JP4234999B2 - 治療標的としてのhiv−1vifタンパク質の多量体形成 - Google Patents
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Description
「HIV−1」は、「1型ヒト免疫不全ウイルス」を意味する。
「Vif」は、「ビリオン感染性因子」を意味する。
「GST」は、「グルタチオン−S−トランスフェラーゼ」を意味する。
「CAT」は、「クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ」を意味する。
「IP」は、「免疫沈降」を意味する。
「WB」は、「ウエスタンブロッティング」を意味する。
用語「アンタゴニスト」は、ここで用いる場合、Vifタンパク質に、好ましくは、Vifタンパク質内の多量体化ドメインに結合し、それによりVif−Vif相互作用及びVifタンパク質の多量体化を阻害する分子をいう。アンタゴニストは、タンパク質及びそれらのペプチド模倣物、核酸、炭水化物又は、Vifタンパク質の多量体化を阻害する任意の他の分子を含むことができる。
図1.無細胞系におけるVif自身の会合。
A.GST−Vif(レーン2)は、イン・ビトロで翻訳された35S標識HIV−1NL4-3Vifタンパク質に結合できるが、GST(レーン3)は、結合できないことを示すオートラジオグラフ。35S標識HIV−1NL4-3Vifタンパク質を、GST−Vif結合体化ビーズに結合させた。結合後に、ビーズに会合した35S標識VifをSDS−PAGE及び直接的オートラジオグラフィーにより分析した。
B.ネイティブ又は比較的ネイティブな条件下で、35S標識HIV−1NL4-3Vifタンパク質が、単量体、二量体、三量体又は四量体を形成することを示すオートラジオグラフ。イン・ビトロで翻訳された35S標識HIV−1NL4-3Vifタンパク質を、直接、ネイティブなロード用緩衝液[62.5mM トリス−HCl(pH6.8)及び20% グリセロール]及び種々の濃度のSDSを用いて、4〜20% トリス−HClゲル(SDSなし)上に載せた。電気泳動を、0.05% SDSを含むトリス−グリセリンランニング緩衝液を用いて行ない、その後、オートラジオグラフィーを行なった。
図2.Vif変異体のVif−Vif相互作用に対する効果。
A.PCRベースの突然変異誘発及びイン・ビトロ翻訳を利用して生成したVifタンパク質に沿っての一連の欠失体を示す概略図。イン・ビトロで翻訳された35S標識HIV−1NL4-3Vifタンパク質及びその変異体を、アガロースビーズに結合体化させたGST−Vifに結合させた。ビーズに会合した35S標識されたVifタンパク質及びその変異体をSDS−PAGEにかけて、直接的オートラジオグラフィーにより可視化した。結合したVif対総投入物の比を、GST−Vif結合した35S標識された野生型Vifタンパク質と35S標識された野生型Vif総投入物(100%)との比を利用して計算した(標準偏差を有する)。これらの値は、オートラジオグラフィーのデンシトメトリーを用いる定量により得られた。殆どの場合に、このデータは、少なくとも5つの独立した実験を反映する。
B.0.1% SDSの存在下で、35S標識されたHIV−1NL4-3Vifタンパク質変異体Δ151−192及びΔ151−164が多量体を形成できないが、他の変異体はそうすることができることを示すオートラジオグラフ。イン・ビトロで翻訳された35S標識されたHIV−1NL4-3Vifタンパク質及びその変異体(それぞれにつき、50,000cpmの計数)を、ロード用緩衝液[62.5mM トリス−HCl(pH6.8)及び20% グリセロール]及び0.1% SDSを用いて、4〜20% トリス−HClゲル(SDSなし)に直接載せた。電気泳動を、0.05% SDSを含むトリス−グリシンランニング緩衝液を用いて行ない、その後、オートラジオグラフィーを行なった。
図3.細胞内でのVif−Vif相互作用を研究するための同時免疫沈降法。
c−Myc又はFlagエピトープによりC末端で標識されたVifタンパク質の、COS−1トランスフェクトされた細胞における発現が、A14抗−c−Mycポリクローナル抗体及び又はM2抗−Flagモノクローナル抗体をそれぞれ利用して検出できることを示すウエスタンブロット(上側の2つのパネル)。COS−1細胞に、Flag又はc−Myc標識Vifを有するベクターをトランスフェクトした。5% CO2、37℃での54時間のインキュベーション後に、20μgの全細胞溶解物を、15% トリス−HClゲルにより分離した。第三のウエスタンブロットは、これらの細胞溶解物をA14抗−c−Mycポリクローナル抗体を用いて免疫沈降させた場合に、Flag標識したVifがMyc標識されたVifと共沈されることを示している。共沈のために、同一バッチに由来する全細胞溶解物を、A14抗−c−Mycポリクローナル抗体による免疫沈降にかけた。免疫沈降物を、15% トリス−HClゲルにて分離してメンブレン上に移してから、M2抗−Flag抗体を用いて検出した。
図4.Vif−Vif相互作用を研究するための哺乳動物ツーハイブリッド系。
A.実験に用いたプラスミド:pVif−VP、pGAL−Vif及びpSG5GalVPを示す図式マップ。
B.様々なベクターと結合させたプラスミドを用いてトランスフェクトしたCOS−1細胞のCAT活性を示すゲル。48時間後に、細胞溶解物を採集して、CAT分析にかけた。
図5.Vif又はVif変異体により影響されたウイルスの感染性。
組換えウイルスが感染したHelaCD4−CAT細胞のCAT活性を描いた図。野生型vif遺伝子又はその変異体を含むpCI−Neo構築物、pNL4−3ΔenvΔvifプラスミド及びpMD.G(VSV envを含む)を、H9細胞にトランスフェクトして、シュードタイプのウイルス粒子を生成した。超遠心分離による濃縮後に、これらのウイルス粒子を、HIV−1 p24抗原により標準化した。ポリブレン(8μg/ml)の存在下で、これらのウイルスを利用して、HelaCD4−CAT細胞に感染させた。48時間後に、それらの細胞溶解物を集めて、CAT分析にかけた。レーン1)pNL4−3;レーン2)pNL4−3ΔenvΔvif、VSV env及び野生型vif、レーン3)pNL4−3ΔenvΔvif、VSV env及びvifΔ 151−164;レーン4)pNL4−3ΔenvΔvif、VSV env及びvifΔ144−150;レーン5)pNL4−3ΔenvΔvif、VSV env及びpCI−Neoベクターのみ。野生型vifの補完の値を100%と設定した。他の試料の相対値を同様に計算した。数字は、3つの独立した実験を表している。値は、平均値±標準偏差である。
図6.PXPモチーフを含むペプチド間での相対的親和性の比較。
GST−Vifタンパク質、Vif変異体(151〜192アミノ酸の欠失)及びGSTのみをプレート上に置いた。Vif含有カラムにより分離されたファージクローンを連続的に希釈して加えた。ファージ−Vif結合を与えるためのインキュベーションの後に、過剰のファージを洗い去った。抗M13ファージ抗体(HRPと結合体化したもの)を、加えて、Vifにより捕捉されたファージと結合させた。洗浄後、基質を加えて発色させた。それ故、Vifに捕捉されたファージが半定量された。405nmでのODが0.15以上を陽性とみなした。ファージ試料数(VMI)は、表1に示したものと同じであった。
HIV−1のVifタンパク質は、イン・ビボでの及び、末梢血単核細胞(PBMC)、マクロファージ及びH9 T細胞の生産性感染でのウイルス複製に必須である。Vifの分子機構は、未知のままであり、更に決定されることが必要である。本発明は、HIV−1によりコードされる他の多くのタンパク質と同様に、Vifタンパク質は、自己会合への強い傾向を有しているということを示す。比較的ネイティブな条件下で、Vifタンパク質は、イン・ビトロで、二量体、三量体又は四量体を含む多量体を形成する。イン・ビボ結合アッセイ例えば共免疫沈降及び哺乳動物ツーハイブリッド系は、Vifタンパク質が、細胞内で互いに相互作用することを示しており、これは、Vifタンパク質の多量体化が単に偶然の凝集によるものではないことを示している。
プラスミド構築
感染性クローンpNL4−3をテンプレートとして用いた場合、HIV−1 Vifの欠失変異は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により媒介されて位置指定された突然変異導入法によって生成される。(Zhang, H.等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(22):12519-24, 1996)。PCRで生成した野生型vif遺伝子及びその変異体を、次いで、イン・ビトロ翻訳のためにpCITE−4aベクター(Novagen, ウィスコンシン、Madison在)に挿入する。このvif遺伝子は又、GST−Vif融合タンパク質のイン・ビトロ発現及び単離のためにpGEXベクターにも挿入した。細胞内Vif−Vif相互作用の研究のために、vif遺伝子に、Flag(DYKDDDDK)(SEQ ID NO:2)又はc−Myc(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO:3)エピトープコード配列をそれぞれ3’末端で用いるPCRによって標識を付けた。これらの標識を付けたvif遺伝子を、次いで、ベクターpCI−Neoに挿入したが、該ベクターは、CMVエンハンサー及び最初期プロモーターの直ぐ下流にキメライントロンを含む(Promega, ウィスコンシン、Mdison在)。その結果生成したプラスミドは、それぞれ、pCI−vif−c−myc又はpCI−vif−flagと呼ばれた。哺乳動物のツーハイブリッド分析のために、pGal−Vif又はpGal−VifΔ151−164を、pSG5GalVPのHindIII−BamHI断片(vp遺伝子を含む)をPCR増幅した完全なvif遺伝子又はその変異体Δ151−164で置き換えることによって構築した。pVif−VP又はpVifΔ151−164−VPを、pSG5GalVPのEcoRI−BflII断片(gal4遺伝子を含む)を、それぞれ、PCR増幅した完全なvif遺伝子又はその変異体Δ151−164で置き換えることによって構築した。(Shimano, R.等、Biochem.Biophys.Res.Comm 242(2):313-6,1998)。すべての構築物の完全性を、DNA配列決定により確認した。
vif遺伝子を有し又は有しないベクターpGEXを、BL21コンピテント細胞(Novagen, ウィスコンシン、Madison在)にトランスフォームした。37℃で約0.6O.D.まで増殖させた後に、GST又はGST−Vifタンパク質の発現を、0.4mM イソプロピルチオ−β−D−ガラクトシド(IPTG)により誘導した。これらの細菌細胞を、溶解緩衝液(1% トリトン−X−100、0.1mg/ml リゾチーム、2mM EDTA、1mM PMSF、2μg/ml ロイペプチン及び1μg/ml アプロチニン)を加えてから超音波処理することにより溶解させた。この試料を、12,000gで、10分間、4℃で遠心分離してペレット化して、上清をグルタチオン結合体化したアガロースビーズ(Sigma, ミズーリ、St.Louis在)カラムに加えた。バッチ結合後に、このマトリクスを、3回洗った(毎回、10床容積のリン緩衝液(PBS)を加えることにより洗浄)。次いで、GST又はGST−Vif結合体化アガロースビーズのアリコートを取り、−20℃に貯蔵した。逆に、35S標識したVif又はその変異型タンパク質を、SPT3キット(Novagen, ウィスコンシン、Madison在)を利用して合成した。製造業者により提供されたプロトコールに従った。イン・ビトロ翻訳後に、RNアーゼA(0.2mg/ml)を加えて反応を停止させて、tRNA及びイン・ビトロ転写されたmRNAを除去した。トリクロロ酢酸(TCA)不溶性の放射性アミノ酸を、シンチレーションカクテルの存在下で定量した。
COS−1又は293T細胞を、リン酸カルシウム沈殿法を利用して、5μgpCI−vif−c−myc及びpCI−vif−flagでトランスフェクトした(Zhang, H.等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(22):12519-24, 1996;Zhang, H.等、J.Virol.69(6):3929-32, 1995)。48時間後に、これらの細胞を、細胞溶解用緩衝液[150mM NaCl、50mM トリス−HCl(pH8.0)、5mM EDTA、1% トリトン−X−100、10% グリセロール、1mM PMSF、2μg/ml アプロチニン、2μg/ml ロイペプチン及び2μg/ml ペプスタチンA]中で溶解させた。直接ウエスタンブロッティングのために、全細胞溶解物をアセトンと混合した(1:3)。この混合物を、氷上で20分間インキュベートした後に、12,000gで10分間遠心分離した。次いで、これらのペレットを、風乾して、SDS含有試料緩衝液に再懸濁させた。これらの試料を、SDS−PAGEゲルにて電気泳動してから、ナイロン/ニトロセルロース膜上に電気泳動によりトランスファーした。一次抗体のヤギ抗c−Myc抗体(A14)(Research Antibodies, カリフォルニア、Santa Cruz在)又はマウス抗Flag抗体(M2)(Stratagene, カリフォルニア、La Jolla在)を、それぞれ、試料を結合するのに用いた。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合体化抗ヤギIgG抗体又は抗マウスIgG抗体(Research Antibodies, カリフォルニア、Santa Cruz在)を二次抗体として利用した。化学ルミネセンスベースの系(ESL、Amersham-Pharmacia Biotech, ニュージャージー、Piscataway在)を利用して、抗原抗体結合を可視化した。
哺乳動物のツーハイブリッド系(GAL4ベースの酵母ツーハイブリッドアッセイを改変したもの)を利用して、イン・ビボでのHIV−1Vifタンパク質の自己会合を研究した。(Shimano, R.等、Biochem.Biophys.Res.Comm.242(2):313-6, 1998;Bogerd, H.及びGreene, W.C., J.Virol.67(5):2496-502, 1993)。この手順は、幾らかの改変を伴って、Shimano, R.等、Biochem.Biophys.Res.Comm.242(2):313-6, 1998及びBogerd, H.及びGreene, W.C., J.Virol.67(5):2496-502, 1993に記載された。簡単にいえば、5μgのpGal−Vif及びpVif−VPをpG5BCATとCOS−1細胞内に、Superfectトランスフェクション試薬(Qiagen, カリフォルニア、Valencia在)を用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、これらの細胞を適当な溶解用緩衝液(Promega, ウィスコンシン、Madison在)中で溶解させて、以前にZhang, H.等、J.Virol.69(6):3929-32, 1995に記載されたようにして、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)アッセイにかけた。
Vif変異体の生物学的活性を、Dornadula, G.等、J.Virol.74(6):2594-602, 2000に記載された単一ラウンドウイルス感染性アッセイを幾らか改変したものを利用することにより評価した。組換えHIV−1ウイルスを生成するために、H9細胞に、5μgのpNL4−3ΔvifΔenv、pMD.G[VSV(vesicular stomatitis virus)エンベロープを含む]及び野生型vif遺伝子又はその変異体(pCI−neo構築物)をエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。(Dornadula, G.等、J.Virol.74(6):2594-602, 2000;Naldini, L.等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(21):11382-8, 1996)。このエレクトロポレーション(650V、250μF、5.1〜6.3m秒)を、遺伝子パルサー装置及びキャパシタンス(Bio-Rad, カリフォルニア、Hercules在)により行なった。その後、調整培地(RPMI1640に10% ウシ胎児血清を加えたもの)を用いて、トランスフェクトしたH9細胞を維持した。トランスフェクションの2日後に、上清中のウイルス粒子を集めて、超遠心分離によりペレット化した。(Dornadula, G.等、J.Virol.74(6):2594-602, 2000)。酵素結合免疫溶媒アッセイ(ELISAキット、DuPont社製)により検出したHIV−1 p24抗原レベルによる標準化の後に、これらのウイルスを、5×105HeLa細胞 CD4−CAT細胞に感染させるのに用いた。(Ciminale, V.等、AIDS Res.Hum.Retro.6(11):1281-7, 1990)。感染の48時間後に、これらの細胞を、適当な溶解用緩衝液(Promega, ウィスコンシン、Madison在)中で溶解させて、CATアッセイにかけた。
M13ファージ上にディスプレーされたVif結合性ぺプチドを、Ph.D.−12(商標)ファージディスプレーペプチドライブラリーキット(New England Biolabs, マサチューセッツ、Beverly在)を利用してスクリーニングした。ファージパニング手順を、キットのプロトコールを幾らか改変して行なった。グルタチオン−アガロースビーズ(Sigma, ミズーリ、St.Louis在)上に結合させたGST−Vif融合タンパク質をファージパニングの標的として利用した。各ラウンドのパニングのために、1011のファージを、6mlの最終容積のTBS緩衝液(50mM トリス−HCl、pH7.5、150mM NaCl)中の3mlのグルタチオン−アガロースゲル上に結合された10mg GSTに加えて、1時間振盪しながら室温でインキュベートした。この結合用溶液を、500g、10分間の遠心分離により分離してから、上清を、3mlのグルタチオン−アガロースビーズに結合させた10mgのGST−Vifに加えた。この混合物を、1時間室温でインキュベートしてから、TBST[50mM トリス−HCl(pH7.5)、500mM NaCl、0.5% ツイーン−20]で6回洗った。これらのGST−Vif結合ファージを、3mlの5mM 還元グルタチオン(TBS中)を加えることにより溶出した。溶出されたファージを、2.5mlの溶出を20mlの大腸菌ER2738培養物(O.D 0.6)に加えて、激しく振盪しながら37℃で4.5時間インキュベートすることにより増幅した。遠心分離後に、上清中のファージを、PEG/NaClにより沈殿させた。洗浄後に、これらのファージを、200μlのTBS中に懸濁させた。溶出された又は増幅されたファージの滴定を、キットのプロトコールに記載されたようにして測定した。3ラウンドのパニングの後に、GST又はGST−Vif溶出滴定プレートに由来する個々のファージプラークを、それぞれ、増幅のために選択した。ファージDNAを精製して配列決定した。
ファージ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を行なって、ファージのGST、GST−Vif又はGST−アミノ酸151〜192を欠くVifに対する相対的結合親和性を測定した。150μlの0.1M NaHCO3(pH8.6)中の100μg/mlのGST及びGST−Vifを、96ウェルミクロ滴定プレート上にそれぞれコートして、4℃で一晩インキュベートした。これらのプレートを、室温で2時間、ブロッキング緩衝液(0.1M NaHCO3、pH8.6、5mg/ml BSA)を用いてブロックした。200μl TBST中の個々のファージクローンを4倍連続希釈し(1011〜105)、GST、GST−Vif又はGST−アミノ酸151〜192を欠くVifでコートされたウェルに加えて2時間室温でインキュベートした。洗浄後に、HRP結合した抗M13抗体を加えてこれらのファージと結合させた。洗浄後に、基質を加えて発色を行なった。それ故、Vifに捕捉されたファージが、半定量された。405nmでのODが0.15以上のものを陽性とした。
HIV−1に曝され又は感染した個人を治療する本発明の方法は、Vif多量体の形成を相互作用的にブロック(即ち、阻止し又は阻害)し、それにより、レンチウイルスの生活環におけるVif機能を阻害する化合物の投与に基づいている。この発明によれば、Vifタンパク質、その断片又は他の誘導体(又は、その類似体)を、抗体を生成するための免疫原として利用することができる(該抗体は、かかる免疫原を認識する)。かかる抗体は、一本鎖、Fab断片、及びFab発現ライブラリーを包含するが、これらに限られない。特定の具体例において、ヒトタンパク質に対する一本鎖抗体を製造する。
一本鎖抗体を、細胞によって合成し、特定の細胞コンパートメントを標的として、高度に特異的な様式でHIV−1の複製に干渉させるために利用することができる。本発明において、この方法は、Vifタンパク質又はその誘導体に結合できる一本鎖抗体の細胞内発現を含み、ここに、この抗体は、好ましくは、その分泌をコードする配列を含まない。かかる一本鎖抗体は、細胞内で標的に結合しない。本発明の抗体は、標的に結合できる抗体の部分をコードする十分な数のヌクレオチドを含むDNA配列から発現される。遺伝コードの固有の縮重のために、実質的に同じ又は機能的に等価な重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をコードする他のDNA配列は、この発明の範囲内にある。この発明に従って利用することのできる変化したDNA配列は、同じ又は機能的に等価な遺伝子産物をコードする配列を生じる種々のヌクレオチド残基の欠失、付加又は置換を含む。この遺伝子産物自体は、アミノ酸残基の欠失、付加又は置換を、重鎖又は軽鎖配列内に含むことができ、これは、サイレント変化を生じ、そうして、機能的に等価なモノクローナル抗体を生成する。
この抗体カセットを、公知の手段の何れかによって細胞に送達する。例えば、Miller, A.D., Nature 357:455-460(1992);Anderson, W.F., Science 256:808-813(1992);Wu等、J.of Biol.Chem.263:14621-14624(1988)を参照されたい。例えば、これらの抗体遺伝子例えばsFv遺伝子を含むカセットを、本発明による遺伝子治療の多くの公知の形態によって、特定の細胞を標的として送達することができる。遺伝子治療の方法の一般的概観のためには、Goldspiel等、Clinical Pharmacy 12:488-505, 1993;Wu及びWu, Biotherapy 3:87-95, 1991;Tolstoshev, Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596, 1993;Mulligan,Science 260:926-932, 1993;並びにMorgan及びAnderson, Ann.Rev.Biochem.62:191-217,1993;1993年5月、TIBTECH 11(5):155-215を参照されたい。利用することのできる組換えDNA技術の分野で公知の方法は、Ausubel等(編), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, NY;及びKriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY.
この発明は、更に、Vifタンパク質及びそれらの誘導体(断片を含むが、それらに限られない)及び類似体に関係し、これらは、Vifタンパク質の多量体化ドメインに結合し、それにより、Vif−Vif相互作用及びVifタンパク質の多量体化を阻害する。Vifタンパク質又は誘導体を含む分子も又、提供される。
本発明は又、PXPモチーフを含むペプチドにも関係する。PXPモチーフを含むペプチドを含む分子も又、与えられる。
本発明は、Vifに特異的に結合し、それにより、多量体化を阻害する分子の検出に関係する。かかる分子は、そうして、HIV−1の生活環を阻止する。好適具体例において、アッセイを行なって、治療剤としての潜在的有用性を有する分子又は薬物開発のためのリード化合物をスクリーニングする。この発明は、Vifに結合してVifの多量体化に拮抗し、それによりVifの活性及びその後のレンチウイルスの複製を阻害する分子を検出するためのアッセイを提供する。
この発明は、治療用化合物の投与による様々な病気の治療又は予防を与える。かかる治療剤は、Vifタンパク質並びにそれらの類似体及び誘導体(断片を含む);それらに対する抗体;これらのタンパク質、類似体又は誘導体をコードする核酸;及びアンタゴニストを包含するが、これらに限られない。好適具体例においては、レンチウイルス感染に関係する疾患を、Vif機能を阻害する治療剤の投与により治療し又は予防する。
この発明は、患者への有功量の治療剤即ち本発明のモノクローナル(又は、ポリクローナル)抗体、レトロウイルスベクター、又はVifアンタゴニストの投与による治療及び予防方法を提供する。好適な面において、この治療剤は、実質的に純粋である。患者は、好ましくは、ウシ、ブタ、ニワトリなどの動物を含む動物であり(これらに限られない)、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
本発明は又、医薬組成物をも提供する。かかる組成物は、治療上有効な量の治療剤及び製薬上許容しうるキャリアー又は賦形剤を含む。かかるキャリアーには、塩溶液、緩衝塩溶液、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びこれらの組合せが含まれるが、これらに限られない。キャリアー及び組成物は、無菌であってよい。この配合は、投与方法に適合させる。
Vifタンパク質は、多量体をイン・ビトロで形成することができる
Vifタンパク質が自己会合する傾向を有するかどうかを調べるために、GST−VifをBL21細菌細胞中で発現させて、グルタチオン結合したアガロースビーズ上に分離した。これらのGST−Vif結合したビーズを、次いで、イン・ビトロ翻訳した35S標識したVifタンパク質とインキュベートした。結合後に、ビーズ結合した35S標識したVifを、SDS−PAGEにより分析してから直接オートラジオグラフィーを行なった。結合した35S標識Vifのオートラジオグラフィーは、GST−Vif(レーン2)が、35S標識されたイン・ビトロ翻訳されたVifタンパク質に結合するが、GST(レーン3)は結合しないことを示し、これはVif−Vif相互作用を示している(図1A)。
Vif多量体形成のための結合部位を決定するために、Vifタンパク質中に、PCRベースの突然変異導入とその後の35S−メチオニンの存在下でのイン・ビトロ翻訳により、一連の欠失を生成させる。これらのVif変異体を、その後、アガロースビーズ上に結合したGST−Vif融合タンパク質に結合させた。結合後に、ビーズに会合した35S標識したVifタンパク質及びその変異体をSDS−PAGEにかけて、直接オートラジオグラフィーにより可視化した。図2Aは、その結果を与えるものである。Vifタンパク質は、C末端の欠失によりVif−Vif結合活性を著しく失い、151〜164位のアミノ酸の欠失は、結合活性を有意に減じる(図2A)。この結果は、ネイティブな多量体形成アッセイにより確認される。0.1% SDS、Vif変異体Δ151−192及びΔ151−164は、多量体を形成することができなかったが、他の変異体は、多量体を形成する能力を保持した(図2B)。
Vifの自己会合が、細胞内でも起きるのかどうかを調べるために、共免疫沈降法を使用した。このVifタンパク質を、c−Myc(SEQ ID NO:3)又はFlagエピトープ(SEQ ID NO:2)を用いてC末端でタグ標識して、COS−1細胞内で発現させた。c−Mycタグ標識したVif及びFlagタグ標識したVifの発現を、マウス抗c−Mycエピトープ抗体又はヤギ抗Flagエピトープ抗体を用いるウエスタンブロッティングによりそれぞれ検出した(図3、上の2つのパネル)。Vif−Vif相互作用を研究するために、これらの細胞溶解物を、抗−Myc抗体を用いて免疫沈降させ、次いで、SDS−PAGEにかけてから、ウエスタンブロッティングを行なった。ヤギ抗−Flag抗体を用いて、Flagタグ標識したVifを検出した。これらの結果を図3の一番下のパネルに示す。Flagタグ標識したVifは、マウス抗−Myc抗体を免疫沈降に使用する場合には、Mycタグ標識したVifにより共沈され、これは、細胞内のVif−Vif相互作用を意味している(図3、一番下のパネル)。
前述のように、Vifは、HIV−1の生活環の後期ステージにおいて機能し、「非許容」細胞例えばPBMC、マクロファージ、及びH9 T細胞によりHIV−1複製のために必要とされる。(Gabuzda, D.H.等、J.Virol.66(11):6489-95, 1992;Blanc, D.等、Virology 193(1):186-92, 1993;von Schwedler, U.等、J.Virol.67(8):4945-55, 1993)。Vifの多量体形成の生理学的意味を調べるために、Vif変異体Δ151−164の、ウイルス生活環においてVif機能を補完する能力を試験した。Vif変異体Δ151−164を、それが、無細胞系で及び細胞内で多量体を形成することができないので利用した。この目的のために、単一ラウンドのウイルス感染性アッセイを適合させた。野生型のVif又はその変異体を、「非許容」H9 T細胞中で発現させた。同時に、シュードタイプ(VSVエンベロープを有する)HIV−1ウイルス(ゲノム中にvif及びenvを有しない)を、これらの細胞から生成させた。富化のための超遠心分離の後に、これらの組換えウイルスを、標的細胞(Hela CD4−CAT)(HIV−1 LTRプロモーター駆動されるCAT遺伝子を含む発現カセットを有する)に感染させた。このウイルス感染性を、新たに合成されたプロウイルスにより発現されるHIV−1 Tatタンパク質により駆動される標的細胞におけるCAT遺伝子発現のレベルにより測定した。図5は、野生型vif遺伝子がvif欠損HIV−1ウイルスを産生する「非許容」H9細胞において発現される場合には、そのウイルス感染性は、高レベルに達するということを示している(レーン2)。しかしながら、VifΔ151−164がvif欠損HIV−1ウイルス産生「非許容」H9 T細胞において発現される場合には、そのウイルス感染性は、vif欠損HIV−1ウイルス(レーン4)と比較して変化しない(レーン3)(図5)。これらのデータは、151−164欠失が、Vifタンパク質の機能を著しく減少させ、「非許容」T細胞から生成したvif欠損HIV−1ウイルスの感染性をレスキューすることを不可能にすることを示している。これらの結果は、Vifタンパク質の多量体形成がVif機能に必要とされることを示している。
Vifタンパク質多量体形成ドメインに結合し、それにより、Vif−Vif相互作用及びHIV−1のウイルス感染性を阻害するペプチドを更に同定するために、PXPモチーフを含む12量体ペプチドの一組(表1、SEQ ID NO:5〜20)を構築したが、その構造は、Vifタンパク質の161PPLP164ドメイン(SEQ ID NO:25)を共有している。ファージペプチドディスプレー法により、これらのペプチドは、精製されたHIV−1 Vifタンパク質に高親和性で結合することが示された(図6)。これらのペプチドの幾つかを合成して、Vif−Vif結合のための反応系に加えた。表1に示したように、PXPモチーフを含むペプチド例えばLPLPAPSFHRTT(VMI9、SEQ ID NO:13)又はSNQGGSPLPRSV(VMI7、SEQ ID NO:11)は、Vif−Vif相互作用を有意に阻害することができる。
多くのHIV−1タンパク質例えばGag、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ、糖タンパク質41(gp41)、Tat、Rev、Vpr及びNefによる二量体又は多量体の形成は、それらのレンチウイルス生活環における機能にとって重要であることが示されている。(Frankel, A.D.及びYoung, J.A., Ann.Rev.Biochem.67:1-25, 1998;Vaishnav, Y.N.及びWong-Staal, F., Annu Rev Biochem 60:577-630, 1991;Zhao, L.J.等、J Biol Chem 269(51):32131-7, 1994;Liu, L.等、J.Virol.74:5310-5319, 2000)。加えて、多量体形成は、多くの原核及び真核生物タンパク質の生物学的活性にとって臨界的であり、タンパク質の機能の活性化/不活性化のための一般的機構である。本発明は、HIV−1 Vifタンパク質が二量体又は多量体を形成すること、及びかかる多量体形成がウイルス生活環におけるVif機能に必須であることを示す。証拠は、イン・ビトロ翻訳された35S標識したVifタンパク質がネイティブな環境で多量体を形成することができることを示す。逆に、GSTタンパク質よりむしろGST−Vif融合タンパク質(細菌の発現系で生成される)が、イン・ビトロ翻訳された35S標識Vifタンパク質に結合することができる。更に、共免疫沈降及び哺乳動物ツーハイブリッド系の結果は、細胞内のVif−Vif相互作用を示している。これらのイン・ビトロ及びイン・ビボデータは、Vifタンパク質が多量体を形成することができることを強く意味している。Vif−Vif結合に必須のドメインの欠失は、「非許容」細胞におけるVifの機能を著しく減じ、これは、Vifの多量体形成がHIV−1生活環におけるその機能にとって重要であることを更に示している。
Claims (7)
- アミノ酸配列SEQ ID NO:11を含み、細胞内でVifタンパク質内の多量体形成ドメインに結合してVifタンパク質の多量体形成を阻害するペプチド。
- アミノ酸配列SEQ ID NO:11を、そのアミノ又はカルボキシ末端で、ペプチド結合により、異なるアミノ酸配列に結合させた、請求項1に記載のペプチド。
- ペプチドが、20以下のアミノ酸を含む請求項1又は2に記載のペプチド。
- ペプチドが、アミノ酸配列SEQ ID NO:11よりなる、請求項1に記載のペプチド。
- 請求項1〜4の何れかに記載の少なくとも一つのペプチド及び製薬上許容しうるキャリアーを含む医薬組成物。
- レンチウイルスの感染性の阻止に使用する請求項1〜4の何れか一項に記載のペプチド。
- レンチウイルスの感染性が、HIVの感染性である、請求項6に記載のペプチド。
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