DE69033829T2

DE69033829T2 - Polyvalenter Repressor von Gen-Funktionen

Info

Publication number: DE69033829T2
Application number: DE69033829T
Authority: DE
Inventors: Helmut Bachmayer; Ernst Boehnlein; Bryan R. Cullen; Warner C. Greene; Joachim Hauber
Original assignee: Novartis AG; University of Durham; Duke University
Current assignee: Novartis AG; University of Durham; Duke University
Priority date: 1989-05-25
Filing date: 1990-05-23
Publication date: 2002-04-04
Anticipated expiration: 2010-05-24
Also published as: JPH10165188A; EP0406557B1; AU6757394A; IL94482A; KR920701440A; JPH04500009A; WO1990014427A2; HU211530A9; IL94482A0; CA2032158A1; HU904245D0; AU648256B2; FI110437B; ATE207122T1; DE69033829D1; DK0406557T3; AU5738890A; KR100215949B1; JP3159671B2; FI910371A0

Description

1. GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der viralen Genexpression, insbesondere die phenotypische Expression des rex (Regulator der Virionproteinexpression)-Gens von HTLV-I und seinen Äquivalenten in andere retroviralen Spezis, wie rev von HIV-I.

2. HINTERGRUND

Viren, insbesondere humane Retroviren, wie das humane Immunodefizienzvirus Typ I (HIV-I) oder das humane Leukämievirus Typ I (HTLV-I) sind die verursachenden Agentien für sehr ernste Erkrankungen. Dies ist im Falle von HIV-1 das erworbene Immundefizienzsyndrom (AIDS) und im Falle von HTLV-I die Erwachsenen-T-Zellenleukämie (ATL) sowie nicht-kanzeröse Zustände, die als tropische spastische Parapesis bekannt sind. HTLV-II ist ätiologisch mit einigen Fällen der varianten T- Zellen-Haarzellenleukämie verwandt. Beide Virusgruppen unterteilen ihren Replikationszyklus ähnlich den DNA-Viren in eine "frühe" und eine "späte" Stufe der Genexpression. Die "frühe" Phase der Genexpression ist durch die Expression der Regularorproteine gekennzeichnet, während in der "späten" Phase die Strukurproteine synthetisiert werden.
Das HTLV-I-Genom codiert für einen Aktivator viraler Transkription mit der Bezeichnung Tax. Das Äquivalent von Tax in HIV-1 wird als Tat bezeichnet. Tax und Tat scheinen hauptsächlich auf die retrovirale LTR (LTR-Sequenz) für die virale Genexpression einzuwirken. Darüber hinaus codiert HTLV-I einen Aktivator der viralen Strukturgenexpression mit der Bezeichnung Rex. Ein funktionelles Rex-Protein ist für den erhöhten Transport von nichtgesplicter viraler mRNA aus dem Kern in das Cytoplasma der infizierten Zelle verantwortlich. Dort konstituieren diese mRNA-Spezies das virale Genom und codieren die Strukturproteine. Das Humanimmunodefizienzvirus Typ I (HIV-1) codiert ein homologes Protein mit der Bezeichnung Rev. Das rev-Genprodukt ist wie Rex in dem HTLV-I-System absolut erforderlich für die Expression der HIV-1-Strukturproteine.
Der diesem zugrunde liegende Grund besteht darin, dass das Produkt des rev-Gens (und seine Äquivalente in anderen viralen Spezies) einen dramatischen Effekt auf die Selektion des Splicemodus für die viralen mRNA-Transkripte in infizierten Zellen aufweist. Dieser Effekt wird im Falle von Rev und Rex durch eine posttranskriptionale Regulation, nämlich durch Erhöhung des Transports der die volle Länge aufweisenden mRNA-Transkripte in das Cytoplasma erreicht, wodurch die Expression von viralen Strukturproteinen, wie Gag und Env für HIV-1 initiiert wird und die Expression von Regularorproteinen gleichzeitig supprimiert wird (vgl. beispielsweise für Rex: M. Hidaka et al., EMBO J. 7 (1988) 519) oder moduliert (vgl. beispielsweise für Rev: M. H. Malim et al., Nature 335 (1988) 181). Somit ist Rev für die Expression der vollständig gespicten HIV-1-mRNAs mit Codierung für die viralen Regulatorproteine, einschließlich Tat und Rev, nicht erforderlich.
Bei HIV-1 ist die oben ausgeführte Selektivität der Induktion auf eine RNA-Targetsequenz zurückzuführen, die für die Rev-Funktion erforderlich ist und die Bezeichnung Rev-Response-Element (ReE) besitzt. ReE koinzidiert mit einer großen, 234 Nucleotide langen RNA-Sekundärstruktur, die in dem HIV-1 env-Gen vorhanden ist. Die Äquivalentstruktur in HTLV-I besitzt die Bezeichnung Rex- Response-Element (RexRE oder RRX). ReV scheint das erste Protein zu sein, von dem es sich gezeigt hat, dass es den nuclearen Export von RNA in einer sequenzspezifischen Weise reguliert.
Mit Rex als Beispiel erfordert die vollständige Funktion des Rex-Proteins bei der Regulierung des Expression der HTLV-I gag- und env-Gene zum mindestens drei funktionell unterschiedliche Komponentenaktivitäten: eine nucleare und nucleolare Lokalisierung. d. h. die Fähigkeit von der Cycoplasmastelle der Synthese aller Proteine zum Kern transportiert zu werden und dort in dem nucleolaren Bereich konzentriert zu werden, eine spezifische Erkennung (direkt oder indirekt) der RexRE (RRX)-Sequenz in viralen RNAs, und eine Rex-Effektoraktivität, die bisher noch unbekannte Aktivität dieses Regulatorproteins, die den Export aus dem Kern ins Cytoplasma der teilweise gesplicten viralen mRNA-Spezies, die die RexRE-Sequenz umfasst, tatsächlich vermittelt.
Bezüglich der strukturellen Orte in dem Rex-Protein, wo diese Komponentenaktivitäten der vollständigen Rex-Funktion liegen (d. h. die funktionellen Domänen), war vor der vorliegenden Erfindung lediglich bekannt, dass eine positiv geladene Peptiddomäne in den ersten zwanzig Aminosäuren am Aminoterminus von Rex für die nucleolare Lokalisierung erforderlich ist (H. Siomi et al., Cell 55 (1988), 197-209).
Wie oben erwähnt, sind sowohl das rex-Genprodukt für HTLV-I als auch das rev- Genprodukt für HIV-1 für die Replikation des Virus erforderlich (vgl. beispielsweise für HIV: E. Terwilliger et al., J. Virol. 62 (1988), 655). Die kritische Bedeutung von Rex und Rev wird durch die Tatsache unterstrichen, dass sie trotz ihrer unterschiedlichen Primärstrukturen funktionell verwandt sind und HTLV-I-Rex seine Funktion in anderen viralen Spezies auszuüben vermag, d. h. in HIV-1 (L. Rimsky et al., Nature 335 (1988), 738): Somit, selbst obwohl
Rev und Rex keinerlei signifikante Homologie auf Nucleotidniveau sowie Aminosäureniveau zeigen,
die Nucleotidsequenzen und Stamm- und Schleifenstrukturen der RRE sich von denen der RexRE (RRX) in HTLV-I unterscheiden,
eine computererzeugte Vorhersage der Sekundärstrukturen der Rex- und Rev-Proteine keinerlei merklichen Ähnlichkeiten zeigen und
das Rex-Protein nicht an denselben Teil der RRE wie das Rev-Protein zu binden scheint,
ist nichtsdestotrotz möglich, das Rev-Protein durch das Rex-Protein in dem HIV-1-System zu substituieren. Darüber hinaus wurde des weiteren jüngst festgestellt, dass HTLV-I-Rex und HIV-1- Rev HIV-2-Rev (Rev2) substituieren können und dass HTLV-I-Rex ferner das analoge HTLV-II- Regulatorprotein substituieren kann. Diese Komplementation reicht aus, um beispielsweise einen revdefizienten HIV-1-Provirus, der ein funktionelles Rex-protein in trans liefert, zu retten. Andererseits scheint die umgekehrte Substitution zur Rettung eines rex-defizienten HTLV-I-Provirus durch funktionales Rev-Protein nicht durchführbar zu sein. Somit besteht in dieser Hinsicht keine vollständige Symmetrie. Die Basis für dieses Fehlen einer Wechselbeziehung wird noch nicht verstanden, sie steht jedoch wahrscheinlich mit Unterschieden in den funktionalen Aspekten dieser Proteine in Verbindung, die für die Target-RNA-Sequenzerkennung erforderlich sind.
Mutationen in Regulatorproteinen können ein Genprodukt mit einem dominanten negativen Phenotyp gegenüber der Wildtypfunktion liefern (I. Herskowitz, Nature 329 (1987), 317). Dominant negative Mutantenproteine, die als transdominante Repressoren bekannt sind (eine kleine Gruppe hiervon wurde jüngst in einigen nicht verwandten Viren gefunden), stellt eine neue Klasse von antiviralen Mitteln dar. In genetischen Analysen sind negative Mutationen solche, die eine Verminderung oder einen Verlust einer Funktion eines Gens verursachen. Dominante negative Mutationen sind solche, die ein geeignetes Funktionieren anderer Kopien desselben Gens, die nicht mutiert wurden (d. h. die die Wildtypsequenz aufweisen) verhindern. Andererseits hemmen rezessive negative Mutationen Gegenstücke vom Wildtyp nicht auf diese Weise. Des weiteren hemmen einige dominante Mutationen Wildtypgene lediglich, wenn sich die Mutanten- und die Wildtypgene auf demselben Chromosom befinden(DNA- oder RNA- Molekül). In diesem Fall wird die hemmende Mutation als "cis-agierend" bezeichnet. Alternativ kann eine dominante Mutation das entsprechende Wildtypgen hemmen, selbst wenn es sich auf einem getrennten Chromosom befindet. Dieser Typ wird als "trans-agierende" dominante Mutation oder noch einfacher als transdominante Mutation klassifiziert.
Einige dieser sogenannten transdominanten Gene wurden im Zusammenhang mit Genen für eukaryotische oder Herpesvirustranskriptionsfaktoren beschrieben (I. A. Hope und K. Struhl, Cell 46 (1986), 885; R. Gentz et al., Science 243 (1989), 1695; S. J. Triezenberg et al., Gen. & Devel. 2 (1988), 718; A. D. Friedman et al., Nature 335 (1988), 452). Somit hemmen bei Überexpression einige Deletionsmutanten des Herpes-simplex-Virus-Transaktivators VP16 die VP16-Funktion, wodurch eine Replikation von HSV-1 in normal permissiven Zellen ausgeschlossen wird. Bezüglich Retroviren wurden auch transdominante Mutanten beschrieben, beispielsweise für das Tax-Protein von HTLV-II (W. Wachsman et al., Science 235 (1987), 674) und nach dem Prioritätstag der vorliegenden Erfindung für die HIV-1-tat-Gene (M. Green et al., Cell 58(1989), 215) und das gag-Gen (D. Trono et al., Cell 59(1989), 113). Diese Unterschiede in den Zusammensetzungen und Funktionen dieser beiden Regulatorproteine zeigen, dass ein Vergleich der Rex-Struktur mit der des Rev-Proteins oder seinen bekannten Mutanten keinerlei Hinweise für die Auswahl von Mutationen liefert, die transdominante Repressoren der viralen Proteine liefern könnten.
Eine therapeutische Anwendung der obigen Konzepte würde die Hemmung der Produktion oder Überproduktion eines deletären Genprodukts durch Manipulation des Gens unter Schaffung dominanter negativer Mutationen umfassen, wodurch das erhaltene Gen mutante Regulatorproteine codiert, die bei Expression die Aktivität der Wildtypfunktion zerstören (I. Herskowitz, Nature 329 (1987), 219). Im Falle von viralen, beispielsweise retroviralen Infektionen erscheint es somit in hohem Maße wünschenswert, entsprechende transdominante Repressoren der Virusfunktion durch die Konstruktion ähnlicher Inhibitoren essenzieller Regulatorgene, beispielsweise von Inhibitoren des rev- oder rex-Gens, bereitzustellen. Dieser Ansatz würde die erforderlichen Werkzeuge für eine "intrazelluläre Immunisierung" liefern, einen Ansatz zur Behandlung von Virusinfektionen, der zuerst 1988 vorgeschlagen wurde (D. Baltimore, Nature 335 (1988), 395).

3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Konstruierte transdominante Versionen des HTLV-I-rex-Gens bzw. des HIV-1-rev-Gens wurden nun hergestellt, deren Produkt eine HTLV-I-, HTLV-II- bzw. HIV-1-Replikation blockiert. Des weiteren blockiert das Produkt einiger dieser konstruierten transdominanten Versionen des rex- oder rev- Gens sowohl eine HTLV-I- (und in einigen Fällen HTLV-II-) sowie eine HIV-1- (und in einigen Fällen eine HIV-2- und SIV-)Replikation.
Es scheint, dass dies das erste berichtete Auftreten der Herstellung von viralen Repressoren ist, die in mehr als einer viralen Spezies agieren, d. h. von transdominanten Genprodukten, die die phenotypische Expression der funktionell äquivalenten Gene von mehr als einer Virusspezies reprimieren.
Die Erfindung betrifft somit Gene mit Codierung für Proteine, die transdominant die phenotypische Expression von funktional äquivalenten Genen von mehr als einer Virusspezies reprimieren und somit die Replikation von mehr als einer viralen Spezies blockieren, insbesondere die Mutantengene in pcRexM2, pcRexM7 und pcRexM8, M6, M7 und M13 sowie pM10 gemäß der folgenden Offenbarung.
Sie betrifft ferner Gene mit Codierung für Proteine, die transdominant die phenotypische Expression des rex-Gens von HTLV-I und/oder HTLV-II reprimieren, und Gene mit Codierung für Proteine, die transdominant die phenotypische Expression des rev-Gens von HIV-1 und/oder HIV-2 und/oder SIV reprimieren, insbesondere die Mutantengene in pcRexM2, pcRexM7, PcRexM8, pcRexM17 und pcRex13Δ15; pM10, pΔ9/14, pΔ10/14, pM21, pM22, pM27, pM28, pM29 und pM32; sowie M6, M7 und M13 gemäß der folgenden Offenbarung.
Sie betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung dieser Gene, das ein Isolieren des entsprechenden Wildtypgens aus einem geeigneten Expressionssystem, das Einbringen dieses Gens in ein geeignetes Klonierungssystem, das Einführen der gewünschten Mutation in das Gen und das Gewinnen des erhaltenen Mutantengens aus den Klonen mit der gewünschten Mutation umfasst. Sie betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen gemäß der obigen Definition, das ein Exprimieren und Amplifizieren eines Mutantengens gemäß der obigen Definition in einem geeigneten Expressions- oder Amplifikationssystem und ein Gewinnen des exprimierten Produkts hieraus umfasst.
Sie betrifft ferner Proteine, die transdominant die phenotypische Expression von funktional äquivalenten Genen von mehr als einer Virusspezies reprimieren und somit die Replikation von mehr als einer viralen Spezies blockieren, insbesondere die Mutantenproteine von pcRexM2, pcRexM7 und PcRexM8; M6, M7 und M13; sowie pM10 gemäß der folgenden Offenbarung.
Sie betrifft ferner Proteine, die transdominant die phenotypische Expression des rex-Gens von HTLV-I und/oder HTLV-II reprimieren, und Proteine, die transdominant die phenotypische Expression des rew-Gens von HIV-1 und/oder HIV-2 und/oder SIV reprimieren, insbesondere die Mutantenproteine von pcRexM2, pcRexM7, PcRexM8, pcResM17 und pcRex13Δ15; pM10, pΔ9/14, pΔ10/14, pM21, pM22, pM27, pM28, pM29 und pM32; sowie M6, M7 und M13 gemäß der folgenden Offenbarung.
Sie betrifft ferner einen Vektor, beispielsweise einen retroviralen oder Plasmidvektor, der ein Gen gemäß der obigen Definition in einer zur Erreichung einer Abgabe in einem funktionalen Zustand in eine Zielsäugetierzelle in vivo oder in vitro geeigneten Form enthält.
Sie betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Gen oder Protein gemäß der obigen Definition in einer zur Erreichung der gewünschten prophylaktischen oder therapeutischen Wirkung geeigneten Form zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel, beispielsweise in Form von Zellen, die dem Körper eines Patienten entnommen und vor Reinsertion in vitro behandelt wurden, enthält.
Sie betrifft ferner ein Verfahren zur Behandlung von Virusinfektionen durch Verabreichen eines Gens oder Proteins gemäß der obigen Definition in einer zur Erreichung der gewünschten prophylaktischen oder therapeutischen Wirkung geeigneten Form an einen Patienten, der einer derartigen Behandlung bedarf, beispielsweise in Form von Zellen, die dem Körper eines Patienten entnommen und vor Reinsertion in vitro behandelt wurden, umfasst.
Unter dem Ausdruck "Behandlung" wird die prophylaktische sowie die kurative Behandlung von Virusinfektionen verstanden, wobei "kurativ" die Stabilisierung einer Virusinfektion in einer Latenzstufe umfasst.
Sie betrifft ferner Gene, Proteine und DNA-Segmente gemäß der Definition hier und im folgenden zur Verwendung als Pharmazeutikum.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Inhibitoren, die von den Genen, Proteinen und DNA-Segmenten gemäß der Definition hier und im folgenden abgeleitet sind und die transdominante, d. h. hauptsächlich die RNA-Bindungsdomäne in einem mutanten Rex- oder Rev-Protein gemäß der obigen Definition nachzuahmen vermögen, beispielsweise ein niedriges Molekulargewicht aufweisende Inhibitoren oder neutralisierende monoklonale Antikörper. Ein niedriges Molekulargewicht bedeutet hier und im folgenden ein Molekulargewicht unter etwa 10 kD, insbesondere unter etwa 1 kD.
Weitere Aspekte, die die vorliegende Erfindung betreffen, sind im folgenden angegeben:
Ein transdominanter Repressor der HIV-1-Rev-Funktion, der eine erste und eine zweite Domäne umfasst, wobei die erste Domäne im wesentlichen die speziellen Bindungsfunktionen von HIV-1- Rev vom Wildtyp und die zweite Domäne nicht die Aktivationsfunktionen von HIV-1-Rev vom Wildtyp aufweist, wobei die zweite Domäne von HIV-1-Rev vom Wildtyp durch eine oder mehrere Mutationen modifiziert ist, wobei vorzugsweise die erste Domäne von etwa der Aminosäureposition 10 bis etwa zur Aminosäureposition 68 von Rev vom Wildtyp umfasst und die modifizierte zweite Domäne von etwa der Aminosäureposition 68 bis etwa zur Aminosäureposition 90 von Rev vom Wildtyp abgeleitet ist, wobei insbesondre die obige eine oder die obigen mehreren Mutationen Missense- oder Deletionsmutationen sind, die zwischen etwa der Aminosäureposition 68 und etwa der Aminosäureposition 90, vorzugsweise von etwa der Aminosäureposition 78 bis etwa zur Aminosäureposition 86, insbesondere von der Aminosäureposition 78 bis etwa zur Aminosäureposition 83 oder 84 von Rev vom Wildtyp auftreten, wobei die spezifischen Bindungsfunktionen der ersten Domäne von HIV-1-Rev vom Wildyp im wesentlichen funktionell intakt bleiben, insbesondere die Repressoren pM10, pM21, pM22, pM27, pM28, pM29 und pM32 gemäß der nachfolgenden Offenbarung;
ein transdominanter Repressor der HIV-1-Rev-Funktion, der eine erste Domäne umfasst, die im wesentlichen die spezifischen Bindungsfunktionen von HIV-1-Rev vom Wildtyp aufweist, wobei dieser transdominante Repressor nicht die Aktivierungsfunktionen von HIV-1-Rev vom Wildtyp aufweist, wobei vorzugsweise die erste Domäne etwa von der Aminosäureposition 10 bis etwa zur Aminosäureposition 68 von Rev vom Wildtyp umfasst und dem transdominanten Repressor (ein Abschnitt) von etwa der Aminosäureposition 68 bis mindestens etwa zur Aminosäureposition 90 von Rev vom Wildtyp fehlt, insbesondere die Repressoren pΔ9/14 und pΔ10/14 gemäß der nachfolgenden Offenbarung;
ein DNA-Segment, das für einen transdominanten Repressor der Funktion des HTLV-I-Rex- Proteins codiert, wobei der Repressor von einer Wildtypform des Rex-Proteins durch mindestens eine transdominante negative Mutation in der Peptiddomäne des Rex-Proteins vom Wildtyp, die die Effektoraktivität des Rex-Proteins zeigt, modifiziert ist, wobei dieser Repressor im wesentlichen die nucleolare Lokalisierungsaktivität der Wildtypform des Rex-Proteins aufweist, vorzugsweise ein derartiges DNA- Segment, in dem die Peptidomäne des Rex-Proteins vom Wildtyp (ein Abschnitt) von etwa der Aminosäureposition 59 bis etwa zur Aminosäureposition 121, insbesondere eine der folgenden Aminosäurepositionen 59, 60, 64, 65, 119, 120 und 121 umfasst, insbesondere ein DNA-Segment, das eines der folgenden Mutanten-rex-Gene umfasst: M6, M7, M13 und Varianten und Derivate hiervon, die eine transdominante Repression der HTLV-I-Rex-Proteinfunktion zeigen;
einen entsprechenden transdominanten Repressor der Funktion des HTLV-I-Rex-Proteins, der gegenüber der Wildtypform so modifiziert ist, vorzugsweise mit der Fähigkeit, entweder die Funktion des HIV-1-Rev-Proteins oder die Funktion des HTLV-II-Rex-Proteins zu reprimieren;
ein Verfahren zur Identifizierung eines speziellen Inhibitors der Genaktivierungsfunktion des Rex-Proteins, das die folgenden Stufen umfasst:
i) Bereitstellen eines genetischen Systems, das:
ein DNA-Segment mit Codierung für eine mRNA, die ein Regulatorreaktionselement, das durch das Rex-Protein erkannt wird und mindestens eine nicht verwendete Splicestelle umfasst (d. h. eine Region oder ein Intron, das durch Spliceerkennungssequenzen gebunden ist, das jedoch nicht aus der mRNA h herausgesplict wurde);
ein DNA-Segment mit Codierung für cin rex-Gen mit der Fähigkeit, unter Bildung eines Proteinprodukts exprimiert zu werden, das den Export der mRNA aus dem Kern induziert; und
eine Wirtszelle umfasst, die durch das DNA-Segment mit Codierung für das rex-Gen und durch das DNA-Segment mit Codierung für die mRNA transformiert ist und die Fähigkeit aufweist, das Proteinprodukt des rex-Gens und die mRNA zu exprimieren;
ii) In-Berührung-Bringen einer Kultur, die die Zellen dieses genetischen Systems umfasst, mit einem Mittel, von dem vermutet wird, dass es sich um einen speziellen Inhibitor des Rex-Proteins unter derartigen Bedingungen, dass das Mittel in die Zellen eindringt, handelt;
iii) Bestimmen des Effekts dieses Mittels auf den Export der mRNA, die die nicht verwendete Splicestelle umfasst, aus dem Kern und
iv) Bestimmen der Wirkung des Mittels auf den Export einer gesplicten Form der mRNA, in der die Splicestelle verwendet wurde, aus dem Kern,
wobei eine Verringerung des Exports der mRNA, die die nicht verwendete Splicestelle umfasst, zusammen mit keiner Verminderung des Exports der gesplicten Form der mRNA zeigt, dass das Mittel ein spezifischer Inhibitor der Aktivität des HTLV-I-rex-Gens oder der Aktivität eines Produkts des rex-Gens ist, wobei das mRNA-Regulatorelement, das durch das Rex-Protein erkannt wird, vorzugsweise von einer mRNA eines Virus abgeleitet ist, das aus I-ITLV-I, HTLV-II und HIV-1 ausgewählt ist;
ein Identifizierungsverfahren gemäß den obigen Definitionen, wobei die Verringerung des Exports der mRNA, die die nicht verwendete Splicestelle umfasst, vorzugsweise durch Bestimmen der Produktionsmenge des ersten Proteins nachgewiesen wird, das durch die mRNA, die die nicht- verwendete Splicestelle umfasst, codiert wird, und die Erhöhung des Exports der gesplicten Form der mRNA vorzugsweise durch Bestimmen der Produktionsmenge eines zweiten Proteins nachgewiesen wird, das durch die gesplicte Form der mRNA codiert wird;
ein Identifizierungsverfahren gemäß den obigen Definitionen, wobei die mRNA, die das Regulatorreaktionselement und die Splicestelle umfasst durch ein Plasmid codiert wird, das das 3'-Ende eines HTLV-I-Provirus einschließlich der Codierregionen für die Rex- und Tax-Proteine, das komplette env-Gew, das Rex-Reaktionselement und den gesamten 3'-LTR-Bereich umfaßt; vorzugsweise durch das Plasmid pgTAX-LTR gemäß der nachfolgenden Offenbarung, wobei das rex-Gen sich vorzugsweise auf dem Plasmid pRex befindet;
das Plasmid pgTAX-LTR;
ein Reagenskit zum Screenen von Mitteln, um einen speziellen Inhibitor der Genaktivierungsfunktion des Rex-proteins gemäß dem obigen Identifizierungsverfahren zu identifiziren, das die folgenden Bestandteile umfasst:
- ein DNA-Segment mit Codierung für eine mRNA, die ein Regulatorreaktionselement, das durch das Rex-Protein erkannt wird und mindestens eine nicht verwendete Splicestelle umfasst:
- ein DNA-Segment mit Codierung für ein rex-Gen mit der Fähigkeit, unter Bildung eines Proteinprodukts exprimiert zu werden, das den Export der mRNA aus dem Kern induziert, und
- ein Behälter, der Wirtzellen enthält, die durch das DNA-Segment mit Codierung für das rex-Gen und durch das DNA-Segment mit Codierung für die mRNA transformiert sind, wobei die Zellen die Fähigkeit aufweisen, das Proteinprodukt des rex-Gens und die mRNA zu exprimieren;
ein Verfahren zur Hemmung der Replikation von HIV-1, HTLV-I oder HTLV-II, das ein Einführen eines DNA-Segments gemäß der obigen Definition in eine Zelle umfasst, die die Fähigkeit aufweist, eines dieser Viren zu replizieren und das DNA-Segment zu exprimieren, wobei ein transdominanter Repressor der HTLV-I-Rex-Funktion erhalten wird; und
ein Verfahren zur Hemmung einer HIV-1-, HIV-2- und SIV-Replikation, insbesondere einer HIV-1-Replikation, das ein Einführen eines transdominanten Repressors der HIV-1-Rev-Funktion in eine mit HIV-1 infizierte Zelle umfasst.

4. ERKLÄRUNG DER FIGUREN

4.1. für 5.1. und 6.1.:
Fig. 1: Nucleotid- und Aminosäuresequenz von HTLV-I-rex (die durch die Nucleotide (1) (Aminosäurepositionen 87, 88 und 89) und (2) (Position 94) substituierten Aminosäurepositionen sind markiert, ebenso wie die Positionen 82, 90, 91 und 97). Die vollständige Sequenz enthält 567 Nucleotide mit Codierung für 189 Aminosäuren.
Fig. 1A: Ort der in das HTLV-I-rex-Gen eingeführten 29 Mutationen. Das HTLV-I-rex- Gen codiert für ein 189 Aminosäuren langes Protein. Unter Verwendung einer stellengerichteten Mutagenese wurden an festgelegten Aminosäureresten (angegeben durch Kästchen) Missense-Substitutionen eingeführt und gemäß ihrer Lage im rex-Gen benannt. Die pΔ-Mutante wird nach dem Ausmaß der Deletion benannt. d. h. 1315 ist zwischen der eingeführten Mutation bei M13 und M15 deletiert.
Fig. 2A: Rex-Immunopräzipitation:
SDS/Polyacrylamidgel-elektrophoretische Analyse von 7 der 30 rex-Mutanten nach einer Rex-Immunopräzipitation (zeigt, dass pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM13, pcRexM14, pcRexM17 und pcRex13Δ15 noch Rex-Protein produzieren):
A: pgtat (negative Kontrolle für den Rex-Antikörper)
B: pcRex
C: pcRexM2
D: pcReM7
E: pcRexM8
F: pcRexM13
G: pcRexM14
H: pcRexM17 (das geringere Molekulargewicht in dieser Spur ist möglicherweise durch eine Veränderung in der Modifikation dieses Proteins, beispielsweise durch Phosphorylierung bedingt)
I: pcRex13Δ15
Fig. 2B: Biologischer Phenotyp der Mutanten:
Wie bei Fig. 2A nach Tat-Immunopräzipitation:
A: pgtat + pXF3
B: pgtat + pcRev
C: pgtat + pcRex
D: pgtat + pcRexM2
E: pgtat + pcRexM7
F: pgtat + pcRexM8
G: pgtat + pcRexM13
H: pgtat + pcRexM14
I: pgtat + pcRexM17
K: pgtat + pcRex13Δ15
Fig. 2C: Wie bei Fig. 2B (zeigt, dass einige der Rex-Mutanten gegenüber Rex vom Wildtyp transdominant sind nämlich pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM14, pcRexM17 und pcRex13Δ15):
A: pgtat + pXF3 + pXF3
B: pgtat + pcRex + pXF3
C: pgtat + pcRex + pcRexM2
D: pgtat + pcRex + pcRexM7
E: pgtat + pcRex + pcRexM8
F: pgtat + pcRex + pcRexM13
G: pgtat + pcRex + pcRexM14
H: pgtat + pcRex + pcRexM17
I: pgtat + pcRex + pcRex 13Δ15
Fig. 2D: Wie bei Fig. 2B (zeigt, dass einige der Rex-Mutanten gegenüber Rev vom Wildtyp transdominant sind, nämlich pcRexM2, pcRexM7, pcRexMB und pcRexM13, teilweise):
A: pgtat + pXF3 + pXF3
B: pgtat + pcRev + pXF3
C: pgtat + pcRev + pcRexM2
D: pgtat + pcRev + pcRexM7
E: pgtat + pcRev + pcRexM8
F: pgtat + pcRev + pcRexM13
G: pgtat + pcRev + pcRexM14
H: pgtat + pcRev + pcRexM17
I: pgtat + pcRev + pcRex13Δ15
Fig. 3: Rex-Mutanten, die konstruiert wurden.
Fig. 4: Sequenz der 29 Oligonucleotide, die synthetisiert wurden, um die rex- Codiersequenz zu mutagenisieren.
4.2. Für 5.2 und 6.2.:
Fig. 5: Lage der in das HIV-1-rev-Gen eingeführten Mutationen. Das HIV-1-rev-Gen codiert für 116 Aminosäuren langes Protein mit der angegebenen vorausgesagten Sequenz. Die Grenze zwischen den beiden codierenden Exons von rev ist angegeben (SP). Die geclusterten Punkt(pM)- Mutationen wurden durch Oligonucleotid-gesteuerte Mutagenese (angegeben durch die Reste in den Kästchen) eingeführt. Diese Mutationen wurden gemäß ihrer Lage innerhalb von Rev benannt, wobei pM1 die am weitesten N-terminale und pM14 die am weitesten C-terminale sind. Alle eingeführten Mutationen beeinflussten zwei bis vier benachbarte Aminosäuren und alle (mit Ausnahme von pM7) führten eine einzelne BgIII-Stelle in die rev-Gensequenz ein. Diese eingeführten Stellen erleichterten die nachfolgende Konstruktion der N- und C-terminalen Deletions(pΔ)-Mutanten. Die pΔ-Mutanten werden nach dem Ausmaß der Deletion benannt, beispielsweise ist pΔ11/14 zwischen den eingeführten pM11- und pM14-Mutationen deletiert.
Fig. 5A: Lage der weiteren Missense- und Deletionsmutationen, die in das HIV-1-rev-Gen eingeführt wurden ( = deletierte Aminosäure).
Fig. 6: DNA und entsprechende Aminosäuresequenz von pcREV.
Fig. 7: DNA-Sequenz, die den Mutationsstellen M1-M14 entspricht.
Fig. 8: Immunopräzipitation der HIV-1-rev- und -tat-Transaktivatoren.
Fig. 9: HIV-1-Provirusrettungsassay.
Fig. 10: Subzellulare Lokalisierung von Rev und ausgewählten Rev-Mutanten durch indirekte Immunofluoreszenz.
Fig. 11A und 118: Analyse von Rev-Mutanten bezüglich eines dominanten negativen Phenotyps.
Fig. 12: Kompetitive Hemmung der Rev-Funktion.
Fig. 12A: Domänenstruktur des HIV-1-rev-Transaktivators. Das die vollständige Länge aufweisende Protein mit 116 Aminosäuren wird durch zwei Exons codiert, die durch ein Intron getrennt sind, das grob dem Virus-env-Gen entspricht. Die "Bindungs-" und "Aktivierungs"-Domänen sind als karierte Kästchen angegeben, die die Reste 23-56 (etwa) bzw. 78-83 umfassen. S = Spliceverbindung: NL = für eine nucleare Lokalisierung wichtige in hohem Maße basische Region, die eine merkliche Identität mit dem "Arg-reichen" RNA-Bindungsmotiv teilt.
4.3. Für 5.3. und 6.3.:
Fig. 13:
(A) Aminosäuresequenz des HTLV-I-Rex-Proteins und Lage eines jeden der eingeführten 25 Punktmutationen. Die Nucleotide mit Codierung für jede der Aminosäuren in Kästchen wurden entfernt und im Rahmen durch ein Oligonucleotid mit Codierung für das Asparaginsäure-Leucin- Dipeptid ersetzt.
(B) Struktur des auf Rex-reagierenden pgTAX-LTR-Expressionsvektors. Das 3'-Ende des CR-1-HTLV-I-Provirus von der HindIII-Stelle an der Kartenposition von 5013 (M. Seiki et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80 (1983), 3618-3622)) durch den 3'-LTR-Bereich hindurch wurde in den pBC12/CMV-Expressionsvektor insertiert. Dieses Fragment enthält die beiden codierenden Exons für Tax (weiße Kästchen), das vollständige env-Gen und den ganzen 3'-LTR-Bereich von HTLV-I einschließlich von RexRE (RRX) (S. M. Hanly et al., Genes Develop. 3 (1989), 1534-144)).
Fig. 14:
(A) Rex, jedoch nicht Rev oder IL-2, aktiviert die Expression des HTLV-I-Env- Proteins durch den pgTAX-LTR-Vektor. Subkonfluierende Kulturen von COS-Zellen wurden mit pgTAX-LTR und pREX (L. Rimsky et al., Nature (1988), 738), pREV (M. H. Malim et al., Nature 335 (1988), 181-183) oder pCMV-IL-2 (B. R. Cullen, Cell 46 (1986), 973-982) cotransfiziert. In der letzten Spur wurden Zellen mit pREX in Abwesenheit von pgTAX-LTR transfiziert. Eine Env-Proteinproduktion wurde durch Immunopräzipitation und Gelelektrophorese analysiert. Die Wanderung bekannter Molekulargewichtsstandards ist auf der linken Seite angegeben.
(B) Analyse der Rex-Funktion von rex-Mutanten. Nach Insertion in den pBC12/CMV-Expressionsvektor wurde jede der 25 rex-Mutanten (mit der Bezeichnung M1-M18 und M21-M27, vgl. Fig. 13A, die Mutanten mit der Bezeichnung M19 und M20 wurden nicht konstruiert) mit pgTAX-LTR cotransfiziert und die Kulturen bezüglich einer Rex-abhängigen HTLV-I-Env- Proteinexpression gemäß Beschreibung in Beispiel 12 analysiert.
Fig. 15: Simultane Analysen durch Immunopräzipitation von HTLV-I-Env-, Tax- und Rex-Proteinen in COS-Zellen, die mit pgTAX-LTR und Vektoren für die inaktiven (M1, M2, M6, M7, M13) oder beeinträchtigten (M15) Rex-Mutanten oder die Wildtyp-pREX-, -pREV- und -pCMV-IL-2- Vektoren cotransformiert worden waren.
(A) Env-Produktion;
(B) Tax-Produktion;
(C) Wildtyp- und Mutanten-Rex-Proteinproduktion.
Fig. 16: Subzcellulare Lokalisierung der HTLV-I-Rex-Mutanten durch Immunofluoreszenz. Die Wildtyp-, M6-, M7- und M13-Rex-Proteine sind in den Nucleoli und Kernen exprimierender Zellen lokalisiert. Im Gegensatz dazu wird das M1-Rex-Protein lediglich im Cytoplasma nachgewiesen, während das M2-Protein in der ganzen Zelle verteilt ist. Die M15-Mutante ist im Kern exprimierender Zellen lokalisiert, im Gegensatz zu Wildtyp-Rex-Protein scheint sie jedoch aus den Nucleoli ausgeschlossen zu sein.
Fig. 17:
(A) Analyse der Fähigkeit von rex-Mutanten, die Funktion des Wildtyp-Rex-Proteins zu hemmen. Jede Kultur wurde mit pgTAX-LTR, pREX und entweder einer Rex-Mutante (Spuren 1-6), pREX (Spur 7), pREV (Spur 8) oder pCMV-IL-2 (Spur 9) cotransfiziert. Die HTLV-I-Env-Produktion wurde wie in Fig. 14 analysiert.
(B) Die transdominanten HTLV-I-rex-Mutanten hemmen die Funktion von HIV-I- Rev-Protein. Die Zellen wurden mit pgTAT, pREV und pBC/CMV-IL-2 oder den transdominanten M6-, M7- und M13-Rex-Mutanten cotransfiziert und bezüglich Rev-induzierter Produktion der stumpfendigen 72 Aminosäuren langen Form des Tat-Proteins (Spur 2) getestet. M6, M7 und M13 (Spuren 3-5) hemmten vollständig das HIV-1-Rev-Protein, da lediglich die die vollständige Länge aufweisende, 86 Aminosäuren umfassende Form des Tat-Proteins nachgewiesen wurde.
(C) Die transdominanten HTLV-I-Rex-Mutanten blockieren eine Rex-Rettung der Replikation des Rev-defizienten-HIV-1-Provirus. Die Zellen wurden mit einem rev-defizienten-HIV-1- Provirusplasmid und pREX in Gegenwart des angegebenen soundsoviel-fachen Überschusses der M1-, M6-, M7- und M13-Mutanten cotransfiziert. Obenauf schwimmende Mengen von HIV-1-p24-Gag- Protein wurden gemessen.

5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Verfahren und Techniken sind auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannt.
Unter einer Virusspezies wird hier und im folgenden eine taxonomisch unterscheidbare Spezies verstanden, wie HTLV-I, HTLV-II, SIV, HIV-1 und HIV-2. Die vorliegende Erfindung liegt insbesondere auf dem Gebiet von Retroviren, insbesondere humanen Retroviren.
Die Gene, deren Expression zu unterdrücken ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist, sind vorzugsweise Gene mit Codierung für eine unerwünschte Eigenschaft, wie einer Funktion, die zur Aktivierung des Provirus und zur Reifung zu infektiösen Teilchen führt, beispielsweise rev von HIV-1 und HIV-2.
rev und Rev gemäß der Verwendung hier und im folgenden bedeutet, wenn nicht anders angegeben, HIV-1 rev bzw. HIV-1 Rev. Somit werden die Äquivalenten rev und Rev einer anderen Virusspezies, wie HIV-2, als "HIV-2 rev(Rev2)" bzw. "HIV-2 Rev(rev2)" usw. bezeichnet.
Sofern ihre Herstellung nicht speziell hier beschrieben ist, sind die als Ausgangsmaterialien oder Reagenzien verwendeten Verbindungen, Vektoren, Zelllinien usw. bekannt und öffentlich verfügbar oder können in üblicherweise aus bekannten und öffentlich vorfügbare Materialien erhalten werden oder äquivalente Materialien können in herkömmlicher Weise aus bekannten und öffentlich verfügbaren Materialien hergestellt werden. So kann beispielsweise das Rex-Gen aus einem beliebigen Isolat von HTLV- 1 und das Rev-Gen aus einem beliebigen Isolat von HIV-I und pgTAX-LTR, beispielsweise aus HUT 102 oder MT1, gewonnen werden. Alternativ können Gene durch chemische Synthese gemäß dem genetischen Code erzeugt werden, um ein Protein mit der gewünschten Aminosäuresequenz herzustellen. Ein transdominanter Repressor einer Rex- oder Rev-Funktion wird durch rekombinante Standard-DNA- Verfahren oder durch chemische Standardverfahren zur Peptidsynthese oder durch eine Kombination dieser Verfahren, die alle herkömmlich sind, hergestellt.
5.1.
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem Ansatz transdominante Repressoren der Rex- Funktion in HTLV-I, insbesondere transdominante Repressoren der Rex-Funktion in HTLV-I, die auch eine Wirkung auf die funktionell äquivalente, jedoch strukturell nicht verwandte Rev-Funktion in HIV- 1 besitzen.
Speziell wurden modifizierte rex-Codiersequenzen konstruiert und exprimiert, wobei sich gezeigt hat, dass sie die obige Eigenschaft besitzen.
Die Wildtyp-rex-Codiersequenz (vgl. Fig. 1) wurde unter Verwendung eines käuflichen Mutagenesesystems gemäß "Oligonucleotid-gesteuertem in-vitro-Mutagenesesystem Version 2", Amersham, England (1988), Code RPN. 1523 (im folgenden kurz als "Amersham-Protokoll" bezeichnet) verändert. Die Konstruktion der letztendlichen Expressionsvektoren erfolgte in die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte nach sich ziehenden Stufen:
1) Herstellung eines Bakteriophagen-M13-Vektors, der die rex-Codiersequenz trägt,
2) Mutagenese der rex-Codiersequenz und
3) Reklonieren des mutierten Gens in Säugetierexpressionsplasmide.
30 Mutanten wurden konstruiert, einschließlich einer Deletionsmutante. Die Position und Natur der 29 Stellen-gerichteten Mutationen sind in Fig. 3 angegeben. Die entsprechenden, zur Mugagenese verwendeten Oligonucleotide sind in Fig. 4 angegeben. Sie alle tragen eine BgIII- Restriktionsstelle.
Die rex-Codiersequenz wurde aus dem Plasmid pcRex(= pRex) (L. Rimsky et al., Nature 335 (1988), 738) isoliert. Weitere Quellen für das Wildtyp-rex-Gen sind verfügbar. So kann das rex-Gen beispielsweise in analoger Weise zu der für die gag-, pol-, env- und tax-Gene von HTLV-I bei B. K. De und A. Srinivasan, Nucl. Ac. Res. 17, Nr. 5(1989), 2142, beschriebenen Weise aus dem Gesamtgenom geschaffener. HTLV-I-infizierter Zelllinien, wie HUT 102 (TIB 162) und MT2 (J. G. Sodroski et al.,
Science 225 (1984), 381; I. Miyoshi et al., Nature 294 (1981), 770; V. Manzari et al., PNAS 80 (1983), 1574) unter Verwendung beispielsweise der Polymerasekettenreaktion kloniert werden.
Die tat- und rev-Codiersequenzen wurden aus den Plasmiden pgTat und pcRev (M. H. Malim et al., Nature 3 (1988), 181 ) isoliert. Sie können alternativ beispielsweise aus dem HIV-Provirusklon, z. B. λHXBZ (Katalog Nr. 70, AIDS Research and Reference Reagent Program, Juni 1989, NIH) isoliert werden.
Die biologische Aktivität der verschiedenen erhaltenen rex-Gene wurde in einem sensitiven Test bezüglich der Wirkung der HIV-1-rev- und der HTLV-I-rex-Genprodukte durch Expression der unterschiedlichen Gene in COS-Zellen (Gluzman et al., Cell 23 (1981), 175) getestet. Ebenso wie ein Initieren der Synthese der viralen Strukturproteine induzieren sowohl die Rev- als auch die Rex-Proteine beide die Produktion der stumpfendigen Form des Hit V-1-Tat-Regulatorproteins (M. H. Malim et al., Nature 335 (1988), 181-183; L. Rimsky et al., Nature 335 (1988), 738-740). Eine Coexpression eines genomischen HIV-1-tat-Gens zusammen mit einem funktionellen HIV-1-rev- oder einem HTLV-I-rex-Gen führt zu der Cytoplasmaexpression einer nicht-gesplicten tat-mRNA mit Codierung für eine stumpfendige, aus einem Exon bestehende Form von tat, die die Länge von 72 Aminosäuren aufweist. Die Abwesenheit eines funktionellen Rev- oder Rex-Proteins erlaubt die Expression eines die vollständige Länge aufweisenden Tat-Proteins mit 86 Aminosäuren, was einer aus zwei Exons bestehenden Form von Tat entspricht. Somit führt die Anwesenheit eines aktiven trans-Repressors der rev- oder rex-Funktion zu einer reduzierten oder unterbundenen Produktion des 72 Aminosäuren umfassenden Tat-Proteins. Dieser Unterschied lässt sich einfach durch eine Immunopräzipitationsanalyse sichtbar machen.
Wie in Fig. 2C gezeigt, wurden von 30 Mutanten 6 aufgefunden, nämlich pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM14, pcRexM17 und pcRex13Δ15, die einen transdominanten Rex- Repressor aufwiesen. Dasselbe Muster wurde auch bei pcRev festgestellt (vgl. Fig. 2D), nämlich für pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8 und teilweise für pcRexM13. Dies deutet darauf hin, dass eine Transdominanz nicht auf das HTLV-I-Gen beschränkt ist, sondern dass einige der Mutanten für beide Gene transdominant sind. d. h. in diesem speziellen Fall pcRexM2, pcRexM7 und pcRexM8.
Während einige der zuerst erhaltenen Ergebnisse darauf hindeuteten, dass die erfolgversprechendsten Mutationen sich zwischen den Aminosäurepositionen 87 und 94 befinden und es somit schien, dass ein Teil des rex/rev-Gens, der zwischen etwa der Aminosäureposition 82 und etwa der Position 97 liegt, von spezieller Bedeutung bei der Konstruktion von transdominanten Rex/Rev-Repressoren ist, haben weitere Untersuchungen gezeigt, dass der Bereich der bevorzugten Positionen der Mutationen im Rex-Protein breiter ist, d. h. dass sie zumindest so nahe am N-Terminus wie die Aminosäureposition 22 und mindestens so weit in Richtung des C-Terminus wie die Aminosäureposition 101 liegen können.
5.2
In einem weiteren Ansatz, der sich auf die Rev-Funktion in HIV-1 konzentriert, wurden auch transdominante rev-Repressoren festgestellt. Es ist möglich, dass einige voll diesen mindestens auch die Rex-Funktion in HTLV-I oder HTLV-II hemmen, dies wurde jedoch hier nicht getestet.
Andererseits hat sich gezeigt, dass einige dieser mindestens auch die Rev-Funktion in HIV-2 und SIVmac hemmen.
Eine umfangreiche Mutationsanalyse hat ferner zu der Skizzierung von mindestens zwei ausgeprägten funktionellen Domänen innerhalb von rev geführt, die scheinbar für eine Transaktivierung essenziell sind. Diese Domänen umfassen gemäß unserer Vorstellung eine "Bindungsdomäne", die das Rev-Protein zu seinem geeigneten Zielsubstrat führt, und eine "Aktivierungsdomäne", die ermöglicht, dass die funktionellen Folgen des Bindungsfalls und einer Transkriptionsaktivierung sichtbar werden.
Folglich wurden die beiden funktionellen Domänen innerhalb von rev wie folgt definiert: Eine Bindungsdomäne, die vermutlich das Rev-Protein zu seinem zellulären Ziel steuert und eine Aktivierungsdomäne, die den nuclearen Export der unvollständig gesplicten RNAs, die die Strukturproteine Gag und Env codieren, gewährleistet. Eine Mutation der Aktivierungsdomäne von Rev führt zur Expression von defektem Rev-Protein, das als transdominanter Inhibitor der Rev-Funktion agiert. Derartige Mutanten hemmen merklich eine HIV-1-Replikation bei Expression in transfizierten Zellen in Kultur und sind somit auch transdominant, wie dies unter 5.1. erhaltene Mutanten sind.
Eine detaillierte Information bezüglich dieses zweiten Ansatzes ergibt sich auch aus dem nachfolgenden Punkt 6.2. Die transdominanten Mutanten, die dadurch festgestellt wurden, besitzen die Bezeichnung pM10, pΔ9/14 und pΔ10/14 (vgl. Beispiele 4 bis 11) und pM21, pM22, pM27, pM28, pM29 und pM32 (vgl. Beispiele 11a und 11b) bezeichnet, wobei sich gezeigt hat, dass pM10 in wirksamer Weise nicht nur die HIV-1-rev-Genfunktion, sondern auch genauso die HIV-2-rev- und SIVmac-rev- Genfunktion hemmt.
Bevorzugt unter den obigen 9 transdominanten Mutanten sind pM10, pM21 und pM32, insbesondere pM10.
5.3.
In einem weiteren Ansatz, der sich auf die Rex-Funktion in HTLV-I ähnlich zu Punkt 5.1. konzentriert, wurden auch transdominante rex-Repressoren gefunden und ein Verfahren entwickelt, das den Nachweis von Rex-Aktivitäten erlaubt und sich zur Identifizierung spezieller Inhibitoren der Rex- Funktion, die im allgemeinen nicht andere virale oder Wirtzellfunktionen stören, eignet. Dieses Rex- Inhibitornachweisverfahren verwendet ein genetisches System, das ein Rex-reaktives "Reporter"-Gen mit Codierung für eine nicht-gesplicte Form einer mRNA, die ein Regulatorelement, beispielsweise RexRE (RRX), umfasst. In diesem System induziert ein die Rex-Funktion lieferndes Protein den Export dieser nicht-gesplicten mRNA aus dem Zellkern in das Cytoplasma. In Abwesenheit der Rex-Funktion wird diese mRNA vor Export in das Cytoplasma, wie oben angegeben, gesplict. Bei In-Berührung-Bringen von Zellen, die dieses genetische System umfassen, mit einem Mittel, von dem vermutet wird, dass es sich um einen Inhibitor einer Rex-Funktion handelt, wird eine spezifische Hemmung der HTLV-I-Rex- Funktion durch dieses Mittel durch die Abnahme des nuclearen Exports der nicht-gesplicten Form dieser speziellen mRNA zusammen mit keiner Abnahme des nuclearen Exports der gesplicten Form derselben mRNA angezeigt. Dieses Verfahren eignet sich zum Nachweis beispielsweise von chemischen Inhibitoren des HTLV-I-Rex-Proteins, beispielsweise von Inhibitoren mit der Fähigkeit zur Nachahmung der transdominanten Domäne in einem Mutanten-Rex- oder -Rev-Protein, beispielsweise von ein niedriges Molekulargewicht aufweisenden chemischen Inhibitoren sowie von transdominanten Mutantenformen von Rex, die als Repressoren von Rex agieren.
Zur Identifikation von transdominanten negativen Mutationen des rex-Gens wurde abermals Reihen von Punktmutationen hergestellt, die Segmente von zwei oder drei Aminosäuren an verschiedenen Stellen entlang der linearen Sequenz des Rex-Proteins veränderten, wobei verschiedene transdominante Repressoren der HTLV-I-Rex-Proteinfunktion unter diesen Mutanten identifiziert wurden, wobei einige hiervon darüber hinaus tansdominant die HTLV-II-Rex- und/oder die HIV-I-Rev-Proteinfunktion reprimierten und somit analog zu einigen der unter 5.1. gefundenen Mutanten auch die phenotypische Expression der funktionell äquivalenten Gene von mehr als einer Virusspezies reprimieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ferner ein Verfahren zur Identifizierung eines speziellen Inhibitors der Genaktivierungsfunktion des Rex-Proteins, das die verschiedenen unter obigem Punkt 3. definierten Stufen umfasst. Wie oben ausgeführt, vermag das HIV-I-Rex-Protein die Funktion des HIV-1-Rev-Proteins zu ersetzen. Darüber hinaus wurde nun festgestellt, dass Rex auch das analoge HTLV-II-Regulatorprotein substituieren kann. Somit können mRNAs aus mindestens einem beliebigen dieser drei Viren, die ein Reaktionselement, das durch Rex erkannt wird, und mindestens eine geeignete nicht verwendete Splicestelle aufweisen, in diesem Verfahren verwendet werden.
Vorzugsweise wird die mRNA, die das Reaktionselement und die Splicestelle umfasst, durch ein Plasmid codiert, das das 3'-Ende eines HTVL-I-Provirus einschließlich der Codierbereiche für die Rex- und Tax-Proteine, das vollständige env-Gen, das Rex-Reaktionselement RexRE (RRX) und den gesamten 3-LTR-Bereich umfasst. Ein Beispiel für ein derartiges Plasmid ist pgTAX-LTR. Aus Bequemlichkeitsgründen wird bei Mutantenanalysen, die die Steuerung des Verhältnisses von Kopien eines Mutanten-rex-Gens zu Kopien vom Wildtyp-rex-Gen erfordern, das rex-Gen in pgTAX-LTR durch eine rezessive negative Mutation inaktiviert und in diesem System das aktive rex-Gen auf einem separaten Plasmid mit der Bezeichnung pREX bereitgestellt. Jedoch könnte zum Testen beispielsweise von Chemikalien, das aktive rex-Gen auf einem separaten Plasmid mit der Bezeichnung pREX bereitgestellt. Jedoch könnte zum Testen beispielsweise von Chemikalien das aktive rex-Gen auf demselben Plasmid oder einer anderen Vektor-DNA wie der erforderlichen mRNA dieses Systems bereitgestellt werden. Des weiteren kann dieses aktive rex-Gen eine natürliche Sequenzvariante, die aus einem von dem erfindungsgemäß verwendeten verschiedenen HTLV-I-Stamm isoliert wurde, oder eine beliebige andere Mutantenform des rex-Gens mit der Fähigkeit unter Bildung eines Proteinprodukts exprimiert zu werden, das die Genaktivierungsfuktion des Rex-Proteins einschließlich der Induktion des Exports der obigen mRNA aus dem Kern liefert, umfassen. Die Elemente des oben angegebenen genetischen Systems können auch durch Verwendung eines DNA-Segments mit Codierung für das gesamte funktionelle Genom eines Retrovirus als Teil dieses genetischen Systems bereitgestellt werden. Eine Applikation auf infizierte Zellen ist möglich. Aus Sicherheitsgründen sowie aus Bequemlichkeitsgründen ist jedoch dieses genetische System vorzugsweise nicht in der Lage, ein beliebiges infektiöses Virus zu produzieren. Dies wird durch Ausbildung eines genetischen Defekts in diesem System erreicht, der die Expression von mindestens einer Virusaktivität verhindert, die für die Produktion eines beliebigen infektösen Virus essenziell ist, von dem ein genetisches Material verwendet wird. Beispielsweise kann dies durch Weglassen mindestens eines Teils eines viralen Gens oder durch irgendwelche anderen Mutationen erfolgen.
Vorzugsweise sind die Wirtszellen, die durch das rex-Gen und durch das DNA-Segment mit Codierung für mRNA transformiert sind, beispielsweise COS-Zellen, die durch die oben beschriebenen Plasmidvektoren transfiziert wurden. Somit umfasst der Ausdruck "Transformation" hier und im folgenden den Ausdruck "Transfektion" und gibt eine genetische Transformation an, die eine Vektor-DNA umfasst, die für ein infektiöses Mittel, insbesondre ein Virus, codiert. Nach Transfektion kann ein derartiger Vektor aus der Minderheit der transformierten Zellen in der Kultur zu der Mehrheit anderer Zellen mit Hilfe von infektiösen Viruspartikeln verbreitet werden, wodurch eine größere Probe von Wirtszellen bereitgestellt wird, die die interessierenden Gene exprimieren. Darüber hinaus muss die Transformation der Wirtszellen in dem vorliegenden genetischen System nicht zu stabilen Konstrukten führen. Es können entweder stabile oder transiente Genexpressionssysteme verwendet werden, um die erforderliche mRNA und das rex-Gen zu liefern. Somit können eine breite Vielzahl von bekannten Expressionssystemen zur Identifizierung von Inhibitoren gemäß dem vorliegenden Verfahren verwendet werden.
Bei diesem Verfahren gibt eine Verminderung des Exports der mRNA, die die nicht- verwendete Splicestelle umfasst, zusammen mit keiner Verminderung des Exports der gesplicten Form dieser mRNA an, dass das Mittel ein spezifischer Inhibitor einer Aktivität eines HTLV-I-rex-Gens oder einer Aktivität eines Produkts des rex-Gens ist. Für den Fall eines chemischen Mittels, von dem sich durch Verwendung des vorliegenden Verfahrens gezeigt hat, dass es ein spezieller Inhibitor ist, kann der Wirkmodus im Prinzip die spezifische Hemmung der Transkription oder Translation der mRNA umfassen. Wahrscheinlichere Wirkmodi umfassen jedoch die spezielle Hemmung einer oder mehrer Aktivitäten des Rex-Proteins einschließlich einer nucleolaren Lokalisierung, Erkennung des Rex-Reaktionselements oder der Rex-Effektorfunktion.
In vorteilhafter Weise wird die Verringerung des nuclearen Exports der mRNA, die die nicht-verwendete Splicestelle umfasst, durch Bestimmen der Produktionsmenge eines ersten Proteins nachgewiesen, wobei das erste Protein durch die mRNA codiert wird, die die nicht-verwendete Splicestelle umfasst (d. h. lediglich die nicht-gesplicte Form der mRNA codiert für dieses erste Protein) und die Erhöhung des nuclearen Exports der gesplicten Form der mRNA wird durch Bestimmen der Produktionsmenge eines zweiten Proteins nachgewiesen, wobei dieses zweite Protein durch die gesplicte Form dieser mRNA codiert wird.
Vorzugsweise codiert die mRNA in der nicht-gesplicten Form für das HTLV-I-Env-Protein. Ein Splicen dieser mRNA führt zu einer kürzeren mRNA, die für ein weiteres HTLV-I-Protein, Tax, codiert. Beispielsweise in den nachfolgenden Beispielen 12 und 13 wird der nucleare Export der nichtgesplicten mRNA mit dem RexRE (RRX)-Element durch die Expression des Env-Proteins nachgewiesen. Des weiteren wird die Hemmung eines derartigen Exports der nicht-gesplicten mRNA, die von der Hemmung der Rex-Funktion herrührt, durch die Abnahme der Produktion des Env-Proteins nachgewiesen. Da diese Abnahme jedoch auch von einer gewissen allgemeinen Toxizität eines Mittels gegenüber dem Virus oder der Wirtzelle herrühren kann, wird die spezifische Hemmung der rex-Genfunktion durch die Abnahme der Env-Expression zusammen mit keiner Abnahme des Exports der gesplicten Form der mRNA (wie es sich in keiner Abnahme der Produktion des HTLV-I-Tax-Proteins widerspiegelt) angezeigt. Somit wird vorzugsweise eine simultane Analyse der HTLV-I-Env-, Tax- und Rex-Proteinexpression bewirkt.
Beispielsweise in den nachfolgenden Beispielen 12 und 13 wird die Expression der Env- und Tax-Proteine durch Immunopräzipitation mit geeigneten Antikörpern und elektrophoretischer Analyse der erhaltenen Präzipitate bestimmt. Alternativen beispielsweise für ein Screenen in großem Maßstab von Proben bezüglich einer spezifischen Hemmung der Rex-Funktion umfassen beispielsweise Enzymimmunoassay (ELISA)-Verfahren bezüglich Env und Tax oder die Veränderung der mRNA durch genetische Konstruktion, um einige andere, besser geeignete Produkte zur Angabe der Expression der gesplicten und nicht-gesplicten Farmen bereitzustellen. Beispielsweise könnte die mRNA so geändert werden, dass sie für ein Enzym codiert, das durch Zugabe eines farblosen Substrats nachgewiesen werden kann, das bei einer Hydrolyse eine Farbe liefert, beispielsweise E. coli-β-Galactosidase. Wenn das Gen für dieses Enzym anstelle des env = Gens insertiert wird, würde die nicht-gespicte mRNA-Form dieses Enzym produzieren, während die gesplicte Form es nicht tun würde. Ein zweites ähnlich geeignetes Indikatorgen könnte auch in der mRNA codiert sein, so dass es in der gesplicten mRNA-Form, beispielsweise durch Fusion an die Tax-Sequenzen, exprimiert werden würde. Weitere Variationen der obigen Ansätze für ein rasches und wirksames Massenscreening sind für den Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet ohne Schwierigkeiten ersichtlich.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Reagenskit zum Screenen von Mitteln, um einen spezifischen Inhibitor für die Genaktivierungsfunktion des Rex-Proteins gemäß dem obigen Verfahren zu identifizieren, wobei der Kit die unter dem obigen Punkt 3. angegebenen Komponenten umfasst. Dieser Kit umfasst optional des weiteren eine beliebige der folgenden Komponenten: Medien, die bei der Kultivierung von Zellen verwendet werden; Reagenzien, die bei der Bestimmung der Menge des nuclearen Exports entweder der gesplicten oder der nicht-gesplicten Form der ReportermRNA, entweder direkt beispielsweise durch Nucleinsäurehybridisierung oder indirekt durch immunologischen Nachweis, beispielsweise der Proteinprodukte der gesplicten und nicht-gesplicten Formen dieser mRNA verwendet werden: und Instruktionen zur Verwendung beliebiger der obigen Komponenten dieses Kits zur praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Das obige Verfahren wurde zum Screenen verschiedener rex-Genmutanten bezüglich dominanter negativer Mutationen verwendet. Wenn diese rex-Genmutanten mit dem Plasmid pgTAX-LTR in dem Rex-Inhibitornachweissystem gemäß der vorliegenden Erfindung vorexprimiert wurden, wurde eine Klasse von Mutationen ähnlich wie unter Punkt 5.1. gefunden, die Aminosäuresubstitutionen in dem Rex- Protein an den Positionen 59-60, 64-65 und 119-121 umfasst, die zu Proteinen führten, denen lediglich die Rex-Funktion fehlte, die jedoch auch als transdominante Repressoren der Funktion des Wildtyp-Rex- Proteins agierten und die auch als transdominante Repressoren der Funktion des Wildtyp-Rev-Proteins agierten.
Diese Mutationsanalyse lieferte ferner eine zweite Klasse von negativen Mutanten, die Substitutionen an den Rex-Aminosäurepositionen 5-7 und 14-15 umfassten, denen eine Rex-Funktion fehlte. Diese Mutantenproteine waren weder geeignet gegenüber dem Zellkern zielgerichtet noch transdominant. Des weiteren behielt eine dritte Klasse von negativen Mutanten, die beispielsweise durch eine einzelne Mutante veranschaulicht ist, die Substitutionen an den Rex-Aminosäurepositionen 141-143 aufweist, eine teilweise Rex-Funktion bei und war bezüglich des Kerns zielgerichtet, versagte jedoch darin, sich in dem nucleolaren Bereich des Kerns zu lokalisieren. Dieses Mutantenprotein war auch kein transdominanter Repressor der HTLV-I-Rex-Funktion. Diese Ergebnisse eröffnen die Möglichkeit, dass die nucleolare Lokalisierungsaktivität Sequenzen umfassen kann, die von den positiv geladenen Resten verschieden sind, die am Aminoterminus identifiziert wurden (H. Siomi et al., Cell 5δ (1988), 197-209). Darüber hinaus lassen diese Erkenntnisse vermuten, dass eine Rex-Proteinmutante, um als transdominanter Repressor der Rex-Funktion dienen zu können, nicht nur eine nucleare Zielaktivität, sondern auch eine ausgeprägte nucleolare Lokalisierungsaktivität des Rex-Proteins aufweisen muss.
Diese Erkenntnisse bei den Rex-Mutanten hier definieren auch ungefähre Grenzen von mindestens zwei funktional unterschiedlichen Peptiddomänen in dem Rex-Protein, von denen eine erste in ein nucleares und nuceolares zielgerichtetes Steuern und die zweite in eine Effektorakvitität involviert sind. Die Rex-Mutanten, denen eine nucleare zielgerichete Steuerung fehlt, sind in der positiv geladenen Peptiddomäne am Aminoterminus von Rex lokalisiert, von der zuvor gezeigt wurde, dass sie als nucleolares Lokalisierungssignal fungiert. Wenn ein Peptid, das die aminoterminalen zwanzig Aminosäuren umfasst, durch rekombinante DNA-Maßnahmen an ein anderes Protein gebunden war, induzierte diese Domäne sowohl eine nucleare Zielsteuerung als auch eine nucleolare Lokalisierung dieses Proteins in einem Muster, das dem für Rex beobachteten ähnelte (H. Siomi et al. (1988), aaO). Somit ist es nicht wahrscheinlich dass die Mutante an den Rex-Aminosäurepositionen 141-143 in einem Bereich liegt, der für eine nucleolare Lokalisierung erforderlich ist, obwohl diese Mutante auf den Kern gerichtet war, jedoch dabei versagte, sich in dem nucleolaren Bereich des Kerns zu lokalisieren. Eher beeinflußt die Veränderung bei dieser Mutante höchstwahrscheinlich die nucleolare Lokalisierungsfunktioin von Rex in der aminoterminalen Domäne indirekt, beispielsweise durch Interferenz mit der geeigneten Proteinfaltung.
Die zweite bedeutende funktionell kenntliche Domäne von Rex umfasst die Aminosäuren 59-60 (Tyrosin-Isoleucin). 64-65 (Tyrosin-Tryptophan) und 119-121 (Threonin-Phenylalanin-Histidin). Eine Veränderung an jeder von diesen diskreten Stellen (M6-, M7- und M13-Mutanten) führt zur Produktion eines Rex-Proteins, dem sowohl die biologische Aktivität fehlt als das auch transdominante Hemmeigenschaften zeigt. Fünf unterschiedliche Mutationen ohne Wirkung auf die Rex-Funktion trennen die Region von M6 und M7 von der von M13 in der linearen Sequenz des Rex-Proteins. Dies zeigt, dass die Wechselwirkung dieser beiden diskreten Regionen in dieser funktionellen Domäne eine geeignete Proteinfaltung erfordern kann. Somit scheint der gesamte lineare Bereich des Rex-Proteins, der diese beiden Regionen von Aminosäuren umfasst, die für die Rex-Effektorfunktion höchst kritisch sind, zu der Effektorfunktion des Rex-Proteins beizutragen und stellt somit die Domäne dar, die mutiert werden muss, um transdominante Repressoren von Rex herzustellen.
Die vorliegenden Erkenntnisse befassen sich nicht mit der Domäne von Rex, in der die Aktivität lokalisiert ist, die für die Erkennung von RexRE (RRX) in einer mRNA erforderlich ist. Folglich ist nicht bekannt, ob ein Mutanten-rex-Protein, um als transdominanter Repressor der Rex-Funktion zu dienen, die. Fähigkeit beibehalten muss, (direkt oder indirekt) an RexRE oder das Erkennungselement eines bestimmten anderen Virus, das durch Rex erkannt wird, zu binden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein DNA-Segment, das für einen transdominanten Repressor der Funktion des HTLV-I-Rex-Proteins codiert sowie einen derartigen transdominanten Repressor. Dieser Repressor ist ein Protein, das von einer Wildtypform des Rex-Proteins durch mindestens eine Mutation modifiziert ist, die negativ die Effektoraktivität des Rex-Proteins beeinflusst. Dieser Repressor weist auch im wesentlichen die nucleolare Lokalisierungsaktivität der Wildtypform des Rex-Proteins auf. Insbesondere ist die negative Mutation dieses Repressors eine, die eine Aminosäure in der Peptiddomäne des Wildtyp-Rex-Proteins, die von etwa der Aminosäureposition 59 bis etwa zur Aminosäureposition 121 reicht, insbesondere eine der folgenden Positionen: 59, 60, 64, 65, 119, 120 und 121 beeinflußt. Das DNA-Segment mit Codierung für den Rex-Repressor wird beispielsweise durch eines der folgenden Mutanten-rex-Gene veranschaulicht: M6, M7, M13 und Varianten und Derivate hiervon, die eine transdominante Repression der HTLV-I-Rev-Proteinfunktion zeigen.
Die Sequenz dieses DNA-Segments stammt von dem Rex-Gen eines beliebigen Isolats von HTLV-I (L. Rimsky et al., Nature 335 (1988), 738-740; M. Seiki et al., Science 227 (1985), 1227-1229) oder wird durch chemische Synthese erzeugt. Der transdominante Repressor der Rex-Funktion wird durch rekombinante Standard-DNA-Verfahren oder durch chemische Standardverfahren zur Peptidsynthese oder durch eine Kombination dieser Verfahren, die alle auf dem einschlägigen Fachgebiet der Genkonstruktion wohlbekannt sind, hergestellt.
Die Mutationen, die die Effektoraktivität des Rex-Proteins negativ beeinflussen, sind in der Beschreibung hier und im folgenden beispielhaft veranschaulicht. Weitere Typen von Mutationen, die so ausgelegt sind, dass sie lokalisierte Effekte auf die Proteinstruktur an oder nahe diesen gleichen Aminosäurepositionen entfalten, liefern jedoch auch höchstwarscheinlich Varianten und Derivate von Rex, die eine transdominante Repression einer HTLV-I-Rex-Proteinfunktion gemäß der vorliegenden Erfindung zeigen. Derartige lokalisierte Effekte umfassen beispielsweise Deletionen oder Insertionen einzelner Aminosäuren oder Substitutionen von chemisch oder strukturell ähnlichen Aminosäuren. Andererseits ist es höchstwahrscheinlich, dass ausgedehntere Deletionen oder Insertionen oder Substitutionen, die die Sekundärstruktur stören, (beispielsweise ein Prolin in einem β-Faltblattbereich) durch Einfluss auf die Proteinfaltung Effekte auf entfernte Teile des Proteins aufweisen. Folglich ist es nicht wahrscheinlich, dass derartige Mutationen an den angegebenen Positionen in der für die Rex-Effektorfunktion erforderlichen Domäne Mutanten-Rex-Proteine liefern, die im wesentlichen die nucleolare Lokalisierungsaktivität der Wildtypform des Res-Proteins aufrechterhalten.
Die transdominanten Rex-Mutanten des obigen Punkts 5.3. wurden auch bezüglich ihrer Hemmung der Rev-Funktion getestet. Es zeigte sich, dass sie auch Repressoren von HIV-1-Rev sind. Das antivirale Potential dieser Klasse von transdominanten Rex-Mutanten wurde unter Verwendung eines Tests auf die Hemmung einer HIV-1-Replikation aufgezeigt.
Darüber hinaus und wie bereits oben ausgeführt, wurde nun festgestellt, dass HTLV-I-Rex auch funktionell das analoge HTLV-II-Regulatorprotein ersetzen kann, selbst obwohl die Nucleotidsequenz des entsprechenden Reaktionselements in HTLV-II eine etwas unterschiedliche Stamm- und Schleifenstruktur gegenüber der von RexRE (RRX) bei HTLV-I aufweist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren ein Verfahren zur Hemmung der Replikation von HIV-1, HTLV-I und HTLV-II, wobei das Verfahren ein Einführen eines DNA-Segments gemäß der obigen Definition, das für einen transdominanten Repressor der Rex-Funktion codiert, in eine Zelle mit der Fähigkeit zur Replikation eines dieser Viren umfasst. Diese Zelle besitzt ferner die Fähigkeit, das DNA-Segment unter Bildung des transdominanten Repressors zu exprimieren. Diese Zelle kann eine sein, die zuvor durch ein oder mehrere dieser Viren infiziert wurde oder diese Zelle kann eine nicht- infizierte Targetzelle bzw. Zielzelle für eines oder mehrere dieser Viren sein.
Bei der bevorzugten Ausführungsform des oben erwähnten genetischen Systems wurde ein auf Rex reagierendes Reporterplasmid pgTAX-LTR hergestellt (Fig. 13B). Kurz gesagt, enthält der pgTAX-LTR-Vektor die beiden Proteincodierexons des tax-Gens, die durch das HTLV-I-env-Gen getrennt sind und einen vollständigen HTLV-I-3'LTR-Bereich, der RexRE (RRE) enthält. Die Expression dieser HTLV-I-Sequenzen wird durch die Immediate-early-Region des humanen Cytomegalovirus gefördert und weitere Polyadenylierungssequenzen werden durch den 3'-Bereich des Rattenpräproinsulingens (B. R. Cullen, Cell 46 (1986), 973-982) bereitgestellt. Dieser Vektor liefert Env lediglich in Gegenwart von Rex, Tax wird jedoch in Gegenwart oder Abwesenheit von Rex synthetisiert. Dieser Vektor liefert selbst nicht Rex infolge der Einführung einer Mutation an der SphI-Stelle, die mit dem Rex- Translationsinitationscodon zusammenfällt. In Abwesenheit von Rex liefert pgTAX-LTR Tax-Protein. Dies reflektiert eine Transiation der gesplicten mRNA-Spezies aus diesem Vektor, dem praktisch die gesamtenen env-Sequenzen fehlen. Jedoch wenn pgTAX-LTR mit dem rex-Expressionsplasmid pREX cotransfiziert wird, wird die Synthese des HTLV-I-Env-Proteins aktiviert. Dieses 62-68 kD-Protein lässt sich bereitwillig identifizieren, wie durch die Immunopräzipitätion mit dem monoklonalen Anti-HTLV-I- Hüllenantikörper 0,5 alpha (S. Matsushita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 2672-2676) (Fig. 14A. Spur 1) gezeigt wurde. Im Gegensatz dazu wird kein HTLV-I-Env-Protein nachgewiesen, wenn pREX durch entweder pREV (Spur 2) oder pCMV-IL-2 (Spur 3), das das HIV-1-Rev-Protien bzw. Human-IL-2-Polypeptid codiert, ersetzt wird. In ähnlicher Weise wird kein Env-Protein festgestellt, wenn Zellen mit pREX in Abwesenheit von pgTAX-LTR transfiziert werden (Spur 4).
Somit wird in dem oben definierten genetischen System eine HTLV-I-Env-Expression durch pgTAX-LTR spezifisch in Gegenwart eines Proteins mit der Genaktivierungsfunktioin des Wildtyp-Rex- Proteins induziert. In dem System, das ein Gen umfasst, das ein Protein mit Rex-Funktion bei Kontakt mit einem Mittel, das die Rex-Funktion hemmt, liefert, wird weiterhin Tax-Protein produziert, sofern das Mittel nicht in gewisser Weise die virale und zelluläre Aktivität beeinflusst, die nicht mit der Expression des Gens oder des Genprodukts, das die Rex-Funktion liefert, in Verbindung steht, d. h. sofern das Mittel nicht ein spezifischer Inhibitor dieses Gens oder seines Produkts ist. Somit umfasst (wie in Beispiel 12 und Fig. 15 angegeben) vorteilhafterweise das Beispielverfahren zur Identifizierung spezifischer Inhibitoren der Rex-Funktion die simultane Analyse einer HTLV-I-Env-, -Tax- und -Rex-Proteinexpression.
Es sei darauf hingewiesen, dass im Fall einer spezifischen Hemmung der Rex-Funktion durch transdominante Repressoren gemäß der nachfolgenden Beschreibung und in Fig. 15 die Produktion von HTLV-I-Tax-Protein sichtbar zunimmt. Dies ist vermutlich ein Ergebnis einer Erhöhung des nuclearen Exports der gesplicten Form der Env-mRNA, die aufgrund eines Fehlens der Rex-Funktion vor dem Splicen nicht exportiert wird. Im Prinzip kann jedoch ein spezifischer Inhibitor der Rex-Funktion ein Splicen der mRNA verhindern, jedoch nicht einen Export der nicht-gesplicten mRNA induzieren. Folglich erfordert das vorliegende Verfahren zur Identifizierung spezifischer Inhibitoren der Rex-Funktion lediglich, dass keine Abnahme des nuclearen Exports der gesplicten mRNA, die in der vorliegenden Situation das Tax-Protein liefert, stattfindet.
Die Verwendung dieses Systems ist im folgenden Beispiel 12 beispielhaft veranschaulicht. In dieser Mutationsanalyse wurde abermals eine Oligonucleotid-gesteuerte Mutagenese in dem M13- Bakteriophagen verwendet, um die Primärsequenz des rex-Gens an 25 unterschiedlichen Stellen zu verändern (Fig. 13A). Die Aminosäuren in Kästchen wurden durch das Dipeptidasparaginsäure-Leucin durch Insertion eines im Rahmen befindlichen Oligonucleotidduplex, das ferner die diagnostische BgIII- Restriktionsstelle enthielt, ersetzt. Jede dieser rex-Mutanten wurde anschließend in den eukaryotischen bBC 12/CMV-Expressionsvektor (B. R. Cullen, Cell 46 (1986), 973-982) insertiert und die Mutationen durch DNA-Sequenzierung verifiziert.
Jede der rex-Mutationen wurde bezüglich biologischer Aktivität durch Cotransfektion mit dem pgTAX-LTR-Vektor untersucht. Während neunzehn dieser rex-Mutanten einen Wildtyp-Phenotyp zeigten, fehlte fünf Mutanten (M1, M2, M6, M7 und M13) eine offensichtliche env- Genaktivierungsaktivität und eine Mutante (M15) zeigte lediglich eine teilweise Funktion (Fig. 14B). COS-Zellen wurden anschließend mit diesen sechs rex-defekten Mutanten und dem pgTAX-LTR-Vektor cotransfiziert, gefolgt von einer simultanen Analyse einer HTLV-I-Env-, -Tax- und -Rex- Proteinexpression gemäß Beschreibung in Beispiel 12 (s. ferner Fig. 15A-C). Während HTLV-I-Env lediglich in Gegenwart des Wildtyp-Rex-Proteins (Fig. 15A, Spur 7) oder der teilweise aktiven M15- Mutante (Fig. 15A, Spur 6) nachgewiesen wurde, wurde das 40 kD große Tax-Protein in allen Kulturen nachgewiesen (Fig. 15B). Somit ist das Fehlen der env-Genexpression bei den M1-, M2-, M6-, M7- und M13-Mutanten eher auf das spezifische Fehlen der biologischen Rex-Aktivität als auf nicht-spezifische toxische Effekte dieser Proteine in den transfizierten COS-Kulturen zurückzuführen. Jede der Mutanten- Rex-Proteine wurde ferner in diesen Kulturen identifiziert, was zeigt, dass alle Mutanten in stabiler Weise exprimiert wurden (Fig. 15C). Die M2-, M6- und M13-Mutanten wanderten in einer Weise, die von dem Wildtyp-Rex-Protein nicht unterscheidbar war (Fig. 15C, Spuren 2, 3, 5 und 7), während die M7- und M15-Proteine ein kleineres scheinbares Molekulargewicht (Spuren 4 und 6) zeigten und die M1-Mutante ein elektrophoretisches Dublett von Proteinen (Spur 1) lieferte. Ein Sequenzieren der Proteincodierbereiche bei den M1-, M7- und M15-Mutanten konnte keinerlei Änderung zeigen, die von den spezifischen eingeführten Mutationen verschieden sind. Somit spiegelt die biochemische Basis für diese offensichtlichen Unterschiede in der Größe wahrscheinlich ein verändertes Posttranslationsprozessieren dieser Mutanten-Rex-Proteine wieder.
Ähnlich dem Wildtyp-Rex-Protein zeigte ein Immunofluoreszenzanfärben in situ von mit den biologisch inaktiven M6-, M7- oder M13-Rex-Mutanten transfizierten Zellen (wie detailliert in Beispiel 12 ausgeführt), ein normales zielgerichtetes Ansteuern der Nucleoli und Kerne der exprimierenden Zellen (Fig. 16). Im scharfen Gegensatz war das M1-Mutantenprotein lediglich in dem Cytoplasmakompartment nachweisbar, während die M2-Rex-Mutante in etwa homogener Weise in der gesamten Zellen verteilt war. Im Einklang mit diesen Erkenntnissen steht die Tatsache, dass die M1- und M2-Mutationen basische Aminosäurereste veränderten, die in der positiv geladenen Peptiddomäne, die als ein nucleolares Lokalisierungssignal fungiert, lokalisiert sind. Die teilweise aktive M15-Mutation führt zu einem Muster einer nuclearen Lokalisierung eines Mutanten-Rex-Proteins, anders als das Wildtyp-Rex-Protein lässt sich das M15-Protein jedoch nicht weiter in dem nucleolaren Bereich des Kerns lokalisieren und in der Tat schien M15 aus den Nucleoli ausgeschlossen zu sein (Fig. 16). Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Reste entfernt von den basischen Aminosäuren am N-Terminus an der nucleolaren Lokalisierung von Rex beteiligt sein können oder dazu beitragen.
Die rex-Mutanten wurden ferner bezüglich ihrer Kapazität zur Blockierung der biologischen Wirkung des Wildtyp-HTLV-I-Rex-Proteins und des Wildtyp-HIV-1-Rev-Proteins untersucht (Fig. 17). Bei Cotransfektion mit pgTAX-LTR und pREX in COS-Zellen (Panel A) zeigte ein 10facher molarer Überschuss der M6-, M7- und M13-Mutanten einen dominanten negativen Phenotyp dahingehend, dass die Wirkung des Wildtyp-Rex-Proteins merklich gehemmt war (Spuren 3-5). Im Gegensatz dazu agierten die M1-, M2- und M15-Proteine als rezessive negative Mutanten, da die Wirkung des Wildtyp-Proteins nicht verändert war (Spuren 1, 2. 6). In ähnlicher Weise störte das Rev-Protein von HIV-I die Wirkung des Rex-Proteins nicht (Spur 8) noch störte es die Wirkung von IL-2 (Spur 9).
Die Fähigkeit der transdominanten Rex-Mutanten zur Blockierung der Funktion von Rev in dem HIV-1-System wurde nachfolgend untersucht (Fig. 17B). Bei Cotransfektion mit pgTAT und pREV in COS-Zellen hemmte ein 10facher molarer Überschuss der M6-, M7- oder M13-Rex-Mutanten die Wirkung des Rev-Proteins (Spuren 3, 4, 5), wie durch eine verminderte Expression der 72 Aminosäuren langen Form des Tat-Proteins gezeigt wurde. Die Fähigkeit dieser transdominanten Rex-Mutanten zur Blockierung einer HIV-1-Virusreplikation wurden auch untersucht (Fig. 17C). Eine Replikation eines Rev-defizienten HIV-1-Provirus, pHXB2-Bam-p3 (L. Rimsky et al., Nature 335 (1988), 738) in Gegenwart von Rex und abgestuften Mengen transdominanter Rex-Mutanten wurde durch Transfektion von COS-Zellen mit diesen Plasmiden untersucht. Wie durch synthetisierte Mengen von HIV-1-p24-Gag- Protein in Kulturüberständen angezeigt wird, lieferten die transdominanten Rex-Mutanten (M6, M7 und M13) eine dosisabhängige Hemmung der HIV-1-Replikation. Im Gegensatz dazu lieferte die rezessive negative M1-Mutante von Rex keine signifikante Wirkung auf die HIV-1-Replikation.
Zusammen zeigen diese Ergebnisse mit verschiedenen rex-Mutanten der nachfolgenden Beispiele 12 und 13 die ungefähren Grenzen innerhalb des Rex-Proteins von mindestens zwei unterschiedlichen Strukturdomänen mit unterschiedlichen Aktivitäten. Somit ist eine Domäne durch die M1- und M2- Mutationen definiert, befindet sich am N-Terminus, umfasst die Aminosäuren 5-7 und 14-15 und scheint eine Rolle bei der zielgerichteten Steuerung des Proteins zum Kern und somit zum Nucleolus zu spielen. Diese positiv geladene Domäne ist ferner bei der Rex-Bindung entweder direkt an RexRE (RRX) oder an andere Proteine, die direkt mit diesem RNA-Element in Berührung gelangen, beteiligt. Die zweite Domäne, die oben beschrieben wurde, ist kritisch für die Rex-Effektorfunktion und kann somit mutiert werden, um transdominante Repressoren zu liefern.
5.4.
Als Zusammenfassung der Erkenntnisse der obigen Punkte 5.1., 5.2. und 5.3. lassen sich folgende Schlüsse ziehen:
a) Ein allgemein anwendbares Prinzip wurde festgestellt, um virale Inhibitoren durch Mutieren eines kritischen Regulatorproteins, wie Rex oder Rev, herzustellen;
b) dieses Prinzip scheint auf die Herstellung von Mutanten-Regulatorproteinen, die auf eine Vielzahl von Virusspezies einwirken, anwendbar zu sein; und
c) die spezifischen transdominanten Mutanten, dic konstruiert und identifiziert wurden, sind die folgenden:
- HTLV-I-Rex-Mutanten, die in wirksamer Weise eine HTLV-I-rex-Genfunktion hemmen:
- pcRexM2, pcRexM7, pcRexMB, pcRexM17 und pcRex13Δ15
(vgl. 5.1. und Beispiele 1-3);
- M6, M7 und M13 (vgl. 5.3. und Beispiele 12-13);
- die HIV-1-Rev-Mutanten, die in wirksamer Weise eine HIV-1-rev-Genfunktion hemmen: pM10, pΔ9/14 und pΔ10/14
(vgl. 5.2. und Beispiele 4-11);
- pM21, pM22, pM27, pM28, pM29 und pM32
(vgl. 5.2. und Beispiel 11a und 11b);
- die HTLV-I-Rex-Mutanten, die in wirksamer Weise eine HTLV-I-rex-Genfunktion und ferner eine HIV-1-rev-Genfunktion hemmen:
- pcRexM2, pcRexM7 und pcRexM8
(vgl. 5.1. und Beispiel 3);
- M6, M7 und M13 (vgl. 5.3. und Beispiele 12-13);
- die HTLV-I-Rex-Mutanten, die in wirksamer Weise eine HTLV-I- und HTLV-II-rex- und HIV-I-rev-Genfunktion hemmen:
- M6, M7 und M13 (vgl. 5.3. und Beispiele 12-13);
- die HIV-I-Rev-Mutanten, die in wirksamer Weise eine HIV-1-rev-Genfunktion und ferner eine HIV-2-rev- und SIVmac-rev-Genfunktion hemmen:
- pM10 (vgl. 5.2. und Beispiel 11b).

6. BEISPIELE

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Sie sollen die Erfindung in keinster Weise einschränken.
6.1.

Beispiel I:

Konstruktion eines transdominanten HTLV-I-rex-Gens

1. Klonierung der rex-Codiersequenz in die RF-DNA des Bakteriophagen M13
5 ug pcRex-DNA wurden mit 10 Einheiten eines jeden der Restriktionsenzyme HindIII und EcoRI in 20 ul Restriktionsenzyminkubationspuffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert: 7,5; 10 mM MgCl&sub2;; 50 mM NaCl: 1 mM Dithiothreit) bei 37ºC während 3 h behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde direkt auf ein 1%iges Agarosegel (Seakem FMC Inc., Rockland, ML USA), das 1 ug/ml Ethidiumbromid enthielt, aufgegeben und einer Elektrophorese bei 50 V, 25 mA während 4 h in Trisacetatpuffer (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982). Cold Spring Harbor Laboratory. New York. S. 156) unterzogen. Die abgetrennte DNA wurde auf einer 366 nm UV-Lampe sichtbar gemacht und eine geeignete Gelscheibe, die das 1,5 kb große res-Fragment enthielt, ausgeschnitten. Dieser Gelbereich wurde in einen Dialysebeutel gegeben, der 500 ul Trisboratpuffer enthielt (Maniatis. S. 156). Dic DNA wurde in den Puffer elektroeluiert und bei -20ºC mit Ethanol gefällt.
5 ug der Bakteriophagen M13mp10-RF-DNA wurden mit den Restriktionsenzymen HindIII und EcoRI behandelt und das 7,2 kb große Vektor-M13-Fragment aus einem 1% Agarosegel in derselben Weise isoliert.
200 ng Phagen-DNA und 1 ug cRex-DNA wurden in 20 ul Ligationspuffer (50 mM Tris- HCl, pH-Wert: 7,4; 10 mM MgCl&sub2;; 10 mM Dithiothreit; 1 mM ATP) mit einer Einheit T4-DNA-Ligase vermischt und 15 h bei 16ºC inkubiert. Dieses Reaktionsgemisch wurde direkt verwendet, um den E. coli-Stamm TG1 (Amersham-Protokoll, S. 16-18) zu transformieren und auszuplattieren.
Die DNA der geeigneten Phagenplaques wurden durch Endonucleasespaltung mit den Restriktionsenzymen HindIII und EcoRI, gefolgt von einer analytischen Gelelektrophorese durch 1% Agarosegel, das 10 ug/ml Ethidiumbromid in Trisacetatpuffer enthielt, überprüft. Ein die rex-Codiersequenz tragender Bakteriophage wurde identifiziert und als mp 10rex bezeichnet.
Einzelsträngige mp 10rex-DNA wurde unter Verwendung eines einen großen Maßstab aufweisenden Präparationsprotokolls (Amersham-Protokoll. S. 24-25) isoliert.

2. Mutagenese der rex-Codiersequenz in mp 10rex

Als Voraussetzung der Mutagenese war es notwendig, geeignete einzelsträngige DNA- Moleküle zu synthetisieren. 29 Oligonucleotide (vgl. Fig. 4) wurden hergestellt, die schließlich zu 30 Mutanten führten. von denen die folgenden sieben Oligonucleotide direkt oder (vgl. Beispiel 2) indirekt zu den Mutanten führten, von denen sich zeigte, dass sie bezüglich des transdominanten Phenotyps erfolgreich sind:
In dem Oligonucleotid (1) sind die Aminosäurereste Phenylalanin (Position 30). Phenylalanin (Position 31) und Serin (Position 32) in dem Rex-Protein durch die Aminosäuren Leucin (Position 30), Asparaginsäure (Position 31) und Leucin (Position 32) ersetzt.
In dem Oligonucleotid (2) sind die Aminosäurereste Alanin (Position 58) und Tyrosin (Position 59) in dem Rex-Protein durch die Aminosäuren Asparaginsäure (Position 58) und Leucin (Position 59) ersetzt.
In dem Oligonucleotid (3) sind die Aminosäurereste Prolin (Position 63) und Tyrosin (Position 64) in dem Rex-Protein durch die Aminosäuren Asparaginsäure (Position 63) und Leucin (Position 64) ersetzt.
In dem Oligonucleotid (4) sind die Aminosäurereste Tyrosin (Position 87), Serin (Position 88) und Serin (Position 89) in dem Rex-Protein durch die Amonosäuren Leucin (Position 87), Asparaginsäure (Position 88) und Leucin (Position 89) ersetzt).
In dem Oligonucleotid (5) sind die Aminosäurereste Leucin (Position 90) und Serin (Position 91) durch die Aminosäurereste Asparagin (Position 90) und Leucin (Position 91) ersetzt.
In dem Oligonucleotid (6) ist der Aminosäurerest Serin (Position 94) durch den Aminosäurerest Leucin ersetzt.
In dem Oligonucleotid (7) sind die Aminosäurereste Arginin (Position 100) und Glutaminsäure (Position 101) in dem Rex-Protein durch die Aminosäuren Asparaginsäure (Position 100) und Leucin (Position 101) ersetzt.
Alle Oligonucleotide führen BgIII-Restriktionsstellen im Rahmen der rex-Codiersequenz ein.
Die Oligonucleotide wurden auf einem festen Träger auf einem Applied Biosystems 380A- Synthesizer unter Verwendung einer β-Cyanoethylphosphoamiditchemie synthetisiert. Eine Reinigung erfolgte mittels 8% Polyacrylamidgelelektrophorese, gefolgt von einem Eluieren des Hauptprodukts und Ethanolpräzipitation. Eine Phosphorylierung der Oligonucleotide unter Verwendung von ATP und Polynucleotidkinase erfolgte gemäß Beschreibung in dem Amersham-Protokoll, S. 13. Die Oligonucleotidgesteuerte Mutagenesereaktion erfolgte gemäß Amersham-Protokoll, S. 13-16. Daran schloss sich eine Transformation und ein Ausplattieren des E. coli-Stamms TG1 gemäß Beschreibung auf den Seiten 16-18 an. Die DNA unterschiedlicher Plaques wurde durch Restriktionsendonucleaseanalyse unter Venwendung der Enzyme BgIII und EcoRI gescreent.
Aus allen sieben Mutationen wurde ein Klon identifiziert, der die eingeführte Mutation in der rex-Codiersequenz trug. Diese Klone wurden als mp10rexM2, mp10rexM7, mp10rexM8, mp10rexM13, mp10rexM14, mp10rexM16 und mprexM17 bezeichnet. Ein weiteres Klon mp10rexM15 wurde bei der Konstruktion der Deletionsmutante (vgl. Beispiel 2) verwendet.

3. Reklonieren der mutierten rex-Gene in Säugetierexpressionsplasmide

Die mutierten Rex-Gene wurden zurück aus den Bakteriophagen-M13-Vektoren in das ursprüngliche Expressionsplasmid bewegt. 5 ug pcRex-DNA wurden mit 10 Einheiten HindIII- und 10 Einheiten EcoRI-Restriktionsendonuclease bei 37ºC 3 h lang inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde direkt auf ein 1%iges Agarosegel, das 10 ug/ml Ethidiumbromid enthielt, aufgetragen und einer Elektrophorese in Trisacetatpuffer bei 50 V; 25 mA während 4 h unterzogen. Das HindIII-EcoRI- Vektorfragment wurde aus der geeigneten Gelscheibe heraus elektroeluiert und mit Ethanol gefällt.
5 ug der unter Punkt 2, erhaltenen Mutanten wurden in derselben Weise behandelt und die rex-Codiersequenz enthaltenden Fragmente isoliert.
200 ng des isolierten Vektorfragments und 1 ug der isolierten rex-Sequenzen wurden zusammen getrennt in 20 ul Ligationspuffer in Gegenwart von einer Einheit T4-DNA-Ligase vermischt und 15 h lang bei 16ºC inkubiert. Die erhaltenen Reaktionsgemische wurden direkt verwendet, um einen E. coli-Stamm HB101 zu transformieren. Die DNAs unterschiedlicher Bakterienkolonien wurden unter Verwendung der Restriktionsendonucleasen HindIII, Asp718 und BgIII, gefolgt von einer analytischen Gelelektrophorese durch ein 1%-iges Agarosegel analysiert. Die auf diese Weise als die rex-Gene tragend identifizierten Plasmide wurden als pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM13, pcRexM14, pcRexM15, pcRexM16 bzw. pcRexM 17 bezeichnet.

Beispiel 2:

Konstruktion einer Deletionsmutation in der rex-Codiersequenz

5 ug pcRexM13-DNA wurden mit 10 Einheiten eines jeden der Restriktionsenzyme BgIII und EcoRI behandelt. Das größere DNA-Fragment, das das Vektorgerüst und den 5'-Teil der rex- Codiersequenz enthält, wurde wie oben beschrieben isoliert. Parallel dazu wurden 5 ug pcRexM15-DNA in analoger Weise behandelt und das kleinere DNA-Fragment, das den 3'-Teil der rex-Codiersequenz enthielt, isoliert.
200 ng des isolierten pcRexM13-DNA-Fragments wurden mit 1 ug des isolierten pcRexM15-DNA-Fragments vermischt und in 20 ul Ligationspuffer in Gegenwart von 1 Einheit T4- DNA-Ligase 15 h lang bei 16ºC inkubiert. Diese Manipulation führte zu einer rex-Codiersequenz, wobei die Aminosäurepositionen 87, 88 und 89 mit denen in dem Klon pcRexM13 identisch sind, und die Position 90-94 deletiert sind.
Das Reaktionsgemisch wurde anschließend direkt verwendet, um den E. coli-Stamm HB101 zu transformieren. Die DNA unterschiedlicher Klone wurde durch Restriktionsendonecleaseverdauung unter Verwendung der Enzyme HindIII, Asp718 und BgIII gescreent. Ein positiver Klon wurde identifiziert und als pcRex13Δ15 bezeichnet.

Beispiel 3:

Biologische Aktivität

a) Biologische Aktivität der Mutanten-Gene in Säugetierzellen

0,25 ug des Rex-Wildtyps und eines jeden Mutanten-Rex-Gen-Expressionsvektors wurden mit 0,25 ug des genomischen tat (Transaktivator)-Expressionsvektors pgtat (M. H. Malim et al.. Nature ³&sup5;S (1988). 181) vermischt und in die bei B. R. Cullen, (Meth. Enzymol. 152 (1987). 684-703) beschriebene COS-Zelllinie transfiziert. 60 h nach der Transfektion wurden die Kulturen 3 h lang mit 300 uCi/ml ³&sup5;S-Custein markiert und bezüglich einer Expression des HIV-1-Tat- und HTLV-I-Rex-Proteins durch Immunopräzipitationsanalyse analysiert. Ein gegen die Aminosäurereste 1-61 von Tat gerichteter Kaninchen-Antipeptid-Antikörper und ein gegen die Aminosäurereste 173-189 von Rex gerichteter Kaninchen- Antipeptid-Antikörper wurden bei diesem Experiment gemäß Beschreibung bei B. R. Cullen. J. Virol. 62 (1988), 2498-201, verwendet. Gefällte Proteine wurden auf SDS/Polyacrylamidgelen getrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Die in den Vektoren pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM14, pcRexM17 und pcRex13Δ15 codierten Rex-Mutanten-Gene lieferten einen negativen Phenotyp für die rex-Wirkung bei diesem Assaysystem (vgl. Fig. 2B, Spuren D, E, F, H, I und K), während die Kontrollen (Spuren B und C) und andere Mutanten (Spur G) einen positiven Phenotyp lieferten.
Alle diese phenotypischen negativen Rex-Mutanten-Klone sind in der Lage, ein durch den oben beschriebenen polyklonalen Anti-Rex-Antikörper erkanntes Rex-spezifisches Protein zu produzieren (Fig. 2A, Spuren C bis E und G bis I). Im Gegensatz dazu führte die Mutation im Klon pcRexM16 zu einem Protein, das durch den rex-spezifischen Antikörper nicht nachweisbar war. Es wird vermutet, dass dies auf die verringerte Proteinhalbwertszeit (nicht dargestellt) zurückzuführen ist.
b) Transdominante Repression einer Wildtyp-HIV-1-rev- und/oder HTLV-I-rex-Funktion durch pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM13, pcRexM14, pcRexM17 und pcRex13Δ15
Derselbe experimentelle Aufbau wurde verwendet, um die Fähigkeit der Rex-Mutanten zur Hemmung der Funktion des Wildtyp-Rev- und -Rex-Proteins in trans-Weise zu untersuchen. 0,25 ug des genomischen tat-Expressionsvektors pgtat, 0,25 ug des Wildtyp-rev (pcRev)- oder des Wildtyp-rex (pcRex)-Expressionsplasmids und ein Überschuss eines jeden Rex-Mutanten-Expressionsplasmids (5 ug) wurden getrennt vermischt und in COS-Zellen transfektiert. Der Einfluss der Mutanten auf die Wildtyp- Rev- oder -Rex-Funktion wurde durch Tat-spezifische Immunopräzipitation gemäß den obigen Ausführungen gemessen.
Das Ergebnis dieses Experiments zeigt, dass die sechs rex-Mutanten pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM14, pcRexM17 und pcRex13Δ15 die Fähigkeit besitzen, die Wildtyp-rex-vermittelte Transaktivierung (vgl. Fig. 2C, Spuren C, D, E, G, H und I) zu hemmen und dass die vier rex-Mutanten pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8 und (teilweise) pcRexM13 die Fähigkeit besitzen, die Wildtyp-revvermittelte Transaktivierung (vgl. Fig. 2D, Spuren C, D, E und F) zu hemmen, während einige der Mutanten, nämlich in diesem Fall pcRexM2, pcRexM7 und pcRexM8 in der Lage sind, sowohl die Wildtyp- Rex- als auch die Wildtyp-rev-vermittelte Transaktivierung zu hemmen.
Diese Gruppe von Experimenten demonstriert auf Proteinniveau die transdominante Repression der Rev- und/oder Rex-Funktion durch die obigen rex-Mutanten.
Die Ergebnisse der Beispiel 1 bis 3 scheinen ferner die Existenz von zwei funktionellen Domänen in dem HTLV-I-Rex-Protein zu zeigen. In Richtung auf den Aminoterminus gibt es zwei Mutanten (pcRexM7, die Aminosäurepositionen 58, 59 und pcRexM8, die Aminosäurepositionen 63, 64), die über sowohl die Rev- als auch die Rex-Proteine transdominant sind. Ein zweiter Cluster, der lediglich über das Rex-Protein transdominante Mutanten enthält, befindet sich in der Mitte der Codiersequenz. Die weitere rev/rex-transdominante Mutante (pcRexM2, Aminosäurepositionen 30-32), die sich zwischen dem nuclearen Lokalisierungssignal und dem Cluster, der aus den Mutanten 7 und 8 besteht, befindet, könnte ein Teil einer dritten funktionellen Domäne sein oder alternativ könnte die eingeführte Aminosäureveränderung die Tertiärstruktur des Proteins stören, was zu dem beobachteten transdominanten Phenotyp führt.
6.2.

Beispiel 4:

Geclusterte Punkt- und Deletionsmutationen in Rev

Das Rev-Protein wird am Serin in vivo phosphoryliert und ist vorwiegend an dem Zellkern lokalisiert, wo es in den Nucleoli konzentriert ist. Die im folgenden beschriebene Mutationsanalyse befasst sich unter anderen Faktoren mit der Relevanz dieser Eigenschaften für die Funktion von Rev als Transaktivator einer HIV-1-Strukturgenexpression.
Geclusterte Punktmutationen (pM) wurden in den HXB-3-Stamm von HIV-1-Rev abermals durch Oligonucleotid-gesteuerte Mutagenese gemäß Beschreibung bei Taylor et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985), 876-8785, eingeführt. Speziell wurde ein Bakteriophagen-M13-Mutagenesesystem (Amersham Corp., Arlington Heights, IL, USA) verwendet, um zielgerichtete Nucleotidsubstitutionen in die vollständige Länge aufweisende cDNA-Kopien von rev, die durch den Expressionsvektor pcREV codiert sind (Malim et al., Nature 335 (1988), 181-183) einzuführen. Die DNA- und entsprechenden Aminosäuresequenzen von pcREV sind in Fig. 6 dargestellt.
Eine Reihe von geclusterten Punktmutationen wurde in Rev (vgl. M1-M14, Fig. 5) eingeführt, kloniert und ihre Sequenzen unter Verwendung eines Didesoxynucleotidsequenziersystems (Stratagene, La Jolla, CA, USA) bestätigt. Die Mutationen sind im allgemeinen gleichmäßig über Rev hinweg beabstandet und dienten dazu, um jeden der 11 Serinreste darin zielgerichtet anzusteuern. Die DNA- Sequenz bei und um jede Mutation herum (pM1-pM14) ist in Fig. 7 angegeben, wobei die veränderten Nucleotide unterstrichen sind.
Die meisten der angegebenen Mutationen führten zu Codons für Asparaginsäure (Asp) und Leucin (Leu), wobei die Reste in den "Kästchen" in Fig. 5 ersetzt wurden. Für eine einfache Bezugnahme wurden die Mutationen gemäß ihrem Ort innerhalb von Rev bezeichnet, beispielsweise steht pM1 für die am weitesten N-terminale Mutation und pM14 für die am weitesten C-terminale Mutation.
Obwohl die genaue Struktur der verschieden pM-Mutanten in Fig. 7 angegeben ist, beeinflusste die Mehrzahl der Mutationen lediglich zwei Codons. Ausnahmen dieser Generalisierung umfassten M2, M4, M23, M24 und M25, die drei Codons beeinflussten und M6, das fünf Codons beeinflusste. In den meisten Fällen entstanden die Aminosäuresubstitutionen aus einer Zwei-Aminosäuren-Missense- Mutation, jedoch in pM6 ersetzen Asp und Leu vier Argininreste, was zu einer zwei Aminosäuren umfassenden Deletion führte, während pM4 eine weitere benachbarte Einzelaminosäuresubstitution enthielt, die in der Mutter-REV nicht beobachtet wurde, was den Ersatz von Tyrosin durch Asparaginsäure in Position 23 einschließt. Diese weiteren Veränderungen ergaben sich aus einzelnen Basenfehlern in dem in dem Mutageneseprotokoll verwendeten einzelsträngigen DNA-Oligonucleotidprimer.
Die meisten Punktmutationen führten zur Bildung einzelner BgIII-Stellen, pM7 wurde durch die einfache Deletion der beiden benachbarten Serinreste (vgl. Fig. 5) konstruiert. Die BgIII-Stellen wurden alle in demselben Translationsrahmen insertiert, wodurch die nachfolgende Konstruktion der Nterminalen und C-terminalen Deletionsmutanten (pΔ) von Rev erleichtert wurde. Die pΔ-Mutanten werden nach dem Ort der Deletion bezeichnet, beispielsweise pΔ11/14 weist eine Deletion zwischen den eingeführten pM11- und pM14-Mutationen auf.

Beispiel 5:

Expression von Rev-Mutanten

Der Mutter-Cytomegalovirus-immediate-early-Promotor-Basis-Vektor pBC12/CMV (B. R. Cullen, Cell 46 (1986), 973-982) wurde als negative Kontrolle verwendet. Ferner wurden hier der genomische tat-Gen-Expressionsvektor pgTAT und der sezernierte alkalische Phosphatasegenexpressionsvektor pBC12/RSV/SEAP (Malim et al., aaO bzw. Berger et al., Gene 66 (1988), 1-10) verwendet.
Der Expressionsvektor pcREV wurde so modifiziert, dass die pM- und pΔ-rev-Mutanten gemäß der Beschreibung hier und im folgenden exprimiert wurden. Abermals wurde ein qualitativer Assay, der die Cotransfektion der modifizierten pcREV zusammen mit pgTAT in COS-Zellen umfasst, verwendet, um die Expression von HIV-1-rev und -tat in den Mutanten zu untersuchen (Malim et al., aaO, und Malim et al., Nature 338 (1989), 254-257). Speziell wurden COS-Zellkulturen (35 mm) durch DNA- vermittelte Transfektionen gemäß Beschreibung bei Cullen (Meth. Enzymol. 152 (1987), 684-703) unter Verwendung von 0,25 ug pgTAT und 0,25 ug des Wildtyp- oder eines modifizierten pcREV- Expressionsvektors mit DEAE-Dextran und Chlorochin cotransfiziert.
Sechzig Stunden nach der Transfektion wurden die Kulturen mit [³&sup5;S]Cystein und [³²P]- anorganischem Phosphat ([³²P]-Pi) parallel gemäß Beschreibung bei Malim et al., 1988, aaO, und Hauber et al., J. Virol. 62 (1988), 4801-04, markiert. Die Zellen wurden anschließend mit RIPA-Puffer lysiert und die relative Menge der rev- und tat-Expression in den Kulturen durch Immunopräzipitationsanalyse unter Verwendung von polyklonalen Kaninchen-Antipeptid-Antiseren (Malim et al. (1988), aa0, und Cullen et al., J. Virol. 62 (1988), 2498-2501) untersucht. Genauer gesagt, wurden Antiseren zu den Rev- Aminosäureresten 1-20 (REV1/20) für die Immunopräzipitation der Mutanten-Proteine, die durch pM5 und pM6 codiert sind, verwendet, während Antiseren zu den Rev-Aminosäureresten 27-51 (REV27/51) für die Immunopräzipitation aller restlichen Mutanten-Proteine verwendet wurden. Eine Immunopräzipitationsanalyse der tat-Expression erfolgte unter Verwendung von polyklonalen Kaninchen-Antipeptid- Antiseren zu den Tat-Aminosäureresten 1-61 (TAT1/61).
Die immunopräzipitierten Proteine wurden durch Elektrophorese auf 14%igen diskontinuierlichen SDS-Acrylamidgelen getrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Fig. 8 angegeben, wobei die relative Wanderung der bekannten Proteinmolekulargewichtsmarkern auf der rechten Seite der Figur angegeben ist.
Eine Immunopräzipitation der [³&sup5;S]-Cystein- und [³²P]-Pi-markierten Kulturen mit Anti-Rev- Antiseren ist in den Fig. 8A bzw. 8C angegeben. Eine Immunopräzipitation der [³&sup5;S]-Cysteinmarkierten Kulturen führte zu der Hauptzahl der Missense (pM)-Mutanten liefernden Banden einer Intensität und Mobilität, die mit der des Wildtyps vergleichbar ist (Fig. 8A, Spuren 1-14). Ausnahmen von dieser Generalisierung umfassen die Mutante pM6, die eine intensive Bande einer et< vas schnelleren Mobilität (Mr ~ 18 kD) lieferte und die Mutante pM1, die eine undeutliche Bande einer signifikant geringeren Mobilität lieferte.
Eine Immunopräzipitationsanalyse der tat-Expression unter Verwendung von Anti-Tat- Antiseren lieferte einen qualitativen Assay für die rev-Funktion unter Verwendung von pgTAT als Modellindikator. Wie oben angegeben exprimiert in Abwesenheit von rev pgTAT eine vollständig gesplicte Cycloplasma-tat-mRNA, die ausschließlich für die 86 Aminosäuren (aa) große zwei Exon umfassende Form des tat-Proteins codiert. In Gegenwart von rev induziert pgTAT jedoch die Cytoplasmaexpression einer nicht-gesplicten tat-mRNA, die für eine stumpfendige, ein Exon umfassende Form des 72 Aminosäuren langen Proteins codiert.
Wildtyp-rev wandert bei einer relativen Molekularmasse (Mr) von 19 Kilodaltons (kD) und wird leicht in Fig. 8 (Spur 0) nachgewiesen, während die 86 Aminosäuren große und die 72 Aminosäuren große Form von tat bei 15,5 kD bzw. 14 kD wandert. Mock-transfizierte Kulturen führen zu keinem spezifischen Signal unter diesen Testbedingungen (Malim et al., 1988, aaO), während eine Inspektion von Fig. 8B zeigt, dass vergleichbare Mengen des Gesamt-tat-Proteins sowohl bei den mit den Mutanten- Expressionsvektoren transfizierten Kulturen als auch bei den mit der Indikatorkonstruktion pgTat cotransformierten Kulturen synthetisiert wurden. Dies lässt vermuten, dass keines der Mutanten-Rev-Proteine für die transfizierten Zellen toxisch war.
Diese Analyse zeigt ferner, dass 5 der Missensemutanten und 2 der Deletionsmutanten von Rev inaktiv waren (Spuren 4-7, 10, 16 und 20), während alle anderen Rev-Mutanten scheinbar vollständig in der Lage waren, eine 72 Aminosäuren große Tat-Expression zu induzieren. Vier der inaktiven Missensemutationen sind zwischen den Aminosäureresten 23 und 56 (M4 bis M7) verclustert, während die fünfte inaktive Mutante (pM10) durch zwei vollständig funktionelle Mutanten getrennt ist und die Reste 78 und 79 beeinflusst. Eine Deletion entweder der 4 Reste nahe des N-Terminus (pΔ1/2) oder der 21 Reste nahe des C-Terminus von Rev (pΔ11/14) hatte eine geringe oder keine Wirkung auf die rev-Funktion. Im Gegenteil führte eine Deletion von weiteren Sequenzen zwischen den Resten 9 und 17 (pΔ1/3) zu einem Verlust der rev-Funktion.

Beispiel 6:

Transaktivierungskapazität von rev-Mutanten

Um die Transaktivierungsfähigkeit der rev-Mutanten eingehender zu bewerten, wurde ihre Fähigkeit, eine replikationsdefekte rev-Mutante von HIV-1 in trans-Weise zu retten, getestet. Für die Zwecke dieser Analyse wurde der rev-HIV-1-Provirus des Vektors pHIV-1Δrev (mit der Bezeichnung pHXB2Bam-p3 von Feinberg et al., Cell 46 (1986), 807-17) verwendet, das eine Rahmenshiftmutation in dem zweiten Codierexon von rev an der Aminosäure 59 enthält, die das Provirus replikationsunfähig macht, d. h. unfähig, um ein funktionelles Rev-Protein zu produzieren, wenn es in Abwesenheit einer Cotransfektion mit einem Vektor mit der Fähigkeit zur Expression von HIV-1-rev in trans-Weise (Rinisky et al., Nature 335 (1989), 73840) in COS-Zellen transfiziert wird. Die Fähigkeit der Mutanten, das rev-Provirus zu retten, wurde gemäß Beschreibung in Fig. 9 analysiert, wobei die Virusreplikation durch quantitativen Assay der Menge des HIV-1-p24-Gag-Proteins (pg/ml), das in den Kulturüberstand freigesetzt wurde, unter Verwendung eines ELISA-Testsystems für eine lösliche p24-Gag-Expresion (DuPont-NEN Inc., Billerica, MA, USA) gemessen wurde, wobei die Standards vom Hersteller bezogen wurden.
Für die Zwecke eines Vergleichs wurde die Transfektionseffizienz der Kulturen mit dem nicht auf Rev reagierenden Vektor pBC 12/RSV/SEAP (12,5 ng/Kultur), einem sezernierten Alkaliphosphatase (SEAP)-Genexpresionsvektor überwacht. Bequemerweise wurden die SEAP-Mengen parallel mit den Mengen von p24-Gag im Überstand gemessen. Darüber hinaus wurden einige Kulturen ferner mit 125 ng entweder des negativen Vergleichsvektors pBC12/CMV (NEG) oder dem Wildtyp-rev- Genexpressionsvektor (pcREV) cotransfiziert.
COS-Zellkulturen (35 mm) wurden mit 250 ng pHIV-1Δrev und 125 ng eines Kontrollvektors oder einem der modifizierten Mutanten enthaltenen Vektoren cotransfiziert. Proben der überstehenden Medien wurden 65 Stunden nach der Transfektion genommen und bezüglich der p24-Gag- Proteinexpressionsmengen untersucht. SEAP-Mengen wurden parallel gemessen. Die erhaltenen Werte sind in Fig. 9 angegeben, wobei eine Korrektur bezüglich der geringen Variabilität, die bei den Überstand-SEAP-Mengen beobachtet wurde, erfolgte (wobei die mittlere SEAP-Aktivität auf 1,00 Einheiten eingestellt wurde, die beobachtete Standardabweichung ± 0,14 betrug und der Bereich zwischen 1,30 und 0,73 lag).
Eine kleine Variation der Menge der SEAP-Aktivität im Überstand wurde bei diesem Experiment beobachtet. Dies zeigt eine äquivalente Transfektionseffizienz und bestätigt das Fehlen einer durch Mutanten induzierten Zelltoxizität. Die Transfektion von pHIV-1Δrev alleine führte zu keinem nachweisbaren p24-Gag-Protein in dem Kulturüberstand (Spur NEG), während eine Cotransfektion mit einem Wildtyp-rev-Genexprossionsvektor in wirksamer Weise die Fähigkeit von pHIV-1ΔRef komplementierte, um die Sezernierung von p24-Gag zu induzieren (Spur pcREV).
Darüber hinaus erreichten alle Rev-Mutanten, die in dem in Fig. 8B sichtbar gemachten Test auf pgTAT-Basis positiv getestet wurden, ein Aktivitätsniveau zwischen 50 und 100% von dem für die Wildtyp-rev-Konstruktion beobachteten Wert bei dem Rettungstest mit Ausnahme von M1, die eine 30% Aktivität erreichte. Dies spiegelt möglicherweise die verringerte in-vivo-Stabilität von M1-Mutante wider. Alle Mutanten, die in Fig. 8B als negativ bewertet wurden, waren in dem Rettungstest vollständig negativ (d. h. 10 pg/ml p24-Gag), mit Ausnahme von M7, die ein kaum nachweisbares Niveau von p24- Gag-Protein im Überstand lieferte.

Beispiel 7:

Für eine biologische Aktivität nicht erforderliche Rev-Phosphorylierung

Das HIV-1-Rev-Protein wird an einem oder mehreren Serinresten bei Expression in vivo phosporyliert. Die in Fig. 5 angegebene Mutationen beeinflussen jeden der 11 Serinreste innerhalb der rev-Codiersequenz. So wurden die immunopräzipitierten [³²P]-Pi-markierten Rev-Proteine, die vorübergehend in transfizierten COS-Zellkulturen exprimiert wurden, beobachtet, um die in vivo- Phosphorylkierungsstellen von HIV-1-rev zu identifizieren (Fig. 8C). Ein Vergleich der Menge des [³²P]- Pi-Einbaus in rev mit der Menge des [³&sup5;S]-Cysteineinbaus in einer parallel transfizierten Kultur (Fig. 8A) wurde verwendet, um den Effekt individueller Mutationen auf die Menge des Phosphateinbaus zu bestimmen. Die Ergebnisse dieses Vergleichs sind in Tabelle 1 angegeben. TABELLE 1 Phenotypische Analyse der HIV-1-rev-Genmutanten
a ++: 50-100% Wildtyp (wt); +: 5-50% wt; -: < 5% wt;
B ++: Vergleichbar mit wt; +: 30-60% wt; ±: 5-20% wt;
-: keine nachweisbare Phosphorylierung;
nd: nicht durchgeführt;
c ?: Nicht nachgewiesen durch Immunofluoreszenz;
nd: nicht durchgeführt;
d ++: In hoher Weise transdominant; +: moderat transdominant;
-: nicht nachweisbar transdominant.
Die in Tabelle 1 zusammengefasste Analyse identifizierte vier Missensemutationen, die zu einer verminderten Phosphorylierung führten. Von diesen besaßen M2 und M12 eine moderate Wirkung auf den Phosphateinbau (-30% bzw. -60% Hemmung), während M5 und M6 drastisch das Niveau des Phosphateinbaus verminderten. Die möglichen Gründe für diese dramatische Wirkung der M5- und M6- Mutationen (die keinerlei Serinreste beeinflussen) auf die Phosphorylierung von rev werden detaillierter im folgenden diskutiert.
Um die Phosphatrezeptorserinreste bei Rev weiter zu lokalisieren, wurde eine Untersuchung des Niveaus der Phosphorylierung der Deletionsmutanten (pΔ) (Fig. 8C, Spuren 15-20) durchgeführt. Diese Analyse zeigte, dass die pΔ13/14-Mutation normalerweise phosphoryliert war, während die pΔ12/14-Deletion und die größeren C-terminalen Deletionen lediglich ein geringes Phosphorylierungsniveau zeigten (-90% Hemmung). In ähnlicher Weise zeigte auch die pΔ1/2-Rev-Mutante, die in wirksamer Weise mit [³&sup5;S]-Cystein markiert war, ein geringes Niveau eines [³&sup5;P]-Pi-Einbaus (-90%ige Hemmung).
Es ist unklar, warum die Deletionen, die sich auf die Stelle der M2- und M12-Mutationen erstrecken, eine drastischere Wirkung auf das Niveau der Phosphorylierung aufwiesen als die Missensemutationen selbst. Diese Ergebnisse stehen jedoch im Einklang mit der Hypothese, dass das Rev-Protein zwei primäre Stellen der Serinphosphorylierung enthält, eine, die am Rest 8 (M2) lokalisiert ist und die zweite, die am Rest 99 (M12) lokalisiert ist. In jedem Fall zeigen die Mutanten, denen diese Reste fehlen (d. h. pM2, pΔ1/2, pM12, pΔ12, pΔ12/14) in etwa Wildtypniveaus der Rev-Aktivität (Fig. 8B, Fig. 9). Letztendlich läßt sich daraus schließen, dass eine Phosphorylierung von Rev für die Transaktivierungsfunktion des HIV-1-Regulatorproteins in transfizierten Zellen nicht essenziell ist.

Beispiel 8:

Nucleare Lokalisierung von Rev

Das das Rev-Protein vorwiegend in den Kernen, insbesondere den Nucleoli exprimierender Zellen lokalisiert ist, wurde durch Analyse der Mutanten unter Verwendung einer indirekten Immunofluoreszenz bestätigt. Die erhaltenen Phasenkontrast- und ensprechende Immunofluoreszenzphotographien fixierter transfizierter COS-Zellkulturen sind in Fig. 10 dargestellt.
Die Technik einer indirekten Immunofluoreszenz, die zum Lokalisieren des Rev-Proteins in der transfizierten COS-Zelle verwendet wurde, war diejenige, die bei B. R. Cullen, Meth. Enzymol. 152 (1987), 684 und bei B. R. Cullen, J. Virol. 62 (1988), 2498, beschrieben wurde, mit der Ausnahme, dass ein modifiziertes Zellfixierungsvorgehen auf Paraformaldehydbasis verwendet wurde (Ruben et al., J. Virol. 53 (1989), 1-8). Im einzelnen wurden die Zellen mit polyklonalem Kaninchen-Anti-Rev-Peptid- Antiserum und anschließend mit Rhodamin-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-IgG behandelt.
Der primäre Kaninchen-Anti-Rev-Antikörper wurde in einer 1 : 800 Verdünnung verwendet. Ein REV 1/20-Antikörper wurde zur Analyse der Mehrzahl der Rev-Mutanten verwendet, mit Ausnahme der Kulturen, die mit den pM1-, pM2, pM3-, pΔ1/2- und pΔ1/3-Vektoren transfiziert waren. REV27/51- Antikörper wurde für diese verwendet. Der zweite Antikörper, der Rhodamin-konjugierte Ziegen-anti- Kaninchen-IgG (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) wurde in einer Verdünnung von 1 : 50 verwendet.
Die Rev-Mutanten zeigten vier Kategorien von subzellulärer Lokalisierung gemäß Angaben in der Figur. Die Kategorien waren:
N: nuclear/nucleolar bei keiner nachweisbaren Cytoplasmaexpression;
N > C: geringe Cytoplasmaexpression;
N ≥ C klare Cytoplasmaexpression bei einiger nuclearer Konzentration;
C > N: willkürliche Verteilung in der Zelle.
Representative Beispiele dieser Verteilungen sind in der Figur angegeben, wobei die veranschaulichten Rev-Proteine in der oberen rechten Ecke der unteren Gruppe der Bilder angegeben sind. Die Lokalisierung einer jeden durch diesen Test nachgewiesenen Rev-Mutante ist in Tabelle 1 angegeben. Wie dargestellt, zeigte der Großteil der Mutanten eine vollständige Wildtyp-subzellulare Lokalisierung (N) einschließlich des Transaktivierungsnegativen Klons pM10 (Fig. 10D). Einige Mutanten lieferten jedoch eine sehr geringe, jedoch nachweisbare Menge an Cytoplasmafluoreszenz, wie dies für pM4 typisch ist (Fig. 10F). Dieser Phenotyp korrelierte nicht deutlich mit der biologischen Aktivität wie sowohl aktive Mutanten (pM3, pM8) als auch inaktive Mutanten (pM4, pM7) diese Eigenschaft zeigten. Darüber hinaus zeigte eine ziemlich umfangreiche Deletionsmutante pΔ1/3 ein subzellulares Lokalisierungszwischenprodukt zwischen dem Wildtyp-Muster und dem durch Mutationen in der basischen Domäne von Rev induzierten Muster (N ≥ C, Fig. 10H). Diese Deletion ist jedoch nicht nahe der basischen Domäne lokalisiert. Obwohl der Grund für dies abweichende Lokalisierung unklar ist, korreliert sie mit dem Fehlen einer biologischen Aktivität, wie sie für pΔ1/3 beobachtet wird.
Eine Mutation der Arginin-reichen Domäne von Rev (pM5, pM6), die eine Homologie zu bekannten nuclearen Lokalisierungssignalen zeigt, führte zu einer großen Menge an Cytoplasma-Rev- Protein (C > N). Diese Proteine waren jedoch nicht aus dem Zellkern ausgeschlossen (Fig. 103). Dies läßt vermuten, dass die basische Domäne von Rev in der Tat ein nucleares Lokalisierungssignal ist.
Es ist von Interesse, dass pM5 und pM6 in vivo nicht signifikant phosphoryliert waren, obwohl sie die oben als Akzeptoren für eine Phosphorylierung vorgeschlagenen Stellen beibehielten. Dies kann darauf zurückzuführen sein, dass die für die Phosphorylierung von Rev verantwortliche Kinase auf den Zellkern beschränkt ist. Somit scheint es möglich, dass eine ungeeignete subzellulare Lokalisierung der pM5- und pM6-Rev-Mutanten für ihren geringen Phosphorylierungsgrad verantwortlich ist.

Beispiel 9:

Transdominante Repression einer Rev-Funktion

Rev-Mutanten, die die Fähigkeit zur Transaktivierung einer HIV-1-Strukturgenexpression verloren hatten, wurden bezüglich ihrer Fähigkeit untersucht, in trans die Funktion des Wildtyp-Rev- Proteins zu hemmen.
COS-Zellen (35 mm) wurden mit 250 ng der Indikatorkonstruktion pgTAT und: 290 ng pBC12/CMV (negative Kontrolle) (Fig. 11A, Spur 1); 40 ng pcREV (niedrige Menge), 250 nm pBC 12/CMV (Spur 2); 290 ng pcREV (große Menge) (Spur 3); 40 ng pcREV, 250 ng pM4 (Spur 4); 40 ng pcREV, 250 ng pM7 (Spur 5); 40 ng pcREV, 250 ng pM10 (Spur 6) cotransifiziert. 60 Stunden nach der Transfektion wurden die Kulturen mit [³&sup5;S]-Cystein markiert und einer Immunopräzipitationsanalyse unter Verwendung von Kaninchen-Anti-Tat-Antiseren unterzogen.
Wie in Fig. 11A gezeigt, besaßen pM4 (Spur 4) und pM7 (Spur 5) eine geringe Wirkung auf die Aktivität des Wildtyp-Rev-Proteins, gemessen durch die Induktion der Expression des 72 Aminosäure großen Tat-Proteins, während pM10 (Spur 6) die Rev-Funktion vollständig zu hemmen schien. Dies läßt vermuten, dass pM10 für einen spezifischen Inhibitor einer HIV-1-rev-Genfunktion codiert.
Um zu demonstrieren, dass pM10 in der Tat dahingehend wirkt, dass er die Cytoplasmaexpression der nicht-gesplicten HIV-1-mRNA, die für die 72 Aminosäuren große Form von tat codiert, spezifisch verhindert, wurde ein S1-Nucleaseschutzassay gemäß Malim et al., (1988), aaO, verwendet. Dieser Test (Fig. 11B) quantifiziert die Menge der gesplicten (S)- und nicht-gesplicten (U)-tat-mRNA, die im Cytoplasma von COS-Zellen (100 mm) exprimiert wird, die mit: 2,75 ug pBC12/CMV + 2,5 ug pcREV (Spur 1); 2,5 uy pgTAT + 2,75 ug pBC12/CMV (Spur 2); 2,5 ug pgTAT + 0,25 ug pcREV + 2,5 ug pBC12/CMV (Spur); 2,5 ug pgTAT + 2,75 ug pcREV (Spur 4); 2,5 ug pgTAT + 0,25 ug pcREV + 2,5 ug pM10 (Spur 5); 2,5 ug pgTAT + 0,25 ug pcREV + 2,5 ug pΔ10/14 (Spur 6) transfiziert wurden. Wie dargestellt, wird die gesamte Input-DNA bei insgesamt 5,25 ug durch Einschluss des Mutterexpressionsvektors pBC12/CMV als negative Kontrolle gehalten.
60 Stunden nach der Transfektioin wurde die Cytoplasma-RNA für eine Analyse geerntet und 5 ug Aliquote in dem S1-Nucleaseprotektionstest verwendet. Die hierbei verwendete DNA-Sonde war eine 798 Basenpaare große Sonde, die an einer XhoII-Stelle, die in dem ersten Codierexon von tat lokalisiert ist, unter Verwendung von Klenow-DNA-Polymerase (Malim et al. (1988), aaO) endmarkiert ist. Die Sonde (I) war so ausgestaltet, dass sie die Menge sowohl der nicht-gesplicten (U)- als auch der gesplicten (S)-Cytoplasma-tat-mRNA in der transfizierten COS-Kultur quantifizieren konnte. Unter Verwendung dieser Sonde wird vorausgesagt, dass gesplicte (S)-tat-mRNA ein 202-nt-Sondenfragment rettet, während nicht-gesplicte (U)-tat-mRNA gemäß Voraussage ein 506-nt-Fragment rettet. Die relative Menge an nichtgesplicter RNA in jeder Spur wurde durch Densitometrie unter Verwendung eines LKB- Softlaser-Scanners quantifiziert. Die Ergebnisse, wie sie in Fig. 11B sichtbar gemacht sind, sind die folgenden:
Spur 2: 14% nicht-gesplict; Spur 3: 63% nicht-gesplict; Spur 4: 82% nicht-gesplict; Spur 5: 22% nicht-gesplict; Spur 6: 24% nicht-gesplict.
Wie erwartet, überwiegt gesplicte tat-mRNA im Cytoplasma von mit pgTAT alleine transfizierten Zellen (Fig. 11B, Spur 2) während nicht-gesplicte tat-mRNA die dominante Cytoplasmaspezies im Cytoplasma von Zellen ist, die das HIV-1-Rev-Protein coexprimieren (Fig. 11B, Spuren 3 und 4). Eine Coexpression von pgTAT mit sowohl peREV als auch pM10 stellte jedoch das Überwiegen der gesplicten Form der tat-mRNA im Cytoplasma wieder her (Fig. 11B, Spur 5).
Obwohl die Gesamtmenge der in den Spuren 5 und 6 geladenen RNA etwas niedrig zu sein scheint, ist es nichtsdestotrotz offensichtlich, dass pM10(Spur 5) in der Lage war, die Rev-induzierte cytoplasmatische Expression der nicht-gesplicten tat-mRNA aus dem pgTAT-Vektor selektiv zu inhibieren. In der Tat ist die relative Menge der nicht-gesplicten tat-mRNA, die in Gegenwart von sowohl von pcREV als auch pM10 nachgewiesen wird, vergleichbar mit der in Abwesenheit von Rev beobachteten Menge.
Dasselbe Muster ist bei pΔ10/14 (Fig. 11B, Spur 6) offensichtlich. Diese Ergebnisse zeigen darüber hinaus, dass eine rev-Gendeletion, die sich 3' der M10-Mutation erstreckt (pΔ10/14) auch für einen Transrepressor einer Rev-Funktion codiert. Eine umfangreichere Deletion, die sich über die Stelle der M10-Mutazion erstreckt, mit der Bezeichnung pΔ9/14 zeigte auch einen dominanten negativen Phenotyp (Tabelle 1). Jedoch war eine Deletion, die sich zu der Stelle der M8-Mutation erstreckt, nicht länger transdominant (Daten nicht angegeben).

Beispiel 10:

pM10-Rev-Mutante ist ein kompetitiver Inhibitor der rev-Funktion

Die experimentellen Ergebnisse, die in Fig. 11A und 11B angegeben sind, zeigen, dass pM10 eine Wildtyp-Rev-Funktion bei Anwesenheit in trans-Anordnung reprimieren kann. Diese Experimente wurden jedoch in Gegenwart eines großen Überschusses pM10 durchgeführt. Um die Wirksamkeit der trans-Hemmung der Rev-Funktion genauer quantifizieren zu können, wurde die Fähigkeit zunehmender Mengen von pM10 zur Hemmung der Rettung einer pHIV- 1Δrev-Provirusmutante durch eine einzelne Menge pcREV analysiert. Dieses Experiment testete auch die Wirkung zunehmender Mengen der pM4- und pΔ10/14-Rev-Mutanten sowie die Wirkung einer einfachen Erhöhung der Menge der Expression von Wildtyp-Rev selbst.
COS-Zellkulturen (35 mM) wurden mit 25 ng pHIV-1Δrev und 50 ng pcREV bei einem zunehmenden x-fachen molaren Überschuss von entweder pcREV ( ), pM4 (Δ), pΔ10/14 (o) oder pM10 ( ) gemäß Angaben in Fig. 12 (d. h. 10-fach bedeutet eine Cotransfektion von 500 ng der angegebenen Plasmidkonstruktion) cotransfiziert. Die gesamte Input-DNA wurde bei insgesamt 587,5 ng durch Einschluss des Mutterexpressioinsvektors pBC12/CMV als negative Kontrolle gehalten. Ein SEAP-Genexpressionsvektor wurde als interne Kontrolle (12,5 ng/Kultur) cotransfiziert. Aus den Überstandmedien wurden nach 65 h Proben entnommen und diese durch Messung der Menge der Überstand-p24-Gag- Expression getestet.
Die Ergebnisse dieses Tests sind in Fig. 12 relativ zu der Menge der in Abwesenheit jeglichen konkurrierenden rev-Vektors erhaltenen p24-Expression (die Menge ist als 1,00 definiert) angegeben. Alle Werte sind relativ zu dem p24-Gag-Expressionsniveau, das in der mit 25 ng pHIV-1Δrev, 50 ng pcREV, 12,5 ng pBC12/RSV/SEAP und 500 ng pBC12/CMV transfizierten Kultur beobachtet wird, ausgedrückt. Dieser Kontrollkultur ( ), die den Basiswert bildet, gegen den die kompetitiven Effekte der zugegebenen Rev-Mutanten gemessen wurden, wurde willkürlich ein Niveau von 1,00 Einheiten einer p24-Gag-Expression zugeordnet. Die hier angegebenen Werte sind bezüglich der geringen Variabilität, die in den Überstand-SEAP-Mengen beobachtet wurde, korrigiert (die mittlere SEAP-Aktivitat betrug 1,00 ± 0,27 im Bereich von 1,28 bis 0,72).
Wie angegeben, wurde festgestellt, dass eine Erhöhung des Niveaus der Transfektion des Wildtyp-rev-Expressionsvektors pcREV eine schwach positive Wirkung auf die virale Replikation ausübt, was maximal zu einer -70%igen Erhöhung der Freisetzung von p24-Gag in die Medien führt. Im Gegensatz dazu besaß eine Cotransfektion des pM10-Vektors eine dramatische Hemmwirkung auf die HIV-1-Strukturgenexpression. Das erhaltene Hemmmuster ist das für einen kompetitiven Inhibitor der Rev-Funktion, der die gleiche Affinität wie Wildtyp-Rev für sein biologisches Ziel zeigt, erwartete. Somit verringerte eine äquimolare Menge pM10 die p24-Gag-Expression um das -2-fache, ein zweifacher Überschuss von pM10 verringerte die Expression um das -3-fache, ein fünffacher Überschuss um das -6-fache, während ein 10-facher Überschuss die p24-Gag-Expression um -93% verringerte.
Neben pM10 verringerte auch eine Cotransfektioin von pΔ10/14 eine p24-Gag-Expression, diese große Deletionsmutante von Rev war jedoch kein so wirksamer Inhibitor wie pM10. Es scheint wahrscheinlich, dass das streng stumpfendig gemachte Protein, das durch pΔ10/14 exprimiert wird, ein weniger wirksamer Kompetitor ist, da ihm Sequenzen fehlen, die die Bindung von Rev an sein biologisches Ziel erhöhen.
Schließlich besaß eine Cotransfektion von pM4 auch eine Hemmwirkung, obwohl sie bei der maximal verwendeten Dosis etwas weniger als das 2-fache (32%) war. Diese Wirkung entsteht vermutlich aus einer Aktivität (Squelching), die nicht in Verbindung mit einer RRE-Bindung steht.

Beispiel 11:

Domänestruktur des HIV-1-Rev-Transaktivators

Wie oben ausgeführt, wurde eine vorübergehende Genexpressionsanalyse in transfizierten Zellen verwendet, um die biologische Aktivität einer Reihe von Missense- und Deletionsmutanten des HIV-1-trans-agierenden Genprodukts Rev zu bestimmen. Diese Ergebnisse veranschaulichen die mögliche Existenz von zwei funktionellen Domänen innerhalb von Rev, wie sie schematisch in Fig. 12A angegeben sind, wobei S eine Splicestelle darstellt. Darüber hinaus könnten diese beiden Domänen für eine Transaktivierung (kreuzschraffiert) essenziell sein.
Die erste dieser Domänen (die RNA-Bindungsdomäne), die durch die vier Missensemutanten pM4, pM5, pM6 und pM7 definiert sind, erstreckt sich über etwa einen 35 Aminosäuren langen Bereich zwischen etwa der Aminosäureposition 10 und etwa der Aminosäureposition 68 von Wildtyp-Rev und enthält ein hoch basisches Sequenzelement, das für die nucleare Lokalisierung von Rev essenziell ist. Sie enthält ferner ein nucleares Lokalisierungs(NL)-Signal (schraffiert). Die in dieser Domäne veränderten Mutanten zeigen einen rezessiven negativen Phenotyp.
Im Gegensatz dazu führen die Mutationen in der zweiten Domäne (die Aktivierungsdomäne), die etwa auf dem Aminosäurerest 79 zentriert ist, und u. a. durch die Missensemutante pM10 und die Deletionsmutanten pΔ9/14 und pΔ10/14 definiert ist, auch zu einem Verlust einer Rev-Funktion, der durch diese Mutanten dargestellte negative Phenotyp ist jedoch bemerkenswerter Weise transdominant. Zwei Regionen von Rev (schraffiert in Fig. 12A) scheinen für die Proteinfunktion unnötig zu sein. Wie hier gezeigt, machen Mutationen in der Rev-Aktivierungsdomäne Rev-defekt und führen zur Bildung von Proteinen, die kompetitiv die Wildtyp-Rev-Funktion hemmen. Diese trans-Repression reicht aus, um die Replikation von HIV-1 in transfizierten Zellen merklich zu verringern oder zu unterdrücken. Die molekulare Basis für die dominanten negativen Phenotypen, die durch pM10 und die verwandten Deletionsmutanten gezeigt wird, ist noch nicht bekannt. Die Beobachtung, dass sowohl Missense (M10)- als auch Deletions (Δ9/14, Δ10/14)-Mutanten in der Lage sind, eine Rev-Funktion in trans zu hemmen, lässt jedoch vermuten, dass der Verlust eher als das Erwerben eines Attributs verantwortlich ist. Eine Möglichkeit ist, dass die defekten Rev-Proteinmoleküle in der Lage sein können, gemischte Multimere mit Wildtyp-Rev-Proteinuntereinheiten zu bilden und somit die Funktion des Wildtyp-Proteins in einer transdominanten Weise zu hemmen. Es ist jedoch gegenwärtig nicht bekannt, ob Rev in vivo als Monomer oder als Multimer fungiert. Eine alternative Hypothese auf der Basis einer früheren Arbeit, die die funktionelle Zerschneidung einer Reihe von prokaryotischen und eukaryotischen Transkriptionsfaktoren umfasste, ist dass Transkriptionstransaktivatoren zwei ausgeprägte funktionelle Domänen tragen, eine spezifische "Bindungsdomäne", die das Protein zu seinem geeigneten Zielsubstrat führt und eine "Aktivierungsdomäne", die gewährleistet, dass die funktionale Folge des Bindungsvorgangs, in diesem Fall eine Transkriptionsaktivierung, gezeigt wird. In einigen Systemen hat sich gezeigt, dass die Bindungsdomäne aus einem sequenzspezifischen DNA-Bindungselement besteht. In mindestens einem Fall (dem des Herpes simplex-Virus Typ 1 (HSV-1)-Transaktivators VP16) scheint es jedoch, dass die Bindungsdomäne stattdessen eine spezifische Wechselwirkung mit dem zellulären Transkriptionsfaktor vermittelt, der seinerseits an Zielsequenzen in dem HSV-1-Genom bindet. Es ist wichtig, dass eine Mutation der Bindungsdomäne dazu neigt, zu einem negativen Phenotyp zu führen, der bei moderaten Expressionsmengen rezessiv ist. Im Gegensatz dazu kann eine Mutation oder Deletion der aktivierenden Domäne eines Transkriptionsfaktors zu Mutanten mit einem dominanten negativen Phenotyp führen. Diese Mutanten, die eine intakte Bindungsdomäne beibehalten, konkurrieren vermutlich mit dem Wildtyp-Transaktivator um die Bindung an das geeignete zelluläre Ziel, sind jedoch noch nicht in der Lage, eine Transkription zu aktivieren, sobald eine Bindung erfolgt ist. Im Falle des HSV-1-VP16-Proteins hat sich gezeigt, dass eine Überexpression einer derartigen transdominanten Mutante in wirksamer Weise die Wildtyp-VP16- Funktion hemmt und somit eine Replikation von HSV-1 in normalen permissiven Zellen ausschließt.
Obwohl das rev-Genprodukt ein posttranskriptioneller trans-Regulator der Genexpression ist, scheint es vernünftig, dass das Konzept von zwei getrennten funktionellen Domänen in diesem Fall anwendbar sein sollte. Insbesondere fungiert Rev in einer in hohem Maße sequenzspezifischen Weise über eine direkte Wechselwirkung (M. H. Malim et al., Cell 60 (1990), 675-683) mit seiner RNA- Targetsequenz, der RRE und muss folglich Sequenzen enthalten, die zu dieser Spezifität beitragen. Sobald ein Binden erfolgt ist, muss dieser Vorgang in einen Aktivierungsvorgang translatiert werden, in diesem Fall einen nuclearen Export der unvollständig gesplicten RNAs, die für die HIV-1- Strukturproteine codieren. Mutationen in dieser letzteren Domäne können somit zu kompetitiven Inhibitoren der Wildrtyp-Rev-Funktion führen. Dies ist der für die pM10 und pΔ10/14-Mutanten von Rev beobachtete Phenotyp. Diese Mutanten können auf die Existenz einer diskreten Aktivierungsdomäne hindeuten. Umgekehrt kann die zweite, die mehr N-terminale essenzielle Region des Rev-Proteins, die durch diese Mutationsanalyse definiert ist, derselben Funktion dienen wie die "Bindungsdomäne", die in einigen Transkriptionsfaktoren definiert sind. In dieser Domäne veränderte Mutanten (z. B. pM4, pM7) zeigen in der Tat einen im allgemeinen rezessiven negativen Phenotyp, obwohl eine geringe, jedoch signifikante Hemmung bei hohen Expressionsniveaus beobachtet wird. Weitere transdominanten Mutanten wurden auch festgestellt (vgl. Fig. 5A und Beispiele 11a und 11b), die erlauben, dass die Lokalisierung der Rev- Aktivierungsdomäne dahingehend präzisiert wird, dass sie sich von etwa der Aminosäureposition 68 bis etwa zur Aminosäureposition 90, insbesondere von etwa der Position 78 bis etwa zur Position 86 und im speziellen von etwa der Position 78 bis etwa zur Position 83 oder 84 vom Wildtyp-Rev erstreckt.

Beispiel 11a:

Weitere transdominante HIV-1-Rev-Mutanten

Weitere HIV-1-rev-Mutanten wurden analog zu den oben unter 6.2. beschriebenen Vorgehensweisen hergestellt. Sie wurden wie in Fig. 5A unter Tabelle 2 ersichtlich ist, bezeichnet und charakterisiert. Der In-vivo-Phenotyp wurde gemäß M. H. Malim et al.. Cell 58 (1989). 205-214, bestimmt (alle Tests wurden intern bezüglich Transfektionseffizienzen gesteuert).
Neben den gemäß Beschreibung in den obigen Beispielen 4 bis 11 gefundenen, wurde festgestellt, dass die folgenden weiteren Mutanten transdominant die Wildtyp-HIV-1-Rev-Funktion hemmen: pM21, pM22, pM27, pM28, pM29 und pM32. TABELLE 2 Phenotypische Analyse weiterer HIV-1-rev-Genmutanten
a++ 40-100% (relativ zu der Wildtyp-Rev-Aktivität)
+ 5-39%
- < 5%
b als prozentuale Hemmung der Wildtyp-Rev-Funktion bei einem 10-fachen Überschuss der Mutanten-Rev gegenüber der Wildtyp-Rev.

Beispiel 11b:

Wirkung auf eine HIV-2- und SIV-Rev-Funktion

Das multivalente Potential der transdominanten HIV-1-rev-Gettmutanten der Beispiele 4 bis 11 wurde unter Verwendung der bereits unter 6.2. und bei M. H. Malim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 8222-8226, beschriebenen Methodologie analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass mindestens die Mutante pM10 die Fähigkeit besitzt, nicht nur die phenotypische Expression des HIV-1- rev-Gens, sondern zusätzlich auch die HIV-2-rev- und -SIVmac-rev-Genfunktion (wie beispielsweise für HIV-2-rev gezeigt, durch starke Hemmung der HIV-2-Rev-Funktion, wenn ein Überschuss von pM10 zusammen mit Wildtyp-HIV-2-rev-Gen exprimiert wird, durch Hemmung einer nicht-gesplicten mRNA und einer 1-Exon-tat-Expression im Cytoplasma zu hemmen.

6.3.

Beispiel 12:

Analysen einer Rex-Funktion

Zum Testen von rex-Mutanten bezüglich Rex-Funktion (Fig. 14) wurde jede Mutanten-DNA mit pgTAX-LTR in COS-Zellen unter Verwendung von DEAE-Dextran (B. P. Cullen, Meth. Enzymol. 152 (1987), 692-693) cotransfiziert. Alle Plasmide wurden in einer Konzentration vn 1,25 ug/ml zugegeben. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen metabolisch mit ³&sup5;S-Cystein 2 h lang markiert, zelluläre Extrakte hergestellt und die Proben mit 0,5 alpha-humanmonoklonalem Antikörper, der spezifisch mit dem HTLV-I-Hüllenprotein reagiert, immunopräzipiert. Immunopräzipitate wurden auf SDS- 10%-Polyacrylamid-Gelen analysiert.
Für eine gleichzeitige Analyse einer HTLV-I-Env-, -Tax- und -Rex-Proteinproduktion (Fig. 15) wurden COS-Zellen mit pgTAX-LTR (0,1 ug/ml) und den für die Mutanten Rex-Proteine codierenden Vektoren (1 ug/ml) oder den Wildtyp-pREX-, pREV- und pCMV-IL-2-Vektoren (1 ug/ml) cotransfiziert. Immunopräzipitationsanalysen der HTLV-I-Proteine verwendeten die folgenden Antikörper: Env: 0,5 Alpha-Antikörper: Tax: Tax-spezifische Antipeptid-Kaninchen-Antiseren (hergestellt durch einen der Erfinder; können auch gemäß W. Wachsman et al., Scienec 235 (1987), 674-677) hergestellt werden); Rex: Rex-spezifische Antipeptid-Kaninchen-Antiseren (hergestellt durch einen der Erfinder können auch gemäß H. Siemi et al., Cell 55 (1988), 197-209 hergestellt werden). In jedem Fall wurde der radioaktiv markierte Zellextrakt für die drei Immunopräzipitationen und elektrophoretischen Analysen verwendet. Lediglich die relevante Region eines jeden der erhaltenen Autoradiogramme ist in der jeweiligen Tafel von Fig. 15 dargestellt.
Für eine subzellulare Lokalisierung der HTLV-I-Rex-Mutanten durch Immunofluoreszenz (Fig. 16) wurden COS-Zellen mit den angegebenen Expressionsplasmiden transfiziert und 48 h später mit Paraformaldehyd fixiert. Die Zellen wurden anschließend nacheinander mit Kaninchen-Anti-Rex- Peptidantiserum (Verdünnung 1 : 100) und Rhodamin-konjugiertes Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (wie zuvor beschrieben (B. R. Cullen (1987), aaO)) angefärbt.

Beispiel 13:

Hemmung einer Rex- und Rev-Funktion

Für eine Analyse der Fähigkeit der rex-Mutanten, die Funktion des Wildtyp-Rex-Proteins zu hemmen (Fig. 17A), wurden COS-Kulturen mit drei Plasmiden, einschließlich pgTAX-LTR (1,25 ug/ml), pREX (0,1 ug/ml) und 1 ug/ml der Rex-Mutanten (Spuren 1-6), pREX (Spur 7), pREV (Spur 8) oder pCMV-IL-2 (Spur 9) cotransfiziert. Eine Env-Produktion wurde durch Immunopräzipitation mit 0,5 alpha-monoklonalem Antikörper und Elektrophorese durch SDS-10%-Polyacrylamidgele analysiert. Für eine Analyse der Hemmung der Funktion des HIV-1-Rev-Proteins wurden COS-Zellen mit pgTAT, pREV und einem 10-fachen molaren Überschuss pBC/CMV-IL-2 oder den M6-, M7- und M13- transdominanten Rex-Mutanten cotransfiziert. Nach 48-stündiger Kultivierung und biosynthetischer Markierung mit ³&sup5;S-Cystein wurden Zellextrakte durch Immunopräzipitation bezüglich einer Rev induzierten Produktion der stumpfendigen 72 Aminosäuren großen Form des Tat-Proteins (Spur 2) getestet. Bei einem Molverhältnis von 10 : 1 hemmten die Mutanten M6, M7 und M13 (Spuren 3-5) vollständig die Wirkung des HIV-1-Rev-Proteins, da lediglich die die vollständige Länge aufweisende 86 Aminosäuren große Form des Tat-Proteins nachgewiesen wurde. Für eine Analyse der Hemmung der Replikation von HIV-1 wurden COS-Zellen mit dem rev-defizienten HIV-1-Provirusplasmid pHXB2-Bam-p3 (M. R. Feinberg et al., Cell 46 (1986), 807-817) und pREX in Gegenwart des angegebenen x-fachen Überschusses der M1-, M6-, M7- und M13-Mutanten cotransifiziert. Die Gesamt-DNA-Konzentration in dem Transfektionscocktail wurde durch Zugabe wechselnder Mengen des pBC/CMV-IL-2-Muttervektors bei konstantem Niveau gehalten. Drei Tage nach der Transfektion wurden die Überstandmengen des HIV-1- p24-Gag-Proteins durch ELISA gemessen (Coulter Immunologie-Kit). Die M6-, M7- und M13-Mutanten lieferten eine dosisabhängige Hemmung der HIV-1-p24-Produktion, während die rezessive negative M1- Mutante dies nicht tat.

7. PHARMAKOLOGISCHE ASPEKTE

HIV-1 ist das vorwiegende ethiologisch Mittel von AIDS, HTLV-I verursacht u. a. ATL; HTLV-II steht ethiologisch mit einigen Fällen von varianter T-Zell-Haarzell-Leukämie in Verbindung. Es hat sich gezeigt, dass die HIV-1-Rev- und HTLV-I-Rex-Transaktivatoren essenziell für eine virale Replikation in Kultur sind und Rev und Rex folglich potentielle Ziele für eine chemotherapeutische Intervention bei betroffenen Patienten sind.
Hier beschrieben werden Mutantenformen von Rev und/oder Rex, die als wirksame kompetitive Inhibitoren einr Wildtyp-Rev- und/oder Rex-Funktion in mit Wildtyp-Rev oder -Rex transfizierten Zellen agieren und die folglich auch als wirksame Inhibitoren einer HIV-1- und/oder HTLV-I- und/oder HTLV-II-Replikation fungieren. Diese Mutanten können somit verwendet werden, um die lymphoiden Zellen von einer Infektion ausgesetzten Patienten zu schützen. Ein Anzeichen, dass erwartet werden kann, dass dieser Ansatz praktikabel ist, ist die Beobachtung, dass eine Expression eines analogen transdominanten Derivats des essenziellen VP16-Transaktivators von HSV-1 in wirksamer Weise eine Resistenz gegen eine HSV-1-Infektion bei einer normal empfänglichen Zellpopulation verleiht (A. D. Friedman et al., Nature 335 (1988), 452-454). Des weiteren scheinen entsprechende transgene Mäuse gegen eine Infektion mit HSV-1 immun zu sein.
Mutanten-rex- und -rev-Gene mit Codierung für transdominante Repressoren von Rex oder Rev sind somit zur Verwendung als "intrazelluläre Immunogene" für die Behandlung von durch HTLV-I oder durch HTLV-II verursachte Erkrankungen oder durch HIV-1-induzierten Erkrankungen einschließlich AIDS und ARS (ARC) indiziert. Da des weiteren mindestens einige der transdominanten Rex- Mutantenproteine der vorliegenden Erfindung das spezielle Attribut aufweisen, sowohl eine HTLV-I- Rex- als auch eine HIV-1-Rev-Proteinwirkung zu hemmen, sind sie ferner für eine Verwendung zur Behandlung von Infektionen durch beide Virustypen indiziert. Diese Eigenschaft kann von besonderem Wert bei mit mehr als einem dieser Viruspathogene gleichzeitig befallenen Patienten oder bei solchen Patienten, deren Infektion zwischen diesen beiden Agenzien nicht unterschieden wurde, sein.
Die Existenz von therapeutischen Mitteln, die bei mehr als einer Virusspezies wirksam sind, scheinen vor der vorliegenden Erfindung nirgends offenbart zu sein. Angesichts seiner breiten Anwendbarkeit scheint das obige Konzept nicht nur bei der Therapie von Erkrankungen, die durch Virusspezies mit Codierung für Rev und Rex verursacht sind, sondern auch bei weiteren Viruserkrankungen, die durch Organismen bedingt sind, die ähnlich regulierte Gene aufweisen, indiziert zu sein.
Die vorliegende Erfindung eignet sich somit zur Verwendung bei der Prophylaxe und Therapie von Viruserkrankungen, insbesondere retroviralen Erkrankungen, wie ATL (Adult-T- Zellenleukämie). AIDS (aquired immunodeficiency sydrome), ARS oder ARC (AIDS-verwandtes Syndrom oder Komplex). SIV (Affenimmunodefizienzvirus), wie SIVmac, FIV (Katzenimmunodefizienzvirus), EIAV (infektiöser Pferdeanämivirus), Visnavirus und Rinderimmunodefizienzvirusinfectionen, insbesondere humanen retroviralen Erkrankungen, in stärker spezieller Weise humanretroviralen Erkrankungen, die durch Pathogene verursacht sind, die durch das rex- oder rev-Gen oder Äquivalente hiervon reguliert werden, wie ATL, AIDS und ARS (ARC).
Von besonderem Nutzen ist hierbei der multivalente Aspekt der Repressorwirkung, da er bei der Behandlung einer multiplen, insbesonderen doppelten Infektion durch Viren, wie sie häufig bei Drogen auf intravenösem Weg zu sich nehmenden Personen, die mit HIV-1 und HTLV-I coinfiziert sind, oder bei der Behandlung von Situationen einer einzelnen Infektion mit erhöhtem Risiko einer weiteren Infektion, wie bei einr HIV-Infektion, oder bei der Prophylaxe in Situationen, wo es gewünscht ist, gegen eine Infektion durch ein Spektrum von unterschiedlichen viralen Spezies zu schützen, von Vorteil ist.
Dieser multivalente Aspekt ist nicht notwendigerweise auf eng verwandte Viren, wie entweder DNA-Virus oder RNA-Retrovirus beschränkt, obwohl normalerweise erwartet wird, dass er bei der Hemmung von irgendwie verwandten Viren eines speziellen Typs, beispielsweise Retroviren, am stärksten wirksam ist: Es ist bekannt, dass Wechselwirkungen in Niveaus der Infektiosität zwischen DNA- Viren und Retroviren, wie zwischen dem HIV-1- und JC-Virus, einem humanen Papovavirus (H. Gendelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 9759-Übliche regulatorische Mechanismen können somit bei phylogenetisch unterschiedlicheren viralen Species, auf die die obigen Prinzipien einer multivalenten Transdominanz angewendet werden können, wirken.
Das therapeutische Potential der vorliegenden Erfindung ist unmittelbar offensichtlich, da die Repression von beispielsweise der Rex-Funktion von HTLV-I und der Rev-Funktion von HIV-1 eine Virusreplikation blockiert, wodurch die Bildung von infektiösen Viruspartikeln verhindert wird. Es wird somit erwartet, dass die latente Stufe der Infektion immer erhalten bleibt. Somit würden die Zellen von Patienten, die bereits mit dem HIV-1-Virus infiziert sind, jedoch darüberhinaus das in deren Genom integrierte Gen für einen transdominanten Repressor aufweisen, funktionsfähig bleiben und die Patienten würden unbegrenzt frei von Symptomen der Erkrankung ohne dem Bedarf einer Langzeittherapie bleiben.
Bei Betrachtung unter diesem Blickwinkel sind die erfindungsgemäßen Gene selbst Pharmazeutika für einzelne oder mehrfache Verabreichung, entweder direkt in vivo oder indirekt in vitro, vorzugsweise als Teil eines Vektors, beispielsweise eines retroviralen oder Plasmidvektors in einer zur Erreichung der Abgabe in funktioneller Form in Zielsäugetierzellen geeigneten Form beispielsweise kann eine Insertion von Genen, die für derartige transdominante Inhibitoren einer Virusreplikation codieren, in vitro in Zellen von Patienten durch direkte Implantation von lymphoiden Zellen, die von infizierten Individuen gewonnen worden sind, in das Genom erreicht werden und diese Zellen können nach der Durchführung der Insertion an den Donorpatienten verabreicht werden. Da HTLV-I und HTLV-II sowie HIV-1 in verschiedenen Typen von T-Zellen replizieren, scheinen die Erkrankungen, die sie verursachen, besonders geeignet zu sein.
Eine Anwendung hierfür würde somit parallel zu dem beispielsweise bei T. Friedmann, Science 244 (16. Juni 1989), 1275 oder bei P. M. Lehn, Bone Marrow Transplant I (1987), 243, offenbarten Gentherapiekonzept verlaufen: hämatopoetische Stammzellen werden beispielsweise aus AIDS/ATL- Patienten extrahiert und in vitro kultiviert; das erfindungsgemäße mutierte Gen mit Codierung für einen transdominanten Repressor für die zu reprimierende Funktion, beispielsweise die Rev/Rex-Funktion, wird unter Verwendung retroviraler Vektoren in diese Zellen implantiert; die nun virusresistente Nachkommen liefernden Stammzellen werden in das Immunsystem des ursprünglichen Patienten zurückgeführt, wo sie den Erwartungen zufolge aufgrund ihres erworbenen selektiven Vorteils gegenüber nicht-behandelten Stammzellen proliferieren. In angemessener Zeit wird die Population hämatopoetischer Zellen ganz aus Zellen, die den transdominanten Faktor herstellen und virusresistent sind, bestehen.
Verfahren, wie dies bewerkstelligt wird, sind bereits auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannt (vgl. beispielsweise US-A-4 868 116). Vektoren, beispielsweise retrovirale oder Plasmidvektoren zur Abgabe der mutierten Gene gemäß der vorliegenden Erfindung in Zielsäugetierzellen, wie Knochenmarkzellen, sind beispielsweise in Science 244 (16. Juni 1989), 1275, offenbart oder es wird in diesem Artikel darauf hingewiesen. Somit werden beispiellsweise verschiedene Rev- und/oder Rex- transdominante Gene in retrovirale Vektorsysteme kloniert. Nach einer durch Retroviren vermittelten Genabgabe in beispielsweise HIV-infizierte menschliche Zelllinien wird der Hemmeffekt der transdominanten Mutanten bereitwillig durch Hemmung der Virusproduktion festgestellt.
Das obige therapeutische Konzept ist ein Beispiel einer intrazellulären Immunisierung, wie sie bei D. Baltimore, Nature 335 (1988), 395, ins Auge gefasst wird. Kurz gesagt, umfasst das Konzept die Insertion eines Gens, das einen Repressor irgendeiner vitalen Funktion eines ausgewählten Virus codiert, in die speziellen Zielzellen, die dieses Virus infiziert (beispielsweise bestimmte T-Zellen im Fall des AIDS verursachenden Virus). Eine Anwendung dieses Therapieansatzes mit einem transdominanten Repressor eines beliebigen Virus ist abhängig von der Feststellung, dass potentielle Vektoren für Gene, die für derartige Mutanten codieren, und mögliche Verfahren zur Insertion dieser Vektoren in die geeigneten Zellen, die im Modellsystem identifiziert wurden, wirksame und sichere intrazelluläre Abgabesysteme für Anwendung bei Mensch und Tier darstellen. Das Konzept kann somit angesichts der ethischen Barrieren, die gegenwärtig eine Gentherapie verhindern, lediglich mit Schwierigkeiten dem Test einer experimentellen Verifizierung unterzogen werden. Jedoch haben die ersten derartigen genetischen Experimente mit nicht-therapeutischen Zielen gerade erst begonnen. Es ist zu erwarten, dass diesen Pioneerexperimenten sehr kurz nach der Demonstration der Unschädlichkeit dieses Verfahrens ähnliche Versuche mit therapeutishen Zielen folgen, zuerst bei lebensbedrohenden Zuständen, wie einer AIDS-Erkrankung und dass die vorliegende Erfindung für eine frühe Verwendung bei derartigen Versuchen gut geeignet sein könnte (vgl. T. Friedmann, Science 244 (16. Juni 1989). 1279, zweite Spalte "Infectious diseases").
Eine weitere Art der Verwendung der Erfindung umfasst die Insertion nicht eines Gens, sondern eines Repressorproteins gemäß der vorliegenden Erfindung in Zielzellen. Die Verabreichung beispielsweise oral oder parenteral wird in herkömmlicher Weise in einer eine intrazelluläre Penetration erlaubenden Form, beispielsweise durch Liposom-vermittelte Abgabe erreicht.
Für diese Verwendungen kann die exakte Dosis selbstverständlich in Abhängigkeit von der verwendeten Verbindung, dem Verabreichungsweg und der gewünschten Behandlung schwanken. Ein Sicherstellen der am besten geeigneten Dosis in einer speziellen Situation unterliegt dem Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet.
Die Erfindung eignet sich des weiteren zur Verwendung bei der Ausgestaltung und Schaffung von antiviralen Arzneimitteln auf der Basis der Transdominanz. Ein Mittel zum Manipulieren einer viralen Genfunktion wurde nun gefunden, das für verschiedene Virusspezies generell anwendbar scheint, obwohl die strukturelle Basis hierfür breit bei den verschiedenen Viren schwankt. Diese unerwartete Erkenntnis eröffnet den Weg für Studien mit dem Ziel zur Schaffung weiterer spezifischer, möglicherweise ein niedriges Molekulargewicht aufweisender, möglicherweise nicht-peptidischer transdominanter Inhibitoren einer Virusreplikation, insbesondere zur Schaffung von Inhibitoren mit der Fähigkeit, die transdominante, d. h. hauptsächlich die RNA-Bindungsdomäne in den Mutanten-Rev- und -Rex-Proteinen nachzuahmen, wie niedrigmolekulare Inhibitoren oder neutralisierende monoklonale Antikörper.
Es ist selbstverständlich, dass verschiedene Kombinationen und Veränderungen in der Form und im Detail bei der oben beschriebenen Erfindung durchgeführt werden können, ohne dass vom Umfang der vorliegenden Ansprüche abgewichen wird.
Es ist ferner selbstverständlich, dass weitere Mutanten gemäß der obigen Beschreibung, einschließlich Mutanten unter den bereits konstruierten und hier offenbarten spezifischen Mutanten, die jedoch nicht charakterisiert wurden, die jedoch bei einer detaillierteren Untersuchung als transdominant hemmend und/oder multivalent charakterisiert werden können, und weitere Mutanten gemäß den oben beschriebenen Prinzipien, die jedoch nicht spezifisch hier offenbart sind, auch unter den Umfang der vorliegenden Ansprüche fallen.

Claims

(Für die benannten Staaten AT, BE, CH, DE, DK, FR, GB, IT, LU, NL und SE:)

1. DNA-Molekül mit Codierung für ein Mutanten-Virusprotein, bei dem es sich um eine modifizierte Form eines Produkts eines für eine Virusfunktion essentiellen Gens handelt und das transdominant die phenotypische Expression eines oder mehrerer der folgenden Gene reprimiert:

i) das Wildtyp-rex-Gen von HTLV-I oder HTLV-II, wobei das Mutanten-Virusprotein von einer Wildtyp-Form des Rex-Proteins modifiziert ist; und

ii) das Wildtyp-rev-Gen von HIV-1, HIV-2 oder SIV, wobei das Mutanten-Virusprotein von einer Wildtyp-Form des Rev-Proteins modifiziert ist.

2. DNA nach Anspruch 1, wobei die phenotypische Expression des rex-Gens von HTLV-I reprimiert wird.

3. DNA-Molekül nach Anspruch 1 mit Codierung für ein HTLV-I-Rex-Protein, das eine Mutation zwischen den Aminosäurepositionen 30 und 101 des Wildtyp-Rex-Proteins von Fig. 1, vorzugsweise zwischen den Positionen 82 und 97, insbesondere zwischen den Positionen 87 und 94 oder eine Mutation zwischen den Aminosäurepositionen 59 und 121, vorzugsweise an der Position 59, 60, 64, 65, 119, 120 oder 121 des Wildtyp-Rex- Proteins von Fig. 1 aufweist.

4. DNA-Molekül nach Anspruch 3 aus dem rex-verwandten pcRexM7 (Fig. 1, 1A, 3 und 4, Mutante Nr. 7 und Beispiel 1).

5. DNA-Molekül nach Anspruch 2, wobei zusätzlich die phenotypische Expression des HIV-I-rev-Gens reprimiert wird.

6. DNA-Molekül nach Anspruch 5 aus dem rex-verwandten pcRexM7 (Fig. 1, 1A, 3 und 4, Mutante Nr. 7 und Beispiel 1).

7. DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei die phenotypische Expression des rev-Gens von HIV-1. HIV-2 oder SIV reprimiert wird.

8. DNA-Molekül nach Anspruch 7, wobei die phenotypische Expression des rev-Gens von HIV-1 reprimiert wird.

9. DNA-Molekül nach Anspruch 7 mit Codierung für ein HIV-I-Rev-Protein, das eine Mutation zwischen den Aminosäurepositionen 68 und 90, vorzugsweise zwischen 78 und 86 insbesondere zwischen 78 und 83 oder 84 des Wildtyp-Rev-Proteins von Fig. 6 aufweist.

10. DNA-Molekül nach Anspruch 9 aus dem rev-verwandten pM32 (Fig. 5A und 6, Mutante pM32 und Beispiel 11a).

11. DNA-Molekül nach Anspruch 9 aus dem rev-verwandten pM10 (Fig. 5, 6 und 7, Mutante M10 und Beispiel 4).

12. DNA-Molekül nach Anspruch 1 aus dem rex-verwandten pcRexM7 (Fig. 1, 1A, 3 und 4, Mutante Nr. 7 und Beispiel 1).

13. DNA-Molekül nach Anspruch 1 aus dem rev-verwandten pM32 (Fig. 5A un d 6, Mutante pM32 und Beispiel 11a).

14 DNA-Molekül nach Anspruch 1 aus dem rev-verwandten pM10 (Fig. 5, 6 und 7, Mutante M10 und Beispiel 4).

15. DNA-Molekül nach Anspruch 1 mit Codierung für einen transdominanten Repressor der Funktion des HTL-1-Rex-Proteins, wobei der Repressor von einer Wildtyp-Form des Rex-Proteins durch mindestens eine transdominante negative Mutatioin in der Peptiddomäne zwischen den Aminosäurepositionen 59 und 121 des Wildtyp-Rex-Proteins, das die zwei Regionen umfasst, die für die Rex-Effektorfunktion am kritischsten sind, modifiziert ist und im wesentlichen die nucleare Lokalisierungsaktivität der Wildtyp-Form des Rex- Proteins aufweist.

16. DNA-Molekül nach Anspruch 11 mit Codierung für das Mutantenprotein M10.

17. DNA-Molekül mit Codierung für das Mutantenprotein M10 nach Anspruch 16, wobei es sich um das Wildtyp-Gen von Fig. 6 handelt, das so modifiziert ist, dass es für Asp an der Position 78 und für Leu an der Position 79 des Wildtyp-Rev-Proteins codiert.

18. DNA-Molekül nach Anspruch 17, das die Necleotide GATCTG mit Codierung für Asp an der Position 78 und für Leu an der Position 79 des Wildtyp-Rev-Proteins umfasst.

19. Mutanten-Virusprotein, wobei das Mutanten-Virusprotein eine modifizierte Form eines Produkts eines für eine Virusfunktion essentiellen Gens ist und das transdominant die phenotypische Expression eines oder mehrerer der folgenden Gene reprimiert:

i) das Wildtyp-rex-Gen von HTLV-I oder HTLV-II, wobei das Mutanten-Virusprotein von einer Wildyp-Form des Rex-Proteins modifiziert ist; und

20. Protein nach Anspruch 19, wobei die phenotypische Expression des rex-Gens von HTLV- I reprimiert wird.

21. Protein nach Anspruch 19, das ein HTLV-I-Rex-Protein ist, das eine Mutation zwischen den Aminosäurepositionen 30 und 101 des Wildtyp-Rex-Proteins von Fig. 1, vorzugsweise zwischen den Positionen 82 und 97 insbesondere zwischen den Positionen 57 und 94 oder eine Mutation zwischen den Aminosäurepositionen 59 und 121, vorzugsweise an der Position 59, 60, 64, 65, 119, 120 oder 121 des Wildtyp-Rex-Proteins von Fig. 1 aufweist.

22. Protein nach Anspruch 21, codiert durch das rex-verwandte pcRexM7 (Fig. 1, 1A, 3 und 4, Mutante Nr. 7 und Beispiel 1).

23. Protein nach Anspruch 20, wobei zusätzlich die phenotypische Expression des HIV-1- rev-Gens reprimiert wird.

24. Protein nach Anspruch 23, codiert durch das rex-verwandte pcRexM7 (Fig. 1, 1A, 3 und 4, Mutante Nr. 7 und Beispiel 1).

25. Protein nach Anspruch 19, wobei die phenotypische Expression des rev-Gens von HIV- 1, HIV-2 oder SIV reprimiert wird.

26. Protein nach Anspruch 25, wobei die phenotypische Expression des rev-Gens von HIV-1 reprimiert wird.

27. Protein nach Anspruch 25, das ein HIV-1-Rev-Protein ist, das eine Mutation zwischen den Aminosäurepositionen 68 und 90, vorzugsweise zwischen 78 und 86, insbesondere zwischen 78 und 83 oder 84 des Wildtyp-Rev-Proteins von Fig. 6 aufweist.

28. Protein nach Anspruch 27, codiert durch das rev-verwandte pM32 (Fig. 5A und 6, Mutante pM32 und Beispiel 11a).

29. Protein nach Anspruch 27, codiert durch das rev-verwandte pM10 (Fig. 5, 6 und 7, Mutante M10 und Beispiel 4).

30. Mutanten-Virusprotein nach Anspruch 19, wobei das Protein durch das rex-verwandte pcRexM7 codiert ist (Fig. 1. 1A, 3 und 4, Mutante Nr. 7 und Beispiel 1).

31. Mutanten-Virusprotein nach Anspruch 19, wobei das Protein durch das rev-verwandte pM32 codiert ist (Fig. 5A und 6, Mutante pM32 und Beispiel 11a).

32. Mutanten-Virusprotein nach Anspruch 19, wobei das Protein durch das rev-verwandte pM10 codiert ist (Fig. 5, 6 und 7, Mutante pM32 und Beispiel 4).

33. Protein nach Anspruch 20 der Funktion des HTLV-I-Rex-Proteins, wobei der Repressor von einer Wildtyp-Form des Rex-Proteins durch mindestens eine transdominante negative Mutation zwischen den Aminosäurepositionen 59 und 121 in der Peptiddomäne des Wildtyp-Rex-Proteins, das die zwei Regionen umfasst, die für die Rex-Effektorfunktion am kritischsten sind, modifiziert ist und im wesentlichen die nucleare Lokalisierungsaktivität der Wildtyp-Form des Rex-Proteins aufweist.

34. Protein nach Anspruch 26 der Funktion des HIV-1-Rev-Proteins, das eine erste und eine zweite Domäne umfasst, wobei die erste Domäne im wesentlichen die spezifische Bindungsfunktion des Wildtyp-HIV-1-Rev-Proteins aufweist und die zweite Domäne durch eine oder mehrere Mutationen von dem Wildtyp-HIV-1-Rev-Protein modifiziert wird.

35. Protein nach Anspruch 26 der Funktion des HIV-1-Rev-Proteins, das eine erste Domäne umfasst, die im wesentlichen die spezifischen Bindungsfunktionen des Wildtyp-Rev- Proteins aufweist, wobei der transdominante Repressor die Aktivierungsfunktionen des Wildtyp-HIV-1-Rev-Proteins nicht aufweist.

36. Protein nach Anspruch 19, codiert durch das DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 16, 17 oder 18.

37. Verfahren zur Herstellung eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 18 durch Isolieren des entsprechenden Wildtyp-Gens aus einem geeigneten Expressionssystem, Einsetzen dieses Gens in ein geeignetes Klonierungssystem, Einführen der gewünschten Mutation in das Gen und Gewinnen des erhaltenen Mutanten-Gens aus den Klonen mit der gewünschten Mutation.

38. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach einem der Ansprüche 19 bis 36 durch Exprimieren und Amplifizieren eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 18 in einem geeigneten Expressions- und Amplifikationssystem und Gewinnen des erhaltenen Produkts daraus.

39. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 18 oder ein Protein nach einem der Ansprüche 19 bis 36 in einer zum Erreichen des gewünschten prophylaktischen oder therapeutischen Effekts geeigneten Form zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.

40. Verfahren zur Hemmung der Replikation von HIV-1, HTLV-I oder HTLV-II in-vitro durch Einführen eines DNA-Segments nach Anspruch 15 in eine Zelle mit der Fähigkeit zur Replikation eines dieser Viren und zum Exprimieren des DNA-Segments zur Herstellung eines transdominanten Repressors nach Anspruch 33 einer HTLV-I-Rex-Funktion.

41. Verfahren zur Hemmung einer HIV-1-Replikation in-vitro durch Einführen eines transdominanten Repressos nach Anspruch 33 der HIV-1-Rev-Funktion in eine mit HIV-1- infizierte Zelle.

42. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Verwendung als Arzneimittel.

43. Protein nach einem der Ansprüche 19 bis 36 zur Verwendung als Arzneimittel.

44. Vektor, der ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 18 in einer Form enthält, die sich eignet, die Abgabe in einer funktionellen Form in eine Zielsäugetierzelle zu erreichen.

45. Verwendung eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 18 oder eines Vektors gemäß Definition in Anspruch 44 bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei der Gentherapie gegen Virusinfektionen.

46. Verwendung nach Anspruch 45 bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei der Gentherapie zum Schutz von lymphoiden Zellen von einer Virusinfektion ausgesetzten Patienten.