 巻、［１９８９年コ、７３８〜４０頁）。第９図に示したように、可溶性ｐ２４ 　Ｇａｇ発現のＥＬＩＳＡ検定法（デュポン−ＮＥＮ社、ビレリカ、ＭＡ、米国 ）を製造業者の標準的な供給によって使用して、培養上清へ放出されたＨＩＶ− １１）２４　Ｇａｇタンパク質濃度（ｐｇ／ｍｇを定量的に検定することにより 、ウィルスの複製を測定し、突然変異体のｒｅｖプロウィルス救援能を分析した 。

対照の目的のため、Ｒｅｖ非応答性ベクターｐＢｃ１２／ＲＳＶ／５ＥＡＰ　（ １培養当たり１２．５ｎｇ）［分泌されたアルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ ）遺伝子発現ベクター〕で培養を同時トランスフェクトすることによって監視し た。上清ｐ２４　Ｇａｇ濃度と並行して５ＥＡＰｉ１度を便宜的に測定した。ま た幾つかの培養では、陰性対照ベクターｐＢｃ１２／ＣＭＶ　（ＮＥＣ）か、ま たは野生型ｒｅｖ遺伝子発現ベクター（ｐｃＲｅｖ）の何れか１２５ｎｇで同時 トランスフェクトした。

ＣｏＳ細胞培養（３５ｍｍ）をｐＨＩＶ−１Δｒｅｖ２５０ｎｇと、対照ベクタ ーまたは修飾した１突然変異体含有ベクター１２５ｎｇで同時トランスフェクト した。６５時間トランスフェクション後、上清培地を採取し、Ｐ２４　Ｇａｇタ ンパク質の発現水準を検定した。同時にＳＥＡＰ濃度を測定した。上清５ＥＡＰ ｉ１度で認められた僅かな変動を補正し、得られた値を第９図に前掲した（ＳＥ ＡＰの平均活性を１．００単位とし、観察された標準偏差は±０．１４、範囲は １．３０〜０．７３である）。

この実験で、５ＥＡＰ活性の上清濃度にはほとんど変動が見られなかったので、 トランスフェクション効率が等価であることが証明され、また細胞毒性を誘発す る突然変異体がないことが確かめられた。ｐＨｒｖ−１Δｒｅｖ単独のトランス フェクションでは、培養上清に検出可能なり２４　Ｇａｇタンパク質を生じなか ったが（レーンＮＥＣ）　、野生型ｒｅｖ遺伝子発現ベクターとの同時トランス フェクションでは、ｐＨＩＶ−１ΔＲｅｖのｐ２４　Ｇａｇ分泌誘導能を有効に 補足していた（レーンｐｃＲＥＶ）。

またＪ）ｇＴＡＴに基づく検定で試験し、陽性であったすべてのＲｅｖ突然変異 体を可視化して第８Ｂ図に示したが、野生型ｒｅｖ組立て体で認められた活性の ５０〜１００％の活性水準が救援検定で達成された。例外としてＭｌでは一３０ ％の活性を示したが、この減少はＭ１変異体の生体内安定性の低下を反映したも のであろう。

第８Ｂ図でマイナスと採点したすべての突然変異体は、救援検定で完全に陰性で あり（即ち、ｐ２４　Ｇａｇの１０　ｐ　ｇ／ｍｌまたはそれ以下）、例外とし てＭ７では辛うじて検出し得た上清のｐ２４Ｇａｇタンパク質濃度を生じた。

［実施例７］ 生物学的活性に必要でないＲｅｖリン酸化ＨＩＶ−Ｉ　Ｒｅｖタンパク質は生体 内で発現すると１またはそれ以上のセリン残基の位置でリン酸化される。第５図 に概略を示した突然変異は、ｒｅｖ暗号配列内の１１個の各セリン残基に影響を 与える。そこでＨＩＩＩ　ｒｅｖの生体内リン酸化部位を確かめるため、トラン スフェクトしたＣＯ８細胞培養で一過性に発現する「３２Ｐ］−Ｐｉ標識Ｒｅｖ タンパク質を免疫沈降により監視した（第８Ｃ図）。［３２Ｐｌ　−Ｐ　ｉのｒ ｅｖへの挿入濃度と、こりと並行してトランスフェクトした培養で挿入された［ Ｏ８］−システィン濃度との比較（第８Ａ図）を用いて、個々の突然変異体のリ ン酸挿入水準に対する効果を評価した。この比較の結果を第１表に示す。

［第１表］　ＨＩＶ−１’ｒｅｖ遺伝子突然変異体の表現型分析クローン　Ｒｅ ｖ’　リン酸イビ　亜細胞゛　トランス優性６機能　局在化　抑制 野生型　＋＋＋＋Ｎ Ｍｌｌ　＋＋　＋＋　Ｎ （第１表つづき） ′十＋：野生型の５０〜１００重量％、＋：５〜５０重量％、−：く５重量％ ５＋＋・重量に匹敵する、＋：３０〜６０重量％、±・５〜２０重量％、−：検 出し得るリン酸化なし、ｎｄ：実施せず ′？：免疫蛍光沈降によって検出されず、ｎｄ：実施せず°＋＋、高度にトラン ス優性、十：中等度にトランス優性第１表にまとめた分析で、リン酸化の減少を 生じる４種のミスセンス変異体を確認した。これらのうち、Ｍ２およびＭ１２は リン酸取り込みに対して中等度の効果を示すが（それぞれ−３０％および一６０ ％の抑制）、Ｍ５およびＭ６はリン酸取り込み水準が劇的に低下した。ｒｅｖの リン酸化に対するＭ５およびＭ６変異体の劇的な効果（これらはどのセリン残基 にも影響しない）に関して考え得る理由を、以下さらに詳細に考察する。

Ｒｅｖにおけるリン酸受容体セリン残基の位置をさらによくつきとめるため、欠 失変異体（ｐΔ）のリン酸化水準の研究を実施した（第８Ｃ図、レーン１５〜２ ０）。この分析の結果、ｐΔ１３／１４変異体は正常にリン酸化されるが、ｐΔ １２／１４欠失およびそれより一層大きいＣ−末端の欠失は、低水準のリン酸化 しか示さない（−９０％抑制）。同様にｐΔ１／２Ｒｅｖ変異体も［３５５コー システインでは効果的に標識され得るが、［”Ｐ］　−Ｐ　ｉの取り込みは低水 準を示す（−９０％抑制）。

Ｍ２およびＭ１２変異体の部位へ広がる欠失が、何故、ミスセンス変異体そのも のより、リン酸化水準に一層激しい効果を示すのかは明らかでない。然しこれら の結果は、Ｒｅｖタンパク質がセリンリン酸化の２ケ所の１次部位を含んでおり 、その１つは残基８　（Ｍ２）にあり、第２は残基９９（Ｍ１２）にあるという 仮説と一致している。何れにしても、これらの残基を欠いている変異体（即ち、 ｐＭ２、ｐΔ１／２、ｐＭｌ２、ｐΔ１２／１４）は、はぼ野生型Ｒｅｖの活性 水準を示す（第８Ｂ図、第９図）。したがってＲｅｖのリン酸化は、トランスフ ェクトされた細胞におけるＨＩＶ−１調節タンパク質のトランス−活性化機能に 不可欠なものではないと結論される。

［実施例８］ Ｒｅｖの核局在化 Ｒｅｖタンパク質が、発現細胞の核、特に核小体へ顕著に局在化されることは、 間接免疫蛍光法を用いた変異体分析によって確認された。固定されたトランスフ ェクトＣＯ８細胞培養から得られた位相差写真およびそれに対応する免疫蛍光写 真を第１０図に示す。

トランスフェクトされたＣＯ８細胞内のＲｅ　Ｖタンパク質を局在化するのに使 用した間接免疫蛍光法の手技は、カレンの報告（Ｂ。

Ｒ，カレン、メソッズ・イン・エンジモロジー、１５２巻、［１９８７年］、６ ８４頁、およびＢ、　Ｒ，カレン、ジャーナル・オブ・ピロロジー、６２巻、［ １９８８年］、２４９８頁）にしたがい、ただし修飾したパラホルムアルデヒド 法に基づ（細胞固定法を使用して行った（ルーベンら、ジャーナル・オブ・ピロ ロジー、５３巻、［１９８９年コ、１〜８頁）。具体的には、細胞を家兎ポリク ローナル抗Ｒｅｖペプチド抗血清で処理し、ついでローダミン結合ヤギ抗家兎１ ｇＧで処理した。

第１の家兎抗Ｒｅｖ抗体は１：８００倍希釈で使用した。ｐＭｌ、ｐＭ２、ｐＭ ３、ｐΔ１／２、ｐΔ１／３ベクターでトランスフェクトした培養を除いて、Ｒ ｅｖ突然変異体の大半の分析にはＲＥＶ１／２０抗体を使用した。上記の例外の 変異体にはＲＥＶ２７１５１抗体を使用した。第２抗体であるローダミン結合ヤ ギ抗家兎ＩｇＧ（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ、インジアナポ リス、ＩＮ、米国）は１．５０倍希釈で使用した。

図に示したように、Ｒｅｖ突然変異体は４つの型に分けられる亜細胞性局在化を 示した。即ち、Ｎ：細胞質発現が検出不可能な核／核小体局在化、Ｎ＞Ｃ：僅か な細胞質発現、Ｎ≧Ｃ：若干の核濃縮を伴った明白な細胞質発現、ＣＡＮ：細胞 内の無秩序な分布、からなる４種類の型である。これらの分布の代表的な例を図 に示した。

図でＲｅｖタンパク質は下段の図の右上隅に表示した。この検定によって検出さ れた各Ｒｅｖタンパク質の局在化を第１表に示す。

図に示したように、変異体の大半は、トランス−活性化陰性のクローンｐＭ１０ （第１０Ｄ図）を含め、完全に野生型の亜細胞性局在化（Ｎ）を示した。然しな がら数種の変異体では、ｐＭ４（第１０Ｆ図）によって代表されるように、極め て微弱ながら検出可能な水準の細胞質蛍光を生じた。この表現型は、活性変異体 （ｐＭ３、ｐＭ８）でも不活性変異体（ｐＭ４ｐＭ？）でも、ともにこの特性を 示すので、生物学的活性と明らかに相関しなかった。しかもかなり幅広い範囲の １欠失変異体（ｐΔ１／３）が、野生型パターンとＲｅｖの塩基性ドメインで突 然変異によって誘導されたパターン（Ｎ≧Ｃ１第１０Ｈ図）との中間型の亜細胞 性局在化を示している。

然しこの欠失は、塩基性ドメインに近接した位置ではない。この異常な局在化の 理由は明らかではないが、ｐΔ１／３で認められた生物学的活性の欠如とよく相 関している。

既知の核局在化シグナルと相同性を示すＲｅｖのアルギニン・リンチな突然変異 （ｐＭ５、ｐＭ６）は、細胞質Ｒｅｖタンパク質を高水準で生じる（Ｃ＞Ｎ）。

ただしこれらのタンパク質は、細胞核から排除されたものではなく（第１ＯＪ図 ）、実際はＲｅｖの塩基性ドメインが核局在化のシグナルであることを示唆して いる。

ｐＭ５およびｐＭ６が、リン酸化受容体として先に提案した部位を保有している にもかかわらず、生体内で必ずしも有意にリン酸化されないことを思い起こせば 興味深い。これはＲｅｖのリン酸化に関与しているキナー七が細胞核に限定され ているためがち知れない。したがってｐＭ５およびｐＭ６Ｒｅｖ変異体の不適当 な亜細胞性局在化は、その低いリン酸化水準に起因している可能性も考えら（れ る。

［実施例９］ Ｒｅｖ機能のトランス優性な抑制 トランス−活性化ＨｒＶ−１構造遺伝子発現能を喪失したＲｅｖ突然変異体につ いて、野生型Ｒｅｖタンパク質の機能をトランスで抑制するその抑制能を検討し た。

ＣＯＳ細胞（３５ｍｍ）を、組立て体指示薬ｐｇＴＡＴ２５０ｎｇと、ｐＢｃ１ ２／ＣＭＶ　２９０ｎｇ　（陰性対照）（第１１Ａ図、Ｌ／−：／１）；　ｐｃ ＲＥＶ　４０μｇ　（低水準）　、ｐＢｃ１２／ＣＭＶ２５０ｎｇ　（レーン２ ）；ｐｃＲＥＶ　２９０ｎｇ　（高水準）（レーン３）；ｐｃＲＥＶ　４０μｇ 、ｐＭ４　２５０ｎｇ　（レーン４）；ｐｃＲＥＶ　４０μｇ、ｐＭ７　２５０ ｎｇ　（レーン５）；ｐｃＲＥＶ　４０μｇＳｐＭＩＯ２５０ｎｇ　（レーン６ ）で同時トランスフェクトした。６０時間トランスフェクション後、培養を［” Ｓ］−ンスティンで標識し、家兎抗Ｔａｔ抗血清を使用する免疫沈降分析に掛け た。

第１１　Ａ図に示したように、ｐＭ４　（レーン４）およびｐＭ７（レーン５） では、７２ａａ　Ｔａｔの発現誘導によって測定した野生型Ｒｅｖタンパク質活 性に対して殆ど効果を示さなかったが、ｐＭｌｏ（レーン６）ではＲｅｖ機能を 完全に抑制するようであった。この成績は、ｐＭｌｏがＨＩＶ−１ｒｅｖ遺伝子 機能の特異的な抑制因子を暗号化していることを示唆する。

ｐＭｌｏが、実際にスプライスされていないＨＩＶ−１ｍＲＮＡ（ｆａｔの７２ ａａ形を暗号化している）の細胞質発現を特異的に防止することによって作用す るということを証明するため、マリムら［（１９８８年）、前掲］の８１ヌクレ アーゼ防御検定法を使用した。この検定法（第１１Ｂ図）は、ｐＢｃ１２／ＣＭ Ｖ　２．７５μｇ＋ｐｃＲＥＶ　２．５μｇ（レーン１）：ｐｇＴＡＴ　２．５ μｇ＋Ｉ）ＢＣｌ　２／ＣＭＶ　２，７５μｇ（レーン２）；ｐｇＴＡＴ　’； ２゜５μｇ＋ｐｃＲＥＶ　０．２５μｇ＋ｐＢＣ１２／ＣＭＶ　２．５ｔｔｇ（ Ｌ／−：／３）；Ｉ）ｇＴＡＴ　２．５μｇ＋ｐｃＲＥＶ　２．７５μｇ（レー ン４）：ｐｇＴＡＴ　２．５μｇ÷ｐｃＲＥＶ　０．２５μｇ＋ｐＭ１０　２． ５μｇ　（レーン５）：ｐｇＴＡＴ　２．５μｇ＋ｐｃＲＥＶ　０．２’Ｂｚｇ ＋ｐΔ１０／１４　２．５ｔｔｇ　（Ｌ／−ン６）　でトランスフェクトされた ＣＯ８細胞（１００ｍｍ）の細胞質において発現されるスプライスされた（Ｓ） およびスプライスされない（Ｕ）ｔａｔｍＲＮＡ濃度を定量する。添加したＤＮ Ａ合計は、陰性対照とした親発現ベクターｐ　Ｂ　Ｃ１２／ＣＭＶを含めて、合 計５．２５μｇに保った。

６０時間トランスフェクション後、細胞質ＲＮＡを分析用に回収し、５μｇアリ コートを８１ヌクレアーゼ防御検定に使用した。使用したＤＮＡプローブは、ｔ ａｔの第１の暗号エキソン内にあるＸｈｏＩＩ部位で、クレノーＤＮＡポリメラ ーゼを使用して末端標識した７９８塩基対のプローブである（マリムら、［１９ ８８年］、前掲）。トランスフェクトしたＣＯ８培養で、スプライスされない（ Ｕ）およびスプライスされた（Ｓ）細胞質ｔａｔｍＲＮＡ濃度をともに定量し得 るよう、プローブ（１）を設計した。このプローブを使用して、スプライスされ た（Ｓ）ｔａｔ　ｍＲＮＡは２０２ｎｔプローブ断片を救援すると予想し、スプ ライスされない（Ｕ）ｔａｔｍＲＮＡは５０６ｎｔ断片を救援すると予想した。

スプライスされないＲＮＡの相対濃度を、各レーン毎にＬＫＢソフトレーザース キャナーを使用するデンシトメトリーによって定量した。これを可視化して、第 １１Ｂ図に示した結果から、レーン２では１４％がスプライスされず、レーン３ では６３％がスプライスされず、レーン４では８２％がスプライスされず、レー ン５では２２％がスプライスされず、レーン６では２４％がスプライスされなか った。

予想されたように、スプライスされたｔａｔｍＲＮＡは、ｐｇＴＡＴ単独でトラ ンスフェクトした細胞の細胞質で顕著であったが（第１１Ｂ図、レーン２）、ス プライスされないｔａｔｍＲＮＡは、ＨＩＶ−Ｉ　Ｒｅｖタンパク質を同時発現 した細胞の細胞質で優性な細胞質種であった（第１１Ｂ図、レーン３および４） 。然しｐｇＴＡＴをｐｃＲＥＶおよびｐＭｌｏの双方と同時発現させると、ｔａ ｔｍＲＮＡのスプライスされた形の細胞質優位性を回復している（第１１Ｂ図、 レーン５）。

レーン５および６で負荷したＲＮＡの合計量は若干低いようであるが、それにも かかわらずｐＭｌｏ（レーン５）がｐｇＴＡＴベクターからのＲｅｖ誘導のスプ ライスされないｔａｔｍＲＮＡの細胞質発現を選択的に抑制できることは明らか である。事実、ｐｃＲＥＶおよびｐＭｌｏの双方の存在で検出したスプライスさ れないｔａｔｍＲＮＡの相対濃度は、Ｒｅｖの存在なしで観察した濃度に匹敵す る。

これと同じパターンがｐ△１０／１４でも明らかである（第１１Ｂ図、レーン６ ）。これらの結果は、さらに３゛からＭＩＯ突然変異へまたがるＲｅｖ遺伝子の 欠失（ｐΔ１０／１４）もＲｅｖ機能のトランス−抑制因子を暗号化しているこ とを示している。ＭＩＯ突然変異の部位から広がるｐΔ９／１４と呼ばれる一層 幅広い欠失も優性な負の表現型を示す（第１表）。然しＭ８突然変異の部位へ広 がる欠失はもはやトランス優性ではなかった（成績は示さず）。

［実施例１０］ ｐＭ１０Ｒｅｖ変異体はｒｅｖ機能の競合的抑制因子である第１１Ａおよび１１ Ｂ図に示した実験結果から、ｐＭｌｏはトランスで存在すると、野生型Ｒｅｖ機 能を抑制できることが判る。然しこれらの実験はｐＭｌｏの大過剰の存在で実施 された。Ｒｅｖ機能のトランス−抑制の効果を一層正確に定量化するため、ｐ　 ｃＲＥＶの単一濃度によるｐＨＩＶ−１Δｒｅｖプロウィルス突然変異体の救援 を抑制するｐＭｌｏの濃度増大による抑制能を分析した。またこの実験では、ｐ Ｍ４およびｐΔ１０／４４Ｒｅｖ変異体の濃度を増大する効果、および野生型Ｒ ｅｖそのものの発現水準を単に増大する効果を試験した。

第１２図に示したように、ｃｏｓ細胞培養（３５ｍｍ）を、ｐＨＩＶ−１Δｒ、 ｅｖ２５ｎｇおよびｐｃＲＥＶ　５０％ｇで同時トランスフェクトし、ｐｃＲＥ Ｖ（マ）　、ｐＭ４　（△）、ｐΔ１０／１４（○）、またはｐＭｌｏ（■）の 倍数モルの過剰を増大した（即ち、１０倍とは示したプラスミド組立て体５００ ｎｇの同時トランスフェクションを表す）。ＤＮＡの添加量合計は、陰性対照と した親発現ベクターｐ　Ｂ　Ｃ１２／ＣＭＶを含めて合計５８７．５ｎｇに保っ た。Ｓ　Ｅ　Ａ　Ｐ遺伝子発現ベクターを内部対照として同時トランスフェクト した（１培養当たり１２．５　ｎ　ｇ）。６５時間目に上清培地を採取し、上清 のＩ）２４　Ｇａｇ発現水準を測定することによって検定した。

この検定の結果を、競合するｒｅｖベクターが全く存在しない場合に得られたｐ ２４の発現水準（水準を１．００と規定）と比較して第１２図に示す。すべての 値はｐＨＩＶ−１Δｒｅｖ　２５％ｇ。

ｐｃＲＥＶ　５０％ｇ、ｐＢｃ１２／Ｒ３Ｖ／５ＥＡＰ　１２．５ｎｇおよびｐ Ｂｃ１２／ＣＭＶ　５００ｎｇでトランスフェクトした培養で観察されたｐ２４ 　Ｇａｇの発貌水準との相対値で表す。この対照培養（・）は、添加したＲｅｖ 変異体の競合的効果の測定に対する基準値となるが、ｐ２４　Ｇａｇ発現を１０ ０単位水準と便宜的に規定した。ここに提示した値を上清５ＥＡＰ濃度で観察さ れた僅かな変動について補正する（平均５ＥＡＰ活性は１．００±０．２７（範 囲１．２８〜０．７２））。

図に示したように、野生型ｒｅｖ発現ベクターｐｃＲＥＶのトランスフェクショ ン水準が増大すると、ウィルス複製に対して複利なプラスの効果が働き、培地へ のｐ２４　Ｇａｇの放出に最高で一７０％の増大をもたらすことが判明した。こ れに反してｐＭ１０ベクターを同時トランスフェクトすると、ＨＩＶ−１構造遺 伝子の発現に劇的な抑制効果を示した。得られた抑制パターンは、生物学的標的 に対して野生型Ｒｅｖと同一の親和性を示すＲｅｖ機能に対する競合的な抑制因 子として期待させるものである。即ち、等モル量のｐＭｌｏではｐ２４　Ｇａｇ の発現を一２倍数減少し、２倍過剰のｐＭｌｏでは発現を一３倍数減少し、５倍 過剰では一６倍数減少したが、１０倍過剰ではｐ２４　Ｇａｇ発現を一９３％減 少した。

］）ＭｌＯ以外にも、ｐΔ１０／１４の同時トランスフェクションでｐ２４　Ｇ ａｇの発現を減少するが、Ｒｅｖのこの大きな欠失変異体はｐＭｌｏはど有効な 抑制因子ではなかった。ｐΔ１０／１４によって発現される厳しく先端を切り取 ったタンパク質は、生物学的標的へのＲｅｖの結合を促進する配列を欠いている ため、効果が低い競合因子である。

最後にｐＭ４の同時トランスフェクションも僅かであるが同様に抑制効果を示す （最高用量を使用しても２倍以下（３２％））。この効果は、ＲＲＥ結合と無関 係な活性（鎮圧）から生じるように考えられる。

［実施例１１］ ＨＩＶ−Ｉ　Ｒｅｖｌ−ランス−活性化因子のドメイン構造上述のように、トラ ンスフェクトした細胞における一過性の遺伝子発現分析を用いて、ＨＩ　Ｖ−１ のトランス−作用性遺伝子生産物Ｒｅｖの一連のミスセンスおよび欠失変異体の 生物学的活性を調べた。これらの結果は、第１２Ａ図（図でＳはスプライス部位 を構成する）に模式的に示したように、Ｒｅｖ内に２つの機能的ドメインが存在 する可能性を明らかに示している。しかもこれらの２つのドメインはトランス− 活性化に不可欠であり得る（ハツチング部分）。

これらのドメインのうち、４種のミスセンス変異体、ｐＭ４．９Ｍ５、ｐＭ６お よびｐＭ７で限定されている第１ドメイン（ＲＮＡ結合ドメイン）は、野生型Ｒ ｅｖのおよそのアミノ酸位置１０〜およそのアミノ酸位置６８の間の約３５アミ ノ酸領域にまたがっており、Ｒｅｖの核局在化に不可欠である高塩基性配列要素 を含んでいる。このドメインはまた、核局在化（ＮＬ）シグナルを含んでいる（ 黒枠）。このドメイン内で変化した突然変異体は劣性の負の表現型を示す。

これに対して第２ドメイン（活性化ドメイン）内の突然変異は、はぼアミノ酸残 基７９を中心にして、一般にミスセンス変異体ｐＭ１０および欠失変異体ｐΔ９ ／１４およびｐΔ１０／１４によって限定されており、Ｒｅｖ機能の喪失を生じ るが、注目すべきことは、これらの変異体によって示される負の表現型はトラン ス優性なことである。Ｒｅｖの２つの領域（第１２Ａ図、ハツチング部分）はタ ンパク質機能にとってさほど必要ではないようである。図で示したように、Ｒｅ ｖ活性化ドメインの突然変異はＲｅｖを欠損させ、野生型Ｒｅｖ機能を競合的に 抑制するタンパク質の生産を生じる。このトランス抑制は、トランスフェクトし た細胞内でのＨＩＶ−１複製を著しく減少または抑制するのに十分である。ｐＭ ｌｏおよび関連する欠失変異体によって示される優性な負の表現型に関する分子 的原理はまだ判っていない。然しミスセンス（ＭＩＯ）および欠失（Δ９／１４ 、Δ１０／１４）変異体が、何れもＲｅ、ｖ機能をトランスで抑制できる観察結 果から、属性の獲得より、むしろその喪失が関与していることが示唆される。一 つの可能性は、欠損型Ｒｅｖタンパク質分子が野生型Ｒｅｖタンパク質のサブユ ニットと混合多量体を作ることができ、そのため野生型タンパク質の機能をトラ ンス優性な態様で抑制するのかも知れない。然しなから生体内でＲｅｖ機能が単 量体であるのか、多量体であるのかは現在のところ判っていない。多数の原核性 および真核性転写因子の詳細な機能分析を含む以前の研究に基づいた別の仮説で は、転写トランス−活性化因子が、タンパク質をその好適な標的物質へ向かわせ る特異的な「結合ドメイン」と、結合反応の機能的結果を発揮させる「活性化ド メイン」　（この場合は転写活性化）の２つの異なった機能的ドメインを保有し ているというものである。幾つかの系で、結合ドメインが配列特異的なりＮＡ結 合要素からなることが判明した。然し少な（とも１つの例では、単純ヘルペス１ 型ウイルス（ＨＳＶ−１）ｈランス−活性化因子〜′Ｐ１６の場合、結合ドメイ ンは細胞性転写因子との特異的な相互作用を仲介する代わりに、ＨＳ　Ｖ−１ケ ノム内の標的配列へ結合するようである。重要なことは、結合ドメインの突然変 異は緩和な発現水準で劣性である負の表現型を生じる傾向があることである。こ れとは対照的に、転写因子の活性化ドメインの突然変異または欠失は、優性な負 の表現型を備えた変異体を生じ得る。

これらの変異体はインタクトな結合ドメインを保有しており、好適な細胞標的へ 結合する野生型トランス−活性化因子と競合するが、いったん結合が起こると転 写を活性化できないと信じられる。ＨＳＶ−ＩＶＰ１６タンパク質の場合、その ようなトランス優性な変異体の過剰発現は野生型ＶＰ１６機能を効果的に抑制し 、そのために正常な許容細胞でＨＳＶ−１の複製を妨害することが判明した。

ｒｅｖ遺伝子生産物は遺伝子発現の転写後トランスー調節因子であるが、この場 合に２つの異なった機能的ドメインの概念が適用し得ると考えるのが合理的なよ うである。特にＲｅｖは、そのＲＮＡ標的配列（ＲＲＥ）との直接的な相互作用 を介して、極めて配列特異的な態様で機能するので（Ｍ、　Ｈマリムら、セル、 ６０巻、［１９９０年］、６７５〜６８３頁）、シたがってこの特異性を付与す る配列を含んでいるはずである。いったん結合が起これば、その結果は活性化反 応（この場合、ＨＩＶ−１構造タンパク質を暗号化している不完全にスライスさ れたＲＮＡの核放出）へ翻訳されるはずである。したがってこの活性化ドメイン における突然変異は、野生型Ｒｅｖ機能の競合的な抑制因子を生じ得る。これが ＲｅｖのｐＭＩＯおよびｐΔ１０／１４変異体で観察された表現型であり、これ らの変異体は分離した活性化ドメインの存在を示しているのかも知れない。逆に この突然変異分析によって規定されたＲｅｖタンパク質の第２の一層Ｎ−末端に 不可欠な領域は、数個の転写因子であると定義された「結合ドメイン」と同一機 能を果たし得る。事実、このドメインで変化した突然変異体（例えばｐＭ４、ｐ Ｍ７）は、低いけれども有意な抑制を高い発現水準で観察されるが、一般に劣性 の負の表現型を示す。Ｒｅｖ活性化ドメインの局在化を、野生型Ｒｅｖのおよそ のアミノ酸位置６８〜およそのアミノ酸位置９０、特におよその位置７８〜およ その位置８６、ことにおよその位置７８〜およその位置８３または８４まで伸長 するように高めるトランス優性な突然変異体がそれ以外にも発見された（第５Ａ 図、および実施例１１Ａおよび１１Ｂ参照）。

［実施例１１ａ］ それ以外のトランス優性なＨＩＶ−Ｉ　Ｒｅｖ突然変異体６．２項で報告した方 法と同様に、それ以外のＨＩＶ−１ｒｅｖ変異体を作成した。これらを第５Ａ図 および第２表に示したように命名し、特性を調べた。生体内における表現型をマ リムらの方法（Ｍ、Ｈ，マリムら、セル、５８巻、［１９８９年コ、２０５〜２ １４頁）にしたがい測定した（すべての検定はトランスフェクション効率のため 内部的に調節した）。

実施例４〜１１に報告した変異体に追加して、それ以外の突然変異体、ｐＭ２１ 、ｐＭ２２、ｐＭ２７、ｐＭ２８、ｐＭ２９およびｐ　Ｍ　３２が、野生型ＨＩ Ｖ−Ｉ　Ｒｅｖ機能をトランス優性に抑制することが判明した。

［第２表］　それ以外のＨＩＶ−１ｒｅｖ遺伝子突然変異体の表現型分析 クローン　表現型“　トランス優性な抑制５ｐＢｃ１２／ＣＭＶ（ヘクター単独 ）　ＱｐΔ９／１９　− （第２表つづき） ＋＋　４０〜１００％（野生型Ｒｅｖ活性と比較して）５野生型Ｒｅｖより１０ 倍過剰の突然変異体Ｒｅｖの場合（野生型［実施例１１ｂ］ ＨＩＶ−２および５ＩＶＲｅｖ機能に対する効果実施例４〜１１のトランス優性 なＨＩＶ−１ｒｅｖ遺伝子突然変異体の多価可能性を、６．２項およびＭ、Ｈ， マリムら（プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ イエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８６巻、［１９８９年コ、８２２２〜８２２６ 頁）が既に報告した手法を使用して分析した。得られた結果から、少なくとも変 異体ｐＭ１０はＨＩＶ−１ｒｅｖ遺伝子の表現型発現ばかりでなく、ＨＩＶ−２ ｒｅｖ遺伝子およびＳＩＶ、、、ｃｒｅＶ遺伝子機能をもトランス優性に抑制す る抑制能を有することが判った。例えばＨＩＶ−２ｒｅｖの場合、ｐＭｉｏの過 剰を野生型ＨＩＶ−２ｒｅｖ遺伝子とともに発現させると、細胞質におけるスプ ライスされないｍＲＮＡおよびエキフン１個形のｔａｔの発現の抑制によってＨ ＩＶ−２Ｒｅｖ機能を強力に抑制する。

［６，３コ ［実施例１２］ Ｒｅｘ機能の分析 Ｒｅｘ機能に対してｒｅｘ突然変異体を試験するため（第１４図）　、ＤＥＡＥ −デキストランを使用して、各変異体ＤＮＡをｐｇＴ４へＸ−ＬＴＲとともにＣ ｏＳ細胞へ同時トランスフェクトした（ＢＰ、カレン、メソッズ・イン・エンジ モロジー、１５２巻、［１９８７年コ、６９２〜６９３頁）。プラスミドはすべ て１．２５μｇ／ｍ１の濃度で添加した。４８時間トランスフェクション後、細 胞を３５８−システィンで代謝的に２時間標識し、細胞抽出物を調製し、試料ヲ 、ＨＴＬＶ−■エンベロープタンパク質と特異的に反応する０、５αヒトモノク ローナル抗体で免疫沈降させた。免疫沈降物を５ＤＳ−１０％ポリアクリルアミ ドゲルで分析した。

ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｅｎｖ、ＴａｘおよびＲｅｘタンパク質生産生産物時分析するた め（第１５図）、ＣＯ８細胞をｐｇＴＡＸ−ＬＴＲ（０，１μｇ／ｍｌ）および 突然変異体Ｒｅｘタンパク質を暗号化しているベクター（１ｕ　ｇ／ｍｌ）また は野生型ｐＲＥＸ、ｐＲｅｖおよびｐｃＭＶ−ＬＬ〜２ベクター（１μｇ’／ｍ ｌ）で同時トランスフェクトした。ＨＴＬＶ−Ｉタンパク質の免疫沈降分析のた め、下記の抗体を使用した。Ｅｎｖ：０．５α抗体、Ｔａｘ：Ｔａｘ特異的な抗 ペプチド家兎抗血清［発明者の１人が調製、またＷ、ワックスマンらの方法（サ イエンス、２３５巻、［１９８７年Ｌ　６７４〜６７７頁）によっても調製でき る］、Ｒｅｘ：Ｒｅｘ特異的な抗ペプチド家兎抗血清［発明者の１人が調製、ま たＨ、シーミらの方法（セル、５５巻、［１９８８年］、１９７〜２０９頁）に よっても調製できるコ。各例毎に、放射能標識した細胞抽出物をそれぞれ３回ず つ免疫沈降および電気泳動分析に使用した。得られたオートラジオダラムを、そ れぞれの関連領域だけ第１５図のパネルに示す。

免疫沈降によるＨＴＬＶ−Ｉ　Ｒｅｘ変異体の腫細胞性局在化のため（第１６図 ）、表記の発現プラスミドでＣｏＳ細胞をトランスフェクトし、４８時間後にパ ラホルムアルデヒドで固定した。ついで細胞を、前に述べたように家兎抗Ｒｅｘ ペプチド抗血清（１：１００倍希釈）およびローダミン結合ヤギ抗家兎ＩｇＧで 逐次染色した（Ｂ、Ｒ，カレン、［１９８７年］、前掲）。

［実施例１３コ ＲｅｘおよびＲｅ　ｖ機能の抑制 野生型Ｒｅｘタンパク質の機能を抑制するｒｅｘ突然変異体の抑制能を分析する ため（第１７Ａ図）、ＣＯ８培養をｐｇＴＡＸ−ＬＴＲ（１，２５μｇ／ｍｌ） 　、ｐＲＥＸ　（０，１μｇ／ｒｎｌ）と、Ｒｅｘ変異体（レーン１〜６）　、 ｐＲＥＸ　（レーン７）　、ｐＲｅｖ　（レーン８）またはｐｃＭｖ−ＩＬ−２ （レーン９）ｌμｇ／ｍ１を含むそれぞれ３種のプラスミドで同時トランスフェ クトした。Ｅｎｖ生産物を０．５αモノクローナル抗体との免疫沈降および５Ｄ Ｓ−１０％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動により分析した。ＨＩＶ−１ ｒｅｖタンパク質機能の抑制を分析するため、ＣＯ８細胞をｐｇＴＡＴ、ｐＲｅ ｖ、および１０倍モル過剰のｐＢＣ／ＣＭＶ−ＩＬ−２またはＭ６、Ｍｌおよび Ｍ１３トランス優性変異体で同時トランスフェクトした。４８時間の培養および ３５Ｓ−システィンによる生合成的な標識ののち、細胞抽出物を、Ｒｅｖ誘導し た先端を切り取った７２アミノ酸形のＴａｔタンパク質生産生産物疫沈降によっ て検定した（レーン２）。完全鎖長のＴａｔタンパク質の８６アミノ酸形だけが 検出されたように、１０：１のモル比で、Ｍ６、ＭｌおよびＭｌ３（レーン３〜 ５）変異体は、ＨＩＶ−ＩＲｅｖタンパク質の作用を完全に抑制した。ＨＩＶ− １複製の抑制を分析するため、ｒｅｖ欠損型ＨＩＶ−１プロウイルスプラスミド ｐＨＸＢ２−Ｂａｍ−ｐ３　（Ｍ、Ｒ，ファインバーブら、セル、４６巻、［１ ９８６年〕、８０７〜８１７頁）およびｐＲＥＸで、Ｍｌ、Ｍ６、ＭｌおよびＭ １３変異体のそれぞれ表記した過剰倍数量の存在で、ＣＯ８細胞を同時トランス フェクトした。トランスフェクション混合物中のＤＮＡ濃度の合計は、ｐＢＣ／ ＣＭＶ−ＩＬ−２親ベクターの添加量を変えることによって一定濃度に保った。

トランスフェクション３日後、ＨＩＶ−１ｐ２４Ｇａｇタンパク質の上清濃度を ＥＬＩＳＡ（コールタ−・イムノロジー・キット）によって測定した。Ｍ６、Ｍ ｌおよびＭ１３変異体は用量に比例したＨＩＶ−１ｐ２４生産の抑制を生じたが 、劣性の負のＭ１変異体は抑制を示さなかった。

［７コ　薬理学的考察 ＨＩＶ−１はエイズの主な病因学的な作因である。ＨＴＬＶ−Ｉは一般にＡＴＬ の原因となる。ＨＴＩＬｖ−１１は異型Ｔ細胞毛状細胞性白血病のある種の例に 病因学的に■係する。ＨＩＶ−Ｉ　ＲｅｖおよびＨＴＬＶ−Ｉ　Ｒｅｘトランス −１活性化因子は、培養で複製に不可欠であることが判明し、ＲｅｖおよびＲｅ ｘはしたがって罹患患者における化学療法介入の可能性のある目標である。

ここで報告するのは、野生型ＲｅｖまたはＲｅｘでトランスフェクトされた細胞 で野生型Ｒｅｖおよび／またはＲｅｘ機能の有効な競合的抑制因子として作用し 、したがってＨＩＶ−１および／またはＨＴＬＶ−１および／またはＨＴＬＶ− ＩＩ複製の有効な抑制因子として作用するＲｅｖおよび／またはＲｅｘの変異体 形態である。

したがってこれらの変異体は、感染にさらされた患者のリンパ細胞を保護するの に使用し得る。この研究の実用化が期待できる適応は、Ｈ３Ｖ−１の本質的なり Ｐ１６トランスー活性化因子に類似したトランス優性な誘導体の発現が、Ｈ８Ｖ −１感染に対する耐性を正常な感受性細胞集団へ有効に付与できた観察結果であ る（Ａ、Ｄ　〕リードマンら、ネーチャー、３３５巻、［１９８８年コ、４５２ 〜４５４頁）。また対応するトランスノニニツタマウスがＨ８Ｖ−１感染に対し て免疫されるようである。

即ち、ＲｅｘまたはＲｅｖのトランス優性な抑制因子を暗号化した突然変異体ｒ ｅｘおよびｒｅｖ遺伝子は、ＨＴＬＶ−１またはＨＴ　Ｌ　Ｖ−ＩＩによって起 こる疾患の処置、またはエイズおよびＡＲ３（ＡＲＣ）を含むＨ１〜ｒ−１で誘 発される疾患の処置に、それぞれ「細胞内免疫原」として使用するのに薦められ る。さらにこの発明の少なくとも幾つかのトランス優性なＲｅｘ突然に異体タン パク質は、特にＨＴＬＶ−Ｉ　ＲｅｘおよびＨＩＶ−Ｉ　Ｒｅｖタンパク質作用 を両者とも抑制できる特性を有するから、この２種類のウィルス型による感染の 処置への使用が薦められる。この特性は、１種類以上のこれらのウィルス性病原 に同時感染した患者、またはその感染がこれら２つのウィルス間で鑑別できない 患者の場合、特に有用であり得る。

１種類以上のウィルス種に対して有効な治療剤の存在は、この発明以前には全く 開示されていないと思われる。広範な適用性の観点から、上記の概念は、Ｒｅｖ およびＲｅｘを暗号化しているウィルス種によって起こされた疾患の治療に適用 されるだけでなく、同様に調節される遺伝子を有する微生物によって起こされた それ以外のウィルス疾患にも適用され得るであろう。

このようにこの発明は、ウィルス疾患の予防および治療、特にＡＴＬ（成人Ｔ細 胞白血病）、エイズ（後天性免疫不全伺候群）、ＡＲ３またはＡＲＣ（エイズ関 連症候群または複合体）、ＳＩＶ、、ｔのような５ＩＶ（サル免疫不全ウィルス ）、ＦＩＶ（ネコ免疫不全ウィルス）、ＥＩＡＶ（ウマ感染性貧血ウィルス）、 ビスナウィルスおよびウシ免疫不全ウィルス感染症のようなレトロウィルス、具 体的にはヒトレトロウィルス疾患、より具体的にはｒｅｘまたはｒｅｖ遺伝子に よって調節される病原体、またはそれと同等な病原体によって起こるＡＴＬ、エ イズ、およびＡＲ３（ＡｋＲＣ）のようなヒトレトロウィルス疾患の予防および 治療への使用に適用される。

特に好都合なことは、そのリプレッサー効果の多価性であって、ＨＩＶ−１およ びＨＴ　Ｌ　Ｖ司に同時感染した静注薬使用者てしばしば見られるようなウィル スによる多重感染、特に二重感染の処置、またはそれ以外の感染（例えばＨＩＶ 感染）の危険が増大している単純感染状態の処置、異なったウィルス種スペクト ルによる感染を防御することが望ましい状態の予防に有用である。

この多価性は、ある特定型のウィルスの関連ウィルス、例えばレトロウィルスの 抑制に最も有効であると通常期待されるが、ＤＮＡウィルスないしＲＮＡ　（レ トロ−）ウィルスの何れかのように、必ずしも極めて近縁のウィルスに制限され る必要はなく、例えばＨＩＶ−１とＪＣウィルス（ヒトパポーバウイルス）間の ようなりＮＡウィルスとレトロウィルスの間の感染レベルで相互作用が存在しく Ｈ，ゲンダーマンら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ− ・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８３巻、［１９８６年］、９７５９ 〜９７６３頁、Ｈ，タダら、同誌、８７巻、〔１９９０年］、３４７９〜３４８ ３頁）、シたがって上記の多価トランス優性の原理が適用できる系統的に一層離 れたウィルス種で共通の調節メカニズムがよく作動し得ることが知られている。

この発明の治療上の可能性は、例えばＨＴ　Ｌ　Ｖ　−１のＲｅｘ機能およびＨ ＩＶ−１のＲｅｖ機能の抑制がウィルスの複製を阻止し、感染性ウィルス粒子の 生成を防止することによって、感染の潜伏段階を持続させることが期待されるか ら直ちに明白である。したがって既にＨＩＶ−１ウイルスに感染した対象の細胞 は、トランス優性なリプレッサーの遺伝子をそのゲノムに組み込んで保有してお り、細胞は機能的なまま温存され、対象は長期治療の必要なく、疾患の症状をい つまでも発現しない。

この観点に立てば、この発明の遺伝子は、それ自体医薬品であって、生体内へ直 接、または生体外で間接に、１回または多回投与により、好ましくは例えばレト ロウィルスベクターまたはプラスミドベクターのようなベクターを要素として、 標的哺乳動物細胞へ機能的な形態で送達を達成し得るのに好適な形態で投与され る。例えばそのようなウィルス複製のトランス優性な抑制因子を暗号化している 遺伝子を、感染患者自身に由来するリンパ細胞のゲノムへ直接埋め込むことによ り、患者の細胞へ生体外で挿入を行い、挿入を実施した後、それらの細胞を保菌 患者へ投与し得る。ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩ、およびＨＩ　Ｖ−１は さまざまな型のＴ細胞で複製するので、それらが原因となった疾患は特に好適で あると思われる。

したがってこの発明の１適用は、例えばフリートマンが報告した遺伝子治療の概 念に相当する（Ｔ　フリートマン、サイエンス、２、Ａ、Ａ、：私、［１９８９ 年６月１６日号］、１２７５頁、またはＰ、Ｍ。

レーン、ボーン・マロー・トランスプラント、】巻、［１９８７年］、２４３頁 ）。造血幹細胞を例えばエイズ／ＡＴＬ患者から採取し、生体・外′で培養（シ １、この発明により突然変異して、Ｒｅｘ／Ｒｅｖ　＊能のような’ｆＭＩす・ べ、き機能に対するトランス優性リプレッサーを暗号化している遺伝子を１、ル トロウイルスベクターを利用してこれらの細胞へ埋め込み、このようにしてウィ ルス耐性となった子孫生産能を備えた幹細胞を、もとの患者の免疫系へ戻してや ると、細胞は、獲得した未処置幹細胞より選択的な優位性により増１することが 期待される。やがて造血細胞の集団は完全にトランス擾性力、因子を生産する細 胞から構成され、ウィルス耐性である。

これを実施する方法は技術上既知である（例えば米国特許第４８６８１１６号） 。この発明によって突然変異した遺伝子を、骨髄細胞のような標的哺乳動物細胞 へ送達するためのベクター、例えばレトロウィルスベクターまたはプラスミドベ クターは報告されており、ここに引用する（サイエンス、２４４巻、［１９８９ 年６月１６日号］、１２７５頁）。したがって、例えば種々のＲｅｖおよび／ま たはＲｅｘ　トランス優性遺伝子をレトロウィルスベクター系へクローン化すゐ 。レトロウィルス依存性遺伝子を、例え°ば１（］■感染したヒトの細胞系へ送 達したのち、トランス優性な突然変異体の抑制効果をウィルス生産物の抑制によ って容易に確かめられる。

上記の治療概念は、バルチモアが着想した細胞内免疫の例である（Ｄ、バルチモ ア、ネーチャー、３３５巻、［１９８８年］、３９５頁）。簡単に説明すると、 この概念は、選ばれたウィルスのある生、活機能のリプレッサーを暗号化してい る遺伝子を、そのウィルスが感染した特定の標的細胞へ挿入することからなる（ 例えばエイズを起こすウィルスの場合、特でのＴ細胞）。こｊの研究方法を任意 のウィルスのトランス優性リプレッサーで治療に適用するには、その４ような突 然変異体タンパク質を暗号化している遺伝子のための可能性あるベクターおよび これらのベクターを適当な細胞へ挿入する、モデル系で確かめられた可能性ある 方法を、ヒトまたは動物へ適用するのに有効で安全な細胞内送達システムの構成 が確立されることが前提条件である。この概念を実験的に立証するための試験を 実行に移すには、現在のところ遺伝子治療を防止しようとする倫理的な障壁のた めに必ず困難が伴う。然しそのような遺伝学的な最初の実験は、非治療的な目的 で既に開始された。その方法の無害性が証明されれば、極めて短期間にこれらの 先駆的な実験に引き続き、まずエイズ疾患のような致命的な条件で、治療目的に 向かって類似の研究が行われるであろう。この発明はそのような研究で初期の利 用によく適合すると思われる（Ｔ、フリートマン、サイエンス、２４４巻、［１ ９８９年６月１６日号］、１２７９頁、第２欄、「インフエクシアス・ディシー ジズ」、参照）。

この発明を利用するもう一つの態様は、遺伝子ではなくてこの発明のリプレッサ ータンパク質を標的細胞へ挿入することを含む。投与は、例えば経口または非経 口で、例えばリポソームを介する送達によって細胞内へ透過できる形で通常の態 様で実施する。

言うまでもなく、これらの用途のための正確な投与量は、使用する化合物、投与 方法および所望する処置によって変わる。個々の状態に応じて最も好適な投与量 を確定することは、当業者の熟知するところである。

この発明はさらに、トランス優性に基づいた抗ウィルス薬の設計および技術に使 用することができる。この発明によって、ウィルス　−の種類によりその構造的 原理は幅広く変わるけれども、数種のウィルス種に全般に適用可能であると思わ れるウィルス遺伝子機能を操作する手段を発見した。この予期しなかった発見は 、さらに特異的な、多分低分子量で、多分非ペプチド性のトランス優性なウィル ス複製の抑制剤、特にトランス優性な、即ち、低分子量の抑制剤または中和モノ クローナル抗体のような、変異体ＲｅｖまたはＲｅｘりンパク質におけるＲＮＡ −結合ドメインを一次的に真似ることができる抑制剤を設計することを目的とし た研究を行う道を開いた。

以上説明した発明に関して、この発明の範囲から逸脱することなく、その態様ま たは詳細の点でさまざまな組み合わせまたは変更を行うことができることは明ら かである。

本明細書で報告した変異体以外にも、既に組み立てられた特異的な突然変異体の 中で、まだ特性が明らかになっていないが、一層詳細な実験によってトランス優 性に抑制的であり、または多価であることが確かめられる変異体、および前記の 原理に基づき、ただし本明細書では具体的に説明を加えなかったそれ以外の突然 変異体もまた、この発明の範囲に包含されることは明らかである。

特表平４−５００００９　（３８） Ｆ工ＧＬＩＲＥ　ｌＡ ２６　Ｌ　Ｄ　Ｒｖ匝］ｏ　Ｔ回ＩＩＴＣＬ［ＩＶＹＫＡＴＧＡ［１５０Ｍ２　 Ｍ３　Ｍ４　Ｍ５ １５１　Ｌ　ｒ：　Ｏ丁Ｐ　ｏｖＧＰ　Ｋ　Ｔ　ＣＴアＩ■ＩＡｐ「ＩＡＣＴ　 １７４Ｍ２３　Ｍ２ｋｌ　Ｍ２ｆ　Ｍ２Ｇ ＦＩＧＵＲＥ　２Ａ ”　２７　ｋＤ ＦｒＧＬＩＲε　２Ｂ ＦＩＧＵＲＥ　２Ｃ ＦＩＧＵＲＥ　２［） ＡＢＣＤＥＦＧＨＩ ＦＩＧ　υＲＥ　３ １　Ｔｈｒ−Ｓｅｒ　２２−２３　Ａｓｐ−Ｌｅｕ２　Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−５ｅｒ 　３０−３１−３２　Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ３　Ｇｌｎ−５ｅｒ　３５−３６ 　Ａｓｐ−Ｌｅｕ４　Ｇｌｕ−Ｔｈｒ　４０−４１　Ａｓｐ−Ｌｅｕ５　Ｐｒｏ −５ｅｒ　４９−５０　Ａｓｐ−Ｌｅｕ６　Ｔｙｒ　５４　Ｌｅｕ ７　Ａｌａ−Ｔｙｒ　５８−５９　Ａｓｐ−Ｌｅｕ８　Ｐｒｏ−Ｔｙｒ　６３− ６４　Ａｓｐ−Ｌｅｕ９　Ｇｌｎ−５ｅｒ　６９−７０　Ａｓｐ−Ｌｅｕｌｏ　 Ａｒｇ−５ｅｒ　７２−７３　Ａｓｐ−Ｌｅｕｌｌ　Ｐｒｏ−５ｅｒ　７７−７ ８　Ａｓｐ−Ｌｅｕ１２　Ｌｅｕ−５ｅｒ　８２−８３　Ａｓｐ−Ｌｅｕ１３　 Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−５ｅｒ　８７．８８．８９　Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ１４　Ｌ ｅｕ−５ｅｒ　９０−９１　Ａｓｐ−Ｌｅｕ１６　Ｐｒｏ−５ｅｒ　９６−９７ 　Ａｓｐ−Ｌｅｕ１７　Ａｒｇ−Ｇｌｕ　１００−１０１　Ａｓｐ−Ｌｅｕ１８ 　Ｓｅｒ−Ａｒｇ−５ｅｒ　１０６．１０７．１０８　Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ １９　Ｇｌｎ−５ｅｒ　１１２−１１３　Ａｓｐ−Ｌ＠ｕ２０　５ｅｒ−５ｅｒ 　１２４−１２５　Ａｓｐ−Ｌｅｕ２１　Ｐｒｏ−５ｅｒ　１３３−１３４　Ａ ｓｐ−Ｌｅｕ２２　５ｅｒ−Ｔｈｒ−５ｅｒ　１４５．１４６．１４７　Ｇｌｙ −Ａｓｐ−Ｌｅｕ２４　Ｐｒｏ−５ｅｒ　１６４−１６５　Ａｓｐ−Ｌｅｕ２５ 　Ｇｌｙ−Ｇｌｕ　１６６−１６７　Ａｓｐ−Ｌｅｕ２６　Ｌｅｕ−５ｅｒ　１ ７０−１７１　Ａｓｐ−Ｌｅｕ２７　５ｅｒ−Ｔｈｒ−５ｅｒ　１７５．１７６ 、１７７　Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ２Ｂ　Ｐｒｏ−５ｅｔ　１８１−１８２　Ａ ｓｐ−Ｌｅｕ２９　Ｐｒｏ−５ｅｔ　１８５−１８６　Ａｓｐ−ＬｅｕＦＩＧＵ ＲＥ　４ 替１：　ＣＡ　ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＣＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＣＡＧ　ＧＧ Ｔ　ＴＴに　ＧＡＣ＃　６：　ＣＣＣＣＡ　ＴＣＴ　ＣＴＧ　ＧＧＡ　ＧＡＴ　 ＣＴＴ　ＧＴＴ　ＣＧＧ　ＣＣＣＧＣＣ＊　１０：　ｃｒ　ＧＴＣＣＡＧ　ＡＧ ＣＡＴＡ　ＧＡＴ　ＣＴＡ　ＣＣＴ　ＧＧＧ　ＡＣＣＣＣＡ番１１：　ＧＡ　Ｔ ＣＡ　ＣＣＴ　ＧＧＧ　ＡＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＡＴＧ　ＧＡＣＧＣＧ　ＴＴ Ａ＃　１２：　ＣＡ　ＴＣＧ　ＡＴＧ　ＧＡＣＧＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＧＣＴ 　ＣＡＧ　ＣＴＣＴＡＣ＃１３：　ＴＣＣＧＣＴ　ＣＡＧ　ＣＴＣＴＴＡ　ＧＡ Ｔ　ＣＴＣＴＴＡ　ＴＣＣＣＴＣＧＡ替１４：　ＡＧ　ＣＴＣＴＡＣＡＧＴ　Ｔ ＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＣＴＣＧＡＣＴＣＣＣＣＴ＃　１５：　ｃＴＴＣＣＴＴＡ 　ＴＣＣＣＴＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＣＣＴ　ＣＣＴ　ＴＣＣＣＣＡ善１６：　ｃｃ 　ＣＴＣＧＡＣＴＣＣＣＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＣＣＡ　ＣＣＣＡＧＡ　ＧＡＡ＃ 　１９：　ＧＧ　ＴＣＣＴＴＡ　ＣＣＣＣＧＡ　ＧＡＴ　ＣＴＡ　ＣＴＣＡＴＡ 　ＣＡＡ　ＣＣＣ４ｊ　２０：　ＣＡ　ＴＴＣＣＡＣＣＣＴ　ＣＣＡ　ＧＡＴ　 ＣＴＣＡＧＧ　ＣＣＡ　ＴＧＣＧＣＡ＃　２１：　ＧＣＧＣＡ　ＡＡＴ　ＡＣＴ 　ＣＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＧＡＡ　ＡＴＧ　ＧＡＴ　ＡＣＡ替２２：　ＣＡ　Ｃ ＣＣＴＴＧ　ＧＧＣＧＧＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＣＡＡ　ＣＣＣＴＧＴ　ＣＴＴ＃２ ３：　ＴＴＴＴｃ　ＣＡＧ　ＡＣＣＣＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＧＧＣＣＣＣＡＡＡ 　ＡＣＣ＃　２４：　ＣＣＡＡＡ　ＡＣＣＴＧＴ　ＡＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　Ｇ ＧＧＧＡＧ　ＧＣＴ　ＣＣＧ：ｔ　２５：　ＣＣＴＧＴ　ＡＣＡ　ＣＣＣＴＣＡ 　ＧＡＴ　（ｍｌ；　ＧＣＴ　ＣＣＧ　ＴＴＧ　ＴＣτ＃　２６：　ＣＴ　ＧＧ Ｇ　ＧＡＧ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＧＣＡ　ＴＧＴ　ＡＣＣＴＣＴ ：　２７：　ＣＴ　ＧＣＡ　ＴＧＴ　ＡＣＣＴＴＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＴＴＴ　Ｃ ＣＣＣＣＣＣＣＡ＃　２８：　ＣＣＡＧＣＴＴｒ　ＣＣＣＣＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴ Ａ　ＣＣＴ　ＧＧＣＣＣＣＴＣＣ＊　２９：　ｃｃ　ＣＣＡ　ＴＣＡ　ＣＣＴ　 ＧＧＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＴＧＣＣＣＣＡＣＧ　ＴＧＡＦＩＧＵＲＥ　５ ＦＩＧＵＲＥ　６ Ｆ　工ＧＵＲＥ　７ ＭＩ　ＣＣＴ　ＡＴＧ　ＧＣＡ　ＧＧＡ　ΩΔエニー；ＣＧＧＡ　ＧＡＣ入ＧＣ ＧＡＭ２　ＧＡ　ＡＧＡ　ＡＧＣＧＧＡ　ＧＡＡ−ＱΔニーｇ工ＣＧＡＡ　ＧＡ ＣＣＴＣＣＴＣＭ３　ＣＣＴＣＡＡＧ　ＧＣＡ　ＧＴＪムＵＣλτＣＡＡＧ　Ｔ ！Ｔ　０Ｍ４　ＡＧ　ＴＴｒ　ＣＴＣＴＡＴ　ＣＡＬ！−工ＪＣＣＣＡ　ＣＣＴ 　ＣＣＣＡＭ５　Ｇ　Ａｃｅ　ＣＧＡ　ＣＡＧ　ＣＣＡ−ＱΔエニー＞　入Ａτ 　入ＧＡ　ＡＧＡ　ＡＧＭ６　Ｇ　ＧＣＣＣにＡ　ＡＧＧ　λべ配Δｄａ！Ｓ１ Ｇ　ＴＧＧ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　０Ｍ７　Ｇ　ＡＧＡ　ＣＡＧ　ＡＴＣＣ ＡＴ　Δ：工　ＧＡＡ　ＣＧＧ　ＡＴＣＣＴＩ’　ＡＧＣＭ８　ＧＴ　ＧＡＡ　 ＣＧＧ　ＡＴＣＣＴＡ」シｙＬ≦＝テτλＴ　ＣＴＧ　にＧＡ　Ｃ０Ｍ９　ＴＡ Ｔ　ＣＴＧ　ＧＧＡ　ＣＣＡ−Ｑへニー；工Ｇ　ＧＡＧ　ＣＣＴ　ＧＴＧ　ＣＣ Ｍｌｏ　ＣＡＧ　ＣＴＡ　ＣＣＡ　Ｃ４工Ｇ　ＡＧＡ　ＣＴｒ　ＡＣＴ　ＣＴ！ ’Ｍｌｌ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＴＧＴ　ＣＧＡ」ｖソ二≦＝ズ　ＧＧＧ　ＡＣＧ　 ＣＡＧ　ＧＧＭ１２　ＣＡＧ　ＧＧＧ　ＧＴＧ　ＧＧＩ、ＪΔニーｒｃ入入入Ｔ Ａ　Ｔ’ｒＧ　ＧＴＣＭ１３　ＣＡＡ　ＡＴＡ　ＴＴＧ　ＧＴＧ　ＧＡＡ−Ｓｉ じＬ−＝ｒｒ　ＡＣＡ　ＧＴＡ　ＴＴＧ　ＧＡＧＭ１４　ＣＴ　ＡＣＡ　ＧＴＡ 　ＴＴＧ　ＧへＬＳΔ工」＝五ＧＣＴ　ＡＭ　ＧＡＡ　ＴＡＧＦ工ＧＯＲＥ　８ ＦＩＧ　υＲＥ　１１Ａ ２５．７− ＦＩＧ　ＬＩ　ＲＥ　１１Ｂ ＋２３４５６ −　−工 −・　−Ｕ Ｆ　Ｉ　Ｇ　Ｕ　ＲＥ　１２ 添６１７　Ｌｒ：ρεＶベアターのＦ目を子５帛し４虻。

ＦＩＧ　υＲＥ　１２Ａ １２、ＮＡ　製ン訃ｐンイン　シ凸ｌ繍チ仁Ｆ×インＦ　Ｉ　Ｇ　＋Ｊ　ＲＥ　 １３ ＭＰＫ口ＥＥＩＥ］ｐ　ＲＲ口！■ＫＥＰ　Ｐ　Ｔ　ｐＱｗｐロｆｉロＥＦＩＶ 匠コＳ回■互！］Ｃ＝ミＡＬＳＡＯＬ区Ｉ刃ＬＳＬつ５ＰＰＳｐｐ呵「ＢＬＲＰ ＝Ｌｐ’ｆ’Ｅ互ＩＱＬ　Ｉ　Ｑ　Ｐ　−１２Ｆ　Ｉ　Ｇ　Ｕ　ＲＥ　１４ ｚＸ　χ　に　ｋｌ＜　χ　ン　χ　Ｘ５５５５５５乞％　％　％ Ｆ工ＧＵＲＥ　１５ Ｆ　Ｉ　Ｇ　Ｕ　ＲＥ　１６ Ｆ　Ｘ　Ｇ　Ｕ　ＲＥ　１７ 国際調査報告 ＋Ｍ′″−１°°０°””””””　ｐＣ〒Ｂ’ｐ　Ｑｎ／ｎｎ１Ｊｉ＋１＊＋ ・１１１１重−Ｍ１＾−””””ＤＭ１ＣＭＱｌ’ｌ／ｎｆｌｌｌｆｆ１ＩＭｓ ｒｍｍｌｌａｌ＾鰺１ｂ−ｍ、ＥＰ　９０１００８３１

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. （１）１種以上のウイルス種の機能的に等価な遺伝子の表現型発現をトランス優 性に抑制し、したがって１種以上のウイルス種の複製を阻止するタンパク質を暗 号化している遺伝子、またはその機能的な断片または誘導体。
2. （２）１種以上のウイルス種の機能的に等価な遺伝子の表現型発現をトランス優 性に抑制し、したがって１種以上のウイルス種の複製を阻止するタンパク質、ま たはその機能的な断片または誘導体。
3. （３）それによって抑制される遺伝子が、ＨＴＬＶ−Ｉｒｅｘ、ＨＴＬＶ−Ｈｒ ｅｘ、ＨＩＶ−１ｒｅｖ、ＨＩＶ−Ｈｒｅｖ、ＳＩＶｒｅｖ、ＥＩＡＶｒｅｖ、 ビスナウイルスｒｅｖ、およびウシ免疫不全ウイルスｒｅｖの２種またはそれ以 上から選ばれたものである請求項１記載の遺伝子、または請求項２記載のタンパ ク質、または 抑制される遺伝子が、ＨＴＬＶ−ＩｒｅｘおよびＨＩＶ−１ｒｅｖである請求項 １記載の遺伝子、または請求項２記載のタンパク質、または 抑制される遺伝子が、ＨＩＶ−１ｒｅｖおよびＨＩＶ−２ｒｅｖである請求項１ 記載の遺伝子、または請求項２記載のタンパク賃、または、 野生型Ｒｅｘタンパク質の約２２〜１０１の間、好ましくは約８２〜約９７の間 、ことに約８７〜約９４の間のアミノ酸位置に突然変異体を有するＨＴＬＶ−Ｉ Ｒｅｘタンパク質を暗号化している請求項１記載の遺伝子、またはＨＴＬＶ−Ｉ Ｒｅｘタンパク質である請求項２記載のタンパク質、または 寿生型Ｒｅｘタンパク質の約５９〜１２１の間、好ましくは約５９、６０、６４ 、６５、１１９、１２０、または１２１のアミノ酸位置に突然変異体を有するＨ ＴＬＶ−ＩＲｅｘタンパク質を暗号化している請求項１記載の遺伝子、またはＨ ＴＬＶ−ＩＲｅｘタンパク質である請求項２記載のタンパク質、または野生型Ｒ ｅｖタンパク質の約６８〜９０の間、好ましくは約７８〜約８６の間、ことに約 ７８〜約８３または８４の間のアミノ酸位置に突然変異体を有するＨＩＶ−１Ｒ ｅｖタンパク質を暗号化している請求項１記載の遺伝子、またはＨＩＶ−１Ｒｅ ｖタンパク質である請求項２記載のタンパク質、または ｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、およびｐｃＲｅｘＭ８、Ｍ６、Ｍ７およびＭ １３、およびｐＭ１０の遺伝子またはタンパク質、またはそれらから誘導された 遺伝子またはタンパク質から選ばれた請求項１記載の遺伝子、または請求項２記 載のタンパク質、または機能的なその断片または誘導体。
4. （４）ＨＴＬＶ−Ｉｒｅｘ遺伝子の表現型発現をトランス優性に抑制するタンパ ク質を暗号化している遺伝子、またはタンパク質、または機能的なその断片また は誘導体。
5. （５）それによってＨＴＬＶ−Ｉｒｅｘ遺伝子の表現型発現が抑制される請求項 ４記載の遺伝子またはタンパク質、または野生型Ｒｅｘタンパク質の約２２〜１ ０１の間、好ましくは約８２〜約９７の間、ことに約８７〜約９４の間のアミノ 酸位置に突然変異体を有するＨＴＬＶ−ＩＲｅｘタンパク質を暗号化している請 求項４記載の遺伝子、またはＨＴＬＶ−ＩＲｅｘタンパク質である請求項４記載 のタンパク質、または 野生型Ｒｅｘタンパク質の約５９〜１２１の間、好ましくは約５９、６０、６４ 、６５、１１９、１２０、または１２１のアミノ酸位置に突然変異体を有するＨ ＴＬＶ−ＩＲｅｘタンパク質を暗号化している請求項４記載の遺伝子、またはＨ ＴＬＶ−ＩＲｅｘタンパク質である請求項４記載のタンパク質、またはｐｃＲｅ ｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ８、ｐｃＲｅｘＭ１７、およびｐｃＲｅ ｘ１３Δ１５、およびＭ６、Ｍ７およびＭ１３の遺伝子またはタンパク質、また はそれらから誘導された遺伝子またはタンパク質から選ばれた請求項４記載の遺 伝子またはタンパク質、 または機能的なその断片または誘導体。
6. （６）ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＥＩＡＶ、ビスナウイルス、またはウ シ免疫不全ウイルスのｒｅｖ遺伝子の表現型発現をトランス優性に抑制するタン パク質を暗号化している遺伝子またはタンパク質、または機能的なその断片また は誘導体。
7. （７）それによってＨＩＶｒｅｖ遺伝子の表現型発現が抑制される請求項６記載 の遺伝子またはタンパク質、またはそれによってＨＩＶｒｅｖ遺伝子の表現型発 現が抑制される請求項６記載の遺伝子またはタンパク質、または野生型Ｒｅｖタ ンパク質の約６８〜９０の間、好ましくは約７８〜約８６の間、ことに約７８〜 約８３または８４の間のアミノ酸位置に突然変異体を有するＨＩＶ−１Ｒｅｖタ ンパク質を暗号化している請求項６記載の遺伝子、またはＨＩＶ−１Ｒｅｖタン パク質である請求項６記載のタンパク質、または ｐＭ１０、ｐΔ９／１４、およびｐΔ１０／１４、およびｐＭ２１、ｐＭ２２、 ｐＭ２７、ｐＭ２８、ｐＭ２９、およびｐＭ３２の遺伝子またはタンパク質、ま たはそれらから誘導された遺伝子またはタンパク質から選ばれた請求項６記載の 遺伝子またはタンパク質、または ｐＭ１０、ｐＭ２１、およびｐＭ３２の遺伝子またはタンパク質、またはそれら から誘導された遺伝子またはタンパク質から選ばれた請求項６記載の遺伝子、ま たは 機能的なその断片または誘導体。
8. （８）少なくとも１個のトランス優性な負の突然変異体によってＲｅｘタンパク 質の野生型の形から、Ｒｅｘタンパク質のエフェクター活性を示す寿生型Ｒｅｘ タンパク質のペプチドドメインに修飾を受け、実質上、Ｒｅｘタンパク質の野生 型の形の核小体局在化活性を有するリプレッサーであるＨＴＬＶ−ＩＲｅｘタン パク質のトランス優性なりプレッサーを暗号化しているＤＮＡセグメント。
9. （９）少なくとも１個のトランス優性な負の突然変異体によってＲｅｘタンパク 質の野生型の形から、Ｒｅｘタンパク質のエフェクター活性を示す野生型Ｒｅｘ タンパク質のペプチドドメインに修飾を受け、実質上、Ｒｅｘタンパク質の野生 型の形の核小体局在化活性を有するリプレッサーであるＨＴＬＶ−ＩＲｅｘタン パク質機能のトランス優性なりプレッサー。
10. （１０）第１ドメインは実質上、野生型ＨＩＶ−１Ｒｅｖの特異的結合機能を有 し、第２ドメインは野生型ＨＩＶ−１Ｒｅｖの活性化機能を有せず、第２ドメイ ンは１またはそれ以上の突然変異体によって野生型ＨＴＬＶ−ＩＲｅｖから修飾 されたものである第１ドメインおよび第２ドメインを含んでいるＨＴＬＶ−ＩＲ ｅｖ機能のトランス優性なりプレッサー。
11. （１１）実質上、寿生型Ｒｅｖの特異的結合機能を有する第１ドメインを含んで おり、野生型ＨＩＶ−１Ｒｅｖの活性化機能を有していないＨＩＶ−１Ｒｅｖ機 能のトランス優性なりプレッサー。
12. （１２）好適な発現系から対応する野生型遺伝子を単離し、この遺伝子を好適な クローニング系へ加えて、所望の突然変異を遺伝子へ導入し、所望の突然変異を 有するクローンから得られた突然変異遺伝子を回収することを含んでなる請求項 １、４および６の何れか１項記載の遺伝子の生産方法。
13. （１３）好適な発現系および増幅系で請求項１、４および６の何れか１項記載の 遺伝子を発現ならびに増幅し、得られた生産物を回収することを含んでなる請求 項２、４および６の何れか１項記載のタンパク質の生産方法。
14. （１４）請求項１、４および６の何れか１項記載の遺伝子、または請求項２、４ および６の何れか１項記載のタンパク質、または機能的なその断片または誘導体 を所望の予防または治療効果を達成し得る好適な形で製薬上許容し得る担体また は希釈剤とともに含有している医薬組成物。
15. （１５）請求項１、４および６の何れか１項記載の遺伝子、または請求項２、４ および６の何れか１項記載のタンパク質、または機能的なその断片または誘導体 を所望の予防または治療効果を達成し得る好適な形でそのような処置を必要とす る対象へ投与することを含んでなるウイルス感染の処置方法。
16. （１６）ＨＩＶ−１、ＨＴＬＶ−Ｉ、またはＨＴＬＶ−ＩＩウイルスの何れか１ つを複製し、ＨＴＬＶ−ＩＲｅｘ機能トランス優性リプレッサーを産生する該Ｄ ＮＡセグメントを発現する能力を有する細胞へ請求項８記載のＤＮＡセグメント を導入することを含んでなるＨＩＶ−１、ＨＴＬＶ−Ｉ、またはＨＴＬＶ−ＩＩ 複製の抑制方法。
17. （１７）ＨＩＶ−１で感染させた細胞へＨＩＶ−１Ｒｅｖ機能を導入することを 含んでなるＨＩＶ−１複製の抑制方法。
18. （１８）医薬として使用する請求項１、４および６の何れか１項記載の遺伝子、 または請求項２、４および６の何れか１項記載のタンパク質、または機能的なそ の断片または誘導体。
19. （１９）請求項１、４および６の何れか１項記載の遺伝子、または機能的なその 断片または誘導体を、標的哺乳動物細胞へ機能的な形で送達し得る好適な形態で 含有するベクター。
20. （２０）トランス優性なドメインを請求項３、５、または７に記載の突然変異体 ＲｅｘまたはＲｅｖタンパク質に似せることができる抑制剤。
21. （２１）（ｉ）−Ｒｅｘタンパク質によって認識される調節応答要素、および少 なくとも１個の未使用のスプライス部位を含んでいるｍＲＮＡを暗号化している ＤＮＡセグメント、−発現されると、核小体からのｍＲＮＡの放出を誘発するタ ンパク質生産物を生産することが可能なｒｅｘ遺伝子を暗号化しているＤＮＡセ グメント、 −ｒｅｘ遺伝子を暗号化しているＤＮＡセグメントおよびｍＲＮＡを暗号化して いるＤＮＡによって形質転換され、ｒｅｘ遺伝子のタンパク質生産物の発現能お よびｍＲＮＡの発現能を保有する宿主を含んでなる遺伝子系を提供し、 （ｉｉ）この遺伝子系の細胞を含有する培養を、Ｒｅｘタンパク質の特異的抑制 因子であることが疑われる因子が細胞へ侵入するような条件下で該因子と接触さ せ、 （ｉｉｉ）未使用のスプライス部位を含んでいるｍＲＮＡの核からの放出に対す るこの因子の効果を測定し、（ｉｖ）スプライス部位を使用したｍＲＮＡのスプ ライス形態の核からの放出に対する該因子の効果を測定し、それによって未使用 のスプライス部位を含んでいるｍＲＮＡの放出を低下し、それと同時にｍＲＮＡ のスプライス形態が低下しなければ、該因子がＨＴＬＶ−Ｉｒｅｘ遺伝子の活性 またはｒｅｘ遺伝子生産物の活性の特異的な抑制因子であることを示す段階を含 んでなるＲｅｘタンパク質の遺伝子活性化機能の特異的抑制因子の同定方法。
22. （２２）−Ｒｅｘタンパク質によって認識される調節応答要素を含んでいるｍＲ ＮＡ、および少なくとも１個の未使用のスプライス部位を暗号化しているＤＮＡ セグメント、−発現されると、核小体からｍＲＮＡの放出を誘発するタンパク質 生産物を生産することが可能なＲｅｘ遺伝子を暗号化しているＤＮＡセグメント 、 −ｒｅｘ遺伝子を暗号化しているＤＮＡセグメント、およびｍＲＮＡを暗号化し ているＤＮＡセグメントによって形質転換された細胞であって、ｒｅｘ遺伝子の タンパク質生産物発現能およびｍＲＮＡ発現能を有する宿主細胞を含有する容器 を含んでなる請求項２１記載の同定方法によってＲｅｘタンパク質の遺伝子活性 化機能の特異的抑制因子を同定する、因子のスクリーニング試薬用キット。