JPH04349890A - モノアセチルポリアミンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はモノアセチルポリアミン
の生化学的な合成方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ジアセチルポリアミンアミドヒドロラー
ゼは、ジアセチルポリアミンを加水分解してモノアセチ
ルポリアミンを生成する酵素で、例えば次の反応を触媒
する酵素である。

【０００３】ジアセチルプトレッシン＋Ｈ２Ｏ　　→　
　モノアセチルプトレッシン＋ＣＨ３ＣＯＯＨ従来、ジ
アセチルポリアミンに作用するアミドヒドロラーゼに関
する知見はほとんどなく、従って工業的に利用できる技
術は確立されていない。

【０００４】ところで、ジアセチルポリアミンからモノ
アセチルポリアミンを有機化学的に合成し、純粋なモノ
アセチルポリアミンを得ようとする際には、更に加水分
解が進んで、アセチル基が結合していない遊離ポリアミ
ンが大量に副成し、分離精製する操作が必要となり、煩
雑である上、収率が低いという問題点があった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記の背景から、ジア
セチルポリアミンに作用し、モノアセチルポリアミンを
生成する酵素、ジアセチルポリアミンアミドヒドロラー
ゼを見い出すことが望まれ、本発明者らが既に提案した
。しかしながら、該酵素を用いたモノアセチルポリアミ
ンの合成方法においては、作用条件によってモノアセチ
ルポリアミンの生成活性が低下したり、目的物であるモ
ノアセチルポリアミンが更に加水分解を受けて遊離ポリ
アミンとなって副生することが判明し、作用条件の選定
が実用上重要であることを見出した。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる課
題を解決すべく鋭意研究した結果、ジアセチルポリアミ
ンに作用しモノアセチルポリアミンを生成する酵素であ
るジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼ、或いはそ
の含有物を、特定ｐＨ領域下にジアセチルポリアミンに
作用させることにより、選択的にモノアセチルポリアミ
ンを製造し得ることを見い出し、本発明を完成させるに
至った。即ち、本発明は、ジアセチルポリアミンに、ア
ルカリゲネス属、キャンディダ属に属する微生物の培養
物、菌体、または菌体処理物をｐＨ５．５〜８．５の条
件下で作用させて、加水分解することを特徴とするモノ
アセチルポリアミンの製造方法である。

【０００７】本発明で使用するジアセチルポリアミンは
、公知なものが特に制限されず用いうる。特に好適に使
用されるものを具体的に例示すれば、ジアセチル−１，
２−ジアミノエタン、ジアセチル　−　１，３−ジアミ
ノプロパン、ジアセチルプトレッシン、ジアセチルカダ
ベリン、ジアセチル−１，６−ジアミノヘキサン、ジア
セチル−１，８−ジアミノオクタン、ジアセチルスペル
ミジン、ジアセチルスペルミン等が挙げられる。

【０００８】本発明で好適に用いられるジアセチルポリ
アミンアミドヒドロラーゼ生産能を有する微生物として
は、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、ま
たはキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物
があげられる。

【０００９】これらの微生物の菌株としては、例えば、
アルカリゲネス・フェカリス　　（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　ＩＦＯ　１４４７９） アルカリゲネス・フェカリス　　（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓＩＦＯ　１３１１１） アルカリゲネス・スピーシーズ　（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ　ＳＰ．　ＩＦＯ　１４１３０） キャンディダ・トロピカリス　　　（Ｃａｎｄｉｄａ　
ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ　ＩＦＯ　　０００７） キャンディダ・ギラモンジ　　　　　（Ｃａｎｄｉｄａ
　ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ　ＩＦＯ　０４５４） 等があげられる。これらの菌株のうちアルカリゲネス・
フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉ
ｓ　ＩＦＯ　１４４７９）、キャンディダ・ギラモンジ
（Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉＩＦ
Ｏ　０４５４）等が好ましく用いられる。

【００１０】上記の各微生物を培養するにあたって使用
する培地としては、公知のものが使用される。例えばグ
ルコース、糖蜜、可溶性でんぷん等の炭素源、肉エキス
、酵母エキス、ポリペプトン等の窒素源、及びリン酸第
一カリウム、リン酸第二カリウム、塩化ナトリウム、硫
酸マグネシウム等の無機塩類を含有するものであれば特
に限定されないが、これらの成分の他にジアセチルプト
レッシン、ジアセチルカダベリン等のジアセチルポリア
ミンやモノアセチルプトレッシン、モノアセチル−１，
６−ジアミノヘキサン等のモノアセチルポリアミンを含
有させることは好ましい態様である。

【００１１】ジアセチルポリアミン、又はモノアセチル
ポリアミンは最初から培地に加えておいてもよいし、培
養途中で添加してもよい。培地の形態は液体、固体のい
ずれでもよい。また培養の方法は静置培養、振トウ培養
、通気攪拌培養のいずれでもよいが、大量培養には通気
攪拌による液体培養が適している。

【００１２】培養温度は、１５〜４０℃。好ましくは２
０〜３５℃で行う。

【００１３】本発明を実施するには、上記のようにして
得られる培養液、該培養液から採取した菌体または該菌
体の処理物、例えば洗浄菌体、乾燥菌体、菌体磨砕物、
菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体抽出物、
あるいは精製酵素を、水性溶媒中ｐＨ５．５〜８．５の
条件下でジアセチルポリアミンに作用させることにより
モノアセチルポリアミンを効率良く生成させることがで
きる。

【００１４】加水分解時のｐＨが５．５より低い場合は
、モノアセチルポリアミンそのものの生成活性が極度に
低下し、モノアセチルポリアミンの合成条件として好ま
しくない。また、ｐＨが８．５より高い場合は、更に加
水分解を受けて遊離ポリアミンの生成が始まり、一旦生
成したモノアセチルポリアミンの生成量が減少すると共
に生成物中のモノアセチルポリアミンの純度が悪くなっ
て、分離精製操作が必要になる。

【００１５】また、上記菌体、粗酵素抽出液、あるいは
精製酵素を、通常用いられる菌体、酵素の固定化方法に
より固定化して用いることも可能である。

【００１６】ジアセチルポリアミンの添加濃度は約１０
ｍＭ以上で、反応を阻害しない範囲であれば特に制限は
ない。

【００１７】作用させる温度は酵素の死活しない温度で
あればよく、通常約１０〜約５０℃、好ましくは約２５
〜約４０℃である。

【００１８】培養液に、ジアセチルポリアミンを添加す
る場合は、対数増殖期または静止期に添加することが好
ましい。添加する濃度は約１０ｍＭ以上で反応を阻害し
ない濃度であればよい。

【００１９】また菌体を用いる場合は、上記培地で培養
した対数増殖期及び静止期の菌体を遠心分離により集め
、生理食塩水等で洗浄後、５０ｍＭリン酸緩衝液　　（
ｐＨ７．０）等に菌体を懸濁し、ジアセチルポリアミン
を約１０ｍＭ以上で反応を阻害しない濃度で添加すれば
よい。

【００２０】このようにして得た培養液あるいは、反応
液からのモノアセチルポリアミンの回収は、イオン交換
カラムクロマログラフィー、結晶化等の公知の方法で行
うことができる。

【００２１】以上の諸方法のうち、ジアセチルポリアミ
ンの存在下に培養して得た菌体を分離し、超音波等によ
り細胞を破砕し得られた粗酵素抽出液を硫安分画、透析
、カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過等により精製し
た酵素標品を用いるのが好ましい。このような標品の中
でアルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　ＩＦＯ　１４４７９）、および
キャンディダ・ギラモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｕｉｌ
ｌｉｅｒｍ−ｏｎｄｉｉＩＦＯ　０４５４）、が生産し
たジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを後記実施
例３、または同６に従って精製した酵素標品について以
下に具体的に示す。

【００２２】ジアセチルプトレッシン　０．２％を含む
培地にアルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓ　ｆａｅｃａ−ｌｉｓ　ＩＦＯ　１４４７９）ま
たはキャンディダ・ギラモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｕ
ｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ　ＩＦＯ　０４５４）を接種
し　２０Ｌジャーファーメンターにて　２８℃で、２４
〜４８時間培養した後、培養液から菌体を分離し、超音
波破砕機、またはダイノミルにて菌体を破砕し得られた
粗酵素抽出液を、イオン交換カラムクロマトグラフィー
、ゲル濾過、疎水性カラムクロマトグラフィー等により
精製したジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの理
化学的性質は次の通りである。

【００２３】［アルカリゲネス属由来ジアセチルポリア
ミンアミドヒドロラーゼ］ １．作用 ジアセチルポリアミンを加水分解して、モノアセチルポ
リアミンを生成する。すなわち以下の反応を触媒する。

【００２４】 　　シ゛アセチルホ゜リアミン　　＋　　Ｈ２Ｏ　　　
　→　　　　　モノアセチルホ゜リアミン　　＋　　Ｃ
Ｈ３ＣＯＯＨ 　　２．基質特異性 １０ｍＭの濃度における各基質に対する本酵素の相対活
性は、ジアセチルプトレッシンに対する活性を１００と
して表示すると表１のようになる。

【００２５】 ＊Ｎ１−アセチルスペルミジン生成 ３．至適ｐＨ：ｐＨ８．５〜９．５　　（図１）４．ｐ
Ｈ安定性 ３０℃で　３０分間保存した時、ｐＨ７．０〜９．０に
おいて９０％以上の残存活性を有する（図２）。

【００２６】５．至適温度 ｐＨ９．０、１５分間の反応において３７〜４２℃であ
る。（図３）６．温度安定性 ｐＨ７．５、３０分間の処理条件下において、５３℃ま
での温度で　９０％以上の残存活性を有し、６７℃、　
３０分間の処理で完全に失活する（図４）。

【００２７】［キャンディダ属由来ジアセチルポリアミ
ンアミドヒドロラーゼ］ １．作用 ジアセチルポリアミンを加水分解して、モノアセチルポ
リアミンを生成する。すなわち以下の反応を触媒する。

【００２８】 　　シ゛アセチルホ゜リアミン　　＋　　Ｈ２Ｏ　　→
　　　　　　　モノアセチルホ゜リアミン　　＋　　Ｃ
Ｈ３ＣＯＯＨ ２．基質特異性 １０ｍＭの濃度における各基質に対する本酵素の相対活
性は、ジアセチルプトレッシンに対する活性を１００と
して表示すると表２のようになる。

【００２９】３．至適ｐＨ：ｐＨ７．０〜８．０　（図
５）４．ｐＨ安定性 ３０℃で　３０分間保存した時、ｐＨ６．０〜１１．４
において９０％以上の残存活性を有する（図６）。

【００３０】 ＊Ｎ１−アセチルスペルミジン生成 ５．至適温度 ｐＨ７．５、１５分間の反応において３７〜４２℃であ
る。

【００３１】（図７） ６．温度安定性 ｐＨ７．５、３０分間の処理条件下において、３２℃ま
での温度で　９０％以上の残存活性を有し、５５℃、３
０分間の処理で完全に失活する（図８）。

【００３２】本発明におけるジアセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼの酵素活性測定方法及び、酵素活性の表
示方法は以下の通りである。

【００３３】［モノアセチルプトレッシン生成活性］２
０ｍＭのジアセチルプトレッシン１．０ｍｌと、アシル
ポリアミンアミドヒドロラーゼ（特公昭５９−７４３５
）６．８ユニット、プトレッシンオキシダーゼ　０．２
８ユニット、パーオキシダーゼ　０．９ユニット、２．
４−ジクロロフェノール　０．７５ｍｇ、４−アミノア
ンチピリン　０．０６ｍｇを含む　０．１Ｍトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８．０）　１．０ｍｌと、ジアシルポリア
ミンアミドヒドロラーゼを含有する被検体　５０μｌを
混合し、３０℃で　１時間反応させた後、５１０ｎｍに
おける吸光度を測定することによって行われる。

【００３４】［プトレッシン生成活性］基質として２０
ｍＭのモノアセチルプトレッシン１．０ｍｌを用いるこ
と、アシルポリアミンアミドヒドロラーゼを用いないこ
と以外は、モノアセルプトレッシン生成活性の測定方法
と全く同様にして行われる。酵素活性値は、１分間当り
　１μｍｏｌｅのモノアセチルプトレッシンまたはプト
レッシンを生成させる酵素量を　１ユニット（μｍｏｌ
ｅ／ｍｉｎ）として表示する。

【００３５】

【発明の効果】本発明により、医農薬中間体として有用
なモノアセチルポリアミンを、温和な条件で選択性及び
収率共に良く合成することができる。従って、煩雑な分
離精製操作を必要としない。また、ジアセチルポリアミ
ンに作用するアミドヒドロラーゼを工業的に利用できる
技術を提供する。

【００３６】

【実施例】実施例により本発明をさらに具体的に以下に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。

【００３７】実施例　１ ０．５％ポリペプトン、０．０１％酵母エキス、０．１
％食塩、０．０５％リン酸第一カリウム、０．１５％リ
ン酸第二カリウム、０．２％ジアセチルプトレッシン、
　　０．０２％消泡剤を含む培地（ｐＨ　７．０）０．
５Ｌを　２Ｌの三角フラスコに入れ　１２０℃で　２０
分間オートクレーブした後、アルカリゲネス・フェカリ
ス（Ａｌｃａｌｉｇ−ｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　Ｉ
ＦＯ　１４４７９）を植菌した。２８℃で　　４８時間
振とう培養を行った後、この培養液を予め上記と同様の
組成を有する培地　２０Ｌを仕込み滅菌しておいたジャ
ーファメンターに加えて本培養を行った。培養条件は　
２８℃、攪拌回転数　１００ｒｐｍ、通気　２０Ｌ／ｍ
ｉｎで４８時間培養の後培養液　０．０５ｍｌを用いて
前記の酵素活性の測定方法により、活性測定をおこなっ
た。モノアセチルプトレッシン生成活性値は、０．０５
４ユニット／ｍｌであり、３０℃　１時間、培養液　０
．０５ｍｌでモノアセチルプトレッシン０．１６μ　　
ｍｏｌｅを生成したことになる。尚、プトレッシン生成
活性は認められなかった。

【００３８】実施例　２ 実施例　１で得られた培養液を遠心分離機にかけて菌体
を採取した。得られた菌体の約２００ｇ（湿菌体重量）
を　１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ　７．５）１Ｌに懸
濁し、その懸濁液を超音波破砕機により菌体破砕を行っ
た（２２０ｗ，　　８０ｍｉｎ）。 その破砕液を遠心分離機を使用して遠心分離し、粗酵素
抽出液を得、前記の酵素活性の測定法により、活性測定
を行った。その結果、粗酵素抽出液のモノセチルプトレ
ッシン生成活性は、０．７１ユニット／ｍｌであり、３
０℃　１時間、粗酵素抽出液　０．０５ｍｌでモノアセ
チルプトレッシン　２．１μｍｏｌｅを生成したことに
なる。尚、プトレッシン生成活性は認められなかった。

【００３９】実施例　３ 実施例　２で得られた粗酵素抽出液を、予め２０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ　７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セ
ルロースカラム（６００ｍｌ）に吸着させ、食塩（０．
１〜　　０．７Ｍ）の直線濃度勾配溶出を行った。活性
画分を集め限外濾過により脱塩した後、硫酸アンモニウ
ムを　２０％となるように添加し、次いで予め　２０％
の硫酸アンモニウムを含む　２０ｍＭリン酸緩衝液　　
　（ｐＨ　７．５）で平衡したブチルトヨパール　６５
０Ｍ　　　（東ソー社製）カラム（１００ｍｌ）に吸着
させ、硫酸アンモニウム（２０〜０％）の逆濃度直線勾
配溶出を行った。活性画分を集め、限外濾過により脱塩
した後、次いでセファクリル　Ｓ−３００（ファルマシ
ア社製）カラム（１．８Ｌ）のゲル濾過を行った。活性
画分を集め、次いで予め　２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
　７．５）で平衡化した　ＥＡＨ−セファロース（ファ
ルマシア社製）カラム（４０ｍｌ）に吸着させ、食塩（
０〜０．６Ｍ）の直線濃度勾配溶出を行った。活性画分
を集め、限外濾過により脱塩した後、次いで予め　　２
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　７．５）で平衡化したＤＥ
ＡＥ−トヨパール　６５０Ｓ（東ソー社製）カラム（７
０ｍｌ）に吸着させ、食塩（０〜０．３５Ｍ）の直線濃
度勾配溶出を行った。活性画分を集め、限外濾過により
脱塩した後、硫酸アンモニウムを　１５％となるように
添加し、次いで予め　１５％の硫酸アンモニウムを含む
　２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　７．５）で平衡化した
フェニル　ー　セファロース　４Ｂ（ファルマシア社製
）カラム（１００ｍｌ）に吸着させ、硫酸アンモニウム
（１５〜０％）の逆直線濃度勾配溶出を行った。活性画
分を集め、限外濾過により脱塩を行い、タンパク質　　
３８．５ｍｇを含む精製酵素溶液３７ｍｌを得た。この
精製酵素溶液を希釈して用いた以外は、実施例　１と全
く同様にジアセチルプトレッシンの加水分解反応を行っ
た。その結果、精製酵素溶液のモノアセチルプトレッシ
ン生成活性は　１３．０ユニット／ｍｌ、比活性は、１
２．５ユニット／ｍｇ−タンパクであった。またモノア
セチルプトレッシン生成活性値より、３０℃　１時間、
精製酵素溶液　０．０５ｍｌで、モノアセチルプトレッ
シン３９μｍｏｌｅ生成したことになる。尚、プトレッ
シン生成活性は認められなかった。

【００４０】実施例　４ キャンディダ・ギラモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｕｉｌ
ｌｉｅ−ｒｍｏｎｄｉｉ　ＩＦＯ　０４５４）を植菌す
ること、培養時間が２４時間であること以外は、実施例
　１と全く同様に培養液を得、酵素活性の測定を行った
。その結果モノアセチルプトレッシン生成活性は、０．
０１１ユニット／ｍｌであり、３０℃　１時間、培養液
　０．０５ｍｌでモノアセチルプトレッシン　０．０３
３μｍｏｌｅ生成したことになる。尚、プトレッシン生
成活性は認められなかった。

【００４１】実施例　５ 実施例　４で得られた培養液を遠心分離機にかけて菌体
を採取した。

【００４２】得られた菌体の約４６０ｇ（湿菌体重量）
を　１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ　７．５）１Ｌに懸
濁し、その懸濁液をダイノミル破砕機により菌体破砕を
行った。その破砕液を遠心分離機を使用して遠心分離し
、粗酵素抽出液を得、実施例　１と同様に酵素活性の測
定を行った。その結果、粗酵素抽出液のモノセチルプト
レッシン生成活性は、０．２２ユニット／ｍｌであり、
３０℃　１時間、粗酵素抽出液　０．０５ｍｌでモノア
セチルプトレッシン　０．６６μｍｏｌｅを生成したこ
とになる。尚、プトレッシン生成活性は認められなかっ
た。

【００４３】実施例　６ 実施例　５で得られた粗酵素抽出液を予め　２０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ　７．５）で平衡化した　ＤＥＡＥ−
セルロースカラム（１．５Ｌ）に吸着させ、食塩（０〜
０．５Ｍ）の直線濃度勾配溶出を行った。活性画分を集
め限外濾過により脱塩した後、硫酸アンモニウムを　２
５％となるように添加し、次いで予め　２５％の硫酸ア
ンモニウムを含む　２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　７．
５）で平衡化したフェニル−セファロース　４Ｂ（ファ
ルマシア社製）カラム（１００ｍｌ）に吸着させ、硫酸
アンモニウム（２５〜０％）の逆濃度直線勾配溶出を行
った。活性画分を集め、限外濾過により脱塩した後、次
いでセファクリル　Ｓ−３００（ファルマシア社製）カ
ラム（１．８Ｌ）のゲル濾過を行った。活性画分を集め
、次いで予め　２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　７．５）
で平衡化した　ＥＡＨ−セファロース（ファマルシア社
製）カラム（４０ｍｌ）に吸着させ、食塩（０〜０．２
５Ｍ）の直線濃度勾配溶出を行った。 活性画分を集め、限外濾過により脱塩した後、次いで予
め　２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　７．５）で平衡化し
た　ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓ（東ソー社製）カラ
ム（１０ｍｌ）に吸着させ、食塩（０〜０．２Ｍ）の直
線勾配溶出を行った。活性画分を集め、限外濾過により
脱塩した後、次いで予め　１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
　７．５）で平衡化した、　ＤＥＡＥ−セルロースカラ
ム（２０ｍｌ）に吸着させ、食塩（０〜０．２Ｍ）の直
線濃度勾配溶出を行った。活性画分を集め、限外濾過に
より脱塩を行い、タンパク質　１．９ｍｇを含む精製酵
素溶液　７．０ｍｌを得た。この精製酵素溶液を希釈し
て用いた以外は、実施例　１と全く同様にジアセチルプ
トレッシンの加水分解反応を行った。その結果、精製酵
素溶液のモノアセチルプトレッシン生成活性は　３．６
ユニット／ｍｌ、比活性は　１３．２ユニット／ｍｇ−
タンパクであった。またモノアセチルプトレッシン生成
活性値より、３０℃　１時間、精製酵素溶液　０．０５
ｍｌで、モノアセチルプトレッシン１１μｍｏｌｅ生成
したことになる。尚、プトレッシン生成活性は認められ
なかった。

【００４４】実施例　７ 実施例２、５で得られた各菌体０．５ｇを、１０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍｌに懸濁させて菌体懸
濁液とした。これらの菌体懸濁液各０．１ｍｌを、１０
０ｍＭジアセチルプトレッシン溶液０．１ｍｌ、０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．５ｍｌ、水０．３ｍ
ｌから成る反応液にそれぞれ添加し、３０℃で３０分間
反応させた。５０％トリクロロ酢酸０．１ｍｌを添加し
て反応を停止させた後、生成したモノアセチルプトレッ
シンを高速液体クロマトグラフィーにより定量した。結
果を表３に示した。尚、プトレッシンの生成は、認めら
れなかった。

【００４５】 実施例　８ 実施例３で得られた精製酵素の、１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）による１０倍希釈液０．０５ｍｌを、１
０ｍＭのジアセチルプトレッシンまたはモノアセチルプ
トレッシンを含む０．１Ｍブリットン−ロビンソン広域
緩衝液（ｐＨ５．５、６．１、７．０、８．０、８．５
、８．８、９．１、　９．４、　９．７、１０．２、１
０．７、１１．０、１１．５）０．９５ｍｌに添加混合
し、３７℃で１５分間反応を行った。この反応液に５０
％トリクロロ酢酸水溶液０．１ｍｌを添加して反応を停
止させた後、生成したモノアセチルプトレッシンおよび
プトレッシンを高速液体クロマトグラフィーにより定量
し、それぞれの酵素活性値を算出した。以上の操作の後
最高の酵素活性を１００％とした相対活性を算出し、グ
ラフ化して図９を得た。図９から明かなように、本酵素
はｐＨ５．５〜８．５においてプトレッシン生成活性は
認められない。

【００４６】実施例　９ 基質としてジアセチルカダベリンまたはモノアセチルカ
ダベリンを用いること、０．１Ｍブリットン−ロビンソ
ン広域緩衝液のｐＨが、５．５、６．５、７．１、８．
０、８．５、９．３、１０．４、１１．２であること以
外は、実施例８と全く同様にして酵素活性を測定し、図
１０を得た。図１０から明かなように、本酵素は　ｐＨ
５．５〜８．５においてカダベリン生成活性は認められ
ない。　　実施例　１０ 基質としてジアセチル−１，６−ジアミノヘキサンまた
はモノアセチル−１，６−ジアミノヘキサンを用いるこ
と以外は、実施例９と全く同様にして酵素活性を測定し
、図１１を得た。図１１から明かなように本酵素はｐＨ
５．５〜８．５において１，６−ジアミノヘキサン生成
活性は認められない。

【００４７】実施例　１１ 実施例６で得られた精製酵素の、１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）による５倍希釈液０．０５ｍｌを用いる
こと、０．１Ｍブリットン−ロビンソン広域緩衝液のｐ
Ｈが、５．５、６．３、６．７、７．１、７．６、８．
０、８．５、９．４、９．７、１０．４、１１．０、１
１．３、１１．５、１１．７であること以外は実施例８
と全く同様にして酵素活性を測定し、図　１２を得た。 図１２から明かなように本酵素はｐＨ５．５〜８．５に
おいてプトレッシン生成活性は認められない。　　実施
例　１２ 基質としてジアセチルカダベリンまたはモノアセチルカ
ダベリンを用いること、０．１Ｍブリットン−ロビンソ
ン広域緩衝液のｐＨが、５．５、６．５、７．１、８．
０、８．５、９．３、１０．４、１１．２であること以
外は、実施例１１と全く同様にして酵素活性を測定し、
図１３を得た。図１３から明かなように、本酵素はｐＨ
５．５〜８．５においてカダベリン生成活性は認められ
ない。

【００４８】実施例　１３ 基質としてジアセチル−１，６−ジアミノヘキサンまた
はモノアセチル−１，６−ジアミノヘキサンを用いるこ
と以外は、実施例１２と全く同様にして酵素活性を測定
し、図１４を得た。図１４から明かなように本酵素はｐ
Ｈ５．５〜８．５において１，６−ジアミノヘキサン生
成活性は認められない。

【図面の簡単な説明】

【図１】アルカリゲネス属由来ジアセチルポリアミンア
ミドヒドロラーゼのｐＨ活性曲線を示す図である。

【図２】同酵素のｐＨ安定性を示す図である。

【図３】同酵素の温度活性曲線を示す図である。

【図４】同酵素の温度安定性を示す図である。

【図５】キャンディダ属由来ジアセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼのｐＨ活性曲線を示す図である。

【図６】同酵素のｐＨ安定性を示す図である。

【図７】同酵素の温度活性曲線を示す図である。

【図８】同酵素の温度安定性を示す図である。

【図９】アルカリゲネス属由来ジアセチルポリアミンア
ミドヒドロラーゼの、ｐＨ活性曲線（○：モノアセチル
プトレッシン生成活性、△：プトレッシン生成活性）を
示す図である。

【図１０】同酵素の、ｐＨ活性曲線（○：モノアセチル
カダベリン生成活性、△：カダベリン生成活性）を示す
図である。

【図１１】同酵素の、ｐＨ活性曲線（○：モノアセチル
−１，６−ジアミノヘキサン生成活性、△：１，６−ジ
アミノヘキサン生成活性）を示す図である。

【図１２】キャンディダ属由来ジアセチルポリアミンア
ミドヒドロラーゼのｐＨ活性曲線（○：モノアセチルプ
トレッシン生成活性、△：プトレッシン生成活性）を示
す図である。

【図１３】同酵素の、ｐＨ活性曲線（○：モノアセチル
カダベリン生成活性、△：カダベリン生成活性）を示す
図である。

【図１４】同酵素の、ｐＨ活性曲線（○：モノアセチル
−１，６−ジアミノヘキサン生成活性、△：１，６−ジ
アミノヘキサン生成活性）を示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ジアセチルポリアミンに、アルカリゲ
   ネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、またはキャンディ
   ダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物の培養物、菌体
   、または菌体処理物をｐＨ５．５〜８．５で作用させて
   、加水分解することを特徴とするモノアセチルポリアミ
   ンの製造方法。