KR100231318B1 - 종양괴사인자 알파 수용체의 c-말단 부분을 갖는 레트로바이러스 벡터 및 이를 이용한 hiv-1 증식 억제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종양괴사인자-α(TNF-α) 수용체(TNF R1)의 C-말단 부분과 사람 면역결핍 바이러스-1(HIV-1)의 프로모터인 LTR의 일부분을 연결한 레트로바이러스 벡터 및 이를 이용하여 HIV-1의 증식을 억제하는 방법에 관한 것으로, HIV-1의 프로모터(LTR)중 전사인자 Sp1의 인식부위 만을 3개 갖는 LTR 결손변이주(3s LTR) 하위에, TNF R1의 C-말단을 코딩하는 유해 유전자와 연결된 레트로바이러스 벡터를 HIV-1이 감염된 세포에서 발현시키는 것에 의하면 HIV-1의 증식을 억제할 수 있어 AIDS의 치료에 사용할 수 있다.

Description

종양괴사인자 알파 수용체의 C-말단 부분을 갖는 레트로바이러스 벡터 및 이를 이용한 HIV-1 증식 억제 방법

본 발명은 종양괴사인자-α(알파) Tumor necrosis factor-α: TNF-α) 수용체의 C-말단 부분(이하 mTR로 약칭함)과 사람 면역결핍 바이러스-1(Human immunodeficiency virus-1: 이하 HIV-1으로 약칭함)의 프로모터인 LTR의 일부분을 연결한 레트로바이러스 벡터 및 이를 이용하여 HIV-1의 증식을 억제하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포에 유해한 영향을 미치는 mTR의 유전자가 HIV-1 LTR 중에서 전사인자 Sp1의 인식부위 만을 3개 갖는 프로모터에 의해 발현되도록 함으로써, HIV-1이 세포에 감염되었을 경우에만 mTR 유전자 산물에 의해 감염된 세포를 사멸시키는 레트로바이러스 벡터 L3smTRSN을 패키징(packaging) 세포주인 PA317에 형질감염시켜 레트로바이러스 3smTR을 얻고 이를 HIV-1이 감염가능한 CEM-ss 세포주에 감염시켜 3smTR 염기서열을 지닌 CEM-3smTR 세포주를 제조하고 이를 이용하여 HIV-1 증식을 CEM-ss 세포주에서와 비교하여 mTR의 항 HIV-1 효과를 비교하고자 한 것이다.

HIV는 레트로바이러스로 렌티바이러스(lentivirus)에 속하며 후천성 면역결핍증(Acquired immunodeficiency syndrome: AIDS)을 유발하는 병원체로 알려져 있다. 1994년 현재 전세계에 걸쳐 약 1400만명에 달하는 인구가 AIDS에 감염되어 있으며 200만명에서 증상이 나타난 것으로 알려져 있는데, 2000년 대에는 4000만명 이상, 최악의 경우에는 1억 이상이 감염되고, 아시아에서만 1000만명 이상이 감염될 것으로 예상되고 있다.

HIV-1 바이러스는 유전정보를 갖고 있는 RNA와 여러가지 바이러스 단백질로 구성되어 있고, 이를 지방질막이 둘러싸고 있다. 바이러스의 표면에 노출된 gp120 단백질이 CD4 T 임파구에 있는 CD4 표면 단백질과 결합하면서 RNA와 단백질 복합체가 감염세포 안으로 들어가게 된다(Freed, E. O., et al., Prod. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4650(1990)). HIV-1은 일반적인 바이러스들과는 달리 역전사효소를 갖는 레트로바이러스이다. 이 효소는 세포 안에서 한가닥의 RNA로부터 이중나선의 DNA를 형성하며, 이렇게 형성된 DNA는 감염세포의 핵안으로 들어가 DNA 중에 끼어 들어가게 되는데, 이 때 바이러스의 삽입효소(integrase)가 작용한다. 그 결과 HIV-1 DNA는 감염세표의 유전물질과 구별할 수가 없어지게 되어, 이와 같이 세포에 끼어 들어간 HIV-1 DNA(프로바이러스; provirus)를 주형으로 하여 RNA가 만들어지고 이어서 바이러스 단백질이 만들어 지는데, 이 과정은 세포가 지니고 있는 효소 단백질에 의해 대부분 이루어 진다. 이어서 바이러스 RNA와 단백질이 세포막으로 모이면서 이것에 둘러싸여 세포 밖으로 나온 뒤 다른 T 임파구를 다시 감염시킨다(Varmus, H., et al., Retrovirus In Mobile DNA, (1989)). 상기 과정을 통하여 HIV-1은 CD4 T 임파구에 감염하고 감염된 세포들은 대개 죽게 되는데, 이 점에 있어서는 바이러스가 직접 세포를 죽인다고 하는 견해와 세포 밖으로 배출된 특정 바이러스 단백질이 감염되지 않은 세포를 죽인다는 견해가 있다. 결국 CD4 T 임파구 수는 감소하게 되고, 그 결과 면역결핍 증상이 나타나게 되는 것이다.

현재까지 알려진 AIDS의 치료방법은 대부분 바이러스의 성장을 억제하는 방법으로, 바이러스에 감염된 세포를 죽이거나 모든 삽입된 프로바이러스를 무기력하게 만드는 것이다. 역전사효소의 기능을 억제하는 AZT가 사용되기도 하지만, 약물 치료후 6개월 내지 1년 사이에 저항성을 갖는 돌연변이가 생긴다는 문제가 있다. 또한 AZT는 세포내 미토콘드리아에 독성을 나타내기 때문에 약물 치료시 부작용이 심각하다는 문제도 있다. 또 다른 치료제로서 단백질 절단효소(protease)에 대한 억제제도 개발되었지만, 이에 대하여 저항성을 갖는 돌연변이가 생겨 문제시 되고 있다.

이와 같은 HIV-1 성장 억제제의 개발과는 별도로 유전자 치료 방법을 사용하여 바이러스의 성장을 억제하려는 시도가 꾸준히 이루어지고 있다. 유전자 치료법(gene therapy)은 어떤 유전자가 없거나 있어도 정상적인 기능을 할 수 없는 유전자 산물을 만들어 내는 유전자를 갖는 질병을 치료하기 위하여 외부에서 정상적인 유전자를 제공한다는 개념을 가지고 처음 시작되었다. 그리고 유전자 발현의 조절, 유전자 전달방법 등의 발달로 인해 유전병은 물론 암의 치료나 감염을 막는데 크게 기여할 가능성이 있는 것으로 생각되고 있다. 즉, 유전자 전달에 기초하여 항 바이러스 전략, 면역치료 등을 포함하는 많은 접근방식이 시도되고 있으며, 몇몇 방식은 실제로 임상에서 시도되고 있다.

1988년에 처음으로 허피스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus)의 VP16 단백질 일부를 줄인 변형된 단백질을 가지고 항 바이러스 효과를 볼 수 있음이 보고된 이후, 이와 비슷한 접근 방법이 치료에도 적용되기 시작했다. 이와 같이 유전자 전달에 기초하여 바이러스 감염에 대해 저항성을 나타낼 수 있는 방법을 가리켜 볼티모어는 세포내 면역(intracellular immunization)이라는 신조어를 만들어 냈다(Baltimore, D. Nature, 335, 395(1988)). HIV-1에 있어서는 구조 단백질과 조절단백질에 주로 관심이 집중되고 있다.

HIV-1 TAR(transactivation region) RNA 염기서열에 붙는 안티센스(antisense) RNA를 세포내 발현시킨 결과 바이러스의 증식이 억제되었다는 보고가 있었으며(Chatterjee, S., et al., Science, 258, 1485(1992)), Rev 안티센스 RNA도 바이러스의 증식을 억제하지만 Gag과 Pol에 대한 안티센스 RNA는 효과가 없는 것으로 알려졌다. 이 방법은 바이러스가 세포 게놈에 삽입된 후에나 작용할 수 있어 한계가 있다.

한편, 헤어핀 라이보자임(hairpin ribozyme)이나 헤머헤드 라이보자임(hammerhead ribozyme)을 이용하여 바이러스 증식을 억제시킨 보고도 있다(Weerashinghe, M., et al., J. Virol. 65, 5531(1991); Yu. M., et al., Prod. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6340(1993)). 이론적으로 이들 라이보자임(ribozyme)은 그 자체가 촉매활성을 가지고 있어서 아주 적은 농도에서도 효과적일 수 있는데, 이러한 대상으로는 리더(leader)부위, 삽입효소(integrase) 등이 있다. 잠재적으로 라이보자임(ribozyme)은 새로 들어오는 바이러스 RNA와 전사된 후의 게놈 RNA 모두를 쪼갬으로써, 전기(삽입전)와 후기(삽입후) 단계에 걸쳐 바이러스 자기복제의 모든 과정이 작용대상으로 될 수 있어 상승작용을 기대할 수 있다. 그러나 이같은 방법들이 효과적으로 작용하기 위해서는 작용대상과 작용물질의 세포내 위치가 중요하고 RNA의 2차 구조와 RNA에 붙는 단백질의 연구 또한 필요하다.

HIV-1 조절단백질인 Tat와 Rev가 붙는 TAR와 RRE(Rev-responsive element)를 세포내에서 발현시켜 이 두 단백질을 희석시킴으로써 바이러스 증식을 억제시키는 RNA 유인(decoy) 방법도 있다(Lisziewicz, J., et al., Prod. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8000(1993)). 하지만 이 방법에서는 RRE와 TAR에 붙는 세포성 단백질이 있을 경우 이들도 함께 제거될 수 있다는 점과, 이 역시 바이러스가 세포 게놈에 삽입된 후에나 작용될 수 있다는 점이 한계로 지적되고 있다.

이와 비슷한 방법으로 우성전달(transdominant; TD) 돌연변이체를 이용한 방법이 있다. TD 돌연변이체는 단백질의 기능을 갖는 부분에만 돌연변이가 있고 대상물질과 붙는 자리는 정상적이다. TD 돌연변이체인 Rev M10은 정상적인 Rev와 다중체(multimer)를 이루어 RRE에 결합하여 Rev의 기능을 저하시킴으로써 HIV-1 증식을 상당히 억제시킨다(Malim, M. H., et al., J. Exp. Med. 176, 1197(1992)). 이 밖에 Gag와 Env의 돌연변이체도 연구되고 있다(Trono, D., et al., Cell, 59, 113(1989)). 이러한 돌연변이체를 이용한 방법의 단점으로는 첫째, 바이러스 발현이나 바이러스 성숙과정을 저해하기 때문에 바이러스가 세포내 게놈으로 삽입된 후에나 작용할 수 있다는 점, 둘째로 외부 바이러스 단백질이 세포내 과정을 통해 클래스 I MHC 분자에 의해 제시되어 CTL 반응을 일으키게 되므로 결과적으로 도입된 유전자를 발현하는 세포를 죽일 수 있다는 것이다. 이러한 점을 고려한다면 세포 단백질에서 유래한 억제 유전자나 RNA 등을 발현시키는 것이 더 좋을 것이다.

한편, 종양괴사인자 α(tumor necrosis factor α; TNFα)는 주로 활성화된 대식세포구에 의해서 생성되는 생리활성 조절물질로, 항암 작용, 세포괴사 작용, 항바이러스 작용 및 면역조절 작용을 나타내고 자가면역질환 등의 만성염증에 관여하는 것으로 알려져 있다(Vilcek, J. 및 Lee, T. H., J. Biol. Chem., 266, 7313-7316(1991); Beuttler, B. 및 Cerami, A., Annu. Rev. Biochem., 57, 505-518(1988)). TNFα가 이러한 작용을 나타내기 위해서는 우선 세포막에 존재하는 TNF 수용체에 결합하여야 한다. TNF 수용체에는 55 kDa의 수용체(TNF R1)와 75 kDa의 수용체(TNF R2)가 존재하는데, TNF R1에 대해서는 비교적 많은 연구가 되어 있으나 TNF R2에 대해서는 거의 연구가 되어 있지 않다. TNF R1은 세포괴사 작용, 상피세포 증식작용, 프로스타글란딘 E2의 생성, 항바이러스 작용, 망간 수퍼옥사이드 디스뮤타제 발현의 유발작용 등을 나타낸다(Tartaglia 및 Goeddal, J. Biol. Chem., 267, 4304-4307(1992)). 그리고 세포괴사 작용에 관여하는 것으로 TNF R1의 세포질내 사멸 도메인(death domain)이 밝혀져 있다(Louis, A. et al., Cell, 174, 845-853(1993)).

이러한 TNFα의 작용은 신호전달 과정에서 핵내의 전사조절 물질에 의해 매개되는데 그 대표적인 예가 NF-κB이다(Nabel, G 및 Baltimore, D., Nature, 326, 711-713(1987)). 즉, TNFα의 신호는 TNF 수용체를 거쳐 결국 NF-κB를 활성화시킴으로써 앞서 열거하였던 여러가지 TNFα의 작용을 유발하게 된다. HIV의 원거리 전사촉진 서열(enhancer) 내에는 NF-κB가 결합하는 염기서열(5'-GGGACTTT- CCC-3')이 포함되어 있기 때문에, TNFα에 의해 HIV의 유전자 발현이 촉진됨으로써 바이러스가 활성화된다(Sen, R 및 Baltimore, D., Cell, 46, 705-716(1986)). 이는 TNFα가 인간 AIDS와도 관련이 있음을 말해주는 것이다. 무증상의 보균자에서는 HIV가 낮은 활성을 나타내지만 TNFα의 생성이 증가하면 HIV가 활성화된다.

본 발명자들은, TNFα 수용체(TNF R1)의 세포질내 특정 도메인을 코딩하는 벡터를 발현시키면 이 벡터의 산물은 TNFα의 신호와는 관계없이 감염시킨 세포를 사멸시킨다는 사실을 발견하여 1994년 12월 21자 대한민국 특허출원 제 94-35513 호로서 출원한 바 있다. 또한 상기 출원에서는 TNF R1의 세포질내 도메인이 HIV 유전자 발현을 저지함을 확인한 바 있다.

본 발명자들은 이와 같은 TNF R1의 작용을 이용하여 HIV-1의 증식을 억제하고자 연구한 결과, 세포에 유해한 영향을 미치는 TNF R1의 세포질내 도메인 유전자가 HIV-1 프로모터 LTR에 의해 발현되도록 함으로써, HIV-1이 세포에 감염되었을 경우에만 감염된 세포를 사멸시킬 수 있게 되어 본 발명의 완성에 이르게 되었다.

본 발명의 목적은 상기에서 언급한 종래의 HIV 증식억제 방법의 문제점을 고려하여, 세포 사멸작용이 있는 TNF R1이 HIV-1의 프로모터에 의해 발현되어 HIV-1의 증식을 억제하도록 하는 방법 및 이를 위해 제조된 레트로바이러스 벡터를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 레트로바이러스 벡터 L3smTRSN의 제작 과정을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 레트로바이러스 벡터 L3smTRSN의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다.

도 3은 HIV-1 LTR 결손 변이주의 기본 활성도를 비교한 그래프이다.

도 4는 HIV-1 LTR 결손 변이주의 HIV-1에 의한 유도정도를 비교한 그래프이다.

도 5는 유해유전자 mTR에 의한 HIV-1 증식의 억제를 보여주는 그래프이다.

도 6은 세포주 CEM-3smTR 후보들에서 레트로바이러스 3smTR의 염기서열을 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭시킨 결과를 나타낸 사진이다.

도 7은 세포주 CEM-ss 및 본 발명의 세포주 CEM-3smTR에 있어서, HIV-1의 성장을 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 8은 본 발명의 세포주 CEM-3smTR에 있어서, 감염 후 1 주일 지났을 때 5배로 세포주를 희석하여 1 주일을 더 배양하면서 HIV-1의 성장을 관찰한 그래프이다.

도 9는 HIV-1의 LTR 염기서열을 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭한 후 8% 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동한 결과이다.

도 10은 세포주 CEM-ss 및 본 발명의 세포주 CEM-3smTR의 성장속도를 비교하여 나타낸 그래프이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 사람 면역결핍 바이러스-1(HIV-1)의 프로모터(LTR)중 전사인자 Sp1의 인식부위 만을 3개 갖는 LTR 결손변이주(3s LTR) 하위에, 종양괴사인자 수용체(TNF R1)의 C-말단을 코딩하는 유해 유전자와 연결된 레트로바이러스 벡터 L3smTRSN을 제공한다.

상기 목적인 HIV-1의 증식 억제를 달성하기 위한 방법은, 상기 레트로바이러스 벡터를 HIV-1이 감염된 세포에서 발현시키는 것을 포함한다.

본 발명에서는 TNF-α의 수용체 TNF R1의 C-말단 유전자 mTR(대한민국 특허출원 제 94-35513 호 참조)이 종양괴사인자와는 무관하게 세포를 죽인다는 점을 이용하여 이 유전자를 HIV-1에 대한 억제 유전자로 선택하게 되었다. 이와 같이 세포를 죽일 수 있는 유해 유전자를 사용할 때는 어떻게 HIV-1이 감염되었을 때에만 선택적으로 발현될 수 있도록 하는가에 관한 문제가 중심이 되는데, 본 발명에서는 HIV-1의 프로모터인 LTR에 의해 유해 유전자가 발현되도록 하는 방법을 사용함으로써 이 문제를 해결할 수 있었다. 그런데 전체 LTR을 사용할 경우에는 프로모터의 기본 활성도가 높아 HIV-1에 감염되지 않아도 세포를 죽일 수 있는 위험이 있기 때문에, 여러가지 다양한 LTR 결손 변이주들을 제조하게 되었다. 이러한 여러 변이주 중에서 전사인자 Sp1의 인식부위를 3개만 가지는 LTR 결손 변이주(이하 3s라 칭함)는 기본 활성도도 낮고 HIV-1에 의한 유전자의 발현정도도 높았기 때문에, 이 LTR 결손 변이주 하위에 mTR 유전자를 붙여 발현벡터를 제조하였다.

RRE(Rev-responsive element) 염기서열은 HIV-1의 env 유전자내에 존재하는 염기서열로서 HIV-1의 조절단백질인 Rev 단백질이 결합하는 자리로 알려져 있다(Malim, M. H., et al., Nature, 338, 254(1989)). Rev 단백질이 존재하지 않을 때에는 이 부분에서 스플라이싱(splicing)이 일어나 짧은 mRNA 전사체가 만들어지지만, 바이러스의 생활사 후반기에 Rev 단백질이 발현되면 RRE 염기서열에 붙게 되어 이로 인해 스플라이싱이 일어나지 못하고 env 유전자 발현에 필요한 mRNA 전사체들과 게놈 RNA가 만들어질 수 있게 된다(Hadzopoulou-Cladras, M., et al., J. Virol., 63, 1265(1989)).

본 발명자들은 이러한 RRE 염기서열의 성질에 착안하여 새로 제조되는 레트로바이러스 벡터에 RRE 염기서열을 포함시킨 결과, 새로운 레트로바이러스 벡터는 HIV-1의 감염이 없을 때는 스플라이싱에 의해 유해유전자를 코딩하는 mRNA 전사체가 만들어지지 않지만, HIV-1이 감염되면 바이러스에 의해 생산되는 Rev 단백질에 의해 스플라이싱이 일어나지 않아 결과적으로 유해 유전자가 발현되도록 할 수 있었다.

또한, 유전자 치료법에 있어서 유전자 산물의 발현 못지않게 중요한 문제는 어떻게 유전자를 세포내로 전달하느냐 하는 것이다. 유전자 전달 방법에는 여러가지가 있는데 첫째, 아데노-계통 바이러스(adeno-associated virus; AAV) 벡터를 이용하는 방법이 있다. 이 벡터시스템은 쉽게 배양액에서 농축될 수 있고 조혈 모세포에 대해서도 높은 전달효율을 보이며 상사 재조합(homologous recombination)의 문제점이 없다는 장점이 있는 반면, 삽입할 수 있는 유전자의 크기가 4.7 kb 이하로 한정되고, 아데노바이러스 오염의 위험성, 및 끼어 들어간 유전자가 다시 제거될 수 있다는 것 등 단점이 알려져 있다. 둘째로 바이러스 벡터를 사용하지 않고 직접 DNA를 주사하거나 리포펙틴(lipofectine)과 같은 물질을 DNA에 섞어 전달하는 방법 등이 있는데, 이들 방법에서는 전달효율(transduction efficiency)이 낮고 외부에서 넣어준 유전자가 세포 게놈으로 삽입되지 않는다는 등의 한계가 있다. 셋째로는 뮤린(murine) 레트로바이러스 벡터를 사용하는 방법이 있는데, 이 벡터시스템은 효율성, 안정성 및 지속적인 발현 등 장점이 있어 많이 사용되어 왔다. 본 발명에서는 레트로바이러스 벡터중 하나인 pLXSN(Miller, A. D., et al., Method in Enzymology, 217, 518(1993))을 개조하여 AIDS 치료에 사용될 수 있는 레트로바이러스 벡터를 만들 수 있었다.

또한 상기 제조된 레트로바이러스 벡터 L3smTRSN을 패키징 세포주 PA317에 형질감염시켜 바이러스 형태의 3smTR을 얻고 이를 HIV-1이 감염가능한 세포주 CEM-ss에 감염시켜 3smTR의 염기서열을 지니는 세포주인 CEM-3smTR을 제조하였으며, 이에 HIV-1을 감염시켜 실제로 HIV-1의 성장이 억제되는 항 HIV-1 증식억제 효과를 관찰하였다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명의 일부분을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다. 하기 실시예에서 사용된 실험방법 및 과정은 특별한 언급이 없는 한 다음의 참조예에 따라 실시하였다.

참 조 예 1 : 올리고 뉴클레오티드의 합성

올리고 뉴클레오티드는 자동화된 고체상 포스포아미다이트 케미스트리(solid-phase phosphoamidite chemistry)를 이용하여 DNA 합성기로 합성하여, 에탄올로 침전시키고 증류수에 용존시킨 다음 260 nm에서의 흡광도를 측정하여 농도를 결정하였다.

참 조 예 2 : 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)

주형 1㎍, 5㎕의 10배 농도 완충용액(10 mM 트리스-HCl, pH 8.8, 1.5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 0.1 % 트리톤-X 100), 2㎕의 dNTP 혼합액(dATP, dGTP, dCTP, dTTP 가 각각 5mM), 프라이머 50ng 씩, 그리고 0.5㎕의 다이나자임(Fynnzymes Oy사)을 넣은 후 증류수를 가하여 총 부피를 50㎕로 하고, 여기에 용액의 증발을 막기 위해 50㎕의 미네랄오일을 첨가하였다. 온도순환기(thermocycler, Ericomp.)를 이용하여 95℃, 1분; 50℃, 1분; 72℃, 1분의 순환 프로그램을 35 회 반복하였다. 반응 후 반응액에 증류수를 가하여 100㎕로 맞추고 70㎕의 페놀/클로로포름을 가한 다음, 혼합액을 잘 섞고 원심분리하여 상층액만을 새 튜브에 옮겼다. 여기에 1/10 부피의 3M 아세트산 나트륨 및 2배 부피의 100 % 에탄올을 넣고 혼합한 다음 다시 원심분리하여 PCR 산물을 얻었다. 이 DNA를 적당량의 증류수에 녹여 다음 실험에 이용하였다.

참 조 예 3 : 제한효소를 이용한 DNA의 절단 및 절편 회수

사용된 제한효소와 완충용액은 베링거 만하임(Boehringer Mannheim; BM)사로 부터 구입하였다. 멸균된 1.5㎖ 에펜도르프 튜브에서 보통 반응부피가 20㎕ 내지 30㎕가 되도록 하고 37℃의 반응온도에서 2 내지 3 시간 동안 반응시켰다. 제한효소 반응에 사용한 10배 완충용액의 조성은 다음과 같다:

10배 BM 완충용액 A: 33mM 트리스-아세테이트, 10mM Mg-아세테이트, 66mM K-아세테이트, 0.5mM 디치오트레이톨, pH 7.0

10배 BM 완충용액 B: 10mM 트리스-HCl, 5mM MgCl₂, 100mM NaCl, 2-β-머캡토에탄올, pH 8.0

10배 BM 완충용액 H: 50mM 트리스-HCl, 10mM MgCl₂, 100mM NaCl, 1mM 디치오트레이톨, pH 7.5

DNA 절편의 회수는 전기영동된 아가로즈 젤을 에티듐브로마이드로 염색하여 원하는 절편을 절단한 후 바이오 101 사의 유전자 클린(Gene clean) II 키트를 사용하여 분리해 내었다.

참 조 예 4 : 접합 반응(ligation reaction)

접합반응에는 접합효소로 리가제(Gibco-BRL 사)와 10배 접합완충용액(660mM 트리스-HCl, pH 7.5, 50mM MgCl₂, 10mM 디티오에리쓰리톨, 10mM ATP)을 사용하여, 보통 20 ㎕의 부피에서 10 단위의 연결효소를 사용하였다. 반응조건은 보통 16 ℃ 에서 적어도 5 시간 이상 반응시켰다.

참 조 예 5 : 대장균 형질전환

대장균 숙주세포로는 E. coli MC1061과 E. coli MC1061/P3(Seed, B., Nature, 329, 840(1987))를 사용하였다. 숙주세포를 500㎖의 액체 배지(1% 박토-트립톤, 5% 효모 추출물, 1% NaCl)에 접종한 후 600nm에서의 흡광도 값이 0.5 내지 1.0이 될때까지 37℃에서 진탕배양하였다. 원심분리로 세포를 수확한 후 차가운 증류수 500㎖로 두번 세척하고, 차가운 10% 글리세롤 용액 4㎖를 가하여 세포들을 균일하게 분산시켰다. 수득한 세포현탁액중 50㎕를 취하여 접합반응 혼합물 2㎕를 가하고 0℃에서 2 분간 정치시켰다. 이어서 바이오-래드(Bio-Rad) 사의 일렉트로포레이터(electroporator)를 사용하여 2.5 kV의 전기충격을 가한 후, 1㎖의 2X YT(1.6 % 박토 트립톤, 1% 박토 효소 추출물, 0.5% NaCl)를 넣어주고 1 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양이 끝난 후 E. coli MC1061 숙주세포의 경우 배양액을 50㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 고체 배지에 도포하고, E. coli MC1061/P3 숙주세포의 경우에는 12.5㎍/㎖의 앰피실린과 7.5㎍/㎖의 테트라사이클린을 포함하는 고체 배지에 도포하여, 37℃에서 밤새 배양하여 콜로니가 형성되도록 하였다.

참 조 예 6 : 세포배양 및 리포펙타민(lipofectamine)을 이용한 형질감염 (transfection) 방법

원숭이 신장세포주 COS7을 둘베코 변형 이글배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM)에 소태아혈청(FBS)를 10% 가 되도록 첨가하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 키운 다음, 형질감염을 위해서 실험 하루전에 30 내지 40% 정도의 조밀도로 6공 플레이트(6-well plate)에 깔아주었다.

형질감염에는 리포펙타민(Gibco-BRL 사)을 사용하여 다음과 같이 실시하였다. 먼저 FBS가 없는 DMEM 100㎕에 DNA를 총량 6 ㎍이 되도록 넣어주고, 여기에 10㎕의 리포펙타민이 들어 있는 100㎕의 DMEM을 가하여 잘 섞은 다음 상온에서 30 분간 정치시켰다. 리포펙타민-DNA 용액에 다시 800㎕의 DMEM을 넣어주고 잘 섞은 후, 배양액을 제거한 세포에 넣어주었다. 37℃ 배양기에서 하루 정도 보관한 다음 리포펙타민-DNA가 들어있는 배양액을 제거하고, 새로 배양액을 넣어 하루를 더 배양하였다.

필요에 따라 루시페라제 활성도의 측정은 루시페라제 활성도 측정 키트(Promega 사)를, HIV-1의 구조단백질 p24의 정량에는 레트로-텍 p24(Retro-Tek p24 ) ELISA 키트(Cellular product 사)를 각각 사용하였다.

실 시 예 1 : 레트로바이러스 벡터의 제조

(단계 1) HIV-1 LTR 결손 변이주 3s의 제조

전사인자 Sp1의 인식부위를 3개 갖는 LTR 결손 변이주 3s를 만들기 위하여 하기 서열 1의 프라이머 LTR380 및 서열 2의 프라이머 LTR550을 합성하였다.

[서열 1]

5'-GGGGGCCCGGGATCCGAGGTGTGGCCTGGGCGGGACTGG-3'

[서열 2]

5'-GGGGGCTCGAGCACTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGC-3'

HIV-1 LTR의 Sp1 인식부위의 시작부분을 포함하는 LTR380과 HIV-1의 TAR 염기서열의 끝부분을 포함하는 LTR550을 프라이머로 하여, HIV-1의 전체게놈이 들어있는 pNL4.3(Adachi, A., et al., J. Virol. 59, 284(1986))으로부터 LTR 결손변이주 3s를 중합효소 연쇄반응을 통해 얻었다. 얻어진 LTR 결손변이주 3s를 BM 완충용액 A에서 제한효소 SmaI으로 절단하여 페놀/클로로포름으로 추출한 다음 에탄올에 침전시키고 16 ㎕의 증류수에 용존시켰다. 이 DNA를 BM 완충용액 H에서 XhoI으로 절단한 후 아가로즈 젤상에서 분리해 내었다.

접합 반응에 사용될 벡터 CDM8-Luc(Kim, C. H., et al., J. of Inflammation in press (1996))을 BM 완충용액 H에서 제한효소 NruI과 XhoI으로 절단한 후 아가로즈 젤상에서 분리해 내었다. 상기에서 얻어진 LTR 결손 변이주 3s 10㎕와 절단한 벡터 2㎕에 T4 DNA 리가제 10 단위체를 가하고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. 이어서 대장균 E. coli MC1061/P3로 형질전환시켜 원하는 재조합 벡터를 찾아 CDM3s-Luc이라 명명하였다.

(단계 2) 유해 유전자(toxic gene)를 지닌 벡터의 제조

mTR(TNF R1 의 C-말단으로부터 116 개의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 TNFR1-116의 TNF R1 부분 유전자의 5'-말단에 미리스틸기 부착 단백질 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결합되어 있어 세포막에 표지가 될 수 있도록 된 플라스미드 MTNFR1-116으로부터 헤마글루티닌 서열을 제거한 것; 대한민국 특허출원 제 94-35513 호)을 BM 완충용액 H에서 제한효소 HindIII와 NotI으로 절단하여 아가로즈 젤상에서 분리해 내었다. (단계 1)에서 얻어진 CDM3s-Luc을 BM 완충용액 H에서 제한효소 HindIII와 NotI으로 절단하여 벡터로 사용하였다.

상기에서 얻어진 절단된 mTR 유전자 10㎕와 벡터 2㎕에 T4 DNA 리가제 10 단위체를 가하고, 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가하여 16℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. 이어서 대장균(E. coli) MC1061로 형질전환시켜 원하는 재조합 벡터를 찾아 CDM3s-mTR로 명명하였다.

(단계 3) HIV-1 RRE 염기서열을 갖는 레트로바이러스 벡터의 제조

RRE 염기서열을 증폭하기 위한 하기 서열 3의 프라이머 RRE7750 및 서열 4의 프라이머 RRE7990를 다음과 같이 합성하였다.

[서열 3]

5'-GGGGGGGATCCGCGGCCGCCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCC-3'

[서열 4]

5'-GGGGGGAATTCGTTAACAGGAGCTGTTGATCCTTTAGGTAT-3'

RRE 염기서열의 시작부분을 포함하는 RRE7750과 끝부분을 포함하는 RRE7990을 프라이머로 하여, 전체 게놈이 들어 있는 pNL4.3(Adachi, A., et al,. J. Virol., 59, 284(1986))으로부터 중합효소 연쇄반응을 통해 RRE 염기서열을 제조하였다. 얻어진 RRE 염기서열을 BM 완충용액 B에서 제한효소 BamHI과 EcoRI으로 절단한 후 아가로즈 젤에서 분리하였다.

접합반응에 사용될 레트로바이러스 벡터 pLXSN(Miller, A. D., et al., Method in Enzymology, 217, 518(1993))을 BM 완충용액 B에서 BamHI과 EcoRI으로 절단한 후 역시 아가로즈 젤 상에서 분리하였다. 접합반응에는 상기에서 얻어진 RRE 염기서열 10㎕와 벡터 2㎕에 T4 DNA 리가제 10 단위체를 가하고 총부피 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. 이어서 대장균(E. coli) MC1061로 형질전환시켜 원하는 재조합 벡터를 찾아 LRSN으로 명명하였다.

(단계 4) 레트로바이러스 벡터의 제조

(단계 2)에서 얻어진 벡터 CDM3s-mTR을 BM 완충용액 H에서 제한효소 BamHI과 NotI으로 절단하여 LTR 결손 변이주 3s와 유해유전자 mTR을 지닌 절편(이하 3smTR이라 칭함)을 아가로즈 젤 상에서 분리해 냈다. 또한 (단계 3)에서 얻어진 벡터 LRSN을 BM 완충용액 H에서 제한효소 BamHI과 NotI으로 절단하여 아가로즈 젤 상에서 분리해 냈다. 상기에서 얻어진 3smTR 10㎕와 벡터 2㎕에 T4 DNA 리가제 10 단위체를 가하고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 뒤 16℃에서 12 시간 동안 반응시켰다.

이어서, 상기 반응물을 가지고 대장균(E. coli) MC1061를 형질전환시켜 원하는 재조합 벡터를 찾아 L3smTRSN으로 명명하였다.

본 발명의 벡터 L3smTRSN로 형질전환된 대장균(Escherichia coli) L3smTRSN은 한국과학기술원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 KCTC 8724P로서 1996년 1월 30일자로 기탁되었다.

도 1은 본 발명의 레트로바이러스 벡터 L3smTRSN의 제작과정을 나타낸 것이고, 도 2는 본 발명의 레트로바이러스 벡터 L3smTRSN의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다.

실 시 예 2 : LTR 결손 변이주 3s의 기본 활성도

LTR 결손 변이주를 제조함에 있어서 문제가 되는 것은 최소한의 기본 활성도를 가지면서 HIV-1에 의해 충분히 유도될 수 있는 LTR 부분을 결정하는 것이다. 이를 위하여 기본적으로 3 종류의 결손 변이주를 제조하여 활성도를 측정하여 보았다.

즉, 전사인자 NF-κB 인식부위 2개와 전사인자 Sp1 인식부위 3개를 가지는 LTR 결손 변이주 2k3s, 전사인자 Sp1 인식부위를 3개 지니는 LTR 결손 변이주 3s, 그리고 전사인자 Sp1 인식부위를 1개만 지니는 LTR 결손 변이주 1s를 제조한 다음, 이들 LTR 결손 변이주의 하위부분에 루시페라제(luciferase)를 연결하여 원숭이 신장세포주 COS7에 형질감염시켜 루시페라제 활성도를 측정함으로써 LTR 결손 변이주들의 기본 활성도를 측정하였다.

도 3은 HIV-1 LTR 결손 변이주의 기본 활성도를 비교한 그래프이다.

실 시 예 3 : LTR 결손 변이주 3s의 HIV-1에 의한 유도정도

상기 실시예 2에서 언급한 바와 같이, HIV-1이 감염되었을 때 레트로바이러스 벡터로 감염된 세포를 죽일 수 있을 정도의 충분한 유해유전자 산물을 만들어내기 위해서는, HIV-1에 의해 충분한 강도로 유도될 수 있는 LTR 결손 변이주를 가져야 한다. 이를 위해서 LTR 결손 변이주의 HIV-1에 의한 유도 정도(inducibility)를 측정하여 보았다.

도 4는 HIV-1 LTR 결손 변이주의 HIV-1에 의한 유도 정도를 비교한 그래프이다. 여기에서 보면, LTR 결손 변이주 3s의 경우 기본 활성도가 낮으면서도 HIV-1에 의해서는 약 7배 정도의 유도 정도를 나타내는 것을 알 수 있다.

실 시 예 4 : 유해유전자 mTR에 의한 HIV-1의 증식 억제

유해유전자 mTR이 HIV-1의 증식에 어느 정도 억제효과를 미치는가를 알아보기 위해, 보통 벡터에 mTR이 있는 CDM3s-mTR과 레트로바이러스 벡터에 mTR이 있는 본 발명의 벡터 L3smTRSN을 각각 HIV-1 전체게놈이 포함된 pNL4.3과 함께 원숭이 신장세포주 COS7에 형질감염시킨 후 HIV-1의 구조단백질 p24의 양을 측정하였다.

도 5는 유해유전자 mTR에 의한 HIV-1 증식의 억제를 보여주는 그래프이다. 여기에서 보듯이, mTR 유전자가 LTR 결손 변이주 3s에 의해 발현되면 HIV-1의 양이 약 3-4 배 정도 감소되는 것을 알 수 있다.

실 시 예 5 : 세포배양 및 칼슘 포스페이트 형질감염 방법

NIH3T3에서 유래된 패키징 세포주(packaging cell line) PA317(ATCC CRL 9078)을 둘베코 변형 이글배지(Dulbecco's modified Eagle's media)에 소태아혈청(fetal bovine serum)을 10%가 되게 첨가하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양한 다음 50 내지 60%의 조밀도로 60mm 조직배양 접시에 플레이팅하였다. 또한 레트로바이러스 3smTR의 감염 대상이 되는 CEM-ss(Lee, H. S., et al., Gene, 161, 151-156(1995))는 RPMI 1640 배지에 소태아혈청이 10%가 되게 첨가하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였다.

형질감염은 변형된 칼슘 포스페이트 방법을 이용하였다. 즉, 용액 A(0.25M CaCl₂)에 15㎍의 플라스미드 L3smTRSN을 넣어 섞어준 뒤 이를 용액 B(50mM Hepes-NaOH, pH 7.1, 1.5mM 포스페이트 완충액, pH 6.9, 250mM NaCl)에 한 방울씩 떨어뜨리면서 잘 섞어주었다. 이 혼합물을 30 분간 상온에서 정치시킨 후 PBS로 씻어낸 세포주에 2㎖의 둘베코 변형 이글배지와 함께 넣어주었다. 37℃, 5% CO₂배양기에서 하루동안 배양한 다음 2㎖의 새로운 둘베코 변형 이글 배지로 갈아주었다. 새로운 배지에서 하루 더 배양한 뒤 레트로바이러스 3smTR이 들어있는 배지 만을 조심스럽게 취해 15㎖ 팔콘튜브(falcon tube)에 옮기고 4℃에서 3000rpm의 속도로 10 분간 원심분리하고 0.2㎛ 필터로 거른 뒤 다음 실험에 사용하거나 -70℃에 보관하였다.

실 시 예 6 : CEM-3smTR 세포주의 제조방법

3.4 X 10⁷개의 CEM-ss 세포주를 2㎖의 RPMI 1640 배지에 현탁한 뒤 실시예 5에서 얻어진 1㎖의 레트로바이러스 3smTR을 첨가하였다. 여기에 8㎎/㎖의 폴리브렌 3㎕을 첨가하여 37℃에서 흔들면서 3 시간 동안 감염시켰다. 감염이 끝난 뒤 세포만을 수확하여 40㎖의 배지를 넣어준 뒤 37℃, 5% CO₂배양기에서 하루동안 배양하였다. 이어서 다시 세포 만을 수확하여 최종 세포수가 1X10⁷세포/㎖이 되게 G418(Gibco BRL)이 750㎍/㎖ 농도로 들어 있는 RPMI 1640 배지를 첨가하였다. 감염된 세포주들을 96공 플레이트에 200㎕씩 넣어준 뒤 4배 씩 연속하여 희석시켜 최종적으로 4^-4까지 희석시켰다. 이렇게 희석시킨 세포들을 37℃, 5% CO₂배양기에서 2 내지 3주 동안 배양하였다. 가장 낮은 세포 농도에서 세포가 성장하는 것만을 골라 세포주 후보들로서 선정하였다.

실 시 예 7 : 중합효소 연쇄반응을 이용한 CEM-3smTR 세포주 후보들에서 레트로바이러스 3smTR의 염기서열 확인

실시예 6에서 얻어진 여러 개의 세포주 후보들 중에서 레트로바이러스 3smTR의 염기서열을 지니고 있는 세포주들만을 골라내기 위해 상기 실시예 1에서 합성한 프라이머 LTR380, LTR550, RRE7750 및 RRE7990을 사용하여 중합효소 연쇄반응을 통하여 레트로바이러스 3smTR의 염기서열 중 LTR 부위와 RRE 부위를 증폭시켰다. 양성 대조군으로는 레트로바이러스 벡터 L3smTRSN을 사용하였다.

중합효소 연쇄반응을 위해서는 세포주 후보들에서 게놈 DNA를 얻어 주형으로 이용하였는데 게놈 DNA의 추출방법은 다음과 같다. 세포주 후보들을 취한 뒤 1㎖의 세포만을 수확하여 150㎕의 PBS에 현탁시켰다. 여기에 300㎕의 용해 완충액(lysis buffer: 7M 우레아, 2% SDS, 350mM NaCl, 1mM EDTA, 10mM 트리스-Cl, pH 8.0)를 가하고 잘 섞어준 뒤 상온에서 5 분간 정치시켰다. 이를 1㎖ 주사기로 절단(shearing)한 뒤 페놀/클로로포름으로 2회 추출하였다. 여기에 1/10 부피의 3M 아세트산 나트륨 및 2배 부피의 100% 에탄올을 넣어 혼합한 후 원심분리하여 게놈 DNA를 얻었다. 이를 적당량의 증류수에 녹여 중합효소 연쇄반응에 사용하였다.

중합효소 연쇄반응은 주형 1㎍, 5㎕의 10배 농도 완충용액(10mM 트리스-HCl, pH 8.8, 1.5mM MgCl₂, 50mM KCl, 0.1% 트리톤-X 100), 2㎕의 dNTP 혼합액(dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP가 각각 5mM), 프라이머 50ng씩, 0.5㎕의 다이나자임(Fynnzymes Oy)을 넣은 후 증류수를 가하여 총부피를 50㎕로 하였다. 여기에 용액의 증발을 막기 위해 50㎕의 미네랄 오일을 첨가하였다. 온도 순환기(thermocycler, Ericomp)를 이용하였으며 순환 프로그램은 95℃ 30초; 50℃ 30초; 72℃ 1분의 순환을 35회 반복하였다. PCR 산물은 2% 아가로즈 젤에서 전기영동한 뒤 에티듐 브로마이드로 염색하여 관찰하였다.

도 6은 CEM-3smTR 세포주 후보들에서 레트로바이러스 3smTR의 염기서열을 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭시킨 결과를 나타낸 사진으로, 제 M 열은 파지 φX174를 HaeIII로 절단한 크기 표지이고, 제 1 열 및 제 5 열은 양성 대조군을 나타낸 것이고, 제 2 열 및 제 6 열은 세포주 CEM-3smTR(#3)을 나타낸 것이고, 제 3 열 및 제 7 열은 세포주 CEM-3smTR(#9)을 나타낸 것이고, 제 4 열 및 제 8 열은 세포주 CEM-3smTR(#10)을 나타낸 것으로, 제 1 열 내지 제 4 열은 3smTR의 LTR 부위를 증폭시킨 것이고, 제 5 열 내지 제 8 열은 3smTR의 RRE 부위를 증폭시킨 것이다.

본 발명의 레트로바이러스 3smTR의 염기서열을 지닌 CEM-3smTR#10 세포주를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1997년 1월 29일자로 기탁번호 제 KCTC 0312BP 호로서 기탁하였다.

실 시 예 8 : CEM-3smTR 세포주에서 mTR의 항 HIV-1 효과 확인

실시예 7에서 얻어진 CEM-3smTR 세포주들 중 #10을 사용하여 HIV-1을 감염시켰을 때 mTR에 의해 HIV-1 성장이 어느 정도 억제되는가를 조사하기 위하여 2.4 X 10⁶개의 CEM-3smTR 세포주를 1.2㎖의 RPMI 1640 배지에 현탁하였다. 여기에 1.2㎕의 폴리브렌(8㎎/㎖)과 4800TCID₅₀의 HIV-1을 첨가한 뒤 37℃에서 흔들면서 3 시간 동안 감염시켰다.

HIV에 의한 감염이 끝나면 소태아혈청이 들어 있지 않은 5㎖의 RPMI 1640 배지로 세포주를 두 번 씻어주고 G418이 750㎍/㎖ 농도로 첨가된 RPMI 1640 배지 12㎖에 최종적으로 현탁시켰다. 이들을 24공 플레이트에 1㎖씩 넣어주고 37℃, 5% CO₂배양기에서 계속 배양하면서 적당한 시간 간격을 두고 배지에 존재하는 HIV-1의 양을 레트로-텍 p24(Retro-Tek p24) ELISA 키트(Cellular product 사)를 사용하여 측정하였다. 비교군으로는 HIV-1이 감염 가능한 CEM-ss 세포주를 사용하였다.

도 7은 세포주 CEM-ss(a) 및 본 발명의 세포주 CEM-3smTR(b)에 있어서, HIV-1의 성장을 비교한 그래프이다.

도 8은 본 발명의 세포주 CEM-3smTR에 있어서, 감염 후 1 주일 지났을 때 5배로 세포주를 희석하여 1 주일을 더 배양하면서 HIV-1의 성장을 관찰한 그래프이다.

실 시 예 9 : CEM-3smTR에 대한 HIV-1의 감염도 비교

실시예 8에서 얻어진 바와 같이 CEM-3smTR 세포주에서는 HIV-1이 감염하면 mTR 유전자가 발현되어 세포를 죽이고 그 결과 HIV-1이 성장하지 못한다. 그러나 이러한 성장 저해가 HIV-1이 CEM-3smTR에 감염하지 못하기 때문이라는 점을 배제하기 위해 CEM-3smTR 세포주와 CEM-ss 세포주의 HIV-1에 대한 감염도를 비교하였다. 감염도 조사를 위해서는 1.6X10⁶세포의 CEM-ss와 CEM-3smTR을 준비하였다. 원심분리를 통해 세포만을 수확한 뒤 5㎖의 RPMI 1640 배지로 씻어 주고 1㎖의 RPMI 1640 배지에 현탁하였다. 여기에 1㎕ 폴리브렌(8㎎/㎖)과 1.6X10⁵TCID₅₀의 HIV-1을 첨가하여 혼합한 다음 37℃에서 3 시간 동안 흔들어 주었다. 이어서 5㎖의 RPMI 1640 배지로 두번 씻어주고 3.2㎖의 RPMI 1640 배지에 현탁하였다. 이중 1㎖를 24공 플레이트에 깔아주고 하루 또는 이틀 동안 배양한 후 수확해 실시예 7에서의 과정을 통해 게놈 DNA를 추출해냈다.

감염도 조사는 게놈 DNA로부터 HIV-1 LTR의 특정 부위만을 중합효소 연쇄 반응을 통해 증폭해내고 증폭된 산물을 8% 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동한 후 에티듐 브로마이드로 염색하여 산물의 양을 비교해 상대적인 감염도를 비교하였다.

문헌(Kim, et al., J. Virol., 63, 3708(1989))에 의하면 HIV-1이 세포에 감염 후 24 시간 내에 숙주 세포의 DNA로 끼어들어 가기 때문에, CEM-3smTR 세포주에 HIV-1을 감염시킨 다음 하루 경과 후 수확한 세포의 게놈 DNA를 주형으로 한 중합효소 연쇄반응 결과를 보면 세포주에 따른 HIV-1의 감염도가 차이가 거의 없음을 알 수 있다.

또한 주형으로 사용된 게놈 DNA의 양이 서로 비슷함을 보여주기 위해 내부 대조군(internal control)으로서 인간 베타 글로빈 유전자의 일부를 증폭하였다.

도 9는 HIV-1의 LTR 염기서열을 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭한 후 8% 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동한 결과이다. 여기에서, NC는 음성 대조군(negative control)을 나타내는 것이고, 제 M 열은 표준분자량 단백질을 나타내고, 제 1 열 및 제 4 열은 세포주 CEM-ss를 나타내고, 제 2 열 및 제 5 열은 세포주 CEM-3smTR(#9)를 나타내고, 제 3 열 및 제 6 열은 세포주 CEM-3smTR(#10)을 나타낸다.

실 시 예 10 : 세포주 CEM-3smTR의 성장 곡선

세포주 CEM-3smTR에서 HIV-1의 성장이 거의 일어나지 못하는 또 다른 원인으로 CEM-3smTR 세포주의 성장이 CEM-ss 세포주에 비해 느리기 때문일 수도 있다는 가설을 배제하기 위해, 세포주 CEM-ss와 CEM-3smTR의 성장속도를 비교하였다. CEM-3smTR과 CEM-ss 세포주를 1X10⁵세포/㎖의 농도로 T25 플라스크에서 배양하였다. 37℃, 5% CO₂배양기에서 계속 배양하면서 매일 세포수를 측정하여 성장속도를 비교하였다. 그 결과 두 세포주간에는 별 다른 성장속도의 차이가 있음을 관찰하지 못하였다.

도 10은 세포주 CEM-ss(a) 및 본 발명의 세포주 CEM-3smTR(b)의 성장속도를 비교하여 나타낸 그래프이다.

본 발명의 HIV-1의 프로모터(LTR)중 전사인자 Sp1의 인식부위 만을 3개 갖는 LTR 결손변이주(3s LTR) 하위에, TNF R1의 C-말단을 코딩하는 유해 유전자와 연결된 레트로바이러스 벡터를 HIV-1이 감염된 세포에서 발현시키는 것에 의하면 HIV-1의 증식을 억제할 수 있어 AIDS의 치료에 사용할 수 있다.

Claims (4)

1. 사람 면역결핍 바이러스-1(HIV-1)의 프로모터(LTR)중 전사인자 Sp1의 인식부위 만을 3개 갖는 LTR 결손변이주(3s LTR) 하위에, 종양괴사인자 수용체(TNF R1)의 C-말단을 코딩하는 유해 유전자와 연결된 레트로바이러스 벡터.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 유해 유전자에, HIV-1의 env 유전자 내에 존재하는 RRE(Rev-responsive element) 서열이 연결된 벡터.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   상기 유해 유전자가 종양괴사인자-α(Tumor necrosis factor-α) 수용체의 C-말단 부분(mTR)인 것을 특징으로 하는 벡터.
4. 제 3 항에 있어서,

   벡터 L3smTRSN.

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