JPH07322885A - シス−３−ヒドロキシ−ｌ−プロリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 医薬品原料または食品添加物として有用なシ
ス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを工業的に有利に製
造する方法および該方法に有用なＬ−プロリン３位水酸
化酵素を提供する。 【構成】 Ｌ−プロリンからシス−３−ヒドロキシ−Ｌ
−プロリンへの水酸化反応を触媒する酵素源、二価鉄イ
オンおよび２−ケトグルタル酸の存在下、培養物中もし
くは水性媒体中でＬ−プロリンをシス−３−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンに変換させ、生成したシス−３−ヒドロ
キシ−Ｌ−プロリンを、該培養物中もしくは該水性媒体
中より採取することを特徴とするシス−３−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンの製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、医薬品の合成原料また
は食品添加物として有用なシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−
プロリンを工業的に有利に製造する方法および該方法に
有用な新規Ｌ−プロリン３位水酸化酵素に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来のシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロ
リンの製造法としては、化学的に合成する方法が知られ
ている〔ジャーナル オブ ザ アメリカン ケミカル
ソサイアティ（J. Amer. Chem. Soc. ）、８４、３９
８０（１９６２）、同書、８５、２８２４（１９６
３）、ネーチャー(Nature ）、２８９、３１０（１９８
１）、ジャーナル オブ オーガニック ケミストリー
（J. Org. Chem. ）、５４、１８６６（１９８９）、ア
クタ ケミカ スカンジナビカ（Acta Chemica Scandin
avica ）、４３、２９０（１９８９）〕。

【０００３】Ｌ−プロリンを直接、位置および立体選択
的に水酸化して、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン
を製造する方法は、合成化学的方法および生物機能を利
用した方法ともに、これまで報告されていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従来の化学合成による
シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造方法は、
（１）原料が高価である、（２）反応工程が長い、
（３）分離精製工程が複雑である、（４）生産効率が低
い、などの点で工業的製造方法としては必ずしも満足で
きる方法ではなく、工業的に有利なシス−３−ヒドロキ
シ−Ｌ−プロリンの製造方法が求められている。

【０００５】本発明の目的は、発酵法によって安価な糖
源から工業的に安価に生産されているＬ−プロリンを直
接微生物的あるいは酵素的に水酸化することにより、工
業的に簡便かつ有利にシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロ
リンを製造する方法および該方法に有用なＬ−プロリン
３位水酸化酵素を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、Ｌ−プ
ロリンからシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンへの水
酸化反応を触媒する酵素源、二価鉄イオンおよび２−ケ
トグルタル酸の存在下、培養物中もしくは水性媒体中で
Ｌ−プロリンをシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに
変換させ、生成したシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンを、該培養物中もしくは該水性媒体中より採取するこ
とを特徴とするシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの
製造法および新規なＬ−プロリン３位水酸化酵素を提供
することができる。

【０００７】本発明のシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロ
リンの製造法で用いられる酵素源は、Ｌ−プロリンを水
酸化してシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成す
る反応を触媒する活性を有していれば、微生物、その培
養物、菌体、菌体処理物、精製酵素または粗酵素のいず
れでもよい。微生物の好適な例としては、ストレプトマ
イセス（Streptomyces）属、あるいはバチルス( Bacill
us）属に属する微生物があげられる。具体的には、スト
レプトマイセス カヌス（Streptomyces canus）ATCC 1
2647およびATCC 12646、ストレプトマセス エスピー
（Streptomyces sp.）ＴＨ１、バチルス エスピー（Ba
cillus sp.）ＴＨ２およびＴＨ３、あるいはこれらの菌
株の継代培養物、突然変異体もしくは誘導体などがあげ
られる。

【０００８】ストレプトマイセス エスピー（Streptom
yces sp.）ＴＨ１は本発明者らが土壌から新たに分離し
た微生物である。以下にストレプトマイセス エスピー
（Streptomyces sp.）ＴＨ１の菌学的性質を示す。 １．形態的性質 ＴＨ１株の形態的性質を第１表に示す。

【０００９】

【表１】

【００１０】２．培養的性質 ＴＨ１株は、一般に使用されている合成および天然培地
で普通もしくは旺盛な生育を示し、基生菌糸は淡桃色、
橙色あるいは緑褐色系を示す。培地により茶色あるいは
黒色系統の可溶性色素が産生されることもある。各種培
地上での２８℃、１４日間培養した時の特徴を第２−
(1)表および第２−(2)表に示す。なお、色の表示はColo
r Harmony Manual (Container Corporation of Americ
a) による色の分類に従った。

【００１１】

【表２】

【００１２】

【表３】

【００１３】３．生理学的性質 ＴＨ１株の生理学的性質を第３表に示す。生育温度範囲
は７日後の、その他は２８℃、２〜３週間後の結果を記
述する。

【００１４】

【表４】

【００１５】４．化学分類学的性質 菌体中のジアミノピメリン酸の光学異性体；ＬＬ型 以上、形態的には、気菌糸に螺旋状に１０個以上の胞子
からなる胞子鎖を形成すること、化学分類的には、細胞
壁がＩ型（ＬＬ−ジアミノピメリン酸）であることか
ら、本菌株は放線菌の中でストレプトマイセス属に分類
される。

【００１６】本菌株をストレプトマイセス・エスピー
（Streptomyces sp.）ＴＨ１と命名し、ブダペスト条約
に基づいて平成５年９月１日付けで工業技術院生命工学
工業技術研究所にFERM BP-4399として寄託した。バチル
ス エスピー（Bacillus sp.）ＴＨ２およびＴＨ３は土
壌から本発明者らが新たに分離した微生物である。以下
に両株の菌学的性質を示す。

【００１７】細胞の大きさが、ＴＨ２は１. ５〜１. ８
×３〜４μｍ、ＴＨ３は１. ２〜１. ５×３. ５〜４μ
ｍ、DNA の塩基組成（Ｇ＋Ｃmol%）がＴＨ２は３６. ４
６％、ＴＨ３は３７. ７４％である以外は２菌株ともに
以下の性質を有している。 １．形態的性質 ＴＨ２およびＴＨ３の形態的性質を第４表に示す。

【００１８】

【表５】

【００１９】２．培養的性質 ＴＨ２およびＴＨ３の培養的性質を第５表に示す。

【００２０】

【表６】

【００２１】３．生理学的性質 ＴＨ２およびＴＨ３の生理学的性質を第６−(1)表およ
び第６−(2)表に示す。

【００２２】

【表７】

【００２３】

【表８】

【００２４】４．その他の諸性質を第７表に、化学分類
学的性質を第８表に示す。

【００２５】

【表９】

【００２６】

【表１０】

【００２７】以上の菌学的性質を有する菌について、バ
ージェイのマニュアル（Bergey's Manual of Systemati
c Bacteriology, Vol. 2, １９８６年）の記載と照合し
た。以上の結果から、２菌株はいずれも、バチルス（Ba
cillus）属に属する細菌と同定し、各々、バチルス・エ
スピー（Bacillus sp.）ＴＨ２、バチルス・エスピー
（Bacillus sp.）ＴＨ３と命名し、それぞれブダペスト
条約に基づいて平成５年９月１日付けで工業技術院生命
工学工業技術研究所にFERM BP-4397およびFERMBP-4398
として寄託した。

【００２８】これらの微生物を培養する培地は、微生物
が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、
Ｌ−プロリンを水酸化してシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−
プロリンを生成する反応を触媒する活性を有する微生物
の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培
地のいずれでもよい。炭素源としては、それぞれの微生
物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラク
トース、シュークロース、これらを含有する糖蜜、デン
プンあるいはデンプン加水分解物などの炭水化物、酢
酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノ
ールなどのアルコール類が用いられる。

【００２９】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、りん酸
アンモニウムなどの各種無機酸や有機酸のアンモニウム
塩、その他含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体
およびその消化物などが用いられる。

【００３０】無機物としては、りん酸第一カリウム、り
ん酸第二カリウム、りん酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウムなどが用いられる。培養は、振盪
培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行
う。培養温度は１５〜３７℃がよく、培養時間は、通常
１６〜９６時間である。培養中ｐＨは、５. ０〜９. ０
に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、ア
ルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを
用いて行う。

【００３１】これら酵素源の反応液中における酵素活性
量は用いる基質の量などにより決定されるが、１．０〜
１０，０００，０００Ｕ／ｌ、好ましくは１，０００〜
２，０００，０００Ｕ／ｌである。微生物の菌体および
菌体処理物を用いる場合、その濃度は、通常は湿菌体で
１〜３００ｇ／ｌである。酵素活性は、下記測定条件
下、１分間に１nmolのシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロ
リンを生成する活性を１単位（Ｕ）として表示する。５
ｍＭ Ｌ−プロリン、５ｍＭ ２−ケトグルタル酸、１
ｍＭ 硫酸第一鉄および５ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸を
含有する１００ｍＭのＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７. ０）に酵
素標品を添加して合計１００μｌとし、３５℃、１０分
間反応する。反応液を１００℃、２分間加熱して反応を
停止した後に、反応液中に生成したシス−３−ヒドロキ
シ−Ｌ−プロリンを高速液体クロマトグラフィーを用い
て定量する。

【００３２】定量にはシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロ
リンを定量できる方法であればどのような方法を用いて
もよいが、例えば通常高速液体クロマトグラフィーを用
いたポストカラム誘導体化法あるいは反応液中の目的化
合物を予めＮＢＤクロライド（７−クロロ−４−ニトロ
ベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾル）を用い、ＮＢ
Ｄ誘導体化しておき、これを高速液体クロマトグラフィ
ーを用いた逆相クロマトグラフィーにかけてＮＢＤ誘導
体化物を分離後、その蛍光（励起波長 ５０３ｎｍ、蛍
光波長 ５４１ｎｍ）を用いて定量する方法（プレカラ
ム誘導体化法）などがあげられる。なおプレカラム誘導
体化法による検出は、ウィリアム Ｊ リンドブラッド
およびロバート Ｆ ディーゲルマンらの方法〔アナリ
ティカル バイオケミストリー（Analytical Biochemis
try ）、１３８、３９０、（１９８４）〕にしたがって
行う。Ｌ−プロリンからシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プ
ロリンへの水酸化反応に用いるＬ−プロリンの濃度は、
１ｍＭ〜２Ｍである。

【００３３】反応には二価鉄イオンが必要とされ、通常
１〜１００ｍＭが用いられる。二価鉄イオンとしては、
二価鉄を含み反応を阻害しないものであれば、どのよう
なものでも用いることができる。たとえば硫酸第一鉄な
どの硫化物、塩化第一鉄などの塩化物、炭酸第一鉄など
のほか、クエン酸塩、乳酸塩、フマル酸塩などのような
有機酸塩などをあげることができる。

【００３４】また反応には、２−ケトグルタル酸が必要
とされるが、反応液に２−ケトグルタル酸を添加しても
よいし、あるいは用いる菌体および菌体処理物の有する
代謝活性によって２−ケトグルタル酸に転換し得る化合
物を用いてもよい。このような化合物としては、グルコ
ースのような糖質、グルタミン酸、コハク酸などがあげ
られる。これらの化合物は単独で用いてもよいし、ある
いは複数を併用してもよい。

【００３５】水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸
塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝
液、およびメタノール、エタノールなどのアルコール
類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケト
ン類、アセトアミドなどのアミド類などの有機溶媒を含
有した水溶液があげられる。反応はＬ−プロリンを水酸
化してシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する
反応を触媒する活性を有している前記微生物の培養物中
でおこなってもよいし、該培養物から分離した菌体ある
いは該菌体の処理物あるいは精製酵素や粗酵素を用いて
水性媒体中でおこなってもよい。

【００３６】菌体処理物としては、菌体の乾燥物、凍結
乾燥物、界面活性剤および／または有機溶剤処理物、酵
素処理物、超音波処理物、機械的摩砕処理物、溶媒処理
物、菌体の蛋白分画、菌体および菌体処理物の固定化物
などがあげられる。また、該菌体より抽出した水酸化酵
素活性を有する酵素、それらの酵素の精製標品、固定化
物なども用いられる。反応は、通常、温度１５〜５０
℃、ｐＨ６. ０〜９. ０で１〜９６時間行う。必要に応
じて、菌体処理あるいは反応時に界面活性剤や有機溶剤
を添加する。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン
・ステアリルアミン（たとえば、ナイミーンＳ−２１
５、日本油脂社製など）、セチルトリメチルアンモニウ
ム・ブロマイド、カチオンＦＢ、カチオンＦ２−４０Ｅ
などのカチオン性界面活性剤、ナトリウムオレイルアミ
ド硫酸、ニューレックスＴＡＢ、ラビゾール８０などの
アニオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン
・モノステアレート（たとえば、ノニオンＳＴ２２１）
などの両性界面活性剤、その他三級アミンＰＢ、ヘキサ
デシルジメチルアミンなどがあげられ、反応を促進する
ものであればいずれでも使用できる。これらは通常０．
１〜５０mg/ml 、好ましくは１〜２０mg/ml の濃度で用
いられる。

【００３７】有機溶剤としては、トルエン、キシレン、
脂肪族アルコール、ベンゼン、酢酸エチルなどが用いら
れる。通常０．１〜５０μl/ml、好ましくは１〜２０μ
l/mlの濃度で用いられる。培養物中または水性媒体中か
らシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを回収する方法
としては、イオン交換樹脂などを用いるカラムクロマト
グラフィーあるいは晶出法など、通常の分離方法が用い
られる。回収されたシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンは¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル、¹H−ＮＭＲスペクトル、
マススペクトル、比旋光度などの通常の分析手段によっ
てその構造を確認することができる。

【００３８】次に本発明のＬ−プロリン３位水酸化酵素
の取得方法を説明する。該酵素はＬ−プロリン３位水酸
化酵素を生産する能力を有する微生物を培養し、培養物
中にＬ−プロリン３位水酸化酵素を生成蓄積させ、該培
養物からＬ−プロリン３位水酸化酵素を採取することに
より得られる。Ｌ−プロリン３位水酸化酵素を生産する
能力を有する微生物であれば、野生株でも、その継代培
養物でも、突然変異体、誘導体などいずれの微生物も用
いることができる。好適な例としては、ストレプトマイ
セス（Streptomyces）属あるいはバチルス（Bacillus）
属に属し、かつＬ−プロリン３位水酸化酵素を生産する
能力を有する微生物があげられる。具体的には前述した
ストレプトマイセス カヌス（Streptomyces canus）AT
CC 12647およびATCC 12646、ストレプトマイセエスピー
（Streptomyces sp.）ＴＨ１、バチルス エスピー（Ba
cillus sp.）ＴＨ２およびＴＨ３、あるいはこれらの菌
株の継代培養物、突然変異体もしくは誘導体などがあげ
られる。

【００３９】このような微生物を培養する培地は、微生
物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有
し、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素を生成する能力を有す
る微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培
地、合成培地のいずれでもよい。炭素源としては、それ
ぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコー
ス、フラクトース、シュークロース、これらを含有する
糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物などの炭水
化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、
プロパノールなどのアルコール類が用いられる。

【００４０】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、りん酸
アンモニウムなどの各種無機酸や有機酸のアンモニウム
塩、その他含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体
およびその消化物などが用いられる。

【００４１】無機物としては、りん酸第一カリウム、り
ん酸第二カリウム、りん酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウムなどが用いられる。培養は、振盪
培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行
う。培養温度は１５〜３７℃がよく、培養時間は、通常
１６〜９６時間である。

【００４２】培養中ｐＨは、５. ０〜９. ０に保持す
る。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶
液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行
う。培養の際、必要に応じてＬ−プロリンを添加しても
よい。

【００４３】培養液から酵素を単離精製するには、通常
の酵素の単離、精製法を用いればよい。例えば、培養液
を遠心分離して集菌した後に、超音波破砕やフレンチプ
レス、マントンガウリン、ダイノミルなどによる機械的
破砕により無細胞抽出液を得る。遠沈後の上清を、硫安
などによる塩析、DEAE（ジエチルアミノエチル）−セフ
ァロースなどの陰イオン交換クロマトグラフィー、ブチ
ルセルロース、フェニルセルロースなどの疎水性クロマ
トグラフィー、分子篩を用いたゲル濾過法、等電点電気
泳動などの電気泳動法などを行い、精製酵素標品を得
る。得られた酵素標品の理化学的特徴は、通常の酵素学
的手法により特定できる。

【００４４】このようにして得られたＬ−プロリン３位
水酸化酵素は、下記（１）〜（１１）の理化学的性質を
有する。 (1) 作用および基質特異性 ２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下、遊離
のＬ−プロリンに作用して、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ
−プロリンを生成する。 (2) 至適ｐＨ ３０℃、２０分間の反応において、ｐＨ６. ５〜７. ５
に至適ｐＨを有する。 (3) ｐＨ安定性 ４℃、２３時間の処理で、ｐＨ６. ５〜８. ０の範囲で
安定に保たれる。 (4) 至適温度 ｐＨ７. ０、１５分間の反応において、３５〜４０℃に
至適温度を有する。 (5) 温度安定性 ｐＨ７. ５、５０℃、３０分間の処理で失活する。 (6) 阻害剤 Zn⁺⁺、Cu⁺⁺、Co⁺⁺およびBa⁺⁺の金属イオンおよびＥＤＴ
Ａにより阻害を受ける。 (7) 活性化 活性化には補酵素を必要としない。反応液へのＬ−アス
コルビン酸の添加は、反応を促進する。 (8) Ｋｍ値 １００ｍＭのＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７. ０）中に５ｍＭ
Ｌ−アスコルビン酸、１ｍＭ硫酸第一鉄および酵素標品
を含有する反応液中で測定したＬ−プロリンに対するＫ
ｍ値は０. ４９ｍＭであり、２−ケトグルタル酸に対す
るＫｍ値は０.１１ｍＭである。 (9) 等電点 ファストシステム（Phast system；ファルマシア社製）
で測定した等電点が、４. ３である。 (10)分子量 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動
法による測定で、３５，０００±５，０００である。 (11)Ｎ末端アミノ酸配列 配列番号１で表されるＮ末端アミノ酸を有する。

【００４５】以下に本発明の実施例を示す。

【００４６】

【実施例】

【００４７】実施例１．シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プ
ロリンの生成 ＳＲ３培地〔グルコース １. ０％、可溶性澱粉 １.
０％、酵母エキス ０. ５％、トリプトン ０. ５％、
肉エキス ０. ３％およびりん酸マグネシウム０. ０５
％を含み、６N NaOHでｐＨ７. ２に調整した培地〕を試
験管（径２５ｍｍ × ２００ｍｍ）に１０ｍｌずつ分
注し、１２０℃、２０分間殺菌した。この培地に、ＨＴ
寒天平板培地〔可溶性澱粉 １％、ＮＺアミン ０. ２
％、酵母エキス ０. １％、肉エキス ０. １％および
寒天 １. ５％を含み、６N NaOHでｐＨ７. ２に調整
後、１２０℃、２０分間殺菌した培地〕に生育したスト
レプトマイセス エスピー（Streptomyces sp.）ＴＨ１
を一白金耳植菌し、２８℃、２日間振盪培養し、種培養
液として用いた。本種培養液を更に２リッター三角フラ
スコに分注、１２０℃、２０分間殺菌した２００ｍｌの
ＳＲ３培地に植菌し、２８℃、２日間振盪培養をした。
この培養液を、５リッタージャーファーメンターに分注
した２リッターのＤｆ３培地〔可溶性澱粉 ５％、コー
ンスティープリカー ３. ０％、りん酸一カリウム
０. ０５％、硫酸マグネシウム７水塩０. ０５％および
炭酸カルシウム ０. ５％を含み、６N NaOHでｐＨ７.
０に調整した培地〕に無菌的に接種し、７００ｒｐｍ、
１ｖｖｍ、の条件で２８℃、２日間培養した。培養中の
ｐＨは無調整で行った。得られた培養液を１５，０００
×ｇ、１０分間、４℃で遠心分離し、湿菌体を培養液１
リッター当たり７５ｇ得た。湿菌体は４℃で生理食塩水
で洗浄し、遠心後使用時まで−８０℃で凍結保存した。

【００４８】得られた湿菌体１. ０ｇを、１０ｍｌの反
応液(a) 〔５ｍＭ Ｌ−プロリン、５ｍＭ α−ケトグ
ルタル酸、５ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸および１ｍＭ
硫酸第一鉄を含有する１００ｍＭ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ
７. ５）にナイミーン溶液（ナイミーンＳ−２１５（日
本油脂株式会社製）４ｇをキシレン１０ｍｌに溶解）を
１. ４％（ｖ／ｖ）添加〕に懸濁し、３０℃、５時間反
応を行った。

【００４９】反応後、菌体反応液より菌体を遠心除去
し、上清中に生成したシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロ
リンについて分析を行った。分析は、高速液体クロマト
グラフィーでポストカラム誘導体化法を用いて、以下の
条件で分析した。検出は、目的化合物をカラム溶出後、
ライン上でＮＢＤ誘導体化し、ＮＢＤ誘導体化物の蛍光
を用いて行った。高速液体クロマトグラフィー分析条件 ［１］装置： 島津製作所製高速液体クロマトグラフィー クロマトパック CR6A システムコントローラー SCL-6B オートインジェクター SIL-6B 送液ポンプ LC-6A カラムオーブン CTO-6A 化学反応槽 CRB-6A 蛍光検出器 RF-550A ［２］使用カラム：SUMCHIRAL OA5000（株式会社住化分
析センター製）（径4.5mm × 250mm） ［３］分析条件： １）移動相 ：1mM 硫酸銅水溶液 ２）同上流速 ：1.0 ｍｌ／分 ３）カラム温度 ：３８℃ ４）緩衝液 ：0.3M 硼酸緩衝液(pH9.6) ２５ｍＭ ＥＤＴＡ ５）同上流速 ：0.2 ｍｌ／分 ６）ＮＢＤクロライド溶液：0.5g/l メタノール溶液 ７）同上流速 ：0.5 ｍｌ／分 ８）反応温度 ：６０℃ ９）反応時間 ：約３分 １０）検出波長 ：励起波長 ５０３ｎｍ 蛍光波長 ５４１ｎｍ １１）試料 ：１０μｌ その結果、反応液中に９１０μＭ（１１９ｍｇ／ｌ）の
シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが生成していた。

【００５０】実施例２．シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プ
ロリンの精製 実施例１で得られた湿菌体１００ｇを１リッターの反応
液(a) に懸濁し、２リッタービーカー中、攪拌しつつ、
３０℃、５時間、反応を行った。反応後、菌体反応液よ
り菌体を遠心除去した上清中に生成したシス−３−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリンについて分析を行った。その結
果、反応液中に８０９μＭ（１０６ｍｇ／ｌ）のシス−
３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが生成していた。

【００５１】反応液上清を、ｐＨを４．５に調整した後
に、イオン交換樹脂ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（ＮＨ₄
⁺ 型、三菱化成社製）２００ｍｌに通塔した。シス−３
−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを含む画分を減圧下濃縮
後、イオン交換樹脂ダイヤイオンPA412 （OH^- 型、三菱
化成社製）２０ｍｌに通塔した。シス−３−ヒドロキシ
−Ｌ−プロリンを含む画分を減圧濃縮後、ｐＨを９. ６
とした後に、１０％容量のo−フタルアルデヒド溶液
（０. ０７５ｇ／ｍｌエタノール溶液）および２％容量
のβ−メルカプトエタノール溶液（１０％ｖ／ｖ水溶
液）を加え、６０℃、５分間保持し、侠雑一級アミノ酸
をo −フタルアルデヒド化した。セパビーズＳＰ２０７
（三菱化成社製）１０ｍｌに通塔し、o −フタルアルデ
ヒド化した侠雑一級アミノ酸とシス−３−ヒドロキシ−
Ｌ−プロリンを分離した。シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−
プロリンを含む画分を減圧濃縮後、再度イオン交換樹脂
ダイヤイオンPA412 （OH^- 型、三菱化成社製）２０ｍｌ
に通塔し、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを含む
画分を得た。本画分を濃縮乾燥し、シス−３−ヒドロキ
シ−Ｌ−プロリンの白色結晶６８ｍｇを得た（収率６３
％）。

【００５２】上記化合物の理化学的性質は以下のとおり
である。 比旋光度：［α］_D ²¹＝−９３. ４°（ｃ＝０. ５０
３、H₂O ） FAB-マススペクトル：１３２（Ｍ＋Ｈ）^{+ 13} Ｃ−ＮＭＲスペクトル（D₂O 、１２５ＭＨｚ）ppm ：
３３. ９、４４. ５、６８. ３、７１. ６、１７１. ３¹ H−ＮＭＲスペクトル（D₂O 、５００ＭＨｚ）ppm ：
２. １８（１Ｈ）、２. ２７（１Ｈ）、３. ５２（１
Ｈ）、３. ６２（１Ｈ）、４. １８（１Ｈ）、４. ７７
（１Ｈ） 上記の比旋光度、マススペクトルによる測定分子量、¹H
−ＮＭＲスペクトル、 ¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルなどの分
析結果は、文献記載値〔ザ ジャーナル オブバイオロ
ジカル ケミストリー（J. Biol. Chem.）、２４１、１
３００（１９６６）〕〔ジャーナル オブ アンチビオ
ティックス（J. Antibiotics）、４５、８２４（１９９
２）〕および、文献記載の方法に従って合成した化学合
成シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン〔リービッヒス
アナーレン デア ケミー（Liebigs Ann. Chem.）、
１８８１、（１９７９）〕〔テトラヘドロン（Tetrahed
ron ）、４２、２４２１、（１９８６）〕と一致した。

【００５３】実施例３．シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プ
ロリンの生成 ストレプトマイセス カヌス（Streptomyces canus）AT
CC 12647およびATCC 12646、バチルス エスピー（Baci
llus sp.）ＴＨ２およびＴＨ３を用いてＬ−プロリンの
水酸化を行った。ＳＲ３培地〔グルコース １. ０％、
可溶性澱粉 １. ０％、酵母エキス ０. ５％、トリプ
トン０. ５％、肉エキス ０. ３％およびりん酸マグネ
シウム０. ０５％を含み、６N NaOHでｐＨ７. ２に調整
した培地〕を試験管（径２５ｍｍ × ２００ｍｍ）に
１０ｍｌずつ分注し、１２０℃、２０分間殺菌した。こ
の培地に、ＨＴ寒天平板培地に生育した各菌株を一白金
耳植菌し、２８℃、１日間振盪培養し、種培養液として
用いた。

【００５４】一方、Ｄｆ４培地〔グリセロール ２. ５
％、グルコース ２. ５％、、ソイビーンミール １.
５％、りん酸１カリウム ０. ０５％、硫酸マグネシウ
ム７水塩 ０. ０５％、炭酸カルシウム ０. ５％を含
み、６N NaOHでｐＨ７. ０に調整した培地〕を試験管
（径２５ｍｍ × ２００ｍｍ）に１０ｍｌずつ分注
し、１２０℃、２０分間殺菌した。この培地に、種培養
液１ｍｌを無菌的に接種し、２８℃、１日間振盪培養し
た。得られた培養液２ｍｌを、１５，０００×ｇ、１０
分間、４℃で遠心した。得られた菌体を８０ｍＭ ＴＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７.５）で洗浄後、遠心した。得られた
湿菌体を、１ｍｌの反応液(a) に懸濁し、３０℃、３時
間反応を行った。

【００５５】その結果反応液中に、各々、２４２μＭ、
２０２μＭ、３１８μＭ、１４１μＭのシス−３−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリンが生成していた。

【００５６】実施例４．シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プ
ロリンの生成 バチルス エスピー（Bacillus sp.）ＴＨ２およびＴＨ
３を、Ｄｆ４培地のかわりにＬ−プロリン１ｇ／ｌを添
加したＤｆ２培地〔可溶性澱粉 ５％、乾燥酵母 １.
５％、りん酸１カリウム ０. ０５％、硫酸マグネシウ
ム７水塩 ０.０５％、炭酸カルシウム ０. ５％を含
み、６N NaOHでｐＨ７. ０に調整した培地〕を用いて、
実施例３と同様に、種培養１日、Ｄｆ２培地で１日培養
を行った。その結果培養液上清中にＴＨ２株で７４５μ
Ｍ（９７. ６ｍｇ／ｌ）、ＴＨ３株で３２７μＭ（４
２. ８ｍｇ／ｌ）のシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ンが生成していた。

【００５７】実施例５ Ｌ−プロリン３位水酸化酵素の
単離精製 (1) 無細胞抽出液の調製 実施例２で得た凍結菌体３０ｇを溶解後、２００ｍｌの
緩衝液(A) 〔１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、
０. ２ｍＭ EDTA 、０. １％（ｖ／ｖ）ツイーン２０
（Tween 20）および１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含
む２０ｍＭピペラジン緩衝液（６Ｎ ＨＣｌでｐＨを
５. ３に調整）〕に氷冷下懸濁した。懸濁液中の菌体
を、氷冷下超音波破砕し、４℃、３０，０００×ｇ、３
０分間遠心後、上清を得た。これ以降の操作は全て氷冷
下ないしは４℃で行った。 (2) カラムクロマトグラフィーによる単離および精製 (2)-1.酸処理 前記工程で得た上清のｐＨを６Ｎ塩酸で４. ５に調整
後、生じた沈殿を１５、０００ｇ、３０分間遠心除去
し、上清を得た。

【００５８】(2)-2.リソースＱカラムクロマトグラフィ
ー(I) 前記工程で得た上清を、緩衝液(A) で平衡化したファル
マシア社製のリソースＱカラム（RESOURCE^TM Q, 6ml ）
に通塔した。緩衝液(A) で洗浄後、該酵素を含む画分を
緩衝液(A) 中に作成した０から０. ３Ｍ間での食塩の直
線濃度勾配を用いて溶出した。

【００５９】(2)-3.リソースＱカラムクロマトグラフィ
ー(II) 前記工程で得た活性画分を、緩衝液(B) 〔１ｍＭ ＤＴ
Ｔ、０. ２ｍＭ EDTAおよび１０％（ｖ／ｖ）グリセロ
ールを含む２０ｍＭ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨを７. ５に調
整）〕で３倍に希釈後、緩衝液(B) で平衡化したファル
マシア社製のリソースＱカラム（RESOURCE^TM Q, 1ml ）
に通塔した。緩衝液(B) で洗浄後、該酵素を含む画分を
緩衝液(B) 中に作成した０から０. ３Ｍ間での食塩の直
線濃度勾配を用いて溶出した。

【００６０】(2)-4.フェニルセファロースクロマトグラ
フィー 前記工程で得た活性画分に、食塩を２Ｍになるように添
加溶解し、２Ｍ食塩を含む緩衝液(B) で平衡化したフェ
ニルセファロースカラム（Phenyl Sepharose HP HiLoa
d, 1ml ）に通塔した。２Ｍ食塩を含む緩衝液(B) で洗
浄後、該酵素を含む画分を、０. １％（ｖ／ｖ）ツイー
ン２０（Tween 20）を含む緩衝液(B) を用いて溶出し
た。

【００６１】(2)-5.リソースＱカラムクロマトグラフィ
ー(III) 前記工程で得た活性画分を緩衝液(A) で平衡化したファ
ルマシア社製ＰＤ−１０カラムを用いて脱塩後、緩衝液
(A) で平衡化したファルマシア社製のリソースＱカラム
（RESOURCE^TM Q, 1ml ）に通塔した。緩衝液(A) で洗浄
後、該酵素を含む画分を緩衝液(A) 中に作成した０から
０. ３Ｍ間での食塩の直線濃度勾配を用いて溶出した。

【００６２】(2)-6.リソースＱカラムクロマトグラフィ
ー(IV) 前記工程で得た活性画分を、０. １％（ｖ／ｖ）ツイー
ン２０（Tween 20）を含む緩衝液(B) で３倍に希釈後、
緩衝液(B) で平衡化したファルマシア社製のリソースＱ
カラム（RESOURCE^TM Q, 1ml ）に通塔した。緩衝液(B)
で洗浄後、該酵素を含む画分を緩衝液(B) 中に作成した
０から０. ３Ｍ間での食塩の直線濃度勾配を用いて溶出
した。Ｌ−プロリン３位水酸化酵素の単離および精製の
概要を第９表にまとめた。

【００６３】

【表１１】

【００６４】実施例６．Ｌ−プロリン３位水酸化酵素の
性質 (1) 電気泳動による分析 実施例５で得られた精製酵素標品を、ドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミド電気泳動法（ATTO社製ポリ
アクリルアミドPAGEL NPU-12.5Lおよびバイオラッド社
製分子量スタンダードSDS-PAGE Molecular Weight Stan
dard Broad Rangeを使用）によって分析した。その結果
本酵素は分子量約３５，０００±５，０００のほぼ均一
なサブユニットからなることが明かとなった。 (2) 酵素反応に関する性質 以下の反応液を用いて、反応成分の基質省略テスト（オ
ミッションテスト）および添加物テストを行うことによ
り、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素反応の必須化合物、促
進化合物、阻害化合物の検討を行った。

【００６５】基本となる反応液組成は、５ｍＭ Ｌ−プ
ロリン、５ｍＭ ２−ケトグルタル酸、１ｍＭ 硫酸第
一鉄、５ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸および酵素標品を含
有する１００ｍＭのＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７. ０）で、液
量は合計１００μｌとした。反応は酵素の添加によって
開始し、３５℃、１０分間反応する。反応液を１００
℃、２分間加熱して反応を停止した後に、反応液中に生
成したシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンをプレカラ
ム誘導体化法によって高速液体クロマトグラフィーを用
いて定量した。反応液１００μｌに０. ３Ｍ硼酸緩衝液
（ｐＨ１０. ７）１００μｌ、１０％（ｖ／ｖ）メルカ
プトエタノール水溶液４μｌおよび５％（ｗ／ｖ）o −
フタルアルデヒドのエタノール溶液１６μｌを添加し６
０℃、３０秒間放置した。更に２％（ｗ／ｖ）ＮＢＤク
ロライドのエタノール溶液５０μｌを加え、６０℃、４
０分間反応した。１Ｎ塩酸３０μｌを加えて反応を停止
後、沈殿を遠心およびフィルター濾過により除去した
後、高速液体クロマトグラフィーにより分析を行い、生
成したシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを定量し
た。高速液体クロマトグラフィーは、以下の条件で行っ
た。 移動相：１０ｍＭクエン酸（ｐＨ４. ０）／メタノール
＝３／１（ｖ／ｖ） 流速：１ｍｌ／分 カラム：YMC Pack ODS AQ-312 （ＹＭＣ社性、６×１５
０ｍｍ） カラム温度：５０℃ 検出：蛍光検出、励起波長５０３ｎｍ、蛍光波長５４１
ｎｍ その結果、Ｌ−プロリン３位水酸化酵素反応にはＬ−プ
ロリン、２−ケトグルタル酸、Fe⁺⁺イオンが必須であ
り、Ｌ−アスコルビン酸は反応を促進、またZn⁺⁺、C
u⁺⁺、Co⁺⁺およびBa⁺⁺イオンおよびEDTAの添加は反応を
阻害した。結果を第１０表に示す。

【００６６】

【表１２】

【００６７】(3) 至適ｐＨ Ｌ−プロリン３位水酸化酵素の活性測定法において、反
応液中の緩衝液成分を、ｐＨ５. ５〜６. ０はMES 〔２
−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸〕緩衝液、ｐＨ
６. ５〜７. ５はPIPES 〔ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス
（２−エタンスルホン酸〕緩衝液、ｐＨ７. ０〜８. ０
はＴＥＳ緩衝液、ｐＨ８. ０〜９. ０はTAPS〔Ｎ−トリ
ス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンス
ルホン酸〕緩衝液に置換え反応を行った結果、ｐＨ６.
５〜７. ５で最高活性の８０％以上の活性を示した。結
果を第１１表に示す。

【００６８】

【表１３】

【００６９】(4) ｐＨ安定性 緩衝液(B) 中の本酵素液を１００ｍＭ緩衝液〔ｐＨ５.
５〜６. ５はMES 緩衝液、ｐＨ６. １〜７. ５はPIPES
緩衝液、ｐＨ７. ０〜８. ０はＴＥＳ緩衝液、ｐＨ８.
０〜９. ０はTAPS緩衝液〕で３倍に希釈し、４℃、２３
時間保持した後、活性を測定した。ｐＨ６. ５〜８. ０
の範囲で保持した酵素は保持前の活性の８０％以上の活
性を有しており、ｐＨ６. ５〜８. ０の範囲で活性は安
定に保たれた。 (5) 至適温度 Ｌ−プロリン３位水酸化酵素の活性測定において、１５
〜５０℃の温度範囲で１５分間反応を行った結果、３５
〜４０℃で最高活性の８０％以上の活性を示した。結果
を第１２表に示す。

【００７０】

【表１４】

【００７１】(6) 温度安定性 本酵素を緩衝液(B) 中で、０〜６０℃の温度範囲で３０
分間保持した後、活性測定を行った結果、本酵素は５０
℃、３０分間の処理で完全に失活した。 (7) Ｋｍ値 １００ｍＭ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７. ０）、１ｍＭ 硫
酸第一鉄、５ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸および酵素表品
を含有する反応液中で測定したＬ−プロリンに対するＫ
ｍ値は０. ４９ｍＭ、２−ケトグルタル酸に対するＫｍ
値は０. １１ｍＭであった。 (8) 等電点 ファストシステム（Phast system；ファルマシア社製）
で等電点を測定した結果、等電点は４. ３であった。 (9) Ｎ末端アミノ酸配列 Protein sequencer model PPSQ-10 （島津製作所社製）
を用いて本酵素蛋白のＮ末端アミノ酸配列を分析した結
果、以下の結果を得た。

【００７２】

【化１】

【００７３】実施例７．Ｌ−プロリンの水酸化 実施例５で取得した精製酵素標品を用いて、Ｌ−プロリ
ンの水酸化を行った。２０ｍＭ ２−ケトグルタル酸、
２０ｍＭ Ｌ−プロリン、５ｍＭ Ｌ−アスコルビン
酸、１ｍＭ硫酸第一鉄および１０６Ｕの精製酵素標品を
含有する２００ｍＭ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７. ０）１０
０μｌを用いて、３５℃、３０分間反応を行った。その
結果反応液中には、１８ｍＭ（２. ４ｇ／ｌ）のシス−
３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが生成した。

【００７４】

【配列表】

【００７５】配列番号：１ 配列の長さ：２９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：ストレプトマイセス エスピー（Streptomyces
sp.） 株名：TH1 (FERM BP-4399) 配列 Met Cys Ser His Ile Leu Gly Arg Ile Glu Leu Asp Gln Glu Arg Leu Gly 1 5 10 15 Arg Asp Leu Glu Tyr Leu Ala Thr Val Pro Thr Val 20 25

【００７６】

【発明の効果】本発明によれば、発酵法によって糖源か
ら工業的に生産されているＬ−プロリンを直接微生物的
あるいは酵素的に水酸化することにより、工業的に有利
にシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを製造する方法
および該方法に有用な新規Ｌ−プロリン３位水酸化酵素
を提供することができる。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年１２月５日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項５

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項６

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００７２】

【化１】

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００７５】配列番号：１ 配列の長さ：２９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：ストレプトマイセス エスピー（Streptomyces
sp.） 株名：TH1 (FERM BP-4399) 配列 Met Arg Ser His Ile Leu Gly Arg Ile Glu Leu Asp Gln Glu Arg Leu Gly 1 5 10 15 Arg Asp Leu Glu Tyr Leu Ala Thr Val Pro Thr Val 20 25

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 千葉 繁 神奈川県川崎市麻生区王禅寺2625−202 (72)発明者 宇於崎 洋一 東京都町田市中町３−９−11

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｌ−プロリンの３位の位置でＬ−プロリ
   ンを水酸化する反応を触媒する酵素源、二価鉄イオン、
   ２−ケトグルタル酸およびＬ−プロリンを水性媒体中に
   存在せしめ、Ｌ−プロリンをシス−３−ヒドロキシ−Ｌ
   −プロリンに変換させ、生成したシス−３−ヒドロキシ
   −Ｌ−プロリンを、該水性媒体中より採取することを特
   徴とするシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの製造
   法。
2. 【請求項２】 酵素源が、ストレプトマイセス（Strept
   omyces）属あるいはバチルス（Bacillus）属に属する微
   生物である請求項１記載の製造法。
3. 【請求項３】 酵素源が、微生物の培養物、菌体、菌体
   処理物、精製酵素または粗酵素である請求項２記載の製
   造法。
4. 【請求項４】 Ｌ−プロリンからシス−３−ヒドロキシ
   −Ｌ−プロリンへの変換を、微生物の培養液中で行うこ
   とを特徴とした請求項２記載の製造法。
5. 【請求項５】 酵素源が、下記(1) 〜(11)の理化学的性
   質を示すＬ−プロリン３位水酸化酵素である請求項１記
   載の製造法。 (1) 作用および基質特異性 ２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下、遊離
   のＬ−プロリンに作用して、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ
   −プロリンを生成する。 (2) 至適ｐＨ ３０℃、２０分間の反応において、ｐＨ６. ５〜７. ５
   に至適ｐＨを有する。 (3) ｐＨ安定性 ４℃、２３時間の処理で、ｐＨ６. ５〜８. ０の範囲で
   安定に保たれる。 (4) 至適温度 ｐＨ７. ０、１５分間の反応において、３５〜４０℃に
   至適温度を有する。 (5) 温度安定性 ｐＨ７. ５、５０℃、３０分間の処理で失活する。 (6) 阻害剤 Zn⁺⁺、Cu⁺⁺、Co⁺⁺およびBa⁺⁺の金属イオンおよびエチレ
   ンジアミンテトラ酢酸により阻害を受ける。 (7) 活性化 活性化には補酵素を必要としない。反応液へのＬ−アス
   コルビン酸の添加は、反応を促進する。 (8) Ｋｍ値 １００ｍＭのＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−
   ２−アミノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ７. ０）中に
   ５ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸、１ｍＭ硫酸第一鉄および
   酵素標品を含有する反応液中で測定したＬ−プロリンに
   対するＫｍ値は０. ４９ｍＭであり、２−ケトグルタル
   酸に対するＫｍ値は０. １１ｍＭである。 (9) 等電点 ファストシステム（Phast system；ファルマシア社製）
   で測定した等電点が、４. ３である。 (10)分子量 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動
   法による測定で、３５，０００±５，０００である。 (11)Ｎ末端アミノ酸配列 配列番号１で表されるＮ末端配列を有する。
6. 【請求項６】 下記(1) 〜(11)の理化学的性質を示すＬ
   −プロリン３位水酸化酵素。 (1) 作用および基質特異性 ２−ケトグルタル酸および２価鉄イオンの存在下、遊離
   のＬ−プロリンに作用して、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ
   −プロリンを生成する。 (2) 至適ｐＨ ３０℃、２０分間の反応において、ｐＨ６. ５〜７. ５
   に至適ｐＨを有する。 (3) ｐＨ安定性 ４℃、２３時間の処理で、ｐＨ６. ５〜８. ０の範囲で
   安定に保たれる。 (4) 至適温度 ｐＨ７. ０、１５分間の反応において、３５〜４０℃に
   至適温度を有する。 (5) 温度安定性 ｐＨ７. ５、５０℃、３０分間の処理で失活する。 (6) 阻害剤 Zn⁺⁺、Cu⁺⁺、Co⁺⁺およびBa⁺⁺の金属イオンおよびエチレ
   ンジアミンテトラ酢酸により阻害を受ける。 (7) 活性化 活性化には補酵素を必要としない。反応液へのＬ−アス
   コルビン酸の添加は、反応を促進する。 (8) Ｋｍ値 １００ｍＭのＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−
   ２−アミノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ７. ０）中に
   ５ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸、１ｍＭ 硫酸第一鉄およ
   び酵素標品を含有する反応液中で測定したＬ−プロリン
   に対するＫｍ値は０. ４９ｍＭであり、２−ケトグルタ
   ル酸に対するＫｍ値は０. １１ｍＭである。 (9) 等電点 ファストシステム（Phast system；ファルマシア社製）
   で測定した等電点が、４. ３である。 (10)分子量 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動
   法による測定で、３５，０００±５，０００である。 (11)Ｎ末端アミノ酸配列 配列番号１で表されるＮ末端配列を有する。
7. 【請求項７】 ストレプトマイセス（Streptomyces）属
   に属し、かつＬ−プロリン３位水酸化酵素を生産する能
   力を有する微生物を培養し、培養物中にＬ−プロリン３
   位水酸化酵素を生成蓄積させ、該培養物からＬ−プロリ
   ン３位水酸化酵素を採取することを特徴とするＬ−プロ
   リン３位水酸化酵素の製造法。