JP3159671B2 - 遺伝子機能の多価リプレッサー - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、ウイルス遺伝子
発現の分野に関するものであって、より具体的にはＨＴ
ＬＶ-Ｉのｒｅｘ（ビリオンタンパク質発現の調節因
子）遺伝子、およびＨＩＶ-１のｒｅｖのようなその他
のレトロウイルス種におけるこれと同等な遺伝子の表現
型の発現に関するものである。
発現の分野に関するものであって、より具体的にはＨＴ
ＬＶ-Ｉのｒｅｘ（ビリオンタンパク質発現の調節因
子）遺伝子、およびＨＩＶ-１のｒｅｖのようなその他
のレトロウイルス種におけるこれと同等な遺伝子の表現
型の発現に関するものである。
【０００２】
【発明の背景】ウイルス、特にヒト免疫不全１型ウイル
ス（ＨＩＶ-１）またはヒト白血病Ｉ型ウイルス（ＨＴ
ＬＶ-Ｉ）のようなヒト・レトロウイルスは、極めて重
篤な疾患の原因となる因子である。ＨＩＶ-１の場合の
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、およびＨＴＬＶ-
Ｉの場合の成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）および熱帯性痙
れん性パラペプシスとして知られる非ガン状態がこれに
該当する。ＨＴＬＶ-IIは、病因学上、ある種の異型Ｔ細
胞毛状細胞性白血病に関連している。どちらのウイルス
群も、ＤＮＡウイルスと同様に、その複製周期が遺伝子
発現の「早期」相および「後期」相に分かていれる。遺
伝子発現の「早期」相は調節タンパク質の発現によって
特徴付けられるが、「後期」相では構造タンパク質が合
成される。
ス（ＨＩＶ-１）またはヒト白血病Ｉ型ウイルス（ＨＴ
ＬＶ-Ｉ）のようなヒト・レトロウイルスは、極めて重
篤な疾患の原因となる因子である。ＨＩＶ-１の場合の
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、およびＨＴＬＶ-
Ｉの場合の成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）および熱帯性痙
れん性パラペプシスとして知られる非ガン状態がこれに
該当する。ＨＴＬＶ-IIは、病因学上、ある種の異型Ｔ細
胞毛状細胞性白血病に関連している。どちらのウイルス
群も、ＤＮＡウイルスと同様に、その複製周期が遺伝子
発現の「早期」相および「後期」相に分かていれる。遺
伝子発現の「早期」相は調節タンパク質の発現によって
特徴付けられるが、「後期」相では構造タンパク質が合
成される。
【０００３】ＨＴＬＶ-Ｉゲノムは、Ｔａｘと呼ばれる
ウイルス転写の活性化因子を暗号化している。ＨＩＶ-
１においてＴａｘに相当するものはＴａｔと呼ばれる。
ＴａｘおよびＴａｔは、主としてウイルス遺伝子発現の
ためのレトロウイルスＬＴＲ（末端反復配列）に作用す
るようである。またＨＴＬＶ-ＩはＲｅｘと呼ばれるウ
イルス構造遺伝子発現の活性化因子を暗号化している。
機能的なＲｅｘタンパク質は、スプライスされていない
ウイルスｍＲＮＡの感染細胞の核から細胞質への移送を
増大するのに働く。これらのｍＲＮＡ種は、そこでウイ
ルスのゲノムを組立て、構造タンパク質を暗号化する。
ヒト免疫不全１型ウイルス（ＨＩＶ-１）は、Ｒｅｖと
呼ばれる相同タンパク質を暗号化している。ｒｅｖ遺伝
子生産物は、ＨＴＬＶ-Ｉ系におけるＲｅｘと同様にＨ
ＩＶ-１の構造タンパク質の発現に絶対に必要である。
ウイルス転写の活性化因子を暗号化している。ＨＩＶ-
１においてＴａｘに相当するものはＴａｔと呼ばれる。
ＴａｘおよびＴａｔは、主としてウイルス遺伝子発現の
ためのレトロウイルスＬＴＲ（末端反復配列）に作用す
るようである。またＨＴＬＶ-ＩはＲｅｘと呼ばれるウ
イルス構造遺伝子発現の活性化因子を暗号化している。
機能的なＲｅｘタンパク質は、スプライスされていない
ウイルスｍＲＮＡの感染細胞の核から細胞質への移送を
増大するのに働く。これらのｍＲＮＡ種は、そこでウイ
ルスのゲノムを組立て、構造タンパク質を暗号化する。
ヒト免疫不全１型ウイルス（ＨＩＶ-１）は、Ｒｅｖと
呼ばれる相同タンパク質を暗号化している。ｒｅｖ遺伝
子生産物は、ＨＴＬＶ-Ｉ系におけるＲｅｘと同様にＨ
ＩＶ-１の構造タンパク質の発現に絶対に必要である。
【０００４】これに関してその根底に存在している理由
は、ｒｅｖ遺伝子の生産物（および他のウイルス種にお
けるこれに対応する生産物）が、感染細胞におけるウイ
ルスｍＲＮＡ転写物をスプライスする様式の選択に対し
て劇的な効果を有していることである。ＲｅｖおよびＲ
ｅｘの場合、この効果は転写後調節、即ち完全鎖長のｍ
ＲＮＡ転写物の細胞質への移送促進によって達成され、
それによってＨＩＶ-１のＧａｇおよびＥｎｖのような
ウイルス構造タンパク質の発現が開始され、それと同時
に調節タンパク質の発現が抑制され（例えばＲｅｘにつ
いては、Ｍ.ヒダカら、ＥＭＢＯ・ジャーナル、７巻、
［１９８８年］、５１９頁参照］、または調節される
（例えばＲｅｖについては、Ｍ.Ｈ.マリムら、ネーチャ
ー、３３５巻、［１９８８年］、１８１頁参照）。した
がってＲｅｖは、ウイルス調節タンパク質（Ｔａｔおよ
びＲｅｖ等）を暗号化している完全にスプライスされた
ＨＩＶ-１ｍＲＮＡの発現には必要でない。
は、ｒｅｖ遺伝子の生産物（および他のウイルス種にお
けるこれに対応する生産物）が、感染細胞におけるウイ
ルスｍＲＮＡ転写物をスプライスする様式の選択に対し
て劇的な効果を有していることである。ＲｅｖおよびＲ
ｅｘの場合、この効果は転写後調節、即ち完全鎖長のｍ
ＲＮＡ転写物の細胞質への移送促進によって達成され、
それによってＨＩＶ-１のＧａｇおよびＥｎｖのような
ウイルス構造タンパク質の発現が開始され、それと同時
に調節タンパク質の発現が抑制され（例えばＲｅｘにつ
いては、Ｍ.ヒダカら、ＥＭＢＯ・ジャーナル、７巻、
［１９８８年］、５１９頁参照］、または調節される
（例えばＲｅｖについては、Ｍ.Ｈ.マリムら、ネーチャ
ー、３３５巻、［１９８８年］、１８１頁参照）。した
がってＲｅｖは、ウイルス調節タンパク質（Ｔａｔおよ
びＲｅｖ等）を暗号化している完全にスプライスされた
ＨＩＶ-１ｍＲＮＡの発現には必要でない。
【０００５】ＨＩＶ-１における上記の誘導選択性は、
Ｒｅｖ機能に必要なＲｅｖ応答要素（ＲＲＥ）と呼ばれ
るＲＮＡ標的配列に起因する。ＲＲＥは、ＨＩＶ-１ｅ
ｎｖ遺伝子内に存在する巨大な２３４ヌクレオチドＲＮ
Ａの二次構造と一致している。ＨＴＬＶ-Ｉにおけるこ
れと同等の構造は、Ｒｅｘ応答要素（ＲｅｘＲＥまたは
ＲＲＸ）と呼ばれる。Ｒｅｖは、配列に特異的な態様で
ＲＮＡの核放出を調節することが判明した最初のタンパ
ク質であろうと思われる。
Ｒｅｖ機能に必要なＲｅｖ応答要素（ＲＲＥ）と呼ばれ
るＲＮＡ標的配列に起因する。ＲＲＥは、ＨＩＶ-１ｅ
ｎｖ遺伝子内に存在する巨大な２３４ヌクレオチドＲＮ
Ａの二次構造と一致している。ＨＴＬＶ-Ｉにおけるこ
れと同等の構造は、Ｒｅｘ応答要素（ＲｅｘＲＥまたは
ＲＲＸ）と呼ばれる。Ｒｅｖは、配列に特異的な態様で
ＲＮＡの核放出を調節することが判明した最初のタンパ
ク質であろうと思われる。
【０００６】Ｒｅｘを例にとって説明すれば、ＨＴＬＶ
-Ｉ ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子発現の調節の際のＲｅｘ
タンパク質の完全な機能には、少なくとも３種類の機能
的に異なった活性要素、即ち、核および核小体局在化
（細胞質のすべてのタンパク質合成部位から核へ移送さ
れ、その核小体領域で濃縮される能力）、ウイルスＲＮ
Ａ（複数）におけるＲｅｘＲＥ（ＲＲＸ）配列の特異的
認識（直接的または間接的な）およびＲｅｘＲＥ配列を
含む部分的にスプライスされたウイルスｍＲＮＡ種の核
小体から細胞質への放出を実質上仲介しているこの調節
タンパク質の、現在なお未知の活性であるＲｅｘエフェ
クター活性が必要である。
-Ｉ ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子発現の調節の際のＲｅｘ
タンパク質の完全な機能には、少なくとも３種類の機能
的に異なった活性要素、即ち、核および核小体局在化
（細胞質のすべてのタンパク質合成部位から核へ移送さ
れ、その核小体領域で濃縮される能力）、ウイルスＲＮ
Ａ（複数）におけるＲｅｘＲＥ（ＲＲＸ）配列の特異的
認識（直接的または間接的な）およびＲｅｘＲＥ配列を
含む部分的にスプライスされたウイルスｍＲＮＡ種の核
小体から細胞質への放出を実質上仲介しているこの調節
タンパク質の、現在なお未知の活性であるＲｅｘエフェ
クター活性が必要である。
【０００７】これらの完全なＲｅｘ機能の要素活性を備
えているＲｅｘタンパク質（即ち、機能的ドメイン）に
おける構造局在化に関してこの発明以前に知られている
ことは、Ｒｅｘのアミノ末端の最初の２０アミノ酸でプ
ラスに荷電しているペプチドドメインが核小体局在化に
必要であるということだけである（Ｈ．シオミら、セ
ル、５５巻、［１９８８年］、１９７〜２０９頁）。
えているＲｅｘタンパク質（即ち、機能的ドメイン）に
おける構造局在化に関してこの発明以前に知られている
ことは、Ｒｅｘのアミノ末端の最初の２０アミノ酸でプ
ラスに荷電しているペプチドドメインが核小体局在化に
必要であるということだけである（Ｈ．シオミら、セ
ル、５５巻、［１９８８年］、１９７〜２０９頁）。
【０００８】上記のように、ＨＴＬＶ-Ｉに対するｒｅ
ｘ遺伝子生産物およびＨＩＶ-１に対するｒｅｖ遺伝子
生産物は、いずれもウイルスの複製に必要である（例え
ばＨＩＶについては、Ｅ．ターウイリガーら、ジャーナ
ル・オブ・ビロロジー、６２巻、［１９８８年］、６５
５頁参照）。ＲｅｘおよびＲｅｖの決定的な重要性は、
それらがその一次構造の相違にもかかわらず、機能的に
関連しており、またＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘは他のウイルス
種、即ちＨＩＶ-１でもその機能を発揮できる事実によ
って強調される（Ｌ.リムスキーら、ネーチャー、３３
５巻、[１９８８年]、７３８頁］。即ち、たとえ −ＲｅｖおよびＲｅｘがヌクレオチドおよびアミノ酸水
準でなんら有意な相同性を共有せず、 −ＲＲＥのヌクレオチド配列、およびそのステム構造お
よびループ構造がＨＴＬＶ-ＩのＲｅｘ ＲＥ（ＲＲＸ）
と異なっており、 −ＲｅｘおよびＲｅｖタンパク質の二次構造のコンピュ
ーターによる予測がなんら有意な相似性を示さず、 −Ｒｅｖタンパク質が結合するのと同じように、Ｒｅｘ
タンパク質がＲＲＥの同一部分へ結合しないようであっ
ても、それにもかかわらず、ＨＩＶ-１系で、Ｒｅｖタ
ンパク質をＲｅｘタンパク質で置き換えることが可能で
あり、さらにごく最近ＨＩＶ-２ Ｒｅｖ（Ｒｅｖ２）を
ＨＴＬＶ-Ｉ ＲｅｘおよびＨＩＶ-１ Ｒｅｖで置き換え
ることができ、また類似のＨＴＬＶ-II調節タンパク質
をＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘで置き換えできることが判明し
た。この相補性は、例えば機能的なＲｅｘタンパク質を
トランスで提供することによってｒｅｖ欠損型ＨＩＶ-
１プロウイルスを十分救援し得るものである。これに反
して、ｒｅｘ欠損型ＨＴＬＶ-Ｉプロウイルスを機能的
なＲｅｖタンパク質によって救援する逆置換はできない
ようである。即ち、この点に関して完全な対称性はな
い。この互換性の欠如に対する原理はまだ解明されてい
ないが、恐らくは標的ＲＮＡ配列認識に必要なこれらの
タンパク質の機能的な態様の相違に関連するのであろ
う。
ｘ遺伝子生産物およびＨＩＶ-１に対するｒｅｖ遺伝子
生産物は、いずれもウイルスの複製に必要である（例え
ばＨＩＶについては、Ｅ．ターウイリガーら、ジャーナ
ル・オブ・ビロロジー、６２巻、［１９８８年］、６５
５頁参照）。ＲｅｘおよびＲｅｖの決定的な重要性は、
それらがその一次構造の相違にもかかわらず、機能的に
関連しており、またＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘは他のウイルス
種、即ちＨＩＶ-１でもその機能を発揮できる事実によ
って強調される（Ｌ.リムスキーら、ネーチャー、３３
５巻、[１９８８年]、７３８頁］。即ち、たとえ −ＲｅｖおよびＲｅｘがヌクレオチドおよびアミノ酸水
準でなんら有意な相同性を共有せず、 −ＲＲＥのヌクレオチド配列、およびそのステム構造お
よびループ構造がＨＴＬＶ-ＩのＲｅｘ ＲＥ（ＲＲＸ）
と異なっており、 −ＲｅｘおよびＲｅｖタンパク質の二次構造のコンピュ
ーターによる予測がなんら有意な相似性を示さず、 −Ｒｅｖタンパク質が結合するのと同じように、Ｒｅｘ
タンパク質がＲＲＥの同一部分へ結合しないようであっ
ても、それにもかかわらず、ＨＩＶ-１系で、Ｒｅｖタ
ンパク質をＲｅｘタンパク質で置き換えることが可能で
あり、さらにごく最近ＨＩＶ-２ Ｒｅｖ（Ｒｅｖ２）を
ＨＴＬＶ-Ｉ ＲｅｘおよびＨＩＶ-１ Ｒｅｖで置き換え
ることができ、また類似のＨＴＬＶ-II調節タンパク質
をＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘで置き換えできることが判明し
た。この相補性は、例えば機能的なＲｅｘタンパク質を
トランスで提供することによってｒｅｖ欠損型ＨＩＶ-
１プロウイルスを十分救援し得るものである。これに反
して、ｒｅｘ欠損型ＨＴＬＶ-Ｉプロウイルスを機能的
なＲｅｖタンパク質によって救援する逆置換はできない
ようである。即ち、この点に関して完全な対称性はな
い。この互換性の欠如に対する原理はまだ解明されてい
ないが、恐らくは標的ＲＮＡ配列認識に必要なこれらの
タンパク質の機能的な態様の相違に関連するのであろ
う。
【０００９】調節タンパク質における突然変異は、優性
な負の表現型を有する遺伝子生産物を野生型機能へ産生
し得る（Ｉ.ヘルスコビッツ、ネーチャー、３２９巻
［１９８７年］、３１７頁）。関連のない数種のウイル
スで最近発見されたトランス優性リプレッサーとして知
られる少数の優性な負の突然変異体タンパク質の一群
は、新しい型の抗ウイルス剤であると言われる。遺伝子
分析では、負の突然変異は遺伝子機能の低下もしくは喪
失を起こすものである。優性な負の突然変異体は、変異
されなかった（即ち、野生型配列を有する）同一遺伝子
の異なったコピーが好適に機能することを防止するもの
である。これに反して、劣性の負の突然変異は野生型の
相手をそのように抑制しない。また優性突然変異の幾つ
かは、その変異体と野生型遺伝子が同一染色体（ＤＮＡ
またはＲＮＡ分子）上に位置している場合に限り、野生
型遺伝子を抑制する。この場合、この抑制型突然変異を
「シス-作用型」であると言う。一方、ある優性突然変
異では、対応する野生型遺伝子が離れた染色体上に存在
している場合でもこれを抑制し得る。この型を「トラン
ス-作用型」優性突然変異、または一層簡単にトランス
優性突然変異として分類する。
な負の表現型を有する遺伝子生産物を野生型機能へ産生
し得る（Ｉ.ヘルスコビッツ、ネーチャー、３２９巻
［１９８７年］、３１７頁）。関連のない数種のウイル
スで最近発見されたトランス優性リプレッサーとして知
られる少数の優性な負の突然変異体タンパク質の一群
は、新しい型の抗ウイルス剤であると言われる。遺伝子
分析では、負の突然変異は遺伝子機能の低下もしくは喪
失を起こすものである。優性な負の突然変異体は、変異
されなかった（即ち、野生型配列を有する）同一遺伝子
の異なったコピーが好適に機能することを防止するもの
である。これに反して、劣性の負の突然変異は野生型の
相手をそのように抑制しない。また優性突然変異の幾つ
かは、その変異体と野生型遺伝子が同一染色体（ＤＮＡ
またはＲＮＡ分子）上に位置している場合に限り、野生
型遺伝子を抑制する。この場合、この抑制型突然変異を
「シス-作用型」であると言う。一方、ある優性突然変
異では、対応する野生型遺伝子が離れた染色体上に存在
している場合でもこれを抑制し得る。この型を「トラン
ス-作用型」優性突然変異、または一層簡単にトランス
優性突然変異として分類する。
【００１０】これらの所謂トランス優性遺伝子の幾つか
は、真核生物またはヘルペスウイルスの転写因子の遺伝
子に関連して報告された（Ｉ.Ａ.ホープおよびＫ.スト
ラール、セル、４６巻、［１９８６年］、８８５頁、
Ｒ.ゲンツら、サイエンス、２４３巻、［１９８９
年］、１６９５頁、Ｓ.Ｊ.トリーゼンバーグら、ジーン
ズ・アンド・デベロップメント、２巻、［１９８８
年］、７１８頁、Ａ.Ｄ.フリードマンら、ネーチャー、
３３５巻、［１９８８年］、４５２頁）。すなわち、単
純ヘルペスウイルス・トランス-活性化因子ＶＰ１６の
ある種の欠失変異体は過発現されるとＶＰ１６機能を抑
制し、それによって正常な許容細胞でのＨＳＶ-１の複
製を阻止する。またレトロウイルスに関し、例えばＨＴ
ＬＶ-IIのＴａｘタンパク質について（Ｗ.ワックスマン
ら、サイエンス、２３５巻、［１９８７年］、６７４
頁）、またこの発明の優先日当日以後において、ＨＩＶ
-１ｔａｔ遺伝子（Ｍ.グリーンら、セル、５８巻、［１
９８９年］、およびｇａｇ遺伝子（Ｄ.トロノら、セ
ル、５９巻、［１９８９年］、１１３頁）についてトラ
ンス優性突然変異体が報告された。
は、真核生物またはヘルペスウイルスの転写因子の遺伝
子に関連して報告された（Ｉ.Ａ.ホープおよびＫ.スト
ラール、セル、４６巻、［１９８６年］、８８５頁、
Ｒ.ゲンツら、サイエンス、２４３巻、［１９８９
年］、１６９５頁、Ｓ.Ｊ.トリーゼンバーグら、ジーン
ズ・アンド・デベロップメント、２巻、［１９８８
年］、７１８頁、Ａ.Ｄ.フリードマンら、ネーチャー、
３３５巻、［１９８８年］、４５２頁）。すなわち、単
純ヘルペスウイルス・トランス-活性化因子ＶＰ１６の
ある種の欠失変異体は過発現されるとＶＰ１６機能を抑
制し、それによって正常な許容細胞でのＨＳＶ-１の複
製を阻止する。またレトロウイルスに関し、例えばＨＴ
ＬＶ-IIのＴａｘタンパク質について（Ｗ.ワックスマン
ら、サイエンス、２３５巻、［１９８７年］、６７４
頁）、またこの発明の優先日当日以後において、ＨＩＶ
-１ｔａｔ遺伝子（Ｍ.グリーンら、セル、５８巻、［１
９８９年］、およびｇａｇ遺伝子（Ｄ.トロノら、セ
ル、５９巻、［１９８９年］、１１３頁）についてトラ
ンス優性突然変異体が報告された。
【００１１】これら２つの調節タンパク質の構成および
機能における相違点から、Ｒｅｘ構造をＲｅｖタンパク
質またはその既知の突然変異体の構造と比較しても、ウ
イルスタンパク質のトランス優性リプレッサーを産生し
得る突然変異体を選択する指針は全く提供されないこと
が分かる。
機能における相違点から、Ｒｅｘ構造をＲｅｖタンパク
質またはその既知の突然変異体の構造と比較しても、ウ
イルスタンパク質のトランス優性リプレッサーを産生し
得る突然変異体を選択する指針は全く提供されないこと
が分かる。
【００１２】上記の概念の治療適用の意味は、遺伝子操
作によって優性な負の突然変異を作り出し、それによっ
て得られた遺伝子が、それが発現されると、野生型機能
の活性を破壊する突然変異体の調節タンパク質を暗号化
していることによって、有害遺伝子生産物の生産もしく
は過生産を抑制することであろう（Ｉ.ヘルスコビッ
ツ、ネーチャー、３２９巻、［１９８７年］、２１９
頁）。このようにウイルス感染、例えばレトロウイルス
感染状態では、不可欠な調節遺伝子に類似の抑制因子、
例えばｒｅｖまたはｒｅｘ遺伝子の抑制因子を組み立て
ることによって、対応するウイルス機能のトランス優性
リプレッサーを提供することは極めて望ましいように思
われる。この研究方法、即ち１９８８年に最初に提案さ
れたウイルス感染処置のための研究方法（Ｄ.バルチモ
ア、ネーチャー、３３５巻、［１９８８年］、３９５
頁］は「細胞内免疫」に必要な手段を提供するはずであ
る。
作によって優性な負の突然変異を作り出し、それによっ
て得られた遺伝子が、それが発現されると、野生型機能
の活性を破壊する突然変異体の調節タンパク質を暗号化
していることによって、有害遺伝子生産物の生産もしく
は過生産を抑制することであろう（Ｉ.ヘルスコビッ
ツ、ネーチャー、３２９巻、［１９８７年］、２１９
頁）。このようにウイルス感染、例えばレトロウイルス
感染状態では、不可欠な調節遺伝子に類似の抑制因子、
例えばｒｅｖまたはｒｅｘ遺伝子の抑制因子を組み立て
ることによって、対応するウイルス機能のトランス優性
リプレッサーを提供することは極めて望ましいように思
われる。この研究方法、即ち１９８８年に最初に提案さ
れたウイルス感染処置のための研究方法（Ｄ.バルチモ
ア、ネーチャー、３３５巻、［１９８８年］、３９５
頁］は「細胞内免疫」に必要な手段を提供するはずであ
る。
【００１３】
【発明の要旨】ＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘ遺伝子および対応す
るＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝子の遺伝子操作による優性転換
体を作成した。その生産物は、ＨＴＬＶ-Ｉ、ＨＴＬＶ-
II、またはＨＩＶ-１の複製をそれぞれ阻止した。また
ｒｅｘまたはｒｅｖ遺伝子の遺伝子操作によるこれらの
優性転換体の幾つかの生産物は、ＨＴＬＶ-Ｉ（および
若干のＨＴＬＶ-II例）およびＨＩＶ-１（および若干の
ＨＩＶ-２およびＳＩＶ例）の複製を双方とも阻止し
た。
るＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝子の遺伝子操作による優性転換
体を作成した。その生産物は、ＨＴＬＶ-Ｉ、ＨＴＬＶ-
II、またはＨＩＶ-１の複製をそれぞれ阻止した。また
ｒｅｘまたはｒｅｖ遺伝子の遺伝子操作によるこれらの
優性転換体の幾つかの生産物は、ＨＴＬＶ-Ｉ（および
若干のＨＴＬＶ-II例）およびＨＩＶ-１（および若干の
ＨＩＶ-２およびＳＩＶ例）の複製を双方とも阻止し
た。
【００１４】この成績は、１種類以上のウイルス種で作
用するウイルス性リプレッサー生産物、即ち１種類以上
のウイルス種の機能的に等価な遺伝子の表現型発現を抑
制するトランス優性な遺伝子生産物が生じることを報告
した最初のものであろうと思われる。
用するウイルス性リプレッサー生産物、即ち１種類以上
のウイルス種の機能的に等価な遺伝子の表現型発現を抑
制するトランス優性な遺伝子生産物が生じることを報告
した最初のものであろうと思われる。
【００１５】このようにこの発明は、１種類以上のウイ
ルス種の機能的に等価な遺伝子の表現型発現をトランス
優性に抑制し、それによって１種類以上のウイルス種の
複製を阻止するタンパク質を暗号化している遺伝子、特
に以下に報告するｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７およ
びｐｃＲｅｘＭ８、Ｍ６、Ｍ７およびＭ１３、およびｐ
Ｍ１０における突然変異遺伝子に関するものである。
ルス種の機能的に等価な遺伝子の表現型発現をトランス
優性に抑制し、それによって１種類以上のウイルス種の
複製を阻止するタンパク質を暗号化している遺伝子、特
に以下に報告するｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７およ
びｐｃＲｅｘＭ８、Ｍ６、Ｍ７およびＭ１３、およびｐ
Ｍ１０における突然変異遺伝子に関するものである。
【００１６】この発明はまた、ＨＴＬＶ-Ｉおよび／ま
たはＨＴＬＶ-IIのｒｅｘ遺伝子の表現型発現をトラン
ス優性に抑制するタンパク質を暗号化している遺伝子、
ならびにＨＩＶ-１および／またはＨＩＶ-２および／ま
たはＳＩＶのｒｅｖ遺伝子の表現型発現をトランス優性
に抑制するタンパク質を暗号化している遺伝子に関する
ものであって、特に以下に報告するｐｃＲｅｘＭ２、ｐ
ｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ８、ｐｃＲｅｘＭ１７およ
びｐｃＲｅｘ１３Δ１５、ｐＭ１０、ｐΔ９/１４、ｐ
Δ１０/１４、ｐＭ２１、ｐＭ２２、ｐＭ２７、ｐＭ２
８、ｐＭ２９およびｐＭ３２、およびＭ６、Ｍ７および
Ｍ１３における突然変異体遺伝子に関するものである。
たはＨＴＬＶ-IIのｒｅｘ遺伝子の表現型発現をトラン
ス優性に抑制するタンパク質を暗号化している遺伝子、
ならびにＨＩＶ-１および／またはＨＩＶ-２および／ま
たはＳＩＶのｒｅｖ遺伝子の表現型発現をトランス優性
に抑制するタンパク質を暗号化している遺伝子に関する
ものであって、特に以下に報告するｐｃＲｅｘＭ２、ｐ
ｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ８、ｐｃＲｅｘＭ１７およ
びｐｃＲｅｘ１３Δ１５、ｐＭ１０、ｐΔ９/１４、ｐ
Δ１０/１４、ｐＭ２１、ｐＭ２２、ｐＭ２７、ｐＭ２
８、ｐＭ２９およびｐＭ３２、およびＭ６、Ｍ７および
Ｍ１３における突然変異体遺伝子に関するものである。
【００１７】この発明はまた、好適な発現系から対応す
る野生型遺伝子を単離し、この遺伝子を好適なクローニ
ング系へ加え、所望の突然変異を該遺伝子へ導入し、所
望の突然変異を保有するクローンから、生じた突然変体
異遺伝子を回収することを含むこれらの遺伝子の生産方
法に関する。この発明はまた、好適な発現系および増幅
系で上記の突然変異遺伝子を発現し、これを増幅して、
発現した生産物を回収することを含む上記のタンパク質
の生産方法に関する。
る野生型遺伝子を単離し、この遺伝子を好適なクローニ
ング系へ加え、所望の突然変異を該遺伝子へ導入し、所
望の突然変異を保有するクローンから、生じた突然変体
異遺伝子を回収することを含むこれらの遺伝子の生産方
法に関する。この発明はまた、好適な発現系および増幅
系で上記の突然変異遺伝子を発現し、これを増幅して、
発現した生産物を回収することを含む上記のタンパク質
の生産方法に関する。
【００１８】この発明はまた、１種類以上のウイルス種
の機能的に等価な遺伝子の表現型発現をトランス優性に
抑制し、それによって１種類以上のウイルス種の複製を
阻止するタンパク質、特に以下に報告するｐｃＲｅｘＭ
２、ｐｃＲｅｘＭ７およびｐｃＲｅｘＭ８、Ｍ６、Ｍ７
およびＭ１３、およびｐＭ１０の突然変異体タンパク質
に関するものである。
の機能的に等価な遺伝子の表現型発現をトランス優性に
抑制し、それによって１種類以上のウイルス種の複製を
阻止するタンパク質、特に以下に報告するｐｃＲｅｘＭ
２、ｐｃＲｅｘＭ７およびｐｃＲｅｘＭ８、Ｍ６、Ｍ７
およびＭ１３、およびｐＭ１０の突然変異体タンパク質
に関するものである。
【００１９】この発明はまた、ＨＴＬＶ-Ｉおよび／ま
たはＨＴＬＶ-IIのｒｅｘ遺伝子の表現型発現をトラン
ス優性に抑制するタンパク質、およびＨＩＶ-１および
／またはＨＩＶ-２および／またはＳＩＶのｒｅｖ遺伝
子の表現型発現をトランス優性に抑制するタンパク質に
関するものであって、特に以下に報告するｐｃＲｅｘＭ
２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ８、ｐｃＲｅｘＭ１
７およびｐｃＲｅｘ１３Δ１５、ｐＭ１０、ｐΔ９/１
４、ｐΔ１０/１４、ｐＭ２１、ｐＭ２２、ｐＭ２７、
ｐＭ２８、ｐＭ２９およびｐＭ３２、およびＭ６、Ｍ７
およびＭ１３の突然変異体タンパク質に関する。
たはＨＴＬＶ-IIのｒｅｘ遺伝子の表現型発現をトラン
ス優性に抑制するタンパク質、およびＨＩＶ-１および
／またはＨＩＶ-２および／またはＳＩＶのｒｅｖ遺伝
子の表現型発現をトランス優性に抑制するタンパク質に
関するものであって、特に以下に報告するｐｃＲｅｘＭ
２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ８、ｐｃＲｅｘＭ１
７およびｐｃＲｅｘ１３Δ１５、ｐＭ１０、ｐΔ９/１
４、ｐΔ１０/１４、ｐＭ２１、ｐＭ２２、ｐＭ２７、
ｐＭ２８、ｐＭ２９およびｐＭ３２、およびＭ６、Ｍ７
およびＭ１３の突然変異体タンパク質に関する。
【００２０】またこの発明は、生体内または生体外で、
上記の遺伝子を標的哺乳動物細胞へ機能的な状態で送達
するのに好適な形で含んでいるベクター、例えばレトロ
ウイルスベクターまたはプラスミドベクターに関する。
上記の遺伝子を標的哺乳動物細胞へ機能的な状態で送達
するのに好適な形で含んでいるベクター、例えばレトロ
ウイルスベクターまたはプラスミドベクターに関する。
【００２１】またこの発明は、上記の遺伝子またはタン
パク質を、所望の予防的または治療的効果を達成する好
適な形で、例えば患者の身体から採取し、再挿入する前
に生体外で処理した細胞の形で、製薬上許容し得る担体
または希釈剤とともに含有する医薬組成物に関する。
パク質を、所望の予防的または治療的効果を達成する好
適な形で、例えば患者の身体から採取し、再挿入する前
に生体外で処理した細胞の形で、製薬上許容し得る担体
または希釈剤とともに含有する医薬組成物に関する。
【００２２】またこの発明は、上記の遺伝子またはタン
パク質を、所望の予防的または治療的効果を達成するの
に好適な形で、例えば患者の体から採取し、再挿入する
前に生体外で処理した細胞の形で、そのような処置を必
要とする対象へ投与することを含んでなるウイルス感染
の処置方法に関する。
パク質を、所望の予防的または治療的効果を達成するの
に好適な形で、例えば患者の体から採取し、再挿入する
前に生体外で処理した細胞の形で、そのような処置を必
要とする対象へ投与することを含んでなるウイルス感染
の処置方法に関する。
【００２３】「処置」の語は、ウイルス感染の予防的お
よび治療的処置の意味であって、ここで「治療的」とは
ウイルス感染を潜伏段階で安定化させることを含む。ま
たこの発明は、ここに定義した遺伝子、タンパク質およ
びＤＮＡセグメントの医薬品としての使用に関する。
よび治療的処置の意味であって、ここで「治療的」とは
ウイルス感染を潜伏段階で安定化させることを含む。ま
たこの発明は、ここに定義した遺伝子、タンパク質およ
びＤＮＡセグメントの医薬品としての使用に関する。
【００２４】またこの発明は、機能的な断片または誘導
体、即ち機能的に等価である断片または誘導体の形の上
記の遺伝子およびタンパク質に関する。「機能的な断片
または誘導体」の語は、インタクトな突然変異遺伝子ま
たはタンパク質の薬理学的活性と質的に同一で、量的に
同一または異なった、即ちインタクトな突然変異遺伝子
またはタンパク質の薬理学的活性より一層強いかまたは
弱い、例えば約１％〜約１００００％、特に約１０％〜
約１０００％の薬理学的活性を有する断片または誘導体
を意味する。
体、即ち機能的に等価である断片または誘導体の形の上
記の遺伝子およびタンパク質に関する。「機能的な断片
または誘導体」の語は、インタクトな突然変異遺伝子ま
たはタンパク質の薬理学的活性と質的に同一で、量的に
同一または異なった、即ちインタクトな突然変異遺伝子
またはタンパク質の薬理学的活性より一層強いかまたは
弱い、例えば約１％〜約１００００％、特に約１０％〜
約１０００％の薬理学的活性を有する断片または誘導体
を意味する。
【００２５】またこの発明は、本明細書に示した遺伝
子、タンパク質およびＤＮＡセグメントから誘導され、
トランス優性（即ち、上記の突然変異体ＲｅｘまたはＲ
ｅｖタンパク質で、主としてＲＮＡ結合ドメイン）を真
似ることができる低分子量の抑制因子または中和モノク
ローナル抗体のような抑制因子に関する。ここで低分子
量とは約１０ｋＤ以下の分子量、ことに約１ｋＤ以下の
分子量を意味する。
子、タンパク質およびＤＮＡセグメントから誘導され、
トランス優性（即ち、上記の突然変異体ＲｅｘまたはＲ
ｅｖタンパク質で、主としてＲＮＡ結合ドメイン）を真
似ることができる低分子量の抑制因子または中和モノク
ローナル抗体のような抑制因子に関する。ここで低分子
量とは約１０ｋＤ以下の分子量、ことに約１ｋＤ以下の
分子量を意味する。
【００２６】この発明はさらに、以下に挙げる諸態様に
関する。 −第１および第２ドメインを含んでなるＨＩＶ-１ Ｒｅ
ｖ機能のトランス優性リプレッサー。ここで第１ドメイ
ンは野生型ＨＩＶ-１ Ｒｅｖの特異的結合機能を実質上
保有し、第２ドメインは野生型ＨＩＶ-１ Ｒｅｖの活性
化機能を保有せず、また第２ドメインは１またはそれ以
上の突然変異体によって野生型ＨＩＶ-１Ｒｅｖから修
飾されたものであり、好ましくは第１ドメインは野生型
Ｒｅｖのおよそのアミノ酸位置１０〜およそのアミノ酸
位置６８からなり、修飾された第２ドメインは野生型Ｒ
ｅｖのおよそのアミノ酸位置６８〜およそのアミノ酸位
置９０から誘導され、ことに上記の１またはそれ以上の
突然変異は、野生型Ｒｅｖのおよそのアミノ酸位置６８
とおよそのアミノ酸位置９０の間、好ましくは約７８〜
約８６の間、特に約７８〜約８３または約８４の間で起
こるミスセンス変異または欠失変異であって、野生型Ｈ
ＩＶ-１ Ｒｅｖの第１ドメインの特異的結合機能は、実
質上機能的に残存し、特に以下に報告するリプレッサー
ｐＭ１０、ｐＭ２１、ｐＭ２２、ｐＭ２７、ｐＭ２８、
ｐＭ２９およびｐＭ３２、および機能的なその断片また
は誘導体である。
関する。 −第１および第２ドメインを含んでなるＨＩＶ-１ Ｒｅ
ｖ機能のトランス優性リプレッサー。ここで第１ドメイ
ンは野生型ＨＩＶ-１ Ｒｅｖの特異的結合機能を実質上
保有し、第２ドメインは野生型ＨＩＶ-１ Ｒｅｖの活性
化機能を保有せず、また第２ドメインは１またはそれ以
上の突然変異体によって野生型ＨＩＶ-１Ｒｅｖから修
飾されたものであり、好ましくは第１ドメインは野生型
Ｒｅｖのおよそのアミノ酸位置１０〜およそのアミノ酸
位置６８からなり、修飾された第２ドメインは野生型Ｒ
ｅｖのおよそのアミノ酸位置６８〜およそのアミノ酸位
置９０から誘導され、ことに上記の１またはそれ以上の
突然変異は、野生型Ｒｅｖのおよそのアミノ酸位置６８
とおよそのアミノ酸位置９０の間、好ましくは約７８〜
約８６の間、特に約７８〜約８３または約８４の間で起
こるミスセンス変異または欠失変異であって、野生型Ｈ
ＩＶ-１ Ｒｅｖの第１ドメインの特異的結合機能は、実
質上機能的に残存し、特に以下に報告するリプレッサー
ｐＭ１０、ｐＭ２１、ｐＭ２２、ｐＭ２７、ｐＭ２８、
ｐＭ２９およびｐＭ３２、および機能的なその断片また
は誘導体である。
【００２７】−野生型ＨＩＶ-１ Ｒｅｖの特異的結合機
能を実質上保有する第１ドメインを含んでいるＨＩＶ-
１ Ｒｅｖ機能のトランス優性リプレッサー。このトラ
ンス優性リプレッサーは野生型ＨＩＶ-１ Ｒｅｖの活性
化機能を有せず、好ましくは第１ドメインは野生型Ｒｅ
ｖのおよそのアミノ酸位置１０〜およそのアミノ酸位置
６８を含んでおり、トランス優性リプレッサーは野生型
Ｒｅｖのおよそのアミノ酸位置６８〜少なくともおよそ
のアミノ酸位置９０を欠いている、特に以下に報告する
リプレッサーｐΔ９/１４およびｐΔ１０/１４、または
機能的なその断片または誘導体である。
能を実質上保有する第１ドメインを含んでいるＨＩＶ-
１ Ｒｅｖ機能のトランス優性リプレッサー。このトラ
ンス優性リプレッサーは野生型ＨＩＶ-１ Ｒｅｖの活性
化機能を有せず、好ましくは第１ドメインは野生型Ｒｅ
ｖのおよそのアミノ酸位置１０〜およそのアミノ酸位置
６８を含んでおり、トランス優性リプレッサーは野生型
Ｒｅｖのおよそのアミノ酸位置６８〜少なくともおよそ
のアミノ酸位置９０を欠いている、特に以下に報告する
リプレッサーｐΔ９/１４およびｐΔ１０/１４、または
機能的なその断片または誘導体である。
【００２８】−ＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘタンパク質の機能の
トランス優性リプレッサーを暗号化しているＤＮＡセグ
メント。このリプレッサーは、Ｒｅｘタンパク質のエフ
ェクター活性を有する野生型Ｒｅｘタンパク質のペプチ
ドドメインにおいて、少なくとも１種類のトランス優性
な負の突然変異によってＲｅｘタンパク質の野生型から
修飾されたものであり、このリプレッサーは、Ｒｅｘタ
ンパク質の野生型形態の核小体局在化活性を実質上保有
しており、好ましくは野生型Ｒｅｘタンパク質のペプチ
ドドメインが、およそのアミノ酸位置５９〜およそのア
ミノ酸位置１２１、特に５９、６０、６４、６５、１１
９、１２０および１２１のアミノ酸位置の任意の１つに
含んでいるＤＮＡセグメント、特に下記の突然変異体ｒ
ｅｘ遺伝子、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ１３、およびＨＴＬＶ-Ｉ
Ｒｅｘタンパク質機能のトランス優性な抑制を示すその
変異体および誘導体の何れかを含んでいるＤＮＡセグメ
ント。
トランス優性リプレッサーを暗号化しているＤＮＡセグ
メント。このリプレッサーは、Ｒｅｘタンパク質のエフ
ェクター活性を有する野生型Ｒｅｘタンパク質のペプチ
ドドメインにおいて、少なくとも１種類のトランス優性
な負の突然変異によってＲｅｘタンパク質の野生型から
修飾されたものであり、このリプレッサーは、Ｒｅｘタ
ンパク質の野生型形態の核小体局在化活性を実質上保有
しており、好ましくは野生型Ｒｅｘタンパク質のペプチ
ドドメインが、およそのアミノ酸位置５９〜およそのア
ミノ酸位置１２１、特に５９、６０、６４、６５、１１
９、１２０および１２１のアミノ酸位置の任意の１つに
含んでいるＤＮＡセグメント、特に下記の突然変異体ｒ
ｅｘ遺伝子、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ１３、およびＨＴＬＶ-Ｉ
Ｒｅｘタンパク質機能のトランス優性な抑制を示すその
変異体および誘導体の何れかを含んでいるＤＮＡセグメ
ント。
【００２９】−野生型形態から、好ましくはＨＩＶ-１
ｒｅｖタンパク質の機能またはＨＴＬＶ-II Ｒｅｘタン
パクの機能の何れかの抑制能を保有するように修飾され
たＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘタンパク質機能の対応するトラン
ス優性リプレッサー。
ｒｅｖタンパク質の機能またはＨＴＬＶ-II Ｒｅｘタン
パクの機能の何れかの抑制能を保有するように修飾され
たＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘタンパク質機能の対応するトラン
ス優性リプレッサー。
【００３０】−（ｉ）−Ｒｅｘタンパク質によって認識
される調節応答要素、および少なくとも１個の未使用の
スプライス部位（即ち、スプライス認識配列によって結
合され、ただし該ｍＲＮＡからスプライスされたもので
はない領域またはイントロン）を含んでいるｍＲＮＡを
暗号化しているＤＮＡセグメント、
される調節応答要素、および少なくとも１個の未使用の
スプライス部位（即ち、スプライス認識配列によって結
合され、ただし該ｍＲＮＡからスプライスされたもので
はない領域またはイントロン）を含んでいるｍＲＮＡを
暗号化しているＤＮＡセグメント、
【００３１】−発現すると、核からのｍＲＮＡの放出を
誘発するタンパク質生産物を生産することが可能なｒｅ
ｘ遺伝子を暗号化しているＤＮＡセグメント、 −ｒｅｘ遺伝子を暗号化しているＤＮＡセグメントおよ
びｍＲＮＡを暗号化しているＤＮＡセグメントによって
形質転換され、ｒｅｘ遺伝子のタンパク質生産物発現能
およびｍＲＮＡ発現能を保有する宿主を含んでなる遺伝
子系を提供し、
誘発するタンパク質生産物を生産することが可能なｒｅ
ｘ遺伝子を暗号化しているＤＮＡセグメント、 −ｒｅｘ遺伝子を暗号化しているＤＮＡセグメントおよ
びｍＲＮＡを暗号化しているＤＮＡセグメントによって
形質転換され、ｒｅｘ遺伝子のタンパク質生産物発現能
およびｍＲＮＡ発現能を保有する宿主を含んでなる遺伝
子系を提供し、
【００３２】（ii）この遺伝子系の細胞を含んでいる培
養を、Ｒｅｘタンパク質の特異的抑制因子であることが
疑われる因子が細胞へ侵入するような条件下で、該因子
と接触させ、（iii）未使用のスプライス部位を含んで
いるｍＲＮＡの核からの放出に対するこの因子の効果を
測定し、（iv）スプライス部位を使用したｍＲＮＡのス
プライス形態の核からの放出に対する該因子の効果を測
定し、
養を、Ｒｅｘタンパク質の特異的抑制因子であることが
疑われる因子が細胞へ侵入するような条件下で、該因子
と接触させ、（iii）未使用のスプライス部位を含んで
いるｍＲＮＡの核からの放出に対するこの因子の効果を
測定し、（iv）スプライス部位を使用したｍＲＮＡのス
プライス形態の核からの放出に対する該因子の効果を測
定し、
【００３３】それによって未使用のスプライス部位を含
んでいるｍＲＮＡの放出が低下し、それと同時にｍＲＮ
Ａのスプライス形態が低下しなければ、該因子がＨＴＬ
Ｖ-Ｉｒｅｘ遺伝子の活性またはｒｅｘ遺伝子生産物の
活性の特異的な抑制因子、即ち、Ｒｅｘタンパク質によ
って認識される、好ましくはＨＴＬＶ-Ｉ、ＨＴＬＶ-II
およびＨＩＶ-１から選ばれたウイルスのｍＲＮＡから
誘導されたｍＲＮＡ調節要素であることを示す段階を含
んでなるＲｅｘタンパク質の遺伝子活性化機能の特異的
抑制因子の同定方法。
んでいるｍＲＮＡの放出が低下し、それと同時にｍＲＮ
Ａのスプライス形態が低下しなければ、該因子がＨＴＬ
Ｖ-Ｉｒｅｘ遺伝子の活性またはｒｅｘ遺伝子生産物の
活性の特異的な抑制因子、即ち、Ｒｅｘタンパク質によ
って認識される、好ましくはＨＴＬＶ-Ｉ、ＨＴＬＶ-II
およびＨＩＶ-１から選ばれたウイルスのｍＲＮＡから
誘導されたｍＲＮＡ調節要素であることを示す段階を含
んでなるＲｅｘタンパク質の遺伝子活性化機能の特異的
抑制因子の同定方法。
【００３４】−未使用のスプライス部位を含んでいるｍ
ＲＮＡで暗号化された第１タンパク質の生産水準を測定
することによって、好ましくは未使用のスプライス部位
を含んでいるｍＲＮＡの放出の低下を検出し、ｍＲＮＡ
のスプライス形態で暗号化された第２タンパク質の生産
水準を測定することによって、好ましくはｍＲＮＡのス
プライス形態の放出の増大を検出する上記の同定方法。
ＲＮＡで暗号化された第１タンパク質の生産水準を測定
することによって、好ましくは未使用のスプライス部位
を含んでいるｍＲＮＡの放出の低下を検出し、ｍＲＮＡ
のスプライス形態で暗号化された第２タンパク質の生産
水準を測定することによって、好ましくはｍＲＮＡのス
プライス形態の放出の増大を検出する上記の同定方法。
【００３５】−調節応答要素およびスプライス部位を含
んでいるｍＲＮＡが、ＲｅｘおよびＴａｘタンパク質の
コード領域、完全なｅｎｖ遺伝子、Ｒｅｘ応答要素およ
び３'ＬＴＲ全体を含んでいるＨＴＬＶ-Ｉプロウイルス
の３'末端を含んでなるプラスミド、好ましくは下記に
説明するプラスミドｐｇＴＡＸ-ＬＴＲによって暗号化
されており、好ましくはｒｅｘ遺伝子をプラスミドｐＲ
ｅｘへ提供することからなる上記の同定方法。
んでいるｍＲＮＡが、ＲｅｘおよびＴａｘタンパク質の
コード領域、完全なｅｎｖ遺伝子、Ｒｅｘ応答要素およ
び３'ＬＴＲ全体を含んでいるＨＴＬＶ-Ｉプロウイルス
の３'末端を含んでなるプラスミド、好ましくは下記に
説明するプラスミドｐｇＴＡＸ-ＬＴＲによって暗号化
されており、好ましくはｒｅｘ遺伝子をプラスミドｐＲ
ｅｘへ提供することからなる上記の同定方法。
【００３６】−プラスミドｐｇＴＡＸ-ＬＴＲ。 −Ｒｅｘタンパク質によって認識される調節応答要素を
含んでいるｍＲＮＡ、および少なくとも１個の未使用の
スプライス部位を暗号化しているＤＮＡセグメント、 −発現されると、核からのｍＲＮＡの放出を誘発するタ
ンパク質生産物を生産することが可能なｒｅｘ遺伝子を
暗号化しているＤＮＡセグメント、 −ｒｅｘ遺伝子を暗号化しているＤＮＡセグメント、お
よびｍＲＮＡを暗号化しているＤＮＡセグメントによっ
て形質転換された細胞であって、ｒｅｘ遺伝子のタンパ
ク質生産物発現能およびｍＲＮＡ発現能を保有する宿主
細胞を含有する容器を含んでなる上記の同定方法によっ
てＲｅｘタンパク質の遺伝子活性化機能の特異的抑制因
子を同定するためのスクリーニング用試薬キット。
含んでいるｍＲＮＡ、および少なくとも１個の未使用の
スプライス部位を暗号化しているＤＮＡセグメント、 −発現されると、核からのｍＲＮＡの放出を誘発するタ
ンパク質生産物を生産することが可能なｒｅｘ遺伝子を
暗号化しているＤＮＡセグメント、 −ｒｅｘ遺伝子を暗号化しているＤＮＡセグメント、お
よびｍＲＮＡを暗号化しているＤＮＡセグメントによっ
て形質転換された細胞であって、ｒｅｘ遺伝子のタンパ
ク質生産物発現能およびｍＲＮＡ発現能を保有する宿主
細胞を含有する容器を含んでなる上記の同定方法によっ
てＲｅｘタンパク質の遺伝子活性化機能の特異的抑制因
子を同定するためのスクリーニング用試薬キット。
【００３７】−ＨＩＶ-１、ＨＴＬＶ-Ｉ、またはＨＴＬ
Ｖ-IIウイルスのうちの１つを複製する能力を有する細
胞へ上記のＤＮＡセグメントを導入して、該ＤＮＡセグ
メントを発現し、ＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘ機能のトランス優
性リプレッサーを生産することを含むこれらのウイルス
の複製を抑制する方法。
Ｖ-IIウイルスのうちの１つを複製する能力を有する細
胞へ上記のＤＮＡセグメントを導入して、該ＤＮＡセグ
メントを発現し、ＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘ機能のトランス優
性リプレッサーを生産することを含むこれらのウイルス
の複製を抑制する方法。
【００３８】−ＨＩＶ-１で感染した細胞へＨＩＶ-１
Ｒｅｖ機能のトランス優性リプレッーを導入することを
含むＨＩＶ-１、ＨＩＶ-２およびＳＩＶ、特にＨＩＶ-
１の複製の抑制方法。
Ｒｅｖ機能のトランス優性リプレッーを導入することを
含むＨＩＶ-１、ＨＩＶ-２およびＳＩＶ、特にＨＩＶ-
１の複製の抑制方法。
【００３９】
［４.１］５.１および６.１項のための図面 第１図：ＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘのヌクレオチドおよびアミ
ノ酸配列［オリゴヌクレオチドによって置換されたアミ
ノ酸位置（１）（アミノ酸位置８７、８８、８９）およ
び（２）（アミノ酸位置９４）、およびアミノ酸位置８
２、９０、９１、９７を番号で示した］。完全配列は５
６７個のヌクレオチドを含んでおり、１８９個のアミノ
酸を暗号化している。 第１Ａ図：ＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘ遺伝子へ導入した２９ケ
所の突然変異の位置。ＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘ遺伝子は１８
９個のアミノ酸タンパク質を暗号化している。部位特異
的突然変異誘発法を用い、特定のアミノ酸残基でミスセ
ンス置換を導入し（枠で囲んで示す）、ｒｅｘ遺伝子内
の位置にしたがってそれぞれ命名した。
ノ酸配列［オリゴヌクレオチドによって置換されたアミ
ノ酸位置（１）（アミノ酸位置８７、８８、８９）およ
び（２）（アミノ酸位置９４）、およびアミノ酸位置８
２、９０、９１、９７を番号で示した］。完全配列は５
６７個のヌクレオチドを含んでおり、１８９個のアミノ
酸を暗号化している。 第１Ａ図：ＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘ遺伝子へ導入した２９ケ
所の突然変異の位置。ＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘ遺伝子は１８
９個のアミノ酸タンパク質を暗号化している。部位特異
的突然変異誘発法を用い、特定のアミノ酸残基でミスセ
ンス置換を導入し（枠で囲んで示す）、ｒｅｘ遺伝子内
の位置にしたがってそれぞれ命名した。
【００４０】第２Ａ図：Ｒｅｘ免疫沈降 Ｒｅｘ免疫沈降後、３０種のｒｅｘ突然変異体のうち７
種のＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析（ｐ
ｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ８、ｐｃ
ＲｅｘＭ１３、ｐｃＲｅｘＭ１４、ｐｃＲｅｘＭ１７お
よびｐｃＲｅｘ１３Δ１５は、なおＲｅｘタンパク質を
生産していることが判る）。 Ａ.ｐｇｔａｔ（Ｒｅｘ抗体の陰性対照） Ｂ.ｐｃＲｅｘ Ｃ.ｐｃＲｅｘＭ２ Ｄ.ｐｃＲｅｘＭ７ Ｅ.ｐｃＲｅｘＭ８ Ｆ.ｐｃＲｅｘＭ１３ Ｇ.ｐｃＲｅｘＭ１４ Ｈ.ｐｃＲｅｘＭ１７（このレーンにおける低分子量
は、恐らく例えばリン酸化によるこのタンパク質の修飾
の変化に起因するものであろう） Ｉ.ｐｃＲｅｘ１３Δ１５
種のＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析（ｐ
ｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ８、ｐｃ
ＲｅｘＭ１３、ｐｃＲｅｘＭ１４、ｐｃＲｅｘＭ１７お
よびｐｃＲｅｘ１３Δ１５は、なおＲｅｘタンパク質を
生産していることが判る）。 Ａ.ｐｇｔａｔ（Ｒｅｘ抗体の陰性対照） Ｂ.ｐｃＲｅｘ Ｃ.ｐｃＲｅｘＭ２ Ｄ.ｐｃＲｅｘＭ７ Ｅ.ｐｃＲｅｘＭ８ Ｆ.ｐｃＲｅｘＭ１３ Ｇ.ｐｃＲｅｘＭ１４ Ｈ.ｐｃＲｅｘＭ１７（このレーンにおける低分子量
は、恐らく例えばリン酸化によるこのタンパク質の修飾
の変化に起因するものであろう） Ｉ.ｐｃＲｅｘ１３Δ１５
【００４１】第２Ｂ図：突然変異体の生物学的表現型 第２Ａ図関連、Ｔａｔ免疫沈降後。 Ａ.ｐｇｔａｔ＋ｐＸＦ３ Ｂ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ Ｃ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ Ｄ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘＭ２ Ｅ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘＭ７ Ｆ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘＭ８ Ｇ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘＭ１３ Ｈ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘＭ１４ Ｉ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘＭ１７ Ｋ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ１３Δ１５
【００４２】第２Ｃ図：第２Ｂ図関連（幾つかのＲｅｘ
突然変異体、即ちｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐ
ｃＲｅｘＭ８、ｐｃＲｅｘＭ１４、ｐｃＲｅｘＭ１７お
よびｐｃＲｅｘ１３Δ１５は、野生型Ｒｅｘよりもトラ
ンス優性である） Ａ.ｐｇｔａｔ＋ｐＸＦ３＋ｐＸＦ３ Ｂ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐＸＦ３ Ｃ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐｃＲｅｘＭ２ Ｄ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐｃＲｅｘＭ７ Ｅ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐｃＲｅｘＭ８ Ｆ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐｃＲｅｘＭ１３ Ｇ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐｃＲｅｘＭ１４ Ｈ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐｃＲｅｘＭ１７ Ｉ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐｃＲｅｘ１３Δ１５
突然変異体、即ちｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐ
ｃＲｅｘＭ８、ｐｃＲｅｘＭ１４、ｐｃＲｅｘＭ１７お
よびｐｃＲｅｘ１３Δ１５は、野生型Ｒｅｘよりもトラ
ンス優性である） Ａ.ｐｇｔａｔ＋ｐＸＦ３＋ｐＸＦ３ Ｂ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐＸＦ３ Ｃ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐｃＲｅｘＭ２ Ｄ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐｃＲｅｘＭ７ Ｅ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐｃＲｅｘＭ８ Ｆ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐｃＲｅｘＭ１３ Ｇ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐｃＲｅｘＭ１４ Ｈ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐｃＲｅｘＭ１７ Ｉ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｘ＋ｐｃＲｅｘ１３Δ１５
【００４３】第２Ｄ図：第２Ｂ図関連（幾つかのＲｅｘ
突然変異体、即ちｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐ
ｃＲｅｘＭ８およびｐｃＲｅｘＭ１３は、野生型Ｒｅｖ
よりも部分的にトランス優性である） Ａ.ｐｇｔａｔ＋ｐＸＦ３＋ｐＸＦ３ Ｂ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐＸＦ３ Ｃ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐｃＲｅｘＭ２ Ｄ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐｃＲｅｘＭ７ Ｅ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐｃＲｅｘＭ８ Ｆ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐｃＲｅｘＭ１３ Ｇ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐｃＲｅｘＭ１４ Ｈ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐｃＲｅｘＭ１７ Ｉ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐｃＲｅｘ１３Δ１５
突然変異体、即ちｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐ
ｃＲｅｘＭ８およびｐｃＲｅｘＭ１３は、野生型Ｒｅｖ
よりも部分的にトランス優性である） Ａ.ｐｇｔａｔ＋ｐＸＦ３＋ｐＸＦ３ Ｂ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐＸＦ３ Ｃ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐｃＲｅｘＭ２ Ｄ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐｃＲｅｘＭ７ Ｅ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐｃＲｅｘＭ８ Ｆ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐｃＲｅｘＭ１３ Ｇ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐｃＲｅｘＭ１４ Ｈ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐｃＲｅｘＭ１７ Ｉ.ｐｇｔａｔ＋ｐｃＲｅｖ＋ｐｃＲｅｘ１３Δ１５
【００４４】第３図：組み立てられたＲｅｘ突然変異体 第４図：ｒｅｘ暗号配列を突然変異誘発するために合成
された２９種のオリゴヌクレオチド配列
された２９種のオリゴヌクレオチド配列
【００４５】［４.２］５.２および６.２項のための図
面 第５図：ＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝子へ導入された突然変異
の位置。ＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝子は予測した配列で示さ
れる１１６個のアミノ酸タンパク質を暗号化している。
ｒｅｖの２つの暗号エキソン間の境界を示す（ＳＰ）。
オリゴヌクレオチドの指令による突然変異誘発によっ
て、集中発生させた点変異（ｐＭ）を導入した（枠で囲
って示した残基）。これらの突然変異は、Ｒｅｖ内のそ
れぞれの位置によって、最もＮ-末端をｐＭ１、最もＣ-
末端をｐＭ１４と命名した。導入された突然変異は、す
べて２〜４個の隣接アミノ酸に影響を与え、すべて（ｐ
Ｍ７を除いて）独特のＢｇｌII部位をｒｅｖ遺伝子配列
へ導入した。これらの導入部位は、それに続くＮ-およ
びＣ-末端の欠失（ｐΔ）変異体の組み立てを促進し
た。ｐΔ変異体は欠失の範囲によって命名され、例えば
ｐΔ１１/１４は導入したｐＭ１１およびｐＭ１４突然
変異の間を欠失している。 第５Ａ図：ＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝子へさらに導入された
ミスセンスおよび欠失変異の位置（−は欠失したアミノ
酸）。
面 第５図：ＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝子へ導入された突然変異
の位置。ＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝子は予測した配列で示さ
れる１１６個のアミノ酸タンパク質を暗号化している。
ｒｅｖの２つの暗号エキソン間の境界を示す（ＳＰ）。
オリゴヌクレオチドの指令による突然変異誘発によっ
て、集中発生させた点変異（ｐＭ）を導入した（枠で囲
って示した残基）。これらの突然変異は、Ｒｅｖ内のそ
れぞれの位置によって、最もＮ-末端をｐＭ１、最もＣ-
末端をｐＭ１４と命名した。導入された突然変異は、す
べて２〜４個の隣接アミノ酸に影響を与え、すべて（ｐ
Ｍ７を除いて）独特のＢｇｌII部位をｒｅｖ遺伝子配列
へ導入した。これらの導入部位は、それに続くＮ-およ
びＣ-末端の欠失（ｐΔ）変異体の組み立てを促進し
た。ｐΔ変異体は欠失の範囲によって命名され、例えば
ｐΔ１１/１４は導入したｐＭ１１およびｐＭ１４突然
変異の間を欠失している。 第５Ａ図：ＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝子へさらに導入された
ミスセンスおよび欠失変異の位置（−は欠失したアミノ
酸）。
【００４６】第６図：ｐｃＲＥＶのＤＮＡおよび対応す
るアミノ酸配列。 第７図：突然変異部位Ｍ１〜Ｍ１４に対応するＤＮＡ配
列。 第８図：ＨＩＶ-１ ｒｅｖおよびｔａｔのトランス-活
性化因子の免疫沈降。 第９図：ＨＩＶ-１プロウイルスの救援検定。 第１０図：間接免疫蛍光法によるＲｅｖおよび選ばれた
Ｒｅｖ突然変異体の亜細胞位置測定。 第１１Ａおよび１１Ｂ図：Ｒｅｖ突然変異体の優性な負
の表現型分析。 第１２図：Ｒｅｖ機能の競合抑制。 第１２Ａ図：ＨＩＶ-１ ｒｅｖトランス-活性化因子の
ドメイン構造。１１６個のアミノ酸の完全鎖長タンパク
質は、ウイルスのｅｎｖ遺伝子と極めて符合するイント
ロンによって分割された２つのエキソンによって暗号化
されている。「結合」および「活性化」ドメインは、そ
れぞれ（およそ）２３〜５６および７８〜８３の残基を
含んでおり、ハッチング枠で囲って示す。Ｓはスプライ
ス部位。ＮＬは、「Ａｒｇに富んだ」ＲＮＡ結合モチー
フによってかなりの独自性を共有している核局在化に重
要な高塩基性領域。
るアミノ酸配列。 第７図：突然変異部位Ｍ１〜Ｍ１４に対応するＤＮＡ配
列。 第８図：ＨＩＶ-１ ｒｅｖおよびｔａｔのトランス-活
性化因子の免疫沈降。 第９図：ＨＩＶ-１プロウイルスの救援検定。 第１０図：間接免疫蛍光法によるＲｅｖおよび選ばれた
Ｒｅｖ突然変異体の亜細胞位置測定。 第１１Ａおよび１１Ｂ図：Ｒｅｖ突然変異体の優性な負
の表現型分析。 第１２図：Ｒｅｖ機能の競合抑制。 第１２Ａ図：ＨＩＶ-１ ｒｅｖトランス-活性化因子の
ドメイン構造。１１６個のアミノ酸の完全鎖長タンパク
質は、ウイルスのｅｎｖ遺伝子と極めて符合するイント
ロンによって分割された２つのエキソンによって暗号化
されている。「結合」および「活性化」ドメインは、そ
れぞれ（およそ）２３〜５６および７８〜８３の残基を
含んでおり、ハッチング枠で囲って示す。Ｓはスプライ
ス部位。ＮＬは、「Ａｒｇに富んだ」ＲＮＡ結合モチー
フによってかなりの独自性を共有している核局在化に重
要な高塩基性領域。
【００４７】［４.３］５.３および６.３項のための図
面 第１３図： （Ａ）ＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘタンパク質のアミノ酸配列お
よび導入された２５ケ所の点変異の個々の位置。それぞ
れ枠組みで囲ったアミノ酸を暗号化しているヌクレオチ
ドを除き、アスパラギン酸−ロイシン-ジペプチドを暗
号化したオリゴヌクレオチドで、枠組みのまま置き換え
た。 （Ｂ）Ｒｅｘ応答性ｐｇＴＡＸ-ＬＴＲ発現ベクターの
構造。ＨｉｎｄIII部位［マップ位置５０１３（Ｍ.セイ
キら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８
０巻、［１９８３年］、３６１８〜３６２２頁）］から
３'ＬＴＲまでのＣＲ-１ＨＴＬＶ-Ｉプロウイルスの３'
末端を、ｐＢＣ１２/ＣＭＶ発現ベクターへ挿入した。
この断片は、Ｔａｘの２つの暗号エキソン（白枠）、完
全なｅｎｖ遺伝子、およびＲｅｘＲＥ（ＲＲＸ）を含ん
だＨＴＬＶ-Ｉの３'ＬＴＲの全体を含んでいる（Ｓ.Ｍ.
ハンリーら、ジーンズ・アンド・デベロップメント、３
巻、［１９８９年］、１５３４〜１５４４頁）。
面 第１３図： （Ａ）ＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘタンパク質のアミノ酸配列お
よび導入された２５ケ所の点変異の個々の位置。それぞ
れ枠組みで囲ったアミノ酸を暗号化しているヌクレオチ
ドを除き、アスパラギン酸−ロイシン-ジペプチドを暗
号化したオリゴヌクレオチドで、枠組みのまま置き換え
た。 （Ｂ）Ｒｅｘ応答性ｐｇＴＡＸ-ＬＴＲ発現ベクターの
構造。ＨｉｎｄIII部位［マップ位置５０１３（Ｍ.セイ
キら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８
０巻、［１９８３年］、３６１８〜３６２２頁）］から
３'ＬＴＲまでのＣＲ-１ＨＴＬＶ-Ｉプロウイルスの３'
末端を、ｐＢＣ１２/ＣＭＶ発現ベクターへ挿入した。
この断片は、Ｔａｘの２つの暗号エキソン（白枠）、完
全なｅｎｖ遺伝子、およびＲｅｘＲＥ（ＲＲＸ）を含ん
だＨＴＬＶ-Ｉの３'ＬＴＲの全体を含んでいる（Ｓ.Ｍ.
ハンリーら、ジーンズ・アンド・デベロップメント、３
巻、［１９８９年］、１５３４〜１５４４頁）。
【００４８】第１４図： （Ａ）ＲｅｘはｐｇＴＡＸ-ＬＴＲベクターによってＨ
ＴＬＶ-ＩＥｎｖタンパク質の発現を活性化する（Ｒｅ
ｖまたはＩＬ-２は活性化しない）。ＣＯＳ細胞の亜集
密的培養を、ｐｇＴＡＸ-ＬＴＲとｐＲＥＸ（Ｌ.リムス
キーら、ネーチャー、［１９８８年］、７３８頁）、ｐ
ＲＥＶ（Ｍ.Ｈ.マリムら、ネーチャー、３３５巻、［１
９８８年］、１８１〜１８３頁）、またはｐＣＭＶ-Ｉ
Ｌ-２（Ｂ.Ｒ.カレン、セル、４６巻、［１９８６
年］、９７３〜９８２頁）で、同時トランスフェクトし
た。最終レーンは、ｐｇＴＡＸ-ＬＴＲの存在なしでｐ
ＲＥＸで細胞をトランスフェクトしたものである。Ｅｎ
ｖタンパク質生産を免疫沈降およびゲル電気泳動法によ
って分析した。分子量既知の標準の移動を左側に示し
た。
ＴＬＶ-ＩＥｎｖタンパク質の発現を活性化する（Ｒｅ
ｖまたはＩＬ-２は活性化しない）。ＣＯＳ細胞の亜集
密的培養を、ｐｇＴＡＸ-ＬＴＲとｐＲＥＸ（Ｌ.リムス
キーら、ネーチャー、［１９８８年］、７３８頁）、ｐ
ＲＥＶ（Ｍ.Ｈ.マリムら、ネーチャー、３３５巻、［１
９８８年］、１８１〜１８３頁）、またはｐＣＭＶ-Ｉ
Ｌ-２（Ｂ.Ｒ.カレン、セル、４６巻、［１９８６
年］、９７３〜９８２頁）で、同時トランスフェクトし
た。最終レーンは、ｐｇＴＡＸ-ＬＴＲの存在なしでｐ
ＲＥＸで細胞をトランスフェクトしたものである。Ｅｎ
ｖタンパク質生産を免疫沈降およびゲル電気泳動法によ
って分析した。分子量既知の標準の移動を左側に示し
た。
【００４９】（Ｂ）ｒｅｘ突然変異体のＲｅｘ機能分
析。２５種のｒｅｘ突然変異体（Ｍ１〜Ｍ１８およびＭ
２１〜Ｍ２７と命名（第１３Ａ図参照）、Ｍ１９および
Ｍ２０と命名した突然変異体は組み立てなかった）をｐ
ＢＣ１２/ＣＭＶ発現ベクターへ挿入した後、それぞれ
ｐｇＴＡＸ-ＬＴＲと同時トランスフェクトし、実施例
１２に記載したように、培養をＲｅｘ特異的ＨＴＬＶ-
ＩＥｎｖタンパク質発現について分析した。
析。２５種のｒｅｘ突然変異体（Ｍ１〜Ｍ１８およびＭ
２１〜Ｍ２７と命名（第１３Ａ図参照）、Ｍ１９および
Ｍ２０と命名した突然変異体は組み立てなかった）をｐ
ＢＣ１２/ＣＭＶ発現ベクターへ挿入した後、それぞれ
ｐｇＴＡＸ-ＬＴＲと同時トランスフェクトし、実施例
１２に記載したように、培養をＲｅｘ特異的ＨＴＬＶ-
ＩＥｎｖタンパク質発現について分析した。
【００５０】第１５図：ｐｇＴＡＸ-ＬＴＲと、不活性
な（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ１３）、または損傷さ
れた（Ｍ１５）Ｒｅｘ突然変異体ベクター、または野生
型ｐＲＥＸ、ｐＲＥＶおよびｐＣＭＶ-ＩＬ-２ベクター
で同時トランスフェクトしたＣＯＳ細胞におけるＨＴＬ
Ｖ-ＩＥｎｖ、ＴａｘおよびＲｅｘタンパク質の免疫沈
降による同時分析。（Ａ）はＥｎｖ生産、（Ｂ）はＴａ
ｘ生産、（Ｃ）は野生型および突然変異体Ｒｅｘタンパ
ク質生産。
な（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ１３）、または損傷さ
れた（Ｍ１５）Ｒｅｘ突然変異体ベクター、または野生
型ｐＲＥＸ、ｐＲＥＶおよびｐＣＭＶ-ＩＬ-２ベクター
で同時トランスフェクトしたＣＯＳ細胞におけるＨＴＬ
Ｖ-ＩＥｎｖ、ＴａｘおよびＲｅｘタンパク質の免疫沈
降による同時分析。（Ａ）はＥｎｖ生産、（Ｂ）はＴａ
ｘ生産、（Ｃ）は野生型および突然変異体Ｒｅｘタンパ
ク質生産。
【００５１】第１６図：ＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘ突然変異体
の免疫蛍光法による亜細胞的位置確認。野生型、Ｍ６、
Ｍ７およびＭ１３Ｒｅｘタンパク質は発現細胞の核小体
および核に局在している。これとは対照的にＭ１ Ｒｅ
ｘタンパク質は細胞質でのみ検出されるが、Ｍ２タンパ
ク質は細胞全体にわたって分布している。Ｍ１５突然変
異体は発現細胞の核に局在しているが、野生型Ｒｅｘタ
ンパク質とは対照的に核小体から排除されるようであ
る。
の免疫蛍光法による亜細胞的位置確認。野生型、Ｍ６、
Ｍ７およびＭ１３Ｒｅｘタンパク質は発現細胞の核小体
および核に局在している。これとは対照的にＭ１ Ｒｅ
ｘタンパク質は細胞質でのみ検出されるが、Ｍ２タンパ
ク質は細胞全体にわたって分布している。Ｍ１５突然変
異体は発現細胞の核に局在しているが、野生型Ｒｅｘタ
ンパク質とは対照的に核小体から排除されるようであ
る。
【００５２】第１７図： （Ａ）ｒｅｘ突然変異体の野生型Ｒｅｘタンパク質機能
の抑制能の分析。各培養をｐｇＴＡＸ-ＬＴＲ、ｐＲＥ
Ｘと、何れか１つのＲｅｘ突然変異体（レーン１〜
６）、ｐＲＥＸ（レーン７）、ｐＲＥＶ（レーン８）、
またはｐＣＭＶ-ＩＬ-２（レーン９）で同時トランスフ
ェクトした。ＨＴＬＶ-ＩＥｎｖ生産を第１４図と同様
に分析した。 （Ｂ）ＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘトランス優性突然変異体は、
ＨＩＶ-１ Ｒｅｖタンパク質の機能を抑制する。細胞を
ｐｇＴＡＴ、ｐＲＥＶと、ｐＢＣ/ＣＭＶ-ＩＬ-２、ま
たはＭ６、Ｍ７、Ｍ１３トランス優性Ｒｅｘ突然変異体
で同時トランスフェクトさせ、先端を切り取られた７２
アミノ酸の形のＴａｔタンパク質のＲｅｖ誘導生産につ
いて検定した（レーン２）。Ｍ６、Ｍ７、Ｍ１３（レー
ン３〜５）はＨＩＶ-１ Ｒｅｖタンパク質を完全に抑制
し、Ｔａｔタンパク質の完全鎖長の８６アミノ酸の形だ
けが検出された。 （Ｃ）ＨＴＬＶ-Ｉのトランス優性Ｒｅｘ突然変異体
は、Ｒｅｖ欠損型ＨＩＶ-１プロウイルスの複製のＲｅ
ｘ救援を阻止する。グラフに示した倍数だけそれぞれ過
剰のＭ１、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ１３突然変異体の存在で、ｒ
ｅｖ欠損型ＨＩＶ-１プロウイルスプラスミドとｐＲＥ
Ｘで細胞を同時感染させた。ＨＩＶ-１ｐ２４Ｇａｇタ
ンパク質の上清濃度を測定した。
の抑制能の分析。各培養をｐｇＴＡＸ-ＬＴＲ、ｐＲＥ
Ｘと、何れか１つのＲｅｘ突然変異体（レーン１〜
６）、ｐＲＥＸ（レーン７）、ｐＲＥＶ（レーン８）、
またはｐＣＭＶ-ＩＬ-２（レーン９）で同時トランスフ
ェクトした。ＨＴＬＶ-ＩＥｎｖ生産を第１４図と同様
に分析した。 （Ｂ）ＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘトランス優性突然変異体は、
ＨＩＶ-１ Ｒｅｖタンパク質の機能を抑制する。細胞を
ｐｇＴＡＴ、ｐＲＥＶと、ｐＢＣ/ＣＭＶ-ＩＬ-２、ま
たはＭ６、Ｍ７、Ｍ１３トランス優性Ｒｅｘ突然変異体
で同時トランスフェクトさせ、先端を切り取られた７２
アミノ酸の形のＴａｔタンパク質のＲｅｖ誘導生産につ
いて検定した（レーン２）。Ｍ６、Ｍ７、Ｍ１３（レー
ン３〜５）はＨＩＶ-１ Ｒｅｖタンパク質を完全に抑制
し、Ｔａｔタンパク質の完全鎖長の８６アミノ酸の形だ
けが検出された。 （Ｃ）ＨＴＬＶ-Ｉのトランス優性Ｒｅｘ突然変異体
は、Ｒｅｖ欠損型ＨＩＶ-１プロウイルスの複製のＲｅ
ｘ救援を阻止する。グラフに示した倍数だけそれぞれ過
剰のＭ１、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ１３突然変異体の存在で、ｒ
ｅｖ欠損型ＨＩＶ-１プロウイルスプラスミドとｐＲＥ
Ｘで細胞を同時感染させた。ＨＩＶ-１ｐ２４Ｇａｇタ
ンパク質の上清濃度を測定した。
【００５３】
【詳細な説明】この発明を実施する際に用いる方法およ
び技術は、従来技術既知のものである。使用するウイル
ス種は、ＨＴＬＶ-Ｉ、ＨＴＬＶ-II、ＳＩＶ、ＨＩＶ-
１、ＨＩＶ-２のような、分類学上、明瞭なウイルス種
を意味する。この発明は、特にレトロウイルスの分野、
とりわけヒト・レトロウイルスに関する。
び技術は、従来技術既知のものである。使用するウイル
ス種は、ＨＴＬＶ-Ｉ、ＨＴＬＶ-II、ＳＩＶ、ＨＩＶ-
１、ＨＩＶ-２のような、分類学上、明瞭なウイルス種
を意味する。この発明は、特にレトロウイルスの分野、
とりわけヒト・レトロウイルスに関する。
【００５４】その発現を抑制することがこの発明の最終
目的である遺伝子は、好ましくはプロウイルスを活性化
して、感染性粒子、例えばＨＩＶ-１およびＨＩＶ-２の
ｒｅｖのような感染粒子へと成熟をもたらす機能のよう
な好ましくない特性を暗号化している遺伝子である。
目的である遺伝子は、好ましくはプロウイルスを活性化
して、感染性粒子、例えばＨＩＶ-１およびＨＩＶ-２の
ｒｅｖのような感染粒子へと成熟をもたらす機能のよう
な好ましくない特性を暗号化している遺伝子である。
【００５５】本明細書で使用するｒｅｖおよびＲｅｖと
は、特に特定しない限り、それぞれＨＩＶ-１ ｒｅｖお
よびＨＩＶ-１ Ｒｅｖを意味する。したがってＨＩＶ-
２のようなその他のウイルス種のこれに対応するｒｅｖ
およびＲｅｖの場合は、それぞれ「ＨＩＶ-２ ｒｅｖ
（ｒｅｖ２）」および「ＨＩＶ-２ Ｒｅｖ（Ｒｅｖ
２）」等のように特定して示す。
は、特に特定しない限り、それぞれＨＩＶ-１ ｒｅｖお
よびＨＩＶ-１ Ｒｅｖを意味する。したがってＨＩＶ-
２のようなその他のウイルス種のこれに対応するｒｅｖ
およびＲｅｖの場合は、それぞれ「ＨＩＶ-２ ｒｅｖ
（ｒｅｖ２）」および「ＨＩＶ-２ Ｒｅｖ（Ｒｅｖ
２）」等のように特定して示す。
【００５６】本明細書で特にその製法を説明しない場
合、出発物質、または試薬として使用する化合物、ベク
ター、細胞系等は、既知で一般に入手可能なものであ
り、あるいは既知で一般に入手可能な材料から通常の方
法で入手し得、または既知で一般に入手可能な材料から
通常の方法でそれと等価のものを生産し得るものであ
る。例えばＲｅｘ遺伝子はＨＴＬＶ-Ｉの任意の単離物
から、そしてＲｅｖ遺伝子はＨＩＶ-１の任意の単離物
から回収し得、ｐｇＴＡＸ-ＬＴＲは、例えばＨＵＴ１
０２またはＭＴ１から回収し得る。別法として、遺伝暗
号にしたがって遺伝子を化学合成により作り出し、必要
なアミノ酸配列を有するタンパク質を生産し得る。Ｒｅ
ｘまたはＲｅｖ機能のトランス優性リプレッサーは、標
準的な組み換えＤＮＡ法、またはペプチド合成のための
標準的な化学的方法、またはこれら方法の組み合わせに
よって生産され、それらはすべて通常の方法である。
合、出発物質、または試薬として使用する化合物、ベク
ター、細胞系等は、既知で一般に入手可能なものであ
り、あるいは既知で一般に入手可能な材料から通常の方
法で入手し得、または既知で一般に入手可能な材料から
通常の方法でそれと等価のものを生産し得るものであ
る。例えばＲｅｘ遺伝子はＨＴＬＶ-Ｉの任意の単離物
から、そしてＲｅｖ遺伝子はＨＩＶ-１の任意の単離物
から回収し得、ｐｇＴＡＸ-ＬＴＲは、例えばＨＵＴ１
０２またはＭＴ１から回収し得る。別法として、遺伝暗
号にしたがって遺伝子を化学合成により作り出し、必要
なアミノ酸配列を有するタンパク質を生産し得る。Ｒｅ
ｘまたはＲｅｖ機能のトランス優性リプレッサーは、標
準的な組み換えＤＮＡ法、またはペプチド合成のための
標準的な化学的方法、またはこれら方法の組み合わせに
よって生産され、それらはすべて通常の方法である。
【００５７】［５.１］この発明の一態様は、ＨＴＬＶ-
ＩにおけるＲｅｘ機能のトランス優性リプレッサー、特
に機能的に等価な、ただし構造的には無関係なＨＩＶ-
１におけるＲｅｖ機能に対しても同様に有効であるＨＴ
ＬＶ-ＩにおけるＲｅｘ機能のトランス優性リプレッサ
ーに関する。
ＩにおけるＲｅｘ機能のトランス優性リプレッサー、特
に機能的に等価な、ただし構造的には無関係なＨＩＶ-
１におけるＲｅｖ機能に対しても同様に有効であるＨＴ
ＬＶ-ＩにおけるＲｅｘ機能のトランス優性リプレッサ
ーに関する。
【００５８】具体的には、修飾したｒｅｘ暗号配列を組
み立て、これを発現させて、上記の特性を有することを
発見した。「オリゴヌクレオチドの指令による生体外突
然変異誘発系、見解２」［アマーシャム、英国（１９８
８年）、コードＲＰＮ.１５２３）］（以下、「アマー
シャム・プロトコール」と略称する）にしたがい、購入
可能な突然変異誘発系を用いて野生型ｒｅｘ暗号配列
（第１図参照）を変化させた。目的の発現ベクターの組
み立ては（１）ｒｅｘ暗号配列を保有するバクテリオフ
ァージＭ１３ベクターの作成、（２）ｒｅｘ暗号配列の
突然変異誘発、（３）突然変異遺伝子の哺乳動物発現プ
ラスミドへの再クローン化により、逐次、尾部形成段階
を実施した。
み立て、これを発現させて、上記の特性を有することを
発見した。「オリゴヌクレオチドの指令による生体外突
然変異誘発系、見解２」［アマーシャム、英国（１９８
８年）、コードＲＰＮ.１５２３）］（以下、「アマー
シャム・プロトコール」と略称する）にしたがい、購入
可能な突然変異誘発系を用いて野生型ｒｅｘ暗号配列
（第１図参照）を変化させた。目的の発現ベクターの組
み立ては（１）ｒｅｘ暗号配列を保有するバクテリオフ
ァージＭ１３ベクターの作成、（２）ｒｅｘ暗号配列の
突然変異誘発、（３）突然変異遺伝子の哺乳動物発現プ
ラスミドへの再クローン化により、逐次、尾部形成段階
を実施した。
【００５９】欠失変異体１つを含んだ突然変異体３０種
を組み立てた。２９種の部位特異的突然変異の位置およ
び性質を第３図に示す。突然変異誘発に使用した対応す
るオリゴヌクレオチドを第４図に挙げた。これらはすべ
てＢｇｌＩＩ制限部位を保有している。
を組み立てた。２９種の部位特異的突然変異の位置およ
び性質を第３図に示す。突然変異誘発に使用した対応す
るオリゴヌクレオチドを第４図に挙げた。これらはすべ
てＢｇｌＩＩ制限部位を保有している。
【００６０】ｒｅｘ暗号配列をプラスミドｐｃＲｅｘ
（ｐＲＥＸ）から単離した（Ｌ.リムスキーら、ネーチ
ャー、３３５巻、［１９８８年］、７３８頁）。野生型
ｒｅｘ遺伝子のための他の供給源も入手可能である。こ
のように、例えばＨＴＬＶ-Ｉのｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎ
ｖおよびｔａｘ遺伝子について報告された類似の方法
（Ｂ.Ｋ.デおよびＡ.スリニバサン、ヌクレイック・ア
シッズ・リサーチ、１７巻、５号、［１９８９年］、２
１４２頁）によって、ＨＵＴ１０２（ＴＩＢ１６２）お
よびＭＴ２（Ｊ.Ｇ.ソドロスキーら、サイエンス、２２
５巻、［１９８４年］、３８１頁、Ｉ.ミヨシら、ネー
チャー、２９４巻、［１９８１年］、７７０頁、Ｖ.マ
ンザリら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳ
Ａ、８０巻、［１９８３年］、１５７４頁）のような株
化したＨＴＬＶ-Ｉ感染細胞系の全ゲノムから、例えば
ポリメラーゼ連鎖反応を利用してｒｅｘ遺伝子をクロー
ン化し得る。
（ｐＲＥＸ）から単離した（Ｌ.リムスキーら、ネーチ
ャー、３３５巻、［１９８８年］、７３８頁）。野生型
ｒｅｘ遺伝子のための他の供給源も入手可能である。こ
のように、例えばＨＴＬＶ-Ｉのｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎ
ｖおよびｔａｘ遺伝子について報告された類似の方法
（Ｂ.Ｋ.デおよびＡ.スリニバサン、ヌクレイック・ア
シッズ・リサーチ、１７巻、５号、［１９８９年］、２
１４２頁）によって、ＨＵＴ１０２（ＴＩＢ１６２）お
よびＭＴ２（Ｊ.Ｇ.ソドロスキーら、サイエンス、２２
５巻、［１９８４年］、３８１頁、Ｉ.ミヨシら、ネー
チャー、２９４巻、［１９８１年］、７７０頁、Ｖ.マ
ンザリら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳ
Ａ、８０巻、［１９８３年］、１５７４頁）のような株
化したＨＴＬＶ-Ｉ感染細胞系の全ゲノムから、例えば
ポリメラーゼ連鎖反応を利用してｒｅｘ遺伝子をクロー
ン化し得る。
【００６１】ｔａｔおよびｒｅｖ暗号配列を、プラスミ
ドｐｇＴａｔおよびｐｃＲｅｖ（Ｍ.Ｈ.マリムら、ネー
チャー、３３５巻、［１９８８年］、１８１頁）から単
離した。別法として、それらは例えばλＨＸＢＺ（エイ
ズ・リサーチ・アンド・リファレンス・リアジェント・
プログラム（１９８９年６月、ＮＩＨ）、カタログ番号
７０）のようなＨＩＶプロウイルスクローンから単離し
得る。
ドｐｇＴａｔおよびｐｃＲｅｖ（Ｍ.Ｈ.マリムら、ネー
チャー、３３５巻、［１９８８年］、１８１頁）から単
離した。別法として、それらは例えばλＨＸＢＺ（エイ
ズ・リサーチ・アンド・リファレンス・リアジェント・
プログラム（１９８９年６月、ＮＩＨ）、カタログ番号
７０）のようなＨＩＶプロウイルスクローンから単離し
得る。
【００６２】得られた各種のｒｅｘ遺伝子の生物学的活
性を、ＣＯＳ細胞におけるさまざまな遺伝子発現による
ＨＩＶ-１ ｒｅｖおよびＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘ遺伝子生産
物の作用に対し感度の高い検定により試験した（グルツ
マンら、セル、２３巻、［１９８１年］、１７５頁）。
またウイルス構造タンパク質の合成が開始されると、Ｒ
ｅｖおよびＲｅｘタンパク質は、何れも先端が切り取ら
れた形のＨＩＶ-１Ｔａｔ調節タンパク質の生産を誘導
する（Ｍ.Ｈ.マリムら、ネーチャー、３３５巻、［１９
８８年］、１８１〜１８３頁、Ｌ.リムスキーら、ネー
チャー、３３５巻、［１９８８年］、７３８〜７４０
頁）。ゲノムＨＩＶ-１ｔａｔ遺伝子を機能的なＨＩＶ-
１ ｒｅｖ遺伝子またはＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘ遺伝子と一
緒に同時発現すると、Ｔａｔの先端が切り取られた７２
アミノ酸鎖長のエキソン１個形を暗号化したスプライス
されてないｔａｔｍＲＮＡの細胞質発現をもたらす。機
能的なＲｅｖまたはＲｅｘタンパク質が存在しない場合
は、Ｔａｔエキソン２個形に対応する８６アミノ酸の完
全鎖長のＴａｔタンパク質の発現を起こす。このように
ｒｅｖまたはｒｅｘ機能の活性トランスリプレッサーの
存在は、７２アミノ酸のＴａｔタンパク質の生産の低下
または消滅をもたらす。この相違は、免疫沈降分析によ
って容易に可視化することができる。
性を、ＣＯＳ細胞におけるさまざまな遺伝子発現による
ＨＩＶ-１ ｒｅｖおよびＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘ遺伝子生産
物の作用に対し感度の高い検定により試験した（グルツ
マンら、セル、２３巻、［１９８１年］、１７５頁）。
またウイルス構造タンパク質の合成が開始されると、Ｒ
ｅｖおよびＲｅｘタンパク質は、何れも先端が切り取ら
れた形のＨＩＶ-１Ｔａｔ調節タンパク質の生産を誘導
する（Ｍ.Ｈ.マリムら、ネーチャー、３３５巻、［１９
８８年］、１８１〜１８３頁、Ｌ.リムスキーら、ネー
チャー、３３５巻、［１９８８年］、７３８〜７４０
頁）。ゲノムＨＩＶ-１ｔａｔ遺伝子を機能的なＨＩＶ-
１ ｒｅｖ遺伝子またはＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘ遺伝子と一
緒に同時発現すると、Ｔａｔの先端が切り取られた７２
アミノ酸鎖長のエキソン１個形を暗号化したスプライス
されてないｔａｔｍＲＮＡの細胞質発現をもたらす。機
能的なＲｅｖまたはＲｅｘタンパク質が存在しない場合
は、Ｔａｔエキソン２個形に対応する８６アミノ酸の完
全鎖長のＴａｔタンパク質の発現を起こす。このように
ｒｅｖまたはｒｅｘ機能の活性トランスリプレッサーの
存在は、７２アミノ酸のＴａｔタンパク質の生産の低下
または消滅をもたらす。この相違は、免疫沈降分析によ
って容易に可視化することができる。
【００６３】第２Ｃ図に示したように、３０種の突然変
異体のうちの６種の、即ちｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘ
Ｍ７、ｐｃＲｅｘＭ８、ｐｃＲｅｘＭ１４、ｐｃＲｅｘ
Ｍ１７およびｐｃＲｅｘ１３Δ１５は、トランス優性な
Ｒｅｘリプレッサーを有していることが判明した。また
ｐｃＲｅｖの場合でも（第２Ｄ図参照）、これと同一の
様式、即ちｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅ
ｘＭ８、および部分的にｐｃＲｅｘＭ１３で認められ、
トランス優性はＨＴＬＶ-Ｉ遺伝子に限定されたもので
はなく、幾つかの変異体では、両方の遺伝子に対してト
ランス優性であり、即ちこの特別な例としてｐｃＲｅｘ
Ｍ２、ｐｃＲｅｘＭ７およびｐｃＲｅｘＭ８が挙げられ
ることが判明した。
異体のうちの６種の、即ちｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘ
Ｍ７、ｐｃＲｅｘＭ８、ｐｃＲｅｘＭ１４、ｐｃＲｅｘ
Ｍ１７およびｐｃＲｅｘ１３Δ１５は、トランス優性な
Ｒｅｘリプレッサーを有していることが判明した。また
ｐｃＲｅｖの場合でも（第２Ｄ図参照）、これと同一の
様式、即ちｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅ
ｘＭ８、および部分的にｐｃＲｅｘＭ１３で認められ、
トランス優性はＨＴＬＶ-Ｉ遺伝子に限定されたもので
はなく、幾つかの変異体では、両方の遺伝子に対してト
ランス優性であり、即ちこの特別な例としてｐｃＲｅｘ
Ｍ２、ｐｃＲｅｘＭ７およびｐｃＲｅｘＭ８が挙げられ
ることが判明した。
【００６４】最初に得られた幾つかの結果から、最も成
功した突然変異はアミノ酸位置８７〜９４の間に局在し
ていることが判り、したがっておよそのアミノ酸位置８
２〜およそのアミノ酸位置９７の間に存在しているｒｅ
ｘ／ｒｅｖ遺伝子の部分は、トランス優性なＲｅｘ／Ｒ
ｅｖリプレッサーの操作に特別の意味を有するものであ
るようであり、さらに試験の結果から、Ｒｅｘタンパク
質に対する突然変異の好ましい位置の範囲は一層広く、
即ち、少なくともＮ-末端に近いアミノ酸位置２２から
Ｃ-末端に向かってアミノ酸位置１０１までに存在し得
ることが分かった。
功した突然変異はアミノ酸位置８７〜９４の間に局在し
ていることが判り、したがっておよそのアミノ酸位置８
２〜およそのアミノ酸位置９７の間に存在しているｒｅ
ｘ／ｒｅｖ遺伝子の部分は、トランス優性なＲｅｘ／Ｒ
ｅｖリプレッサーの操作に特別の意味を有するものであ
るようであり、さらに試験の結果から、Ｒｅｘタンパク
質に対する突然変異の好ましい位置の範囲は一層広く、
即ち、少なくともＮ-末端に近いアミノ酸位置２２から
Ｃ-末端に向かってアミノ酸位置１０１までに存在し得
ることが分かった。
【００６５】［５.２］さらにＨＩＶ-１におけるＲｅｖ
機能に焦点を合わせた研究で、トランス優性なｒｅｖリ
プレッサーが発見された。これらの幾つかは少なくとも
ＨＴＬＶ-ＩまたはＨＴＬＶ-IIにおけるＲｅｘ機能を抑
制する可能性があるが、ここでは試験しなかった。
機能に焦点を合わせた研究で、トランス優性なｒｅｖリ
プレッサーが発見された。これらの幾つかは少なくとも
ＨＴＬＶ-ＩまたはＨＴＬＶ-IIにおけるＲｅｘ機能を抑
制する可能性があるが、ここでは試験しなかった。
【００６６】これに反してこれらの幾つかは、少なくと
もＨＩＶ-２およびＳＩＶmacにおけるＲｅｖ機能を同様
に抑制することが判明した。膨大な突然変異分析によっ
て、トランス活性化に不可欠と思われるｒｅｖ内の少な
くともさらに２つの異なった機能的ドメインの輪郭が明
らかになった。これらのドメインは、Ｒｅｖタンパク質
をその好適な標的基質へ向かわせる「結合ドメイン」
と、結合反応の機能的な結果である転写活性化を発揮さ
せる「活性化ドメイン」からなるものと想定される。
もＨＩＶ-２およびＳＩＶmacにおけるＲｅｖ機能を同様
に抑制することが判明した。膨大な突然変異分析によっ
て、トランス活性化に不可欠と思われるｒｅｖ内の少な
くともさらに２つの異なった機能的ドメインの輪郭が明
らかになった。これらのドメインは、Ｒｅｖタンパク質
をその好適な標的基質へ向かわせる「結合ドメイン」
と、結合反応の機能的な結果である転写活性化を発揮さ
せる「活性化ドメイン」からなるものと想定される。
【００６７】したがってｒｅｖ内の２つの機能的ドメイ
ンは、Ｒｅｖタンパク質を、その細胞標的へ向かわせる
と思われる結合ドメインと、構造タンパク質Ｇａｇおよ
びＥｎｖを暗号化している、不完全にスプライスされた
ＲＮＡ（複数）の核放出を可能にする活性化ドメインで
あると定義した。Ｒｅｖの活性化ドメインの突然変異
は、Ｒｅｖ機能のトランス優性な抑制因子として作用す
る欠損型Ｒｅｖタンパク質の発現をもたらす。そのよう
な突然変異体が、培養においてトランスフェクトされた
細胞で発現すると、ＨＩＶ-１の複製を著しく抑制し、
したがって５.１項で得られた突然変異体と同様にトラ
ンス優性である。
ンは、Ｒｅｖタンパク質を、その細胞標的へ向かわせる
と思われる結合ドメインと、構造タンパク質Ｇａｇおよ
びＥｎｖを暗号化している、不完全にスプライスされた
ＲＮＡ（複数）の核放出を可能にする活性化ドメインで
あると定義した。Ｒｅｖの活性化ドメインの突然変異
は、Ｒｅｖ機能のトランス優性な抑制因子として作用す
る欠損型Ｒｅｖタンパク質の発現をもたらす。そのよう
な突然変異体が、培養においてトランスフェクトされた
細胞で発現すると、ＨＩＶ-１の複製を著しく抑制し、
したがって５.１項で得られた突然変異体と同様にトラ
ンス優性である。
【００６８】この第２の研究に関する詳細な情報は、後
述する６.２項からも明白である。それによって発見さ
れたトランス優性な突然変異体はｐＭ１０、ｐΔ９/１
４、ｐΔ１０/１４（実施例４〜１１参照）、およびｐ
Ｍ２１、ｐＭ２２、ｐＭ２７、ｐＭ２８、ｐＭ２９、ｐ
Ｍ３２（実施例１１ａおよび１１ｂ参照）であり、ここ
でｐＭ１０はＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝子機能の抑制に有効
であるばかりでなく、ＨＩＶ-２ ｒｅｖおよびＳＩＶ
macｒｅｖ遺伝子機能の抑制にもまた有効である。上記
の９種類のトランス優性な突然変異体のうち、好ましい
ものはｐＭ１０、ｐＭ２１、ｐＭ３２であって、特にｐ
Ｍ１０が好ましい。
述する６.２項からも明白である。それによって発見さ
れたトランス優性な突然変異体はｐＭ１０、ｐΔ９/１
４、ｐΔ１０/１４（実施例４〜１１参照）、およびｐ
Ｍ２１、ｐＭ２２、ｐＭ２７、ｐＭ２８、ｐＭ２９、ｐ
Ｍ３２（実施例１１ａおよび１１ｂ参照）であり、ここ
でｐＭ１０はＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝子機能の抑制に有効
であるばかりでなく、ＨＩＶ-２ ｒｅｖおよびＳＩＶ
macｒｅｖ遺伝子機能の抑制にもまた有効である。上記
の９種類のトランス優性な突然変異体のうち、好ましい
ものはｐＭ１０、ｐＭ２１、ｐＭ３２であって、特にｐ
Ｍ１０が好ましい。
【００６９】［５.３］５.１項と同様にＨＴＬＶ-Ｉに
おけるＲｅｘ機能に焦点を合わせたもう一つの研究で
も、トランス優性なｒｅｘリプレッサーが発見され、そ
れによってＲｅｘ活性の検出を可能とする方法が開発さ
れた。この検出方法は、他のウイルスまたは宿主細胞機
能を一般に妨害することなく、Ｒｅｘ機能の特異的抑制
因子を同定するのに有用である。このＲｅｘ抑制因子の
検出方法は、調節要素、例えばＲｅｘ ＲＥ（ＲＲＸ）
を含むｍＲＮＡのスプライスされない形を暗号化してい
るＲｅｘ応答性「リポーター」遺伝子を含む遺伝子系を
利用する。この系では、Ｒｅｘ機能を提供するタンパク
質が、このスプライスされていないｍＲＮＡを細胞核か
ら細胞質へ放出するのを誘導する。Ｒｅｘ機能が存在し
ない場合は、このｍＲＮＡは上記のように細胞質へ放出
される前にスプライスされる。この遺伝子系を含んだ細
胞が、Ｒｅｘ機能の抑制因子であると疑われる因子と接
触すると、この因子によるＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘ機能の特
異的抑制は、この特有なｍＲＮＡのスプライスされない
形の核放出の減少によって示されるが、同じｍＲＮＡの
スプライスされた形の核放出の減少を伴わない。この方
法は、例えばＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘタンパク質の化学的抑
制因子（例えば突然変異体ＲｅｘまたはＲｅｖタンパク
質中のトランス優性なドメインを真似ることができる抑
制因子、例えば低分子量の化学的抑制因子）およびＲｅ
ｘリプレッサーとして作用するＲｅｘのトランス優性な
突然変異体形を検出するのに有用である。
おけるＲｅｘ機能に焦点を合わせたもう一つの研究で
も、トランス優性なｒｅｘリプレッサーが発見され、そ
れによってＲｅｘ活性の検出を可能とする方法が開発さ
れた。この検出方法は、他のウイルスまたは宿主細胞機
能を一般に妨害することなく、Ｒｅｘ機能の特異的抑制
因子を同定するのに有用である。このＲｅｘ抑制因子の
検出方法は、調節要素、例えばＲｅｘ ＲＥ（ＲＲＸ）
を含むｍＲＮＡのスプライスされない形を暗号化してい
るＲｅｘ応答性「リポーター」遺伝子を含む遺伝子系を
利用する。この系では、Ｒｅｘ機能を提供するタンパク
質が、このスプライスされていないｍＲＮＡを細胞核か
ら細胞質へ放出するのを誘導する。Ｒｅｘ機能が存在し
ない場合は、このｍＲＮＡは上記のように細胞質へ放出
される前にスプライスされる。この遺伝子系を含んだ細
胞が、Ｒｅｘ機能の抑制因子であると疑われる因子と接
触すると、この因子によるＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘ機能の特
異的抑制は、この特有なｍＲＮＡのスプライスされない
形の核放出の減少によって示されるが、同じｍＲＮＡの
スプライスされた形の核放出の減少を伴わない。この方
法は、例えばＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘタンパク質の化学的抑
制因子（例えば突然変異体ＲｅｘまたはＲｅｖタンパク
質中のトランス優性なドメインを真似ることができる抑
制因子、例えば低分子量の化学的抑制因子）およびＲｅ
ｘリプレッサーとして作用するＲｅｘのトランス優性な
突然変異体形を検出するのに有用である。
【００７０】ｒｅｘ遺伝子のトランス優性な負の突然変
異を同定するため、Ｒｅｘタンパク質の直線状配列の全
体にわたってさまざまな部位で２または３個のアミノ酸
セグメントを変化させる一連の点突然変異を再び作成
し、これらの突然変異体の中で数個のＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅ
ｘタンパク質機能のトランス優性リプレッサーを同定し
た。そのうちの幾つかは、ＨＴＬＶ-II Ｒｅｘおよび／
またはＨＩＶ-１ Ｒｅｖタンパク質機能を追加的にトラ
ンス優性に抑制し、したがってこれらは、５.１項で発
見された幾つかの突然変異体と同様に、１ウイルス種の
機能的に等価な遺伝子の表現型発現を抑制した。
異を同定するため、Ｒｅｘタンパク質の直線状配列の全
体にわたってさまざまな部位で２または３個のアミノ酸
セグメントを変化させる一連の点突然変異を再び作成
し、これらの突然変異体の中で数個のＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅ
ｘタンパク質機能のトランス優性リプレッサーを同定し
た。そのうちの幾つかは、ＨＴＬＶ-II Ｒｅｘおよび／
またはＨＩＶ-１ Ｒｅｖタンパク質機能を追加的にトラ
ンス優性に抑制し、したがってこれらは、５.１項で発
見された幾つかの突然変異体と同様に、１ウイルス種の
機能的に等価な遺伝子の表現型発現を抑制した。
【００７１】したがってこの発明はまた、前記の３項で
示した数段階からなるＲｅｘタンパク質の遺伝子活性化
機能の特異的な抑制因子を同定する方法に関する。前述
のように、ＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘタンパク質はＨＩＶ-１
Ｒｅｖタンパク質の機能を置き換えることができる。そ
のうえＲｅｘはまた、類似のＨＴＬＶ-II調節タンパク
質を置き換えできることが分かった。このように、Ｒｅ
ｘによって認識される応答要素と少なくとも１個の好適
な未使用のスプライス部位とを保有する、これら３種の
ウイルスの少なくとも何れか１つに由来するｍＲＮＡを
この方法に使用することができる。
示した数段階からなるＲｅｘタンパク質の遺伝子活性化
機能の特異的な抑制因子を同定する方法に関する。前述
のように、ＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘタンパク質はＨＩＶ-１
Ｒｅｖタンパク質の機能を置き換えることができる。そ
のうえＲｅｘはまた、類似のＨＴＬＶ-II調節タンパク
質を置き換えできることが分かった。このように、Ｒｅ
ｘによって認識される応答要素と少なくとも１個の好適
な未使用のスプライス部位とを保有する、これら３種の
ウイルスの少なくとも何れか１つに由来するｍＲＮＡを
この方法に使用することができる。
【００７２】好ましくは応答要素およびスプライス部位
を含んでいるｍＲＮＡは、ＲｅｘおよびＴａｘタンパク
質のコード領域、完全なｅｎｖ遺伝子、Ｒｅｘ応答要素
Ｒｅｘ ＲＥ（ＲＲＸ）および３'ＬＴＲ全体からなるＨ
ＴＬＶ-Ｉプロウイルスの３'末端を含んだプラスミドに
よって暗号化されている。そのようなプラスミドの例
は、ｐｇＴＡＸ-ＬＴＲである。野生型ｒｅｘ遺伝子コ
ピーに対する突然変異体ｒｅｘ遺伝子のコピー比を調節
する必要がある突然変異体分析では、便宜上、ｐｇＴＡ
Ｘ-ＬＴＲ上のｒｅｘ遺伝子を劣性の負の突然変異によ
って失活させ、ｐＲＥＸと命名された別のプラスミドで
活性ｒｅｘ遺伝子をこの系に提供する。然しながら、例
えば化学物質を試験する場合は、この系に必要なｍＲＮ
Ａとして、活性ｒｅｘ遺伝子が同一のプラスミドまたは
別のベクターＤＮＡで提供されるはずである。またこの
活性ｒｅｘ遺伝子は、この発明に使用した株とは別のＨ
ＴＬＶ-Ｉ株から単離された天然配列の変異体を含んで
いるかもしれず、あるいは発現して、上記のｍＲＮＡの
核からの放出を誘導することを含め、Ｒｅｘタンパク質
の遺伝子活性化機能を提供するタンパク質生産物を生産
することができる何か別のｒｅｘ遺伝子の突然変異体形
であるかもしれない。
を含んでいるｍＲＮＡは、ＲｅｘおよびＴａｘタンパク
質のコード領域、完全なｅｎｖ遺伝子、Ｒｅｘ応答要素
Ｒｅｘ ＲＥ（ＲＲＸ）および３'ＬＴＲ全体からなるＨ
ＴＬＶ-Ｉプロウイルスの３'末端を含んだプラスミドに
よって暗号化されている。そのようなプラスミドの例
は、ｐｇＴＡＸ-ＬＴＲである。野生型ｒｅｘ遺伝子コ
ピーに対する突然変異体ｒｅｘ遺伝子のコピー比を調節
する必要がある突然変異体分析では、便宜上、ｐｇＴＡ
Ｘ-ＬＴＲ上のｒｅｘ遺伝子を劣性の負の突然変異によ
って失活させ、ｐＲＥＸと命名された別のプラスミドで
活性ｒｅｘ遺伝子をこの系に提供する。然しながら、例
えば化学物質を試験する場合は、この系に必要なｍＲＮ
Ａとして、活性ｒｅｘ遺伝子が同一のプラスミドまたは
別のベクターＤＮＡで提供されるはずである。またこの
活性ｒｅｘ遺伝子は、この発明に使用した株とは別のＨ
ＴＬＶ-Ｉ株から単離された天然配列の変異体を含んで
いるかもしれず、あるいは発現して、上記のｍＲＮＡの
核からの放出を誘導することを含め、Ｒｅｘタンパク質
の遺伝子活性化機能を提供するタンパク質生産物を生産
することができる何か別のｒｅｘ遺伝子の突然変異体形
であるかもしれない。
【００７３】またレトロウイルスの機能的ゲノム全体を
暗号化したＤＮＡセグメントをこの遺伝子系の一部とし
て使用することによって、上に挙げた遺伝子系の要素を
提供することもできる。これは感染細胞へ適用できる。
然し、安全性の理由と便宜性のため、この遺伝子系は好
ましくは感染性ウイルスを生産することはできない。こ
のことは、どの感染性ウイルスの生産にも不可欠な、少
なくとも１ウイルス活性の発現から、ある遺伝子要素の
使用を防止する遺伝的欠損系へ設計することによって達
成される。これは、例えば少なくとも１ウイルス遺伝子
の一部をその系から省くことにより、あるいはその他の
突然変異により達成し得る。
暗号化したＤＮＡセグメントをこの遺伝子系の一部とし
て使用することによって、上に挙げた遺伝子系の要素を
提供することもできる。これは感染細胞へ適用できる。
然し、安全性の理由と便宜性のため、この遺伝子系は好
ましくは感染性ウイルスを生産することはできない。こ
のことは、どの感染性ウイルスの生産にも不可欠な、少
なくとも１ウイルス活性の発現から、ある遺伝子要素の
使用を防止する遺伝的欠損系へ設計することによって達
成される。これは、例えば少なくとも１ウイルス遺伝子
の一部をその系から省くことにより、あるいはその他の
突然変異により達成し得る。
【００７４】好ましくはｒｅｘ遺伝子によって、またｍ
ＲＮＡを暗号化したＤＮＡセグメントによって形質転換
された宿主細胞の例として、前記のプラスミドベクター
でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞が挙げられる。即
ち、本明細書で用いる「形質転換」の語は、「トランス
フェクション」の語を包含し、感染性因子、特にウイル
スを暗号化しているベクターＤＮＡを含んだ遺伝子の形
質転換を示す。トランスフェクションの後、そのような
ベクターは、ついで培養中の少数の形質転換細胞から感
染性ウイルス粒子によって他の多数の細胞へ広がること
ができ、それによって対象遺伝子を発現する大量の宿主
細胞試料を提供する。しかもこの遺伝子系における宿主
細胞の形質転換は、安定な組み立て物を生じる必要はな
く、安定な遺伝子発現系、もしくは一過性の遺伝子発現
系を利用して、必要なｍＲＮＡおよびｒｅｘ遺伝子を提
供すればよい。したがって多くの既知の発現系が、この
発明方法による抑制因子の同定に使用し得る。
ＲＮＡを暗号化したＤＮＡセグメントによって形質転換
された宿主細胞の例として、前記のプラスミドベクター
でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞が挙げられる。即
ち、本明細書で用いる「形質転換」の語は、「トランス
フェクション」の語を包含し、感染性因子、特にウイル
スを暗号化しているベクターＤＮＡを含んだ遺伝子の形
質転換を示す。トランスフェクションの後、そのような
ベクターは、ついで培養中の少数の形質転換細胞から感
染性ウイルス粒子によって他の多数の細胞へ広がること
ができ、それによって対象遺伝子を発現する大量の宿主
細胞試料を提供する。しかもこの遺伝子系における宿主
細胞の形質転換は、安定な組み立て物を生じる必要はな
く、安定な遺伝子発現系、もしくは一過性の遺伝子発現
系を利用して、必要なｍＲＮＡおよびｒｅｘ遺伝子を提
供すればよい。したがって多くの既知の発現系が、この
発明方法による抑制因子の同定に使用し得る。
【００７５】この方法では、未使用のスプライス部位を
含んだｍＲＮＡの放出が減少するが、それと一緒にこの
ｍＲＮＡのスプライス形の放出が減少しなければ、その
因子が、ＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘ遺伝子活性またはｒｅｘ遺
伝子生産物活性の特異的な抑制因子であることを示す。
この発明方法を使用することによって特異的な抑制因子
であることが判明した化学因子の場合、その作用形式
は、原則としてｍＲＮＡの転写または翻訳の特異的な抑
制を含み得る。然しながら一層可能性のある作用形式
は、核小体の局在化、Ｒｅｘ応答要素の認識またはＲｅ
ｘエフェクター機能等を含んだＲｅｘタンパク質活性の
１またはそれ以上の特異的な抑制である。
含んだｍＲＮＡの放出が減少するが、それと一緒にこの
ｍＲＮＡのスプライス形の放出が減少しなければ、その
因子が、ＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘ遺伝子活性またはｒｅｘ遺
伝子生産物活性の特異的な抑制因子であることを示す。
この発明方法を使用することによって特異的な抑制因子
であることが判明した化学因子の場合、その作用形式
は、原則としてｍＲＮＡの転写または翻訳の特異的な抑
制を含み得る。然しながら一層可能性のある作用形式
は、核小体の局在化、Ｒｅｘ応答要素の認識またはＲｅ
ｘエフェクター機能等を含んだＲｅｘタンパク質活性の
１またはそれ以上の特異的な抑制である。
【００７６】都合よいことに、未使用のスプライス部位
を含んだｍＲＮＡの核放出の減少は、第１タンパク質の
生産水準を測定することによって検出され、この第１タ
ンパク質は未使用のスプライス部位を含むｍＲＮＡによ
って暗号化されている（即ち、ｍＲＮＡのスプライスさ
れていない形態だけがこの第１タンパク質を暗号化して
いる）。そしてｍＲＮＡのスプライスされた形の核放出
の増大は第２タンパク質の生産水準を測定することによ
って検出され、この第２タンパク質は、このｍＲＮＡの
スプライスされた形によって暗号化されている。
を含んだｍＲＮＡの核放出の減少は、第１タンパク質の
生産水準を測定することによって検出され、この第１タ
ンパク質は未使用のスプライス部位を含むｍＲＮＡによ
って暗号化されている（即ち、ｍＲＮＡのスプライスさ
れていない形態だけがこの第１タンパク質を暗号化して
いる）。そしてｍＲＮＡのスプライスされた形の核放出
の増大は第２タンパク質の生産水準を測定することによ
って検出され、この第２タンパク質は、このｍＲＮＡの
スプライスされた形によって暗号化されている。
【００７７】好ましくはこのｍＲＮＡはスプライスされ
ない形で、ＨＴＬＶ-ＩＥｎｖタンパク質を暗号化して
いる。このｍＲＮＡをスプライスすると、もう一つのＨ
ＴＬＶ-Ｉタンパク質であるＴａｘを暗号化した一層短
いｍＲＮＡが生じる。例えば実施例１２および１３にお
いて、Ｒｅｘ ＲＥ（ＲＲＸ）要素を保有しているスプ
ライスされないｍＲＮＡの核放出は、Ｅｎｖタンパク質
の発現によって検出される。さらに、Ｒｅｘ機能の抑制
から生じたスプライスされないｍＲＮＡのそのような放
出の抑制は、Ｅｎｖタンパク質生産の減少によって検出
される。然しながらこの減少は、ある因子のウイルスま
たは宿主に対するある種の一般的な毒性から生じたもの
かも知れないから、ｒｅｘ遺伝子機能の特異的な抑制
は、Ｅｎｖ発現の減少と同時に、ＨＴＬＶ-ＩＴａｘタ
ンパク質の生産が減少しないことを反映しているｍＲＮ
Ａのスプライスされた形の放出の減少が起こらないこと
によって示される。したがって好ましくはＨＴＬＶ-Ｉ
Ｅｎｖ、ＴａｘおよびＲｅｘタンパク質発現の同時分析
を実施する。
ない形で、ＨＴＬＶ-ＩＥｎｖタンパク質を暗号化して
いる。このｍＲＮＡをスプライスすると、もう一つのＨ
ＴＬＶ-Ｉタンパク質であるＴａｘを暗号化した一層短
いｍＲＮＡが生じる。例えば実施例１２および１３にお
いて、Ｒｅｘ ＲＥ（ＲＲＸ）要素を保有しているスプ
ライスされないｍＲＮＡの核放出は、Ｅｎｖタンパク質
の発現によって検出される。さらに、Ｒｅｘ機能の抑制
から生じたスプライスされないｍＲＮＡのそのような放
出の抑制は、Ｅｎｖタンパク質生産の減少によって検出
される。然しながらこの減少は、ある因子のウイルスま
たは宿主に対するある種の一般的な毒性から生じたもの
かも知れないから、ｒｅｘ遺伝子機能の特異的な抑制
は、Ｅｎｖ発現の減少と同時に、ＨＴＬＶ-ＩＴａｘタ
ンパク質の生産が減少しないことを反映しているｍＲＮ
Ａのスプライスされた形の放出の減少が起こらないこと
によって示される。したがって好ましくはＨＴＬＶ-Ｉ
Ｅｎｖ、ＴａｘおよびＲｅｘタンパク質発現の同時分析
を実施する。
【００７８】例えば実施例１２および１３では、Ｅｎｖ
およびＴａｘタンパク質の発現を、好適な抗体との免疫
沈降と、それによって生じた沈降物の電気泳動分析によ
って測定する。別法として、例えばＲｅｘ機能の特異的
抑制について試料の大規模スクリーニングのため、Ｅｎ
ｖおよびＴａｘについて、例えば酵素結合免疫検定法
（ＥＬＩＳＡ）、またはスプライス形およびスプライス
されない形の発現をもたらす何か一層都合よい別の生産
物を提供する遺伝子操作によるｍＲＮＡの変形等が挙げ
られる。例えばｍＲＮＡを変化させて、エシェリキア・
コリ-β-ガラクトシダーゼのような、加水分解すると発
色する無色の基質の添加によって検出できる酵素を暗号
化することも可能である。ｅｎｖ遺伝子の代わりにこの
酵素の遺伝子を挿入すると、スプライスされていないｍ
ＲＮＡ形態はこの酵素を生産するが、スプライスされた
形態はこれを生産しない。また別の類似の都合のよい指
示遺伝子を、スプライスされたｍＲＮＡ形でこれを発現
できるように（例えばＴａｘ配列へ融合することによっ
て）ｍＲＮＡに暗号化することができる。迅速かつ効率
的な大量スクリーニングのために上記の方法をさらに変
更することは、当業者にとって容易に明らかなことであ
ろう。
およびＴａｘタンパク質の発現を、好適な抗体との免疫
沈降と、それによって生じた沈降物の電気泳動分析によ
って測定する。別法として、例えばＲｅｘ機能の特異的
抑制について試料の大規模スクリーニングのため、Ｅｎ
ｖおよびＴａｘについて、例えば酵素結合免疫検定法
（ＥＬＩＳＡ）、またはスプライス形およびスプライス
されない形の発現をもたらす何か一層都合よい別の生産
物を提供する遺伝子操作によるｍＲＮＡの変形等が挙げ
られる。例えばｍＲＮＡを変化させて、エシェリキア・
コリ-β-ガラクトシダーゼのような、加水分解すると発
色する無色の基質の添加によって検出できる酵素を暗号
化することも可能である。ｅｎｖ遺伝子の代わりにこの
酵素の遺伝子を挿入すると、スプライスされていないｍ
ＲＮＡ形態はこの酵素を生産するが、スプライスされた
形態はこれを生産しない。また別の類似の都合のよい指
示遺伝子を、スプライスされたｍＲＮＡ形でこれを発現
できるように（例えばＴａｘ配列へ融合することによっ
て）ｍＲＮＡに暗号化することができる。迅速かつ効率
的な大量スクリーニングのために上記の方法をさらに変
更することは、当業者にとって容易に明らかなことであ
ろう。
【００７９】この発明のもう一つの態様は、上記の方法
によってＲｅｘタンパク質の遺伝子活性化機能の特異的
抑制因子を同定するため、前記３項に挙げた構成要素を
含んでなる因子スクリーニング用試薬キットに関する。
このキットは、所望により、さらに下記の任意の構成要
素、即ち、細胞培養に使用する培地、リポーターｍＲＮ
Ａのスプライスされた形またはスプライスされない形の
何れかの核放出水準を、このｍＲＮＡのスプライスされ
た形およびスプライスされない形のタンパク質生産物
を、例えば核酸ハイブリッド形成によって直接的に、あ
るいは例えば免疫学的検出によって間接的に測定するの
に使用する試薬、およびこの発明方法の実施の際に、こ
のキットの上記の任意の構成要素を使用するための指示
書を含む。
によってＲｅｘタンパク質の遺伝子活性化機能の特異的
抑制因子を同定するため、前記３項に挙げた構成要素を
含んでなる因子スクリーニング用試薬キットに関する。
このキットは、所望により、さらに下記の任意の構成要
素、即ち、細胞培養に使用する培地、リポーターｍＲＮ
Ａのスプライスされた形またはスプライスされない形の
何れかの核放出水準を、このｍＲＮＡのスプライスされ
た形およびスプライスされない形のタンパク質生産物
を、例えば核酸ハイブリッド形成によって直接的に、あ
るいは例えば免疫学的検出によって間接的に測定するの
に使用する試薬、およびこの発明方法の実施の際に、こ
のキットの上記の任意の構成要素を使用するための指示
書を含む。
【００８０】各種のｒｅｘ遺伝子突然変異体を、優性な
負の突然変異についてスクリーニングするのに上記の方
法を使用した。これらのｒｅｘ遺伝子突然変異体を、こ
の発明のＲｅｘ抑制因子検出系でプラスミドｐｇＴＡＸ
-ＬＴＲと同時発現させると、５.１項と同様に、Ｒｅｘ
タンパク質の５９〜６０位、６４〜６５位、および１１
９〜１２１位でアミノ酸置換を含んだ１種の突然変異が
認められた。これらはＲｅｘ機能を欠いているばかりで
なく、野生型Ｒｅｘタンパク質機能のトランス優性リプ
レッサーとしても作用し、また野生型Ｒｅｖタンパク質
機能のトランス優性リプレッサーとしても作用するタン
パク質を生じた。
負の突然変異についてスクリーニングするのに上記の方
法を使用した。これらのｒｅｘ遺伝子突然変異体を、こ
の発明のＲｅｘ抑制因子検出系でプラスミドｐｇＴＡＸ
-ＬＴＲと同時発現させると、５.１項と同様に、Ｒｅｘ
タンパク質の５９〜６０位、６４〜６５位、および１１
９〜１２１位でアミノ酸置換を含んだ１種の突然変異が
認められた。これらはＲｅｘ機能を欠いているばかりで
なく、野生型Ｒｅｘタンパク質機能のトランス優性リプ
レッサーとしても作用し、また野生型Ｒｅｖタンパク質
機能のトランス優性リプレッサーとしても作用するタン
パク質を生じた。
【００８１】またこの突然変異分析では、Ｒｅｘアミノ
酸位置５〜７および１４〜１５でＲｅｘ機能を欠いた置
換を含んでいる第２の型の負の突然変異体を生じた。こ
れらの変異体タンパク質は細胞核へ好適に標的指向せ
ず、トランス優性でもなかった。さらにＲｅｘアミノ酸
位置１４１〜１４３に置換を有する単一な突然変異体Ｒ
ｅｘで例示される第３の型の負の突然変異体は、部分的
なＲｅｘ機能を保有しており、核へ標的指向したが、核
の核小体領域内に局在化できなかった。この変異体タン
パク質もまた、ＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘ機能のトランス優性
リプレッサーではなかった。これらの結果から、核小体
局在化活性は、アミノ末端で確認されたプラスに荷電し
た残基（Ｈ.シオミら、セル、５５巻、［１９８８
年］、１９７〜２０９頁）以外の配列を含み得る可能性
が生じた。しかもこの知見は、Ｒｅｘタンパク質突然変
異体がＲｅｘ機能のトランス優性リプレッサーとして作
用するには、変異体が、核標的指向活性ばかりでなく、
Ｒｅｘタンパク質の明白な核小体局在化活性を保有する
ことが必要であり得ることを示唆している。
酸位置５〜７および１４〜１５でＲｅｘ機能を欠いた置
換を含んでいる第２の型の負の突然変異体を生じた。こ
れらの変異体タンパク質は細胞核へ好適に標的指向せ
ず、トランス優性でもなかった。さらにＲｅｘアミノ酸
位置１４１〜１４３に置換を有する単一な突然変異体Ｒ
ｅｘで例示される第３の型の負の突然変異体は、部分的
なＲｅｘ機能を保有しており、核へ標的指向したが、核
の核小体領域内に局在化できなかった。この変異体タン
パク質もまた、ＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘ機能のトランス優性
リプレッサーではなかった。これらの結果から、核小体
局在化活性は、アミノ末端で確認されたプラスに荷電し
た残基（Ｈ.シオミら、セル、５５巻、［１９８８
年］、１９７〜２０９頁）以外の配列を含み得る可能性
が生じた。しかもこの知見は、Ｒｅｘタンパク質突然変
異体がＲｅｘ機能のトランス優性リプレッサーとして作
用するには、変異体が、核標的指向活性ばかりでなく、
Ｒｅｘタンパク質の明白な核小体局在化活性を保有する
ことが必要であり得ることを示唆している。
【００８２】またここで、Ｒｅｘ突然変異体に関するこ
れらの知見は、核および核小体標的指向に関与している
第１ドメインと、エフェクター活性に関与している第２
ドメインからなる少なくとも２つの機能的に異なったペ
プチドドメインのＲｅｘタンパク質内のおよその範囲を
特定する。核標的指向性が不十分であるＲｅｘ突然変異
体は、先に核小体局在化シグナルとして機能することが
判明したＲｅｘのアミノ末端で、プラスに荷電している
ペプチドドメインに位置している。組み換えＤＮＡ手技
によって、アミノ末端の２０アミノ酸を含んでいるペプ
チドを他のタンパク質へ付着させると、このドメインは
Ｒｅｘで観察されたのと同様の形式で、そのタンパク質
の核標的指向性および核小体局在化を何れも誘導した
（Ｈ.シオミら、［１９８８年］、前掲）。このよう
に、たとえＲｅｘアミノ酸位置１４１〜１４３における
突然変異体が核へ標的指向するにしても、核の核小体領
域に局在化できないことから、この変異体が核小体局在
化に必要な領域にあるようには思われない。この突然変
異体における変化は、むしろアミノ末端ドメインでのＲ
ｅｘ核小体の局在化機能に、例えば適当なタンパク質の
折り畳みを妨害することを介して間接的に影響するらし
いと考えるのが最も妥当であろう。
れらの知見は、核および核小体標的指向に関与している
第１ドメインと、エフェクター活性に関与している第２
ドメインからなる少なくとも２つの機能的に異なったペ
プチドドメインのＲｅｘタンパク質内のおよその範囲を
特定する。核標的指向性が不十分であるＲｅｘ突然変異
体は、先に核小体局在化シグナルとして機能することが
判明したＲｅｘのアミノ末端で、プラスに荷電している
ペプチドドメインに位置している。組み換えＤＮＡ手技
によって、アミノ末端の２０アミノ酸を含んでいるペプ
チドを他のタンパク質へ付着させると、このドメインは
Ｒｅｘで観察されたのと同様の形式で、そのタンパク質
の核標的指向性および核小体局在化を何れも誘導した
（Ｈ.シオミら、［１９８８年］、前掲）。このよう
に、たとえＲｅｘアミノ酸位置１４１〜１４３における
突然変異体が核へ標的指向するにしても、核の核小体領
域に局在化できないことから、この変異体が核小体局在
化に必要な領域にあるようには思われない。この突然変
異体における変化は、むしろアミノ末端ドメインでのＲ
ｅｘ核小体の局在化機能に、例えば適当なタンパク質の
折り畳みを妨害することを介して間接的に影響するらし
いと考えるのが最も妥当であろう。
【００８３】機能的に明白なＲｅｘの第２主要ドメイン
は、アミノ酸５９〜６０（チロシン−イソロイシン）、
６４〜６５（チロシン−トリプトファン）、および１１
９〜１２１（スレオニン−フェニルアラニン−ヒスチジ
ン）を包含する。これらの離れた部位をそれぞれの位置
で変化させると（Ｍ６、Ｍ７およびＭ１３突然変異
体）、生物学的活性を欠き、それと同時にトランス優性
な抑制特性を現すＲｅｘタンパク質の生産をもたらす。
Ｒｅｘ機能に対して効果を示さない５種類の異なった突
然変異は、Ｒｅｘタンパク質の直線状配列において、Ｍ
６およびＭ７領域をＭ１３領域から分離し、これら２つ
の離れた領域でのこの機能的ドメイン内の相互作用が、
適当なタンパク質の折り畳みを必要とするらしいことを
示す。即ち、Ｒｅｘエフェクター機能にとって最も決定
的なこれら２つのアミノ酸領域を包含しているＲｅｘタ
ンパク質の完全な直線状部分は、Ｒｅｘタンパク質のエ
フェクター機能に寄与しているようであり、したがって
このドメインを突然変異させることはＲｅｘのトランス
優性リプレッサーの生産を意味する。
は、アミノ酸５９〜６０（チロシン−イソロイシン）、
６４〜６５（チロシン−トリプトファン）、および１１
９〜１２１（スレオニン−フェニルアラニン−ヒスチジ
ン）を包含する。これらの離れた部位をそれぞれの位置
で変化させると（Ｍ６、Ｍ７およびＭ１３突然変異
体）、生物学的活性を欠き、それと同時にトランス優性
な抑制特性を現すＲｅｘタンパク質の生産をもたらす。
Ｒｅｘ機能に対して効果を示さない５種類の異なった突
然変異は、Ｒｅｘタンパク質の直線状配列において、Ｍ
６およびＭ７領域をＭ１３領域から分離し、これら２つ
の離れた領域でのこの機能的ドメイン内の相互作用が、
適当なタンパク質の折り畳みを必要とするらしいことを
示す。即ち、Ｒｅｘエフェクター機能にとって最も決定
的なこれら２つのアミノ酸領域を包含しているＲｅｘタ
ンパク質の完全な直線状部分は、Ｒｅｘタンパク質のエ
フェクター機能に寄与しているようであり、したがって
このドメインを突然変異させることはＲｅｘのトランス
優性リプレッサーの生産を意味する。
【００８４】この知見は、ｍＲＮＡでＲｅｘ ＲＥ（Ｒ
ＲＸ）の認識に必要な活性が位置しているＲｅｘのドメ
インを指摘しない。したがってＲｅｘ機能のトランス優
性リプレッサーとして作用するために、突然変異体ｒｅ
ｘタンパク質がＲｅｘ ＲＥへの結合能を（直接的また
は間接的に）保有しなければならないのか、あるいはＲ
ｅｘによって認識される何か他のウイルス認識の要素へ
の結合能を保有しなければならないのかは分からない。
ＲＸ）の認識に必要な活性が位置しているＲｅｘのドメ
インを指摘しない。したがってＲｅｘ機能のトランス優
性リプレッサーとして作用するために、突然変異体ｒｅ
ｘタンパク質がＲｅｘ ＲＥへの結合能を（直接的また
は間接的に）保有しなければならないのか、あるいはＲ
ｅｘによって認識される何か他のウイルス認識の要素へ
の結合能を保有しなければならないのかは分からない。
【００８５】この発明のもう一つの態様は、ＨＴＬＶ-
Ｉ Ｒｅｘタンパク質機能のトランス優性リプレッサー
を暗号化しているＤＮＡセグメントおよびそのようなト
ランス優性リプレッサーに関する。このリプレッサー
は、Ｒｅｘタンパク質のエフェクター活性へマイナスに
影響する少なくとも１つの突然変異によってＲｅｘタン
パク質の野生型形態から修飾されたタンパク質である。
このリプレッサーはまた、Ｒｅｘタンパク質の野生型形
態の核小体局在化活性を実質上保有している。特にこの
リプレッサーの負の突然変異は、野生型Ｒｅｘタンパク
質のおよそのアミノ酸位置５９からおよそのアミノ酸位
置１２１までを含んでいるペプチドドメイン、より詳細
には下記に示す５９、６０、６４、６５、１１９、１２
０および１２１の任意の位置にあるアミノ酸に影響を与
えるものである。Ｒｅｘリプレッサーを暗号化している
ＤＮＡセグメントを例示すれば、下記の突然変異体ｒｅ
ｘ遺伝子、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ１３の何れか、およびＨＴＬ
Ｖ-Ｉ Ｒｅｖタンパク質機能のトランス優性な抑制を示
すその変異体および誘導体である。
Ｉ Ｒｅｘタンパク質機能のトランス優性リプレッサー
を暗号化しているＤＮＡセグメントおよびそのようなト
ランス優性リプレッサーに関する。このリプレッサー
は、Ｒｅｘタンパク質のエフェクター活性へマイナスに
影響する少なくとも１つの突然変異によってＲｅｘタン
パク質の野生型形態から修飾されたタンパク質である。
このリプレッサーはまた、Ｒｅｘタンパク質の野生型形
態の核小体局在化活性を実質上保有している。特にこの
リプレッサーの負の突然変異は、野生型Ｒｅｘタンパク
質のおよそのアミノ酸位置５９からおよそのアミノ酸位
置１２１までを含んでいるペプチドドメイン、より詳細
には下記に示す５９、６０、６４、６５、１１９、１２
０および１２１の任意の位置にあるアミノ酸に影響を与
えるものである。Ｒｅｘリプレッサーを暗号化している
ＤＮＡセグメントを例示すれば、下記の突然変異体ｒｅ
ｘ遺伝子、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ１３の何れか、およびＨＴＬ
Ｖ-Ｉ Ｒｅｖタンパク質機能のトランス優性な抑制を示
すその変異体および誘導体である。
【００８６】このＤＮＡセグメントの配列は、ＨＴＬＶ
-Ｉの任意の単離体のＲｅｘ遺伝子（Ｌ.リムスキーら、
ネーチャー、３３５巻、［１９８８年］、７３８〜７４
０頁、Ｍ.セイキら、サイエンス、２２７巻、［１９８
５年］、１２２７〜１２２９頁）から誘導され、または
化学的合成によって作り出される。Ｒｅｘ機能のトラン
ス優性リプレッサーは、標準的な組み換えＤＮＡ法、ま
たはペプチド合成のための標準的な化学的方法、または
これらの方法の組み合わせによって作成される。これら
の方法はすべて遺伝子操作技術で周知の方法である。
-Ｉの任意の単離体のＲｅｘ遺伝子（Ｌ.リムスキーら、
ネーチャー、３３５巻、［１９８８年］、７３８〜７４
０頁、Ｍ.セイキら、サイエンス、２２７巻、［１９８
５年］、１２２７〜１２２９頁）から誘導され、または
化学的合成によって作り出される。Ｒｅｘ機能のトラン
ス優性リプレッサーは、標準的な組み換えＤＮＡ法、ま
たはペプチド合成のための標準的な化学的方法、または
これらの方法の組み合わせによって作成される。これら
の方法はすべて遺伝子操作技術で周知の方法である。
【００８７】ここでＲｅｘタンパク質のエフェクター活
性にマイナスに影響する突然変異を例示する。然しこれ
らと同一のアミノ酸位置またはこれに近接した位置に限
局して、タンパク質構造に効果を生じるように設計され
た他の型の突然変異でも、この発明によるＨＴＬＶ-Ｉ
Ｒｅｘタンパク質機能のトランス優性な抑制を示すＲｅ
ｘの変異体および誘導体を生産する可能性は極めて高
い。そのような限局的な欠損は、例えば単一アミノ酸の
欠失または挿入、または化学的または構造的に類似した
アミノ酸の置換等である。これに反して、一層広範囲な
欠失または挿入、または２次構造（例えば、β-シート
領域内のプロリン）を破壊する置換は、タンパク質の折
り畳みに対する影響を介してタンパク質の固有部分に効
果を及ぼす可能性が高い。したがってＲｅｘエフェクタ
ー機能に必要なドメイン内の与えられた位置で起こるそ
のような突然変異は、Ｒｅｘタンパク質の野生型形態の
核小体局在化活性を実質上保有する突然変異体Ｒｅｘタ
ンパク質を生産することはあり得ない。
性にマイナスに影響する突然変異を例示する。然しこれ
らと同一のアミノ酸位置またはこれに近接した位置に限
局して、タンパク質構造に効果を生じるように設計され
た他の型の突然変異でも、この発明によるＨＴＬＶ-Ｉ
Ｒｅｘタンパク質機能のトランス優性な抑制を示すＲｅ
ｘの変異体および誘導体を生産する可能性は極めて高
い。そのような限局的な欠損は、例えば単一アミノ酸の
欠失または挿入、または化学的または構造的に類似した
アミノ酸の置換等である。これに反して、一層広範囲な
欠失または挿入、または２次構造（例えば、β-シート
領域内のプロリン）を破壊する置換は、タンパク質の折
り畳みに対する影響を介してタンパク質の固有部分に効
果を及ぼす可能性が高い。したがってＲｅｘエフェクタ
ー機能に必要なドメイン内の与えられた位置で起こるそ
のような突然変異は、Ｒｅｘタンパク質の野生型形態の
核小体局在化活性を実質上保有する突然変異体Ｒｅｘタ
ンパク質を生産することはあり得ない。
【００８８】上記の５.３項のトランス優性Ｒｅｘ突然
変異体を、Ｒｅｖ機能抑制について同様に試験し、これ
らの変異体がＨＩＶ-１ Ｒｅｖのリプレッサーでもある
ことが判明した。この型のトランス優性Ｒｅｘ突然変異
体の抗ウイルス作用の可能性をＨＩＶ-１複製の抑制検
定を用いて証明した。
変異体を、Ｒｅｖ機能抑制について同様に試験し、これ
らの変異体がＨＩＶ-１ Ｒｅｖのリプレッサーでもある
ことが判明した。この型のトランス優性Ｒｅｘ突然変異
体の抗ウイルス作用の可能性をＨＩＶ-１複製の抑制検
定を用いて証明した。
【００８９】また既述したように、たとえＨＴＬＶ-II
内の対応する応答要素のヌクレオチド配列が、ＨＴＬＶ
-Ｉ内のＲｅｘ ＲＥ（ＲＲＸ）のヌクレオチド配列と若
干異なったステム構造およびループ構造を有していると
しても、ＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘが類似体ＨＴＬＶ-II調節
タンパク質に機能的に置き換わり得ることがこの研究で
判明した。
内の対応する応答要素のヌクレオチド配列が、ＨＴＬＶ
-Ｉ内のＲｅｘ ＲＥ（ＲＲＸ）のヌクレオチド配列と若
干異なったステム構造およびループ構造を有していると
しても、ＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘが類似体ＨＴＬＶ-II調節
タンパク質に機能的に置き換わり得ることがこの研究で
判明した。
【００９０】したがってこの発明はさらに、、ＨＩＶ-
１、ＨＴＬＶ-ＩおよびＨＴＬＶ-IIウイルスのうちの１
つを複製する複製能を有する細胞へ、Ｒｅｘ機能のトラ
ンス優性リプレッサーを暗号化した上記のＤＮＡセグメ
ントを導入することからなるこれらのウイルスの複製の
抑制方法に関する。この細胞はまた、トランス優性リプ
レッサーを生産するＤＮＡセグメントの発現能を有す
る。この細胞は１またはそれ以上のこれらのウイルスに
よって予め感染したものであってもよく、あるいはこの
細胞は１またはそれ以上のこれらのウイルスに未感染の
標的細胞であってもよい。
１、ＨＴＬＶ-ＩおよびＨＴＬＶ-IIウイルスのうちの１
つを複製する複製能を有する細胞へ、Ｒｅｘ機能のトラ
ンス優性リプレッサーを暗号化した上記のＤＮＡセグメ
ントを導入することからなるこれらのウイルスの複製の
抑制方法に関する。この細胞はまた、トランス優性リプ
レッサーを生産するＤＮＡセグメントの発現能を有す
る。この細胞は１またはそれ以上のこれらのウイルスに
よって予め感染したものであってもよく、あるいはこの
細胞は１またはそれ以上のこれらのウイルスに未感染の
標的細胞であってもよい。
【００９１】上述の遺伝子系の好ましい態様として、Ｒ
ｅｘ応答性リポータープラスミドｐｇＴＡＸ-ＬＴＲを
作成した（第１３Ｂ図）。要約すれば、ｐｇＴＡＸ-Ｌ
ＴＲベクターは、ＨＴＬＶ-Ｉｅｎｖ遺伝子によって分
けられたｔａｘ遺伝子の２つのタンパク質暗号エキソン
と、Ｒｅｘ ＲＥ（ＲＲＥ）を含んだ完全なＨＴＬＶ-Ｉ
３'ＬＴＲを含んでいる。これらのＨＴＬＶ-Ｉ配列の発
現は、ヒト・シトメガロウイルスの即時早期領域によっ
て促進され、追加的なポリアデニル化配列はラット・プ
レプロインスリン遺伝子の３'領域（Ｂ.Ｒ.カレン、セ
ル、４６巻、［１９８６年］、９７３〜９８２頁）によ
って提供される。このベクターは、Ｒｅｘが存在する場
合だけＥｎｖを生産するが、Ｒｅｘが存在しても、しな
くてもＴａｘを合成する。このベクターは、Ｒｅｘ翻訳
開始コドンと一致するＳｐｈＩ部位に突然変異を導入し
ているため、それ自身はＲｅｘを生産しない。Ｒｅｘが
存在しないと、ｐｇＴＡＸ-ＬＴＲは、ｅｎｖ配列のす
べてを事実上欠いているこのベクターから、スプライス
されたｍＲＮＡ種の翻訳を反映したＴａｘタンパク質を
生産する。然しｐｇＴＡＸ-ＬＴＲをｒｅｘ発現プラス
ミドｐＲＥＸと同時トランスフェクトすると、ＨＴＬＶ
-ＩＥｎｖタンパク質の合成が活性化される。この６２
〜６８ｋＤタンパク質は、抗ＨＴＬＶ-Ｉエンベロープ
・モノクローナル抗体０.５αとの免疫沈降による立証
によって容易に確認される（Ｓ.マツシタら、プロシー
ディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８３巻、［１９８
６年］、２６７２〜２６７６頁）（第１４Ａ図、レーン
１）。これとは対照的に、ｐＲＥＸをｐＲＥＶ（レーン
２）またはｐＣＭＶ-ＩＬ-２（レーン３）の何れかで置
き換えても（これらはそれぞれＨＩＶ-１ Ｒｅｖタンパ
ク質およびヒト・ＩＬ-２ポリペプチドを暗号化してい
る）、ＨＴＬＶ-ＩＥｎｖタンパク質は検出されない。
同様に、ｐｇＴＡＸ-ＬＴＲの存在なしでは、細胞をｐ
ＲＥＸでトランスフェクトしてもＥｎｖタンパク質は同
定されなかった（レーン４）。
ｅｘ応答性リポータープラスミドｐｇＴＡＸ-ＬＴＲを
作成した（第１３Ｂ図）。要約すれば、ｐｇＴＡＸ-Ｌ
ＴＲベクターは、ＨＴＬＶ-Ｉｅｎｖ遺伝子によって分
けられたｔａｘ遺伝子の２つのタンパク質暗号エキソン
と、Ｒｅｘ ＲＥ（ＲＲＥ）を含んだ完全なＨＴＬＶ-Ｉ
３'ＬＴＲを含んでいる。これらのＨＴＬＶ-Ｉ配列の発
現は、ヒト・シトメガロウイルスの即時早期領域によっ
て促進され、追加的なポリアデニル化配列はラット・プ
レプロインスリン遺伝子の３'領域（Ｂ.Ｒ.カレン、セ
ル、４６巻、［１９８６年］、９７３〜９８２頁）によ
って提供される。このベクターは、Ｒｅｘが存在する場
合だけＥｎｖを生産するが、Ｒｅｘが存在しても、しな
くてもＴａｘを合成する。このベクターは、Ｒｅｘ翻訳
開始コドンと一致するＳｐｈＩ部位に突然変異を導入し
ているため、それ自身はＲｅｘを生産しない。Ｒｅｘが
存在しないと、ｐｇＴＡＸ-ＬＴＲは、ｅｎｖ配列のす
べてを事実上欠いているこのベクターから、スプライス
されたｍＲＮＡ種の翻訳を反映したＴａｘタンパク質を
生産する。然しｐｇＴＡＸ-ＬＴＲをｒｅｘ発現プラス
ミドｐＲＥＸと同時トランスフェクトすると、ＨＴＬＶ
-ＩＥｎｖタンパク質の合成が活性化される。この６２
〜６８ｋＤタンパク質は、抗ＨＴＬＶ-Ｉエンベロープ
・モノクローナル抗体０.５αとの免疫沈降による立証
によって容易に確認される（Ｓ.マツシタら、プロシー
ディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８３巻、［１９８
６年］、２６７２〜２６７６頁）（第１４Ａ図、レーン
１）。これとは対照的に、ｐＲＥＸをｐＲＥＶ（レーン
２）またはｐＣＭＶ-ＩＬ-２（レーン３）の何れかで置
き換えても（これらはそれぞれＨＩＶ-１ Ｒｅｖタンパ
ク質およびヒト・ＩＬ-２ポリペプチドを暗号化してい
る）、ＨＴＬＶ-ＩＥｎｖタンパク質は検出されない。
同様に、ｐｇＴＡＸ-ＬＴＲの存在なしでは、細胞をｐ
ＲＥＸでトランスフェクトしてもＥｎｖタンパク質は同
定されなかった（レーン４）。
【００９２】このように上記の遺伝子系では、ｐｇＴＡ
Ｘ-ＬＴＲによるＨＴＬＶ-ＩＥｎｖ発現は、野生型Ｒｅ
ｘタンパク質の遺伝子活性化機能を保有するタンパク質
の存在によって特異的に誘導される。Ｒｅｘ機能を保有
するタンパク質を提供する遺伝子を含んだ系で、因子と
の接触がＲｅｘ機能を抑制するなら、その因子がＲｅｘ
機能を提供する遺伝子または遺伝子生産物の発現と無関
係なあるウイルス活性もしくは細胞活性に影響する場合
を除いて、即ち、因子がその遺伝子またはその生産物の
特異的抑制因子でない場合を除いて、Ｔａｘタンパク質
は生産され続ける。したがって実施例１２および第１５
図に示したように、Ｒｅｘ機能の特異的な抑制因子を同
定する典型的な方法は、ＨＴＬＶ-ＩＥｎｖ、Ｔａｘお
よびＲｅｘタンパク質発現の同時分析を都合よく含んで
いる。
Ｘ-ＬＴＲによるＨＴＬＶ-ＩＥｎｖ発現は、野生型Ｒｅ
ｘタンパク質の遺伝子活性化機能を保有するタンパク質
の存在によって特異的に誘導される。Ｒｅｘ機能を保有
するタンパク質を提供する遺伝子を含んだ系で、因子と
の接触がＲｅｘ機能を抑制するなら、その因子がＲｅｘ
機能を提供する遺伝子または遺伝子生産物の発現と無関
係なあるウイルス活性もしくは細胞活性に影響する場合
を除いて、即ち、因子がその遺伝子またはその生産物の
特異的抑制因子でない場合を除いて、Ｔａｘタンパク質
は生産され続ける。したがって実施例１２および第１５
図に示したように、Ｒｅｘ機能の特異的な抑制因子を同
定する典型的な方法は、ＨＴＬＶ-ＩＥｎｖ、Ｔａｘお
よびＲｅｘタンパク質発現の同時分析を都合よく含んで
いる。
【００９３】第１５図および下記に示すトランス優性リ
プレッサーによってＲｅｘ機能が特異的に抑制される場
合、ＨＴＬＶ-ＩＴａｘタンパク質の生産が明らかに増
大することは注目し得る。これは恐らく、Ｒｅｘ機能を
欠くためにスプライシング前は放出されなかったＥｎｖ
ｍＲＮＡが、スプライスされた形で核放出の増大を来し
た結果であろう。然し原則的に、Ｒｅｘ機能の特異的抑
制因子はｍＲＮＡのスプライシングを防止し得るが、ス
プライスされないＲＮＡの放出を誘導し得ない。したが
ってＲｅｘ機能の特異的な抑制因子を同定するこの方法
は、現状では、Ｔａｘタンパク質を生産するスプライス
されたｍＲＮＡの核放出の減少がない場合に限り必要で
ある。
プレッサーによってＲｅｘ機能が特異的に抑制される場
合、ＨＴＬＶ-ＩＴａｘタンパク質の生産が明らかに増
大することは注目し得る。これは恐らく、Ｒｅｘ機能を
欠くためにスプライシング前は放出されなかったＥｎｖ
ｍＲＮＡが、スプライスされた形で核放出の増大を来し
た結果であろう。然し原則的に、Ｒｅｘ機能の特異的抑
制因子はｍＲＮＡのスプライシングを防止し得るが、ス
プライスされないＲＮＡの放出を誘導し得ない。したが
ってＲｅｘ機能の特異的な抑制因子を同定するこの方法
は、現状では、Ｔａｘタンパク質を生産するスプライス
されたｍＲＮＡの核放出の減少がない場合に限り必要で
ある。
【００９４】この系の使用方法を実施例１２に例示し
た。この突然変異分析では、Ｍ１３バクテリオファージ
で、オリゴヌクレオチドの指令による突然変異誘発を再
び使用し、２５ケ所の別々の部位でｒｅｘ遺伝子の１次
配列を変化させた（第１３Ａ図）。特徴的なＢｇｌII制
限部位を同様に含んでいる枠組みにしたオリゴヌクレオ
チド２重ラセンの挿入によって、四角で囲ったアミノ酸
を、ジペプチドアスパラギン酸-ロイシンで置き換え
た。ついでこれらのｒｅｘ突然変異体をそれぞれｐＢＣ
１２/ＣＭＶ真核性発現ベクターへ挿入し(Ｂ.Ｒ.カレ
ン、セル、４６巻、[１９８６年]、９７３〜９８２
頁)、ＤＮＡ配列決定によって突然変異を証明した。
た。この突然変異分析では、Ｍ１３バクテリオファージ
で、オリゴヌクレオチドの指令による突然変異誘発を再
び使用し、２５ケ所の別々の部位でｒｅｘ遺伝子の１次
配列を変化させた（第１３Ａ図）。特徴的なＢｇｌII制
限部位を同様に含んでいる枠組みにしたオリゴヌクレオ
チド２重ラセンの挿入によって、四角で囲ったアミノ酸
を、ジペプチドアスパラギン酸-ロイシンで置き換え
た。ついでこれらのｒｅｘ突然変異体をそれぞれｐＢＣ
１２/ＣＭＶ真核性発現ベクターへ挿入し(Ｂ.Ｒ.カレ
ン、セル、４６巻、[１９８６年]、９７３〜９８２
頁)、ＤＮＡ配列決定によって突然変異を証明した。
【００９５】ｐｇＴＡＸ−ＬＴＲベクターで同時トラン
スフェクトすることにより、ｒｅｘ突然変異体の生物活
性をそれぞれ測定した。これらのｒｅｘ突然変異体のう
ちの１９種は野生型の表現型を示したが、５種類の突然
変異体（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ６、Ｍ７およびＭ１３）は明瞭
なｅｎｖ遺伝子活性化作用を欠いており、１突然変異体
（Ｍ１５）は部分的な機能だけを示した（第１４Ｂ
図）。つぎにＣＯＳ細胞をこれら６種のｒｅｘ欠損型突
然変異体およびｐｇＴＡＸ-ＬＴＲベクターで同時トラ
ンスフェクトし、ついで実施例１２に示したようにＨＴ
ＬＶ-ＩＥｎｖ、ＴａｘおよびＲｅｘタンパク質発現の
同時分析を実施した（第１５Ａ〜Ｃ図参照）。ＨＴＬＶ
-ＩＥｎｖは、野生型Ｒｅｘタンパク質（第１５Ａ図、
レーン７）または部分的に活性なＭ１５突然変異体（第
１５Ａ図、レーン６）の存在した場合にのみ検出された
が、４０ｋＤＴａｘタンパク質はすべての培養で検出さ
れた（第１５Ｂ図）。このようにＭ１、Ｍ２、Ｍ６、Ｍ
７およびＭ１３突然変異体で観察されたｅｎｖ遺伝子発
現の欠如は、トランスフェクトされたＣＯＳ培養におけ
るこれらのタンパク質の非特異的な毒性効果というよ
り、むしろＲｅｘ生物学的活性の特異的な喪失に起因す
るものである。また突然変異体Ｒｅｘタンパク質は何れ
もこれらの培養で確認され、すべての変異体が安定した
形で発現することが判明した（第１５Ｃ図）。Ｍ２、Ｍ
６およびＭ１３突然変異体は野生型Ｒｅｘタンパク質と
区別し難いパターンで移動し（第１５Ｃ図、レーン２、
３、５、７）、一方、Ｍ７およびＭ１５タンパク質は、
一層小さい見掛けの分子量を示し（レーン４および
６）、Ｍ１突然変異体は、電気泳動でタンパク質の二重
線を生じた（レーン１）。Ｍ１、Ｍ７およびＭ１５突然
変異体におけるタンパク質コード領域の配列決定では、
導入した特異的な突然変異以外には何らの変化も見いだ
せなかった。したがってこれらのサイズの見掛け上の相
違に関する生化学的な根拠は、これらの変異体タンパク
質の翻訳後プロセシングの変化を反映しているのであろ
うと思われる。
スフェクトすることにより、ｒｅｘ突然変異体の生物活
性をそれぞれ測定した。これらのｒｅｘ突然変異体のう
ちの１９種は野生型の表現型を示したが、５種類の突然
変異体（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ６、Ｍ７およびＭ１３）は明瞭
なｅｎｖ遺伝子活性化作用を欠いており、１突然変異体
（Ｍ１５）は部分的な機能だけを示した（第１４Ｂ
図）。つぎにＣＯＳ細胞をこれら６種のｒｅｘ欠損型突
然変異体およびｐｇＴＡＸ-ＬＴＲベクターで同時トラ
ンスフェクトし、ついで実施例１２に示したようにＨＴ
ＬＶ-ＩＥｎｖ、ＴａｘおよびＲｅｘタンパク質発現の
同時分析を実施した（第１５Ａ〜Ｃ図参照）。ＨＴＬＶ
-ＩＥｎｖは、野生型Ｒｅｘタンパク質（第１５Ａ図、
レーン７）または部分的に活性なＭ１５突然変異体（第
１５Ａ図、レーン６）の存在した場合にのみ検出された
が、４０ｋＤＴａｘタンパク質はすべての培養で検出さ
れた（第１５Ｂ図）。このようにＭ１、Ｍ２、Ｍ６、Ｍ
７およびＭ１３突然変異体で観察されたｅｎｖ遺伝子発
現の欠如は、トランスフェクトされたＣＯＳ培養におけ
るこれらのタンパク質の非特異的な毒性効果というよ
り、むしろＲｅｘ生物学的活性の特異的な喪失に起因す
るものである。また突然変異体Ｒｅｘタンパク質は何れ
もこれらの培養で確認され、すべての変異体が安定した
形で発現することが判明した（第１５Ｃ図）。Ｍ２、Ｍ
６およびＭ１３突然変異体は野生型Ｒｅｘタンパク質と
区別し難いパターンで移動し（第１５Ｃ図、レーン２、
３、５、７）、一方、Ｍ７およびＭ１５タンパク質は、
一層小さい見掛けの分子量を示し（レーン４および
６）、Ｍ１突然変異体は、電気泳動でタンパク質の二重
線を生じた（レーン１）。Ｍ１、Ｍ７およびＭ１５突然
変異体におけるタンパク質コード領域の配列決定では、
導入した特異的な突然変異以外には何らの変化も見いだ
せなかった。したがってこれらのサイズの見掛け上の相
違に関する生化学的な根拠は、これらの変異体タンパク
質の翻訳後プロセシングの変化を反映しているのであろ
うと思われる。
【００９７】野生型Ｒｅｘタンパク質と同様に、生物学
的に不活性なＭ６、Ｍ７またはＭ１３Ｒｅｘ突然変異体
でトランスフェクトした細胞のイン・サイチュ免疫蛍光
染色では（詳細は実施例１２参照）、発現細胞の核小体
および核への正常な標的指向性が認められた（第１６
図）。コントラストを強めると、Ｍ１変異体タンパク質
は細胞質区画でのみ検出可能であったが、Ｍ２ Ｒｅｘ
変異体は細胞全体にほぼ均質な形で分布していた。Ｍ１
およびＭ２変異体が、核小体局在化のシグナルとして機
能する、プラスに荷電したペプチドドメイン内にだけ存
在している塩基性アミノ酸残基を変化させる事実は、こ
れらの知見と一致する。部分的に活性なＭ１５突然変異
は変異体Ｒｅｘタンパク質の核局在化のパターンをもた
らすが、野生型Ｒｅｘタンパク質とは異なり、Ｍ１５タ
ンパク質は核の核小体領域内へさらに局在化せず、実際
はＭ１５は核小体から排除されるようである（第１６
図）。これらの成績は、Ｎ-末端で塩基性アミノ酸から
離れている残基がＲｅｘの核小体局在化に関与し、もし
くは寄与し得ることを示唆している。
的に不活性なＭ６、Ｍ７またはＭ１３Ｒｅｘ突然変異体
でトランスフェクトした細胞のイン・サイチュ免疫蛍光
染色では（詳細は実施例１２参照）、発現細胞の核小体
および核への正常な標的指向性が認められた（第１６
図）。コントラストを強めると、Ｍ１変異体タンパク質
は細胞質区画でのみ検出可能であったが、Ｍ２ Ｒｅｘ
変異体は細胞全体にほぼ均質な形で分布していた。Ｍ１
およびＭ２変異体が、核小体局在化のシグナルとして機
能する、プラスに荷電したペプチドドメイン内にだけ存
在している塩基性アミノ酸残基を変化させる事実は、こ
れらの知見と一致する。部分的に活性なＭ１５突然変異
は変異体Ｒｅｘタンパク質の核局在化のパターンをもた
らすが、野生型Ｒｅｘタンパク質とは異なり、Ｍ１５タ
ンパク質は核の核小体領域内へさらに局在化せず、実際
はＭ１５は核小体から排除されるようである（第１６
図）。これらの成績は、Ｎ-末端で塩基性アミノ酸から
離れている残基がＲｅｘの核小体局在化に関与し、もし
くは寄与し得ることを示唆している。
【００９８】また野生型ＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘタンパク質
および野生型ＨＩＶ-１ Ｒｅｖタンパク質の生物学的活
性に対するｒｅｘ突然変異体の阻止能を測定した（第１
７図）。ＣＯＳ細胞をｐｇＴＡＸ-ＬＴＲおよびｐＲＥ
Ｘで同時トランスフェクトすると（パネルＡ）、Ｍ６、
Ｍ７およびＭ１３変異体の１０倍モル過剰は優性な負の
表現型を示し、野生型Ｒｅｘタンパク質の活性を著しく
抑制した（レーン３〜５）。これと対照的にＭ１、Ｍ２
およびＭ１５タンパク質は、野生型タンパク質の作用を
変化しないので、劣性の負の突然変異体として作用した
（レーン１、２、６）。同様にＨＩＶ-１のＲｅｖタン
パク質は、Ｒｅｘタンパク質（レーン８）およびＩＬ-
２（レーン９）の作用を妨害しなかった。
および野生型ＨＩＶ-１ Ｒｅｖタンパク質の生物学的活
性に対するｒｅｘ突然変異体の阻止能を測定した（第１
７図）。ＣＯＳ細胞をｐｇＴＡＸ-ＬＴＲおよびｐＲＥ
Ｘで同時トランスフェクトすると（パネルＡ）、Ｍ６、
Ｍ７およびＭ１３変異体の１０倍モル過剰は優性な負の
表現型を示し、野生型Ｒｅｘタンパク質の活性を著しく
抑制した（レーン３〜５）。これと対照的にＭ１、Ｍ２
およびＭ１５タンパク質は、野生型タンパク質の作用を
変化しないので、劣性の負の突然変異体として作用した
（レーン１、２、６）。同様にＨＩＶ-１のＲｅｖタン
パク質は、Ｒｅｘタンパク質（レーン８）およびＩＬ-
２（レーン９）の作用を妨害しなかった。
【００９９】つぎにトランス優性なＲｅｘ突然変異体の
ＨＩＶ-１系におけるＲｅｖ機能に対する阻止能を測定
した（第１７Ｂ図）。ＣＯＳ細胞においてｐｇＴＡＴお
よびおよびｐＲＥＶで同時トランスフェクトすると、Ｍ
６、Ｍ７またはＭ１３Ｒｅｘ突然変異体の１０倍モル過
剰はＴａｔタンパク質の７２アミノ酸形の発現が減少す
ることによって立証されるＲｅｖタンパク質の作用の抑
制を示した（レーン３、４、５）。またこれらのトラン
ス優性Ｒｅｘ突然変異体のＨＩＶ-１ウイルス複製阻止
能を検討した（第１７Ｃ図）。Ｒｅｘおよび段階的な量
のトランス優性なＲｅｘ変異体の存在で、Ｒｅｖ欠損型
ＨＩＶ-１プロウイルスｐＨＸＢ２-Ｂａｍ-ｐ３（Ｌ.リ
ムスキーら、ネーチャー、３３５巻、［１９８８年］、
７３８頁）の複製を、これらのプラスミドによるＣＯＳ
細胞のトランスフェクションにより検討した。培養上清
中のＨＩＶ-１ｐ２４Ｇａｇタンパク質の合成水準によ
って分かるように、トランス優性なＲｅｘ突然変異体
（Ｍ６、Ｍ７およびＭ１３）は投与量に比例するＨＩＶ
-１複製の抑制を生じた。これとは対照的に、ｒｅｘの
劣性の負のＭ１突然変異体はＨＩＶ-１の複製に対して
有意な効果を示さなかった。
ＨＩＶ-１系におけるＲｅｖ機能に対する阻止能を測定
した（第１７Ｂ図）。ＣＯＳ細胞においてｐｇＴＡＴお
よびおよびｐＲＥＶで同時トランスフェクトすると、Ｍ
６、Ｍ７またはＭ１３Ｒｅｘ突然変異体の１０倍モル過
剰はＴａｔタンパク質の７２アミノ酸形の発現が減少す
ることによって立証されるＲｅｖタンパク質の作用の抑
制を示した（レーン３、４、５）。またこれらのトラン
ス優性Ｒｅｘ突然変異体のＨＩＶ-１ウイルス複製阻止
能を検討した（第１７Ｃ図）。Ｒｅｘおよび段階的な量
のトランス優性なＲｅｘ変異体の存在で、Ｒｅｖ欠損型
ＨＩＶ-１プロウイルスｐＨＸＢ２-Ｂａｍ-ｐ３（Ｌ.リ
ムスキーら、ネーチャー、３３５巻、［１９８８年］、
７３８頁）の複製を、これらのプラスミドによるＣＯＳ
細胞のトランスフェクションにより検討した。培養上清
中のＨＩＶ-１ｐ２４Ｇａｇタンパク質の合成水準によ
って分かるように、トランス優性なＲｅｘ突然変異体
（Ｍ６、Ｍ７およびＭ１３）は投与量に比例するＨＩＶ
-１複製の抑制を生じた。これとは対照的に、ｒｅｘの
劣性の負のＭ１突然変異体はＨＩＶ-１の複製に対して
有意な効果を示さなかった。
【０１００】これと同時に、実施例１２および１３の各
種のｒｅｘ突然変異体に関するこれらの知見から、異な
った活性を有する少なくとも２つの異なった構造ドメイ
ンのＲｅｘタンパク質内のおよその境界が判明した。即
ち、１つのドメインはＭ１およびＭ２突然変異によって
特定され、Ｎ-末端に位置し、アミノ酸５〜７および１
４〜１５を含み、タンパク質を核へ標的指向させ、それ
から核小体へ標的指向させする役割を果たしているよう
である。このプラスに荷電しているドメインはまた、直
接ＲｅｘＲＥ（ＲＲＸ）へ、あるいはこのＲＮＡ要素へ
直接接触する他のタンパク質へのＲｅｘ結合に関与し得
る。上述の第２ドメインはＲｅｘエフェクター機能にと
って不可欠であり、したがって突然変異して、トランス
優性なリプレッサーを生産することができる。
種のｒｅｘ突然変異体に関するこれらの知見から、異な
った活性を有する少なくとも２つの異なった構造ドメイ
ンのＲｅｘタンパク質内のおよその境界が判明した。即
ち、１つのドメインはＭ１およびＭ２突然変異によって
特定され、Ｎ-末端に位置し、アミノ酸５〜７および１
４〜１５を含み、タンパク質を核へ標的指向させ、それ
から核小体へ標的指向させする役割を果たしているよう
である。このプラスに荷電しているドメインはまた、直
接ＲｅｘＲＥ（ＲＲＸ）へ、あるいはこのＲＮＡ要素へ
直接接触する他のタンパク質へのＲｅｘ結合に関与し得
る。上述の第２ドメインはＲｅｘエフェクター機能にと
って不可欠であり、したがって突然変異して、トランス
優性なリプレッサーを生産することができる。
【０１０１】以上の５.１、５.２および５.３項の知見
を要約すれば （ａ）決定的な調節タンパク質（ＲｅｘおよびＲｅｖの
ような）を突然変異することによってウイルス抑制因子
を生産する一般に適用可能な原則を発見した。 （ｂ）この原則は複数のウイルス種に作用する突然変異
体調節タンパク質の生産に適用可能なようである。
を要約すれば （ａ）決定的な調節タンパク質（ＲｅｘおよびＲｅｖの
ような）を突然変異することによってウイルス抑制因子
を生産する一般に適用可能な原則を発見した。 （ｂ）この原則は複数のウイルス種に作用する突然変異
体調節タンパク質の生産に適用可能なようである。
【０１０２】（ｃ）組み立てて、同定した特異的にトラ
ンス優性な突然変異体は −ＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘ遺伝子機能の抑制に有効なＨＴＬ
Ｖ-Ｉ Ｒex突然変異体 −ｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ８、
ｐｃＲｅｘＭ１７およびｐｃＲｅｘ１３Δ１５（５.１
項および実施例１〜３参照）、 −Ｍ６、Ｍ７およびＭ１３（５.３項および実施例１２
〜１３参照）、 −ＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝子機能の抑制に有効なＨＩＶ-
１ Ｒｅｖ突然変異体 −ｐＭ１０、ｐΔ９/１４およびｐΔ１０/１４（５.２
項および実施例４〜１１参照）、 −ｐＭ２１、ｐＭ２２、ｐＭ２７、ｐＭ２８、ｐＭ２９
およびｐＭ３２（５.２項および実施例１１ａ〜１１ｂ
参照）、 −ＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘ遺伝子機能の抑制に有効で、ＨＩ
Ｖ-１ ｒｅｖ遺伝子機能の抑制にも有効なＨＴＬＶ-Ｉ
Ｒｅｘ突然変異体 −ｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７およびｐｃＲｅｘＭ
８（５.１項および実施例３参照）、 −Ｍ６、Ｍ７およびＭ１３（５.３項および実施例１２
〜１３参照）、 −ＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘおよびＨＴＬＶ-II ｒｅｘおよび
ＨＩＶ-１ｒｅｖ遺伝子機能の抑制に有効なＨＴＬＶ-Ｉ
Ｒｅｘ突然変異体−Ｍ６、Ｍ７およびＭ１３（５.３項
および実施例１２〜１３参照）、 −ＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝子機能の抑制に有効で、ＨＩＶ
-２ ｒｅｖおよびＳＩＶmacｒｅｖ遺伝子機能の抑制に
も有効なＨＩＶ-１Ｒｅｖ突然変異体 −ｐＭ１０（５.２項および実施例１１ｂ参照）と結論
する。
ンス優性な突然変異体は −ＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘ遺伝子機能の抑制に有効なＨＴＬ
Ｖ-Ｉ Ｒex突然変異体 −ｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ８、
ｐｃＲｅｘＭ１７およびｐｃＲｅｘ１３Δ１５（５.１
項および実施例１〜３参照）、 −Ｍ６、Ｍ７およびＭ１３（５.３項および実施例１２
〜１３参照）、 −ＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝子機能の抑制に有効なＨＩＶ-
１ Ｒｅｖ突然変異体 −ｐＭ１０、ｐΔ９/１４およびｐΔ１０/１４（５.２
項および実施例４〜１１参照）、 −ｐＭ２１、ｐＭ２２、ｐＭ２７、ｐＭ２８、ｐＭ２９
およびｐＭ３２（５.２項および実施例１１ａ〜１１ｂ
参照）、 −ＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘ遺伝子機能の抑制に有効で、ＨＩ
Ｖ-１ ｒｅｖ遺伝子機能の抑制にも有効なＨＴＬＶ-Ｉ
Ｒｅｘ突然変異体 −ｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７およびｐｃＲｅｘＭ
８（５.１項および実施例３参照）、 −Ｍ６、Ｍ７およびＭ１３（５.３項および実施例１２
〜１３参照）、 −ＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘおよびＨＴＬＶ-II ｒｅｘおよび
ＨＩＶ-１ｒｅｖ遺伝子機能の抑制に有効なＨＴＬＶ-Ｉ
Ｒｅｘ突然変異体−Ｍ６、Ｍ７およびＭ１３（５.３項
および実施例１２〜１３参照）、 −ＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝子機能の抑制に有効で、ＨＩＶ
-２ ｒｅｖおよびＳＩＶmacｒｅｖ遺伝子機能の抑制に
も有効なＨＩＶ-１Ｒｅｖ突然変異体 −ｐＭ１０（５.２項および実施例１１ｂ参照）と結論
する。
【０１０３】
【実施例】以下に実施例をあげてこの発明を説明する。
これらの実施例は単に発明を説明するためのものであっ
て、発明の範囲を限定するものではない。
これらの実施例は単に発明を説明するためのものであっ
て、発明の範囲を限定するものではない。
【０１０４】［６.１］ ［実施例１］ トランス優性ＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘ遺伝子の組み立て （１）ｒｅｘ暗号配列のバクテリオファージＭ１３ＲＦ
-ＤＮＡへのクローン化 ｐｃＲｅｘＤＮＡ５μｇを、制限酵素インキュベーショ
ン緩衝液（１０ｍＭトリス-ＨＣl(ｐＨ７.５）、１０ｍ
ＭＭｇＣl2、５０ｍＭＮａＣl、１ｍＭジチオトレイト
ール）２０μl中で、制限酵素ＨＩｎｄIIIおよびＥｃｏ
ＲＩ各１０単位で３７℃で３時間処理した。反応混合物
を、１μｇ/ｍl臭化エチジウム含有１％アガロースゲル
（シーケムＦＭＣ社、ロックランド、ＭＥ、米国）へ直
接負荷し、トリス-酢酸緩衝液（Ｔ.マニアチスら、モレ
キュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュア
ル［１９８２年］、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー、ニューヨーク、１５６頁）中、５０Ｖ、
２５ｍＡで４時間電気泳動を行った。分離したＤＮＡを
３６６ｎｍのＵＶランプで可視化し、１.５ｋｂのｒｅ
ｘ断片を含有する好適なゲル切片を切り出した。このゲ
ル切片をトリス-ほう酸緩衝液５００μlを含有する透析
バッグへ加えた（マニアチス、１５６頁）。ＤＮＡを緩
衝液へ電気泳動溶出し、−２０℃でエタノール沈殿させ
た。
-ＤＮＡへのクローン化 ｐｃＲｅｘＤＮＡ５μｇを、制限酵素インキュベーショ
ン緩衝液（１０ｍＭトリス-ＨＣl(ｐＨ７.５）、１０ｍ
ＭＭｇＣl2、５０ｍＭＮａＣl、１ｍＭジチオトレイト
ール）２０μl中で、制限酵素ＨＩｎｄIIIおよびＥｃｏ
ＲＩ各１０単位で３７℃で３時間処理した。反応混合物
を、１μｇ/ｍl臭化エチジウム含有１％アガロースゲル
（シーケムＦＭＣ社、ロックランド、ＭＥ、米国）へ直
接負荷し、トリス-酢酸緩衝液（Ｔ.マニアチスら、モレ
キュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュア
ル［１９８２年］、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー、ニューヨーク、１５６頁）中、５０Ｖ、
２５ｍＡで４時間電気泳動を行った。分離したＤＮＡを
３６６ｎｍのＵＶランプで可視化し、１.５ｋｂのｒｅ
ｘ断片を含有する好適なゲル切片を切り出した。このゲ
ル切片をトリス-ほう酸緩衝液５００μlを含有する透析
バッグへ加えた（マニアチス、１５６頁）。ＤＮＡを緩
衝液へ電気泳動溶出し、−２０℃でエタノール沈殿させ
た。
【０１０５】バクテリオファージＭ１３ｍｐ１０ＲＦ-
ＤＮＡ５μｇを制限酵素ＨＩｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩ
で処理し、同様に１％アガロースゲルから７.２ｋｂの
ベクターＭ１３断片を単離した。ライゲーション緩衝液
（５０ｍＭトリス-ＨＣl(ｐＨ７.４)、１０ｍＭＭｇＣl
2、１０ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭＡＴＰ）２０
μl中で、ファージＤＮＡ２００ｎｇおよびｃＲｅｘＤ
ＮＡ１μｇをＴ４-ＤＮＡ-リガーゼ１単位と混合し、１
６℃で１５時間インキュベートした。この反応混合物を
直接使用して、エシェリキア・コリＴＧ１株を形質転換
し、培養した（アマーシャム・プロトコール、１６〜１
８頁）。
ＤＮＡ５μｇを制限酵素ＨＩｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩ
で処理し、同様に１％アガロースゲルから７.２ｋｂの
ベクターＭ１３断片を単離した。ライゲーション緩衝液
（５０ｍＭトリス-ＨＣl(ｐＨ７.４)、１０ｍＭＭｇＣl
2、１０ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭＡＴＰ）２０
μl中で、ファージＤＮＡ２００ｎｇおよびｃＲｅｘＤ
ＮＡ１μｇをＴ４-ＤＮＡ-リガーゼ１単位と混合し、１
６℃で１５時間インキュベートした。この反応混合物を
直接使用して、エシェリキア・コリＴＧ１株を形質転換
し、培養した（アマーシャム・プロトコール、１６〜１
８頁）。
【０１０６】好適なファージプラークのＤＮＡを制限酵
素ＨＩｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩによるエンドヌクレア
ーゼ切断によって検査し、ついでトリス-酢酸緩衝液
中、１０μｇ/ｍl臭化エチジウム含有１％アガロースゲ
ルにより分析的ゲル電気泳動を行った。ｒｅｘ暗号配列
を保有していたバクテリオファージを同定し、これをｍ
ｐ１０ｒｅｘと命名した。大規模生産プロトコール（ア
マーシャム・プロトコール、２４〜２５頁）を使用して
１本鎖ｍｐ１０ｒｅｘＤＮＡを単離した。
素ＨＩｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩによるエンドヌクレア
ーゼ切断によって検査し、ついでトリス-酢酸緩衝液
中、１０μｇ/ｍl臭化エチジウム含有１％アガロースゲ
ルにより分析的ゲル電気泳動を行った。ｒｅｘ暗号配列
を保有していたバクテリオファージを同定し、これをｍ
ｐ１０ｒｅｘと命名した。大規模生産プロトコール（ア
マーシャム・プロトコール、２４〜２５頁）を使用して
１本鎖ｍｐ１０ｒｅｘＤＮＡを単離した。
【０１０７】（２）ｍｐ１０ｒｅｘ中のｒｅｘ暗号配列
の突然変異誘発 突然変異誘発の必要条件として、好適な１本鎖ＤＮＡ分
子の合成が必要であった。２９種類のオリゴヌクレオチ
ドを作成し（第４図参照）、結局３０種の突然変異体が
得られた。そのうち、下記の７種のオリゴヌクレオチド
から、トランス優性な表現型の点で好結果であることが
分かった突然変異体が直接または間接的に（実施例２参
照）得られた。
の突然変異誘発 突然変異誘発の必要条件として、好適な１本鎖ＤＮＡ分
子の合成が必要であった。２９種類のオリゴヌクレオチ
ドを作成し（第４図参照）、結局３０種の突然変異体が
得られた。そのうち、下記の７種のオリゴヌクレオチド
から、トランス優性な表現型の点で好結果であることが
分かった突然変異体が直接または間接的に（実施例２参
照）得られた。
【０１０８】
【０１０９】オリゴヌクレオチド（１）は、Ｒｅｘタン
パク質のアミノ酸残基フェニルアラニン（アミノ酸位置
３０）、フェニルアラニン（アミノ酸位置３１）および
セリン（アミノ酸位置３２）を、アミノ酸ロイシン（ア
ミノ酸位置３０）、アスパラギン酸（アミノ酸位置３
１）およびロイシン（アミノ酸位置３２）で置き換えて
いる。
パク質のアミノ酸残基フェニルアラニン（アミノ酸位置
３０）、フェニルアラニン（アミノ酸位置３１）および
セリン（アミノ酸位置３２）を、アミノ酸ロイシン（ア
ミノ酸位置３０）、アスパラギン酸（アミノ酸位置３
１）およびロイシン（アミノ酸位置３２）で置き換えて
いる。
【０１１０】オリゴヌクレオチド（２）は、Ｒｅｘタン
パク質のアミノ酸残基アラニン（アミノ酸位置５８）お
よびチロシン（アミノ酸位置５９）を、アミノ酸アスパ
ラギン酸（アミノ酸位置５８）およびロイシン（アミノ
酸位置５９）で置き換えている。オリゴヌクレオチド
（３）は、Ｒｅｘタンパク質のアミノ酸残基プロリン
（アミノ酸位置６３）およびチロシン（アミノ酸位置６
４）を、アミノ酸アスパラギン酸（アミノ酸位置６３）
およびロイシン（アミノ酸位置６４）で置き換えてい
る。
パク質のアミノ酸残基アラニン（アミノ酸位置５８）お
よびチロシン（アミノ酸位置５９）を、アミノ酸アスパ
ラギン酸（アミノ酸位置５８）およびロイシン（アミノ
酸位置５９）で置き換えている。オリゴヌクレオチド
（３）は、Ｒｅｘタンパク質のアミノ酸残基プロリン
（アミノ酸位置６３）およびチロシン（アミノ酸位置６
４）を、アミノ酸アスパラギン酸（アミノ酸位置６３）
およびロイシン（アミノ酸位置６４）で置き換えてい
る。
【０１１１】オリゴヌクレオチド（４）は、Ｒｅｘタン
パク質のアミノ酸残基チロシン（アミノ酸位置８７）、
セリン（アミノ酸位置８８）およびセリン（アミノ酸位
置８９）を、アミノ酸ロイシン（アミノ酸位置８７）、
アスパラギン酸（アミノ酸位置８８）およびロイシン
（アミノ酸位置８９）で置き換えている。オリゴヌクレ
オチド（５）は、Ｒｅｘタンパク質のアミノ酸残基ロイ
シン（アミノ酸位置９０）およびセリン（アミノ酸位置
９１）を、アミノ酸アスパラギン酸（アミノ酸位置９
０）およびロイシン（アミノ酸位置９１）で置き換えて
いる。
パク質のアミノ酸残基チロシン（アミノ酸位置８７）、
セリン（アミノ酸位置８８）およびセリン（アミノ酸位
置８９）を、アミノ酸ロイシン（アミノ酸位置８７）、
アスパラギン酸（アミノ酸位置８８）およびロイシン
（アミノ酸位置８９）で置き換えている。オリゴヌクレ
オチド（５）は、Ｒｅｘタンパク質のアミノ酸残基ロイ
シン（アミノ酸位置９０）およびセリン（アミノ酸位置
９１）を、アミノ酸アスパラギン酸（アミノ酸位置９
０）およびロイシン（アミノ酸位置９１）で置き換えて
いる。
【０１１２】オリゴヌクレオチド（６）は、Ｒｅｘタン
パク質のアミノ酸残基セリン（アミノ酸位置９４）を、
アミノ酸ロイシンで置き換えている。オリゴヌクレオチ
ド（７）は、Ｒｅｘタンパク質のアミノ酸残基アルギニ
ン（アミノ酸位置１００）およびグルタミン酸（アミノ
酸位置１０１）を、アミノ酸アスパラギン酸（アミノ酸
位置１００）およびロイシン（アミノ酸位置１０１）で
置き換えている。
パク質のアミノ酸残基セリン（アミノ酸位置９４）を、
アミノ酸ロイシンで置き換えている。オリゴヌクレオチ
ド（７）は、Ｒｅｘタンパク質のアミノ酸残基アルギニ
ン（アミノ酸位置１００）およびグルタミン酸（アミノ
酸位置１０１）を、アミノ酸アスパラギン酸（アミノ酸
位置１００）およびロイシン（アミノ酸位置１０１）で
置き換えている。
【０１１３】すべてのオリゴヌクレオチドは、ｒｅｘ暗
号配列の枠内にＢｇｌII制限部位を導入してある。オリ
ゴヌクレオチドは、β-シアノ-エチルホスホアミダイト
化学を使用したアプライド・バイオシステムズ３８０Ａ
・シンセサイザーで固体支持体により合成した。精製
は、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、つ
いで主要生産物を溶出およびエタノール沈殿することに
よって行った。ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼ
を使用するオリゴヌクレオチドのリン酸化をアマーシャ
ム・プロトコール（１３頁）の記載にしたがって実施し
た。オリゴヌクレオチドの指令による突然変異誘発反応
をアマーシヤム・プロトコール（１３〜１６頁）にした
がって実施した。ついでこれを形質転換し、エシェリキ
ア・コリＴＧ１株から平板培養した（アマーシヤム・プ
ロトコール１６〜１８頁）。異なったプラークのＤＮＡ
を、酵素ＢｇｌIIおよびＥｃｏＲＩを使用する制限エン
ドヌクレアーゼ分析によってスクリーニングした。
号配列の枠内にＢｇｌII制限部位を導入してある。オリ
ゴヌクレオチドは、β-シアノ-エチルホスホアミダイト
化学を使用したアプライド・バイオシステムズ３８０Ａ
・シンセサイザーで固体支持体により合成した。精製
は、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、つ
いで主要生産物を溶出およびエタノール沈殿することに
よって行った。ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼ
を使用するオリゴヌクレオチドのリン酸化をアマーシャ
ム・プロトコール（１３頁）の記載にしたがって実施し
た。オリゴヌクレオチドの指令による突然変異誘発反応
をアマーシヤム・プロトコール（１３〜１６頁）にした
がって実施した。ついでこれを形質転換し、エシェリキ
ア・コリＴＧ１株から平板培養した（アマーシヤム・プ
ロトコール１６〜１８頁）。異なったプラークのＤＮＡ
を、酵素ＢｇｌIIおよびＥｃｏＲＩを使用する制限エン
ドヌクレアーゼ分析によってスクリーニングした。
【０１１４】７種の突然変異のすべてから、ｒｅｘ暗号
配列に導入された突然変異を保有している１クローンが
確認された。これらのクローンをｍｐ１０ｒｅｘＭ２、
ｍｐ１０ｒｅｘＭ７、ｍｐ１０ｒｅｘＭ８、ｍｐ１０ｒ
ｅｘＭ１３、ｍｐ１０ｒｅｘＭ１４、ｍｐ１０ｒｅｘＭ
１６およびｍｐ１０ｒｅｘＭ１７と命名した。さらにも
う一つのクローンｍｐ１０ｒｅｘＭ１５を、欠失変異体
の組み立てに使用した（実施例２参照）。
配列に導入された突然変異を保有している１クローンが
確認された。これらのクローンをｍｐ１０ｒｅｘＭ２、
ｍｐ１０ｒｅｘＭ７、ｍｐ１０ｒｅｘＭ８、ｍｐ１０ｒ
ｅｘＭ１３、ｍｐ１０ｒｅｘＭ１４、ｍｐ１０ｒｅｘＭ
１６およびｍｐ１０ｒｅｘＭ１７と命名した。さらにも
う一つのクローンｍｐ１０ｒｅｘＭ１５を、欠失変異体
の組み立てに使用した（実施例２参照）。
【０１１５】（３）突然変異ｒｅｘ遺伝子の哺乳動物発
現プラスミドへの再クローン化 突然変異させたｒｅｘ遺伝子をバクテリオファージＭ１
３ベクターから起原種の発現プラスミドへ戻した。ｐｃ
ＲｅｘＤＮＡ５μｇを制限エンドヌクレアーゼＨＩｎｄ
III１０単位およびＥｃｏＲＩ１０単位と３７℃で３時
間インキュベートした。反応混合物を１０μｇ/ｍl臭化
エチジウム含有１％アガロースゲルへ直接負荷し、トリ
ス-酢酸緩衝液中、５０Ｖ、２５ｍＡで４時間電気泳動
を行った。好適なゲル切片から、ＨＩｎｄIII-ＥｃｏＲ
Ｉベクター断片を電気泳動溶出し、エタノール沈殿し
た。
現プラスミドへの再クローン化 突然変異させたｒｅｘ遺伝子をバクテリオファージＭ１
３ベクターから起原種の発現プラスミドへ戻した。ｐｃ
ＲｅｘＤＮＡ５μｇを制限エンドヌクレアーゼＨＩｎｄ
III１０単位およびＥｃｏＲＩ１０単位と３７℃で３時
間インキュベートした。反応混合物を１０μｇ/ｍl臭化
エチジウム含有１％アガロースゲルへ直接負荷し、トリ
ス-酢酸緩衝液中、５０Ｖ、２５ｍＡで４時間電気泳動
を行った。好適なゲル切片から、ＨＩｎｄIII-ＥｃｏＲ
Ｉベクター断片を電気泳動溶出し、エタノール沈殿し
た。
【０１１６】（２）で得られた突然変異体５μｇを同様
に処理して、ｒｅｘ暗号配列を含んだ断片を単離した。 単離したベクター断片２００ｎｇおよび単離したｒｅｘ
配列１μｇを、Ｔ４-ＤＮＡ-リガーゼ１単位の存在でラ
イゲーション緩衝液２０μlに別々に混合し、１６℃で
１５時間インキュベートした。得られた反応混合物を直
接使用して、エシェリキア・コリＨＢ１０１株を形質転
換した。制限エンドヌクレアーゼＨＩｎｄIII、Ａｓｐ
７１８およびＢｇｌIIを使用して、異なった細菌コロニ
ーのＤＮＡを分析し、これを１％アガロースゲルで分析
的ゲル電気泳動に掛けた。このようにしてｒｅｘ遺伝子
を保有していることを確認したプラスミドを、それぞれ
ｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ８、ｐ
ｃＲｅｘＭ１３、ｐｃＲｅｘＭ１４、ｐｃＲｅｘＭ１
５、ｐｃＲｅｘＭ１６およびｐｃＲｅｘＭ１７と命名し
た。
に処理して、ｒｅｘ暗号配列を含んだ断片を単離した。 単離したベクター断片２００ｎｇおよび単離したｒｅｘ
配列１μｇを、Ｔ４-ＤＮＡ-リガーゼ１単位の存在でラ
イゲーション緩衝液２０μlに別々に混合し、１６℃で
１５時間インキュベートした。得られた反応混合物を直
接使用して、エシェリキア・コリＨＢ１０１株を形質転
換した。制限エンドヌクレアーゼＨＩｎｄIII、Ａｓｐ
７１８およびＢｇｌIIを使用して、異なった細菌コロニ
ーのＤＮＡを分析し、これを１％アガロースゲルで分析
的ゲル電気泳動に掛けた。このようにしてｒｅｘ遺伝子
を保有していることを確認したプラスミドを、それぞれ
ｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ８、ｐ
ｃＲｅｘＭ１３、ｐｃＲｅｘＭ１４、ｐｃＲｅｘＭ１
５、ｐｃＲｅｘＭ１６およびｐｃＲｅｘＭ１７と命名し
た。
【０１１７】［実施例２］ ｒｅｘ暗号配列中の欠失変異の組み立て ｐｃＲｅｘＭ１３ＤＮＡ５μｇを制限酵素ＢｇｌIIおよ
びＥｃｏＲＩそれぞれ１０単位で処理した。ベクター主
鎖およびｒｅｘ暗号配列の５’部分を含んでいる大きい
方のＤＮＡ断片を前記と同様に単離した。これと並行し
てｐｃＲｅｘＭ１５ＤＮＡ５μｇを類似の方法で処理
し、ｒｅｘ暗号配列の３’部分を含んでいる小さい方の
ＤＮＡ断片を単離した。
びＥｃｏＲＩそれぞれ１０単位で処理した。ベクター主
鎖およびｒｅｘ暗号配列の５’部分を含んでいる大きい
方のＤＮＡ断片を前記と同様に単離した。これと並行し
てｐｃＲｅｘＭ１５ＤＮＡ５μｇを類似の方法で処理
し、ｒｅｘ暗号配列の３’部分を含んでいる小さい方の
ＤＮＡ断片を単離した。
【０１１８】単離したｐｃＲｅｘＭ１３ＤＮＡ断片２０
０ｎｇを、単離したｐｃＲｅｘＭ１５ＤＮＡ断片１μｇ
と混合し、Ｔ４-ＤＮＡリガーゼ１単位の存在でライゲ
ーション緩衝液２０μl中、１６℃で１５時間インキュ
ベートした。この操作の結果、アミノ酸位置８７、８８
および８９がクローンｐｃＲｅｘＭ１３と同一であり、
アミノ酸位置９０〜９４を欠失しているｒｅｘ暗号配列
を得た。ついで反応混合物を直接使用して、エシェリキ
ア・コリＨＢ１０１株を形質転換した。異なったクロー
ンのＤＮＡを、酵素ＨＩｎｄIII、Ａｓｐ７１８および
ＢｇｌIIを使用する制限エンドヌクレアーゼ消化により
スクリーニングした。陽性であったクローンを同定し、
これをｐｃＲｅｘ１３Δ１５と命名した。
０ｎｇを、単離したｐｃＲｅｘＭ１５ＤＮＡ断片１μｇ
と混合し、Ｔ４-ＤＮＡリガーゼ１単位の存在でライゲ
ーション緩衝液２０μl中、１６℃で１５時間インキュ
ベートした。この操作の結果、アミノ酸位置８７、８８
および８９がクローンｐｃＲｅｘＭ１３と同一であり、
アミノ酸位置９０〜９４を欠失しているｒｅｘ暗号配列
を得た。ついで反応混合物を直接使用して、エシェリキ
ア・コリＨＢ１０１株を形質転換した。異なったクロー
ンのＤＮＡを、酵素ＨＩｎｄIII、Ａｓｐ７１８および
ＢｇｌIIを使用する制限エンドヌクレアーゼ消化により
スクリーニングした。陽性であったクローンを同定し、
これをｐｃＲｅｘ１３Δ１５と命名した。
【０１１９】［実施例３］ 生物学的活性 （ａ）突然変異体遺伝子の哺乳動物細胞における生物学
的活性 ｒｅｘ野生型遺伝子および各突然変異体ｒｅｘ遺伝子発
現ベクター０.２５μｇを、ゲノムｔａｔ（トランス-活
性化因子）発現ベクターｐｇｔａｔ（Ｍ.Ｈ.マリムら、
ネーチャー、３３５巻、［１９８８年］、１８１頁）
０.２５μｇと混合し、これをカレンが報告したように
Ｃｏｓ細胞系へ同時トランスフェクトした（Ｂ.Ｒ.カレ
ン、メソッズ・イン・エンジモロジー、１５２巻、［１
９８７年］、６８４〜７０３頁）。６０時間のトランス
フェクション後、培養を35Ｓ-システイン３００μＣｉ/
ｍlで３時間標識し、ＨＩＶ-１ＴａｔおよびＨＴＬＶ-
ＩＲｅｘタンパク質の発現を免疫沈降分析により分析し
た。カレンが報告したように、Ｔａｔのアミノ酸残基１
〜６１に対する家兎抗ペプチド抗体、およびＲｅｘのア
ミノ酸残基１７３〜１８９に対する家兎抗ペプチド抗体
をこの実験に使用した（Ｂ.Ｒ.カレン、ジャーナル・オ
ブ・ビロロジー、６２巻、［１９８８年］、２４９８〜
２５０１頁）。沈降したタンパク質をＳＤＳ/ポリアク
リルアミドゲルで分離し、オートラジオグラフィーによ
り可視化した。
的活性 ｒｅｘ野生型遺伝子および各突然変異体ｒｅｘ遺伝子発
現ベクター０.２５μｇを、ゲノムｔａｔ（トランス-活
性化因子）発現ベクターｐｇｔａｔ（Ｍ.Ｈ.マリムら、
ネーチャー、３３５巻、［１９８８年］、１８１頁）
０.２５μｇと混合し、これをカレンが報告したように
Ｃｏｓ細胞系へ同時トランスフェクトした（Ｂ.Ｒ.カレ
ン、メソッズ・イン・エンジモロジー、１５２巻、［１
９８７年］、６８４〜７０３頁）。６０時間のトランス
フェクション後、培養を35Ｓ-システイン３００μＣｉ/
ｍlで３時間標識し、ＨＩＶ-１ＴａｔおよびＨＴＬＶ-
ＩＲｅｘタンパク質の発現を免疫沈降分析により分析し
た。カレンが報告したように、Ｔａｔのアミノ酸残基１
〜６１に対する家兎抗ペプチド抗体、およびＲｅｘのア
ミノ酸残基１７３〜１８９に対する家兎抗ペプチド抗体
をこの実験に使用した（Ｂ.Ｒ.カレン、ジャーナル・オ
ブ・ビロロジー、６２巻、［１９８８年］、２４９８〜
２５０１頁）。沈降したタンパク質をＳＤＳ/ポリアク
リルアミドゲルで分離し、オートラジオグラフィーによ
り可視化した。
【０１２０】ベクターｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ
７、ｐｃＲｅｘＭ８、ｐｃＲｅｘＭ１４、ｐｃＲｅｘＭ
１７およびｐｃＲｅｘ１３Δ１５に暗号化されているｒ
ｅｘ遺伝子は、この検定系で、ｒｅｘ作用に対する負の
表現型を生じたが（第２Ｂ図、レーンＤ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、
ＩおよびＫ）、対照（レーンＢおよびＣ）およびその他
の突然変異体（レーンＧ）は正の表現型を生じた。これ
らの表現型で負のＲｅｘ突然変異体クローンは、すべて
上記のポリクローナル抗Ｒｅｘ抗体によって認識される
Ｒｅｘ特異的なタンパク質を生産することができる（第
２Ａ図、レーンＣ〜ＥおよびＧ〜Ｉ参照）。これに対し
て、クローンｐｃＲｅｘＭ１６における突然変異はＲｅ
ｘ特異的抗体によって検出不可能なタンパク質を生じ
た。このことはタンパク質の半減期の短縮（成績は示さ
ず）に起因するものであると信じられる。
７、ｐｃＲｅｘＭ８、ｐｃＲｅｘＭ１４、ｐｃＲｅｘＭ
１７およびｐｃＲｅｘ１３Δ１５に暗号化されているｒ
ｅｘ遺伝子は、この検定系で、ｒｅｘ作用に対する負の
表現型を生じたが（第２Ｂ図、レーンＤ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、
ＩおよびＫ）、対照（レーンＢおよびＣ）およびその他
の突然変異体（レーンＧ）は正の表現型を生じた。これ
らの表現型で負のＲｅｘ突然変異体クローンは、すべて
上記のポリクローナル抗Ｒｅｘ抗体によって認識される
Ｒｅｘ特異的なタンパク質を生産することができる（第
２Ａ図、レーンＣ〜ＥおよびＧ〜Ｉ参照）。これに対し
て、クローンｐｃＲｅｘＭ１６における突然変異はＲｅ
ｘ特異的抗体によって検出不可能なタンパク質を生じ
た。このことはタンパク質の半減期の短縮（成績は示さ
ず）に起因するものであると信じられる。
【０１２１】（ｂ）ｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、
ｐｃＲｅｘＭ８、ｐｃＲｅｘＭ１３、ｐｃＲｅｘＭ１
４、ｐｃＲｅｘＭ１７およびｐｃＲｅｘ１３Δ１５によ
る野生型ＨＩＶ-１ ｒｅｖおよび／またはＨＴＬＶ-Ｉ
ｒｅｘ機能のトランス優性な抑制 前記と同一の実験装置を使用して、野生型Ｒｅｖおよび
Ｒｅｘタンパク質の機能をトランスで抑制するｒｅｘ突
然変異体の抑制能を検討した。ゲノムｔａｔ発現ベクタ
ーｐｇｔａｔ０.２５μｇ、野生型ｒｅｖ（ｐｃＲｅ
ｖ）または野生型ｒｅｘ（ｐｃｒｅｘ）発現プラスミド
０.２５μｇ、および各ｒｅｘ突然変異体発現プラスミ
ドの過剰量（５μｇ）を別々に混合し、これらをＣｏｓ
細胞へトランスフェクトした。突然変異体の野生型Ｒｅ
ｖまたはＲｅｘ機能に対する影響を、上記のＴａｔ特異
的免疫沈降法によって測定した。
ｐｃＲｅｘＭ８、ｐｃＲｅｘＭ１３、ｐｃＲｅｘＭ１
４、ｐｃＲｅｘＭ１７およびｐｃＲｅｘ１３Δ１５によ
る野生型ＨＩＶ-１ ｒｅｖおよび／またはＨＴＬＶ-Ｉ
ｒｅｘ機能のトランス優性な抑制 前記と同一の実験装置を使用して、野生型Ｒｅｖおよび
Ｒｅｘタンパク質の機能をトランスで抑制するｒｅｘ突
然変異体の抑制能を検討した。ゲノムｔａｔ発現ベクタ
ーｐｇｔａｔ０.２５μｇ、野生型ｒｅｖ（ｐｃＲｅ
ｖ）または野生型ｒｅｘ（ｐｃｒｅｘ）発現プラスミド
０.２５μｇ、および各ｒｅｘ突然変異体発現プラスミ
ドの過剰量（５μｇ）を別々に混合し、これらをＣｏｓ
細胞へトランスフェクトした。突然変異体の野生型Ｒｅ
ｖまたはＲｅｘ機能に対する影響を、上記のＴａｔ特異
的免疫沈降法によって測定した。
【０１２２】この実験の結果から、６種のｒｅｘ突然変
異体、ｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ
８、ｐｃＲｅｘＭ１４、ｐｃＲｅｘＭ１７およびｐｃＲ
ｅｘ１３Δ１４は、野生型ｒｅｘ依存性トランス-活性
化の抑制能を有することが判明した（第２Ｃ図、レーン
Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ）。このうち４種のｒｅｘ突然
変異体ｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ
８、およびｐｃＲｅｘＭ１３（部分的に）は野生型ｒｅ
ｘ依存性トランス-活性化作用の抑制能を有していたが
（第２Ｄ図、レーンＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）、ある種の突然変
異体、即ちこの場合、ｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７
およびｐｃＲｅｘＭ８は、野生型ｒｅｘおよび野生型ｒ
ｅｖ依存性トランス-活性化をともに抑制することがで
きた。
異体、ｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ
８、ｐｃＲｅｘＭ１４、ｐｃＲｅｘＭ１７およびｐｃＲ
ｅｘ１３Δ１４は、野生型ｒｅｘ依存性トランス-活性
化の抑制能を有することが判明した（第２Ｃ図、レーン
Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ）。このうち４種のｒｅｘ突然
変異体ｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７、ｐｃＲｅｘＭ
８、およびｐｃＲｅｘＭ１３（部分的に）は野生型ｒｅ
ｘ依存性トランス-活性化作用の抑制能を有していたが
（第２Ｄ図、レーンＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）、ある種の突然変
異体、即ちこの場合、ｐｃＲｅｘＭ２、ｐｃＲｅｘＭ７
およびｐｃＲｅｘＭ８は、野生型ｒｅｘおよび野生型ｒ
ｅｖ依存性トランス-活性化をともに抑制することがで
きた。
【０１２３】この実験系では、上記のｒｅｘ突然変異体
によるＲｅｖおよび／またはＲｅｘ機能のトランス優性
な抑制を、タンパク質レベルで証明した。また実施例１
〜３の成績は、ＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘタンパク質に２つの
機能的ドメインが存在することを示しているようであ
る。アミノ末端の方向へ向けて、ＲｅｖおよびＲｅｘタ
ンパク質双方に対してトランス優性である２つの突然変
異体が存在する［ｐｃＲｅｘＭ７（アミノ酸位置５８、
５９）およびｐｃＲｅｘＭ８（アミノ酸位置６３、６
４）］。Ｒｅｘタンパク質だけにトランス優性な突然変
異体を含んでいる第２のクラスターは、暗号配列の中央
部に位置している。核局在化シグナルと突然変異体７お
よび８からなるクラスターの間に位置している追加的な
ｒｅｖ／ｒｅｘトランス優性な変異体は第３の機能的ド
メインの一部であるか、さもなければ導入されたアミノ
酸変化がタンパク質の３次構造を妨害して、その結果、
観察されるトランス優性な表現型を生じたのかもしれな
い。
によるＲｅｖおよび／またはＲｅｘ機能のトランス優性
な抑制を、タンパク質レベルで証明した。また実施例１
〜３の成績は、ＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘタンパク質に２つの
機能的ドメインが存在することを示しているようであ
る。アミノ末端の方向へ向けて、ＲｅｖおよびＲｅｘタ
ンパク質双方に対してトランス優性である２つの突然変
異体が存在する［ｐｃＲｅｘＭ７（アミノ酸位置５８、
５９）およびｐｃＲｅｘＭ８（アミノ酸位置６３、６
４）］。Ｒｅｘタンパク質だけにトランス優性な突然変
異体を含んでいる第２のクラスターは、暗号配列の中央
部に位置している。核局在化シグナルと突然変異体７お
よび８からなるクラスターの間に位置している追加的な
ｒｅｖ／ｒｅｘトランス優性な変異体は第３の機能的ド
メインの一部であるか、さもなければ導入されたアミノ
酸変化がタンパク質の３次構造を妨害して、その結果、
観察されるトランス優性な表現型を生じたのかもしれな
い。
【０１２４】［６.２］ ［実施例４］ Ｒｅｖで集中発生した点変異および欠失変異 Ｒｅｖタンパク質は生体内でセリンの位置でリン酸化さ
れ、主として細胞核へ局在化し、その核小体で濃縮され
る。下記の突然変異分析は、Ｒｅｖ機能のこの特性関連
を、他のどの因子よりＨＩＶ-１構造遺伝子発現のトラ
ンス-活性化因子として指摘する。
れ、主として細胞核へ局在化し、その核小体で濃縮され
る。下記の突然変異分析は、Ｒｅｖ機能のこの特性関連
を、他のどの因子よりＨＩＶ-１構造遺伝子発現のトラ
ンス-活性化因子として指摘する。
【０１２５】テーラーらが報告したオリゴヌクレオチド
指令による突然変異誘発を再び使用して、集中発生する
点変異（ｐＭ）をＨＩＶ-１ ＲｅｖのＨＸＢ-３株へ導
入した（テーラーら、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ、１３巻、［１９８５年］、８７６５〜８７８５
頁）。具体的にはバクテリオファージＭ１３突然変異誘
発系（アマーシャム社、アーリントンハイツ、ＩＬ、米
国）を使用して、発現ベクターｐｃＲＥＶ（マリムら、
ネーチャー、３３５巻、［１９８８年］、１８１〜１８
３頁）によって暗号化された完全鎖長のｃＤＮＡコピー
ｒｅｘへ標的指向ヌクレオチド置換を導入した。ｐｃＲ
ＥＶのＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を第６図に示
す。
指令による突然変異誘発を再び使用して、集中発生する
点変異（ｐＭ）をＨＩＶ-１ ＲｅｖのＨＸＢ-３株へ導
入した（テーラーら、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ、１３巻、［１９８５年］、８７６５〜８７８５
頁）。具体的にはバクテリオファージＭ１３突然変異誘
発系（アマーシャム社、アーリントンハイツ、ＩＬ、米
国）を使用して、発現ベクターｐｃＲＥＶ（マリムら、
ネーチャー、３３５巻、［１９８８年］、１８１〜１８
３頁）によって暗号化された完全鎖長のｃＤＮＡコピー
ｒｅｘへ標的指向ヌクレオチド置換を導入した。ｐｃＲ
ＥＶのＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を第６図に示
す。
【０１２６】集中発生する一連の点変異をＲｅｖへ導入
し（第５図、Ｍ１〜Ｍ１４）、クローン化し、ジデオキ
シヌクレオチド配列決定システム（ストラタジーン、ラ
・ジョラ、ＣＡ、米国）を使用してその配列を確定し
た。突然変異は、Ｒｅｖ全体にわたってほぼ均等に配置
され、その中にある１１個のセリン残基へそれぞれ標的
指向することができた。変化したヌクレオチドに下線を
付して、各突然変異（ｐＭ１〜ｐＭ１４）およびそれを
囲むＤＮＡ配列を第７図に示す。
し（第５図、Ｍ１〜Ｍ１４）、クローン化し、ジデオキ
シヌクレオチド配列決定システム（ストラタジーン、ラ
・ジョラ、ＣＡ、米国）を使用してその配列を確定し
た。突然変異は、Ｒｅｖ全体にわたってほぼ均等に配置
され、その中にある１１個のセリン残基へそれぞれ標的
指向することができた。変化したヌクレオチドに下線を
付して、各突然変異（ｐＭ１〜ｐＭ１４）およびそれを
囲むＤＮＡ配列を第７図に示す。
【０１２７】注目した大部分の突然変異は、第５図で四
角で囲んだ残基を置き換えて、アスパラギン酸（Ａｓ
ｐ）およびロイシン（Ｌｅｕ）のコドンを生じた。各突
然変異は、Ｒｅｖ内のその位置にしたがい、例えばＮ-
末端に最も近い突然変異をｐＭ１、Ｃ-末端に最も近い
突然変異をｐＭ１４と命名した。種々のｐＭ突然変異体
の正確な構造を第７図に示した。突然変異の大半は２つ
のコドンだけに影響したが、この一般法則の例外とし
て、Ｍ４およびＭ１３は３個のコドンに影響を与え、ま
たＭ６は４個のコドンに影響を与えた。多くの場合、ア
ミノ酸置換はアミノ酸２個のミスセンス変異から起こっ
たが、ｐＭ６の場合は、ＡｓｐおよびＬｅｕがアルギニ
ン残基４個を置換し、それによってアミノ酸２個の欠失
を生じた。ｐＭ４およびｐＭ１３は、何れももとのＲｅ
ｖで観察されなかった近接したアミノ酸１個の置換を追
加的に含んでいた。ｐＭ４では２３位のチロシンのアス
パラギン酸置換を含み、ｐＭ１３では１０９位のイソロ
イシンがバリンに置換された。これらの追加的な変化
は、突然変異誘発プロトコールに使用した１本鎖ＤＮＡ
オリゴヌクレオチドプライマー内の１塩基エラーから起
こったものである。
角で囲んだ残基を置き換えて、アスパラギン酸（Ａｓ
ｐ）およびロイシン（Ｌｅｕ）のコドンを生じた。各突
然変異は、Ｒｅｖ内のその位置にしたがい、例えばＮ-
末端に最も近い突然変異をｐＭ１、Ｃ-末端に最も近い
突然変異をｐＭ１４と命名した。種々のｐＭ突然変異体
の正確な構造を第７図に示した。突然変異の大半は２つ
のコドンだけに影響したが、この一般法則の例外とし
て、Ｍ４およびＭ１３は３個のコドンに影響を与え、ま
たＭ６は４個のコドンに影響を与えた。多くの場合、ア
ミノ酸置換はアミノ酸２個のミスセンス変異から起こっ
たが、ｐＭ６の場合は、ＡｓｐおよびＬｅｕがアルギニ
ン残基４個を置換し、それによってアミノ酸２個の欠失
を生じた。ｐＭ４およびｐＭ１３は、何れももとのＲｅ
ｖで観察されなかった近接したアミノ酸１個の置換を追
加的に含んでいた。ｐＭ４では２３位のチロシンのアス
パラギン酸置換を含み、ｐＭ１３では１０９位のイソロ
イシンがバリンに置換された。これらの追加的な変化
は、突然変異誘発プロトコールに使用した１本鎖ＤＮＡ
オリゴヌクレオチドプライマー内の１塩基エラーから起
こったものである。
【０１２８】２つの隣接したセリン残基の単一な欠失に
よって組み立てられたｐＭ７を除いて、すべての点変異
は独特なＢｇｌII部位の生成を生じた（第５図参照）。
ＢｇｌII部位はすべて同一の読み取り枠へ挿入され、そ
れによってそれに伴うＲｅｖのＮ-末端およびＣ-末端の
欠失変異（ｐΔ）の組み立てを促進した。ｐΔ変異体は
欠失の位置によって命名され、例えばｐΔ１１/１４は
導入したｐＭ１１およびｐＭ１４突然変異の間に欠失を
有する。
よって組み立てられたｐＭ７を除いて、すべての点変異
は独特なＢｇｌII部位の生成を生じた（第５図参照）。
ＢｇｌII部位はすべて同一の読み取り枠へ挿入され、そ
れによってそれに伴うＲｅｖのＮ-末端およびＣ-末端の
欠失変異（ｐΔ）の組み立てを促進した。ｐΔ変異体は
欠失の位置によって命名され、例えばｐΔ１１/１４は
導入したｐＭ１１およびｐＭ１４突然変異の間に欠失を
有する。
【０１２９】［実施例５］ Ｒｅｖ突然変異体の発現 親シトメガロウイルスの即時早期プロモーターに基づく
ベクターｐＢＣ１２/CMV(B.Ｒ.カレン、セル、４６巻、
［１９８６年］、９７３〜９８２頁）を陰性対照として
使用した。またこの実験では、ゲノムｔａｔ遺伝子発現
ベクターｐｇＴＡＴおよび分泌されたアルカリ性ホスフ
ァターゼ遺伝子発現ベクターｐＢＣ１２/ＲＳＶ/ＳＥＡ
Ｐを使用した（マリムら、前掲、およびバージャーら、
ジーン、６６巻、［１９８８年］、１〜１０頁）。
ベクターｐＢＣ１２/CMV(B.Ｒ.カレン、セル、４６巻、
［１９８６年］、９７３〜９８２頁）を陰性対照として
使用した。またこの実験では、ゲノムｔａｔ遺伝子発現
ベクターｐｇＴＡＴおよび分泌されたアルカリ性ホスフ
ァターゼ遺伝子発現ベクターｐＢＣ１２/ＲＳＶ/ＳＥＡ
Ｐを使用した（マリムら、前掲、およびバージャーら、
ジーン、６６巻、［１９８８年］、１〜１０頁）。
【０１３０】発現ベクターｐｃＲＥＶを修飾して、ｐＭ
およびｐΔｒｅｖ変異体を発現した。修飾したｐｃＲＥ
ＶをｐｇＴＡＴとともにＣＯＳ細胞へ同時トランスフェ
クトすることからなる定性的検定を再び使用し、変異体
におけるＨＩＶ-１ ｒｅｖおよびｔａｔの発現を検定し
た（マリムら、前掲、およびマリムら、ネーチャー、３
３８巻、［１９８９年］、２５４〜５７頁）。具体的に
は、カレンが報告したように（メソッズ・イン・エンジ
モロジー、１５２巻、［１９８７年］、６８４〜７０３
頁）、ｐｇＴＡＴ０.２５μｇと、野生型、またはＤＥ
ＡＥ-デキストランおよびクロロキンで修飾したｐｃＲ
ＥＶ発現ベクター０.２５μｇを使用するＤＮＡ依存性
トランスフェクションによって、ＣＯＳ細胞培養（３５
ｍｍ）を同時トランスフェクトした。
およびｐΔｒｅｖ変異体を発現した。修飾したｐｃＲＥ
ＶをｐｇＴＡＴとともにＣＯＳ細胞へ同時トランスフェ
クトすることからなる定性的検定を再び使用し、変異体
におけるＨＩＶ-１ ｒｅｖおよびｔａｔの発現を検定し
た（マリムら、前掲、およびマリムら、ネーチャー、３
３８巻、［１９８９年］、２５４〜５７頁）。具体的に
は、カレンが報告したように（メソッズ・イン・エンジ
モロジー、１５２巻、［１９８７年］、６８４〜７０３
頁）、ｐｇＴＡＴ０.２５μｇと、野生型、またはＤＥ
ＡＥ-デキストランおよびクロロキンで修飾したｐｃＲ
ＥＶ発現ベクター０.２５μｇを使用するＤＮＡ依存性
トランスフェクションによって、ＣＯＳ細胞培養（３５
ｍｍ）を同時トランスフェクトした。
【０１３１】６０時間のトランスフェクション後、培養
を［35Ｓ］-システインおよび［32Ｐ］-無機リン酸塩
（［32Ｐ］-Ｐｉ）で同時標識した（マリムら、［１９
８８年］、前掲、およびハウバーら、ジャーナル・オブ
・ビロロジー、６２巻、［１９８８年］、４８０１〜０
４頁）。ついで細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、家兎ポ
リクローナル抗ペプチド抗血清を使用する免疫沈降分析
により、培養中のｒｅｖおよびｔａｔ発現の相対水準を
検定した（マリムら、［１９８８年］、前掲、およびカ
レンら、ジャーナル・オブ・ビロロジー、６２巻、［１
９８８年］、２４９８〜２５０１頁）。より具体的に
は、Ｒｅｖアミノ酸残基１〜２０（ＲＥＶ１/２０）に
対する抗血清をｐＭ５およびｐＭ６によって暗号化され
た変異体タンパク質の免疫沈降に使用し、またＲｅｖア
ミノ酸残基２７〜５１（ＲＥＶ２７/５１）に対する抗
血清を残りすべての変異体タンパク質の免疫沈降に使用
した。ｔａｔ発現の免疫沈降分析は、Ｔａｔアミノ酸残
基１〜６１（ＴＡＴ１/６１）に対する家兎ポリクロー
ナル抗ペプチド抗血清を使用して実施した。
を［35Ｓ］-システインおよび［32Ｐ］-無機リン酸塩
（［32Ｐ］-Ｐｉ）で同時標識した（マリムら、［１９
８８年］、前掲、およびハウバーら、ジャーナル・オブ
・ビロロジー、６２巻、［１９８８年］、４８０１〜０
４頁）。ついで細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、家兎ポ
リクローナル抗ペプチド抗血清を使用する免疫沈降分析
により、培養中のｒｅｖおよびｔａｔ発現の相対水準を
検定した（マリムら、［１９８８年］、前掲、およびカ
レンら、ジャーナル・オブ・ビロロジー、６２巻、［１
９８８年］、２４９８〜２５０１頁）。より具体的に
は、Ｒｅｖアミノ酸残基１〜２０（ＲＥＶ１/２０）に
対する抗血清をｐＭ５およびｐＭ６によって暗号化され
た変異体タンパク質の免疫沈降に使用し、またＲｅｖア
ミノ酸残基２７〜５１（ＲＥＶ２７/５１）に対する抗
血清を残りすべての変異体タンパク質の免疫沈降に使用
した。ｔａｔ発現の免疫沈降分析は、Ｔａｔアミノ酸残
基１〜６１（ＴＡＴ１/６１）に対する家兎ポリクロー
ナル抗ペプチド抗血清を使用して実施した。
【０１３２】免疫沈降したタンパク質を、１４％不連続
ＳＤＳ-アクリルアミドゲル電気泳動によって分解し、
オートラジオグラフィーにより可視化した。これらの実
験の結果を第８図に示す。既知タンパク質分子量マーカ
ーの相対移動度を図の右側に示す。［35Ｓ］-システイ
ンおよび［32Ｐ］-Ｐｉ標識した培養の抗-Ｒｅｖ抗血清
による免疫沈降をそれぞれ第８Ａおよび８Ｃ図に示す。
［35Ｓ］-システイン標識培養の免疫沈降では、大半の
ミスセンス（ｐＭ）変異体で野生型に匹敵する強度およ
び移動度を示すバンドを生じた（第８Ａ図、レーン１〜
１４）。この一般法則の例外として、変異体ｐＭ６では
僅かに早い移動度を示す強いバンドを生じ（Ｍr〜１８
ｋＤ）、ｐＭ１では著しく遅い移動度を示す微弱なバン
ドを生じた。
ＳＤＳ-アクリルアミドゲル電気泳動によって分解し、
オートラジオグラフィーにより可視化した。これらの実
験の結果を第８図に示す。既知タンパク質分子量マーカ
ーの相対移動度を図の右側に示す。［35Ｓ］-システイ
ンおよび［32Ｐ］-Ｐｉ標識した培養の抗-Ｒｅｖ抗血清
による免疫沈降をそれぞれ第８Ａおよび８Ｃ図に示す。
［35Ｓ］-システイン標識培養の免疫沈降では、大半の
ミスセンス（ｐＭ）変異体で野生型に匹敵する強度およ
び移動度を示すバンドを生じた（第８Ａ図、レーン１〜
１４）。この一般法則の例外として、変異体ｐＭ６では
僅かに早い移動度を示す強いバンドを生じ（Ｍr〜１８
ｋＤ）、ｐＭ１では著しく遅い移動度を示す微弱なバン
ドを生じた。
【０１３３】抗Ｔａｔ抗血清を使用するｔａｔ発現の免
疫沈降分析は、モデル指示薬としてｐｇＴＡＴを使用す
るｒｅｖ機能の定性的検定を提供した。前述のようにｒ
ｅｖが存在しないと、８６アミノ酸（ａａ）のエキソン
２個形ｔａｔタンパク質をもっぱら暗号化している完全
にスプライスされた細胞質性ｔａｔｍＲＮＡが発現す
る。然しｒｅｖが存在すると、ｐｇＴＡＴは、先端を切
り取られたエキソン１個形の７２ａａ鎖長のタンパク質
を暗号化しているスプライスされないｔａｔｍＲＮＡの
細胞質発現を誘導する。
疫沈降分析は、モデル指示薬としてｐｇＴＡＴを使用す
るｒｅｖ機能の定性的検定を提供した。前述のようにｒ
ｅｖが存在しないと、８６アミノ酸（ａａ）のエキソン
２個形ｔａｔタンパク質をもっぱら暗号化している完全
にスプライスされた細胞質性ｔａｔｍＲＮＡが発現す
る。然しｒｅｖが存在すると、ｐｇＴＡＴは、先端を切
り取られたエキソン１個形の７２ａａ鎖長のタンパク質
を暗号化しているスプライスされないｔａｔｍＲＮＡの
細胞質発現を誘導する。
【０１３４】第８図で、野生型ｒｅｖは１９キロダルト
ン（ｋＤ）の相対分子質量（Ｍr）で移動し、容易に検
出されるが（レーン０）、ｔａｔの８６ａａ形および７
２ａａ形はそれぞれ１５.５ｋＤおよび１４ｋＤで移動
する。模擬トランスフェクト培養は、これらの検定条件
下で何ら特異的な信号を生じないが（マリムら、前
掲）、第８Ｂ図を精査した結果、突然変異体発現ベクタ
ーでトランスフェクトした培養でも、組立て体指示薬ｐ
ｇＴＡＴで同時トランスフェクトした培養でも、どちら
もｔａｔタンパク質合計に匹敵する量を合成することが
判明した。この成績から、どの変異体Ｒｅｖタンパク質
もトランスフェクト細胞に対して有毒でないことが示唆
される。
ン（ｋＤ）の相対分子質量（Ｍr）で移動し、容易に検
出されるが（レーン０）、ｔａｔの８６ａａ形および７
２ａａ形はそれぞれ１５.５ｋＤおよび１４ｋＤで移動
する。模擬トランスフェクト培養は、これらの検定条件
下で何ら特異的な信号を生じないが（マリムら、前
掲）、第８Ｂ図を精査した結果、突然変異体発現ベクタ
ーでトランスフェクトした培養でも、組立て体指示薬ｐ
ｇＴＡＴで同時トランスフェクトした培養でも、どちら
もｔａｔタンパク質合計に匹敵する量を合成することが
判明した。この成績から、どの変異体Ｒｅｖタンパク質
もトランスフェクト細胞に対して有毒でないことが示唆
される。
【０１３５】またこの分析は、Ｒｅｖの５種のミスセン
ス変異体および２種の欠失変異体が不活性であることを
示したが（レーン４〜７、１０、１６、２０）、その他
のＲｅｖ突然変異体はすべて完全に７２ａａＴａｔ発現
を誘導できることが判った。４種の不活性なミスセンス
変異体はアミノ酸残基２３と５６の間（Ｍ４〜Ｍ７）で
集中発生したが、第５の不活性変異体（ｐＭ１０）は２
つの完全に機能的な突然変異体によって分離され、残基
７８および７９に影響を与える。ＲｅｖのＮ-末端に近
い４残基（ｐΔ１/２）またはＣ-末端に近い２１残基
（ｐΔ１１/１４）の欠失は、ｒｅｖ機能に対して殆ど
または全く効果がなかった。これとは対照的に残基９と
１７の間の追加的な配列の欠失（ｐΔ１/３）はｒｅｖ
機能の喪失を生じた。
ス変異体および２種の欠失変異体が不活性であることを
示したが（レーン４〜７、１０、１６、２０）、その他
のＲｅｖ突然変異体はすべて完全に７２ａａＴａｔ発現
を誘導できることが判った。４種の不活性なミスセンス
変異体はアミノ酸残基２３と５６の間（Ｍ４〜Ｍ７）で
集中発生したが、第５の不活性変異体（ｐＭ１０）は２
つの完全に機能的な突然変異体によって分離され、残基
７８および７９に影響を与える。ＲｅｖのＮ-末端に近
い４残基（ｐΔ１/２）またはＣ-末端に近い２１残基
（ｐΔ１１/１４）の欠失は、ｒｅｖ機能に対して殆ど
または全く効果がなかった。これとは対照的に残基９と
１７の間の追加的な配列の欠失（ｐΔ１/３）はｒｅｖ
機能の喪失を生じた。
【０１３６】［実施例６］ ｒｅｖ突然変異体のトランス-活性化能 ｒｅｖ突然変異体のトランス-活性化能を一層厳密に評
価するため、ＨＩＶ-１の複製欠損型ｒｅｖ変異体をト
ランスで救援するｒｅｖ突然変異体の救援能を試験し
た。この分析の目的のため、ベクターｐＨＩＶ-１Δｒ
ｅｖのｒｅｖＨＩＶ-１プロウイルス［ファインバーグ
らによってｐＨＸＢ２Ｂａｍ-ｐ３と命名された（セ
ル、４６巻、［１９８６年］、８０７〜１７頁］を使用
した。このプロウイルスは、ｒｅｖの第２暗号エキソン
のアミノ酸位置５９に該プロウイルスの複製を不可能に
するフレーム・シフト変異を含んでおり、即ち、ＣＯＳ
細胞へトランスフェクトしたとき、ＨＩＶ-１ ｒｅｖ発
現がトランスで可能なベクターとの同時トランスフェク
トがないと、機能的なＲｅｖタンパク質を産生できない
（リムスキーら、ネーチャー、３３５巻、［１９８９
年］、７３８〜４０頁）。第９図に示したように、可溶
性ｐ２４Ｇａｇ発現のＥＬＩＳＡ検定法（デュポン-Ｎ
ＥＮ社、ビレリカ、ＭＡ、米国）を製造業者の標準的な
供給によって使用して、培養上清へ放出されたＨＩＶ-
１ｐ２４Ｇａｇタンパク質濃度（ｐｇ/ｍl）を定量的に
検定することにより、ウイルスの複製を測定し、突然変
異体のｒｅｖプロウイルス救援能を分析した。
価するため、ＨＩＶ-１の複製欠損型ｒｅｖ変異体をト
ランスで救援するｒｅｖ突然変異体の救援能を試験し
た。この分析の目的のため、ベクターｐＨＩＶ-１Δｒ
ｅｖのｒｅｖＨＩＶ-１プロウイルス［ファインバーグ
らによってｐＨＸＢ２Ｂａｍ-ｐ３と命名された（セ
ル、４６巻、［１９８６年］、８０７〜１７頁］を使用
した。このプロウイルスは、ｒｅｖの第２暗号エキソン
のアミノ酸位置５９に該プロウイルスの複製を不可能に
するフレーム・シフト変異を含んでおり、即ち、ＣＯＳ
細胞へトランスフェクトしたとき、ＨＩＶ-１ ｒｅｖ発
現がトランスで可能なベクターとの同時トランスフェク
トがないと、機能的なＲｅｖタンパク質を産生できない
（リムスキーら、ネーチャー、３３５巻、［１９８９
年］、７３８〜４０頁）。第９図に示したように、可溶
性ｐ２４Ｇａｇ発現のＥＬＩＳＡ検定法（デュポン-Ｎ
ＥＮ社、ビレリカ、ＭＡ、米国）を製造業者の標準的な
供給によって使用して、培養上清へ放出されたＨＩＶ-
１ｐ２４Ｇａｇタンパク質濃度（ｐｇ/ｍl）を定量的に
検定することにより、ウイルスの複製を測定し、突然変
異体のｒｅｖプロウイルス救援能を分析した。
【０１３７】対照の目的のため、Ｒｅｖ非応答性ベクタ
ーｐＢＣ１２/ＲＳＶ/ＳＥＡＰ（１培養当たり１２.５
ｎｇ）［分泌されたアルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡ
Ｐ）遺伝子発現ベクター］で培養を同時トランスフェク
トすることによって監視した。上清ｐ２４Ｇａｇ濃度と
並行してＳＥＡＰ濃度を便宜的に測定した。また幾つか
の培養では、陰性対照ベクターｐＢＣ１２/ＣＭＶ（Ｎ
ＥＧ）か、または野生型ｒｅｖ遺伝子発現ベクター（ｐ
ｃＲｅｖ）の何れか１２５ｎｇで同時トランスフェクト
した。
ーｐＢＣ１２/ＲＳＶ/ＳＥＡＰ（１培養当たり１２.５
ｎｇ）［分泌されたアルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡ
Ｐ）遺伝子発現ベクター］で培養を同時トランスフェク
トすることによって監視した。上清ｐ２４Ｇａｇ濃度と
並行してＳＥＡＰ濃度を便宜的に測定した。また幾つか
の培養では、陰性対照ベクターｐＢＣ１２/ＣＭＶ（Ｎ
ＥＧ）か、または野生型ｒｅｖ遺伝子発現ベクター（ｐ
ｃＲｅｖ）の何れか１２５ｎｇで同時トランスフェクト
した。
【０１３８】ＣＯＳ細胞培養（３５ｍｍ）をｐＨＩＶ-
１Δｒｅｖ２５０ｎｇと、対照ベクターまたは修飾した
１突然変異体含有ベクター１２５ｎｇで同時トランスフ
ェクトした。６５時間トランスフェクション後、上清培
地を採取し、Ｐ２４Ｇａｇタンパク質の発現水準を検定
した。同時にＳＥＡＰ濃度を測定した。上清ＳＥＡＰ濃
度で認められた僅かな変動を補正し、得られた値を第９
図に再掲した（ＳＥＡＰの平均活性を１.００単位と
し、観察された標準偏差は±０.１４、範囲は１.３０〜
０.７３である)。
１Δｒｅｖ２５０ｎｇと、対照ベクターまたは修飾した
１突然変異体含有ベクター１２５ｎｇで同時トランスフ
ェクトした。６５時間トランスフェクション後、上清培
地を採取し、Ｐ２４Ｇａｇタンパク質の発現水準を検定
した。同時にＳＥＡＰ濃度を測定した。上清ＳＥＡＰ濃
度で認められた僅かな変動を補正し、得られた値を第９
図に再掲した（ＳＥＡＰの平均活性を１.００単位と
し、観察された標準偏差は±０.１４、範囲は１.３０〜
０.７３である)。
【０１３９】この実験で、ＳＥＡＰ活性の上清濃度には
ほとんど変動が見られなかったので、トランスフェクシ
ョン効率が等価であることが証明され、また細胞毒性を
誘発する突然変異体がないことが確かめられた。ｐＨＩ
Ｖ-１Δｒｅｖ単独のトランスフェクションでは、培養
上清に検出可能なｐ２４Ｇａｇタンパク質を生じなかっ
たが（レーンＮＥＧ）、野生型ｒｅｖ遺伝子発現ベクタ
ーとの同時トランスフェクションでは、ｐＨＩＶ-１Δ
Ｒｅｖのｐ２４Ｇａｇ分泌誘導能を有効に補足していた
（レーンｐｃＲＥＶ）。
ほとんど変動が見られなかったので、トランスフェクシ
ョン効率が等価であることが証明され、また細胞毒性を
誘発する突然変異体がないことが確かめられた。ｐＨＩ
Ｖ-１Δｒｅｖ単独のトランスフェクションでは、培養
上清に検出可能なｐ２４Ｇａｇタンパク質を生じなかっ
たが（レーンＮＥＧ）、野生型ｒｅｖ遺伝子発現ベクタ
ーとの同時トランスフェクションでは、ｐＨＩＶ-１Δ
Ｒｅｖのｐ２４Ｇａｇ分泌誘導能を有効に補足していた
（レーンｐｃＲＥＶ）。
【０１４０】またｐｇＴＡＴに基づく検定で試験し、陽
性であったすべてのＲｅｖ突然変異体を可視化して第８
Ｂ図に示したが、野生型ｒｅｖ組立て体で認められた活
性の５０〜１００％の活性水準が救援検定で達成され
た。例外としてＭ１では−３０％の活性を示したが、こ
の減少はＭ１変異体の生体内安定性の低下を反映したも
のであろう。第８Ｂ図でマイナスと採点したすべての突
然変異体は、救援検定で完全に陰性であり（即ち、ｐ２
４Ｇａｇの１０pg/mlまたはそれ以下）、例外としてＭ
７では辛うじて検出し得た上清のｐ２４Ｇａｇタンパク
質濃度を生じた。
性であったすべてのＲｅｖ突然変異体を可視化して第８
Ｂ図に示したが、野生型ｒｅｖ組立て体で認められた活
性の５０〜１００％の活性水準が救援検定で達成され
た。例外としてＭ１では−３０％の活性を示したが、こ
の減少はＭ１変異体の生体内安定性の低下を反映したも
のであろう。第８Ｂ図でマイナスと採点したすべての突
然変異体は、救援検定で完全に陰性であり（即ち、ｐ２
４Ｇａｇの１０pg/mlまたはそれ以下）、例外としてＭ
７では辛うじて検出し得た上清のｐ２４Ｇａｇタンパク
質濃度を生じた。
【０１４１】［実施例７］ 生物学的活性に必要でないＲｅｖリン酸化 ＨＩＶ-１ Ｒｅｖタンパク質は生体内で発現すると１ま
たはそれ以上のセリン残基の位置でリン酸化される。第
５図に概略を示した突然変異は、ｒｅｖ暗号配列内の１
１個の各セリン残基に影響を与える。そこでＨＩＶ-１
ｒｅｖの生体内リン酸化部位を確かめるため、トランス
フェクトしたＣＯＳ細胞培養で一過性に発現する
［32Ｐ］-Ｐｉ標識Ｒｅｖタンパク質を免疫沈降により
監視した（第８Ｃ図）。［32Ｐ］-Ｐｉのｒｅｖへの挿
入濃度と、これと並行してトランスフェクトした培養で
挿入された［35Ｓ］-システイン濃度との比較（第８Ａ
図）を用いて、個々の突然変異体のリン酸挿入水準に対
する効果を評価した。この比較の結果を第１表に示す。
たはそれ以上のセリン残基の位置でリン酸化される。第
５図に概略を示した突然変異は、ｒｅｖ暗号配列内の１
１個の各セリン残基に影響を与える。そこでＨＩＶ-１
ｒｅｖの生体内リン酸化部位を確かめるため、トランス
フェクトしたＣＯＳ細胞培養で一過性に発現する
［32Ｐ］-Ｐｉ標識Ｒｅｖタンパク質を免疫沈降により
監視した（第８Ｃ図）。［32Ｐ］-Ｐｉのｒｅｖへの挿
入濃度と、これと並行してトランスフェクトした培養で
挿入された［35Ｓ］-システイン濃度との比較（第８Ａ
図）を用いて、個々の突然変異体のリン酸挿入水準に対
する効果を評価した。この比較の結果を第１表に示す。
【０１４２】
【表１】 ＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝子突然変異体の表現型分析 クローン Ｒｅｖa リン酸化b 亜細胞c トランス優性d 機能 局在化 抑制 野生型 ＋＋ ＋＋ Ｎ Ｍ１ ＋ ＋＋ ？ Ｍ２ ＋＋ ＋ Ｎ Ｍ３ ＋＋ ＋＋ Ｎ＞Ｃ Ｍ４ − ＋＋ Ｎ＞Ｃ − Ｍ５ − ± Ｃ＞Ｎ − Ｍ６ − − Ｃ＞Ｎ − Ｍ７ − ＋＋ Ｎ＞Ｃ − Ｍ８ ＋＋ ＋＋ Ｎ＞Ｃ Ｍ９ ＋＋ ＋＋ Ｎ Ｍ１０ − ＋＋ Ｎ ＋＋ Ｍ１１ ＋＋ ＋＋ Ｎ Ｍ１２ ＋＋ ＋ Ｎ Ｍ１３ ＋＋ ＋＋ Ｎ Ｍ１４ ＋＋ ＋＋ Ｎ Δ１/２ ＋＋ ± Ｎ Δ１/３ − − Ｎ＞Ｃ − Δ９/１４ − ｎｄ ｎｄ ＋ Δ１０/１４ − ± Ｎ ＋ Δ１１/１４ ＋＋ ± Ｎ Δ１２/１４ ＋＋ ± Ｎ Δ１３/１４ ＋＋ ＋＋ Ｎ a＋＋：野生型の５０〜１００重量％、＋：５〜５０重量％、 −：＜５重量％ b＋＋：重量に匹敵する、＋：３０〜６０重量％、 ±：５〜２０重量％、−：検出し得るリン酸化なし、 ｎｄ：実施せず c？：免疫蛍光沈降によって検出されず、ｎｄ：実施せず d＋＋：高度にトランス優性、＋：中等度にトランス優性 −：検出し得るトランス優性なし
【０１４３】第１表にまとめた分析で、リン酸化の減少
を生じる４種のミスセンス変異体を確認した。これらの
うち、Ｍ２およびＭ１２はリン酸取り込みに対して中等
度の効果を示すが（それぞれ−３０％および−６０％の
抑制）、Ｍ５およびＭ６はリン酸取り込み水準が劇的に
低下した。ｒｅｖのリン酸化に対するＭ５およびＭ６変
異体の劇的な効果（これらはどのセリン残基にも影響し
ない）に関して考え得る理由を、以下さらに詳細に考察
する。
を生じる４種のミスセンス変異体を確認した。これらの
うち、Ｍ２およびＭ１２はリン酸取り込みに対して中等
度の効果を示すが（それぞれ−３０％および−６０％の
抑制）、Ｍ５およびＭ６はリン酸取り込み水準が劇的に
低下した。ｒｅｖのリン酸化に対するＭ５およびＭ６変
異体の劇的な効果（これらはどのセリン残基にも影響し
ない）に関して考え得る理由を、以下さらに詳細に考察
する。
【０１４４】Ｒｅｖにおけるリン酸受容体セリン残基の
位置をさらによくつきとめるため、欠失変異体（ｐΔ）
のリン酸化水準の研究を実施した（第８Ｃ図、レーン１
５〜２０）。この分析の結果、ｐΔ１３/１４変異体は
正常にリン酸化されるが、ｐΔ１２/１４欠失およびそ
れより一層大きいＣ-末端の欠失は、低水準のリン酸化
しか示さない（−９０％抑制）。同様にｐΔ１/２ Ｒｅ
ｖ変異体も［35Ｓ］-システインでは効果的に標識され
得るが、［32Ｐ］-Ｐｉの取り込みは低水準を示す（−
９０％抑制）。
位置をさらによくつきとめるため、欠失変異体（ｐΔ）
のリン酸化水準の研究を実施した（第８Ｃ図、レーン１
５〜２０）。この分析の結果、ｐΔ１３/１４変異体は
正常にリン酸化されるが、ｐΔ１２/１４欠失およびそ
れより一層大きいＣ-末端の欠失は、低水準のリン酸化
しか示さない（−９０％抑制）。同様にｐΔ１/２ Ｒｅ
ｖ変異体も［35Ｓ］-システインでは効果的に標識され
得るが、［32Ｐ］-Ｐｉの取り込みは低水準を示す（−
９０％抑制）。
【０１４５】Ｍ２およびＭ１２変異体の部位へ広がる欠
失が、何故、ミスセンス変異体そのものより、リン酸化
水準に一層激しい効果を示すのかは明らかでない。然し
これらの結果は、Ｒｅｖタンパク質がセリンリン酸化の
２ケ所の１次部位を含んでおり、その１つは残基８（Ｍ
２）にあり、第２は残基９９（Ｍ１２）にあるという仮
説と一致している。何れにしても、これらの残基を欠い
ている変異体（即ち、ｐＭ２、ｐΔ１/２、ｐＭ１２、
ｐΔ１２/１４）は、ほぼ野生型Ｒｅｖの活性水準を示
す（第８Ｂ図、第９図）。したがってＲｅｖのリン酸化
は、トランスフェクトされた細胞におけるＨＩＶ-１調
節タンパク質のトランス-活性化機能に不可欠なもので
はないと結論される。
失が、何故、ミスセンス変異体そのものより、リン酸化
水準に一層激しい効果を示すのかは明らかでない。然し
これらの結果は、Ｒｅｖタンパク質がセリンリン酸化の
２ケ所の１次部位を含んでおり、その１つは残基８（Ｍ
２）にあり、第２は残基９９（Ｍ１２）にあるという仮
説と一致している。何れにしても、これらの残基を欠い
ている変異体（即ち、ｐＭ２、ｐΔ１/２、ｐＭ１２、
ｐΔ１２/１４）は、ほぼ野生型Ｒｅｖの活性水準を示
す（第８Ｂ図、第９図）。したがってＲｅｖのリン酸化
は、トランスフェクトされた細胞におけるＨＩＶ-１調
節タンパク質のトランス-活性化機能に不可欠なもので
はないと結論される。
【０１４６】［実施例８］ Ｒｅｖの核局在化 Ｒｅｖタンパク質が、発現細胞の核、特に核小体へ顕著
に局在化されることは、間接免疫蛍光法を用いた変異体
分析によって確認された。固定されたトランスフェクト
ＣＯＳ細胞培養から得られた位相差写真およびそれに対
応する免疫蛍光写真を第１０図に示す。トランスフェク
トされたＣＯＳ細胞内のＲｅｖタンパク質を局在化する
のに使用した間接免疫蛍光法の手技は、カレンの報告
（Ｂ.Ｒ.カレン、メソッズ・イン・エンジモロジー、１
５２巻、［１９８７年］、６８４頁、およびＢ.Ｒ.カレ
ン、ジャーナル・オブ・ビロロジー、６２巻、［１９８
８年］、２４９８頁）にしたがい、ただし修飾したパラ
ホルムアルデヒド法に基づく細胞固定法を使用して行っ
た（ルーベンら、ジャーナル・オブ・ビロロジー、５３
巻、［１９８９年］、１〜８頁）。具体的には、細胞を
家兎ポリクローナル抗Ｒｅｖペプチド抗血清で処理し、
ついでローダミン結合ヤギ抗家兎ＩｇＧで処理した。
に局在化されることは、間接免疫蛍光法を用いた変異体
分析によって確認された。固定されたトランスフェクト
ＣＯＳ細胞培養から得られた位相差写真およびそれに対
応する免疫蛍光写真を第１０図に示す。トランスフェク
トされたＣＯＳ細胞内のＲｅｖタンパク質を局在化する
のに使用した間接免疫蛍光法の手技は、カレンの報告
（Ｂ.Ｒ.カレン、メソッズ・イン・エンジモロジー、１
５２巻、［１９８７年］、６８４頁、およびＢ.Ｒ.カレ
ン、ジャーナル・オブ・ビロロジー、６２巻、［１９８
８年］、２４９８頁）にしたがい、ただし修飾したパラ
ホルムアルデヒド法に基づく細胞固定法を使用して行っ
た（ルーベンら、ジャーナル・オブ・ビロロジー、５３
巻、［１９８９年］、１〜８頁）。具体的には、細胞を
家兎ポリクローナル抗Ｒｅｖペプチド抗血清で処理し、
ついでローダミン結合ヤギ抗家兎ＩｇＧで処理した。
【０１４７】第１の家兎抗Ｒｅｖ抗体は１：８００倍希
釈で使用した。ｐＭ１、ｐＭ２、ｐＭ３、ｐΔ１/２、
ｐΔ１/３ベクターでトランスフェクトした培養を除い
て、Ｒｅｖ突然変異体の大半の分析にはＲＥＶ１/２０
抗体を使用した。上記の例外の変異体にはＲＥＶ２７/
５１抗体を使用した。第２抗体であるローダミン結合ヤ
ギ抗家兎ＩｇＧ（ベーリンガー・マンハイム・バイオケ
ミカルズ、インジアナポリス、ＩＮ、米国）は１：５０
倍希釈で使用した。図に示したように、Ｒｅｖ突然変異
体は４つの型に分けられる亜細胞性局在化を示した。即
ち、Ｎ：細胞質発現が検出不可能な核／核小体局在化、
Ｎ＞Ｃ：僅かな細胞質発現、Ｎ≧Ｃ：若干の核濃縮を伴
った明白な細胞質発現、Ｃ＞Ｎ：細胞内の無秩序な分
布、からなる４種類の型である。これらの分布の代表的
な例を図に示した。図でＲｅｖタンパク質は下段の図の
右上隅に表示した。この検定によって検出された各Ｒｅ
ｖタンパク質の局在化を第１表に示す。
釈で使用した。ｐＭ１、ｐＭ２、ｐＭ３、ｐΔ１/２、
ｐΔ１/３ベクターでトランスフェクトした培養を除い
て、Ｒｅｖ突然変異体の大半の分析にはＲＥＶ１/２０
抗体を使用した。上記の例外の変異体にはＲＥＶ２７/
５１抗体を使用した。第２抗体であるローダミン結合ヤ
ギ抗家兎ＩｇＧ（ベーリンガー・マンハイム・バイオケ
ミカルズ、インジアナポリス、ＩＮ、米国）は１：５０
倍希釈で使用した。図に示したように、Ｒｅｖ突然変異
体は４つの型に分けられる亜細胞性局在化を示した。即
ち、Ｎ：細胞質発現が検出不可能な核／核小体局在化、
Ｎ＞Ｃ：僅かな細胞質発現、Ｎ≧Ｃ：若干の核濃縮を伴
った明白な細胞質発現、Ｃ＞Ｎ：細胞内の無秩序な分
布、からなる４種類の型である。これらの分布の代表的
な例を図に示した。図でＲｅｖタンパク質は下段の図の
右上隅に表示した。この検定によって検出された各Ｒｅ
ｖタンパク質の局在化を第１表に示す。
【０１４８】図に示したように、変異体の大半は、トラ
ンス-活性化陰性のクローンｐＭ１０（第１０Ｄ図）を
含め、完全に野生型の亜細胞性局在化（Ｎ）を示した。
然しながら数種の変異体では、ｐＭ４（第１０Ｆ図）に
よって代表されるように、極めて微弱ながら検出可能な
水準の細胞質蛍光を生じた。この表現型は、活性変異体
（ｐＭ３、ｐＭ８）でも不活性変異体（ｐＭ４ｐＭ７）
でも、ともにこの特性を示すので、生物学的活性と明ら
かに相関しなかった。しかもかなり幅広い範囲の１欠失
変異体（ｐΔ１/３）が、野生型パターンとＲｅｖの塩
基性ドメインで突然変異によって誘導されたパターン
（Ｎ≧Ｃ、第１０Ｈ図）との中間型の亜細胞性局在化を
示している。然しこの欠失は、塩基性ドメインに近接し
た位置ではない。この異常な局在化の理由は明らかでは
ないが、ｐΔ１/３で認められた生物学的活性の欠如と
よく相関している。
ンス-活性化陰性のクローンｐＭ１０（第１０Ｄ図）を
含め、完全に野生型の亜細胞性局在化（Ｎ）を示した。
然しながら数種の変異体では、ｐＭ４（第１０Ｆ図）に
よって代表されるように、極めて微弱ながら検出可能な
水準の細胞質蛍光を生じた。この表現型は、活性変異体
（ｐＭ３、ｐＭ８）でも不活性変異体（ｐＭ４ｐＭ７）
でも、ともにこの特性を示すので、生物学的活性と明ら
かに相関しなかった。しかもかなり幅広い範囲の１欠失
変異体（ｐΔ１/３）が、野生型パターンとＲｅｖの塩
基性ドメインで突然変異によって誘導されたパターン
（Ｎ≧Ｃ、第１０Ｈ図）との中間型の亜細胞性局在化を
示している。然しこの欠失は、塩基性ドメインに近接し
た位置ではない。この異常な局在化の理由は明らかでは
ないが、ｐΔ１/３で認められた生物学的活性の欠如と
よく相関している。
【０１４９】既知の核局在化シグナルと相同性を示すＲ
ｅｖのアルギニン・リッチな突然変異（ｐＭ５、ｐＭ
６）は、細胞質Ｒｅｖタンパク質を高水準で生じる（Ｃ
＞Ｎ）。ただしこれらのタンパク質は、細胞核から排除
されたものではなく（第１０Ｊ図）、実際はＲｅｖの塩
基性ドメインが核局在化のシグナルであることを示唆し
ている。ｐＭ５およびｐＭ６が、リン酸化受容体として
先に提案した部位を保有しているにもかかわらず、生体
内で必ずしも有意にリン酸化されないことを思い起こせ
ば興味深い。これはＲｅｖのリン酸化に関与しているキ
ナーゼが細胞核に限定されているためかも知れない。し
たがってｐＭ５およびｐＭ６Ｒｅｖ変異体の不適当な亜
細胞性局在化は、その低いリン酸化水準に起因している
可能性も考えられる。
ｅｖのアルギニン・リッチな突然変異（ｐＭ５、ｐＭ
６）は、細胞質Ｒｅｖタンパク質を高水準で生じる（Ｃ
＞Ｎ）。ただしこれらのタンパク質は、細胞核から排除
されたものではなく（第１０Ｊ図）、実際はＲｅｖの塩
基性ドメインが核局在化のシグナルであることを示唆し
ている。ｐＭ５およびｐＭ６が、リン酸化受容体として
先に提案した部位を保有しているにもかかわらず、生体
内で必ずしも有意にリン酸化されないことを思い起こせ
ば興味深い。これはＲｅｖのリン酸化に関与しているキ
ナーゼが細胞核に限定されているためかも知れない。し
たがってｐＭ５およびｐＭ６Ｒｅｖ変異体の不適当な亜
細胞性局在化は、その低いリン酸化水準に起因している
可能性も考えられる。
【０１５０】［実施例９］ Ｒｅｖ機能のトランス優性な抑制 トランス-活性化ＨＩＶ-１構造遺伝子発現能を喪失した
Ｒｅｖ突然変異体について、野生型Ｒｅｖタンパク質の
機能をトランスで抑制するその抑制能を検討した。ＣＯ
Ｓ細胞（３５ｍｍ）を、組立て体指示薬ｐｇＴＡＴ２５
０ｎｇと、ｐＢＣ１２/ＣＭＶ２９０ｎｇ（陰性対照）
（第１１Ａ図、レーン１）；ｐｃＲＥＶ４０ｎｇ（低水
準）、ｐＢＣ１２/ＣＭＶ２５０ｎｇ（レーン２）；ｐ
ｃＲＥＶ２９０ｎｇ（高水準）（レーン３）；ｐｃＲＥ
Ｖ４０ｎｇ、ｐＭ４２５０ｎｇ（レーン４）；ｐｃＲＥ
Ｖ４０ｎｇ、ｐＭ７２５０ｎｇ（レーン５）；ｐｃＲＥ
Ｖ４０ｎｇ、ｐＭ１０２５０ｎｇ（レーン６）で同時ト
ランスフェクトした。６０時間トランスフェクション
後、培養を［35Ｓ］-システインで標識し、家兎抗Ｔａ
ｔ抗血清を使用する免疫沈降分析に掛けた。
Ｒｅｖ突然変異体について、野生型Ｒｅｖタンパク質の
機能をトランスで抑制するその抑制能を検討した。ＣＯ
Ｓ細胞（３５ｍｍ）を、組立て体指示薬ｐｇＴＡＴ２５
０ｎｇと、ｐＢＣ１２/ＣＭＶ２９０ｎｇ（陰性対照）
（第１１Ａ図、レーン１）；ｐｃＲＥＶ４０ｎｇ（低水
準）、ｐＢＣ１２/ＣＭＶ２５０ｎｇ（レーン２）；ｐ
ｃＲＥＶ２９０ｎｇ（高水準）（レーン３）；ｐｃＲＥ
Ｖ４０ｎｇ、ｐＭ４２５０ｎｇ（レーン４）；ｐｃＲＥ
Ｖ４０ｎｇ、ｐＭ７２５０ｎｇ（レーン５）；ｐｃＲＥ
Ｖ４０ｎｇ、ｐＭ１０２５０ｎｇ（レーン６）で同時ト
ランスフェクトした。６０時間トランスフェクション
後、培養を［35Ｓ］-システインで標識し、家兎抗Ｔａ
ｔ抗血清を使用する免疫沈降分析に掛けた。
【０１５１】第１１Ａ図に示したように、ｐＭ４（レー
ン４）およびｐＭ７（レーン５）では、７２ａａＴａｔ
の発現誘導によって測定した野生型Ｒｅｖタンパク質活
性に対して殆ど効果を示さなかったが、ｐＭ１０（レー
ン６）ではＲｅｖ機能を完全に抑制するようであった。
この成績は、ｐＭ１０がＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝子機能の
特異的な抑制因子を暗号化していることを示唆する。
ン４）およびｐＭ７（レーン５）では、７２ａａＴａｔ
の発現誘導によって測定した野生型Ｒｅｖタンパク質活
性に対して殆ど効果を示さなかったが、ｐＭ１０（レー
ン６）ではＲｅｖ機能を完全に抑制するようであった。
この成績は、ｐＭ１０がＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝子機能の
特異的な抑制因子を暗号化していることを示唆する。
【０１５２】ｐＭ１０が、実際にスプライスされていな
いＨＩＶ-１ｍＲＮＡ（ｔａｔの７２ａａ形を暗号化し
ている）の細胞質発現を特異的に防止することによって
作用するということを証明するため、マリムら［（１９
８８年）、前掲］のＳ１ヌクレアーゼ防御検定法を使用
した。この検定法（第１１Ｂ図）は、ｐＢＣ１２/ＣＭ
Ｖ２.７５μｇ＋ｐｃＲＥＶ２.５μｇ（レーン１）；ｐ
ｇＴＡＴ２.５μｇ＋ｐＢＣ１２/ＣＭＶ２.７５μｇ
（レーン２）；ｐｇＴＡＴ２.５μｇ＋ｐｃＲＥＶ０.２
５μｇ＋ｐＢＣ１２/ＣＭＶ２.５μｇ（レーン３）；ｐ
ｇＴＡＴ ２.５μｇ＋ｐｃＲＥＶ２.７５μｇ（レーン
４）；ｐｇＴＡＴ２.５μｇ＋ｐｃＲＥＶ０.２５μｇ＋
ｐＭ１０２.５μｇ（レーン５）；ｐｇＴＡＴ２.５μｇ
＋ｐｃＲＥＶ０.２５μｇ＋ｐΔ１０/１４２.５μｇ
（レーン６）でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞（１
００ｍｍ）の細胞質において発現されるスプライスされ
た（Ｓ）およびスプライスされない（Ｕ）ｔａｔｍＲＮ
Ａ濃度を定量する。添加したＤＮＡ合計は、陰性対照と
した親発現ベクターｐＢＣ１２/ＣＭＶを含めて、合計
５.２５μｇに保った。
いＨＩＶ-１ｍＲＮＡ（ｔａｔの７２ａａ形を暗号化し
ている）の細胞質発現を特異的に防止することによって
作用するということを証明するため、マリムら［（１９
８８年）、前掲］のＳ１ヌクレアーゼ防御検定法を使用
した。この検定法（第１１Ｂ図）は、ｐＢＣ１２/ＣＭ
Ｖ２.７５μｇ＋ｐｃＲＥＶ２.５μｇ（レーン１）；ｐ
ｇＴＡＴ２.５μｇ＋ｐＢＣ１２/ＣＭＶ２.７５μｇ
（レーン２）；ｐｇＴＡＴ２.５μｇ＋ｐｃＲＥＶ０.２
５μｇ＋ｐＢＣ１２/ＣＭＶ２.５μｇ（レーン３）；ｐ
ｇＴＡＴ ２.５μｇ＋ｐｃＲＥＶ２.７５μｇ（レーン
４）；ｐｇＴＡＴ２.５μｇ＋ｐｃＲＥＶ０.２５μｇ＋
ｐＭ１０２.５μｇ（レーン５）；ｐｇＴＡＴ２.５μｇ
＋ｐｃＲＥＶ０.２５μｇ＋ｐΔ１０/１４２.５μｇ
（レーン６）でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞（１
００ｍｍ）の細胞質において発現されるスプライスされ
た（Ｓ）およびスプライスされない（Ｕ）ｔａｔｍＲＮ
Ａ濃度を定量する。添加したＤＮＡ合計は、陰性対照と
した親発現ベクターｐＢＣ１２/ＣＭＶを含めて、合計
５.２５μｇに保った。
【０１５３】６０時間トランスフェクション後、細胞質
ＲＮＡを分析用に回収し、５μｇアリコートをＳ１ヌク
レアーゼ防御検定に使用した。使用したＤＮＡプローブ
は、ｔａｔの第１の暗号エキソン内にあるＸｈｏII部位
で、クレノーＤＮＡポリメラーゼを使用して末端標識し
た７９８塩基対のプローブである（マリムら、［１９８
８年］、前掲）。トランスフェクトしたＣＯＳ培養で、
スプライスされない（Ｕ）およびスプライスされた
（Ｓ）細胞質ｔａｔｍＲＮＡ濃度をともに定量し得るよ
う、プローブ（Ｉ）を設計した。このプローブを使用し
て、スプライスされた（Ｓ）ｔａｔｍＲＮＡは２０２ｎ
ｔプローブ断片を救援すると予想し、スプライスされな
い(Ｕ)ｔａｔｍＲＮＡは５０６ｎｔ断片を救援すると予
想した。スプライスされないＲＮＡの相対濃度を、各レ
ーン毎にＬＫＢソフトレーザースキャナーを使用するデ
ンシトメトリーによって定量した。これを可視化して、
第１１Ｂ図に示した結果から、レーン２では１４％がス
プライスされず、レーン３では６３％がスプライスされ
ず、レーン４では８２％がスプライスされず、レーン５
では２２％がスプライスされず、レーン６では２４％が
スプライスされなかった。
ＲＮＡを分析用に回収し、５μｇアリコートをＳ１ヌク
レアーゼ防御検定に使用した。使用したＤＮＡプローブ
は、ｔａｔの第１の暗号エキソン内にあるＸｈｏII部位
で、クレノーＤＮＡポリメラーゼを使用して末端標識し
た７９８塩基対のプローブである（マリムら、［１９８
８年］、前掲）。トランスフェクトしたＣＯＳ培養で、
スプライスされない（Ｕ）およびスプライスされた
（Ｓ）細胞質ｔａｔｍＲＮＡ濃度をともに定量し得るよ
う、プローブ（Ｉ）を設計した。このプローブを使用し
て、スプライスされた（Ｓ）ｔａｔｍＲＮＡは２０２ｎ
ｔプローブ断片を救援すると予想し、スプライスされな
い(Ｕ)ｔａｔｍＲＮＡは５０６ｎｔ断片を救援すると予
想した。スプライスされないＲＮＡの相対濃度を、各レ
ーン毎にＬＫＢソフトレーザースキャナーを使用するデ
ンシトメトリーによって定量した。これを可視化して、
第１１Ｂ図に示した結果から、レーン２では１４％がス
プライスされず、レーン３では６３％がスプライスされ
ず、レーン４では８２％がスプライスされず、レーン５
では２２％がスプライスされず、レーン６では２４％が
スプライスされなかった。
【０１５４】予想されたように、スプライスされたｔａ
ｔｍＲＮＡは、ｐｇＴＡＴ単独でトランスフェクトした
細胞の細胞質で顕著であったが（第１１Ｂ図、レーン
２）、スプライスされないｔａｔｍＲＮＡは、ＨＩＶ-
１ Ｒｅｖタンパク質を同時発現した細胞の細胞質で優
性な細胞質種であった（第１１Ｂ図、レーン３および
４）。然しｐｇＴＡＴをｐｃＲＥＶおよびｐＭ１０の双
方と同時発現させると、ｔａｔｍＲＮＡのスプライスさ
れた形の細胞質優位性を回復している（第１１Ｂ図、レ
ーン５）。
ｔｍＲＮＡは、ｐｇＴＡＴ単独でトランスフェクトした
細胞の細胞質で顕著であったが（第１１Ｂ図、レーン
２）、スプライスされないｔａｔｍＲＮＡは、ＨＩＶ-
１ Ｒｅｖタンパク質を同時発現した細胞の細胞質で優
性な細胞質種であった（第１１Ｂ図、レーン３および
４）。然しｐｇＴＡＴをｐｃＲＥＶおよびｐＭ１０の双
方と同時発現させると、ｔａｔｍＲＮＡのスプライスさ
れた形の細胞質優位性を回復している（第１１Ｂ図、レ
ーン５）。
【０１５５】レーン５および６で負荷したＲＮＡの合計
量は若干低いようであるが、それにもかかわらずｐＭ１
０（レーン５）がｐｇＴＡＴベクターからのＲｅｖ誘導
のスプライスされないｔａｔｍＲＮＡの細胞質発現を選
択的に抑制できることは明らかである。事実、ｐｃＲＥ
ＶおよびｐＭ１０の双方の存在で検出したスプライスさ
れないｔａｔｍＲＮＡの相対濃度は、Ｒｅｖの存在なし
で観察した濃度に匹敵する。これと同じパターンがｐΔ
１０/１４でも明らかである（第１１Ｂ図、レーン
６）。これらの結果は、さらに３’からＭ１０突然変異
へまたがるＲｅｖ遺伝子の欠失（ｐΔ１０/１４）もＲ
ｅｖ機能のトランス-抑制因子を暗号化していることを
示している。Ｍ１０突然変異の部位から広がるｐΔ９/
１４と呼ばれる一層幅広い欠失も優性な負の表現型を示
す（第１表）。然しＭ８突然変異の部位へ広がる欠失は
もはやトランス優性ではなかった（成績は示さず）。
量は若干低いようであるが、それにもかかわらずｐＭ１
０（レーン５）がｐｇＴＡＴベクターからのＲｅｖ誘導
のスプライスされないｔａｔｍＲＮＡの細胞質発現を選
択的に抑制できることは明らかである。事実、ｐｃＲＥ
ＶおよびｐＭ１０の双方の存在で検出したスプライスさ
れないｔａｔｍＲＮＡの相対濃度は、Ｒｅｖの存在なし
で観察した濃度に匹敵する。これと同じパターンがｐΔ
１０/１４でも明らかである（第１１Ｂ図、レーン
６）。これらの結果は、さらに３’からＭ１０突然変異
へまたがるＲｅｖ遺伝子の欠失（ｐΔ１０/１４）もＲ
ｅｖ機能のトランス-抑制因子を暗号化していることを
示している。Ｍ１０突然変異の部位から広がるｐΔ９/
１４と呼ばれる一層幅広い欠失も優性な負の表現型を示
す（第１表）。然しＭ８突然変異の部位へ広がる欠失は
もはやトランス優性ではなかった（成績は示さず）。
【０１５６】［実施例１０］ｐＭ１０Ｒｅｖ変異体はｒ
ｅｖ機能の競合的抑制因子である 第１１Ａおよび１１Ｂ図に示した実験結果から、ｐＭ１
０はトランスで存在すると、野生型Ｒｅｖ機能を抑制で
きることが判る。然しこれらの実験はｐＭ１０の大過剰
の存在で実施された。Ｒｅｖ機能のトランス-抑制の効
果を一層正確に定量化するため、ｐｃＲＥＶの単一濃度
によるｐＨＩＶ-１Δｒｅｖプロウイルス突然変異体の
救援を抑制するｐＭ１０の濃度増大による抑制能を分析
した。またこの実験では、ｐＭ４およびｐΔ１０/１４
Ｒｅｖ変異体の濃度を増大する効果、および野生型Ｒｅ
ｖそのものの発現水準を単に増大する効果を試験した。
ｅｖ機能の競合的抑制因子である 第１１Ａおよび１１Ｂ図に示した実験結果から、ｐＭ１
０はトランスで存在すると、野生型Ｒｅｖ機能を抑制で
きることが判る。然しこれらの実験はｐＭ１０の大過剰
の存在で実施された。Ｒｅｖ機能のトランス-抑制の効
果を一層正確に定量化するため、ｐｃＲＥＶの単一濃度
によるｐＨＩＶ-１Δｒｅｖプロウイルス突然変異体の
救援を抑制するｐＭ１０の濃度増大による抑制能を分析
した。またこの実験では、ｐＭ４およびｐΔ１０/１４
Ｒｅｖ変異体の濃度を増大する効果、および野生型Ｒｅ
ｖそのものの発現水準を単に増大する効果を試験した。
【０１５７】第１２図に示したように、ＣＯＳ細胞培養
（３５ｍｍ）を、ｐＨＩＶ-１Δｒｅｖ２５ｎｇおよび
ｐｃＲＥＶ５０ｎｇで同時トランスフェクトし、ｐｃＲ
ＥＶ（▼）、ｐＭ４（△）、ｐΔ１０/１４（○）、ま
たはｐＭ１０（■）の倍数モルの過剰を増大した（即
ち、１０倍とは示したプラスミド組立て体５００ｎｇの
同時トランスフェクションを表す）。ＤＮＡの添加量合
計は、陰性対照とした親発現ベクターｐＢＣ１２/ＣＭ
Ｖを含めて合計５８７.５ｎｇに保った。ＳＥＡＰ遺伝
子発現ベクターを内部対照として同時トランスフェクト
した（１培養当たり１２.５ｎｇ）。６５時間目に上清
培地を採取し、上清のｐ２４Ｇａｇ発現水準を測定する
ことによって検定した。
（３５ｍｍ）を、ｐＨＩＶ-１Δｒｅｖ２５ｎｇおよび
ｐｃＲＥＶ５０ｎｇで同時トランスフェクトし、ｐｃＲ
ＥＶ（▼）、ｐＭ４（△）、ｐΔ１０/１４（○）、ま
たはｐＭ１０（■）の倍数モルの過剰を増大した（即
ち、１０倍とは示したプラスミド組立て体５００ｎｇの
同時トランスフェクションを表す）。ＤＮＡの添加量合
計は、陰性対照とした親発現ベクターｐＢＣ１２/ＣＭ
Ｖを含めて合計５８７.５ｎｇに保った。ＳＥＡＰ遺伝
子発現ベクターを内部対照として同時トランスフェクト
した（１培養当たり１２.５ｎｇ）。６５時間目に上清
培地を採取し、上清のｐ２４Ｇａｇ発現水準を測定する
ことによって検定した。
【０１５８】この検定の結果を、競合するｒｅｖベクタ
ーが全く存在しない場合に得られたｐ２４の発現水準
（水準を１.００と規定）と比較して第１２図に示す。
すべての値はｐＨＩＶ-１Δｒｅｖ２５ｎｇ、ｐｃＲＥ
Ｖ５０ｎｇ、ｐＢＣ１２/ＲＳＶ/ＳＥＡＰ１２.５ｎｇ
およびｐＢＣ１２/ＣＭＶ５００ｎｇでトランスフェク
トした培養で観察されたｐ２４Ｇａｇの発現水準との相
対値で表す。この対照培養（●）は、添加したＲｅｖ変
異体の競合的効果の測定に対する基準値となるが、ｐ２
４Ｇａｇ発現を１.００単位水準と便宜的に規定した。
ここに提示した値を上清ＳＥＡＰ濃度で観察された僅か
な変動について補正する（平均ＳＥＡＰ活性は１.００
±０.２７(範囲１.２８〜０.７２)）。
ーが全く存在しない場合に得られたｐ２４の発現水準
（水準を１.００と規定）と比較して第１２図に示す。
すべての値はｐＨＩＶ-１Δｒｅｖ２５ｎｇ、ｐｃＲＥ
Ｖ５０ｎｇ、ｐＢＣ１２/ＲＳＶ/ＳＥＡＰ１２.５ｎｇ
およびｐＢＣ１２/ＣＭＶ５００ｎｇでトランスフェク
トした培養で観察されたｐ２４Ｇａｇの発現水準との相
対値で表す。この対照培養（●）は、添加したＲｅｖ変
異体の競合的効果の測定に対する基準値となるが、ｐ２
４Ｇａｇ発現を１.００単位水準と便宜的に規定した。
ここに提示した値を上清ＳＥＡＰ濃度で観察された僅か
な変動について補正する（平均ＳＥＡＰ活性は１.００
±０.２７(範囲１.２８〜０.７２)）。
【０１５９】図に示したように、野生型ｒｅｖ発現ベク
ターｐｃＲＥＶのトランスフェクション水準が増大する
と、ウイルス複製に対して緩和なプラスの効果が働き、
培地へのｐ２４Ｇａｇの放出に最高で−７０％の増大を
もたらすことが判明した。これに反してｐＭ１０ベクタ
ーを同時トランスフェクトすると、ＨＩＶ-１構造遺伝
子の発現に劇的な抑制効果を示した。得られた抑制パタ
ーンは、生物学的標的に対して野生型Ｒｅｖと同一の親
和性を示すＲｅｖ機能に対する競合的な抑制因子として
期待させるものである。即ち、等モル量のｐＭ１０では
ｐ２４Ｇａｇの発現を−２倍数減少し、２倍過剰のｐＭ
１０では発現を−３倍数減少し、５倍過剰では−６倍数
減少したが、１０倍過剰ではｐ２４Ｇａｇ発現を−９３
％減少した。
ターｐｃＲＥＶのトランスフェクション水準が増大する
と、ウイルス複製に対して緩和なプラスの効果が働き、
培地へのｐ２４Ｇａｇの放出に最高で−７０％の増大を
もたらすことが判明した。これに反してｐＭ１０ベクタ
ーを同時トランスフェクトすると、ＨＩＶ-１構造遺伝
子の発現に劇的な抑制効果を示した。得られた抑制パタ
ーンは、生物学的標的に対して野生型Ｒｅｖと同一の親
和性を示すＲｅｖ機能に対する競合的な抑制因子として
期待させるものである。即ち、等モル量のｐＭ１０では
ｐ２４Ｇａｇの発現を−２倍数減少し、２倍過剰のｐＭ
１０では発現を−３倍数減少し、５倍過剰では−６倍数
減少したが、１０倍過剰ではｐ２４Ｇａｇ発現を−９３
％減少した。
【０１６０】ｐＭ１０以外にも、ｐΔ１０/１４の同時
トランスフェクションでｐ２４Ｇａｇの発現を減少する
が、Ｒｅｖのこの大きな欠失変異体はｐＭ１０ほど有効
な抑制因子ではなかった。ｐΔ１０/１４によって発現
される厳しく先端を切り取ったタンパク質は、生物学的
標的へのＲｅｖの結合を促進する配列を欠いているた
め、効果が低い競合因子である。最後にｐＭ４の同時ト
ランスフェクションも僅かであるが同様に抑制効果を示
す（最高用量を使用しても２倍以下(３２％)）。この効
果は、ＲＲＥ結合と無関係な活性（鎮圧）から生じるよ
うに考えられる。
トランスフェクションでｐ２４Ｇａｇの発現を減少する
が、Ｒｅｖのこの大きな欠失変異体はｐＭ１０ほど有効
な抑制因子ではなかった。ｐΔ１０/１４によって発現
される厳しく先端を切り取ったタンパク質は、生物学的
標的へのＲｅｖの結合を促進する配列を欠いているた
め、効果が低い競合因子である。最後にｐＭ４の同時ト
ランスフェクションも僅かであるが同様に抑制効果を示
す（最高用量を使用しても２倍以下(３２％)）。この効
果は、ＲＲＥ結合と無関係な活性（鎮圧）から生じるよ
うに考えられる。
【０１６１】［実施例１１］ ＨＩＶ-１ Ｒｅｖトランス-活性化因子のドメイン構造 上述のように、トランスフェクトした細胞における一過
性の遺伝子発現分析を用いて、ＨＩＶ-１のトランス-作
用性遺伝子生産物Ｒｅｖの一連のミスセンスおよび欠失
変異体の生物学的活性を調べた。これらの結果は、第１
２Ａ図（図でＳはスプライス部位を構成する）に模式的
に示したように、Ｒｅｖ内に２つの機能的ドメインが存
在する可能性を明らかに示している。しかもこれらの２
つのドメインはトランス-活性化に不可欠であり得る
（ハッチング部分）。
性の遺伝子発現分析を用いて、ＨＩＶ-１のトランス-作
用性遺伝子生産物Ｒｅｖの一連のミスセンスおよび欠失
変異体の生物学的活性を調べた。これらの結果は、第１
２Ａ図（図でＳはスプライス部位を構成する）に模式的
に示したように、Ｒｅｖ内に２つの機能的ドメインが存
在する可能性を明らかに示している。しかもこれらの２
つのドメインはトランス-活性化に不可欠であり得る
（ハッチング部分）。
【０１６２】これらのドメインのうち、４種のミスセン
ス変異体、ｐＭ４、ｐＭ５、ｐＭ６およびｐＭ７で限定
されている第１ドメイン（ＲＮＡ結合ドメイン）は、野
生型Ｒｅｖのおよそのアミノ酸位置１０〜およそのアミ
ノ酸位置６８の間の約３５アミノ酸領域にまたがってお
り、Ｒｅｖの核局在化に不可欠である高塩基性配列要素
を含んでいる。このドメインはまた、核局在化（ＮＬ）
シグナルを含んでいる（黒枠）。このドメイン内で変化
した突然変異体は劣性の負の表現型を示す。
ス変異体、ｐＭ４、ｐＭ５、ｐＭ６およびｐＭ７で限定
されている第１ドメイン（ＲＮＡ結合ドメイン）は、野
生型Ｒｅｖのおよそのアミノ酸位置１０〜およそのアミ
ノ酸位置６８の間の約３５アミノ酸領域にまたがってお
り、Ｒｅｖの核局在化に不可欠である高塩基性配列要素
を含んでいる。このドメインはまた、核局在化（ＮＬ）
シグナルを含んでいる（黒枠）。このドメイン内で変化
した突然変異体は劣性の負の表現型を示す。
【０１６３】これに対して第２ドメイン（活性化ドメイ
ン）内の突然変異は、ほぼアミノ酸残基７９を中心にし
て、一般にミスセンス変異体ｐＭ１０および欠失変異体
ｐΔ９/１４およびｐΔ１０/１４によって限定されてお
り、Ｒｅｖ機能の喪失を生じるが、注目すべきことは、
これらの変異体によって示される負の表現型はトランス
優性なことである。Ｒｅｖの２つの領域（第１２Ａ図、
ハッチング部分）はタンパク質機能にとってさほど必要
ではないようである。図で示したように、Ｒｅｖ活性化
ドメインの突然変異はＲｅｖを欠損させ、野生型Ｒｅｖ
機能を競合的に抑制するタンパク質の生産を生じる。こ
のトランス抑制は、トランスフェクトした細胞内でのＨ
ＩＶ-１複製を著しく減少または抑制するのに十分であ
る。ｐＭ１０および関連する欠失変異体によって示され
る優性な負の表現型に関する分子的原理はまだ判ってい
ない。然しミスセンス（Ｍ１０）および欠失（Δ９/１
４、Δ１０/１４）変異体が、何れもＲｅｖ機能をトラ
ンスで抑制できる観察結果から、属性の獲得より、むし
ろその喪失が関与していることが示唆される。一つの可
能性は、欠損型Ｒｅｖタンパク質分子が野生型Ｒｅｖタ
ンパク質のサブユニットと混合多量体を作ることがで
き、そのため野生型タンパク質の機能をトランス優性な
態様で抑制するのかも知れない。然しながら生体内でＲ
ｅｖ機能が単量体であるのか、多量体であるのかは現在
のところ判っていない。多数の原核性および真核性転写
因子の詳細な機能分析を含む以前の研究に基づいた別の
仮説では、転写トランス-活性化因子が、タンパク質を
その好適な標的物質へ向かわせる特異的な「結合ドメイ
ン」と、結合反応の機能的結果を発揮させる「活性化ド
メイン」（この場合は転写活性化）の２つの異なった機
能的ドメインを保有しているというものである。幾つか
の系で、結合ドメインが配列特異的なＤＮＡ結合要素か
らなることが判明した。然し少なくとも１つの例では、
単純ヘルペス１型ウイルス（ＨＳＶ-１）トランス-活性
化因子ＶＰ１６の場合、結合ドメインは細胞性転写因子
との特異的な相互作用を仲介する代わりに、ＨＳＶ-１
ゲノム内の標的配列へ結合するようである。重要なこと
は、結合ドメインの突然変異は緩和な発現水準で劣性で
ある負の表現型を生じる傾向があることである。これと
は対照的に、転写因子の活性化ドメインの突然変異また
は欠失は、優性な負の表現型を備えた変異体を生じ得
る。これらの変異体はインタクトな結合ドメインを保有
しており、好適な細胞標的へ結合する野生型トランス-
活性化因子と競合するが、いったん結合が起こると転写
を活性化できないと信じられる。ＨＳＶ-１ＶＰ１６タ
ンパク質の場合、そのようなトランス優性な変異体の過
剰発現は野生型ＶＰ１６機能を効果的に抑制し、そのた
めに正常な許容細胞でＨＳＶ-１の複製を妨害すること
が判明した。
ン）内の突然変異は、ほぼアミノ酸残基７９を中心にし
て、一般にミスセンス変異体ｐＭ１０および欠失変異体
ｐΔ９/１４およびｐΔ１０/１４によって限定されてお
り、Ｒｅｖ機能の喪失を生じるが、注目すべきことは、
これらの変異体によって示される負の表現型はトランス
優性なことである。Ｒｅｖの２つの領域（第１２Ａ図、
ハッチング部分）はタンパク質機能にとってさほど必要
ではないようである。図で示したように、Ｒｅｖ活性化
ドメインの突然変異はＲｅｖを欠損させ、野生型Ｒｅｖ
機能を競合的に抑制するタンパク質の生産を生じる。こ
のトランス抑制は、トランスフェクトした細胞内でのＨ
ＩＶ-１複製を著しく減少または抑制するのに十分であ
る。ｐＭ１０および関連する欠失変異体によって示され
る優性な負の表現型に関する分子的原理はまだ判ってい
ない。然しミスセンス（Ｍ１０）および欠失（Δ９/１
４、Δ１０/１４）変異体が、何れもＲｅｖ機能をトラ
ンスで抑制できる観察結果から、属性の獲得より、むし
ろその喪失が関与していることが示唆される。一つの可
能性は、欠損型Ｒｅｖタンパク質分子が野生型Ｒｅｖタ
ンパク質のサブユニットと混合多量体を作ることがで
き、そのため野生型タンパク質の機能をトランス優性な
態様で抑制するのかも知れない。然しながら生体内でＲ
ｅｖ機能が単量体であるのか、多量体であるのかは現在
のところ判っていない。多数の原核性および真核性転写
因子の詳細な機能分析を含む以前の研究に基づいた別の
仮説では、転写トランス-活性化因子が、タンパク質を
その好適な標的物質へ向かわせる特異的な「結合ドメイ
ン」と、結合反応の機能的結果を発揮させる「活性化ド
メイン」（この場合は転写活性化）の２つの異なった機
能的ドメインを保有しているというものである。幾つか
の系で、結合ドメインが配列特異的なＤＮＡ結合要素か
らなることが判明した。然し少なくとも１つの例では、
単純ヘルペス１型ウイルス（ＨＳＶ-１）トランス-活性
化因子ＶＰ１６の場合、結合ドメインは細胞性転写因子
との特異的な相互作用を仲介する代わりに、ＨＳＶ-１
ゲノム内の標的配列へ結合するようである。重要なこと
は、結合ドメインの突然変異は緩和な発現水準で劣性で
ある負の表現型を生じる傾向があることである。これと
は対照的に、転写因子の活性化ドメインの突然変異また
は欠失は、優性な負の表現型を備えた変異体を生じ得
る。これらの変異体はインタクトな結合ドメインを保有
しており、好適な細胞標的へ結合する野生型トランス-
活性化因子と競合するが、いったん結合が起こると転写
を活性化できないと信じられる。ＨＳＶ-１ＶＰ１６タ
ンパク質の場合、そのようなトランス優性な変異体の過
剰発現は野生型ＶＰ１６機能を効果的に抑制し、そのた
めに正常な許容細胞でＨＳＶ-１の複製を妨害すること
が判明した。
【０１６４】ｒｅｖ遺伝子生産物は遺伝子発現の転写後
トランス-調節因子であるが、この場合に２つの異なっ
た機能的ドメインの概念が適用し得ると考えるのが合理
的なようである。特にＲｅｖは、そのＲＮＡ標的配列
（ＲＲＥ）との直接的な相互作用を介して、極めて配列
特異的な態様で機能するので（Ｍ.Ｈ.マリムら、セル、
６０巻、［１９９０年］、６７５〜６８３頁）、したが
ってこの特異性を付与する配列を含んでいるはずであ
る。いったん結合が起これば、その結果は活性化反応
（この場合、ＨＩＶ-１構造タンパク質を暗号化してい
る不完全にスライスされたＲＮＡの核放出）へ翻訳され
るはずである。したがってこの活性化ドメインにおける
突然変異は、野生型Ｒｅｖ機能の競合的な抑制因子を生
じ得る。これがＲｅｖのｐＭ１０およびｐΔ１０/１４
変異体で観察された表現型であり、これらの変異体は分
離した活性化ドメインの存在を示しているのかも知れな
い。逆にこの突然変異分析によって規定されたＲｅｖタ
ンパク質の第２の一層Ｎ-末端に不可欠な領域は、数個
の転写因子であると定義された「結合ドメイン」と同一
機能を果たし得る。事実、このドメインで変化した突然
変異体（例えばｐＭ４、ｐＭ７）は、低いけれども有意
な抑制を高い発現水準で観察されるが、一般に劣性の負
の表現型を示す。Ｒｅｖ活性化ドメインの局在化を、野
生型Ｒｅｖのおよそのアミノ酸位置６８〜およそのアミ
ノ酸位置９０、特におよその位置７８〜およその位置８
６、ことにおよその位置７８〜およその位置８３または
８４まで伸長するように高めるトランス優性な突然変異
体がそれ以外にも発見された（第５Ａ図、および実施例
１１Ａおよび１１Ｂ参照）。
トランス-調節因子であるが、この場合に２つの異なっ
た機能的ドメインの概念が適用し得ると考えるのが合理
的なようである。特にＲｅｖは、そのＲＮＡ標的配列
（ＲＲＥ）との直接的な相互作用を介して、極めて配列
特異的な態様で機能するので（Ｍ.Ｈ.マリムら、セル、
６０巻、［１９９０年］、６７５〜６８３頁）、したが
ってこの特異性を付与する配列を含んでいるはずであ
る。いったん結合が起これば、その結果は活性化反応
（この場合、ＨＩＶ-１構造タンパク質を暗号化してい
る不完全にスライスされたＲＮＡの核放出）へ翻訳され
るはずである。したがってこの活性化ドメインにおける
突然変異は、野生型Ｒｅｖ機能の競合的な抑制因子を生
じ得る。これがＲｅｖのｐＭ１０およびｐΔ１０/１４
変異体で観察された表現型であり、これらの変異体は分
離した活性化ドメインの存在を示しているのかも知れな
い。逆にこの突然変異分析によって規定されたＲｅｖタ
ンパク質の第２の一層Ｎ-末端に不可欠な領域は、数個
の転写因子であると定義された「結合ドメイン」と同一
機能を果たし得る。事実、このドメインで変化した突然
変異体（例えばｐＭ４、ｐＭ７）は、低いけれども有意
な抑制を高い発現水準で観察されるが、一般に劣性の負
の表現型を示す。Ｒｅｖ活性化ドメインの局在化を、野
生型Ｒｅｖのおよそのアミノ酸位置６８〜およそのアミ
ノ酸位置９０、特におよその位置７８〜およその位置８
６、ことにおよその位置７８〜およその位置８３または
８４まで伸長するように高めるトランス優性な突然変異
体がそれ以外にも発見された（第５Ａ図、および実施例
１１Ａおよび１１Ｂ参照）。
【０１６５】［実施例１１ａ］ それ以外のトランス優性なＨＩＶ-１ Ｒｅｖ突然変異体 ６.２項で報告した方法と同様に、それ以外のＨＩＶ-１
ｒｅｖ変異体を作成した。これらを第５Ａ図および第
２表に示したように命名し、特性を調べた。生体内にお
ける表現型をマリムらの方法（Ｍ.Ｈ.マリムら、セル、
５８巻、［１９８９年］、２０５〜２１４頁）にしたが
い測定した（すべての検定はトランスフェクション効率
のため内部的に調節した）。
ｒｅｖ変異体を作成した。これらを第５Ａ図および第
２表に示したように命名し、特性を調べた。生体内にお
ける表現型をマリムらの方法（Ｍ.Ｈ.マリムら、セル、
５８巻、［１９８９年］、２０５〜２１４頁）にしたが
い測定した（すべての検定はトランスフェクション効率
のため内部的に調節した）。
【０１６６】実施例４〜１１に報告した変異体に追加し
て、それ以外の突然変異体、ｐＭ２１、ｐＭ２２、ｐＭ
２７、ｐＭ２８、ｐＭ２９およびｐＭ３２が、野生型Ｈ
ＩＶ-１ Ｒｅｖ機能をトランス優性に抑制することが判
明した。
て、それ以外の突然変異体、ｐＭ２１、ｐＭ２２、ｐＭ
２７、ｐＭ２８、ｐＭ２９およびｐＭ３２が、野生型Ｈ
ＩＶ-１ Ｒｅｖ機能をトランス優性に抑制することが判
明した。
【０１６７】
【表２】それ以外のＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝子突然変異体の表現型分析 クローン 表現型a トランス優性な抑制b pBC12/CMV(ベクター単独) ０ pM15 ＋＋ pM16 ＋＋ pM17 ＋＋ pM18 ＋ pM19 ＋＋ pM20 ＋＋ pM21 − ９７ pM22 − ９３ pM23 ＋＋ pM24 ＋＋ pM25 ＋＋ pΔ9/19 − pΔ18/19 ＋ pΔ18/23 − pΔ22/14 − pΔ23/14 ＋ pM27 − ９２ pM28 − ９２ pM29 − ９１ pM32 − ９７ pM33 ＋＋ pM34 ＋＋ pM35 ＋＋ pM36 ＋ a＋＋ ４０〜１００％（野生型Ｒｅｖ活性と比較して） ＋ ５〜３９％ − ＜５ ％ b野生型Ｒｅｖより１０倍過剰の突然変異体Ｒｅｖの場合（野生型Ｒｅｖ機能の抑制％）
【０１６８】［実施例１１ｂ］ ＨＩＶ-２およびＳＩＶＲｅｖ機能に対する効果 実施例４〜１１のトランス優性なＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝
子突然変異体の多価可能性を、６.２項およびＭ.Ｈ.マ
リムら（プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、
８６巻、［１９８９年］、８２２２〜８２２６頁）が既
に報告した手法を使用して分析した。得られた結果か
ら、少なくとも変異体ｐＭ１０はＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝
子の表現型発現ばかりでなく、ＨＩＶ-２ ｒｅｖ遺伝子
およびＳＩＶmacｒｅｖ遺伝子機能をもトランス優性に
抑制する抑制能を有することが判った。例えばＨＩＶ-
２ ｒｅｖの場合、ｐＭ１０の過剰を野生型ＨＩＶ-２
ｒｅｖ遺伝子とともに発現させると、細胞質におけるス
プライスされないｍＲＮＡおよびエキソン１個形のｔａ
ｔの発現の抑制によってＨＩＶ-２ Ｒｅｖ機能を強力に
抑制する。
子突然変異体の多価可能性を、６.２項およびＭ.Ｈ.マ
リムら（プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、
８６巻、［１９８９年］、８２２２〜８２２６頁）が既
に報告した手法を使用して分析した。得られた結果か
ら、少なくとも変異体ｐＭ１０はＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝
子の表現型発現ばかりでなく、ＨＩＶ-２ ｒｅｖ遺伝子
およびＳＩＶmacｒｅｖ遺伝子機能をもトランス優性に
抑制する抑制能を有することが判った。例えばＨＩＶ-
２ ｒｅｖの場合、ｐＭ１０の過剰を野生型ＨＩＶ-２
ｒｅｖ遺伝子とともに発現させると、細胞質におけるス
プライスされないｍＲＮＡおよびエキソン１個形のｔａ
ｔの発現の抑制によってＨＩＶ-２ Ｒｅｖ機能を強力に
抑制する。
【０１６９】［６.３］ ［実施例１２］ Ｒｅｘ機能の分析 Ｒｅｘ機能に対してｒｅｘ突然変異体を試験するため
（第１４図）、ＤＥＡＥ-デキストランを使用して、各
変異体ＤＮＡをｐｇＴＡＸ-ＬＴＲとともにＣＯＳ細胞
へ同時トランスフェクトした（Ｂ.Ｐ.カレン、メソッズ
・イン・エンジモロジー、１５２巻、［１９８７年］、
６９２〜６９３頁）。プラスミドはすべて１.２５μｇ/
ｍlの濃度で添加した。４８時間トランスフェクション
後、細胞を35Ｓ-システインで代謝的に２時間標識し、
細胞抽出物を調製し、試料を、ＨＴＬＶ-Ｉエンベロー
プタンパク質と特異的に反応する０.５αヒトモノクロ
ーナル抗体で免疫沈降させた。免疫沈降物をＳＤＳ-１
０％ポリアクリルアミドゲルで分析した。
（第１４図）、ＤＥＡＥ-デキストランを使用して、各
変異体ＤＮＡをｐｇＴＡＸ-ＬＴＲとともにＣＯＳ細胞
へ同時トランスフェクトした（Ｂ.Ｐ.カレン、メソッズ
・イン・エンジモロジー、１５２巻、［１９８７年］、
６９２〜６９３頁）。プラスミドはすべて１.２５μｇ/
ｍlの濃度で添加した。４８時間トランスフェクション
後、細胞を35Ｓ-システインで代謝的に２時間標識し、
細胞抽出物を調製し、試料を、ＨＴＬＶ-Ｉエンベロー
プタンパク質と特異的に反応する０.５αヒトモノクロ
ーナル抗体で免疫沈降させた。免疫沈降物をＳＤＳ-１
０％ポリアクリルアミドゲルで分析した。
【０１７０】ＨＴＬＶ-ＩＥｎｖ、ＴａｘおよびＲｅｘ
タンパク質生産物を同時分析するため（第１５図）、Ｃ
ＯＳ細胞をｐｇＴＡＸ-ＬＴＲ（０.１μｇ/ｍl）および
突然変異体Ｒｅｘタンパク質を暗号化しているベクター
（１μｇ/ｍl）または野生型ｐＲＥＸ、ｐＲｅｖおよび
ｐＣＭＶ-ＩＬ-２ベクター（１μｇ/ｍl）で同時トラン
スフェクトした。ＨＴＬＶ-Ｉタンパク質の免疫沈降分
析のため、下記の抗体を使用した。Ｅｎｖ：０.５α抗
体、Ｔａｘ：Ｔａｘ特異的な抗ペプチド家兎抗血清［発
明者の１人が調製、またＷ.ワックスマンらの方法（サ
イエンス、２３５巻、［１９８７年］、６７４〜６７７
頁）によっても調製できる］、Ｒｅｘ：Ｒｅｘ特異的な
抗ペプチド家兎抗血清［発明者の１人が調製、またＨ.
シーミらの方法（セル、５５巻、［１９８８年］、１９
７〜２０９頁）によっても調製できる］。各例毎に、放
射能標識した細胞抽出物をそれぞれ３回ずつ免疫沈降お
よび電気泳動分析に使用した。得られたオートラジオグ
ラムを、それぞれの関連領域だけ第１５図のパネルに示
す。
タンパク質生産物を同時分析するため（第１５図）、Ｃ
ＯＳ細胞をｐｇＴＡＸ-ＬＴＲ（０.１μｇ/ｍl）および
突然変異体Ｒｅｘタンパク質を暗号化しているベクター
（１μｇ/ｍl）または野生型ｐＲＥＸ、ｐＲｅｖおよび
ｐＣＭＶ-ＩＬ-２ベクター（１μｇ/ｍl）で同時トラン
スフェクトした。ＨＴＬＶ-Ｉタンパク質の免疫沈降分
析のため、下記の抗体を使用した。Ｅｎｖ：０.５α抗
体、Ｔａｘ：Ｔａｘ特異的な抗ペプチド家兎抗血清［発
明者の１人が調製、またＷ.ワックスマンらの方法（サ
イエンス、２３５巻、［１９８７年］、６７４〜６７７
頁）によっても調製できる］、Ｒｅｘ：Ｒｅｘ特異的な
抗ペプチド家兎抗血清［発明者の１人が調製、またＨ.
シーミらの方法（セル、５５巻、［１９８８年］、１９
７〜２０９頁）によっても調製できる］。各例毎に、放
射能標識した細胞抽出物をそれぞれ３回ずつ免疫沈降お
よび電気泳動分析に使用した。得られたオートラジオグ
ラムを、それぞれの関連領域だけ第１５図のパネルに示
す。
【０１７１】免疫沈降によるＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘ変異体
の亜細胞性局在化のため(第１６図)、表記の発現プラス
ミドでＣＯＳ細胞をトランスフェクトし、４８時間後に
パラホルムアルデヒドで固定した。ついで細胞を、前に
述べたように家兎抗Ｒｅｘペプチド抗血清（１：１００
倍希釈）およびローダミン結合ヤギ抗家兎ＩｇＧで逐次
染色した（Ｂ.Ｒ.カレン、［１９８７年］、前掲）。
の亜細胞性局在化のため(第１６図)、表記の発現プラス
ミドでＣＯＳ細胞をトランスフェクトし、４８時間後に
パラホルムアルデヒドで固定した。ついで細胞を、前に
述べたように家兎抗Ｒｅｘペプチド抗血清（１：１００
倍希釈）およびローダミン結合ヤギ抗家兎ＩｇＧで逐次
染色した（Ｂ.Ｒ.カレン、［１９８７年］、前掲）。
【０１７２】［実施例１３］ ＲｅｘおよびＲｅｖ機能の抑制 野生型Ｒｅｘタンパク質の機能を抑制するｒｅｘ突然変
異体の抑制能を分析するため（第１７Ａ図）、ＣＯＳ培
養をｐｇＴＡＸ-ＬＴＲ（１.２５μｇ/ｍl）、ｐＲＥＸ
（０.１μｇ/ｍl）と、Ｒｅｘ変異体（レーン１〜
６）、ｐＲＥＸ（レーン７）、ｐＲｅｖ（レーン８）ま
たはｐＣＭＶ-ＩＬ-２（レーン９）１μｇ/ｍlを含むそ
れぞれ３種のプラスミドで同時トランスフェクトした。
Ｅｎｖ生産物を０.５αモノクローナル抗体との免疫沈
降およびＳＤＳ-１０％ポリアクリルアミドゲルによる
電気泳動により分析した。ＨＩＶ-１ ｒｅｖタンパク質
機能の抑制を分析するため、ＣＯＳ細胞をｐｇＴＡＴ、
ｐＲｅｖ、および１０倍モル過剰のｐＢＣ/ＣＭＶ-ＩＬ
-２またはＭ６、Ｍ７およびＭ１３トランス優性変異体
で同時トランスフェクトした。４８時間の培養および35
Ｓ-システインによる生合成的な標識ののち、細胞抽出
物を、Ｒｅｖ誘導した先端を切り取った７２アミノ酸形
のＴａｔタンパク質生産物の免疫沈降によって検定した
（レーン２）。完全鎖長のＴａｔタンパク質の８６アミ
ノ酸形だけが検出されたように、１０：１のモル比で、
Ｍ６、Ｍ７およびＭ１３（レーン３〜５）変異体は、Ｈ
ＩＶ-１ Ｒｅｖタンパク質の作用を完全に抑制した。Ｈ
ＩＶ-１複製の抑制を分析するため、ｒｅｖ欠損型ＨＩ
Ｖ-１プロウイルスプラスミドｐＨＸＢ２-Ｂａｍ-ｐ３
（Ｍ.Ｒ.ファインバーグら、セル、４６巻、［１９８６
年］、８０７〜８１７頁）およびｐＲＥＸで、Ｍ１、Ｍ
６、Ｍ７およびＭ１３変異体のそれぞれ表記した過剰倍
数量の存在で、ＣＯＳ細胞を同時トランスフェクトし
た。トランスフェクション混合物中のＤＮＡ濃度の合計
は、ｐＢＣ/ＣＭＶ-ＩＬ-２親ベクターの添加量を変え
ることによって一定濃度に保った。トランスフェクショ
ン３日後、ＨＩＶ-１ｐ２４Ｇａｇタンパク質の上清濃
度をＥＬＩＳＡ（コールター・イムノロジー・キット）
によって測定した。Ｍ６、Ｍ７およびＭ１３変異体は用
量に比例したＨＩＶ-１ｐ２４生産の抑制を生じたが、
劣性の負のＭ１変異体は抑制を示さなかった。
異体の抑制能を分析するため（第１７Ａ図）、ＣＯＳ培
養をｐｇＴＡＸ-ＬＴＲ（１.２５μｇ/ｍl）、ｐＲＥＸ
（０.１μｇ/ｍl）と、Ｒｅｘ変異体（レーン１〜
６）、ｐＲＥＸ（レーン７）、ｐＲｅｖ（レーン８）ま
たはｐＣＭＶ-ＩＬ-２（レーン９）１μｇ/ｍlを含むそ
れぞれ３種のプラスミドで同時トランスフェクトした。
Ｅｎｖ生産物を０.５αモノクローナル抗体との免疫沈
降およびＳＤＳ-１０％ポリアクリルアミドゲルによる
電気泳動により分析した。ＨＩＶ-１ ｒｅｖタンパク質
機能の抑制を分析するため、ＣＯＳ細胞をｐｇＴＡＴ、
ｐＲｅｖ、および１０倍モル過剰のｐＢＣ/ＣＭＶ-ＩＬ
-２またはＭ６、Ｍ７およびＭ１３トランス優性変異体
で同時トランスフェクトした。４８時間の培養および35
Ｓ-システインによる生合成的な標識ののち、細胞抽出
物を、Ｒｅｖ誘導した先端を切り取った７２アミノ酸形
のＴａｔタンパク質生産物の免疫沈降によって検定した
（レーン２）。完全鎖長のＴａｔタンパク質の８６アミ
ノ酸形だけが検出されたように、１０：１のモル比で、
Ｍ６、Ｍ７およびＭ１３（レーン３〜５）変異体は、Ｈ
ＩＶ-１ Ｒｅｖタンパク質の作用を完全に抑制した。Ｈ
ＩＶ-１複製の抑制を分析するため、ｒｅｖ欠損型ＨＩ
Ｖ-１プロウイルスプラスミドｐＨＸＢ２-Ｂａｍ-ｐ３
（Ｍ.Ｒ.ファインバーグら、セル、４６巻、［１９８６
年］、８０７〜８１７頁）およびｐＲＥＸで、Ｍ１、Ｍ
６、Ｍ７およびＭ１３変異体のそれぞれ表記した過剰倍
数量の存在で、ＣＯＳ細胞を同時トランスフェクトし
た。トランスフェクション混合物中のＤＮＡ濃度の合計
は、ｐＢＣ/ＣＭＶ-ＩＬ-２親ベクターの添加量を変え
ることによって一定濃度に保った。トランスフェクショ
ン３日後、ＨＩＶ-１ｐ２４Ｇａｇタンパク質の上清濃
度をＥＬＩＳＡ（コールター・イムノロジー・キット）
によって測定した。Ｍ６、Ｍ７およびＭ１３変異体は用
量に比例したＨＩＶ-１ｐ２４生産の抑制を生じたが、
劣性の負のＭ１変異体は抑制を示さなかった。
【０１７３】［７］薬理学的考察 ＨＩＶ-１はエイズの主な病因学的な作因である。ＨＴ
ＬＶ-Ｉ は一般にＡＴＬの原因となる。ＨＴＬＶ-IIは異型Ｔ細
胞毛状細胞性白血病のある種の例に病因学的に関係す
る。ＨＩＶ-１ ＲｅｖおよびＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘトラン
ス-活性化因子は、培養で複製に不可欠であることが判
明し、ＲｅｖおよびＲｅｘはしたがって罹患患者におけ
る化学療法介入の可能性のある目標である。
ＬＶ-Ｉ は一般にＡＴＬの原因となる。ＨＴＬＶ-IIは異型Ｔ細
胞毛状細胞性白血病のある種の例に病因学的に関係す
る。ＨＩＶ-１ ＲｅｖおよびＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘトラン
ス-活性化因子は、培養で複製に不可欠であることが判
明し、ＲｅｖおよびＲｅｘはしたがって罹患患者におけ
る化学療法介入の可能性のある目標である。
【０１７４】ここで報告するのは、野生型Ｒｅｖまたは
Ｒｅｘでトランスフェクトされた細胞で野生型Ｒｅｖお
よび／またはＲｅｘ機能の有効な競合的抑制因子として
作用し、したがってＨＩＶ-１および／またはＨＴＬＶ-
Ｉおよび／またはＨＴＬＶ-II複製の有効な抑制因子と
して作用するＲｅｖおよび／またはＲｅｘの変異体形態
である。したがってこれらの変異体は、感染にさらされ
た患者のリンパ細胞を保護するのに使用し得る。この研
究の実用化が期待できる適応は、ＨＳＶ-１の本質的な
ＶＰ１６トランス-活性化因子に類似したトランス優性
な誘導体の発現が、ＨＳＶ-１感染に対する耐性を正常
な感受性細胞集団へ有効に付与できた観察結果である
（Ａ.Ｄ.フリードマンら、ネーチャー、３３５巻、［１
９８８年］、４５２〜４５４頁）。また対応するトラン
スジェニックマウスがＨＳＶ-１感染に対して免疫され
るようである。
Ｒｅｘでトランスフェクトされた細胞で野生型Ｒｅｖお
よび／またはＲｅｘ機能の有効な競合的抑制因子として
作用し、したがってＨＩＶ-１および／またはＨＴＬＶ-
Ｉおよび／またはＨＴＬＶ-II複製の有効な抑制因子と
して作用するＲｅｖおよび／またはＲｅｘの変異体形態
である。したがってこれらの変異体は、感染にさらされ
た患者のリンパ細胞を保護するのに使用し得る。この研
究の実用化が期待できる適応は、ＨＳＶ-１の本質的な
ＶＰ１６トランス-活性化因子に類似したトランス優性
な誘導体の発現が、ＨＳＶ-１感染に対する耐性を正常
な感受性細胞集団へ有効に付与できた観察結果である
（Ａ.Ｄ.フリードマンら、ネーチャー、３３５巻、［１
９８８年］、４５２〜４５４頁）。また対応するトラン
スジェニックマウスがＨＳＶ-１感染に対して免疫され
るようである。
【０１７５】即ち、ＲｅｘまたはＲｅｖのトランス優性
な抑制因子を暗号化した突然変異体ｒｅｘおよびｒｅｖ
遺伝子は、ＨＴＬＶ-ＩまたはＨＴＬＶ-IIによって起こ
る疾患の処置、またはエイズおよびＡＲＳ（ＡＲＣ）を
含むＨＩＶ-１で誘発される疾患の処置に、それぞれ
「細胞内免疫原」として使用するのに薦められる。さら
にこの発明の少なくとも幾つかのトランス優性なＲｅｘ
突然変異体タンパク質は、特にＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘおよ
びＨＩＶ-１ Ｒｅｖタンパク質作用を両者とも抑制でき
る特性を有するから、この２種類のウイルス型による感
染の処置への使用が薦められる。この特性は、１種類以
上のこれらのウイルス性病原に同時感染した患者、また
はその感染がこれら２つのウイルス間で鑑別できない患
者の場合、特に有用であり得る。
な抑制因子を暗号化した突然変異体ｒｅｘおよびｒｅｖ
遺伝子は、ＨＴＬＶ-ＩまたはＨＴＬＶ-IIによって起こ
る疾患の処置、またはエイズおよびＡＲＳ（ＡＲＣ）を
含むＨＩＶ-１で誘発される疾患の処置に、それぞれ
「細胞内免疫原」として使用するのに薦められる。さら
にこの発明の少なくとも幾つかのトランス優性なＲｅｘ
突然変異体タンパク質は、特にＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘおよ
びＨＩＶ-１ Ｒｅｖタンパク質作用を両者とも抑制でき
る特性を有するから、この２種類のウイルス型による感
染の処置への使用が薦められる。この特性は、１種類以
上のこれらのウイルス性病原に同時感染した患者、また
はその感染がこれら２つのウイルス間で鑑別できない患
者の場合、特に有用であり得る。
【０１７６】１種類以上のウイルス種に対して有効な治
療剤の存在は、この発明以前には全く開示されていない
と思われる。広範な適用性の観点から、上記の概念は、
ＲｅｖおよびＲｅｘを暗号化しているウイルス種によっ
て起こされた疾患の治療に適用されるだけでなく、同様
に調節される遺伝子を有する微生物によって起こされた
それ以外のウイルス疾患にも適用され得るであろう。
療剤の存在は、この発明以前には全く開示されていない
と思われる。広範な適用性の観点から、上記の概念は、
ＲｅｖおよびＲｅｘを暗号化しているウイルス種によっ
て起こされた疾患の治療に適用されるだけでなく、同様
に調節される遺伝子を有する微生物によって起こされた
それ以外のウイルス疾患にも適用され得るであろう。
【０１７７】このようにこの発明は、ウイルス疾患の予
防および治療、特にＡＴＬ（成人Ｔ細胞白血病）、エイ
ズ（後天性免疫不全症候群）、ＡＲＳまたはＡＲＣ（エ
イズ関連症候群または複合体）、ＳＩＶmacのようなＳ
ＩＶ（サル免疫不全ウイルス）、ＦＩＶ（ネコ免疫不全
ウイルス）、ＥＩＡＶ（ウマ感染性貧血ウイルス）、ビ
スナウイルスおよびウシ免疫不全ウイルス感染症のよう
なレトロウイルス、具体的にはヒトレトロウイルス疾
患、より具体的にはｒｅｘまたはｒｅｖ遺伝子によって
調節される病原体、またはそれと同等な病原体によって
起こるＡＴＬ、エイズ、およびＡＲＳ（ＡＲＣ）のよう
なヒトレトロウイルス疾患の予防および治療への使用に
適用される。
防および治療、特にＡＴＬ（成人Ｔ細胞白血病）、エイ
ズ（後天性免疫不全症候群）、ＡＲＳまたはＡＲＣ（エ
イズ関連症候群または複合体）、ＳＩＶmacのようなＳ
ＩＶ（サル免疫不全ウイルス）、ＦＩＶ（ネコ免疫不全
ウイルス）、ＥＩＡＶ（ウマ感染性貧血ウイルス）、ビ
スナウイルスおよびウシ免疫不全ウイルス感染症のよう
なレトロウイルス、具体的にはヒトレトロウイルス疾
患、より具体的にはｒｅｘまたはｒｅｖ遺伝子によって
調節される病原体、またはそれと同等な病原体によって
起こるＡＴＬ、エイズ、およびＡＲＳ（ＡＲＣ）のよう
なヒトレトロウイルス疾患の予防および治療への使用に
適用される。
【０１７８】特に好都合なことは、そのリプレッサー効
果の多価性であって、ＨＩＶ-１およびＨＴＬＶ-Ｉに同
時感染した静注薬使用者でしばしば見られるようなウイ
ルスによる多重感染、特に二重感染の処置、またはそれ
以外の感染（例えばＨＩＶ感染）の危険が増大している
単純感染状態の処置、異なったウイルス種スペクトルに
よる感染を防御することが望ましい状態の予防に有用で
ある。
果の多価性であって、ＨＩＶ-１およびＨＴＬＶ-Ｉに同
時感染した静注薬使用者でしばしば見られるようなウイ
ルスによる多重感染、特に二重感染の処置、またはそれ
以外の感染（例えばＨＩＶ感染）の危険が増大している
単純感染状態の処置、異なったウイルス種スペクトルに
よる感染を防御することが望ましい状態の予防に有用で
ある。
【０１７９】この多価性は、ある特定型のウイルスの関
連ウイルス、例えばレトロウイルスの抑制に最も有効で
あると通常期待されるが、ＤＮＡウイルスないしＲＮＡ
（レトロ-）ウイルスの何れかのように、必ずしも極め
て近縁のウイルスに制限される必要はなく、例えばＨＩ
Ｖ-１とＪＣウイルス（ヒトパポーバウイルス）間のよ
うなＤＮＡウイルスとレトロウイルスの間の感染レベル
で相互作用が存在し（Ｈ.ゲンダーマンら、プロシーデ
ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８３巻、［１９８６
年］、９７５９〜９７６３頁、Ｈ.タダら、同誌、８７
巻、［１９９０年］、３４７９〜３４８３頁）、したが
って上記の多価トランス優性の原理が適用できる系統的
に一層離れたウイルス種で共通の調節メカニズムがよく
作動し得ることが知られている。
連ウイルス、例えばレトロウイルスの抑制に最も有効で
あると通常期待されるが、ＤＮＡウイルスないしＲＮＡ
（レトロ-）ウイルスの何れかのように、必ずしも極め
て近縁のウイルスに制限される必要はなく、例えばＨＩ
Ｖ-１とＪＣウイルス（ヒトパポーバウイルス）間のよ
うなＤＮＡウイルスとレトロウイルスの間の感染レベル
で相互作用が存在し（Ｈ.ゲンダーマンら、プロシーデ
ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８３巻、［１９８６
年］、９７５９〜９７６３頁、Ｈ.タダら、同誌、８７
巻、［１９９０年］、３４７９〜３４８３頁）、したが
って上記の多価トランス優性の原理が適用できる系統的
に一層離れたウイルス種で共通の調節メカニズムがよく
作動し得ることが知られている。
【０１８０】この発明の治療上の可能性は、例えばＨＴ
ＬＶ-ＩのＲｅｘ機能およびＨＩＶ-１のＲｅｖ機能の抑
制がウイルスの複製を阻止し、感染性ウイルス粒子の生
成を防止することによって、感染の潜伏段階を持続させ
ることが期待されるから直ちに明白である。したがって
既にＨＩＶ-１ウイルスに感染した対象の細胞は、トラ
ンス優性なリプレッサーの遺伝子をそのゲノムに組み込
んで保有しており、細胞は機能的なまま温存され、対象
は長期治療の必要なく、疾患の症状をいつまでも発現し
ない。
ＬＶ-ＩのＲｅｘ機能およびＨＩＶ-１のＲｅｖ機能の抑
制がウイルスの複製を阻止し、感染性ウイルス粒子の生
成を防止することによって、感染の潜伏段階を持続させ
ることが期待されるから直ちに明白である。したがって
既にＨＩＶ-１ウイルスに感染した対象の細胞は、トラ
ンス優性なリプレッサーの遺伝子をそのゲノムに組み込
んで保有しており、細胞は機能的なまま温存され、対象
は長期治療の必要なく、疾患の症状をいつまでも発現し
ない。
【０１８１】この観点に立てば、この発明の遺伝子は、
それ自体医薬品であって、生体内へ直接、または生体外
で間接に、１回または多回投与により、好ましくは例え
ばレトロウイルスベクターまたはプラスミドベクターの
ようなベクターを要素として、標的哺乳動物細胞へ機能
的な形態で送達を達成し得るのに好適な形態で投与され
る。例えばそのようなウイルス複製のトランス優性な抑
制因子を暗号化している遺伝子を、感染患者自身に由来
するリンパ細胞のゲノムへ直接埋め込むことにより、患
者の細胞へ生体外で挿入を行い、挿入を実施した後、そ
れらの細胞を保菌患者へ投与し得る。ＨＴＬＶ-Ｉおよ
びＨＴＬＶ-II、およびＨＩＶ-１はさまざまな型のＴ細
胞で複製するので、それらが原因となった疾患は特に好
適であると思われる。 したがってこの発明の１適用
は、例えばフリードマンが報告した遺伝子治療の概念に
相当する（Ｔ.フリードマン、サイエンス、２４４巻、
［１９８９年６月１６日号］、１２７５頁、またはＰ.
Ｍ.レーン、ボーン・マロー・トランスプラント、１
巻、［１９８７年］、２４３頁）。造血幹細胞を例えば
エイズ／ＡＴＬ患者から採取し、生体外で培養し、この
発明により突然変異して、Ｒｅｘ／Ｒｅｖ機能のような
抑制すべき機能に対するトランス優性リプレッサーを暗
号化している遺伝子を、レトロウイルスベクターを利用
してこれらの細胞へ埋め込み、このようにしてウイルス
耐性となった子孫生産能を備えた幹細胞を、もとの患者
の免疫系へ戻してやると、細胞は、獲得した未処置幹細
胞より選択的な優位性により増殖することが期待され
る。やがて造血細胞の集団は完全にトランス優性な因子
を生産する細胞から構成され、ウイルス耐性である。
それ自体医薬品であって、生体内へ直接、または生体外
で間接に、１回または多回投与により、好ましくは例え
ばレトロウイルスベクターまたはプラスミドベクターの
ようなベクターを要素として、標的哺乳動物細胞へ機能
的な形態で送達を達成し得るのに好適な形態で投与され
る。例えばそのようなウイルス複製のトランス優性な抑
制因子を暗号化している遺伝子を、感染患者自身に由来
するリンパ細胞のゲノムへ直接埋め込むことにより、患
者の細胞へ生体外で挿入を行い、挿入を実施した後、そ
れらの細胞を保菌患者へ投与し得る。ＨＴＬＶ-Ｉおよ
びＨＴＬＶ-II、およびＨＩＶ-１はさまざまな型のＴ細
胞で複製するので、それらが原因となった疾患は特に好
適であると思われる。 したがってこの発明の１適用
は、例えばフリードマンが報告した遺伝子治療の概念に
相当する（Ｔ.フリードマン、サイエンス、２４４巻、
［１９８９年６月１６日号］、１２７５頁、またはＰ.
Ｍ.レーン、ボーン・マロー・トランスプラント、１
巻、［１９８７年］、２４３頁）。造血幹細胞を例えば
エイズ／ＡＴＬ患者から採取し、生体外で培養し、この
発明により突然変異して、Ｒｅｘ／Ｒｅｖ機能のような
抑制すべき機能に対するトランス優性リプレッサーを暗
号化している遺伝子を、レトロウイルスベクターを利用
してこれらの細胞へ埋め込み、このようにしてウイルス
耐性となった子孫生産能を備えた幹細胞を、もとの患者
の免疫系へ戻してやると、細胞は、獲得した未処置幹細
胞より選択的な優位性により増殖することが期待され
る。やがて造血細胞の集団は完全にトランス優性な因子
を生産する細胞から構成され、ウイルス耐性である。
【０１８２】これを実施する方法は技術上既知である
（例えば米国特許第４８６８１１６号）。この発明によ
って突然変異した遺伝子を、骨髄細胞のような標的哺乳
動物細胞ヘ送達するためのベクター、例えばレトロウイ
ルスベクターまたはプラスミドベクターは報告されてお
り、ここに引用する（サイエンス、２４４巻、［１９８
９年６月１６日号］、１２７５頁）。したがって、例え
ば種々のＲｅｖおよび／またはＲｅｘトランス優性遺伝
子をレトロウイルスベクター系へクローン化する。レト
ロウイルス依存性遺伝子を、例えばＨＩＶ感染したヒト
の細胞系へ送達したのち、トランス優性な突然変異体の
抑制効果をウイルス生産物の抑制によって容易に確かめ
られる。
（例えば米国特許第４８６８１１６号）。この発明によ
って突然変異した遺伝子を、骨髄細胞のような標的哺乳
動物細胞ヘ送達するためのベクター、例えばレトロウイ
ルスベクターまたはプラスミドベクターは報告されてお
り、ここに引用する（サイエンス、２４４巻、［１９８
９年６月１６日号］、１２７５頁）。したがって、例え
ば種々のＲｅｖおよび／またはＲｅｘトランス優性遺伝
子をレトロウイルスベクター系へクローン化する。レト
ロウイルス依存性遺伝子を、例えばＨＩＶ感染したヒト
の細胞系へ送達したのち、トランス優性な突然変異体の
抑制効果をウイルス生産物の抑制によって容易に確かめ
られる。
【０１８３】上記の治療概念は、バルチモアが着想した
細胞内免疫の例である（Ｄ.バルチモア、ネーチャー、
３３５巻、［１９８８年］、３９５頁）。簡単に説明す
ると、この概念は、選ばれたウイルスのある生活機能の
リプレッサーを暗号化している遺伝子を、そのウイルス
が感染した特定の標的細胞へ挿入することからなる（例
えばエイズを起こすウイルスの場合、特定のＴ細胞）。
この研究方法を任意のウイルスのトランス優性リプレッ
サーで治療に適用するには、そのような突然変異体タン
パク質を暗号化している遺伝子のための可能性あるベク
ターおよびこれらのベクターを適当な細胞へ挿入する、
モデル系で確かめられた可能性ある方法を、ヒトまたは
動物へ適用するのに有効で安全な細胞内送達システムの
構成が確立されることが前提条件である。この概念を実
験的に立証するための試験を実行に移すには、現在のと
ころ遺伝子治療を防止しようとする倫理的な障壁のため
に必ず困難が伴う。然しそのような遺伝学的な最初の実
験は、非治療的な目的で既に開始された。その方法の無
害性が証明されれば、極めて短期間にこれらの先駆的な
実験に引き続き、まずエイズ疾患のような救命的な条件
で、治療目的に向かって類似の研究が行われるであろ
う。この発明はそのような研究で初期の利用によく適合
すると思われる（Ｔ.フリードマン、サイエンス、２４
４巻、［１９８９年６月１６日号］、１２７９頁、第２
欄、「インフェクシアス・ディシージズ」、参照）。
細胞内免疫の例である（Ｄ.バルチモア、ネーチャー、
３３５巻、［１９８８年］、３９５頁）。簡単に説明す
ると、この概念は、選ばれたウイルスのある生活機能の
リプレッサーを暗号化している遺伝子を、そのウイルス
が感染した特定の標的細胞へ挿入することからなる（例
えばエイズを起こすウイルスの場合、特定のＴ細胞）。
この研究方法を任意のウイルスのトランス優性リプレッ
サーで治療に適用するには、そのような突然変異体タン
パク質を暗号化している遺伝子のための可能性あるベク
ターおよびこれらのベクターを適当な細胞へ挿入する、
モデル系で確かめられた可能性ある方法を、ヒトまたは
動物へ適用するのに有効で安全な細胞内送達システムの
構成が確立されることが前提条件である。この概念を実
験的に立証するための試験を実行に移すには、現在のと
ころ遺伝子治療を防止しようとする倫理的な障壁のため
に必ず困難が伴う。然しそのような遺伝学的な最初の実
験は、非治療的な目的で既に開始された。その方法の無
害性が証明されれば、極めて短期間にこれらの先駆的な
実験に引き続き、まずエイズ疾患のような救命的な条件
で、治療目的に向かって類似の研究が行われるであろ
う。この発明はそのような研究で初期の利用によく適合
すると思われる（Ｔ.フリードマン、サイエンス、２４
４巻、［１９８９年６月１６日号］、１２７９頁、第２
欄、「インフェクシアス・ディシージズ」、参照）。
【０１８４】この発明を利用するもう一つの態様は、遺
伝子ではなくてこの発明のリプレッサータンパク質を標
的細胞へ挿入することを含む。投与は、例えば経口また
は非経口で、例えばリポソームを介する送達によって細
胞内へ透過できる形で通常の態様で実施する。言うまで
もなく、これらの用途のための正確な投与量は、使用す
る化合物、投与方法および所望する処置によって変わ
る。個々の状態に応じて最も好適な投与量を確定するこ
とは、当業者の熟知するところである。
伝子ではなくてこの発明のリプレッサータンパク質を標
的細胞へ挿入することを含む。投与は、例えば経口また
は非経口で、例えばリポソームを介する送達によって細
胞内へ透過できる形で通常の態様で実施する。言うまで
もなく、これらの用途のための正確な投与量は、使用す
る化合物、投与方法および所望する処置によって変わ
る。個々の状態に応じて最も好適な投与量を確定するこ
とは、当業者の熟知するところである。
【０１８５】この発明はさらに、トランス優性に基づい
た抗ウイルス薬の設計および技術に使用することができ
る。この発明によって、ウイルスの種類によりその構造
的原理は幅広く変わるけれども、数種のウイルス種に全
般に適用可能であると思われるウイルス遺伝子機能を操
作する手段を発見した。この予期しなかった発見は、さ
らに特異的な、多分低分子量で、多分非ペプチド性のト
ランス優性なウイルス複製の抑制剤、特にトランス優性
な、即ち、低分子量の抑制剤または中和モノクローナル
抗体のような、変異体ＲｅｖまたはＲｅｘタンパク質に
おけるＲＮＡ-結合ドメインを一次的に真似ることがで
きる抑制剤を設計することを目的とした研究を行う道を
開いた。
た抗ウイルス薬の設計および技術に使用することができ
る。この発明によって、ウイルスの種類によりその構造
的原理は幅広く変わるけれども、数種のウイルス種に全
般に適用可能であると思われるウイルス遺伝子機能を操
作する手段を発見した。この予期しなかった発見は、さ
らに特異的な、多分低分子量で、多分非ペプチド性のト
ランス優性なウイルス複製の抑制剤、特にトランス優性
な、即ち、低分子量の抑制剤または中和モノクローナル
抗体のような、変異体ＲｅｖまたはＲｅｘタンパク質に
おけるＲＮＡ-結合ドメインを一次的に真似ることがで
きる抑制剤を設計することを目的とした研究を行う道を
開いた。
【０１８６】以上説明した発明に関して、この発明の範
囲から逸脱することなく、その態様または詳細の点でさ
まざまな組み合わせまたは変更を行うことができること
は明らかである。本明細書で報告した変異体以外にも、
既に組み立てられた特異的な突然変異体の中で、まだ特
性が明らかになっていないが、一層詳細な実験によって
トランス優性に抑制的であり、または多価であることが
確かめられる変異体、および前記の原理に基づき、ただ
し本明細書では具体的に説明を加えなかったそれ以外の
突然変異体もまた、この発明の範囲に包含されることは
明らかである。
囲から逸脱することなく、その態様または詳細の点でさ
まざまな組み合わせまたは変更を行うことができること
は明らかである。本明細書で報告した変異体以外にも、
既に組み立てられた特異的な突然変異体の中で、まだ特
性が明らかになっていないが、一層詳細な実験によって
トランス優性に抑制的であり、または多価であることが
確かめられる変異体、および前記の原理に基づき、ただ
し本明細書では具体的に説明を加えなかったそれ以外の
突然変異体もまた、この発明の範囲に包含されることは
明らかである。
【図１】 ＨＴＬＶ-Ｉ ｒｅｘのヌクレオチドおよびア
ミノ酸配列を示す図である。
ミノ酸配列を示す図である。
【図２】 Ｒｅｘ免疫沈降後のアミドゲル電気泳動分析
を示す図である。
を示す図である。
【図３】 組み立てられたＲｅｘ突然変異体を示す図で
ある。
ある。
【図４】 ｒｅｘ暗号配列を突然変異誘発するために合
成された２９種のオリゴヌクレオチド配列を示す図であ
る。
成された２９種のオリゴヌクレオチド配列を示す図であ
る。
【図５】 ＨＩＶ-１ ｒｅｖ遺伝子へ導入された突然変
異の位置を示す図である。
異の位置を示す図である。
【図６】 ｐｃＲＥＶのＤＮＡおよび対応するアミノ酸
配列を示す図である。
配列を示す図である。
【図７】 突然変異部位Ｍ１〜Ｍ１４に対応するＤＮＡ
配列を示す図である。
配列を示す図である。
【図８】 ＨＩＶ-１ ｒｅｖおよびｔａｔのトランス-
活性化因子の免疫沈降を示す図である。
活性化因子の免疫沈降を示す図である。
【図９】 ＨＩＶ-１プロウイルスの救援検定結果を示
すグラフである。
すグラフである。
【図１０】 間接免疫蛍光法によるＲｅｖおよび選ばれ
たＲｅｖ突然変異体の亜細胞位置測定を示す図である。
たＲｅｖ突然変異体の亜細胞位置測定を示す図である。
【図１１】 Ｒｅｖ突然変異体の優性な負の表現型分析
を示す図である。
を示す図である。
【図１２】 Ｒｅｖ機能の競合抑制を示す図である。
【図１３】 ＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘタンパク質のアミノ酸
配列および導入された２５ケ所の点変異の個々の位置を
示す図およびＲｅｘ応答性ｐｇＴＡＸ-ＬＴＲ発現ベク
ターの構造を示す図である。
配列および導入された２５ケ所の点変異の個々の位置を
示す図およびＲｅｘ応答性ｐｇＴＡＸ-ＬＴＲ発現ベク
ターの構造を示す図である。
【図１４】 免疫沈降およびゲル電気泳動法によって分
析したグラフである。
析したグラフである。
【図１５】 ＨＴＬＶ-ＩＥｎｖ、ＴａｘおよびＲｅｘ
タンパク質の免疫沈降による同時分析を示す図である。
タンパク質の免疫沈降による同時分析を示す図である。
【図１６】 ＨＴＬＶ-Ｉ Ｒｅｘ突然変異体の免疫蛍光
法による亜細胞的位置確認を示す図である。
法による亜細胞的位置確認を示す図である。
【図１７】 ｒｅｘ突然変異体の野生型Ｒｅｘタンパク
質機能の抑制能の分析を示す図である。
質機能の抑制能の分析を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/16 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＤ (31)優先権主張番号 ４４２６７０ (32)優先日 平成１年11月29日(1989．11．29) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 ヘルムート・バッハマイエル オーストリア国アー−2344マリア・エン ツェルスドルフ、ホーヘ・バンド・シュ トラーセ34／４番 (72)発明者 エルンスト・ベーンライン オーストリア国アー−2531ガーデン、ハ ウプトシュトラーセ91／６番 (72)発明者 ブライアン・アール・カレン アメリカ合衆国27707ノース・カロライ ナ、ダーラム、トレイル23、3636番 (72)発明者 ワーナー・シー・グリーン アメリカ合衆国27514ノース・カロライ ナ、チャペル・ヒル、アルダー・プレイ ス101番 (72)発明者 ヨアヒム・ハウベル オーストリア国アー−2344マリア・エン ツェルスドルフ、エルラウフシュトラー セ32／７番 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA A61K 35/76 A61K 38/00 ABD A61K 39/21 A61K 48/00 ADY C07K 14/16 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (12)
- 【請求項１】 ＨＩＶ−１の野生型Ｒｅｖタンパク質の
アミノ酸６８位からアミノ酸９０位の間に１個またはそ
れ以上の突然変異を含む、ＨＩＶ−１の野性型ｒｅｖ遺
伝子の表現型発現をトランス優性に抑制するタンパク
質。 - 【請求項２】 変異がミスセンスまたは欠失変異であ
る、請求項１記載のタンパク質。 - 【請求項３】 変異がミスセンス変異である、請求項２
記載のタンパク質。 - 【請求項４】 ＨＩＶ−１の野性型Ｒｅｖタンパク質の
アミノ酸７８位および７９位に変異を有する、請求項１
記載のタンパク質。 - 【請求項５】 変異がミスセンス変異である、請求項４
記載のタンパク質。 - 【請求項６】 ＨＩＶ−１の野生型Ｒｅｖタンパク質の
アミノ酸７８位にＡｓｐおよび７９位にＬｅｕを有す
る、請求項４記載のタンパク質。 - 【請求項７】 変異体ＨＩＶ−１Ｒｅｖタンパク質が第
１ドメインおよび第２ドメインを含み、当該第１ドメイ
ンは野生型ＨＩＶ−１Ｒｅｖタンパク質のアミノ酸約１
０位からアミノ酸約６８位を含み、当該第２ドメインは
野生型ＨＩＶ−１Ｒｅｖタンパク質のアミノ酸約６８位
からアミノ酸約９０位を含み、当該第２ドメインは１個
またはそれ以上の変異を含むことにより修飾されている
ものである、ＨＩＶ−１の野生型ｒｅｖ遺伝子の表現型
発現をトランス優勢に抑制する変異体ＨＩＶ−１Ｒｅｖ
タンパク質。 - 【請求項８】 変異がミスセンスまたは欠失変異であ
る、請求項７記載のタンパク質。 - 【請求項９】 変異体タンパク質Ｍ１０、Δ９／１４お
よびΔ１０／１４からなる群から選択される、請求項７
記載のタンパク質。 - 【請求項１０】 変異体タンパク質Ｍ１０である、請求
項７記載のタンパク質。 - 【請求項１１】 変異体タンパク質Ｍ１０が野生型Ｒｅ
ｖタンパク質のアミノ酸７８位にＡｓｐおよび７９位に
Ｌｅｕを有するものである、請求項１０記載のタンパク
質。 - 【請求項１２】 変異体ＨＩＶ−１Ｒｅｖタンパク質が
実質的に野生型ＨＩＶ-１Ｒｅｖタンパク質の特異的結
合機能を有する第１ドメインおよび野生型ＨＩＶ-１Ｒ
ｅｖタンパク質の活性化機能を有しない第２ドメインを
含み、当該第２ドメインは野生型ＨＩＶ−１Ｒｅｖタン
パク質のアミノ酸約６８位から約９０位を含み、該第２
ドメインは１個またはそれ以上の変異を含むことにより
修飾されているものである、ＨＩＶ−１の野生型ｒｅｖ
遺伝子の表現型発現をトランス優勢に抑制する変異体Ｈ
ＩＶ−１Ｒｅｖタンパク質。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US35687889A | 1989-05-25 | 1989-05-25 | |
| GB898915602A GB8915602D0 (en) | 1989-07-07 | 1989-07-07 | Multivalent repressor of gene function |
| GB898924396A GB8924396D0 (en) | 1989-10-30 | 1989-10-30 | Multivalent repressor of gene function |
| US44267089A | 1989-11-29 | 1989-11-29 | |
| US442670 | 1989-11-29 | ||
| US8915602 | 1989-11-29 | ||
| US8924396 | 1989-11-29 | ||
| US356878 | 1994-12-15 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10165188A JPH10165188A (ja) | 1998-06-23 |
| JP3159671B2 true JP3159671B2 (ja) | 2001-04-23 |
Family
ID=27450368
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02507933A Expired - Lifetime JP3126378B2 (ja) | 1989-05-25 | 1990-05-23 | 遺伝子機能の多価リプレッサー |
| JP31805597A Expired - Lifetime JP3159671B2 (ja) | 1989-05-25 | 1997-11-19 | 遺伝子機能の多価リプレッサー |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02507933A Expired - Lifetime JP3126378B2 (ja) | 1989-05-25 | 1990-05-23 | 遺伝子機能の多価リプレッサー |
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| JP (2) | JP3126378B2 (ja) |
| KR (1) | KR100215949B1 (ja) |
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| AU (2) | AU648256B2 (ja) |
| CA (1) | CA2032158C (ja) |
| DE (1) | DE69033829T2 (ja) |
| DK (1) | DK0406557T3 (ja) |
| ES (1) | ES2166748T3 (ja) |
| FI (1) | FI110437B (ja) |
| HU (2) | HU217091B (ja) |
| IL (1) | IL94482A (ja) |
| WO (1) | WO1990014427A2 (ja) |
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| US5534408A (en) * | 1993-09-24 | 1996-07-09 | University Of Massachusetts Medical Center | 2-deoxystreptamine aminoglycoside inhibition of HIV RRE/Rev binding |
| US5650306A (en) * | 1993-06-07 | 1997-07-22 | University Of Michigan | Recombinant nucleic acids for inhibiting HIV gene expression |
| WO1995004546A1 (en) * | 1993-08-06 | 1995-02-16 | Kai Juhani Ernst Krohn | Novel mutated human and simian immunodeficiency viruses and vaccines containing said viruses |
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| US5981258A (en) * | 1993-12-13 | 1999-11-09 | Transgene S.A. | Composition of trans-dominant variants of viral proteins for obtaining an antiviral effect |
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| CN1991365A (zh) | 1996-01-26 | 2007-07-04 | 沃尔科股份有限公司 | 根据人类hiv病毒株的表型药物敏感性控制hiv阳性病人化疗的方法 |
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| EP0914423A2 (en) * | 1996-06-06 | 1999-05-12 | Novartis AG | Inhibition of hiv-1 replication by antisense rna expression |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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