FI110437B - Menetelmä mutanttia virusproteiinia koodaavan DNA-molekyylin valmistamiseksi - Google Patents

Description

110437

MENETELMÄ MUTANTTIA VIRUSPROTEIINIA KOODAAVAN DNA-MOLEKYYLIN VALMISTAMISEKSI

1. KEKSINNÖN ALA

5 Keksintö koskee virusgeeni-ilmentymistä, ja erityisesti HTLV-I:n "rex-(virusproteiini-ilmentymisen säätelijä)geenin ja sen muissa retroviruslajeissa olevien ekvivalenttien, kuten HIV-l:n rev:n, fenotyyppis-tä ilmentymistä.

10 2. TEKNIIKAN TASO

Virukset, erityisesti ihmisen retrovirukset, kuten ihmisen immuunikatovirus tyyppi 1 (HIV-1) tai ihmisen leukemiavirus tyyppi I (HTLV-I), ovat monien vakavien sairauksien aiheuttajia. Tällaisia sairauksia 15 ovat HIV-1 immuunikatotauti (Acquired Deficiency Syndrome, AIDS) ja HTLV-I aikuisiän T-soluleukemia (ATL), kuin myös eräs ei-syöpäsairaus, joka tunnetaan nimellä trooppinen spastinen parapesis. HTLV-II liittyy etio-logisesti tiettyihin muuttuva-T-solu-karva(hai-20 ry)soluleukemiaan. Molemmissa virusryhmissä replikaa-·;·· tiosykli jakaantuu DNA-viruksien mukaisesti geeni- ilmentymisen "varhaiseen" ja "myöhäiseen" vaiheeseen. Geeni-ilmentymisen "varhaiselle" vaiheelle on tyypil-listä säätelyproteiinien ilmentyminen, kun taas "myö-25 hemmässä" vaiheessa syntetisoituvat rakenneproteiinit.

HTLV-I genomi koodaa virustranskription akti-' vaattoria nimeltään Tax. Tax:in ekvivalentin nimi HIV- l:ssä on Tat. Tax ja Tat näyttävät vaikuttavan pääasiallisesti retroviraaliseen LTRrään (pitkäterminaali-30 toisto) virusgeeni-ilmentymistä varten. HTLV-I koodaa lisäksi viraalista rakennegeeni-ilmentymistä nimeltään ,·* Rex. Funktionaalinen Rex vastaa pilkkomat toman (uns- pliced) virus mRNA:n lisääntyneestä poiskuljetuksesta tumasta infektoituneen solun sytoplasmaan. Siellä nämä 35 mRNA lajit muodostavat virusgenomin ja koodaavat ra-. .·. kenneproteiineja. Ihmisen immuunikatovirus tyyppi 1 (HIV-1) koodaa homologista proteiinia nimeltään Rev.

2 110437 rev geenituote on, kuten Rex HTLV-I systeemissä, välttämätön HIV-1 rakenneproteiinien ilmentymiselle.

Tämä johtuu rev geenituotteen (ja sen muissa o lajeissa olevien ekvivalenttien) dramaattisesta vaiku-5 tuksesta virus mRNA transkriptien pilkkoutu-mis(splicing)mallin valintaan infektoituneessa solussa. Tämä vaikutus saadaan aikaan Revin ja Rexin tapauksessa post-transkriptionaalisella säätelyllä, nimittäin lisäämällä täyspitkien mRNA transkriptien kuljβίο tusta sytoplasmaan, jolloin alkaa viraalisten rakenne-proteiinien, kuten Gag ja Env HIV-1 tapauksessa, ilmentyminen ja samanaikaises-ti estyy (ks. esim.

Rexilie M. Hidaka et ai.,EMBO J. 7 [1988] 519) tai moduloituu (ks. esim. Reville M.H. Malim et ai., Nature 15 335 [1988] 181) säätelyproteiinien ilmentyminen. Siten

Rev ei ole välttämätön täysin pilkottujen HIV-1 mRNAiiden, jotka koodaavat viraalisia säätelyprote-iineja, kuten Tat ja Rev, ilmentymisessä.

HIV-lissä edellä mainitun induktion selektii- 20 visyyden aikaansaa RNA kohdesekvenssi, joka tarvitaan . Rev funktiolle ja josta käytetään nimitystä Rev-vaste- elementti (Rev Response Element, RRE). RRE on yhtäpi- ·' " tävä HIV-1 env-geenissä olevan, suuren, 234 nukleoti- » · * : .- din suuruisen RNA sekundäärisen rakenteen kanssa. Vas- ·,,,' 25 taava rakenne HTLV-I issa on Rex-vaste-elementti (Rex "·; Response Element, RexRE tai RRX) . Rev näyttää olevan :*:*.* ensimmäinen proteiini, jonka on osoitettu säätelevän RNAin poiskuljettamista tumasta sekvenssispesifiseen tapaan.

30 Rex ollessa esimerkkinä, Rex proteiinin täy- , , dellinen funktio HTLV-I gag ja env geenien ilmentymi- sen säätelyssä ilmentymisessä vaatii ainakin kolme ’··· funktionaalisesti selvää komponenttiaktiivisuuttai tu- ma- ja tumajyväspaikallistamisen, so. kapasiteettia 35 tulla kuljetetuksi kaikkien proteiinien synteesien sy-·/ toplasmisesta kohdasta tumaan ja siellä konsentroitua * ·:’ tumajyväsalueelle; RexRE (RRX) sekvenssin spesifistä 110437 3 tunnistamista (suoraan tai epäsuorasti) virus RNArissa; ja Rex efektoriaktiivisuutta, joka on tähän mennessä vielä tämän säätelyproteiinin tuntematon aktiivisuus, joka itse asiassa välittää RexRE sekvenssin 5 sisältävien, osittain pilkottujen viraalisten mRNA lajien poiskuljetusta tumasta sytoplasmaan.

Tarkasteltaessa Rex proteiinin rakenteellisia sijainteja, joista löytyvät täydellisen Rex funktion ko. komponenttiaktiivisuudet (so. funktionaaliset do-10 meenit), niin kaikki mitä tiedettiin ennen tätä keksintöä on, että positiivisesti varautunut peptidido-meeni ensimmäisissä kahdessakymmenessä aminohapossa Rex aminoterminaalissa on välttämätön tumajyväspaikal-listamisessa (H.Siomi et ai., Cell 55 [1988] 197-209).

15 Kuten edellä on mainittu, sekä rex geenituote HTLV-I tapauksessa, että rev geenituote HIV-1 tapauksessa tarvitaan viruksen replikaatioon (ks. esim. HIV:lie E. Terwilliger et ai., J.Virol. 62, [1988] 655) . Rex:n ja Rev:n tärkeä osa johtuu siitä, että, 20 huolimatta niiden erilaisista primäärisistä rakenteis-

. ta, ne liittyvät toisiinsa toiminnallisesti ja HTLV-I

[ ' Rex pystyy toteuttamaan funktionsa muissa viruslajeis- • ‘ sa, so. HIV*l:ssa (L.Rimsky et ai., Nature 335 [1988] # * · " i 738) : vaikka • ' t' 25 - Rev: 11a ja Rex: 11a ei ole mitään merkittävää homolo- " : giaa nukleotidi- eikä myöskään aminohappotasolla, - nukleotidisekvenssit ja runko- ja silmukkarakenteet RRE:llä poikkeavat RexRE:n (RRX) vastaavista HTLV-I: SSA, 30 - Rex ja Rev proteiineille tietokoneen avulla mallite- , , tuissa sekundäärisissä rakenteissa ei havaita merkit- ; · täviä samankaltaisuuksia, ja ‘ ··· - Rex proteiini ei näytä sitovan samaa RRE osaa kuin

Rev, niin on kuitenkin mahdollista korvata Rev prote-35 iini Rex proteiinilla HIV-1 systeemissä, ja, edelleen, ’,· äskettäin on havaittu , että HIV-2 Rev (Rev2) voidaan korvata HTLV-I Rex:llä ja HIV-1 Rev:llä ja että analo- 110437 4 ginen HTLV-II säätelyproteiini voidaan myös korvata HTLV-I Rexrllä. Tämä komplementaatio on riittävä avustamaan esim. rev-vajäälle HIV-1 provirukselle funktionaalisen Rex proteiinin saamisen trans:ssa. Toisaalta 5 käänteinen substituutio rex-vajaan HTLV-I proviruksen avustamiseksi funktionaalisella Rev proteiinilla ei näytä mahdolliselta. Siten tässä suhteessa ei ole täydellistä symmetriaa. Tätä käänteisyyden puuttumista ei vielä ymmärretä täysin, mutta se liittyy luultavasti 10 näiden proteiinien eroihin funktionaalisissa kohdissa, joita tarvitaan kohde RNA sekvenssin tunnistamiseen.

Mutaatiot säätelyproteiineissa voivat johtaa geenituotteeseen, jolla on dominantti (vallitseva) negatiivinen fenotyyppi villi-tyyppiseen funktioon näh-15 den (I. Herskowitz, Nature 329 [1987] 317). Dominantit negatiiviset mutanttiproteiinit, jotka tunnetaan transdominantteinä repressoreina ja joita on löydetty viimeaikoina pieni joukko useista, toisiinsa läheisesti liittymättömistä viruksista, edustavat uutta anti-20 virus-aineluokkaa. Geneettisissä analyyseissä negatii-viset mutaatiot aiheuttavat geenin funktion vähenty-mistä tai häviämistä. Dominantit negatiiviset mutaati- • t , ot estävät saman geenin, joka ei ole mutatoitunut (so.

» I I

• * jolla on villityyppinen sekvenssi), muiden kopioiden • i 25 kunnollisen toiminnan. Toisaalta resessiiviset nega- t ”tiiviset mutaatiot eivät juuri inhiboi villityyppisiä ! t! vastineitaan. Edelleen, eräät dominantit mutaatiot in hiboivat villityyppisiä geenejä vain silloin, kun mu-tantti- ja villityyppiset geenit sijaitsevat samassa 30 kromosomissa (DNA- tai RNA molekyyli). Tällöin inhi- t . boivan mutaation sanotaan olevan "cis-toimiva" ("cis- • i » acting"). Vaihtoehtoisesti dominantti mutaatio voi in-hiboida vastaavaa villityyppistä geeniä, vaikka se si- * » * ; : jaitsisikm erillisessä kromosomissa. Tämä tyyppi luo- 35 kitellaan "trans-toimivaksi" ("trans-acting") domi- V nantti mutaatioksi tai yksinkertaisemmin transdominan- I ♦ ‘*· tiksi mutaatioksi.

110437 5

Muutamia näistä transdominanteista geeneistä on kuvattu koskien geenejä eukaryooteille tai Herpes virustranskriptiotekijöitä (I.A. Hope ja K. Struhl, Cell 46 [1986] 885; R. Gentz et ai., Science 243 5 [1989] 1695; S.J. Triezenberg et ai., Gen.& Devei. 2

[1988] 718; A.D. Friedman et ai., Nature 335 [1988] 452) . Siten yli-ilmennettäessä eräitä Herpes simplex virus trans-aktivaattori VP16 deleetiomutantteja ne inhiboivat VP16 funktiota, jolloin HSV-1 replikaatio 10 estyy soluissa, joissa se olisi muutoin mahdollinen. Myös retroviruksille on kuvattu transdominantteja mu-tantteja, esim. HTLV-II:n Tax proteiinille (W. Wachs-man et ai., Science 235 [1987] 674) ja esillä olevan keksinnön prioriteet-tipäivän jälkeen HIV-1 tat- (M. 15 Green et ai., Cell 58 [1989] 215) ja qag- (D.Trono et ai., Cell 59 [1989] 113) geeneille.

Näiden kahden säätelyproteiinien koostumukselle ja funktioille esitettyjen erojen perusteella voidaan päätellä, että Rex rakenteen vertailu Rev pro-20 teiinin tai sen tunnettujen mutanttien rakenteen kanssa ei auta lainkaan virusproteiinien transdominantteja repressoreita mahdollisesti tuottavien mutaatioiden valinnassa.

Edellä esitettyjen kohtien terapeuttinen so-25 veltaminen voisi sisältää vahingollisen geenituotteen '··; tuoton tai ylituoton inhibition manipuloimalla geeni tuottamaan dominantteja negatiivisia mutaatioita, jolloin saatu geeni koodaa mutantteja säätelyproteiineja, jotka ilmentyessään häiritsevät villi-tyyppisen funk-30 tion aktiivisuutta (I. Herskowitz, Nature 329 [1987] 219) . Virusinfektioiden, esim. retrovirusinfektioiden, '· tapauksessa olisi siten erittäin toivottavaa tuottaa ·...· vastaavia transdominantteja repressoreita virus- funktiolle muodostamalla vastaavia, välttämättömien .···. 35 säätelygeenien inhibiittoreita, esim. rev tai rex gee- ·/ nien inhibiittoreita. Tämä menetelmä antaisi riittävät työkalut "intrasellulaariselle immunoinnille", joka on 110437 6 esitetty ensimmäisen kerran vuonna 1988 menetelmänä virusinfektioiden hoitoon (D. Baltimore, Nature 335 [1988] 395).

Julkaisu EP 246 882 koskee ART nukleotidiseg-5 menttejä, vektoreita, solulinjoja, menetelmää niiden valmistamiseksi ja niiden käyttöä. Viitatun julkaisun ajankohtana tiedettiin hyvin vähän rev:stä, se edusti molekyylibiologiaa, joka oli täysin uutta, ja se, ky-ettäisiinkö tuottamaan transdominantti negatiivisia 10 mutantteja oli täysin epäselvää, sillä jotkut proteiinit eivät muodosta transdominantteja negatiiveja, vaikka ne mutatoidaan kuten esillä olevassa keksinnössä on kuvattu, tällainen on mm. HIV-1 tat. Erityisesti ei ollut tiedossa sitoutuuko Rev nukleiinihappoon ja 15 eikä varmasti ollut tiedossa, että Revrllä on erityinen aktivaatiodomeeni, jonka funktio voidaan selektiivisesti eliminoida. Mitä tiedettiin oli se, että Rev toimi RNA kohdesekvenssin avulla. Tämä olisi helposti voinut olla epäsuoraa vuorovaikutusta.

20 Julkaisu Wachsman et ai. Science (1987) 235 , 674-677 koskee HTLV x geenin mutantteja. Tämä julkaisu koskee HTLV-II:n transkriptionaalista Tax proteiinia : ja tax geeniä (=x geeni). Julkaisussa esitetyt mutan- : tit näyttävät transdominoivasti inhiboivan lyhytaikai- : : 25 sessa kotransfektiotestissä villityyppisten proteii- ····· nien ilmentymistä, esim. Leu5 mutantin, vaikka ei näy- tä olevan myöhemmin vahvistusta siitä, että inhibointi tapahtuisi tehokkaasti in vivo olosuhteissa.

Julkaisu Friedman et ai. CA 110 (1989) 163: 30 52087t koskee hyvin tutkittua Herpes virus transakti- vaattoriproteiinia VP-16. Julkaisussa pohditaan, että • "· samankaltaiset toimintatavat voivat olla käyttökelpoi- siä myös muissa virussairauksissa, kuten AIDS:ssa. Julkaisu Peteriin, Biotechnology 6 (1988) 794-799 kos- t ,··. 35 kee HIV repiikaatiota ja sen inhiboimista. Tämä kat- • · sausartikkeli kokoaa monet mahdolliset tavat tulevai- suudessa tapahtuvalle tutkimukselle. Julkaisussa ei 110437 7 kuitenkaan esitetä mitään konkreettisia ratkaisuja tai osoiteta mitään tapaa, joka voisi olla erityisen suositeltava lukuisten esitettyjen menetelmien joukossa. Julkaisu Sadaie et ai. CA 108 (1988) 160:162332k kos- 5 kee tat ja trs (=rev) mutantteja, erityisesti julkaisussa on esitetty, että tietyt pistemutaatiot trs (rev) geenissä vaikuttavat HIV-l:n biologisiin ominaisuuksiin. Nämä mutanttivirukset eivät syntetisoi tavallisia määriä viraalisia mRNA:ta, rakenneproteiineja 10 ja/tai viraalisia partikkeleita. Pistemutantti provi-rusten, joilta puuttuu trs, ko-transfektio cDNArn kanssa, joka cDNA koodaa villityyppistä trs sekvenssiä, säilyttää tavanomaisen transskription ja virus-tuotannon. Tämä julkaisu ei erityisesti esitä transdo-15 minantteja rev mutantteja, jotka kykenevät dominoivasti vaikuttamaan villityyppisen rev proteiinin funktioon. Julkaisu Perkins et ai., J.Acq Def.Imm. Syndromes 2 (1989) 256-263 koskee HIV rev proteiinin rakenteel lista ja funktionaalista määrittämistä. Julkaisussa 20 esitetyt 12 mutanttiplasmidia, erityisesti kuvassa IA , esitetyt plasmidit, on konstruoitu käyttämällä paikka- johdettua mutageneesiä. Viitatussa julkaisussa ei esi-: ” tetä yhtään Rev mutanttia, jolla olisi transdominantti : negatiivinen fenotyyppi.

25 3. YHTEENVETO KEKSINNÖSTÄ ···· Keksinnön mukaisesti, HTLV-I rex- ja vast.

HIV-1 rev geenin geeniteknisesti muunneltuja, transdo-minantteja versioita, joiden tuotteet blokkaavat HTLV-I, HTLV-II tai vast. HIV-1 repiikaatiota, on nyt val-30 mistettu. Edelleen, eräät näiden rex- tai rev geenien muunneUtujen, transdominanttien versioiden tuotteista •'! blokkaavat sekä HTLV-I (ja joissakin tapauksissa HTLV- II) että HIV-1 (ja joissakin tapauksissa HIV-2 ja SIV) replikaatiota.

,···. 35 Esillä oleva keksintö näyttää olevan ensim- '·’* mäinen julkaistu menetelmä useammassa kuin yhdessä vi- ruslajissa toimivien virusrepressoreiden valmistami- 110437 8 seksi, so. transdominanttien geenituotteiden, jotka repressoivat useamman kuin yhden viruslajin funktio-naalisesti ekvivalenttien geenien fenotyyppistä ilmentymistä, valmistamiseksi.

5 Keksintö koskee siten menetelmää DNA- molekyylien valmistamiseksi, jotka DNA-molekyylit koo-daavat proteiineja, jotka puolestaan repressoivat transdominoivasti useamman kuin yhden viruslajin funk-tionaalisesti ekvivalenttien geenien fenotyyppistä il-10 mentymistä ja siten blokkaavat useamman kuin yhden viruslajin replikaatiota, ja erityisesti menetelmää DNA-molekyylien valmistamiseksi pcRexM7:stä ja pM10:stä, kuten myöhemmin esitetään.

Edelleen keksintö koskee menetelmää prote-15 iineja koodaavan DNA-molekyylin valmistamiseksi, jotka proteiinit puolestaan repressoivat transdominoivasti HTLV-I:n ja/tai HTLV-II:n rex geenin fenotyyppistä ilmentymistä, ja menetelmää proteiineja koodaavan DNA-molekyylin valmistamiseksi, jotka proteiinit puoles-20 taan repressoivat transdominoi-vasti HIV-l:n ja/tai HIV-2:n ja/tai SIV:n rev geenin fenotyyppistä ilmentymistä, ja erityisesti menetelmää DNA-molekyylin val-: mistamiseksi pcRexM7:stä, pM10:ssä, ja pM32:sta, kuten • V myöhemmin esitetään.

! : 25 Keksintö koskee edelleen menetelmää tällais- — ten geenien valmistamiseksi, jolloin vastaava villi- tyyppinen geeni eristetään sopivasta ilmentämisjärjes-telmästä, tämä geeni viedään sopivaan kloonausjärjes-telmään, geeniin saatetaan haluttu mutaatio ja saatu 30 mutanttigeeni otetaan talteen halutun mutaation omaa-vista klooneista. Edelleen keksintö koskee menetelmää '· ”· edellä määriteltyjen proteiinien valmistamiseksi, jol- ’·,,, loin edellä määriteltyä geeniä ilmennetään ja lisätään .·;· sopivassa ilmentämis- ja lisäysjär jestelmässä ja il- ,···. 35 mennetty tuote otetaan talteen ko. järjestelmästä.

Keksintö koskee edelleen menetelmää proteii-nien valmistamiseksi, jotka proteiinit repressoivat 110437 9 transdominoivasti useamman kuin yhden viruslajin funktionaalisesta ekvivalenttien geenien fenotyyppistä ilmentymistä ja blokkaavat siten useamman kuin yhden viruslajin replikaatiota, ja erityisesti menetelmää 5 pcRexM7:n ja pM10:n mutanttiproteiinien valmistamisek si, kuten myöhemmin esitetään.

Keksintö koskee edelleen menetelmää proteiinien valmistamiseksi, jotka proteiinit repressoivat transdominoivasti HTLV-I:n ja/tai HTLV-II:n rex geenin 10 fenotyyppistä ilmentymistä, ja menetelmää proteiinien valmistamiseksi, jotka proteiinit repressoivat transdominoivasti HIV-1:n ja/tai HIV-2:n ja/tai SIV:n rev geenin fenotyyppistä ilmentymistä, ja erityisesti menetelmää pcRexM7:n, pM10:n, ρΔ9/14:η ja pM32:n mutant-15 tiproteiinien valmistamiseksi, kuten myöhemmin esite tään.

Vektoria, esim. retrovirus- tai plasmidivek-toria, joka sisältää edellä määritellyn menetelmän mukaisesti valmistetun geenin sellaisessa muodossa, jol-20 la aikaansaadaan vienti funktionaalisessa tilassa koh- denisäkässoluun in vivo tai in vitro, voidaan käyttää.

Keksintö koskee edelleen menetelmää far-: " maseuttisen ainekoostumuksen valmistamiseksi, joka • V koostumus sisältää edellä määriteltyä DNA-molekyyliä : : 25 tai proteiinia sellaisessa muodossa, jolla aikaansaa- ·'··· daan haluttu profylaktinen tai terapeuttinen vaikutus, esim. potilaasta otettujen solujen, joita on käsitelty in vitro ennen takaisinsaattamista, muodossa, yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan tai laimennus-30 aineen kanssa.

Keksintö koskee edelleen patenttivaatimusten ‘· “ 17, 18 ja 19 mukaisia menetelmiä. Virusinfektioita hoidetaan antamalla tällaista hoitoa tarvitsevalle kohteelle edellä määriteltyä DNA-molekyyliä tai prote-,···. 35 iinia sellaisessa muodossa, jolla saavutetaan haluttu • · profylaktinen tai terapeuttinen vaikutus, esim. poti- 110437 10 laasta otettujen solujen, joita on käsitelty in vitro ennen takaisinsaattamista, muodossa.

"Hoidolla" tarkoitetaan virusinfektioiden profylaktista kuin myös parantavaa hoitoa ja "paranta-5 vaan" hoitoon sisällytetään virusinfektion stabiloiminen latenssitilaan.

Määriteltyjen geenien ja proteiinien funktionaaliset fragmentti- tai johdannaismuodot, so. fragmentit tai johdannaiset ovat funktionaalisesti ekviva-10 lentteja. Termillä "funktionaalinen fragmentti tai johdannainen" tarkoitetaan fragmenttia tai johdannaista, jonka farmaseuttinen aktiivisuus on kvalitatiivisesti identtinen koskemattoman mutanttigeenin tai proteiinin farmakologisen aktiivisuuden kanssa ja 15 kvantitatiivisesti sama tai erilainen, so. suurempi tai pienempi, kuin koskemattoman mutanttigeenin tai -proteiinin farmakologinen aktiivisuus, esim. n. 1-10000 %, edullisesti n. 10-1000 %.

Inhibiittorit, jotka on johdettu keksinnön 20 mukaisista geeneistä, proteiineista ja DNA segmenteis- . tä ja kykenevät jäljittelemään transdominanttisuutta, ] so. primäärisesti RNA-sitovaa domeenia edellä määri- ' “ tellyssä Rex- tai Rev proteiinissa, kuten alhaisen mo- : lekyylipainon omaavat inhibiittorit tai neutraloivat 25 monoklonaaliset vasta-aineet. Alhainen molekyylipaino ···*· tarkoittaa tässä yhteydessä molekyylipainoa, joka on alle n. 10 kD, edullisesti alle n. 1 kD.

- HIV-1 Rev funktion transdominantti repressori, sisältää ensimmäisen ja toisen domeenin ensimmäisen do-30 meenin omatessa oleellisesti villityyppisen HIV-1

Rev:n spesifiset sitoutumisfunktiot, mutta toisen do-’· *: meenin ollessa ilman villityyppisen HIV-1 Rev:n akti- vaatiofunktioita siten, että toinen domeeni on modifi-.*:* oitu villityyppisestä HIV-1 Rev:stä yhdellä tai useam- .*··. 35 maila mutaatiolla; ensimmäinen domeeni sisältää edul- lisesti aminohappopaikasta n. 10 aminohappopaikkaan n. 68 villityypppistä Rev:iä ja modifioitu toinen domeeni 110437 11 on johdettu aminohappopaikasta n. 68 aminohappopaik-kaan n. 90 villityyppisestä Revistä; edullisesti, edellä mainittu yksi tai useampi mutaatio on missen-se(muutos)- tai deleetio(poisto)mutaatioita, jotka ta-5 pahtuvat villityyppisen Rev:n aminohappopaikkojen n.

68-90, edullisesti n. 78-86, edullisemmin n. 78-83 tai 84, välillä, villityyppisen HIV-1 Revin ensimmäisen domeenin spesifisten sitoutumisfunktioiden jäädessä oleellisesti funktionaalisesti koskemattomaksi; ja 10 erityisesti repressoreita pMIO ja pM32, kuten myöhem min esitetään.

- HIV-1 Rev funktion transdominantti repressori, sisältää ensimmäisen domeenin, jolla on oleellisesti villityyppisen HIV-1 Revin spesifiset sitoutumisfunk-15 tiot, ja tällä transdominantilla repressorilla ei ole villityyppisen HIV-1 Revin aktivaatiofunktioita; ensimmäinen domeeni sisältää edullisesti aminohappopaikasta n. 10 aminohappopaikkaan n. 68 villityyppistä Reviiä ja transdominantista repressorista puuttuu ami-20 nohappopaikasta n. 68 ainakin aminohappopaikkaan n. 90 villityyppistä Reviä.

’ ‘ - DNA segmentti, joka koodaa HTLV-I Rex pro- • « • *· teiinin funktion transdominanttia repressoria, joka on • · · : *#· modifioitu Rex proteiinin villityyppisestä muodostaa 25 ainakin yhdellä transdominoivalla negatiivisella mu- taatiolla villityyppisen Rex proteiinin peptidido-meenissa, jolla on Rex proteiinin efekto-ri (vaikuttaja)-aktiivisuus, ja repressorilla on oleellisesti Rex proteiinin Villityyppisen muodon tu-30 majyväspaikallistamisaktiivisuus; edullisesti sellai nen DNA segmentti, jossa villityyppisen Rex proteiinin peptididomeeni sisältää aminohappopaikat paikasta n.

• 59 paikkaan n. 121, edullisesti missä tahansa seuraa- ,·;· vista aminohappopaikoistai 59, 60, 64, 65, 119, 120 ja 35 121.

- Vastaava HTLV-I Rex proteiinin funktion transdomi-:,j,; nantti repressori, joka on näin modifioitu villityyp- *110437 12 pisestä muodosta ja jolla on edullisesti kyky repres-soida joko HIV-1 Rev proteiinin funktiota tai HTLV-II Rex proteiinin funktiota.

- Menetelmässä Rex proteiinin geeniaktivaatiofunktion 5 spesifisen inhibiittorin identifioimiseksi, i) tuotetaan geneettinen järjestelmä, joka sisältää: -DNA segmentin, joka koodaa mRNA:ta, joka puolestaan sisältää Rex proteiinin tunnistaman sääte-lyvaste-elementin ja ainakin yhden käyttämättömän 10 pilkkomiskohdan (splice site) (so. alue tai introni, jota rajoittaa (bounded) pilkkomisen tunnistussekvens-sillä mutta jota ei ole pilkottu mRNArsta); -DNA segmentin, joka koodaa rex geeniä, joka puolestaan kykenee ilmentämään mRNA:n poiskuljetuksen 15 tumasta indusoivaa proteiinituotetta; -isäntäsolun, joka on transformoitu rex geeniä koodaavalla DNA segmentillä ja mRNA:ta koodaavalla DNA segmentillä ja jolla on kyky ilmentää rex geenin proteiinituotetta sekä ilmentää mRNA:ta; 20 ii) saatetaan yhteen tämän geneettisen järjestelmän soluja sisältämä viljelmä ja aine, jota epäillään Rex proteiinin spesifiseksi inhibiittoriksi, sellaisissa • ' olosuhteissa, joissa aine menee soluihin; • iii) määritetään ko. aineen vaikutus mRNA.-n, joka si- • 25 sältää käyttämättömän pilkkomiskohdan, poiskuljetuk- ··: seen tumasta; ja iv) määritetään aineen vaikutus mRNA:n pilkotun muo- » don, jonka pilkkomiskohta on käytetty, poiskuljetukseen tumasta; jolloin käyttämättömän pilkkomiskohdan 30 sisältävän mRNA:n poiskuljetuksen vähentyminen ja mRNA:n pilkotun muodon poiskuljetuksen ei-vähentyminen '· ’· osoittaa aineen olevan HTLV-I rex geenin aktiivisuuden ‘tai rex geeni tuotteen aktiivisuuden spesifinen inhi-;*:* biittori; Rex proteiinin tunnistama mRNA säätelyele- ,*··. 35 mentti on edullisesti johdettu HTLV-I, HTLV-II tai *’· HIV-1 viruksen mRNA:sta; 110437 13 edellä määriteltyä identifioimismenetelmää, jossa käyttämättömän pilkkomiskohdan sisältävän mRNA:n poiskuljetuksen vähentyminen detektoidaan edullisesti määrittämällä käyttämättömän pilkkomiskohdan sisältävän 5 mRNA:n koodaaman ensimmäisen proteiinin tuottotaso ja pilkotussa muodossa olevan mRNA:n poiskuljetuksen lisääntyminen detektoidaan edullisesti määrittämällä pilkotussa muodossa olevan mRNA:n koodaaman toisen proteiinin tuottotaso; 10 -edellä määritellyssä identifioimismenetelmässä, jossa säätelyvaste-elementin ja pilkkomiskohdan sisältävää mRNA:ta koodaa plasmidi, joka sisältää HTLV-I provi-ruksen 3'pään mukaanlukien Rex- ja Tax proteiineja koodaavat alueet, täydellisen env geenin, Rex vaste-15 elementin ja koko 3'LTR; ja erityisesti pgTAX-LTR plasmidi, kuten myöhemmin esitetään; ja pRex plasmidi sisältää edullisesti rex geenin; - pgTAX-LTR plasmidia; - reagenssikittiä aineiden seulontaan Rex proteiinin 20 geeniaktivaatiofunktion spesifisen inhibiittorin identifioimiseksi edellä esitetyn menetelmän mukaisesti, joka sisältää: i ’· - DNA segmentin, joka koodaa mRNA:ta, joka * · · j '/ puolestaan sisältää Rex proteiinin tunnistaman sääte- : 25 lyvaste-elementin ja ainakin yhden käyttämättömän — ’ pilkkomiskohdan; - DNA segmentin, joka koodaa rex geeniä, jo ka puolestaan kykenee ilmentymään tuottaen mRNA:n poiskuljetusta tumasta indusoivaa proteiinituotetta; 30 ja - säilytysastian sisältäen isäntäsolun, joka *. on transformoitu rex geeniä koodaavalla DNA segmentil- lä ja mRNA:ta koodaavalla DNA segmentillä ja joka ky-,·;* kenee ilmentämään rex geeniä ja mRNA:n prote- ,···. 35 iinituotetta; - menetelmässä HIV-1, HTLV-I tai HTLV-II replikaation *.·. inhiboimiseksi edellä määritelty DNA segmentti saate- 110437 14 taan soluun, joka kykenee replikoimaan yhden ko. viruksista ja ilmentämään DNA segmenttiä HTLV-I rex funktion transdominantin repressorin tuottamiseksi; ja - menetelmässä HIV-1, HIV-2 ja SIV, erityisesti HIV-1, 5 replikaation inhiboimiseksi, jolloin HIV-1 Rev funktion transdominantti repressori saatetaan HIV-1 infektoituneeseen soluun.

4. KUVIEN SELITYKSET 10 4.1 5.1:tä ja 6.1:tä varten

Kuva 1: HTLV-I rex:n nukleotidi- ja aminohapposekvenssi [aminohappopaikat, jotka on korvattu oligonukleoti-deillä (1) (aminohappopaikat 87, 88, 89) ja (2) (paik-15 ka 94) , on merkitty, kuin myös paikat 82, 90, 91 ja 97. Koko sekvenssi sisältää 567 nukleotidiä koodaten 189 aminohappoa.

Kuva IA: 29 mutaation, jotka on saatettu HTLV-I rex geeniin, sijainnit. HTLV-I rex geeni koodaa 189 ami-20 no-happoproteiinia. Käyttäen paikka-kohdennettua (site-directed) mutaatiota missensesubstituutiot toteutettiin määrätyille aminohappotähteille (merkitty laa- * » i *' tikoilla) ja ne nimettiin niiden sijainnin rex geenis- f « · 5 * ' sä mukaan.

i » 25 Kuva 2A: Rex immunosaostus: SDS/polyakryyliamidigee- ····' lielektroforeettinen analyysi 30 rex mutantin seitse- ,V mästä mutantista Rex immunosaostuksen jälkeen (osoit taa, että pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM13, pcRexM14, pcRexM17 ja pcRexl3Al5 tuottavat yhä Rex 30 proteiinia): A: pgtat (negatiivinen kontrolli Rex vasta-aineelle) B: pcRex ,, t C: pcRexM2 D: pcRexM7 35 E: pcRexM8 1F: pcRexM13 •,*. G: pcRexM14 110437 15 H: pcRexM17 (alempi molekyylipaino tässä juovassa johtuu mahdollisesti muutoksesta tämän proteiinin modifikaatiossa, esim. fosforylaatio) I: pcRexl3Al5

5 Kuva 2B: Mutanttien biologinen fenotyyppi: Kuvan 2A

mukaisesti Tat immunosaostuksen jälkeen: A: pgtat + pXF3 B: pgtat + pcRev C: pgtat + pcRex 10 D: pgtat + pcRexM2 E: pgtat + pcRexM7 F: pgtat + pcRexM8 G: pgtat + pcRexM13 H: pgtat + pcRexM14 15 I: pgtat + pcRexM17 K: pgtat + pcRexl3Al5

Kuva 2C: Kuvan 2B mukaisesti (osoittaa, että eräät Rex mutanteista ovat transdominantteja villityyppiseen 20 Rex:iin nähden, nimittäin pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM14, pcRexM17 ja pcRexl3Al5): A: pgtat + pXF3 + pXF3 i » ; ** B: pgtat + pcRex + pXF3

1 k I

j ‘ / C: pgtat + pcRex + pcRexM2 25 D: pgtat + pcRex + pcRexM7 112 .... E: pgtat + pcRex + pcRexM8 ,V F: pgtat + pcRex + pcRexM13 i » G: pgtat + pcRex + pcRexM14 H: pgtat + pcRex + pcRexM17 30 I: pgtat + pcRex + pcRexl3Al5

Kuva 2D: Kuvan 2B mukaisesti (osoittaa, että eräät Rex 1 ,, mutantit ovat transdominantteja villityyppiseen * » .;· Rev:iin nähden, nimittäin pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8 ja 35 pcRexM13 osittain): i‘. A: pgtat + pXF3 + pXF3 ; .· B: pgtat + pcRev + pXF3 i6 1 10437 C: pgtat + pcRev + pcRexM2 D: pgtat + pcRev + pcRexM7 E: pgtat + pcRev + pcRexM8 F: pgtat + pcRev + pcRexM13 5 G: pgtat + pcRev + pcRexM14 H: pgtat + pcRev + pcRexM17 I: pgtat + pcRev + pcRexl3Al5

Kuva 3: Muodostetut Rex mutantit 10 Kuva 4: 29 oligonukleotidin, jotka on syntetisoitu mu-tatoimaan rex:ä koodaava sekvenssi, sekvenssi.

4.2 5.2:ta ja 6.2:ta varten 15 Kuva 5: HIV-1 rev geeniin saatettujen mutaatioiden sijainnit. HIV-1 rev geeni koodaa 116 aminohappoproteii-nia, joiden ehdotettu sekvenssi on esitetty. Revin kahden koodaavan eksonin välinen raja on merkitty (SP) . "clustered point"-mutaatiot toteutettiin oligo-20 nukleotidi-kohdennetulla mutageneesillä, kuten on osoitettu laatikoiduilla tähteillä. Nämä mutaatiot nimettiin niiden rev:issä sijainnin mukaan, pMl ollessa : ·· kaikkein N-terminaalisin ja pM14 kaikkein C- : terminaalisin. Kaikki saatetut mutaatiot vaikuttivat : 25 2-4 viereiseen aminohappoon ja kaikki (paitsi pM7) ·>·.: toivat ainutlaatuisen Bglll kohdan rev geenisekvenssi·. siin. Ko. tuodut kohdat helpottivat myöhempää N- ja C- terminaalisien deleetio(ρΔ)mutanttien muodostamista. pQmutantit nimetään deleetion 1. poiston laajuuden mu-30 kaan, esim. pAll/14:ssa on tehty poisto saatettujen pMll ja pM14 mutaatioiden välistä.

Kuva 5A: Muiden , HIV-1 rev geeniin saatettujen mis-sense- ja deleetiomutaatioiden sijainti (- = poistettu aminohappo) .

35 Kuva 6: pcREVin DNA- ja vastaava aminohapposekvenssi. Kuva 7: DNA sekvenssi, joka vastaa mutaatiokohtia Ml-M14.

110437 17

Kuva 8: HIV-1 rev ja tat transaktivaattoreiden immu-nosaostus.

Kuva 9: HIV-1 proviraalinen avustus(rescue)määritys . Kuva 10: Rev:n ja valikoitujen Rev mutanttien subsel-5 lulaarinen paikallistuminen epäsuoralla immunofluore-senssillä.

Kuva 11A ja 11B: Rev mutanttien analyysi dominoivan negatiivisen fenotyypin suhteen.

Kuva 12: Rev funktion kompeteiivinen inhibitio.

10 Kuva 12A: HIV-1 rev transaktivaattorin domeenirakenne. 116 aminohappoa sisältävää, täyspitkää proteiinia koo-daa kaksi eksonia, joita erottaa introni, joka suurelta osin vastaa viraalista env geeniä. "Sitova" ja "aktivaatio" domeenit näkyvät viivoitettuina laatikkoina 15 sulkien sisäänsä tähteet 23-56 (suunnilleen) ja vast. 78-83. S= pilkkomiskohta; NL= erittäin perusalue, joka on tärkeä tumapaikallistamiseen ja jolla on huomattavaa samankaltaisuutta "Arg-pitoisen" RNA sitovan alueen kanssa.

20 4.3 5.3:a ja 6.3:a varten i » : '·· Kuva 13: (A) HTLV-I Rex proteiinin aminohapposekvenssi > V ja jokaisen saatetun 25 pistemutaation sijainti. Jo- : 25 kaista laatikoitua aminohappoa koodaavat nukleotidit ····· poistettiin ja korvattiin runkoon (in-frame) aspara- giinihappo-leusiinidipeptidiä koodaavalla oligonukle-otidillä.

(B) Rex-vasteellisen pgTAX-LTR ilmentämisvektorin ra-30 ken-ne. Kartan kohdassa 5013, saatu CR-1 HTLV-I provi-ruksen 3'pää Hindlll kohdasta (M.Seiki et ai., Proc, Nat. Acad. Sei. USA 80 [1983] 3618-3622) 3 ' LTR saakka ·...· saatettiin pBC12/CMV ilmentämisvektoriin. Tämä frag- .·;· mentti sisältää kaksi koodaavaa eksonia Tax:lie (val- .···, 35 koiset laatikot), täydellisen env geenin ja HTLV-I:n koko 3'LTR mukaan-lukien RexRE (RRX) (S.M. Hanly et ai., Genes Deve 1 op. 3_[1989] 1534-1544) .

110437 18

Kuva 14: (A) Rex, mutta ei Rev tai IL-2, aktivoi HTLV- I Env proteiinin ilmentymistä pgTAX-LTR vektorilla. COS solujen ei-yhteen kasvaneet viljelmät transfektoi-tiin sekä pgTAX-LTR:11a että pREXrllä (L. Rimsky et 5 ai., Nature [-il988] 738), pREV:llä (M.H. Malim et ai., Nature 335 [1988] 181-183) tai pCMV-IL-2:11a (B.R.

Cullen, Cell 46 [1986] 973-982). Viimeisestä juovaa varten solut transfektoitiin pREX:llä pgTAX-LTR:n poissaollessa. Env proteiinituotto analysoitiin immu-10 nosaostuksella ja elektroforeesilla. Vasemmalla on esitetty tunnettujen molekyylipainostandardien liikkuminen .

(B) rex mutanttien Rex funktion analyysi. pBC12/CMV ilmentämisvektoriin saattamisen jälkeen, jokainen 25 15 rex mutantista (merkitty: M1-M18 ja M21-M27, ks. kuva 13A; mutantteja, jotka on merkitty M19 ja M20 ei ole muodostettu) transfektoitiin yhdessä pgTAX-LTR kanssa ja viljelmät analysoitiin Rex-riippuvaisen HTLV-I Env proteiinin ilmentymisen suhteen esimerkissä 12 kuvatun 20 mukaisesti.

Kuva 15: Immunosaostuksella suoritettu samanaikainen ' ‘ analyysi HTLV-I Env, Tax ja Rex proteiineille COS so- ; '·· luissa, jotka transfektoitiin pgTAX-LTR: llä ja inak- ; tiivisilla- (Ml, M2, M6, M7, M13) tai heikentyneillä 25 (M15) Rex mutanteilla tai villityyppisillä pREX-, pREV- ja pCMV-IL-2 vektoreilla. (A) Env tuotto; (B) Tax tuotto; (C) villityyppinen ja mutantti Rex proteiinituotto.

Kuva 16: HTLV-I Rex mutanttien subsellulaarinen pai- 30 kallistaminen immunofluoresenssillä. Villityyppinen-, M6-, M7- ja M13 Rex proteiini sijaitsevat ilmentävien ,'·· solujen tumajyväsissä ja tumissa. Sitä vastoin Ml Rex !>>#· proteiini detektoidaan ainoastaan sytoplasmasta, kun .·;· taas M2 proteiini on jakautunut kaikkialle soluun. M15 35 mutantti sijaitsee ilmentävien solujen tumissa, mutta villityyppiselle Rex proteiinille vastakkaisesti sitä ''I/· ei näytä olevan tumajyväsissä.

110437 19

Kuva 17: (A) Analyysi rex mutanttien kyvystä inhiboida villityyppisen Rex proteiinin funktiota. Jokainen viljelmä transfektoitiin pgTAX-LTR:llä, pREX:llä sekä jollakin seuraavista: Rex mutantti, (juovat 1-6), pREX 5 (juova 7) , pREV (juova 8) tai pCMV-IL-2 (juova 9) . HTLV-I Env tuotto analysoitiin kuvan 14 mukaisesti.

(B) HTLV-I rex transdominantit mutantit inhiboivat HIV-1 Rev proteiinin funktiota. Solut transfektoitiin pgTAT:11a, pREV:llä ja pBC/CMV-IL-2:11a tai M6, M7 ja 10 M13 transdominanteilla Rex mutanteilla ja niistä mää ritettiin Tat proteiinin lyhennetyn (truncated) 72 aminohappomuodon (juova 2) Rev-indusoitu tuotto. M6, M7 ja M13 (juovat 3-5) inhiboivat täydellisesti HIV-1 Rev proteiinin, sillä voitiin havaita ainoastaan Tat 15 proteiinin täyspitkä 86 aminohappomuoto.

(C) HTLV-I transdominantit Rex mutantit blokkaavat rev-vajaan HIV-1 proviruksen replikaation Rex avustusta. Solut transfektoitiin rev-vajaalla HIV-1 provirus-plas-midilla ja pREX:llä tietyn Ml-, M6-, M7- ja M13 20 mutanttiylimäärän läsnäollessa. HIV-1 p24 Gag proteiinin supernatanttitasot määritettiin.

5. YKSITYISKOHTAINEN KUVAUS

i · 25 Esillä olevan keksinnön toteutuksessa käytet- .tiin alalla yleisesti tunnettuja menetelmiä ja teknii- ;· koita.

♦ » ·

Viruslajilla tarkoitetaan tässä yhteydessä taksonomisesti selviä lajeja, kuten HTLV-I, HTLV-II, 30 SIV, HIV-1 ja HIV-2. Keksintö koskee erityisesti ret-roviruksia, etenkin ihmisen retroviruksia.

Geenit, joiden ilmentymistä keksinnön on tar-koitus repressoida, ovat edullisesti ei-toivottavaa ominaisuutta, kuten toimintoa, jonka tuloksena on pro-35 viruksen aktivoituminen ja kypsyminen infektoivaksi ;·’ partikkeliksi, koodaavia geenejä, esim. HIV-1 :n ja : HIVa2:n rev.

110437 20 Tässä yhteydessä käytetyt rev ja Rev tarkoittavat HIV-1 rev ja vast. HIV-1 Rev, ellei toisin mainita. Siten muiden viruslajien ,kuten HIV-2:n, ekviva-1 lentteja rev:ä ja Rev:ä merkitään "HIV-2 rev (rev2) 11 5 ja vast. "HIV-2 Rev (Rev2)" jne.

Mikäli valmistusta ei ole erikseen kuvattu, yhdisteet, vektorit, solulinjat, jne., joita käytetään lähtömateriaaleina tai reagensseina, ovat tunnettuja ja yleisesti saatavilla tai ne voidaan saada konven-10 tionaaliseen tapaan tunnetuista ja yleisesti saatavilla olevista materiaaleista, tai ekvivalentteja materiaaleja voidaan valmistaa konventionaaliseen tapaan tunnetuista ja yleisesti saatavilla olevista materiaaleista. Siten esim. Rex geeni voidaan ottaa talteen 15 mistä tahansa HTLV-I eristyksestä ja Rev geeni mistä tahansa HIV-1 eristyksestä sekä pgTAX-LTR voidaan ottaa talteen esim. HUT102:sta tai MTl:stä. Vaihtoehtoisesti, geenit voidaan muodostaa kemiallisen synteesin avulla geneettisen koodin mukaisesti halutun aminohap-20 posekvenssin omaavan proteiinin tuottamiseksi. Rex - tai Rev funktion transdominantti repressori valmiste-: taan standardirekombinantti DNA menetelmillä tai pep- | tidisynteesille standardikemiallisilla menetelmillä, tai näiden menetelmien kombinaatiolla, jotka ovat 25 kaikki konventionaalisia menetelmiä.

5.1 HTLV-I:ssä olevan Rex funktion transdominan-30 tit repressorit, erityisesti sellaiset HTLV-I:n Rex funktion repressorit ovat aktiivisia myös HIV-1:ssa !/··’ olevalle, funktionaalisesti ekvivalentille, mutta ra- kenteellisesti ei-läheiselle Rev funktiolle.

.!.* Täsmällisemmin, muodostettiin modifiotuja rex 35 koodaavia sekvenssejä, saatettiin ne ilmentymään ja ’*;·[ niiden havaittiin omaavan edellä esitetyn ominaisuu- : :': den.

21 110437

Villityypisen rex:n koodaavaa sekvenssiä muutettiin käyttäen valmista mutageneesijärjestelmää "Oligonucleotide-directed in vitro mutagenesis system Version 2" Amersham, Englanti (1988), koodi RPN.1523, 5 josta käytetään myöhemmin lyhennystä "Amershamin menetelmä" . Lopullisten ilmentämisvektoreiden muodostus toteutettiin seuraavien peräkkäisten vaiheiden mukaisesti: 1) Bakteriofagi M13 vektorin, joka sisältää rex:ä koodaavan sekvenssin, valmistus, 10 2) rex:ä koodaavan sekvenssin mutageneesi, ja 3) Mutatoidun geenin uudelleenkloonaus nisäkäs-ilmentämisplasmideihin.

Muodostettiin 30 mutanttia, joihin sisältyi yksi deleetio mutantti. 29 paikka(site)-kohdennetun 15 mutaation paikka ja luonne on esitetty kuvassa 3. Mu- tageneesissä käytetyt vastaavat oligonukleotidit on luetteloitu kuvassa 4. Niissä kaikissa on Bglll rest-rik-tiokohta.

rex»:ä koodaava sekvenssi eristettiin pcRex 20 (= pRex) plasmidista (L. Rimsky et ai., Nature 335

[1988] 738) . Myös muista lähteistä saatua villityyp- * pistä rex geeniä voidaan käyttää. Siten rex geeni voi- : daan kloonata esim. analogisesti HTLV-I:n gag-, pol-, :*'· env- ja tax geeneille julkaisussa, B.K. De ja A. Sri- i - 25 nivasan, Nucl. Ac. Res. 17 no.5 (1989) 2142, kuvatun kanssa muodostettujen HTLV-I-infektoitujen solulinjo-jen, kuten HUT102 (TIB 162) ja MT2, koko genomista (J.G. Sodroski et. ai., Science 225 [1984] 381; I.

Miyoshi et ai., Nature 294 [1981] 770; V. Manzari et 30 ai., PNAS 80 [1983] 1574), käyttäen esim. polyme raasiketjureaktiota .

Tat:ia ja rev: iä koodaavat sekvenssit eris-tettiin pgTat ja pcRev plasmideista (M.H. Malim et ai., Nature 335 [1988] 181). Ne voidaan vaihtoehtoi- « · ‘.. 35 sesti eristää esim. HIV proviruskloonista, kuten lamb- daHXBZ, (Katalogi no 70, AIDS Research and Reference : : : Reagent Program, kesäkuu 1989, NIH) .

< i » * * 110437 22

Saatujen erilaisten rex geenien biologinen aktiivisuus testattiin herkkyysmäärityksellä HIV-1 rev- ja HTLV-I rex geenituotteiden toiminnan suhteen 1 ilmentämällä eri geenejä COS soluissa (Gluzman et ai., 5 Cell 23 [1981] 175. Viraalisten rakenneproteiinien synteesin alkuunpanon lisäksi Rev- ja Rex proteiinit indusoivat kumpikin HIV-1 Tat säätelyproteiinin lyhennetyn muodon tuottoa (M.H. Malim et ai., Nature 335 [1988] 181-183; L. Rimsky et ai., Nature 335 [1988] 10 738-740). Genomisen HIV-1 tat geenin ja funktionaalisen HIV-1 rev- tai HTLV-I rex geenin yhteisilmentymi-nen johtaa pilkkomattoman tat mRNA:n, joka koodaa

Tatin lyhennettyä, pituudeltaan 72 aminohappoa olevaa yksi-eksonimuotoa, sytoplasma-ilmentymiseen. Funktio-15 naalisen Rev- tai Rex proteiinin puuttuminen mahdollistaa 86 aminohappoa käsittävän täyspitkän Tat proteiinin, joka vastaa Tatin kaksi-eksonimuotoa, ilmentymisen. Siten aktiivisen rev- tai rex funktion trans-repressorin läsnäolo johtaa vähentyneeseen tai hävin-20 neeseen 72 aminohapon Tat proteiinin tuottoon. Tämä ero voidaan osoittaa helposti immunosaostus-: analyysillä.

: ’· Kuten kuvasta 2C näkyy, 30 mutantista löydet- :*·'· tiin 6, nimittäin pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM14, 25 pcRexM17 ja pcRexl3Al5·, joissa oli transdominantti ,...· Rex repressori. Vastaavanlainen tilanne havaittiin SS, pcRevin tapauksessa (ks. kuva 2D), nimittäin ( I · pcRexM2:lle, pcRe-xM7:lie, pcRexM8ille ja osittain pcRexM13:lie, mikä osoittaa, että transdominoivuus ei 30 rajoitu HTLV-I geeniin ja että eräät mutantit ovat transdominantteja molemmille geeneille, nimittäin, tässä erityisessä tapauksessa, pcRexM2, pcRexM7 ja : pcRexM8.

Vaikka eräiden ensin saatujen tuloksien pe- * · 35 rusteella näytti siltä, että kaikkein onnistuneimmat mutaatiot sijaitsivat aminohappopaikkavälillä 87 ja ; : 94, viitaten siihen, että rex/rev geenin osa, joka si- 110437 23 jaitsi n. aminohappopaikkavälillä 82-97, oli erityisen merkittävä transdominanttien Rex/Rev repressoreiden muodostamisessa, niin lisäkokeet ovat osoittaneet, että Rex proteiinissa olevien edullisten mutaatiopaikko-5 jen väli on laajempi, so. mutaatiot voivat sijaita ainakin niin lähellä N-terminaalia kuin aminohappopa!-kassa 22 ja ainakin niin kauas kohti C-terminaalia kuin aminohappopaikkaan 101.

10 5.2

On mahdollista, että eräät HIV-l:n Rev funktion transdominantit rev repressorit inhiboisivat myös ainakin HTLV-I:n tai HTLV-II:n Rex funktiota. Tätä ei ole kuitenkaan testattu tässä yhteydessä.

15 Toisaalta on havaittu, että eräät näistä in hiboivat ainakin myös HIV-2:n ja SlVmacm Rev funktiota .

Laajat mutaatioanalyysit ovat edelleen johtaneet rev:ssä olevien ainakin kahden funktionaalisen 20 domeenin, jotka näyttäisivät olevan oleellisia trans-aktivaatiossa, hahmottamiseen. Näiden domeenien olete-taan sisältävän "sitovan domeenin", joka kohdistaa Rev f * • proteiinin sen sopivaan kohdesubstraattiin, ja "akti- *'* vaatiodomeenin", joka mahdollistaa sitoutumistapahtu- • · ."* 25 man funktionaalisten seurauksien, transkriptiivisen .... aktivaation, tapahtumisen.

Siten määritellään rev:iin sisältyvät kaksi i » · ' funktionaalista domeenia: sitova domeeni, joka toden näköisesti kohdistaa Rev proteiinin sen sellulaarikoh- 30 teeseen, ja aktivaatiodomeeni, joka mahdollistaa epätäydellisestä pilkkoutuneiden, Gag ja Env rakennepro- • » '/· teiineja koodaavien RNA:iden poiskuljetuksen tumasta.

Rev: n aktivaatiodomeenin mutaatio aiheuttaa vajaan (defective) Rev proteiinin, joka toimii Rev funktion > » 35 transdominanttina inhibiittorina, ilmentymisen. Täl- ’•;'f laiset mutantit inhiboivat merkittävästi HIV-1 repli- , kaatiota ilmentyessään transfektoiduissa soluviljel- 110437 24 missä ja ovat siten myös transdominantteja, kuten kohdan 5.1 mutantit.

Myöhempi kohta 6.2 sisältää myös yksityiskoh-' täistä informaatiota tästä toisesta sovellutuksesta.

5 Tähän liittyviä , löydettyjä mutantteja ovat pMIO, pA9/14 ja pAlO/14 (ks. esimerkit 4-11) ja pM21, pM22, pM27, pM28, pM29 ja pM32 (ks. esimerkit 11a ja 11b), joista pMIO;n havaittiin olevan tehokas ei ainoastaan HIV-1 rev geeni funktion, mutta myös HIV-2 rev- ja 10 SIVmac rev geenifunktion inhiboimisessa.

Näistä yhdeksästä mutantista ovat edullisia pMIO, pM21 ja pM32, erityisesti pMIO.

5.3 15 On tutkittu HTLV-I:n Rex funktioon liittyviä transdominantteja rex repressoreita ja menetelmää, jolla mahdollistetaan Rex aktiivisuuksien detektointi ja joka on hyödyllinen Rex funktion spesifisten inhi-biittoreiden, jotka eivät häiritse tavallisesti muita 20 viraalisia- tai isäntäsolun funktioita, identifioimisessa. Tässä Rex inhibiittorin määritysmenetelmässä ··· hyödynnetään geneettistä järjestelmää, joka sisältää

Rex-vasteellisen "reportteri" geenin, joka koodaa sää-telyelementin, esim. RexRE (RRX), sisältävää, pilkko-25 mattomassa muodossa olevaa mRNA:ta. Tässä järjestelmässä Rex funktion edellyttävä proteiini indusoi ko. pilkkomattoman mRNA:n poiskuljetuksen solutumasta sy-' toplasmaan. Rex funktion puuttuessa tämä mRNA pilkkou tuu ennen poiskuljetusta sytoplasmaan edellä esitetyn 30 mukaisesti. Kun aine, jonka epäillään olevan Rex funktion inhibiittori, on joutunut kontaktiin ko. geneet-tisen järjestelmän sisältävien solujen kanssa, niin aineen aikaansaama HTLV-I Rex funktion spesifinen in-·'· hibitio havaitaan tämän erityisen mRNA:n pilkkomatto- '.· 35 man muodon poiskuljetuksen tumasta vähenemisenä sekä tämän saman mRNA:n pilkotun muodon poiskuljetuksen tu-. .·. masta ei-vähenemisenä. Tämä menetelmä on hyödyllinen 110437 25 määritettäessä esim. HTLV-I Rex proteiinin kemiallisia inhibiittoreita, kuten inhibiittoreita, jotka kykenevät jäljittelemään mutantissa Rex- tai Rev proteiinissa olevaa transdominanttia domeenia, esim. matalan mo-5 lekyylipainon omaavia kemiallisia inhibiittoreita, kuin myös Rex:n transdominantteja mutanttimuotoja, jotka käyttäytyvät kuten Rex:n repressorit.

rex geenin transdominanttien mutaatioiden identifioimiseksi tuotettiin jälleen sarja pistemutaa-10 tioita, jotka muuttivat kahden tai kolmen aminohapon segmenttejä eri kohdissa Rex proteiinin lineaarista sekvenssiä, ja näistä mutanteista identifioitiin useita HTLV-I Rex proteiinifunktion transdominantteja rep-ressoreita, joista eräät repressoivat transdominoivas-15 ti lisäksi HTLV-II Rex- ja/tai HIV-1 Rev prote-iinifunktiota, ja siten, analogisesti eräiden kohdan 5.1 mutanttien kanssa, repressoivat siten myös useamman kuin yhden viruslajin funktionaalisesti ekviva lenttien geenien fenotyyppistä ilmentymistä.

20 Vastaavasti menetelmä Rex proteiinin geeniak- tivaatiofunktion spesifisen inhibiittorin identifioi- miseksi sisältäen kohdassa 3. määritellyt vaiheet. Ku-. ten yllä on esitetty HTLV-I Rex proteiini kykenee kor- .·, vaarnaan HIV-1 Rev proteiinin funktion. Lisäksi nyt on 25 havaittu, että analoginen HTLV-II säätelyproteiini voidaan korvata Rexrllä. Tällöin tässä menetelmässä voidaan käyttää minkä tahansa näiden kolmen viruksen mRNAiita, joilla on Rex:n tunnistama vaste-elementti ja ainakin yksi sopiva käyttämätön pilkkomiskohta.

30 Vaste-elementin ja pilkkomiskohdan sisältävää mRNA.-ta koodaa edullisesti plasmidi, joka sisältää : HTLV-I proviruksen 3'pään mukaanlukien Rex- ja Tax proteiinien koodaavat alueet, täydellisen env geenin, *’· Rex vaste-elementin RexRE (RRX) ja koko 3 ' LTR:n. Esi- 35 merkkinä tällaisesta plasmidista mainittakoon pgTAX-:>it· LTR. Mutanttianalyysin, jota tarvitaan mutanttien rex , geenikopioiden ja villityyppisten rex geenikopioiden 110437 26 välisen suhteen kontrollointiin, helpottamiseksi pgTAX-LTR:ssä oleva rex geeni inaktivoidaan resessiivisellä negatiivisella mutaatiolla ja tässä järjestelmässä aktiivinen rex geeni sisällytetään erilliseen 5 plasmidiin, pREX:iin. Kuitenkin, esim. kemikaalien testauksessa, aktiivinen rex geeni voi sijaita samassa plasmidissa tai toisessa DNA vektorissa kuin tämän järjestelmän vaadittu mRNA. Tämä aktiivinen rex geeni voi myös koostua luonnon sekvenssivariantista, joka on 10 eristetty jostain muusta HTLV-I kannasta kuin keksinnössä käytetystä kannasta, tai se voi olla mikä tahansa muu rex geenin mutanttimuoto, joka kykenee ilmentymään tuottaen proteiinituotetta, joka aikaansaa Rex proteiinin geeniaktivaatiofunktion mukaanlukien induk-15 tion ko. mRNA:n poiskuljettamiseksi tumasta.

Edellä esitetyt geneettisen järjestelmän elementit voidaan saada myös käyttämällä DNA segmenttiä, joka koodaa retroviruksen koko funktionaalista geno-mia, osana tätä järjestelmää; sitä voidaan käyttää so-20 lujen infektoimiseen. Kuitenkin, turvallisuus- ja mukavuussyistä, tämä geneettinen järjestelmä on edulli-;··: sesti kykenemätön tuottamaan infektoivaa virusta. Tämä X, aikaansaadaan muodostamalla järjestelmään geneettisen vajauksen, joka estää ainakin yhden viraalisen aktii-, ·· 25 visuuden ilmentymisen, joka aktiivisuus on välttämätön infektoivan viruksen, josta jotain geneettistä elementtiä on käytetty, tuottamiselle. Tämä voidaan to-’·' ' teuttaa jättämällä järjestelmässä yhdestä virusgeenis- tä ainakin osa pois tai jollakin muulla mutaatiolla.

30 Isäntäsolusta, joka on transformoitu rex gee nillä ja mRNA:ta koodaavalla segmentillä, on edullise-na esimerkkinä COS solut, jotka on transfektoitu plas-.·** midivektoreilla edellä esitetyn mukaisesti. Siten täs- ; · sä yhteydessä käytetty termi "transformaatio" sisältää '·’ 35 termin " transfektio" ja se tarkoittaa geneettistä transformaatiota DNA vektorilla, joka koodaa infek-. toivaa ainetta, erityisesti virusta. Transfektion jäi- 110437 27 keen tällainen vektori voi levitä viljelmässä muutamista transformoiduista soluista suurimpaan osaan soluja infektoivien viruspartikkeleiden välityksellä, jolloin saadaan suurempi näytemäärä mielenkiinnon koh-5 teenä olevia geenejä ilmentäviä isäntäsoluja. Lisäksi isäntäsolujen transformaation ei tarvitse tuottaa pysyviä rakenteita keksinnön kohteena olevassa geneettisessä järjestelmässä; voidaan käyttää joko stabiilia tai lyhytaikaista ilmentämisjärjestelmää halutun 10 mRNA:n ja rex geenin tuottamiseksi. Siten voidaan käyttää lukuisia erilaisia tunnettuja ilmentämisjärjestelmiä inhibiittoreiden identifioimiseksi keksinnön mukaisella menetelmällä.

Tässä menetelmässä käyttämättömän pilkkomis-15 kohdan sisältävän mRNA:n poiskuljetuksen vähentyminen yhdessä tämän mRNA:n pilkotun muodon poiskuljetuksen ei-vähentymisen kanssa osoittavat, että aine on HTLV-I rex geenin aktiivisuuden tai rex geenituotteen aktiivisuuden spesifinen inhibiittori. Esillä olevan kek-20 sinnön mukaisella menetelmällä spesifiseksi inhibiit toriksi todetun kemiallisen aineen tapauksessa vaiku-·,··· tusmalli voi pääpirteittäin käsittää mRNA:n transkrip- r. tion tai translaaton spesifisen inhibition. Vaikutus- mallit kuitenkin todennäköisemmin käsittävät Rex pro-25 teiinin yhden tai useamman aktiivisuuden, mukaanlukien tumajyväspaikallistamisen, Rex vaste-elementin tunnistamisen tai Rex efektorifunktion spesifisen inhibiti-’.* · on.

Edullisesti, käyttämättömän pilkkomiskohdan 30 sisältävän mRNA:n poiskuljetuksen tumasta vähentyminen detektoidaan määrittämällä ensimmäisen proteiinin : tuottotaso, jota ensimmäistä proteiinia koodaa käyttä- ,**· mättömän pilkkomi skohdan sisältävä mRNA (so. vain mRNA:n pilkkomaton muoto koodaa tätä ensimmäistä pro-V 35 teiinia); ja mRNA:n liittyneen muodon poiskuljetuksen :iit‘ tumasta lisääntyminen detektoidaan määrittämällä toi- 110437 28 sen proteiinin tuottotaso, jota toista proteiinia koo-daa ko. mRNA:n liittynyt muoto.

Edullisesti, mRNA:n pilkkomaton muoto koodaa ' HTLV-I Env proteiinia. Pilkkomalla tämä mRNA saadaan 5 lyhyempi mRNA, joka koodaa toista HTLV-I proteiinia, Tax:ia. Esim. alla esimerkeissä 12 ja 13 pilkkomaton mRNA:n, joka sisältää RexRE (RRX) elementin, poiskuljetus tumasta määritetään Env proteiinin ilmentymisestä. Edelleen, pilkkomattoman mRNA:n sellaisen poiskul-10 jetuksen inhibitio, joka johtuu Rex funktion inhibiti-osta, detektoidaan Env proteiinin tuoton vähentymisenä. Kuitenkin, koska tämä vähentyminen voi johtua myös aineen jonkinlaisesta yleisestä toksisuudesta virukselle tai isäntäsolulle, niin rex geenifunktion spesi-15 finen inhibitio osoitetaan Env ilmentymisen vähentymisenä sekä mRNA:n liittyneen muodon poiskuljetuksen ei-vähentymisenä, mikä näkyy HTLV-I Tax proteiinin tuoton ei-vähentymisenä. Siten suoritetaan edullisesti samanaikainen HTLV-I Env, Tax ja Rex proteiinin ilmentymi-20 sen analyysi.

Esim. alla esimerkeissä 12 ja 13 esitetty .» Env- ja Tax proteiinien ilmentyminen määritetään immu- ;·, nosaostamalla sopivilla vasta-aineilla ja saatujen sa- * 3 · !»_. ostumien elektroforeettisella analyysillä. Vaihtoeh- 25 töinä, esim. näytteiden seulomiseksi suuressa mitta- kaavassa Rex funktion spesifisen inhibition suhteen, mainittakoon esim. entsyymisidottu immunomääri-·.* tys (ELISA)menetelmät Env: lie ja Tax: lie tai mRNA:n muuttaminen geeniteknisesti joidenkin muiden, helpom-30 min käsiteltävien tuotteiden aikaansaamiseksi, joilla

tuotteilla voidaan puolestaan osoittaa pilkotun ja .*, · pilkkomat toman muodon ilmentyminen. Esimerkiksi, mRNA

voidaan muuttaa koodaamaan entsyymiä, joka on detek-|. toitavissa lisäämällä väritöntä substraattia, joka V 35 muodostaa värin hydrolysoituessaan, kuten E.coli β- galaktosidaasi. Mikäli tälle entsyymille tarkoitettu geeni viedään env geenin paikalle, niin pilkkomaton 110437 29 mRNA muoto kykenee tuottamaan tätä entsyymiä, kun taas pilkottu muoto ei kykene. Toinen vastaavanlainen sopiva indikaattorigeeni voisi olla mRNA:n koodaama siten, että se ilmentyisi pilkotussa mRNA muodossa, esim.

5 fuusioituneena Tax sekvensseihin. Alan ammattilaisen on helppo toteuttaa myös muunlaisia variaatioita yllä esitetyille sovellutuksille nopeaa ja tehokasta mas-saseulontaa varten.

Reagenssikitti aineiden seulomista varten 10 identifioitaessa edellä esitetyllä menetelmällä Rex proteiinin geeniaktivaatiofunktion spesifisiä inhi-biittoreita sisältää edellä kohdassa 3. luetteloidut aineet. Tämä kitti sisältää valinnaisesti lisäksi: kasvatusalustan solujen kasvatusta varten; reagensse-15 ja, joita käytetään määrittämään joko pilkotun tai pilkkomattoman reportteri mRNA muodon poiskuljetusta tumasta määrityksen tapahtuessa joko suoraan esim. nukleiinihappohybridisaatiolla tai epäsuorasta immunologisella detektioinnilla esim. tämän mRNA:n pilkotun 20 tai pilkkomattoman muodon proteiinituotteiden suhteen; ja/tai käyttöohjeet kitin eri komponenteille keksinnön , mukaisen menetelmän toteuttamiseksi.

Yllä esitettyä menetelmää on käytetty erilaisten rex geenimutanttien seulontaan dominanttien • ; 25 negatiivisten mutaatioiden suhteen. Kun näitä rex gee- nimutantteja ilmennettiin yhdessä pgTAX-LTR plasmidin • kanssa keksinnön mukaisessa Rex inhibiittorimääritys- · järjestelmässä, niin löydettiin mutaatioluokka, joka on samanlainen kuin kohdassa 5.1 esitetty ja joka si- 30 sälsi aminohapposubtituutioita Rex proteiinin paikassa 59-60, 64-65 ja 119-121, jolloin saaduista proteii- ·, ; neista ei vain puuttunut Rex funktio, vaan ne myös toimivat villityyppisen Rex proteiinin funktion trans-dominantteina repressoreina sekä edelleen villityyppi- · / · 35 sen Rev proteiinin funktion transdominantteina repres- soreina.

110437 30 Tämä mutaatioanalyysi tuotti myös toisen negatiivisten mutanttiluokan, joka sisälsi substituutioita Rex aminohappopaikoissa 5-7 ja 14-15 ja josta puuttui Rex funktio. Näiden mutanttiproteiinien toi-5 minto ei kohdistunut asianmukaisesti solutumaan eikä transdominoivuuteen. Edelleen, kolmas negatiivisten mutanttien luokka, josta esimerkkinä yksi mutantti, jolla oli substituutioita Rex aminohappopaikoissa 141-143, säilytti osittain Rex funktion ja se kohdistui 10 tumaan, mutta epäonnistui paikallistumisessa tuman tu-majyväsalueelle; tämä mutanttiproteiini ei myöskään ollut HTLV-I Rex funktion transdominantti repressori. Näiden tulosten perusteella on mahdollista, että tuma-jyväspaikallistamisaktiviteetti liittyy joihinkin mui-15 hin sekvensseihin, kuin aminoterminaalista identifioituihin, positiivisesti varattuihin tähteisiin (H.Siomi et ai., "Cell 55 [1988] 197-209). Lisäksi havainnot viittaisivat siihen, että kyetäkseen toimimaan Rex funktion transdominanttina repressorina Rex prote-20 iinimutantin täytyy omata ilmeisesti Rex proteiinin tumakohdistusaktiivisuuden lisäksi myös selvän tumajy-väspaikallistamisaktiivisuuden.

Nämä Rex mutanteista tehdyt havainnot määrittelevät likimääräiset rajat myös ainakin kahdelle 25 funktionaalisesti selvälle peptididomeenille Rex proteiinissa ensimmäisen domeenin liittyessä tuma- ja tu-majyväskohdistamiseen ja toisen liittyessä efektoriak-·' tiivisuuteen. Rex mutanttien, jotka ovat puutteellisia tumakohdistuksessa, mutaatiot sijaitsevat Rex:n amino-30 terminaalin positiivisesti varatussa peptididomeenis-sa, jonka on aiemmin osoitettu toimivan tumajyväspai-,: kallistamissignaalina; kun aminoterminaaliset 20 ami- nohappoa sisältävä peptidi liitettiin toiseen proteii-niin rekombinantti DNA menetelmin, niin tämä domeeni 35 indusoi ko. proteiinille sekä tumakohdi s tuksen, että itumajyväspaikallistamisen Rex:lie havaitun mallin mu-V kaisesti (H. Siomi et ai., [1988] supra). Siten ei ole 110437 31 todennäköistä, että mutantti, jossa mutaatio on Rex:n aminohappopaikoissa 141-143 sijaitsee alueella, joka on välttämätön tumajyväspaikallistamiseen, vaikka tämä mutantti kohdistuikin tumaan, mutta epäonnistui pai-5 kallistumisessa tuman tumajyväsalueelle. Pikemminkin muutos tässä mutantissa vaikuttaa todennäköisimmin epäsuorasti Rex:n tumajyväspaikallistamisfunktioon aminoterminaalidomeenissa, esim. proteiinin laskostumiseen liittyvän häiriön välityksellä.

10 Toinen pääasiallinen, funktionaalisesti selvä

Rex:n domeeni käsittää aminohapot 59-60 (tyrosiini-isoleusiini), 64-65 (tyrosiini-tryptofaani) ja 119-121 (treoniini-fenyylialaniini-histidiini). Muutos jokaisessa näissä epäjatkuvissa kohdissa (M6, M7 ja M13 mu-15 tantit) aiheuttaa sellaisen Rex proteiinin tuoton, jolta puuttuu biologinen aktiivisuus ja joka omaa transdominantteja inhiboivia ominaisuuksia. Viisi erilaista mutaatiota, joilla ei ole vaikutusta Rex funktioon, erottavat M6 ja M7 alueen M13 alueesta Rex pro-20 teiinin lineaarisessa sekvenssissä viitaten , että näiden kahden epäjatkuvan alueen vuorovaikutus tässä funktionaalisessa domeenissa voi edellyttää asianmu-;·, kaisen laskostuksen. Näin ollen Rex proteiinin koko lineaarinen osa mukaanlukien nämä kaksi aminohappoalu-'25 että, jotka ovat kaikkein kriittisempiä Rex efektori- ·’ funktiolle, näyttää myötävaikuttavan Rex proteiinin efektorifunktioon ja tämän vuoksi se edustaa domeenia, ·.· · joka täytyy mutatoida Rex:n transdominanttien repres- soreiden tuottamiseksi.

30 Esillä olevan keksinnön avulla ei pystytä paikallistamaan Rex:n domeenia, jossa sijaitsee : mRNArssa olevan RexRE:n (RRX) tunnistamiseen tarvitta va aktiivisuus. Vastaavasti ei tiedetä tarvitseeko mu-'!*. tantin rex proteiinin, Rex funktion transdominanttina 35 repressorina toimiakseen, säilyttää kyky sitoutua : : (suoraan tai epäsuorasti) RexRE:iin tai jonkin muun ,·’ Rex:n tunnistaman viruksen tunnistuselementtiin.

110437 32 DNA segmentti, joka koodaa HTLV-I Rex proteiinin funktion transdominanttia repressoria, kuin myös tällainen transdominantti repressori. Ko. repre ssori on proteiini, joka on modifioitu muoto Rex pro-5 teiinin villityyppisestä muodosta ja on saatu ainakin yhden mutaation, joka vaikuttaa negatiivisesti Rex proteiinin efektoriaktiivisuuteen, kautta. Tällaisella repressorilla on oleellisesti myös Rex proteiinin vil-lityyppisen muodon tumajyväspaikallistamisaktiivisuus.

10 Tämän repressorin negatiivinen mutaatio vaikuttaa erityisesti aminohappoon villityyppisessä Rex proteiinin peptididomeenissa, joka sisältää aminohapot aminohap-popaikasta n. 59-121, erityisemmin johonkin seuraavis-ta paikoista: 59, 60, 64, 65, 119, 120 ja 121. Rex 15 repressoria koodaavasta DNA segmentistä mainittakoon esimerkkinä seuraavat mutantit rex geenit: M6, M7, M13 sekä näiden muunnelmat ja johdannaiset, jotka omaavat HTLV-I Rev proteiinifunktion transdominanttia repressiota.

20 Tämän DNA segmentin sekvenssi voidaan johtaa minkä tahansa HTLV-I eristyksen Rex geenistä (L. Rims- -j ky et ai., Nature 335 [1988] 738-740; M. Seiki et ai.,

Science 227 [1985] 1227-1229) tai se muodostetaan ke miallisella synteesillä. Rex funktion transdominantti ! 25 repressori valmistetaan standardirekombinantti DNA menetelmin tai peptidisynteesien yhteydestä tunnetuin standardikemiallisin menetelmin tai näiden menetelmien kombinaation kautta, jotka ovat kaikki hyvin tunnettuja geenitekniikan alueella.

30 Mutaatiot, jotka vaikuttavat negatiivisesti

Rex proteiinin vaikutusaktiivisuuteen, on esitetty : esimerkein. Kuitenkin, muunkinlaiset mutaatiot, jotka on suunniteltu aikaansaamaan paikallisia vaikutuksia proteiinirakenteeseen näissä samoissa aminohappopa i-’.· 35 koissa tai niiden läheisyydessä, ovat myös erittäin :(ΐι· todennäköisiä Rex:n muunnelmien tai johdannaisten, , .· jotka omaavat keksinnön mukaista HTLV-I Rex prote- 110437 33 iinifunktion transdominanttia repressiota, tuottajia. Tällaisiin paikallisiin vajauksiin kuuluu esim. yksittäisten aminohappojen deleetiot tai insertiot, tai kemiallisesti tai rakenteellisesti samankaltaisten ami-5 nohappojen substituutiot. Toisaaltaa laajemmat deleetiot tai insertiot (vieminen), tai sekundääristä rakennetta häiritsevät substituutiot (esim. proliini β-laskos(sheet)alueella), vaikuttavat erittäin todennäköisesti proteiinin kaukaisempiin osiin proteiinin 10 laskostumisen johdosta; siten tällaiset mutaatiot mainituissa paikoissa domeenia, joka tarvitaan Rex efek-torifunktiota varten, eivät todennäköisesti tuota mu-tantteja Rex proteiineja, jotka säilyttäisivät oleellisesti Rex proteiinin villityyppisen muodon tumajy-15 väspaikallistamisaktiivisuuden.

Kohdan 5.3 transdominantteja Rex mutantteja testattiin myös niiden Rev funktion inhibition suhteen ja niiden havaittiin olevan myös HIV-1 Rev:n represso-reita. Tämän transdominantin Rex mutanttiluokan anti-20 viruspotentiaali osoitettiin käyttämällä HIV-1 repli-kaation inhibointimääritystä.

Nyt on lisäksi keksitty, kuten edellä on mai-nittu, että analoginen HTLV-II säätelyproteiini voi-• · daan korvata HTLV-I Rex:llä, vaikka HTLV-II:ssa ole- 25 valla, vastaavan vaste-elementin nukleotidisekvenssil-lä on jokseenkin erilainen runko- ja silmukkarakenne kuin HTLV-II:n RexRErllä (RRX).

· Menetelmässä HIV-1:n replikaation inhiboimi- seksi edellä määritelty, Rex funktion transdominanttia 30 repressoria koodaava DNA segmentti saatetaan soluun, joka kykenee replikoimaan yhden näistä viruksista. Ko.

: solu kykenee myös ilmentämään DNA segmentin transdo minantin repressorin tuottamiseksi. Solu voi olla ai-kaisemmin infektoitu yhdellä tai useammalla näistä vi-V 35 ruksista tai solu voi olla infektoimaton kohdesolu yh- : : delle tai useammalle näistä viruksista.

110437 34

Edellä mainitun geneettisen järjestelmän eräässä edullisessa sovellutuksessa valmistettiin Rex vasteellinen reportteriplasmidi, pgTAX-LTR (kuva 13B).

' Lyhyesti, pgTAX-LTR vektori sisältää tax geenin kaksi 5 proteiinia koodaavaa eksonia HTLV-I env geenin erottamana ja täydellisen HTLV-I 3'LTR:n mukaanlukien RexRE (RRE). Näiden HTLV-I sekvenssien ilmentymistä edistettiin ihmisen sytomegaloviruksen välittömällä varhaisella alueella (immediate early region) ja lisäpoly-10 adenylaatiosekvenssit saatiin rotan preproinsuliini-geenin 3'alu-eesta (B. R. Cullen, Cell 46 [1986] 973- 982) . Tämä vektori tuottaa Env:tä vain Rex:n läsnäollessa, mutta Tax: ia syntetisoituu Rex.-n puuttuessa ja läsnäollessa. Tämä vektori itsessään ei tuota Rex:ä 15 johtuen mutaatiosta Sphl kohdassa, joka on yhdenmukainen Rex translaatio-kodonin kanssa. Rex:n puuttuessa pgTAX-LTR tuottaa Tax proteiinia viitaten tämän vektorin pilkotun mRNA lajin, josta puuttuu käytännöllisesti katsoen kaikki env sekvenssit, translaatioon. Kui-20 tenkin, kun pgTAX-LTR transfektoidaan rex ilmentämis-plasmidilla, pREX, niin HTLV-I Env proteiinin synteesi aktivoituu. Tämä 62-68 kd proteiini on helposti tunnistettavissa, kuten on osoitettu immunosaostamalla ; . anti-HTLV-I kuoren (envelope) monoklonaalisella vasta- ' · 25 aineella 0.5 alfan kanssa (S. Matsushita et ai., * "Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 [1986] 2672-2676) (kuva ‘ 14A, jova 1). Vastakkaisesti ei voida havaita mitään : : : HTLV-I Env proteiinia korvattaessa pREX joko pREV:llä (juova 2) tai pCMV-IL-2:11a (juova 3), jotka koodaavat 30 vastaavasti HIV-1 Rev proteiinia ja ihmisen IL-2 poly-peptidiä. Edelleen, ei voida havaita mitään Env prote-. iinia, kun solut transfektoidaan pREX:llä pgTAX-LTR:n puuttuessa (juova 4) .

Siten edellä esitetyssä geneettisessä järjesti 35 telmässä HTLV-I Env ilmentyminen pgTAX-LTR:llä indu- soituu nimenomaan, kun läsnä on proteiinia, joka omaa villi tyyppisen Rex proteiinin geeniaktivaatiofunktion.

110437 35 Järjestelmä, johon kuuluu Rex funktion omaavaa proteiinia tuottava geeni, joutuessaan kosketuksiin Rex funktiota inhiboivan aineen kanssa, Tax proteiinin tuotto jatkuu, ellei ko. aine vaikuta johonkin viraa-5 liseen tai sellulaariseen aktiivisuuteen, joka ei liity Rex funktion tuottaman geenin tai geenituotteen ilmentymiseen, so. ellei aine ole geenin tai sen tuotteen spesifinen inhibiittori. Siten, kuten on esitetty esimerkissä 12 ja kuvassa 15, edullinen esimerkkimene-10 telmä Rex funktion spesifisten inhibiittoreiden identifioimiseksi sisältää HTLV-I Env, Tax ja Rex proteiini -ilmentymisen samanaikaisen analyysin.

On syytä huomata, että alla ja kuvassa 15 kuvattujen transdominanttien repressoreiden aikaansaaman 15 Rex funktion spesifisen inhibition tapauksessa HTLV-I Tax proteiinin tuotto kasvaa selvästi. Tämä johtuu luultavasti Env mRNA:n pilkotun muodon, jota Env mRNArta ei olla poiskuljetettu ennen pilkkomista, poiskuljetuksen tumasta lisääntymisenä johtuen Rex 20 funktion puuttumisesta. Kuitenkin, periaatteessa, Rex funktion spesifinen inhibiittori voi estää mRNAtn pilkkomisen, mutta se ei indusoi pilkkomattoman mRNArn poiskuljetusta. Rex funktion spesifisten inhibiittoreiden identifiointiin tarkoitetulta keksinnön mukai-; 25 seita menetelmältä edellytetään siten vain, että pil kotun mRNA:n, joka tässä tapauksessa tuottaa Tax proteiinia, poiskuljetuksen tumasta vähenemistä ei esiin-: - ny.

Tämän menetelmän käytöstä on esitetty esi-30 merkki alla esimerkissä 12. Tässä mutaatioanalyysissä käytettiin jälleen oligonukleotidi-kohdennettua muta-,·, · geneesiä M13 bakteriofagissa rex geenin primäärisen I t sekvenssin muuttamiseksi 25 epäjatkuvassa kohdassa (kuva 13A) . Laatikoidut aminohapot korvattiin dipepti-

» I I

y 35 dillä, asparagiinihappo-leusiinilla, viemällä kehyk- ’ sissä oleva (in-frame) oligonukleotididupleksi, joka V sisälsi myös diagnostisen Bglll restriktiokohdan. Jo- • ♦ * * » * 110437 36 kainen näistä rex mutanteista insertoitiin pBC12/CMV eukaryoottiseen ilmentämisvektoriin (B.R. Cullen, Cell 46 [1986] 973-982) ja mutaatiot varmistettiin DNA sek-venssauksen avulla.

5 Jokaisesta rex mutantista tutkittiin biologi nen aktiivisuus transfektoimalla pgTAX-LTR vektorin kanssa. Näistä rex mutanteista 19 omasi villityyppisen fenotyypin, viideltä mutantilta (Ml, M2, M6, M7 ja M13) puuttui ilmeinen env geeni aktivaatioaktiivisuus 10 ja yksi mutantti (M15) omasi vain osittaisen funktion (kuva 14B) . Seuraavaksi COS solut transfektoitiin näillä kuudella rex- vajaalla mutantilia ja pgTAX-LTR vektorilla, jonka jälkeen suoritettiin HTLV-I Env-, Tax- ja Rex proteiinien ilmentymisen samanaikainen 15 analyysi esimerkissä 12 kuvatun mukaisesti (katso myös kuvat 15 A-C). HTLV-I Env havaittiin ainoastaan villi-tyyppisen Rex proteiinin läsnäollessa (kuva 15A, juova 7) tai osittain aktiivisen M15 mutantin läsnäollessa (kuva 15A, juova 6), mutta 40 kd Tax proteiini havait-20 tiin kaikissa viljelmissä (kuva 15B) . Siten Ml-, M2-, . M6-, M7- ja M13 mutanteissa havaittu env geeni- ilmentymisen puuttuminen johtuu pikemminkin Rex biologisen aktiivisuuden spesifisestä puuttumisesta kuin näiden proteiinien ei-spesifisistä, toksisista vaiku-: 25 tuksista transfektoituihin COS viljelmiin. Lisäksi jo- ·· kainen mutantti Rex proteiini tunnistettiin näistä . viljelmistä osoittaen, että kaikki mutantit ilmentyi vät stabiililla tavalla (kuva 15C) . M2, M6 ja M13 mutantit liikkuivat tavalla, jota ei juuri erottanut 30 villityyppisen proteiinin tavasta (kuva 15C, juovat 2, 3, 5 ja 7), kun taas M7- ja M15 proteiineilla oli pie-' " nempi todennäköinen molekyylipaino (juovat 4 ja 6) ja

Ml mutantille saatiin elektroforeettinen proteiinidu-pietti (juova 1). Ml-, M7- ja M15 mutanteilla proteii-,···. 35 nia koodaavan sekvenssin määrityksessä ei pystytty '·’· paljastamaan mitään muita muutoksia kuin viedyt spesi- fiset mutaatiot. Nämä selvät kokoerot viittaavat to- i 37 110437 dennäköisesti siten näiden mutantti Rex proteiinien muuttuneeseen post-translaatioprosessointiin asiaa biologiselta kannalta tarkasteltaessa·

Kuten villityyppisenkin Rex proteiinin tapa-5 uksessa, biologisesti inaktiivisilla M6-, M7- tai M13 Rex mutanteilla transfektoitujen solujen immunofluore-senssivärjäys esimerkissä 12 esitetyn mukaisesti osoittaa normaalin kohdistumisen tumajyväsiin ja tumiin ilmentävissä soluissa (kuva 16) . Ml mutantti pro-10 teiini havaittiin täysin vastakkaisesti edelliselle ainoastaan sytoplasmaosastossa, kun taas M2 Rex mutantti oli jakautunut likimain homogeenisesti koko soluun. Näitä havaintoja tukee seikka, että Ml- ja M2 mutaatiot muuttivat perusaminohappotähteitä, jotka si-15 jaitsivat tumajyväspaikallistamissignaalina toimivas sa, positiivisesti varatussa peptididomeenissa. Osittain aktiivinen M15 mutaatio johti mutantin Rex proteiinin tumapaikallistamismalliin, mutta, vastoin kuin villityyppinen Rex proteiini, M15 proteiini ei paikal-20 listunut enää tuman tumajyväsalueelle ja se näytti _ jäävän tumajyvästen ulkopuolelle (kuva 16). Nämä tu lokset viittaavat siihen, että tähteet, jotka sijaitsevat kaukana N-terminaalin perusaminohapoista voivat liittyä tai myötävaikuttaa Rex:n tumajyväspaikallista-25 miseen.

" rex mutanteista tutkittiin lisäksi niiden ka- : pasiteettia blokata villityyppisen HTLV-I Rex proteii nin ja villityyppisen HIV-1 Rev proteiinin biologinen aktiivisuus (kuva 17) . Kun COS solut transfektoitiin 30 pgTAX - LTR :11a ja pREXrlla (kohta A) M6-, M7- ja M13 . . mutanttien 10-kertainen molaarinen ylimäärä osoitti ;ti* dominoivaa negatiivista fenotyyppiä siten, että villi- '···[ tyyppisen Rex proteiinin toiminta inhiboitui merkittä- västi (juovat 3-5). Vastakkaisesti, Ml-, M2- ja M15 35 proteiinit toimivat resessiivisinä negatiivisina mu- tantteina, sillä villityyppisen proteiinin toiminta ei muuttunut (juovat 1, 2, 6). Samoin HIV-1 Rev proteiini 110437 38 ei häirinnyt Rex proteiinin toimintaa (juova 8), eikä myöskään IL-2 (juova 9).

Seuraavaksi tutkittiin transdominanttien Rex mutanttien kapasiteettia blokata HIV-1 järjestelmässä 5 olevaa Rev funktiota (kuva 17B). Kun COS solut trans-fektoitiin pgTATrlla ja pREV:llä, niin M6-, M7- tai M13 Rex mutanttien 10-kertainen molaarinen ylimäärä inhiboi Rev proteiinin toimintaa (juovat 3, 4, 5), kuten on osoitettu Tat proteiinin 72 aminohappomuodon 10 ilmentymisen vähentymisenä. Näiden transdominanttien Rex mutanttien kykyä blokata HIV-1 virusreplikaatiota tutkittiin myös (kuva 17C). Rev-vajaan HIV-1 proviruk-sen, pHXB2-Bam-p3 (L. Rimsky et ai., Nature 335 [1988] 738), replikaatiota tutkittiin Rex:n ja transdominant-15 tien Rex mutanttien eri määrien läsnäollessa transfek-toimalla COS solut näillä plasmideilla. Kuten on osoitettu HIV-1 p24 Gag proteiinin syntetisoiduilla tasoilla supernatanttiviljelmistä, niin transdominanatit Rex mutantit (M6, M7 ja M13) tuottivat annoksesta 20 riippuvan HIV-1 replikaation inhibition. Vastakkaises- . ti, Rex:n resessiivinen negatiivinen Ml mutantti ei vaikuttanut merkittävästi HIV-1 replikaatioon.

• Nämä havainnot yhdessä esimerkkien 12 ja 13 erilaisten rex mutanttien kanssa osoittavat Rex prote-25 iinin sisällä likimääräiset rajat ainakin kahdelle erilaiselle rakennedomeenille, joilla on erilaiset ak-tiviteetit. Yksi domeeni määritetään siten Ml- ja M2 mutaatioilla, se sijaitsee N-terminaalissa, käsittää aminohapot 5-7 ja 14-15 ja näyttää osallistuvan prote-30 iinin kohdistamiseen tumaan ja sitten tumajyväseen.

, . Tämä positiivisesti varattu domeeni voi mahdollisesti • ‘ myös liittyä Rex:n sitoutumiseen suoraan RexREriin '··· (RRX) tai muihin proteiineihin sitoutumisen kautta, jotka proteiinit puolestaan liittyvät suoraan tähän 35 RNA elementtiin. Toinen domeeni, joka on kuvattu edel- */ lä, vaikuttaa ratkaisevasti Rex efektorifunktioon ja 110437 39 se voidaan siten mutatoida transdominanttien represso-reiden tuottamiseksi.

5.4 5

Kohdissa 5.1, 5.2 ja 5.3 esitettyjen yhteenvetona voidaan päätellä: a) on keksitty yleisesti käyttökelpoinen periaate virusinhibiittoreiden valmistamiseksi mu-tatoimalla kriittisiä säätelyproteiineja, kuten Rex ja 10 Rev; b) tämä periaate on osoittautunut käyttökelpoiseksi useissa viruslajeissa toimintakykyisten mutanttisääte-lyproteiinien tuottamiselle; c) spesifiset transdominantit mutantit, jotka on val-15 mistettu ja identifioitu, ovat: - HTLV-I Rex mutantti, joka on tehokas HTLV-I rex geenifunktion inhibitiossa: - pcRexM7 (ks. 5.1 ja esimerkit 1-3); - HIV-1 Rev mutantti, joka on tehokas HIV-1 rev geeni-funktion inhibitiossa: - pMIO (ks. 5.2 ja esimerkit 4- 20 11); pM32 (ks. 5.2 ja esimerkit 11a ja 11b); - HTLV-I Rex mutantti, joka on tehokas HTLV-I rex gee-nifunktion inhibitiossa ja lisäksi tehokas HIV-1 rev geenifunktion inhibitiossa: - pcRexM7 (ks. 5.1 ja esi- 25 merkki 3) ; - HIV-1 Rev mutantti, joka on tehokas HIV-1 rev gee ni-funktion inhibitiossa ja lisäksi tehokas HIV-2 rev ja SIVmac rev geenifunktion inhibitiossa: - pMIO (ks.

5.2 ja esimerkki 11b).

30

6. ESIMERKIT

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksin-: ti töä rajoittamatta sitä.

:.. 35 6.1

Esimerkki 1: Transdominantin HTLV-I rex geenin valmis-> taminen 40 110 4 3 7 1. rex:ä koodaavan sekvenssin kloonaus bakteriofagin M13:n RF-DNA:hän 5 μ9 pcRex DNA:ta käsiteltiin 10 yksiköllä 5 kumpaakin restriktioentsyymiä HindiII ja EcoRI 20 μΐ restriktioentsyymi-inkubointipuskurissa (lOmM Tris-HCl pH 7.5; lOmM MgClM2; 50mM NaCl; 1 mM ditiotreitolia) 37°C 3 h ajan. Reaktioseos saatettiin suoraan 1 % aga-roosigeelin (Seakem FMC Inc., Rockland, ME, USA), joka 10 sisälsi 1 μ9/ιη1 etidiumbromidia, päälle ja siihen kohdistettiin elektroforeesi 50 V; 25 mA 4 h ajan Tris-asetaattipuskurissa (T. Maniatis et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual [1982], Cold Spring Harbor Laboratory, New York, s.156).Erotettu DNA saatet-15 tiin nähtäväksi 366 nm UV-lampulla ja haluttu, 1.5 kb rex fragmentin sisältävä geelipala poistettiin. Tämä geelileike asetettiin dialyysipussiin, joka sisälsi 500 μΐ Tris-boraattipuskuria (Maniatis, s. 156) . DNA elektroeluoitiin puskuriin ja saostettiin -20°C lämpö-20 tilassa etanolilla.

5 μ9 bakteriofagia M13mpl0 RF-DNA käsiteltiin restriktioentsyymeillä Hindlll ja EcoRI ja 7.2 kb M13 vektori fragmentti eristettiin 1 % agaroosigeelistä samalla tavoin.

25 200 ng DNA fagia ja 1 μ9 cRex DNA:ta sekoi tettiin 20 μΐ ligaatiopuskuriin (50 mM Tris-HCl pH 7.4; 10 mM MgC1^2; lOmM ditiotreitoli; 1 mM ATP) 1 yksikkö T4-DNA-ligaasin kanssa sekä inkuboitiin 15 h 16°C. Tätä reaktioseosta käytettiin suoraan 30 E.colikannan TG1 transformoimiseksi ja maljaan viljelemiseksi (plate out) (Amersham menetelmä, s. 16-18).

1 - Sopivien fagitäplien DNA:t tarkistettiin Hin dlll ja EcoRI restriktioentsyymien endonukleaasikat-.j* kaisulla, jota seurasi analyyttinen geelielektroforee- .··. 35 si 1 % agaroosigeelistä, joka sisälsi 10 μ9/πι1 eti diumbromidia Tris-asetaattipuskurissa. Rex:iä koodaa- 110437 41 vaa sekvenssiä kantava bakteriofagi identifioitiin ja nimettiin mplOrex:ksi.

Yksisäikeinen mplOrex DNA eristettiin käyttäen suuren mittakaavan valmistusmenetelmää (Amersham 5 menetelmä, s. 24-25).

2. rex:ä koodaavan sekvenssin mutatointi mplOrex:ssä

Mutageneesin edellytyksenä oli välttämätöntä syntetisoida sopivia yksisäikeisiä DNA molekyylejä. 10 Valmistettiin 29 oligonukleotidiä (ks. kuva 4), jotka lopulta johtivat 30 mutanttiin ja joista seuraavat seitsemän oligonukleotidiä johtivat suoraan tai (ks. esimerkki 2) epäsuorasti mutantteihin, joiden havaittiin olevan menestyksellisiä transdominoivan fenotyy-15 pin suhteen: (1) 5'- TG GAC AGA GTC TTA GAT CTG GAT ACC CAG TCT -3'

Bglll (2) 5'- AC TAT GTT CGG CCA GAT CTC ATC GTC ACG CCC -3' 20 Bglll (3) 5'- CC TAC ATC GTC ACA GAT CTC TGG CCA CCT GTC -3' I// Bglll ♦ * 25 (4) 5'- TCG GCT CAG CTC TTA GAT CTC TTA TCC CTC GA -3' ····: Bglll (5) 5'- AG CTC TAC AGT TCA GAT CTC CTC GAC TCC CCT -3'

Bglll 30 (6) 5'- GT TCC TTA TCC CTA GAT CTC CCT CCT TCC CCA -3' ' Bglll 1 5'- CT CCT TCC CCA CCA GAT CTA CCT CTA AGA CCC -3' 35 Bglll 42 110 4 3 7

Oligonukleotidi (1) korvaa Rex proteiinin aminohappotähteet: fenyylialaniini (paikka 30), fenyylialaniini (paikka 31) ja seriini (paikka 32) aminohapoilla: leu-5 siini (paikka 30) , asparagiinihappo (paikka 31) ja le-usiini (paikka 32).

Oligonukleotidi (2) korvaa Rex proteiinin aminohappotähteet: alaniini (paikka 58) ja tyrosiini (paikka 59) aminohapoilla: asparagiinihappo (paikka 58) ja leusii-10 ni (paikka 59).

Oligonukleotidi (3) korvaa Rex proteiinin aminohappotähteet: proliini (paikka 63) ja tyrosiini (paikka 64) aminohapoilla: asparagiinihappo (paikka 63) ja leusii-ni (paikka 64).

15 Oligonukleotidi (4) korvaa Rex proteiinin aminohappotähteet: tyrosiini (paikka 87), seriini (paikka 88) ja seriini (paikka 89) aminohapoilla: leusiini (paikka 87) , asparagiinihappo (paikka 88) ja leusiini (paikka 89) .

20 Oligonukleotidi (5) korvaa aminohappotähteet: leusiini (paikka 90) ja seriini (paikka 91) aminohapoilla : asparagiinihappo (paikka 90) ja leusiini (paikka 91).

: ' Oligonukleotidi (6) korvaa aminohappotähteen seriini i » * i , (paikka 94) aminohapolla leusiini.

'·,,,· 25 Oligonukleotidi (7) korvaa Rex proteiinin aminohappo- tähteet: arginiini (paikka 100) ja glutamiinihappo (paikka 101) aminohapoilla: asparagiinihappo (paikka 100) ja leusiini (paikka 101).

Kaikki oligonukleotidit vievät Bglll restrik-30 tiokohdat rex koodaavan sekvenssin runkoon.

Oligonukleotidit on syntetisoitu kiinteällä • ' kantajalla Applied Biosystems 380A syntetisaattorissa käyttäen β-syano-etyylifosfoamidiitti-kemiaa. Puhdis-tus suoritettiin 8 % polyakryyliamidigeelielektrofo- 35 reesilla, jota seurasi päätuotteen eluointi ja etano-· lisaostus. Oligonukleotidien fosforylointi käyttäen ATP ja polynukleotidikinaasia suoritettiin Amersham 43 110437 menetelmän mukaisesti, s. 13. Oligonukleotidi-kohdennettu mutageneesireaktio toteutettiin Amersham menetelmän mukaisesti, s.13-16. Tätä seurasi E.coli-kannan TG1 transformaatio ja maljaviljely ss. 16-18 5 esitetyn mukaisesti. Erilaisten täplien DNA seulottiin restriktioendonukleaasianalyysillä käyttäen Bglll- ja EcoRI entsyymejä.

Kaikista seitsemästä mutaatiosta yhden kloonin tunnistettiin kantavan viedyn mutaation rex:iä 10 koodaavassa sekvenssissä. Nämä kloonit on nimetty: mp!0rexM2, mp!0rexM7, mpl0rexM8, mp!0rexl3, mp!0rexM14, mp!0rexM16 ja mp!0rexM17. Lisäksi käytettiin mpl0rexM15 kloonia deleetiomutantin valmistamiseksi (ks. esimerkki 2).

15 3. Mutatoitujen rex geenien uudelleenkloonaus nisäkkään ilmentämisplasmideihin

Mutatoidut rex geenit siirrettiin takaisin 20 bakteriofagi M13 vektoreista alkuperäisiin ilmentämisplasmideihin. 5 μg pcRex DNA inkuboitiin 10 yksikköä HindiII ja 10 yksikköä EcoRI restriktioendonukleaasin : ' kanssa 37°C lämpötilassa 3 h ajan. Reaktioseos saatet- ; . tiin suoraan 1 % agaroosigeelille, joka sisälsi 10 t 25 ^g/ml etidiumbromidia, siihen kohdistettiin elektrofo-" reesi Tris-asetaattipuskurissa 50 V; 25 mA 4 h ajan.

Hindlll-EcoRI vektorifragmentti elektroeluoitiin halutusta geeliosasta ja saostettin etanolilla.

5 μg kohdassa 2. saatuja mutantteja käsitel-30 tiinsamalla tavoin ja rex:iä koodaavan sekvenssin si-, , sältävät fragmentit eristettiin.

* i ' 200 ng eristettyä vektorifragmenttia sekoi- tettiin 1 μg aina kunkin eristetyn rex sekvenssin » » ;'·* kanssa yhteen 20 μΐ ligaatiopuskurissa 1 yksikön T4- 35 DNA-ligaasin läsnäollessa sekä inkuboitiin 16°C 15 h f * * ajan. Saadut reaktioseokset käytettiin suoraan E.coli I » kannan HB101 transformoimiseksi. Eri bakteeripesäk- I I i » 44 110437 keistä saadut DNA:t analysoitiin käyttäen Hindlll, Asp718 ja Bglll restriktioendonukleaaseja, jonka jälkeen suoritettiin analyyttinen geelielektroforeesi 1 % agaroosigeelillä. Näin identifioidut, rex geenejä kan-5 tavat plasmidit nimettiin vastaavasti: pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM13, pcRexM14, pcRexM15, pcRexM16 ja pcRexM17.

Esimerkki 2: Deleetiomutaation muodostaminen 10 rex:iä kooodaavaan sekvenssiin 5 μg pcRexM13 DNA käsiteltiin 10 yksiköllä kumpaakin restriktioentsyymiä, Bglll ja EcoRI. Suurempi DNA fragmentti, joka sisälsi vektorin rungon ja 15 5'osan rex:iä koodaavasta sekvenssistä, eristettiin edellä esitetyn mukaisesti. Samanaikaisesti käsiteltiin 5 μg pcRexMIS DNA analogiseen tapaan ja pienempi DNA fragmentti, joka sisälsi 3'osan rex:iä koodaavasta sekvenssistä,eristettin.

20 200 ng eristettyä pcRexM13 DNA fragmenttia sekoitettiin 1 μg eristetyn pcRexM15 DNA fragmentin kanssa ja inkuboitiin 20 μΐ ligaatiopuskurissa 1 yksikkö T4-DNA ligaasin läsnäollessa 16°C 15 h ajan. Tä-: mä käsittely johti rex:iä koodaavaan sekvenssiin, jos- : 25 sa aminohappopaikat 87, 88 ja 89 ovat identtisiä ·; pcRexM13 kloonin paikkojen kanssa ja paikat 90-94 on poistettu.

Reaktioseos käytettiin sitten suoraan E.coli-kannan HB101 transformoimiseen. Eri kloonien DNA seu-30 lottiin restriktioesdonukleaasidigestiol- la(pilkkomisella) käyttäen Hindlll-, Asp718- ja Bglll ‘· entsyymejä. Tunnistettiin positiivinen klooni ja se nimettiin pcRex!3Al5:ksi.

,···. 35 Esimerkki 3: Biologinen aktiivisuus „ 110437 45 a)Mutanttigeenien biologinen aktiivisuus nisäkässo-luissa ' 0.25 μg rex villityyppi- ja kutakin mutantti- 5 rexgeeni-ilmentämisvektoria sekoitettiin 0.25 μg geno-misen tat (trans-aktivaattori) ilmentämisvektorin pgtat:n (M.H. Malim et ai., Nature 335 [1988] 181) kanssa ja suoritettiin transfektio Cos solulinjaan julkaisun, B.R. Cullen, Meth. Enzymol. 152 (1987) 684-10 703, mukaisesti. 60 h transfektion jälkeen viljelmät leimattiin 3 h ajan 300 μ^/πιΐ 35S-kysteiinillä ja analysoitiin HIV-1 Tat- ja HTLV-I Rex proteiinin ilmentymisen suhteen immunosaostusanalyysillä. Tässä kokeessa käytettiin kaniini-anti-peptidivasta-ainetta, 15 joka on kohdistettu Tat:n aminohappotähteille 1-61, ja kaniini-anti-peptidivasta-ainetta, joka on kohdistettu Rex:n aminohappotähteille 173-189 julkaisussa, B.R. Cullen, J. Virol. 62 (1988) 2498-2501, mukaisesti. Sa- ostetut proteiinit määritettiin SDS/polyakryyliamidi-20 geelillä ja ne saatettiin nähtäviksi autoradiograafi-sesti.

Rex mutanttigeenit, jotka koodautuivat vektoreissa pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM14, pcRexM17 V ja pcRexl3Al5, omasivat negatiivisen fenotyypin rex 25 toiminnalle tässä määritysjärjestelmässä (ks. kuva 2B, -·\ juovat D, E, F, H, I ja K) , kun taas kontrollit (juo vat B ja C) sekä muut mutantit (juova G) omasivat positiivisen fenotyypin.

Kaikki nämä fenotyyppisesti negatiiviset Rex 30 mutanttikloonit kykenevät tuottamaan Rex-spesifisen proteiinin, jonka edellä kuvattu polyklonaalinen anti-Rex-vasta-aine tunnistaa (ks. kuva 2A, juovat C-E ja ',,,· G-1) . Vastakkaisesti mutaatio pcRexM16 kloonissa tuot ti proteiinin,jota ei voitu detektoida Rex-.···. 35 spesifisellä vasta-aineella; tämän uskotaan johtuvan vähentyneestä proteiinin puoliintumisajasta (ei esi-’tetty) .

110437 46 b) pcRexM2:n, pcRexM7:n, pcRexM8:n, pcRexM13:n, pcRexM14:n, pcRexM17:n ja pcRexl3A15:n aikaansaama transdominantti repressio villityyppiselle 5 Hiv-1 rev- ja/tai HTLV-I rex funktiolle

Samaa koejärjestelyä käytettiin tutkittaessa rex mutanttien kykyä inhiboida trans;ssa villityyppi-sen Rev- ja Rex proteiinin funktiota. 0.25 μ9 genomis-10 ta tat ilmentämisvektoria, pgtat, 0.25 \lg villityyp-pistä rev- (pcRev) tai villityyppistä rex (pcRex) il-mentämisplasmidia sekä ylimäärä aina kutakin rex mu-tantti ilmentämisplasmidia (5 μ9) sekoitettiin erillään ja transfektoitiin Cos soluihin. Mutanttien vai-15 kutus villityyppiseen Rev- tai Rex funktioon määritettiin Tat-spesifisellä immunosaostuksella edellä esitetyn mukaisesti.

Tämän kokeen tulos osoittaa, että kuudella rex mutantilla,pcRexM2;11a, pcRexM7:lla, pcRexM8:lla, 20 pcRexM14;11a, pcRexM17:lla ja pcRex!3Al5:11a, on kyky . inhiboida villityyppistä, rex-välitteistä trans- aktivaatiota (ks.kuva 2C, juovat C, D, E, G, H ja I) ja että neljällä rex mutantilla, pcRexM2:lla, pcRexM7:lla, pcRexM8:lla ja (osaksi) pcRexM13:11a, on 25 kyky inhiboida villityyppistä rev-välitteistä trans-aktivaatiota (ks. kuva 2D, juovat C, D, E ja F), kun taas eräät näistä mutanteista, nimittäin esim. pcRexM2, pcRexM7 ja pcRexM8, kykenevät inhiboimaan sekä villityyppistä rex- että villityyppistä rev-30 välitteistä trans-aktivaatiota.

. . Tämä koemalli osoittaa proteiinitasolla edel- ; lä mainittujen rex mutanttien aikaansaaman Rev- ja/tai ’·; Rex funktion transdominantin repression.

Esimerkkien 1-3 tulokset näyttävät myös viit-35 taavan kahden funktionaalisen domeenin olemassaoloon HTLV-I Rex proteiinissa. Aminoterminaalin läheisyyteen ··’ liittyy kaksi mutanttia (pcRexM7, aminohappopaikoilla 110437 47 58, 59, ja pcRexM8, aminohappopaikoilla 63, 64), jotka ovat transdominantteja molempien Rev- ja Rex proteiinien suhteen. Toinen ryhmittymä, johon liittyy vain Rex proteiinia transdominoivat mutantit, sijaitsee 5 koodaavan sekvenssin keskiosassa. Lisäksi rev/rex transdominantti mutantti (pcRexM2, aminohappopaikat 30-32) on mutatoitu tumapaikallistamissignaalin ja ryhmän, johon liittyy mutantit 7 ja 8, väliltä, joka voi olla osa kolmatta funktionaalista domeenia tai, 10 vaihtoehtoisesti, tehty aminohappovaihdos voi häiritä proteiinin tertiääristä rakennetta, jonka tuloksena on havaittu transdominantti fenotyyppi.

6.2 15

Esimerkki 4: "Clustered point"(ryhmmittymä)- ja delee-tiomutaatiot Rev:ssä

Rev proteiini fosforyloidaan seriinin kohdal-20 ta in vivo ja paikallistetaan pääasiallisesti solutumaan, jossa se konsentroituu tumajyväseen. Alla kuvattu mutaatioanalyysi osoittaa, muiden seikkojen ohella, näiden ominaisuuksien merkityksellisyyden Rev funkti-,· olle HIV-1 rakennegeeni-ilmentymisen trans- : 25 aktivaattorina.

·: "Clustered point"-mutaatot (pM) saatettiin, jälleen, oiigonukleotidi-kohdennetulla mutaatiolla HIV-1 Rev:n HXB-3 kantaan julkaisussa, Taylor et ai., Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8765-8785, esitetyn mu- 30 kaisesti. Tarkemmin, käytettiin bakteriofagi M13 muta-geneesijärjestelmää (Amersham Corp., Arlington ‘· Heights, IL, USA) kohdennettujen nukleotidisubstituu- tioiden viemiseksi täyspitkään cDNA rev kopioihin, .·;· joita koodasi pcREV ilmentämisvektori (Malim et ai., 35 Nature 335 [1988] 181-183) . pcREV:n DNA- ja vastaava aminohapposekvenssi on esitetty kuvassa 6.

110437 48

Rev:iin saatettiin sarja "clustered point"-mutaatioita (ks. M1-M14, kuva 5), suoritettiin kloonaus ja mutaatioiden sekvenssit varmistettiin käyttäen dideoksinukleotidi sekvenssinmääritysjärjestelmää 5 (Stratagene, La Jolla, CA,USA). Mutaatiot sijoittuivat yleensä tasaisesti koko Reviiin ja ne kohdistuivat jokaiseen siinä olevaan 11 seriiniin. Jokaisen mutaation (pMl-pM14) ja mutaation lähiympäristön DNA sekvenssit on esitetty kuvassa 7 muuttuneiden nukleotidien olles-10 sa alleviivattuna.

Suurin osa havaituista mutaatioista päätyivät kodoneihin asparagiinihapolle (Asp) ja leusiinille (Leu) korvaten "laatikoidut" tähteet kuvassa 5. Viittauksen helpottamiseksi mutaatiot on nimetty niiden 15 Rev:ssä sijainnin mukaisesti, esim. pMl ollessa kaikkein N-terminaalisin mutaatio ja pM14 kaikkein C-terminaalisin mutaatio.

Vaikka eri pM mutanttien tarkka rakenne on esitetty kuvassa 7, niin pääosa mutaatioista vaikutti 20 ainoastaan kahteen kodoniin. Poikkeuksena tähän yleistykseen mainittakoon M2, M4, M23, M24 ja M25, jotka vaikuttivat kolmeen kodoniin, ja M6, joka vaikutti viiteen kodoniin. Suurimmassa osassa tapauksia amino-,· happosubstituutiot perustuivat kaksi-aminohappomis- : 25 sensemutaatioon, kuitenkin pM6:n tapauksessa Asp ja

Leu korvasivat neljä arginiinitähdettä, jolloin pää-; dyttiin kahteen aminohappodeleetioon, kun pM4 sisälsi ylimääräisen, vierekkäisen yhden aminohapposubstituu-tion, jota ei voitu havaita parentaali REV:ssä,jossa 30 asparagiinihappo oli korvattu tyrosiinilla paikassa 23. Nämä lisämuutokset johtuvat yksittäisistä emäsvir-heistä yksisäikeisessä DNA oligonukleotidi-primerissä, jota on käytetty mutageneesissä.

Useimmat pistemutaatiot johtivat ainutker-,···. 35 täisten Bglll kohtien muodostumiseen; pM7 muodostet tiin kahden vierekkäisen seriinitähteen yksinkertai-sella deleetiolla (ks. kuva 5). Bglll kohdat saatet- 110437 49 tiin kaikki samaan translaatiorunkoon helpottaen myöhempää Rev:n N-terminaali- ja C-terminaalideleetiomu-tanttien (ρΔ) muodostamista. ρΔ mutantit on nimetty deleetiopaikan mukaan, esim. pAll/14:ssä on deleetio 5 saatettujen pMll ja pM14 mutaatioden välissä.

Esimerkki 5: Rev mutanttien ilmentyminen

Negatiivisena kontrollina käytettiin paren-10 taalisen sytomegaloviruksen välittömään varhaiseen promoottoriin (immediate early promotor) perustuvaa pBC12/CMV vektoria (B.R. Cullen, Cell 46 [1986] 973- 982). Edelleen käytettiin genomista tat geeni-ilmentä-misvektoria, pgTAT:a, sekä eritettävää alkalifosfataa-15 sigeeni-ilmentämisvektoria, pBC12/RSV/SEAP (Malini et ai., supra, ja Berger et ai., gene 66 [1988] 1-10, vastaavasti).

pcREV ilmentämisvektoria modifioitiin edellä kuvatun mukaisesti pM- ja ρΔ rev mutanttien ilmentämi-20 seksi. Jälleen käytettiin kvalitatiivista määritystä, johon kuului modifioidun pcREV:n ja pgTATin yhteis-’ transfektio COS soluihin HIV-1 revin ja tatin ilmenty- • ’· misen määrittämiseksi mutanteista (Malim et ai., sup- ; '‘· ra, ja Malim et ai., Nature 338 [1989] 254-57). Tar- 25 kemmin, COS soluviljelmät (35 mm) transfektoitiin ku- , kin DNA-välitteisillä transfektioilla Cullen (Meth.

. . Enzymol. 152 [1987] 684-703) mukaisesti käyttäen 0.25 [ig pgTAT ja 0.25 μg villityyppistä tai modifioitua pcREV ilmentämisvektoria DEAE-dekstraanin ja klorokii-30 nin kanssa.

Kuusikymmentä tuntia transfektion jälkeen viljelmät leimattiin [35S] -kysteiinillä ja [ t32P]-epäor-gaanisella fosfaatilla ( [32P]-Pi) samanaikaisesti jul-kaisuissa, Malim et ai., 1988, supra, ja Hauber et 35 ai., J. Virol. 62 [1988] 4801-04, kuvatun mukaisesti.

Tämän jälkeen soluille suoritettiin lyysi RIPA pusku-: rilla, ja rev - ja tat ilmentymisen suhteellinen taso 110437 50 viljelmissä määritettiin immunosaostusanalyysillä käyttäen kaniini-polyklonaalista antipeptidiantiseeru-mia (Malim et ai., [1988], supra, ja Cullen et ai., J. Virol. 62 [1988] 2498-2501). Tarkemmin, Rev aminohap- 5 potähteille 1-20 (REV1/20) kohdistettua antiseerumia käytettiin mutanttiproteiinien, joita koodasi pM5 ja pM6, immunosaostukseen, kun taas Rev aminohappotähteille 27-51 (REV27/51) kohdistettua antiseerumia käytettiin jäljelle jäävien mutanttiproteiinien saostami-10 seen.

tat ilmentymisen immunosaostusanalyysi suoritettiin käyttäen kaniini-polyklonaalista antipeptidi- antiseerumia, joka kohdistuu Tat aminohappotähteille 1-61 (TÄTI/61).

15 Immunosaostetut proteiinit määritettiin elek- troforeettisesti 14 % epäjatkuvilla SDS-akryyliamidi-geeleillä ja ne saatettiin näkyviin autoradiografises-ti. Näiden kokeiden tulokset on esitetty kuvassa 8, jossa tunnetun molekyylipainon omaavien proteiinimark-20 kereiden suhteellinen liikkuminen on esitetty kuvan oikeassa reunassa.

[35S]-kysteiinillä ja [32P]-Pi leimattujen * · • '· viljelmien immunosaostus anti-Rev antiseerumilla on esitetty kuvissa 8A ja vast. 8C. [35S]-kysteiinileimat-25 tujen viljelmien immunosaostuksesta saatiin pääasial-lisesti missensemutantteja (pM) , joiden täplien intensiteetti ja liikkuvuus oli verrattavissa villityyppiin (kuva 8A, juovat 1-14). Poikkeuksena tähän yleistykseen mainittakoon pM6 mutantti, jolla oli voimakkaat 30 täplät ja ne liikkuivat hieman nopeammin (Mr n. 18 kd) ja pMl, jolla oli heikot täplät ja ne liikkuivat hi- :. ’ ·; taammin.

: tat ilmentymisen immunosaostusanalyysi käyt- .!.* täen anti-Tat antiseerumia toimi kvalitatiivisena mää- 35 rityksenä rev funktiolle käytettäessä pgTAT:a malli-*;·, indikaattorina. Edellä esitetyn mukaisesti, rev puut- tuessa pgTAT ilmentää täysin pilkottua sytoplasma tat 110437 51 mRNA:ta, joka koodaa yksinomaan 86 aminohappoa (aa) pitkää tat proteiinin kaksi-eksonimuotoa. rev läsnäollessa pgTAT kuitenkin indusoi pilkkomattoman tat mRNA:n, joka koodaa katkaistua, 72 aa pitkää proteii-5 nin yksi-eksonimuotoa, sytoplasmailmentymistä.

Villityyppinen rev liikkuu suhteellisen mole-kyylipainon (Mr) 19 kilodaltöniä (kd) kohdalle ja se voidaan havaita helposti kuvassa 8 (juova 0), kun taas tat .-n 86 aa ja 72 aa muodot liikkuvat kohtiin 15.5 kd 10 ja vast. 14 kd. Mock-transfektoidut viljemät eivät tuota spesifisiä signaaleja näissä määritysolosuhteis-sa (Malim et ai., 1988, supra), kun taas kuvasta 8B havaitaan, että koko tat proteiinin vertailtavissa olevia tasoja syntetisoitui sekä viljelmissä,jotka oli 15 transfektoitu mutantti-ilmentämisvektoreilla, että viljelmissä, jotka oli transfektoitu yhdessä pgTat in-dikaattorirakenteen kanssa. Tämä viittaa siihen, että yksikään mutantti Rev proteiineista ei ollut toksinen transfektoiduille soluille.

20 Analyysistä voidaan myös nähdä, että Rev:n 5 missensemutanttia ja 2 deleetiomutanttia olivat inaktiivisia (juovat 4-7,10,16 ja 20), kun taas kaikki i ' muut Rev mutantit osoittautuivat täysin kykeneviksi % * t • \ indusoimaan 72 aa Tat ilmentymistä. Neljä inaktiivi- ; i 25 sesta missensemutantista on ryhmittynyt aminohappotäh- ·>*, teiden 23 ja 56 välille (M4-M7), mutta viides inaktii- vinen mutantti (pMIO) on kahden täysin funktionaalisen t mutantin erottama ja vaikuttaa tähteisiin 78 ja 79. Joko 4 tähteen, jotka sijaitsevat Rev:n N-terminaalin 30 lähellä, deleetiolla (ρΔΐ/2), tai 21 tähteen, jotka sijaitsevat Revin C-terminaalin lähellä, deleetiolla I » 'V\ (pAll/14) oli vain vähän tai ei lainkaan vaikutusta <ii( rev funktioon. Vastakkaisesti, edelleen sekvenssien ,*·,· deleetiot tähteiden 9 ja 17 väliltä (ρΔ1/3) aikaansai- » * 35 vat rev funktion häviämisen.

I 1 1

> » t I I

I t » I » 110437 52

Esimerkki 6: rev mutanttien trans-aktivaatiokapa- siteetti

Mutantti rev:ien trans-aktivaation täsmälli-5 sempää arviointia varten testattiin niiden kykyä avustaa, trans:ssa, HIV-l:n replikaatio-vajaata rev mu-tanttia. Tässä analyysissä käytettiin pHIV-1 rev vektorin rev HIV-1 provirusta (nimetty pHXB2Bam-p3 Fein-berg et ai., Cell 46 [1986] 807-17, toimesta), joka 10 sisältää runko-vaihto(frame-shift)mutaation rev;n toisessa koodaavassa eksonissa aminohapon 59 kohdalla, mikä tekee proviruksen kykenemättömäksi replikaatioon, so. kykenemättömiksi tuottamaan funktionaalista Rev proteiinia transfektoitaessa COS soluihin, kun puuttuu 15 yhteistransfektio vektorilla, joka kykenee ilmentämään HIV-1 rev:n trans:ssa (Rimsky et ai., Nature 335 [1989] 738-40). Mutanttien kykyä avustaa rev provirus ta analysoitiin kuvassa 9 esitetyn mukaisesti käyttäen virusreplikaation mittaukseen HIV-1 p24 Gag proteii-20 nin, joka vapautuu viljelmäsupernatanttiin, tason (pg/ml) kvantitatiivista määritystä ELISA määritysjär-jestelmällä liukoiselle p24 Gag ilmentymiselle (Du-Pont-NEN Inc., Billerca, MA, USA) valmistajan toimittamilla standardeilla.

25 Kontrollia varten transfektiotehoa seurattiin .transfektoimalla viljelmät Rev ei-vasteellisella vek-torilla, pBC12/RSV/SEAP: 11a (12.5 ng/viljelmä) , joka on erittävä alkalifosfataasi(SEAP)geeni-ilmentämisvek-tori. SEAP tasot mitattiin sopivasti samanaikaisesti 30 supernatantti p24 Gag tasojen kanssa. Eräät viljelmät transfektoitiin lisäksi 125 ng joko negatiivisella kontrollivektorilla,pBC12/CMV (NEG) , tai villityyp-; . pisellä rev geeni-ilmentämisvektorilla (pcREV).

•J·’ COS soluviljelmät (35 mm) transfektoitiin 250 35 ng pHIV-lArev:llä ja 125 ng kontrollivektorilla tai modifioiduilla, mutantin sisältävillä vektoreilla. Su-pernatanttikasvatusliuoksesta otettiin näytteet 65 h 110437 53 ajalta transfektiosta ja määritettin p24 Gag proteiini -ilmentymistasot. Samanaikaisesti määritettiin SEAP tasot. Saadut arvot on esitetty kuvassa 9 korjattuna hienoisen vaihtelevuuden, joka havaittiin supernatant-5 ti SEAP tasoissa, suhteen (keskimääräinen SEAP aktiivisuus asetettu 1.00 yksiköksi, havaittu standardien poikkeama oli + 0.14 ja väli 1.30-0.73).

Tässä kokeessa havaittiin vähäistä vaihtelua SEAP aktiivisuuden supernatanttitasossa, mikä osoittaa 10 ekvivalentin transfektiotehon ja varmistaa mutantti-indusoidun, sellulaarisen toksisuuden puuttumisen. Pelkän pHIV-lArev:n transfektio ei tuottanut havaittavaa p24 Gag proteiinia viljelmäsupernatanttiin (juova NEG) , kun taas transfektio yhdessä villityyppisen rev 15 geeni-ilmentymisvektorin kanssa täydensi tehokkaasti pHIV-lDRev:n kykyä indusoida p24 Gag:n eritys (juova pcREV).

Lisäksi, kaikki Rev mutantit, jotka olivat positiivisia pgTAT:iin perustuvassa määrityksessä ku-20 vassa 8B esitetyn mukaisesti, saavuttivat 50-100 % ak- tiivisuustason saatuun villityyppiseen rev rakentee-seen nähden avustusmäärityksessä, lukuunottamatta ·. Ml:tä, joka saavutti -30 % aktiivisuuden, joka vähen- ·': tyminen voi johtua Ml mutantin in vivo stabiilisuuden 25 heikentymisestä. Kaikki mutantit, jotka oli merkitty . negatiivisiksi kuvassa 8B, olivat täysin negatiivisia .. avustusmäärityksessäkin (so. % 10 pg/ml p24 Gag:a) M7 ollessa poikkeuksena, sille todettiin tuskin havaittava supernatantti p24 Gag proteiinitaso.

30

Esimerkki 7: Rev fosforylaatio, jota ei tarvita biolo-giseen aktiivisuuteen : ”. HIV-1 Rev proteiini fosforyloituu yhdestä tai .!. useammasta seriinitähteestä ilmennettäessä in vivo.

35 Kuvassa 5 kuvatut mutaatiot vaikuttavat jokaiseen 11 seriinitähteeseen rev: iä koodaavassa sekvenssissä. Si-: ten immunosaostettuja, [32P]-Pi leimattuja Rev prote- 110437 54 iinieja, jotka ilmentyivät lyhytaikaisesti transfek-toiduissa COS soluviljelmissä, seurattiin HIV-1 rev: n in vivo fosforylaatiokohtien identifioimiseksi (kuva 8C) . [32P]-Pi liittymistasoa rev:iin verrattiin vastaa- 5 vasti transfektoidussa viljelmässä olevaan [35S] -kysteiinin liittymistasoon (kuva 8A) yksittäisten mutaatioiden vaikutuksen fosfaatin liittymistasoon arvioimiseksi. Tämän vertailun tulokset on esitetty taulukossa 1: 10 TAULUKKO 1 HIV-1 rev geenimutanttien fenotyyppinen analyysi

Klooni Reva Fosfory- Subsellu- Transdomi-15 funktio laatiob laarinenc nanttid paikallis- repressio tuminen villi-

20 tyyppi ++ ++ N

Ml + ++ ?

M2 ++ + N

M3 ++ ++ N>C

M4 - ++ N>C

25 M5 - ± C>N

M6 - - C>N

M7 - ++ N>C

M8 ++ ++ N>C

M9 ++ ++ N

30 M10 - ++ N ++

MH ++ ++ N

M12 ++ + N

M13 ++ ++ N

M14 ++ ++ N

V.. 35 Δ1/2 ++ ± N

’·;·; Δ1/3 - - N>C

Δ9/14 - nd nd + 110437 55

Δ10/14 ± N

Δ11/14 ++ ± N

Δ12/14 ++ ± N

Δ13/14 ++ ++ N

5 a ++, 50-100 % villityyppinen (wt); +, 5-50 % wt; < 5 % wt; b ++, verattavissa wt:hen; +, 30-60 % wt; ±, 5-20 % wt; -, ei havaittavaa fosforylaatiota; nd, ei tehty; c ?, ei havaittu immunofluoresensilla; nd, ei tehty; 10 d ++, erittäin trans-dominantti; +, kohtalaisesti trans-dominantti; -, ei havaittavasti trans-dominantti

Taulukossa 1 esitetyssä analyysissä tunnistettiin neljä missensemutaatiota, jotka johtivat vähen-15 tyneeseen fosforylaatioon. Näistä M2:11a ja M12:lla oli kohtalainen teho fosfaattiliittymiseen (-30 % ja vast.

-60 % inhibitio) , kun taas M5 ja M6 vähensivät dramaattisesti fosfaattiliittymistasoa. M5 ja M6 mutaatioiden (jotka eivät vaikuta yhteenkään seriinitähteeseen) 20 draamaatisen tehon mahdollisista syistä rev:n fosforylaatioon keskustellaan myöhemmin yksityiskohtaisemmin.

Revrssä olevien fosfaattireseptoriseriinitäh-teiden edelleen paikallistamiseksi tutkittiin deleetio-mutanttien (ρΔ) fosforylaatiotasoa(kuva 8C, juovat 15-25 20). Tämä analyysi paljasti, että ρΔ13/14 mutaatio fos- foryloitui normaalisti, mutta ρΔ12/14 deleetio ja suuremmat C-terminaaliset deleetiot omasivat vain alhaisen fosforylaatiotason (-90 % inhibitio). Vastaavasti, ρΔΐ/2 Rev mutantti, joka leimautui tehokkaasti [35S]-30 kysteiinillä, omasi myös alhaisen [32P] -Pi liit-tymistason (-90 % inhibitio).

On epäselvää, miksi M2 ja M12 mutaatioden kohtaan ulottuvat deleetiot omasivat dramaattisemman tehon fosforylaatiotasoon kuin itse missensemutaatiot. Kui-35 tenkin nämä tulokset ovat yhtäpitäviä väitteelle, jonka mukaan Rev proteiini sisältää kaksi primääristä kohtaa seriinifosforylaatiolle, joista yksi sijaitsee tähtees- 110437 56 sä 8 (M2) ja toinen tähteessä 99 (M12). joka tapauksessa, mutantit, joista puuttuu nämä tähteet (so. pM2, ρΔ1/2, pM12, ρΔ12/14), omaavat suunnilleen Rex aktiivisuuden villityyppiset tasot (kuva 8B, kuva 9). Näin ol-5 Ien voidaan päätellä, että Rev:n fosforylaatio ei ole oleellista HIV-1 säätelyproteiinin trans-aktivaa-tiofunktiolle transfektoiduissa soluissa.

Esimerkki 8: Revin tumapaikallistuminen 10

Rev proteiinin pääasiallinen paikallistuminen tumaan, erityisesti tumajyväseen, ilmentävissä soluissa osoitettiin mutanttianalyysillä käyttäen epäsuoraa im-munofluoresenssiä. Kiinnitettyjen, transfektoitujen COS 15 soluviljelmien saadut faasikontrastit ja vastaavat im- munofluoresenssi valokuvat on esitetty kuvassa 10.

Rev proteiinin paikallistamiseen transfektoiduissa COS soluissa käytettiin epäsuoraa immunofluore-senssimenetelmää julkaisujen, B.R. Cullen, Meth. En-20 zymol. 152 [1987] 684 ja B.R. Cullen, J. Virol. 62

[1988] 2498, mukaisesti paitsi, että modifioitu para- formaldehydi-pohjainen solukiinnitysmenetelmä toteutet-; .· tiin julkaisun, (Ruben et ai., J. Virol. 53 [1989] 1- ’ ’· 8), mukaisesti. Tarkemmin, soluja käsiteltiin kaniini- . 25 polyklonaalisella anti-Rev- peptidiantiseerumi11a ja tämän jälkeen rodamiinikonjugoidulla-vuohi-anti-kaniini IgGilla.

Primääristä kaniini-anti-Rev- vasta-ainetta käytettiin 1:800 laimennoksena. REVl/20 vasta-aineella 30 analysoitiin suurin osa Rev mutanteista, paitsi viljelmät, jotka oli transfektoitu pMl, pM2, pM3, ρΔ1/2 ja '· ρΔ1/3 vektoreilla. Näitä varten käytettiin REV27/51 vasta-ainetta. Toista vasta-ainetta, rodamiini-konjugoitua-vuohi-anti-kaniini IgGita (Boehringer Mann-35 heim Biochemicals, Indianapolis, IN, USA), käytettiin ‘ · · ‘ 1:50 laimennoksena.

110437 57

Rev mutantit omasivat neljä kategoriaa subsel-lulaarisessa paikallistamisessa kuvan mukaisesti. Kategoriat olivat: N, tuma/tumajyvänen eikä havaittavaa sy-toplasmailmentymistä; N>C, hieman sytoplasmailmen-5 tyrnistä; N=C, selvä sytoplasmailmentyminen ja hieman tumaan konsentroitumista,- C>N, jakautuu satunnaisesti soluun. Esimerkit näistä jakautumisista on esitetty kuvassa kuvattujen Rev proteiinien ollessa kuvien alemman osan ylemmässä oikeassa kulmassa. Taulukossa 1 on esi-10 tetty tämän määrityksen jokaisen Rev mutantin havaittu paikallistaminen.

Kuten näkyy, suurin osa mutanteista omasi täysin villityyppisen subsellulaarisen paikallistamisen (N) mukaanlukien myös trans-akt ivaat ionegat i ivisen 15 kloonin, pMIO (kuva 10D). Kuitenkin, useat mutantit tuottivat hyvin alhaisen, mutta deteketoitavan sytoplasmat luoresenssitason, josta esimerkkinä pM4 (kuva 10F) . Tämä fenotyyppi ei korreloinut selvästi biologisen aktiivisuuden kanssa, kuten sekä aktiiviset mutan-20 tit (pM3, pM8), että inaktiiviset mutantit (pM4,pM7) tekivät. Yksi suhteellisen laaja deleetiomutantti, ρΔ1/3, omasi lisäksi subsellulaarisen paikallis- tamisvälimuodon, joka sijoittui villityyppisen mallin ·'’· sekä mallin, joka oli indusoitu mutaatioilla Rev:n pe- ·'. 25 rusdomeeniin, väliin (N=C, kuvalOH) . Tämä deleetio ei sijaitse kuitenkaan lähellä perusdomeenia. Vaikka syy tälle poikkeukselliselle sijainnille on epäselvä, niin se korreloi kuitenkin ρΔ1/3:11β havaitun biologisen aktiivisuuden puuttumisen kanssa.

30 Rev:n arginiinipitoisen domeenin mutaatio (pM5, pM6), joka omaa homologiaa tunnetuihin tumapai-kallistamissignaaleihin nähden, tuotti korkean syto-plasma Rev proteiinitason (C>N). Näiden proteiinien pääsy tumaan ei kuitenkaan ole estynyt (kuva 10J) , mikä 35 viittaa siihen, että Rev:n perusdomeeni on itse asiassa ’ ··** tumapaikallistamissignaali.

, i 58 110437

On syytä muistuttaa, että pM5 ja pM6 eivät fosforyloituneet merkittävästi in vivo, vaikka ne säilyttivät edellä fosforylaation vastaanottajiksi ehdote- tut kohdat. Tämä voi johtua siitä, että Rev:n fosfory-5 laatiosta vastaava kinaasi rajoittuu solutumaan. Siten on mahdollista, että pM5 ja pM6 Rev mutanttien epäasianmukainen subsellulaarinen paikallistaminen aiheuttaa niiden alhaisen fosforylaatiotaso.

10 Esimerkki 9: Rev funktion transdominantti repressio

Rev mutanteista, jotka olivat menettäneet kyvyn trans-aktivoida HIV-1 rakennegeeni-ilmentymistä, tutkittiin niiden kykyä inhiboida villityyppisen Rev 15 proteiinin trans funktiota.

COS solut (35 mm) transfektoitiin 250 ng pgTAT indikaattorirakenteella ja: 290 ng pBC12/CMV (negatii vinen kontrolli) (kuva 11A, juova 1) ; 40 ng pcREV (alhainen taso) , 250 ng pBC12/CMV (juova 2) ; 290 ng pcREV 20 (korkea taso) (juova 3); 40 ng pcREV, 250 ng pM4 (juova 4); 40 ng pcREV, 250 ng pM7 (juova 5); 40 ng pcREV, 250 ng pMIO (juova 6). 60 h kuluttua transfektiosta vil- jelmät leimattiin [35SJ -kysteiinillä ja niihin kohdis-··’· tettiin immunosaostusanalyysi käyttäen kaniini-anti- I i 25 Tat-antiseerumia.

Kuten näkyy kuvasta 11A, pM4 (juova 4) ja pM7 , . (juova 5) vaikuttivat vähän villityyppisen Rev proteii- • nin aktiivisuuteen mitattaessa 72 aa Tat ilmentymisen induktiota, kun taas pMIO (juova 6) näytti inhiboivan 30 Rev funktion täydellisesti. Tämä viittaa siihen, että pMIO koodaa HIV-1 rev geenifunktion spesifistä inhi-: ·.' biittoria.

Sen osoittamiseksi, että pMIO todella estää spesifisesti pilkkomattoman, tat :n 72 aa muotoa koodaa-35 van HIV-1 mRNA:n sytoplasmailmentymisen, suoritettiin '···' SI nukleaasisuojausmääritys julkaisun, Malim et ai., : (1988), supra, mukaisesti. Tässä menetelmässä (kuva 110437 59 11B) määritetään kvantitatiivisesti pilkotun (S) ja pilkkomat toman (U) tat mRNA:n, joka ilmentyy COS solujen sytoplasmassa, taso transfektoitaessa COS solut (100 mm): 2.75 μ9 pBC12/CMV + 2.5 μ9 pcREV (juova 1) ; 5 2.5 μ9 pgTAT + 2.75 μ9 pBC12/CMV (juova 2); 2.5 μ9 pgTAT + 0.25 μ9 pcREV + 2.5 μ9 pBC12/CMV (juova 3); 2.5 μ9 pgTAT + 2.75 μ9 pcREV (juova 4); 2.5 μ9 pgTAT + 0.25 μ9 pcREV + 2.5 μ9 pMl 0 (j uova 5) ; 2.5 μ9 pgTAT + 0.25 μ9 pcREV + 2.5 μ9 ρΔΙΟ/14 (juova 6). Kuten on esitetty, 10 koko DNA määrä pysyi kaikkiaan määränä 5.25 μ9 mukaan-ottamalla parentaali ilmentämisvektori, pBC12/CMV, negatiivisena kontrollina.

60 h kuluttua transfektiosta sytoplasma RNA kerättiin talteen analyysiä varten ja 5 μ9 liuosta käy-15 tettiin SI nukleaasisuojausmääritykseen. Määrityksessä käytetty DNA koetin oli 798 emäsparikoetin pääte-leimattuna (end-labelled) XhoII kohtaan, joka sijaitsee tat:n ensimmäisessä koodaavassa eksonissa, käyttäen Klenow DNA polymeraasia (Malim et ai., [1988] supra). 20 Koetin (I) oli suunniteltu määrittämään kvantitatiivisesti sekä pilkkomattoman (U), että pilkotun (S) sytoplasma tat mRNA:n tason transfektoidussa COS viljelmässä. Käyttämällä tätä koetintä pilkotun (S) tat

» I

!. . mRNA:n pitäisi liittyä 202 nt koetinfragmenttiin, kun » * · 25 taas pilkkomattoman (U) tat mRNAtn pitäisi liittyä 506 • > ’···’ nt fragmenttiin. Pilkkomattoman mRNA:n suhteellinen ta so jokaisessa juovassa määritettiin kvantitatiivisesti densitometrillä käyttäen LKB pehmeälaserskanneria. Tulokset, jotka on esitetty kuvassa 11B, ovat: juova 2: 30 14 % pilkkomatonta; juova 3: 63 % pilkkomatonta; juova 4: 82 % pilkkomatonta; juova 5; 22 % pilkkomatonta; .·. · juova 6: 24 % pilkkomatonta.

Pilkottu tat mRNA vallitsee odotetusti pelkäs-tään pgTAT: 11a transf ektoituj en solujen sytoplasmassa * t · V 35 (kuva 11B, juova 2), ja pilkkomaton tat mRNA on domi- « I t nantti sytoplasmalaji HIV-1 Rev proteiinia lisäksi il- » * .,* mentävien solujen sytoplasmassa (kuva 11B, juovat 3 ja 110437 60 4) . Kuitenkin, pgTAT:n ilmentyminen yhdessä pcREV:n ja pMIO:n kanssa palauttivat takaisin mRNA:n pilkotun muodon sytoplasmavallitsevuuden (kuva 11B, juova 5).

Vaikka juovissa 5 ja 6 oleva kokonais RNA taso 5 on jokseenkin alhainen, niin silti on selvää, että pMIO (juova 5) kykeni selektiivisesti inhiboimaan Rev:n in-dusoimaa, pilkkomattoman tat mRNA:n sytoplasmailmen-tymistä pgTAT vektorista. Sekä pcREV:n, että pMIO:n läsnäollessa havaittu pilkkomattoman tat mRNA:n suh-10 teellinen taso on todella verrattavissa Rev puuttuessa havaittuun tasoon.

Sama malli on ilmeinen ρΔ10/14:lie (kuva 11B, juova 6). Tulokset osoittavat edelleen, että rev geeni-deleetio, joka ulottuu 3':sta M10 mutaatioon (ρΔ10/14) 15 koodaa myös Rev funktion transrepressoria. Laajempi mutaatio, joka ulottuu M10 mutaationkohdan ohi, nimeltään ΡΔ9/14, oli myös dominoiva negatiivinen fenotyyppi (taulukko 1). Deleetio, joka ulottui M8 mutaatiokohtaan ei ollut kuitenkaan enää transdominantti (tuloksia ei 20 esitetty).

Esimerkki 10: pMIO Rev mutantti on rev funktion kom-: petitiivinen inhibiittori » » 25 Kuvissa 11A ja 11B esitetyt koetulokset osoit- ,tavat, että pMIO voi repressoida villityyppistä Rev i . funktiota trans:ssa. Nämä kokeet suoritettiin kuitenkin

, i -l-l I

' pM10:n suurella ylimäärällä. Rev funktion trans-inhibi- tion tehokkuuden tutkimiseksi tarkemmin kvantitatiivi-30 sesti analysoitiin pM10:n kasvavien tasojen kykyä inhiboida yhtä tasoa olevan pcREV:n pHIV-IDrev provirus-. mutanttiavustusta. Kokeessa testattiin myös kasvavien pM4- ja ρΔ10/14 Rev mutanttitasojen vaikutusta, kuin myös pelkästään itse villityyppisen Rev:n kasvavan il- i i 35 mentymistason vaikutusta.

'<'· COS soluviljelmät (35 mm) transfektoitiin 25 j ng pHIV-lArev:llä ja 50 ng pcREV:llä, sekä kasvavalla ' % 110437 61 molaarisella ylimäärällä joko pcREVriä (^), pM4:ää (Δ) , pA10/14:ää (o) tai pM10:tä (H), kuvan 12 mukaisesti, so. 10-kertainen tarkoittaa transfaktiota 500 ng ko. plasmidirakenteella. Kokonais DNA määrä pysytettiin 5 kaikkiaan arvossa 587.5 ng mukaanottamalla parentaali ilmentämisvektori, pBC12/CMV, negatiiviseksi kontrolliksi. SEAP geeni-ilmentämisvektori transfektoitiin sisäiseksi kontrolliksi (12.5 ng/viljelmä) . Supernatant-tikasvatusliuoksesta otettiin näytteitä 65 h ajan ja 10 niistä määritettiin supernatantti p24 Gag ilmentymis-taso.

Kokeen tulokset on esitetty kuvassa 12 suhteessa p24 ilmentymistasoon, joka on saatu siten, että yhtäkään kilpailevaa rev vektoria ei ole ollut läsnä, 15 tason ollessa määritelty arvoksi 1.00. Kaikki arvot on ilmaistu suhteessa p24 Gag ilmentymistasoon, joka on havaittu 25 ng pHIV-lArev:llä, 50 ng pcREVrllä, 12.5 ng pBC12/RSV/SEAP:lla ja 500 ng pBC12/CMV:llä transfek-toidusta viljelmästä. Ko. kontrolliviljelmä (·) muodos-20 ti perusarvon, jota vasten lisättyjen Rev mutanttien • : kompetitiiviset vaikutukset mitattiin ja jota merkit tiin mielivaltaisesti 1.00 yksikön p24 Gag ilmentymis-tasoksi. Esitetyt arvot on korjattu supernatantti SEAP tasoille havaitun, hienoisen vaihtelun suhteen (keski-25 määräinen SEAP aktiivisuus oli 1.00 + 0.27 välillä 1.28-0.72).

Kuten näkyy, villityyppisen rev ilmentämisvektorin, pcREV:n, transfektiotason lisäämisen havaittiin aikaansaavan hieman positiivisen vaikutuksen virusre-30 plikaatioon, tuottaen maksimissaan -70 % kasvun p24

Gag:n vapautumiselle kasvatusliuokseen. pMIO vektorin transfektiolla oli sitä vastoin dramaattinen inhiboiva ;· vaikutus HIV-1 rakennegeeni-ilmentymiseen. Saatu in- hibointimalli oli Rev funktion kompetitiiviselle in-...· 35 hibiittorille odotettu malli, jolla on samanlainen af- finiteeti kuin villityyppisellä Rev:llä tämän biologi-____: seen kohteeseen. Siten ekvimolaarinen määrä pM10:tä vä- .1 62 110437 hensi p24 Gag ilmentymistä -2-kertaisesti, 2-kertainen ylimäärä pM10:tä vähensi ilmentymistä -3-kertaisesti, 5- kertainen ylimäärä -6-kertaisesti, mutta 10- kertainen ylimäärä vähensi p24 Gag ilmentymistä -93 %.

5 pMIO lisäksi myös ρΔ10/ΐ4:η transfektio vähen si p24 Gag ilmentymistä, mutta tämä Rev:n suuri delee-tiomutantti ei ollut yhtä tehokas inhibiittori kuin pMIO. Todennäköisesti ρΔ10/14:η ilmentämä, erittäin paljon katkaistu proteiini on vähemmän tehokas kilpai-10 lija, sillä siitä puuttuu Rev:n sitoutumista sen biologiseen kohteeseen lisäävät sekvenssit.

pM4:n transfektiolla oli myös vielä inhiboiva vaikutus , vaikkakin heikko, vähemmän kuin 2-kertainen (32 %) käytetyllä maksimiannoksella. Tämän vaikutuksen 15 arvellaan johtuvan RRE sitoutumiseen liittymättömästä aktiivisuudesta (kohina, squelching).

Esimerkki 11: HIV-1 Rev trans-aktivaattorin domeeni rakenne 20 ·: Edellä esitetyn mukaisesti käytettiin lyhytai kaista geeni-ilmentymisanalyysia transfektoiduissa so-*, luissa HIV-1 trans-toimivan geenituotteen, Revin, mis- sense- ja deleetiomutanttisarjojen biologisen aktiivi-25 suuden määrittämiseksi. Nämä tulokset osoittavat kahden funktionaalisen doomenin mahdollisen olemassaolon ·.' * Revrssä, kuten on esitetty kuvassa 12A, jossa S tarkoittaa pilkkomiskohtaa. Nämä kaksi domeenia ovat mahdollisesti oleellisia trans-aktivaatiossa (ris-30 tikoitu).

: Ensimmäinen domeeni (RNA sitova domeeni), joka on määritelty neljän missensemutantin avulla, pM4:n, 'pM5:n, pM6:n ja pM7:n, ulottuu n. 35 aminohapon pitui-sen alueen yli villityyppisen Rev:n aminohappopaikan n. 35 10 ja aminohappopaikan n. 68 väliin ja se sisältää eri- , tyisen perussekvenssielementin, joka on välttämätön ' Rev:n tumapaikallistumiselle. Se sisältää myös tumapai- 110437 63 kallistamis(NL)signaalin (varjostettu). Mutantit, joiden muutokset on tässä domeenissa, osoittavat resessiivistä fenotyyppiä.

Sitä vastoin mutaatiot toisessa domeenissa 5 (aktivaatiodomeeni), joka keskittyy suunnilleen aminohappotähteeseen 79 ja joka on määritelty mm. missense-mutantin pMIO avulla ja deleetiomutanttien ρΔ9/14 sekä ρΔ10/14 avulla, aikaansaavat Rev funktion katoamisen, mutta on merktittävää, että näiden mutanttien omaava 10 negatiivinen fenotyyppi on transdominoiva. Rev:n kaksi aluetta (varjostettu kuvassa 12A) näyttävät olevan tarpeettomia proteiinifunktiolle. Esitetyn mukaisesti, mutaatiot Rev aktivaatiodomeenissa aikaansaavat Rev vajauksen ja tuloksena on villityyppistä Rev funktiota kom-15 petitiivisesti inhiboivien proteiinien tuotto. Tämä trans-repressio riittää vähentämään tai supressoimaan merkittävästi HIV-1 replikaatiota transfektoiduissa soluissa. Molekylaariset perusteet pMIO ja vastaavien deleetiomutanttien omaaville dominanteille negatiivisille 20 fenotyypeille ovat vielä epätiedossa. Havainto, että sekä missense (M10)- että deleetio (Δ9/14, Δ10/14) mutantit kykenevät inhiboimaan Rev funktiota trans:ssa, viittaa siihen, että ominaisuuden puuttumisella, pikemminkin kuin lisäyksellä, on merkitystä. Yhtenä mah-25 dollisuutena on, että vajaat Rev proteiinimolekyylit kykenevät mahdollisesti muodostamaan sekoittuneita mul-* timeerejä villityyppisten Rev proteiinialayksikköjen kanssa ja siten inhiboivat villityyppisen proteiinin funktiota transdominoivaan tapaan. Vielä ei kuitenkaan 30 tiedetä, toimiiko Rev monomeerinä vai multimeerinä in : vivo. Vaihtoehtoinen olettamus pohjautuu aikaisempaan ·· tutkimukseen ja liittyy lukuisten prokaryoottisten ja eukaryoottisten transkriptiotekijöiden funktionaaliseen ·.· dissektioon (leikkelyyn), ja sen mukaan transkriptio- "/ 35 naaliset trans-aktivaattorit omaavat kaksi selvää funk tionaalista domeenia , spesifisen "sitovan domeenin", joka kohdistaa proteiinin sille sopivaan kohdesubst- ,1 64 110437 raattin, ja "aktivaatiodomeeni", joka mahdollistaa si-tomutumistapahtuman funktionaalisten seurauksien, tässä tapauksessa transkriptionaalisen aktivaation, esiin tu- lemisen. Sitovan domeenin on useissa järjestelmissä 5 osoitettu koostuvan sekvenssi-spesifisestä DNA sitoutu-miselementistä; ainakin yhdessä tapauksessa, nimittäin herpex simplex virus tyypin 1 (HSV-1) trans- aktivaattorin VP16 tapauksessa, näyttää kuitenkin siltä, että sitova domeeni sen sijaan välittää spesifisen 10 vuorovaikutuksen sellulaarisen transkriptiotekijän kanssa, joka puolestaan sitoutuu kohdesekvensseihin HSV-1 genomissa. Erityisesti, sitovan domeenin mutaatiolla on taipumus tuottaa negatiivinen fenotyyppi, joka on resessiivinen kohtalaisissa ilmentymistasoissa. Vas-15 takkaisesti, transkriptiotekijän aktivaatiodomeenin mutaatio tai deleetio voi tuottaa mutantteja, joilla on dominoiva negatiivinen fenotyyppi. Ko. mutanttien, joissa sitova domeeni on koskematon, uskotaan kilpailevan villityyppisen trans-aktivaattorin kanssa sitoutu-20 misesta asianmukaiseen sellulaariseen kohteeseen, mutta . ne eivät kuitenkaan kykene aktivoimaan transkriptiota sitoutumisen tapahduttua. HSV-1 VP16 proteiinin tapauksessa tällaisen transdominantin mutantin yli-; ilmentymisen on osoitettu inhiboivan villityyppistä >' 25 VP16 funktiota tehokkaasti ja siten estävän HSV-1 :n ”"· replikaatiota yleensä repiikaation sallivissa soluissa.

Vaikka rev geenituote on geeni-ilmentymisen posttranskriptionaalinen trans-säätelijä, niin on aivan mahdollista, että kahteen funktionaaliseen domeeniin 30 perustuva olettamus olisi käyttökelpoinen tässä tapauk- ; sessa. Erityisesti, Rev toimii erittäin sekvenssi-

spesifiseen tapaan, välittömällä vuorovaikutuksella (M.H. Malim et ai., Cell 60 [1990] 675-683) sen RNA

kohteen, RRE, kanssa, ja sen täytyy sisältää tämän spe-35 sifisyyden mahdollistavat sekvenssit. Kim sitoutuminen on tapahtunut, tämä tapahtuma täytyy kääntää aktivaa-tiotapahtumaksi, joka on tässä tapauksessa epätäydelli- 110437 65 sesti pilkottujen, HIV-1 rakenneproteiineja koodaavien mRNA:iden tumasta poiskuljetus. Mutaatiot tässä jälkimmäisessä domeenissa voivat siten johtaa villityyppisen Rev funktion kompetitiivisiin inhibiittoreihin. Tämä on 5 Rev:n pMIO ja ρΔΙΟ/14 mutanteille havaittu fenotyyppi ja nämä mutantit voivat viitata diskreetin aktivaatio-domeenin olemassaoloon. Käänteisesti, toinen, Rev proteiinin enemmän N-terminaalinen, välttämätön alue, joka on määritelty tällä mutaatioanalyysillä, voi palvella 10 samaa funktiota kuin "sitovat domeenit", jotka on määritelty useissa transkriptiotekijöissä. Tämän domeenin osalta muutetut mutantit (esim. pM4, pM7) omaavat itse asiassa yleensä resessiivisen fenotyypin, vaikkakin alhainen, mutta merkittävä inhibitio on havaittavissa 15 korkeilla ilmentymistasoilla. On löydetty myös muita transdominantteja mutantteja (kuva 5A ja esimerkit 11a ja 11b), joiden ansiosta Rev aktivaatiodomeenin sijainti raffinoituu ulottumalla villityyppisen Rev:n amino-happopaikasta n. 68 aminohappopaikkaan n. 90, erityi-20 sesti paikasta n. 78 paikkaan n. 86 ja erityisemmin • *j paikasta n. 78 paikkaan n. 83 tai 84.

Esimerkki 11a: Muita transdominantteja HIV-1 ·· Rev mutantteja ·' 25

Muita HIV-1 rev mutantteja on valmistettu ana-,· ; logisesti edellä esitetyn kohdan 6.2 menetelmien kans sa. Ne on suunniteltu ja karakterisoitu kuvan 5A ja taulukon 2 mukaisesti. In vivo fenotyyppi on määritetty 30 julkaisun, M.H. Malim et ai., Cell 58 [1989] 205-214 : mukaisesti (kaikki määritykset kontrolloitiin sisäises ti transfektiotehon suhteen).

‘y. Edellä, esimerkeissä 4-11 löydettyjen lisäksi, v on löydetty seuraavat uudet mutantit, jotka inhiboivat 35 transdominoivasti villityyppistä HIV-1 Rev funktiota: V pM21, pM22, pM27, pM28, pM29 ja pM32.

110437 66 TAULUKKO 2

Muiden HIV-1 rev geenimutanttien fenotyyppianalyysi

Klooni Fenotyyppi* Transdominantti rep- 5 ressiob

pBC12/CMV

(pelkkä vektori) 0 pM15 ++ 10 pM16 + + pM17 ++ pM18 + pM19 ++ pM20 ++ 15 pM21 - 97 pM22 - 93 pM23 ++ pM24 ++ pM25 ++ 20 ρΔ9/19 ρΔΐδ/19 + ρΔΙβ/23 ΡΔ22/14 I. ! ρΔ23/14 + : 25 pM27 - 92 pM28 - 92 pM29 - 91 :V: pM32 - 97 pM33 ++ 30 pM34 ++ pM35 ++ : pM36 + a ++ 40-100 % (suhteessa villi tyyppi seen Rev aktiivi-; . suuteen) 0’ 35 + 5-39 % :[” - < 5 % V b %-inhibitiona villityyppisestä Rev funktiosta, kun mutantti Rev:iä on 10-kertainen ylimäärä villityyppi- 110437 67 seen Rev:iin nähden_

Esimerkki 11b: Vaikutus HIV-2- ja SIV Rev funktioon 5 Esimerkkien 4-11 transdominanttien HIV-1 rev geenimutanttien multivalenttia tehoa on analysoitu käyttäen edellä kohdassa 6.2 kuvattua menetelmää sekä julkaisun, M.H. Malim et ai., Proc.Natl. Acad.Sei.USA 86 [1989] 8222-8226, mukaista menetelmää. Saatujen tu lo losten perusteella ainakin mutantilla pMIO on kyky inhiboida transdominoivasti HIV-1 rev geenin fenotyyp-pisen ilmentymisen lisäksi myös HIV-2 rev- ja SIV^c rev geenifunktiota, kuten on osoitettu esim. HIV-2 rev: n tapauksessa HIV-2 Rev funktion voimakkaalla inhibitiol-15 la, kun pMIO ylimäärää ilmennetään yhdessä villityyp-pisen HIV-2 rev geenin kanssa, mikä näkyy pilkkomatto-man mRNA:n ja 1-eksoni tat:n ilmentymisen sytoplasmain-hibitiona.

20 6.3 ; Esimerkki 12: Rex funktion analyysi rex mutanttien testaamiseksi Rex funktion suh-25 teen (kuva 14) kukin mutantti DNA transfektoitiin pgTAX-LTR kanssa COS soluihin käyttäen DEAE-dekstraania (B.P. Cullen, Meth. Enzymol. 152 [1987] 692-693). Kaik ki plasmidit lisättiin konsentraatiossa 1.25 μg/ml. 48 h kuluttua transfektiosta solut leimattiin metabolises-30 ti 35S-kysteiinillä 2 h ajan, valmistettiin sellulaari-: uutteet ja näytteet immunosaostettiin 0.5 alfa ihmisen monoklonaalisella vasta-aineella, joka reagoi spesifi-. sesti HTLV-I kuoren (envelope) proteiinin kanssa. Im- munosaosteet analysoitiin SDS-10 % polyakryyliamidigee-' / 35 leiliä.

'·’ HTLV-I Env-, Tax- ja Rex proteiinien tuoton samanaikaista analyysiä varten (kuva 15) COS solut 110437 68 transfektoitiin pgTAX-LTR:llä (0.1 μ9/π\1) ja mutantti Rex proteiineja koodaavilla vektoreilla (1 μ9/πι1) tai villityyppisellä pREX-, pREV- ja pCMV-IL-2 vektoreilla (1 μ9/ιη1) . HTLV-I proteiinien immunosaostusanalyysissä 5 käytettiin seuraavia vasta-aineita: Env, 0.5 alfa vasta-aine; Tax, Tax-spesifinen anti-peptidi-kaniini- antiseerumi (valmistettu erään keksijän toimesta; voidaan valmistaa myös julkaisun, W. Wachsman et ai., Science 235 [1987] 674-677, mukaisesti); Rex, Rex- 10 spesifinen anti-peptidi-kaniini-antiseerumi (valmistet tu erään keksijän toimesta; voidaan valmistaa myös julkaisun, H. Siemi et ai., Cell 55 [1988] 197-209, mukaisesti) . Radioleimattua sellulaariuutetta käytettiin kaikissa tapauksissa kolmeen immunosaostukseen ja 15 elektroforeettiseen analyysiin; jokaisesta saadusta au- toradiogrämmistä on vain merkitykselliset alueet esitetty kussakin kuvan 15 kohdassa.

HTLV-I Rex mutanttien subsellulaariseksi paikallistamiseksi immunofluoresenssilla (kuva 16) COS so-20 lut transfektoitiin esitetyillä ilmentämisplasmideilla ja kiinnitettiin paraformaldehydillä 48 h myöhemmin.

,, Solut värjättiin seuraavaksi sarjassa kaniini-anti-Rex- * ä ), , peptidi-antiseerumilla (1:100 laimennos) ja rodamiiniin • f • ; konjugoidun vuohi-anti-kaniini IgG:lla edellä kuvatun 25 mukaisesti (B.R. Cullen [1987] supra) .

♦ » I * -

Esimerkki 13 : Rex ja Rev funktion inhibitio

Koetta, jossa analysoitiin rex mutanttien ky-30 kyä inhiboida villityyppisen Rex proteiinin funktiota • i · (kuva 17A) , varten COS viljelmät transfektoitiin koi- » * mella plasmidilla, jotka olivat pgTAX-LTR (1.25 μφ/ιηΐ) , * pREX (0.1 μ9/πι1) sekä 1 μ9/πι1 kullakin Rex mutantilla (juovat 1-6), pREX: llä (juova 7), pREV (juova 8) tai 35 pCMV-IL-2 (juova 9). Env tuotto analysoitiin immu- * » » nosaostamalla 0.5 alfa-monoklonaalisella vasta-aineella » »

» I

sekä elektroforeesilla SDS-10 % polyakryyliamidigeelien , i 69 110437 läpi. HIV-1 Rev proteiinin funktion inhibition analysoimiseksi COS proteiinit transfektoitiin pgTAT:lla, pREVrllä ja 10-kertaisella molaarisella ylimäärällä pBC/CMV-IL-2:11a tai M6-, M7- ja M13 transdominanteilla 5 Rex mutanteilla. 48 h kasvatuksen ja 1 2 3 4 5 6S-kysteiinillä biosynteettisen leimauksen jälkeen sellulaariuutteet määritettiin immunosaostuksella Tat proteiinin katkaistun 72 aminohappomuodon Rev-indusoidun tuoton suhteen (juova 2). Molaarisessa suhteessa 10:1 M6-, M7- ja M13-10 (juovat 3-5) mutantit inhiboivat täydellisesti HIV-1 Rev proteiinin toimintaa, sillä voitiin havaita vain Tat proteiinin täyspitkän 86 aminohappomuoto. HIV-1:n replikaation inhibition analysoimiseksi COS solut transfektoitiin rev-vajaalla HIV-1 provirusplasmidilla, 15 pHXB2-Bam-p3, (M.R. Feinberg et ai., Cell 46 [1986] 807-817) ja pREX:llä yhdessä Ml-, M6-, M7- ja M13 mutanttien tietyn ylimäärän kanssa. Kokonais DNA konsentraatio transfek-tiosekoituksessa pidettiin tietyn tasoisena lisäämällä 20 vaihtelevia määriä pBC/CMV-IL-2 parentaalivektoria. Kolmen päivän kuluttua transfektiosta HIV-1 p24 Gag proteiinin supematanttitasot määritettiin ELISA (Coul- » , ter Immunology kit) avulla. M6-, M7- ja M13 mutantit ; aikaansaivat HIV-1 p24 tuoton annoksesta riippuvan in- ·' 25 hibition, mitä resessiivinen, negatiivinen Ml mutantti ei tehnyt.

»

7. FARMAKOLOGINEN TARKASTELU

HIV-1 on AIDS:n pääasiallinen etiologinen ai- ,<t · ne; HTLV-I aiheuttaa mm. ATL:n; HTLV-II liittyy etiolo- 2 gisesti tiettyihin vaihtelevan T-solun karvasolu (hairy 3 ;. cell) leukemiatapauksiin. HIV-1 Rev- ja HTLV-I Rex 4 > » 5 i ti trans-aktivaattorit ovat osoittautuneet välttämättömik- 6 si virusreplikaatiolle viljelmässä, ja Rev sekä Rex ovat siten potentiaalisia kohteita kemoterapiassa hoi-" dettaessa sairatuneita potilaita.

* i i t 110437 70 Tässä yhteydessä on kuvattu Rev:n ja/tai Rex:n mutanttimuotoja, jotka toimivat tehokkaina kompetitii-visina inhibiittoreina villityyppiselle Rev- ja/tai Rex funktiolle villityyppisellä Rev:llä tai Rexrllä trans-5 fektoiduissa soluissa ja siten ovat tehokkaita inhibi-ittoreita HIV-l:n ja/tai HTLV-I:n ja/tai HTLV-II:n rep-likaatiossa. Näitä mutantteja voitaisiin siten käyttää suojaamaan infektion saaneiden potilaiden imusoluja. Tämän voitanee toteuttaa käytännössä, sillä on ha-10 vaittu, että HSV-l:n välttämättömän VP16 trans-aktivaattorin analogisen transdominantin johdannaisen ilmentyminen voi aikaansaada tehokkaan resistenssin HSV-1 infektiolle tavallisesti sallivalla solupopulaatiolla (A.D. Friedman et ai., Nature 335 [1988] 452- 15 454) . Lisäksi vastaavat transgeeniset hiiret näyttävät olevan immuuneja HSV-1 infektiolle.

Mutantit rex- ja rev geenit, jotka koodaavat Rex:n tai Rev:n transdominantteja repressoreita, soveltuvat siten käytettäväksi "solunsisäisinä immunogeenei-20 nä" tautien, jotka ovat HTLV-I:n tai HTLV-II:n aiheut-. tamia, hoitoon, tai vast. HIV-1-indusoitujen tautien, kuten AIDS ja ARS (ARC), hoitoon. Edelleen, koska ainakin eräät keksinnön mukaiset transdominantit Rex mu-tanttiproteiinit omaavat erityisen edullisen ominaisuu-: 25 den kyeten inhiboimaan sekä HTLV-I Rex- ja HIV-1 Rev ··· proteiinitoimintaa, ne soveltuvat käytettäväksi molem- pien virustyyppien aiheuttamien infektioiden hoitoon. Tämä ominaisuus voi olla erityisen arvokas sellaisten potilaiden kohdalla, jotka ovat saaneet useamman kuin 30 yhden tälläisen viruspatogeenin tai joiden infektiota ei ole pystytty erottamaan näistä kahdesta aineesta.

• "· Useammalle kuin yhdelle viruslajille tehok kaiden aineiden olemassaoloa ei näytä olevan esitetty ennen esillä olevaa keksintöä. Laajan käyttökelpoisuu-·. 35 tensa vuoksi edellä esitettyä keksintöä voidaan käyt- • tää Rev:iä ja Rex:iä koodaavien viruslajien aiheuttami- .· en tautien hoitoon ja sen lisäksi vielä muiden virus- , i 71 110437 tautien, jotka ovat samalla tavoin säädeltyjä geenejä omaavien organismien aiheuttamia, hoitoon.

Keksintöä voidaan siten käyttää virustautien, erityisesti retrovirustautien, kuten ATL- (aikuisiän T-5 solu leukemia), AIDS (immuunikatotauti, acquired immunodeficiency syndrome), ARS- tai ARC- (AIDS-liittyvä syndrooma tai -kompleksi), SIV- (apinan immuunikatovirus, simian immunodeficiency virus), kuten SlVmac-/ FIV-(kissan immuunikatovirus, feline immunodeficiency vi-10 rus), EIAV- (hevosen näivetystautivirus), visnavirus-ja karjan immuunikatovirusinfektiot, edullisesti ihmisen retrovirustautien, edullisemmin ihmisen retrovirustautien, jotka ovat rex- tai rev geenin tai niiden ekvivalenttien säätelemien patogeenien aiheuttamia, ku-15 ten ATL, AIDS ja ARS (ARC), profylaksiaan ja hoitoon.

Tällöin repressorivaikutuksen multivalentti-suus on erityisen hyödyllinen ominaisuus, sillä siitä on hyötyä hoidettaessa useita, erityisesti kahta virusinfektiota, kuten on usein asian laita i.v. huumeiden 20 käyttäjillä, jotka ovat saaneet HIV-1- ja HTLV-I infek-. tion, tai hoidettaessa tilannetta, jossa vallitsee yksi infektio ja muun infektion, kuten HIV infektion, riski on lisääntynyt, tai profylaksiaan tilanteessa, jossa ’ halutaan suojaa eri viruslajispektrin aiheuttamia in- : 25 fektioita vastaan.

• Tämä multivalenttisuus, vaikkakin sen odote- taan tavallisesti olevan kaikkein tehokkain yhtä erityistä tyyppiä olevien, jokseenkin läheisten virusten, esim. retroviraalisten virusten, inhibitiossa, niin si-30 tä ei ole välttämättä rajoitettu toisiinsa läheisesti , , liittyviin viruksiin, kuten joko DNA virukseen tai ’· RNA(retro-)virukseen: DNA viruksien ja retroviruksien, kuten HIV-1:n ja JC viruksen, ihmisen papoaviruksen, välillä tiedetään olevan vuorovaikutuksia infektoita-35 vuustasoilla (H. Gendelman et ai., '· Proc .Natl. Acad. Sei .USA 83 [1986] 9759- 9763; H. Tada et ' ai., ibid. 87 [1990] 3479-3483) ja yhteisiä säätelyme- , i 72 110437 kanismeja voi siten hyvinkin olla fylogeenisesti (lajinkehityksellisesti) etäisemmillä viruslajeilla, joihin mekanismeihin voitaisiin soveltaa edellä esitettyjä multivalenttisen transdominanttisuuden periaatteita.

5 Keksinnön terapeuttinen potentiaali on aivan selvä, sillä esim. HTLV-I:n Rex funktion ja HIV-l:n Rev funktion repressio blokkaa virusreplikaation ja siten estää infektoivien viruspartikkeleiden muodostumisen, jolloin on odotettavissa infektion latentin vaiheen 10 jääminen pysyväksi. Tällöin potilaiden solut, jotka ovat jo infektoituneet HIV-1 viruksella, mutta sisältävät, integroituneena niiden genomiin, geenin transdo-minantille repressorille, säilyvät funktionaalisina ja potilaat ovat epämääräisiä aikoja oireettomia sairau-15 desta ilman, että tarvitaan pitkäaikaista terapiaa.

Näin tarkasteltuna keksinnön mukaiset geenit ovat itsessään lääkevalmisteita, yhtä tai useampaa antoa varten, joko suoraan in vivo, tai epäsuorasti in vitro, edullisesti vektorin, esim. retrovirus- tai 20 plasmidivektorin, osana sellaisessa sopivassa muodossa, , jolla saavutetaan vieminen kohdenisäkässoluun funktio naalisessa muodossa; esimerkiksi geenien, jotka koodaa-vat virusreplikaation ko. transdominantteja inhibiitto-,· reita, insertio voidaan toteuttaa in vitro potilaiden ' 25 soluihin suoralla implantaatiolla infektoituneista yk- : siioista johdettujen imusolujen genomiin ja näitä solu- ; ; ; ja voidaan antaa luovuttajapotilaalle insertion toteut tamisen jälkeen. Koska HTLV-I ja HTLV-II, kuin myös HIV-1 replikoituvat erityyppisissä T-soluissa, niiden 30 aiheuttamat taudit näyttäisivät soveltuvan erityisen hyvin.

’ > I

Eräs edullinen sovellutus voisi siten olla yhdenmukainen erään geeniterapiamenetelmän kanssa, joka on esitetty esim. julkaisussa, T. Friedmann, Science 35 244 (16. kesäkuuta 1989) 1275 tai P.M. Lehn, Bone Marrow Transplant 1 (1987) 243: hematopoieettiset run- kosolut uutetaan esim. AIDS/ATL potilaista ja kasvate- 110437 73 taan in vitro, keksinnön mukainen mutatoitu geeni, joka koodaa transdominanttia repressoria repressoitavalle funktiolle, esim. Rev/Rex funktiolle, implantoidaan näihin soluihin käyttäen retrovirusvektoreita; näin 5 saadut virusresistentit, jälkeläisiä tuottavat run- kosolut palautetaan alkuperäisen potilaan immuunijärjestelmään, jossa niiden odotetaan proliferoituvan käsittelemättömiin runkosoluihin nähden hankitun, selektiivisen edun suhteen;tietyn ajan kuluttua hematopoiet-10 tinen solupopulaatio koostuu kokonaan transdominanttia tekijää tuottavista soluista, jotka ovat virus-resistenttejä.

Toteutusmenetelmät tähän ovat jo tunnettuja alalla, ks. esim. patenttijulkaisu US 4868116. Vekto-15 reita, esim. retroviraalisia tai plasmidivektoreita, keksinnön mukaisesti mutatoitujen geenien saattamiseksi kohdenisäkässoluihin, kuten luuydinsoluihin, on esitetty tai niihin on viitattu esim. julkaisussa, Science 244 (16. kesäkuu 1989 ) 1275. Siten esim. erilaiset 20 Rev- ja/tai Rex transdominantit geenit kloonataan ret- . rovirusvektorijärjestelmiin. Retroviraalisvälitteisen geenisaaton esim. HIV-infektoituihin ihmisen solulin-joihin jälkeen transdominanttien mutanttien teho on välittömästi tarkistettavissa virustuoton inhibitiosta.

25 Edellä esitetty terapeuttinen menetelmä on esimerkkinä julkaisussa, D. Baltimore, Nature 335 Y; (1988) 395, esitetyn mukaisesta intrasellulaarisesta immunoinnista. Lyhyesti, sovellutus käsittää valitun viruksen tietyn elinvoimaisen funktion repressoria koo-30 daavan geenin insertion erityisiin kohdesoluihin, jotka , , ovat tämän viruksen infektoimia (esim. AIDS:ia aiheut- / tavan viruksen tapauksessa tietyt T-solut). Esillä ole van menetelmän soveltaminen terapiaan minkä tahansa vi-ruksen transdominanttia repressoria käyttäen riippuu 35 potentiaalisten vektoreiden muodostamisesta tällaisia mutanttiproteiineja koodaaville geeneille sekä mahdol-' ·' lisistä menetelmistä näiden vektoreiden viemiseksi ,1 74 110437 asianmukaisiin, mallijärjestelmillä identifioituihin soluihin, jolloin ko. ehdot täyttävä menetelmä tuo esiin tehokkaan ja turvallisen intrasellulaarisen vie- misjärjestelmän ihmis- ja eläinsovellutuksiin. Sovel-5 lutusta voidaan siten käyttää kokeelliseen tarkasteluun vaikeuksien ollessa eettisissä esteissä, jotka estävät tällä hetkellä geeniterapian. Ensimmäiset tällaiset geneettiset kokeet on kuitenkin juuri aloitettu päämäärien ollessa ei-terapeuttisia. On odotettavissa, että hy-10 vin pian sen jälkeen, kun menetelmän vaarattomuus on osoitettu, näitä pioneerikokeita seuraa samanlaiset testit terapeuttisin päämäärin, aluksi hegenvaarallisia tiloja varten, kuten AIDS-tautia varten, ja esillä oleva keksintö näyttääkin sopivan erinomaisesti käytet-15 täväksi tällaisten kokeiden alkuvaiheessa (ks. T. Friedmann, Science 244 [16. kesäkuuta 1989] 1279, toi nen artikkeli, "Infectious diseases").

Edelleen eräs uusi sovellutus käsittää geenin sijasta keksinnön mukaisen repressoriproteiinin inser-20 tion kohdesoluihin. Esim. oraalinen (suun kautta) tai parenteraalinen (ruoansulatuskanavan ulkopuolinen) anto toteutetaan konventionaaliseen tapaan muodossa, joka sallii intrasellulaarisen penetraation, esim. liposomi-välitteisessä vientimuodossa.

• 25 Näihin käyttötarkoituksiin sopiva tarkka annos riippuu luonnollisesti käytetystä yhdisteestä, antotavasta ja halutusta hoitovaikutuksesta; alan ammattilainen kykenee selvittämään kuhunkin tilanteeseen sopivimman annoksen.

30 Keksintö sopii edelleen käytettäväksi antivi- ruslääkevalmisteiden, jotka perustuvat transdominoivuu-teen, suunnitteluun ja valmistamiseen. Nyt on löydetty keinot manipuloida virusgeenifunktiota ja ko. keinot ovat ilmeisesti yleisesti sovellettavissa useisiin vi-35 ruslajeihin, vaikka virusten rakenneperusteet vaih-telisivatkin laajasti eri virusten tapauksessa. Nämä : odottamattomat löydöt avaavat tien kokeille, joiden 110437 75 päämääränä on virusreplikaation vielä spesifisempien, mahdollisesti alhaisen molekyylipainon omaavien, mahdollisesti ei-peptidisten transdominanttien inhibiitto-reiden suunniteleminen, ja erityisesti transdominantti-5 suutta, so. pääasiallisesti RNA- sitovaa domeenia mu-tanteissa Rev- ja Rex proteiineissa, jäljittelemään kykenevien inhibiittoreiden, kuten alhaisen molekyyli-painon omaavien inhibiittoreiden tai neutraloivien mo-no-klonaalisten vasta-aineiden suunnitteleminen.

10 Esillä olevan keksinnön muotoon ja yksityis kohtiin voidaan luonnollisesti tehdä erilaisia kombinaatioita ja muutoksia ilman, että poiketaan keksinnön piiristä.

Edelleen, muut edellä esitetyt mutantit, joi-15 hin kuuluu jo muodostetut ja tässä yhteydessä esiin tuodut spesifiset mutantit, joita ei olla karakterisoitu, mutta jotka voidaan karakterisoida yksityiskohtaisemmilla kokeilla transdominanttisesti inhiboiviksi ja/tai multivalenteiksi mutanteiksi, sekä edellä kuvat-20 tujen periaatteiden mukaiset, muunlaiset mutantit, joita ei ole erityisesti mainittu tässä yhteydessä, kuuluvat luonnollisesti myös keksinnön piiriin.

Claims (19)

76

1. Menetelmä mutanttia virusproteiinia koodaavan DNA-molekyylin valmistamiseksi, 5 tunnettu siitä, että proteiini on virusfunktion kannalta olennaisen geenin tuotteen modifioitu muoto ja transdominoivasti repressoi yhden tai useamman seuraavan geenin fenotyyppistä ilmentymistä: i) HTLV-I:n tai HTLV-II:n villityyppinen rex 10 geeni, mutantin virusproteiinin ollessa modifioitu Rex proteiinin villityyppimuodosta; ja ii) HIV-l:n, HIV-2:n tai SIV:n villityyppinen rev geeni; mutantin virusproteiinin ollessa modifioitu Rev proteiinin villityyppimuodosta, käsittäen vastaavan 15 viillityyppisen geenin eristämisen sopivasta ilmentymissysteemistä, tämän geenin laittamisen sopivaan kloonaussysteemiin, halutun mutaation saattamisen geeniin ja saadun mutanttigeenin talteen ottamisen klooneista, joilla on haluttu mutaatio.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että HTLV-I rex geenin feno-tyyppinen ilmentyminen repressoituu.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksessa 1 25 määritetty DNA-molekyyli, joka koodaa HTLV-I Rex proteiinia, valmistetaan kuvan 1 mukaisen villityyppisen Rex proteiinin mutaatiolla aminohappoasemien 30 ja 101 välillä, edullisesti välillä 82-97, edullisemmin välillä 87-94; tai kuvan 1 30 mukaisen villityyppisen Rex proteiinin mutaatiolla aminohappoasemien 59 ja 121 välillä, edullisesti asemissa 59, 60, 64, 65 ja 119, 120 tai 121.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksessa 3 35 määritetty DNA-molekyyli valmistetaan rex johdetusta pcRexM7:stä (kuvat 1, IA, 3 ja 4, mutantti no.7). 110437 77

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisäksi HIV-1 rev geenin fenotyyppinen ilmentyminen repressoituu.

6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että patenttivaatimuksessa 4 määritetty DNA-molekyyli valmistetaan rex johdetusta pcRexM7:stä (kuvat 1, IA, 3 ja 4, mutantti no.7).

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että HIV-l:n, HIV-2:n tai SIV:n 10 rev geenin fenotyyppinen ilmentyminen repressoituu.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että HIV-1 :n rev geenin feno- tyyppinen ilmentyminen repressoituu.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että DNA-molekyyli, joka koodaa HIV-1 Rev proteiinia, valmistetaan kuvan 6 mukaisen villityyppisen Rev proteiinin mutaatiolla aminohappo-asemien 68 ja 90 välillä, edullisesti 78 ja 86 välillä, edullisimmin 78 ja 83 tai 84 välillä.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksessa 9 määritetty DNA-molekyyli valmistetaan rev johdetusta pM32:sta (kuvat 5A ja 6, mutantti pM32).

11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, \ 25 tunnettu siitä, että patenttivaatimuksessa 9 määritetty DNA-molekyyli valmistetaan rev johdetusta pM10:stä (kuvat 5, 6 ja 7, mutantti M10).

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-molekyyli valmistetaan 30 rex johdetusta pcRexM7:stä (kuvat 1, IA, 2 ja 4, mutantti no. 7).

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-molekyyli valmistetaan rev johdetusta pM32:sta (kuvat 5A, 6, mutantti pM32).

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-molekyyli valmistetaan .. rev johdetusta pM10:sta (kuvat 5, 6, 7, mutantti M10) . 110437 78

15. Menetelmä patenttivaatimuksessa 1 tai 12-14 määritetyn mutantti virusproteiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää patenttivaatimuksessa 1 tai 12-14 määritetyn DNA- 5 molekyylin ilmentymisen ja monistumisen sopivassa ilmentymis- ja monistussysteemissä ja siitä saadun tuotteen talteen ottamisen.

16. Menetelmä farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä 10 käsittää patenttivaatimuksessa 1 määritetyn DNA-molekyylin tai proteiinin sekoituksen sopivassa muodossa, jolla saadaan haluttu profylaktinen tai terapeuttinen vaikutus, yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan tai laimennusaineen kanssa.

17. Menetelmä HIV-1 replikaation inhiboimi- seksi in vitro, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää transdominantin repressorin, jolla on patenttivaatimuksessa 1 määritetty HIV-1 Rev funktio, saattamisen HIV-1 infektoituneeseen soluun.

18. Menetelmä koostumuksen valmistamiseksi, :**: käytettäväksi geeniterapiassa virusinfektioiden hoitoon, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää jonkin patenttivaatimuksissa 1-14 määritetyn DNA-molekyylin sekoittamisen yhdessä farmaseuttisesti 25 hyväksytyn kantajan tai laimennusaineen kanssa.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä koostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että koostumusta käytetään geeniterapiassa suojaamaan lymfoidisoluja potilailla, jotka ovat altistuneet 30 virusinfektioille. 79 1 10437