JPH0898683A - 7−アミノセファロスポラン酸エステラーゼ - Google Patents
7−アミノセファロスポラン酸エステラーゼInfo
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- JPH0898683A JPH0898683A JP23867694A JP23867694A JPH0898683A JP H0898683 A JPH0898683 A JP H0898683A JP 23867694 A JP23867694 A JP 23867694A JP 23867694 A JP23867694 A JP 23867694A JP H0898683 A JPH0898683 A JP H0898683A
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Abstract
(57)【要約】 (修正有)
【目的】セファロスポリン系抗生物質製造における有用
な中間体であるデアセチルセファロスポラン酸誘導体を
セファロスポラン酸誘導体から製造する際に使用する7
−アミノセファロスポラン酸エステラーゼに関する。 【構成】下記の理化学的性質を有する新規7−アミノセ
ファロスポラン酸エステラーゼ。酵素作用;7−アミ
ノセファロスポラン酸(7−ACA)または7−アシル
−ACAのアセチル基を加水分解する反応を触媒する、
基質特異性;酢酸プロピル、酢酸ブチル、セファロス
ポリンC、7−ACA、7−クロロアセチル−ACA、
7−ベンジルオキシカルボニル−ACA等に作用する、
分子量;141kDa(ゲル濾過法)、サブユニット
の分子量;82kDa(SDS−PAGE)、至適p
H;5.5、安定pH範囲;5.5〜7.0、至適温
度;30〜35℃、安定温度;pH7.0で15分処理
では20℃まで安定。
な中間体であるデアセチルセファロスポラン酸誘導体を
セファロスポラン酸誘導体から製造する際に使用する7
−アミノセファロスポラン酸エステラーゼに関する。 【構成】下記の理化学的性質を有する新規7−アミノセ
ファロスポラン酸エステラーゼ。酵素作用;7−アミ
ノセファロスポラン酸(7−ACA)または7−アシル
−ACAのアセチル基を加水分解する反応を触媒する、
基質特異性;酢酸プロピル、酢酸ブチル、セファロス
ポリンC、7−ACA、7−クロロアセチル−ACA、
7−ベンジルオキシカルボニル−ACA等に作用する、
分子量;141kDa(ゲル濾過法)、サブユニット
の分子量;82kDa(SDS−PAGE)、至適p
H;5.5、安定pH範囲;5.5〜7.0、至適温
度;30〜35℃、安定温度;pH7.0で15分処理
では20℃まで安定。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、セファロスポリン系抗
生物質製造における有用な中間体であるデアセチルセフ
ァロスポラン酸誘導体をセファロスポラン酸誘導体から
製造する際に使用する7−アミノセファロスポラン酸エ
ステラーゼに関する。
生物質製造における有用な中間体であるデアセチルセフ
ァロスポラン酸誘導体をセファロスポラン酸誘導体から
製造する際に使用する7−アミノセファロスポラン酸エ
ステラーゼに関する。
【0002】
【従来の技術】セファロスポラン酸誘導体から3位のア
セトキシメチル基のアセチル基を脱離させてデアセチル
セファロスポラン酸誘導体を製造する方法としては、化
学的手法よりも酵素法が経済的に有利であることが知ら
れており、種々の方法が知られている(特開昭49−1
32294、特開昭59−108790、特公昭54−
43598、特公昭56−46839、特公昭61−1
1600、特開昭61−67489、特公平1−471
58号公報等)。
セトキシメチル基のアセチル基を脱離させてデアセチル
セファロスポラン酸誘導体を製造する方法としては、化
学的手法よりも酵素法が経済的に有利であることが知ら
れており、種々の方法が知られている(特開昭49−1
32294、特開昭59−108790、特公昭54−
43598、特公昭56−46839、特公昭61−1
1600、特開昭61−67489、特公平1−471
58号公報等)。
【0003】上記酵素法に使用される酵素は、セファロ
スポリンCデアセチラーゼまたは7−アミノセファロス
ポラン酸エステラーゼ等と呼ばれており、本酵素自体に
ついては,バチルス属由来のセファロスポリンCデアセ
チラーゼとして、WRRL−B−558・デアセチラー
ゼ;Appl.Microbiol.,30(3),4
13(1975)〔文献A〕、ATCC6633・デア
セチラーゼ;Biochim.Biophys.Act
a,485,367(1977)〔文献B〕、SHS−
0133・デアセチラーゼ;J.Ferment.Bi
oeng.,77,17(1994)〔文献C〕が、オ
ーレオバシディウム属由来のセファロスポリンCデアセ
チラーゼとして、4466−I・アセチルエステラー
ゼ;特公平2−51594号公報〔文献D〕および44
66−II・アセチルエステラーゼ;特公平2−515
94号公報〔文献E〕等が報告されている。
スポリンCデアセチラーゼまたは7−アミノセファロス
ポラン酸エステラーゼ等と呼ばれており、本酵素自体に
ついては,バチルス属由来のセファロスポリンCデアセ
チラーゼとして、WRRL−B−558・デアセチラー
ゼ;Appl.Microbiol.,30(3),4
13(1975)〔文献A〕、ATCC6633・デア
セチラーゼ;Biochim.Biophys.Act
a,485,367(1977)〔文献B〕、SHS−
0133・デアセチラーゼ;J.Ferment.Bi
oeng.,77,17(1994)〔文献C〕が、オ
ーレオバシディウム属由来のセファロスポリンCデアセ
チラーゼとして、4466−I・アセチルエステラー
ゼ;特公平2−51594号公報〔文献D〕および44
66−II・アセチルエステラーゼ;特公平2−515
94号公報〔文献E〕等が報告されている。
【0004】また、N末アミノ酸配列および部分アミノ
酸配列で示されるセファロスポリンCデアセチラーゼも
報告されている(特開平4−228079号公報)。
酸配列で示されるセファロスポリンCデアセチラーゼも
報告されている(特開平4−228079号公報)。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】従来のセファロスポリ
ンCデアセチラーゼ(Cecデアセチラーゼ)または7
−アミノセファロスポラン酸エステラーゼ(7−ACA
エステラーゼ)は、セファロスポラン酸誘導体からデア
セチルセファロスポラン酸誘導体への変換に使用する
と、酵素反応に長時間を要したり、Km値が大きいため
に反応収率を100%とすることが困難であった。従っ
て、CeCデアセチラーゼとして、比活性(Vmax
値)が高く、Km値の低い特性を有する酵素の出現が、
工業化に有利なために求められていた。
ンCデアセチラーゼ(Cecデアセチラーゼ)または7
−アミノセファロスポラン酸エステラーゼ(7−ACA
エステラーゼ)は、セファロスポラン酸誘導体からデア
セチルセファロスポラン酸誘導体への変換に使用する
と、酵素反応に長時間を要したり、Km値が大きいため
に反応収率を100%とすることが困難であった。従っ
て、CeCデアセチラーゼとして、比活性(Vmax
値)が高く、Km値の低い特性を有する酵素の出現が、
工業化に有利なために求められていた。
【0006】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
上記の問題を解決すべく、種々研究を続けた結果、本発
明者が土壌より分離したロドトルラ属に属する微生物に
より産生される7−ACAエステラーゼが、一般式
(3)
上記の問題を解決すべく、種々研究を続けた結果、本発
明者が土壌より分離したロドトルラ属に属する微生物に
より産生される7−ACAエステラーゼが、一般式
(3)
【0007】
【化4】 (式中、R1 は水素原子、D−5−アミノ−5−カルボ
キシバレリル、クロロアセチルまたはベンジルオキシカ
ルボニル基を示す)で表される7−アミノセファロスポ
ラン酸誘導体〔以下、単に「7−ACA誘導体(3)」
と称する〕を非常に反応収率良く一般式(4)
キシバレリル、クロロアセチルまたはベンジルオキシカ
ルボニル基を示す)で表される7−アミノセファロスポ
ラン酸誘導体〔以下、単に「7−ACA誘導体(3)」
と称する〕を非常に反応収率良く一般式(4)
【0008】
【化5】 (式中、R1 は前記と同じ意味を有する)で表されるデ
アセチル−7−アミノセファロスポラン酸誘導体〔以
下、単に「D−7−ACA誘導体(4)」と称する〕に
変換することを見い出し、本発明を完成したものであ
る。
アセチル−7−アミノセファロスポラン酸誘導体〔以
下、単に「D−7−ACA誘導体(4)」と称する〕に
変換することを見い出し、本発明を完成したものであ
る。
【0009】すなわち、本発明は、下記の理化学的性質
を有する7−ACAエステラーゼ〔以下、単に「本酵
素」と称することがある〕を提供することを目的とする
ものである。 酵素作用 少なくとも、一般式(1)
を有する7−ACAエステラーゼ〔以下、単に「本酵
素」と称することがある〕を提供することを目的とする
ものである。 酵素作用 少なくとも、一般式(1)
【化6】 (式中、Rは水素原子またはアシル基を示す)で表され
る7−アミノセファロスポラン酸誘導体〔以下、単に
「7−ACA誘導体(1)」と称する〕を一般式(2)
る7−アミノセファロスポラン酸誘導体〔以下、単に
「7−ACA誘導体(1)」と称する〕を一般式(2)
【化7】 (式中、Rは前記と同じ意味を有する)で表されるデア
セチル−7−アミノセファロスポラン酸誘導体〔以下、
単に「D−7−ACA誘導体(2)」と称する〕と酢酸
に加水分解する反応を触媒する。
セチル−7−アミノセファロスポラン酸誘導体〔以下、
単に「D−7−ACA誘導体(2)」と称する〕と酢酸
に加水分解する反応を触媒する。
【0010】 基質特異性 少なくとも、酢酸プロピル、酢酸ブチル等の酢酸低級ア
ルキルエステルおよび7−ACA誘導体(3)に作用す
る。特に、セファロスポリンC(CeC)、7−クロロ
アセチルアミノ−セファロスポラン酸(7−CAAC
A)、7−アミノセファロスポラン酸(7−ACA)お
よび酢酸ブチルに強く作用する。
ルキルエステルおよび7−ACA誘導体(3)に作用す
る。特に、セファロスポリンC(CeC)、7−クロロ
アセチルアミノ−セファロスポラン酸(7−CAAC
A)、7−アミノセファロスポラン酸(7−ACA)お
よび酢酸ブチルに強く作用する。
【0011】 分子量 分子量は141kDaである(ゲル濾過法)。サブユニ
ットの分子量は82kDaである(SDS−PAG
E)。 至適pHおよび安定pH範囲 至適pHは5.5である。pH5.5〜7.0が安定p
H領域である。 至適温度および安定温度 至適温度は30〜35℃である。pH7.0で15分処
理においては、20℃まで安定である。
ットの分子量は82kDaである(SDS−PAG
E)。 至適pHおよび安定pH範囲 至適pHは5.5である。pH5.5〜7.0が安定p
H領域である。 至適温度および安定温度 至適温度は30〜35℃である。pH7.0で15分処
理においては、20℃まで安定である。
【0012】 阻害 Cu2+、Hg2+、(p−アミジノフェニル)メタンスル
ホニルフルオライド、硫酸エセリン等で阻害される。 糖含量 20%以上の混成型糖鎖を含む。
ホニルフルオライド、硫酸エセリン等で阻害される。 糖含量 20%以上の混成型糖鎖を含む。
【0013】 N末アミノ酸配列 Thr−Asn−Pro−Asn−Glu−Pro−P
ro−Pro−Val−Val−Asp−Leu−Gl
y−Tyr−Ala−
ro−Pro−Val−Val−Asp−Leu−Gl
y−Tyr−Ala−
【0014】 部分アミノ酸配列 少なくとも次に示す4種類のアミノ酸配列を含む。 (a)Ala−Phe−Gly−Leu−X−Ala (式中、Xは未同定アミノ酸を示す) (b)Gly−Phe−Ile−Phe−Thr−As
p−Ala
p−Ala
【0015】(c)Ala−Val−Asp−Ala−
Ala−Ala−Leu−Ala−Ala−Ala−G
ly−Val−Leu−Asn−Ser−Ala−Al
a−Phe (d)Thr−Ser−Ser−Leu−Thr−As
p−Phe−Gly−Thr−Ser−Gln−Ile
−Thr−Ile−Ile−Asp−Phe−Trp−
Arg−Gly−Gly−Ile
Ala−Ala−Leu−Ala−Ala−Ala−G
ly−Val−Leu−Asn−Ser−Ala−Al
a−Phe (d)Thr−Ser−Ser−Leu−Thr−As
p−Phe−Gly−Thr−Ser−Gln−Ile
−Thr−Ile−Ile−Asp−Phe−Trp−
Arg−Gly−Gly−Ile
【0016】本発明の7−ACAエステラーゼ生産菌は
ロドトルラ属に属するが、例えば、本発明者が京都府の
土壌から分離したロドトルラ・グルチニス(Rhodo
torula glutinis)38B1は、本発明
に最も有効に使用される菌株の一例であって、本菌株は
微工研菌寄第13039号として微生物工業技術研究所
に寄託されており,その菌学的性質は特開平6−125
785号公報に記載されている。
ロドトルラ属に属するが、例えば、本発明者が京都府の
土壌から分離したロドトルラ・グルチニス(Rhodo
torula glutinis)38B1は、本発明
に最も有効に使用される菌株の一例であって、本菌株は
微工研菌寄第13039号として微生物工業技術研究所
に寄託されており,その菌学的性質は特開平6−125
785号公報に記載されている。
【0017】本発明においては、先ずロドトルラ属に属
する7−ACAエステラーゼ生産菌が適当な培地に培養
される。上記の7−ACAエステラーゼ生産菌として
は、前述のロドトルラ・グルチニス38B1が挙げられ
るが、微生物の一般的性状として菌学上の性質は変異し
得るものであるから、自然的にあるいは通常行われる人
工的変異手段により変異し得る人工変異株は勿論、自然
変異株も含め、ロドトルラ属に属し、本酵素を生産する
能力を有する菌株は、すべて本発明に使用することがで
きる。
する7−ACAエステラーゼ生産菌が適当な培地に培養
される。上記の7−ACAエステラーゼ生産菌として
は、前述のロドトルラ・グルチニス38B1が挙げられ
るが、微生物の一般的性状として菌学上の性質は変異し
得るものであるから、自然的にあるいは通常行われる人
工的変異手段により変異し得る人工変異株は勿論、自然
変異株も含め、ロドトルラ属に属し、本酵素を生産する
能力を有する菌株は、すべて本発明に使用することがで
きる。
【0018】上記の培養は、酵母の培養に一般に使用さ
れる公知の培養方法に準じて行うことができる。使用す
る培地は、一般酵母の栄養源として公知のものが利用で
き、例えば、グルコース、シュークロース、マルトー
ス、エタノール、酢酸、オレイン酸エチル等の炭素源、
硝酸、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、アンモニ
ア等の窒素源、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉
エキス、ポテト等の有機栄養源、L−バリン、L−グル
タミン酸等のアミノ酸、リン酸、マグネシウム、カリウ
ム、鉄、コバルト、マンガン等の無機栄養源を適宜組合
せて使用できる。
れる公知の培養方法に準じて行うことができる。使用す
る培地は、一般酵母の栄養源として公知のものが利用で
き、例えば、グルコース、シュークロース、マルトー
ス、エタノール、酢酸、オレイン酸エチル等の炭素源、
硝酸、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、アンモニ
ア等の窒素源、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉
エキス、ポテト等の有機栄養源、L−バリン、L−グル
タミン酸等のアミノ酸、リン酸、マグネシウム、カリウ
ム、鉄、コバルト、マンガン等の無機栄養源を適宜組合
せて使用できる。
【0019】さらに、本酵素活性を誘導するために各種
脂肪酸エステル化合物、例えばメチルオレートを培地中
に0.01〜10%になるように添加してもよい。培地
のpHは3〜10の範囲で選べばよい。
脂肪酸エステル化合物、例えばメチルオレートを培地中
に0.01〜10%になるように添加してもよい。培地
のpHは3〜10の範囲で選べばよい。
【0020】培養は、通常振盪または通気攪拌培養等の
好気的条件下で行うのがよく、工業的には深部通気攪拌
培養が好ましい。培養温度は本酵素生産菌が発育し、本
酵素を生産する範囲内で適宜変更し得るが、通常は15
℃〜40℃である。培養時間は培養条件によって異なる
が、本酵素が最高力価に達する時期を見計らって適当な
時期まで培養すればよいが、通常は1日〜10日の範囲
でよい。
好気的条件下で行うのがよく、工業的には深部通気攪拌
培養が好ましい。培養温度は本酵素生産菌が発育し、本
酵素を生産する範囲内で適宜変更し得るが、通常は15
℃〜40℃である。培養時間は培養条件によって異なる
が、本酵素が最高力価に達する時期を見計らって適当な
時期まで培養すればよいが、通常は1日〜10日の範囲
でよい。
【0021】このようにして得られた本酵素は、主とし
て菌体内に含有されるので、得られた培養物から濾過ま
たは遠心分離等の手段によって集菌し、この菌体を超音
波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理、凍結破
砕処理等の機械的破壊手段等の種々の公知の菌体処理手
段を適宜組み合わせて破砕し、細胞片等の固形物を遠心
分離によって除き、粗製の7−ACAエステラーゼ含有
液が得られる。
て菌体内に含有されるので、得られた培養物から濾過ま
たは遠心分離等の手段によって集菌し、この菌体を超音
波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理、凍結破
砕処理等の機械的破壊手段等の種々の公知の菌体処理手
段を適宜組み合わせて破砕し、細胞片等の固形物を遠心
分離によって除き、粗製の7−ACAエステラーゼ含有
液が得られる。
【0022】該粗酵素含有液から、公知の蛋白質・酵素
等の単離、精製手段を用いることにより、さらに精製さ
れた本酵素を得ることができる。例えば、超遠心分離分
画、硫安、食塩、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム等を
添加する塩析沈澱、アセトン等を添加する有機溶媒沈澱
等の手段により沈澱物として、本酵素を回収すればよ
い。
等の単離、精製手段を用いることにより、さらに精製さ
れた本酵素を得ることができる。例えば、超遠心分離分
画、硫安、食塩、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム等を
添加する塩析沈澱、アセトン等を添加する有機溶媒沈澱
等の手段により沈澱物として、本酵素を回収すればよ
い。
【0023】さらに、この沈澱物は、半透膜を用いる透
析、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、ハイドロフォービッグクロマトグラフィー、ゲ
ル濾過クロマトグラフィー等等の手段を適宜組み合わせ
て行うことにより精製することができる。
析、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、ハイドロフォービッグクロマトグラフィー、ゲ
ル濾過クロマトグラフィー等等の手段を適宜組み合わせ
て行うことにより精製することができる。
【0024】このようにして得られた7−ACAエステ
ラーゼは、次の理化学的性質を有する。 1)酵素作用 少なくとも、7−ACA誘導体(1)をD−7−ACA
誘導体(2)と酢酸に加水分解する反応を触媒する。
ラーゼは、次の理化学的性質を有する。 1)酵素作用 少なくとも、7−ACA誘導体(1)をD−7−ACA
誘導体(2)と酢酸に加水分解する反応を触媒する。
【0025】ここで、前記一般式(1)中の基Rにおい
て定義されるアシル基とは、公知のセファロスポリン化
合物のアシル基であって、例えば、アミノ基、カルボニ
ル基またはカルボキシル基の1個ないし数個により置換
されていてもよい炭素数2〜7個の直鎖状または分鎖状
アルカノイル基;ハロゲン原子、シアノ基、低級アルコ
キシ基、置換基を有していてもよいアリールオキシ基、
イミノ基、低級アルキリデン基もしくは複素環式基によ
り置換された炭素数2〜4個のアルカノイル基;置換基
を有していてもよいアリールオキシ基で置換されていて
もよい炭素数2〜5個の直鎖状または分鎖状アルコキシ
カルボニル基;置換基を有していてもよいアリール−低
級アルカノイル基等を意味する。
て定義されるアシル基とは、公知のセファロスポリン化
合物のアシル基であって、例えば、アミノ基、カルボニ
ル基またはカルボキシル基の1個ないし数個により置換
されていてもよい炭素数2〜7個の直鎖状または分鎖状
アルカノイル基;ハロゲン原子、シアノ基、低級アルコ
キシ基、置換基を有していてもよいアリールオキシ基、
イミノ基、低級アルキリデン基もしくは複素環式基によ
り置換された炭素数2〜4個のアルカノイル基;置換基
を有していてもよいアリールオキシ基で置換されていて
もよい炭素数2〜5個の直鎖状または分鎖状アルコキシ
カルボニル基;置換基を有していてもよいアリール−低
級アルカノイル基等を意味する。
【0026】2)基質特異性 本酵素を用いて基質特異性を検討した。酵素活性の測定
は、後記の酵素活性測定法に従った。7−ACA誘導体
(1)を基質とする場合には、その中から7−ACA誘
導体(3)を選択した。各基質に対する本酵素の基質特
異性について測定した結果は表1の通りである。
は、後記の酵素活性測定法に従った。7−ACA誘導体
(1)を基質とする場合には、その中から7−ACA誘
導体(3)を選択した。各基質に対する本酵素の基質特
異性について測定した結果は表1の通りである。
【表1】
【0027】上記の結果から、本酵素は7−ACA誘導
体(3)に作用する。特に、CeC、7−CAACA、
7−ACAに強く作用する。また、酢酸低級アルキルエ
ステルに作用し、アルコール鎖が長い程活性が強い。一
方、N−アセチルグルコサミン、キチン等のN−アセチ
ル化合物を加水分解しないことより、キチン・デアセチ
ラーゼ〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.,90,2564(1993)〕とは異なるこ
とを示している。
体(3)に作用する。特に、CeC、7−CAACA、
7−ACAに強く作用する。また、酢酸低級アルキルエ
ステルに作用し、アルコール鎖が長い程活性が強い。一
方、N−アセチルグルコサミン、キチン等のN−アセチ
ル化合物を加水分解しないことより、キチン・デアセチ
ラーゼ〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.,90,2564(1993)〕とは異なるこ
とを示している。
【0028】3)分子量 公知の方法によりSDS−PAGEで電気泳動を行い、
標準蛋白質と比較することにより、本酵素のサブユニッ
トの分子量は82kDaである(SDS−PAGE)。
また、通常状態での本酵素の分子量を求めるために、S
uperdex200 prep gradeのカラム
を用いて溶出させ、標準蛋白質と比較することにより、
本酵素の分子量は141kDaである(ゲル濾過法)。
標準蛋白質と比較することにより、本酵素のサブユニッ
トの分子量は82kDaである(SDS−PAGE)。
また、通常状態での本酵素の分子量を求めるために、S
uperdex200 prep gradeのカラム
を用いて溶出させ、標準蛋白質と比較することにより、
本酵素の分子量は141kDaである(ゲル濾過法)。
【0029】以上の結果より、本酵素は82kDaのサ
ブユニットが2個会合した酵素であり、このような分子
量およびサブユニットの分子量を有する本酵素は、従来
公知のCeCデアセチラーゼとは異なる。
ブユニットが2個会合した酵素であり、このような分子
量およびサブユニットの分子量を有する本酵素は、従来
公知のCeCデアセチラーゼとは異なる。
【0030】4)至適pHおよび安定pH範囲 緩衝液以外は後記酵素活性測定法により本酵素の至適p
Hを求めた。緩衝液はpH4.0〜6.0のコハク酸−
NaOH緩衝液、pH5.5〜7.8のリン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH7.5〜9.0のトリス−塩酸緩衝液を
用いた。測定結果は図3に示す通りであり、至適pHは
5.5である。一方、pH5.5〜7.0が安定pH領
域である。
Hを求めた。緩衝液はpH4.0〜6.0のコハク酸−
NaOH緩衝液、pH5.5〜7.8のリン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH7.5〜9.0のトリス−塩酸緩衝液を
用いた。測定結果は図3に示す通りであり、至適pHは
5.5である。一方、pH5.5〜7.0が安定pH領
域である。
【0031】5)至適温度および安定温度 反応温度を変化させる以外は後記酵素活性測定法により
本酵素の至適温度を求めた。測定結果は図2に示す通り
であり、至適温度は30〜35℃である。一方、pH
7.0で15分処理においては、20℃まで安定であ
る。
本酵素の至適温度を求めた。測定結果は図2に示す通り
であり、至適温度は30〜35℃である。一方、pH
7.0で15分処理においては、20℃まで安定であ
る。
【0032】6)阻害 後記酵素活性測定法の反応系において、各種金属イオン
または阻害剤の存在下での本酵素活性を測定し、各種金
属イオンまたは阻害剤の影響を求めた。各種添加物はp
−クロロマーキュリーベンゾエートを0.1mM添加し
た以外はすべて1.0mM添加した。無添加の場合の活
性を100%としたときの相対活性は表2に示す通りで
ある。
または阻害剤の存在下での本酵素活性を測定し、各種金
属イオンまたは阻害剤の影響を求めた。各種添加物はp
−クロロマーキュリーベンゾエートを0.1mM添加し
た以外はすべて1.0mM添加した。無添加の場合の活
性を100%としたときの相対活性は表2に示す通りで
ある。
【0033】
【表2】 以上の結果より、本酵素はCu2+、Hg2+、(p−アミ
ジノフェニル)メタンスルホニルフルオライド、硫酸エ
セリン等で阻害される。
ジノフェニル)メタンスルホニルフルオライド、硫酸エ
セリン等で阻害される。
【0034】7)糖含量 本酵素をSDS−PAGEにかけた後、ポリビニリデン
ジフルオライド(PVDF)膜に転写した後、シアル酸
を除くために25mM硫酸で80℃、1時間処理した。
洗浄後、メンブラン上の酵素は各種のパーオキシダーゼ
ーレクチン試薬〔文献;新生化学実験講座,3.糖質,
I,31(1990)〕と反応させた。次に,パーオキ
シダーゼ染色は45mMの4−アミノアンチピリン0.
3ml、60mMのフェノール0.3ml、30%の過
酸化水素2μl、15mMリン酸ナトリウム緩衝液(p
H6.8)8.4mlからなる反応混合液を用いて行っ
た。
ジフルオライド(PVDF)膜に転写した後、シアル酸
を除くために25mM硫酸で80℃、1時間処理した。
洗浄後、メンブラン上の酵素は各種のパーオキシダーゼ
ーレクチン試薬〔文献;新生化学実験講座,3.糖質,
I,31(1990)〕と反応させた。次に,パーオキ
シダーゼ染色は45mMの4−アミノアンチピリン0.
3ml、60mMのフェノール0.3ml、30%の過
酸化水素2μl、15mMリン酸ナトリウム緩衝液(p
H6.8)8.4mlからなる反応混合液を用いて行っ
た。
【0035】その結果、本酵素はコンカナバリンA(C
on A)とコムギ胚レクチン(Wheat germ
lectin)と反応したが、Arachis hy
pogaea レクチン(PNA)、Ricinus
communis レクチン(RCA120 )、Phas
eolus vulgaris レクチン(PHA−E
4 )とは反応しなかった。このことは,本酵素がアスパ
ラギン残基に結合した混成型糖鎖を持つことを示してい
る。
on A)とコムギ胚レクチン(Wheat germ
lectin)と反応したが、Arachis hy
pogaea レクチン(PNA)、Ricinus
communis レクチン(RCA120 )、Phas
eolus vulgaris レクチン(PHA−E
4 )とは反応しなかった。このことは,本酵素がアスパ
ラギン残基に結合した混成型糖鎖を持つことを示してい
る。
【0036】さらに、この糖の含量を決定するために、
本酵素をEndo H処理を行い、SDS−PAGEに
かけたところ、3つの主バンドと2つの副バンドが見ら
れ、分子量は74000、72000、69000、6
7000、65000となった。このことより、本酵素
は20%以上の混成型糖鎖を含む。
本酵素をEndo H処理を行い、SDS−PAGEに
かけたところ、3つの主バンドと2つの副バンドが見ら
れ、分子量は74000、72000、69000、6
7000、65000となった。このことより、本酵素
は20%以上の混成型糖鎖を含む。
【0037】8)N末アミノ酸配列 本酵素をSDS−PAGEにかけた後、PVDF膜に転
写し、次いでエドマン法によるプロテイン シーケンサ
ーにかけたところ、N末アミノ酸配列は次の通りであ
る。Thr−Asn−Pro−Asn−Glu−Pro
−Pro−Pro−Val−Val−Asp−Leu−
Gly−Tyr−Ala−
写し、次いでエドマン法によるプロテイン シーケンサ
ーにかけたところ、N末アミノ酸配列は次の通りであ
る。Thr−Asn−Pro−Asn−Glu−Pro
−Pro−Pro−Val−Val−Asp−Leu−
Gly−Tyr−Ala−
【0038】9)部分アミノ酸配列 本酵素の部分アミノ酸配列を知るために、Staphy
lococcus aureusV8プロテアーゼを利
用したクリーブランド法によるペプチドマッピング(遺
伝子クローニングのためのタンパク質構造解析,平野久
書,東京化学同人,89−92頁)を行ったところ、本
酵素は少なくとも次に示す4種類のアミノ酸配列を含
む。
lococcus aureusV8プロテアーゼを利
用したクリーブランド法によるペプチドマッピング(遺
伝子クローニングのためのタンパク質構造解析,平野久
書,東京化学同人,89−92頁)を行ったところ、本
酵素は少なくとも次に示す4種類のアミノ酸配列を含
む。
【0039】 (a)Ala−Phe−Gly−Leu−X−Ala (式中、Xは未同定アミノ酸を示す) (b)Gly−Phe−Ile−Phe−Thr−As
p−Ala
p−Ala
【0040】(c)Ala−Val−Asp−Ala−
Ala−Ala−Leu−Ala−Ala−Ala−G
ly−Val−Leu−Asn−Ser−Ala−Al
a−Phe (d)Thr−Ser−Ser−Leu−Thr−As
p−Phe−Gly−Thr−Ser−Gln−Ile
−Thr−Ile−Ile−Asp−Phe−Trp−
Arg−Gly−Gly−Ile
Ala−Ala−Leu−Ala−Ala−Ala−G
ly−Val−Leu−Asn−Ser−Ala−Al
a−Phe (d)Thr−Ser−Ser−Leu−Thr−As
p−Phe−Gly−Thr−Ser−Gln−Ile
−Thr−Ile−Ile−Asp−Phe−Trp−
Arg−Gly−Gly−Ile
【0041】10)酵素の均一性 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法〔U.K.
Laemmli,Nature,227,680(19
70)〕を行ったところ、均一な1本のタンパクバンド
が見られ、公知の標準蛋白質との比較より、この蛋白質
の分子量は82kDaである。
Laemmli,Nature,227,680(19
70)〕を行ったところ、均一な1本のタンパクバンド
が見られ、公知の標準蛋白質との比較より、この蛋白質
の分子量は82kDaである。
【0042】11)酵素活性測定法 〔酵素活性測定法1〕7−ACA5μmol、コハク酸
−ホウ酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)0.1mmo
lおよび適量の酵素を加え、0.5mlになるように混
合して,30℃にて30分反応させた後、50%のジメ
チルスルホキサイド液2mlを添加して反応を停止させ
た。生成したデアセチル−7−アミノセファロスポラン
酸(D−7−ACA)を次の条件による高速液体クロマ
トグラフィー(HPLC)により測定した。
−ホウ酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)0.1mmo
lおよび適量の酵素を加え、0.5mlになるように混
合して,30℃にて30分反応させた後、50%のジメ
チルスルホキサイド液2mlを添加して反応を停止させ
た。生成したデアセチル−7−アミノセファロスポラン
酸(D−7−ACA)を次の条件による高速液体クロマ
トグラフィー(HPLC)により測定した。
【0043】分析条件A; カラム;ガードカラム(30×4.6mm)のついたワ
コージル−II 5C 18 HG(250×4.6m
m,和光純薬工業社製)のカラム(35℃保温 ) 移動相;7.7%(V/V)アセトニトリル、1mMテ
トラブチルアンモニウム硫酸水素塩および64mM酢酸
アンモニウムを含む水溶液 流速;0.8ml/分 検出;254nmの吸光度 1分間に1μmolのD−7−ACAを生成する酵素を
1単位とした。
コージル−II 5C 18 HG(250×4.6m
m,和光純薬工業社製)のカラム(35℃保温 ) 移動相;7.7%(V/V)アセトニトリル、1mMテ
トラブチルアンモニウム硫酸水素塩および64mM酢酸
アンモニウムを含む水溶液 流速;0.8ml/分 検出;254nmの吸光度 1分間に1μmolのD−7−ACAを生成する酵素を
1単位とした。
【0044】尚、7−ACA誘導体(3)の基質特異性
の測定においては、7−ACA以外の基質についても、
上記と同様の反応条件を用いるが、基質として7−ベン
ジルオキシカルボニルアミノ−セファロスポラン酸(7
−BZACA)および7−CAACAを用いた場合のH
PLC分析条件は、次の通りである。
の測定においては、7−ACA以外の基質についても、
上記と同様の反応条件を用いるが、基質として7−ベン
ジルオキシカルボニルアミノ−セファロスポラン酸(7
−BZACA)および7−CAACAを用いた場合のH
PLC分析条件は、次の通りである。
【0045】分析条件B;7−BZACAよりデアセチ
ル体を生成する場合 カラム;コスモジル 5C18−AR(150×4.6
mm,ナカライテスク(株)製)のカラム(35℃保
温) 移動相;27%(V/V)アセトニトリルおよび67m
Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を含む水溶液 流速;1.6ml/分 検出;254nmの吸光度
ル体を生成する場合 カラム;コスモジル 5C18−AR(150×4.6
mm,ナカライテスク(株)製)のカラム(35℃保
温) 移動相;27%(V/V)アセトニトリルおよび67m
Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を含む水溶液 流速;1.6ml/分 検出;254nmの吸光度
【0046】分析条件C;7−CAACAよりデアセチ
ル体を生成する場合 カラム;コスモジル 5C18−AR(150×4.6
mm,ナカライテスク社製)のカラム(35℃保温) 移動相;7.7%(V/V)アセトニトリル,1mMテ
トラブチルアンモニウム硫酸水素塩および64mM酢酸
アンモニウムを含む水溶液 流速;1.6ml/分 検出;254nmの吸光度
ル体を生成する場合 カラム;コスモジル 5C18−AR(150×4.6
mm,ナカライテスク社製)のカラム(35℃保温) 移動相;7.7%(V/V)アセトニトリル,1mMテ
トラブチルアンモニウム硫酸水素塩および64mM酢酸
アンモニウムを含む水溶液 流速;1.6ml/分 検出;254nmの吸光度
【0047】〔酵素活性測定法2〕さらに、酢酸低級ア
ルキルエステルを基質とした場合の酵素活性測定は、次
の通りに行った。すなわち、4μmolの基質、コハク
酸−ホウ酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)40μmo
lおよび適量の酵素を加え、0.2mlになるように混
合して30℃、20分反応させた後、50%のジメチル
スルホキサイド液を添加し反応を停止させた。生成した
酢酸は3つの酵素をカップリングさせる方法〔H.U.
Bergmeyer,Methods Enzym.A
nal.,1,172(1974)〕に従って測定し
た。
ルキルエステルを基質とした場合の酵素活性測定は、次
の通りに行った。すなわち、4μmolの基質、コハク
酸−ホウ酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)40μmo
lおよび適量の酵素を加え、0.2mlになるように混
合して30℃、20分反応させた後、50%のジメチル
スルホキサイド液を添加し反応を停止させた。生成した
酢酸は3つの酵素をカップリングさせる方法〔H.U.
Bergmeyer,Methods Enzym.A
nal.,1,172(1974)〕に従って測定し
た。
【0048】12)反応速度(Km値)および比活性
(Vmax値) 7−ACA誘導体(3)に対する本酵素のKm値および
Vmax値を求めたところ、7−ACAに対しては各々
1.43mM、422μmol/分/mg、CeCに対
しては各々8.39mM、1000μmol/分/mg
である。
(Vmax値) 7−ACA誘導体(3)に対する本酵素のKm値および
Vmax値を求めたところ、7−ACAに対しては各々
1.43mM、422μmol/分/mg、CeCに対
しては各々8.39mM、1000μmol/分/mg
である。
【0049】以上の理化学的性質を有する本酵素と先行
文献A〜Eの公知のCeCデアセチラーゼと比較する
と、本酵素は次の理由により公知のCeCデアセチラー
ゼとは明らかに異なるので、新規酵素であるということ
ができる。
文献A〜Eの公知のCeCデアセチラーゼと比較する
と、本酵素は次の理由により公知のCeCデアセチラー
ゼとは明らかに異なるので、新規酵素であるということ
ができる。
【0050】(1)分子量141kDaおよび82kD
aのサブユニットを有する本酵素は、分子量およびサブ
ユニットの分子量の点で公知のCeCデアセチラーゼと
は異なる。 (2)本酵素の至適pHは5.5であるのに対し、公知
のCeCデアセチラーゼの至適pHは、先行文献A〜C
のそれは7.0〜8.5で、先行文献D〜Eのそれは4
以下であることより、本酵素は公知のCeCデアセチラ
ーゼとは異なる。
aのサブユニットを有する本酵素は、分子量およびサブ
ユニットの分子量の点で公知のCeCデアセチラーゼと
は異なる。 (2)本酵素の至適pHは5.5であるのに対し、公知
のCeCデアセチラーゼの至適pHは、先行文献A〜C
のそれは7.0〜8.5で、先行文献D〜Eのそれは4
以下であることより、本酵素は公知のCeCデアセチラ
ーゼとは異なる。
【0051】(3)本酵素の糖含量は20%以上である
のに対し、公知のCeCデアセチラーゼに糖が含まれて
いることは知られていない。 (4)本酵素のN末アミノ酸配列および部分アミノ酸配
列は、公知のCeCデアセチラーゼのアミノ酸配列とは
異なる。 (5)本酵素は7−ACA誘導体(3)に対してKm値
が小さく、Vmax値が公知のCeCデアセチラーゼよ
り遙に大きい。
のに対し、公知のCeCデアセチラーゼに糖が含まれて
いることは知られていない。 (4)本酵素のN末アミノ酸配列および部分アミノ酸配
列は、公知のCeCデアセチラーゼのアミノ酸配列とは
異なる。 (5)本酵素は7−ACA誘導体(3)に対してKm値
が小さく、Vmax値が公知のCeCデアセチラーゼよ
り遙に大きい。
【0052】
【発明の効果】上記の通り、本発明の7−ACAエステ
ラーゼは7−ACA誘導体(1)をD−7−ACA誘導
体(2)に変換する上で、常温常圧下において加水分解
を行い、しかも基質に対してKm値が小さく、Vmax
が公知のCeCデアセチラーゼより遙に大きいため、少
量の酵素量で反応収率を100%にすることができるの
で、工業的に非常に有用な酵素を提供することができ、
本酵素を使用することにより、7−ACA誘導体(1)
からD−7−ACA誘導体(2)を工業的に有利に製造
することができる。
ラーゼは7−ACA誘導体(1)をD−7−ACA誘導
体(2)に変換する上で、常温常圧下において加水分解
を行い、しかも基質に対してKm値が小さく、Vmax
が公知のCeCデアセチラーゼより遙に大きいため、少
量の酵素量で反応収率を100%にすることができるの
で、工業的に非常に有用な酵素を提供することができ、
本酵素を使用することにより、7−ACA誘導体(1)
からD−7−ACA誘導体(2)を工業的に有利に製造
することができる。
【0053】
【実施例】次に、実施例により本発明をより詳細に説明
する。これにより本発明の範囲を限定するものではな
い。
する。これにより本発明の範囲を限定するものではな
い。
【実施例1】 7−ACAエステラーゼ含有菌体の培養 麦芽エキス2%、ペプトン0.5%を含み、pHを6.
0に調整した殺菌培地150ml(2L容三角フラスコ
使用)に、予め上記と同一組成の培地で28℃、1日試
験管培養(7ml)したロドトルラ・グルチニス38B
1を移植、,28℃で1日間培養した。この培養液を麦
芽エキス2%、ペプトン0.5%、オレイン酸メチル
0.5%を含み、pHを6.0に調整した10Lの殺菌
培地を仕込んだ15L容ジャーファーメンターに移植
し、5L/分の通気条件、400rpmの攪拌条件にて
33時間培養した。得られた培養物を遠心分離により菌
体を集菌し、0.85%食塩水にて洗浄して菌体を得
た。7−ACAの加水分解活性をみると、1.7単位/
ml(培養液)であった。
0に調整した殺菌培地150ml(2L容三角フラスコ
使用)に、予め上記と同一組成の培地で28℃、1日試
験管培養(7ml)したロドトルラ・グルチニス38B
1を移植、,28℃で1日間培養した。この培養液を麦
芽エキス2%、ペプトン0.5%、オレイン酸メチル
0.5%を含み、pHを6.0に調整した10Lの殺菌
培地を仕込んだ15L容ジャーファーメンターに移植
し、5L/分の通気条件、400rpmの攪拌条件にて
33時間培養した。得られた培養物を遠心分離により菌
体を集菌し、0.85%食塩水にて洗浄して菌体を得
た。7−ACAの加水分解活性をみると、1.7単位/
ml(培養液)であった。
【0054】
【実施例2】 7−ACAエステラーゼの精製 実施例1で得た菌体を2mMDTTを含む50mMリン
酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に懸濁し,−20℃
に凍結した。融解した菌体液をガラスビーズを用いたダ
イノーミル(Willy A.Bachofen Ma
nufacturing Engineers)により
菌体破砕を行った。これを7000Gで60分間遠心分
離により沈澱を除き、無細胞抽出液を得た。これに硫酸
ストレプトマイシンを1%になるように添加し、遠心分
離により核酸を沈澱として除去した。これに硫酸アンモ
ニウムが65%飽和となるように添加した後、遠心分離
により上清液を取得した。これに硫酸アンモニウムをさ
らに80%飽和となるようにさらに添加し、遠心分離に
より活性画分を沈澱として採取した。
酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に懸濁し,−20℃
に凍結した。融解した菌体液をガラスビーズを用いたダ
イノーミル(Willy A.Bachofen Ma
nufacturing Engineers)により
菌体破砕を行った。これを7000Gで60分間遠心分
離により沈澱を除き、無細胞抽出液を得た。これに硫酸
ストレプトマイシンを1%になるように添加し、遠心分
離により核酸を沈澱として除去した。これに硫酸アンモ
ニウムが65%飽和となるように添加した後、遠心分離
により上清液を取得した。これに硫酸アンモニウムをさ
らに80%飽和となるようにさらに添加し、遠心分離に
より活性画分を沈澱として採取した。
【0055】この沈澱を2mMのDTTを含むコハク酸
−NaOH緩衝液(pH5.5)に溶解し、同一緩衝液
にて透析を2回行った。透析された酵素液はYM30メ
ンブラン(アミコン社製)を用いる限外濾過により濃縮
した。得られた酵素液を上記と同一の緩衝液で平衡化し
たCM−Toyopearl 650M pre−pa
cked カラム(20×2.2cm i.d.)にチ
ャージした。分画は5mlとして、同一緩衝液で先ず3
0分,次に食塩濃度を0〜0.2M含む同一緩衝液でグ
ラジエント溶出(0−0.1M、30−55分;0.1
−0.2M、55−90分)した。活性画分を集めた
後、YM30メンブランフィルターおよびセントリコン
30コンセントレイターにて濃縮した。
−NaOH緩衝液(pH5.5)に溶解し、同一緩衝液
にて透析を2回行った。透析された酵素液はYM30メ
ンブラン(アミコン社製)を用いる限外濾過により濃縮
した。得られた酵素液を上記と同一の緩衝液で平衡化し
たCM−Toyopearl 650M pre−pa
cked カラム(20×2.2cm i.d.)にチ
ャージした。分画は5mlとして、同一緩衝液で先ず3
0分,次に食塩濃度を0〜0.2M含む同一緩衝液でグ
ラジエント溶出(0−0.1M、30−55分;0.1
−0.2M、55−90分)した。活性画分を集めた
後、YM30メンブランフィルターおよびセントリコン
30コンセントレイターにて濃縮した。
【0056】得られた濃縮液を2mMDTTおよび0.
1MNaClを含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液
(pH7.0)で平衡化されたSuperdex200
prep grade カラム(60×1.6cm
i.d.)にチャージした。1ml/分の流速で上記と
同一緩衝液で溶出した。得られた活性区分のみを集め、
凍結乾燥して精製酵素7−ACAエステラーゼを得た。
上記の精製過程を表3に示す。
1MNaClを含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液
(pH7.0)で平衡化されたSuperdex200
prep grade カラム(60×1.6cm
i.d.)にチャージした。1ml/分の流速で上記と
同一緩衝液で溶出した。得られた活性区分のみを集め、
凍結乾燥して精製酵素7−ACAエステラーゼを得た。
上記の精製過程を表3に示す。
【表3】
【0057】
【実施例3】 7−ACAからのD−7−ACAの生成 コハク酸−ホウ酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)1m
mol、7−ACA0.05mmol、実施例2で得た
精製酵素8単位を含む反応液5mlを30℃にて攪拌し
ながら反応させた。7−ACA、D−7−ACAおよび
酢酸を定量した。その結果は図1に示す通りであり,基
質の7−ACAの減少に伴い、D−7−ACAと酢酸が
等モルずつ生成されることより,明らかに精製酵素が7
−ACAエステラーゼであることを示していた。
mol、7−ACA0.05mmol、実施例2で得た
精製酵素8単位を含む反応液5mlを30℃にて攪拌し
ながら反応させた。7−ACA、D−7−ACAおよび
酢酸を定量した。その結果は図1に示す通りであり,基
質の7−ACAの減少に伴い、D−7−ACAと酢酸が
等モルずつ生成されることより,明らかに精製酵素が7
−ACAエステラーゼであることを示していた。
【0058】
【実施例4】 7−ACA誘導体(3)に対するKmおよびVmax値 7−ACA誘導体(3)に対するKm値およびVmax
値を求めるために、実施例2で得た精製7−ACAエス
テラーゼを用いて、前記の酵素活性測定法において、基
質およびその濃度を変化させて活性を測定し、逆数プロ
ット(Lineweaver−Burk plots)
にてKmおよびVmaxを求めた。
値を求めるために、実施例2で得た精製7−ACAエス
テラーゼを用いて、前記の酵素活性測定法において、基
質およびその濃度を変化させて活性を測定し、逆数プロ
ット(Lineweaver−Burk plots)
にてKmおよびVmaxを求めた。
【0059】基質としては7−ACA、CeC、7−C
AACAおよび7−BZACAを用いた。これらに対す
るKm値は各々1.43、8.39、2.03および
1.11mMであった。また、Vmax値は各々42
2、1000、562および391単位/mgであっ
た。
AACAおよび7−BZACAを用いた。これらに対す
るKm値は各々1.43、8.39、2.03および
1.11mMであった。また、Vmax値は各々42
2、1000、562および391単位/mgであっ
た。
【0060】配列番号:1 配列の長さ:15 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Thr Asn Pro Asn Glu Pro Pro Pro Val Val Asp Leu Gly Tyr Ala 1 5 10 15
【0061】配列番号:2 配列の長さ:6 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド
【0062】配列番号:3 配列の長さ:7 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド
【0063】配列番号:4 配列の長さ:18 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Ala Val Asp Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Gly Val Leu Asn Ser Ala 1 5 10 15 Ala Phe
【0064】配列番号:5 配列の長さ:22 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Thr Ser Ser Leu Thr Asp Phe Gly Thr Ser Gln Ile Thr Ile Ile Asp 1 5 10 15 Phe Trp Arg Gly Gly Ile 20
【図1】本発明の7−アミノセファロスポラン酸エステ
ラーゼを用いた、7−アミノセファロスポラン酸(7−
ACA)からのデアセチル−7−アミノセファロスポラ
ン酸(D−7−ACA)の生成経過の結果を示す曲線で
ある。
ラーゼを用いた、7−アミノセファロスポラン酸(7−
ACA)からのデアセチル−7−アミノセファロスポラ
ン酸(D−7−ACA)の生成経過の結果を示す曲線で
ある。
【図2】本発明の7−アミノセファロスポラン酸エステ
ラーゼの至適温度を示す曲線である。
ラーゼの至適温度を示す曲線である。
【図3】本発明の7−アミノセファロスポラン酸エステ
ラーゼの至適pHを示す曲線である。
ラーゼの至適pHを示す曲線である。
Claims (1)
- 【請求項1】 下記の理化学的性質を有する7−アミノ
セファロスポラン酸エステラーゼ。 酵素作用 少なくとも、一般式(1) 【化1】 (式中、Rは水素原子またはアシル基を示す)で表され
る7−アミノセファロスポラン酸誘導体を一般式(2) 【化2】 (式中、Rは前記と同じ意味を有する)で表されるデア
セチル−7−アミノセファロスポラン酸誘導体と酢酸に
加水分解する反応を触媒する。 基質特異性 少なくとも、酢酸プロピル、酢酸ブチル等の酢酸低級ア
ルキルエステルおよび一般式(3) 【化3】 (式中、R1 は水素原子、D−5−アミノ−5−カルボ
キシバレリル、クロロアセチルまたはベンジルオキシカ
ルボニル基を示す)で表される7−アミノセファロスポ
ラン酸誘導体に作用する。特に、セファロスポリンC、
7−クロロアセチルアミノ−セファロスポラン酸、7−
アミノセファロスポラン酸および酢酸ブチルに強く作用
する。 分子量 分子量は141kDaである(ゲル濾過法)。サブユニ
ットの分子量は82kDaである(SDS−PAG
E)。 至適pHおよび安定pH範囲 至適pHは5.5である。pH5.5〜7.0が安定p
H領域である。 至適温度および安定温度 至適温度は30〜35℃である。pH7.0で15分処
理においては、20℃まで安定である。 阻害 Cu2+、Hg2+、(p−アミジノフェニル)メタンスル
ホニルフルオライド、硫酸エセリン等で阻害される。 糖含量 20%以上の混成型糖鎖を含む。 N末アミノ酸配列 Thr−Asn−Pro−Asn−Glu−Pro−P
ro−Pro−Val−Val−Asp−Leu−Gl
y−Tyr−Ala− 部分アミノ酸配列 少なくとも次に示す4種類のアミノ酸配列を含む。 (a)Ala−Phe−Gly−Leu−X−Ala (式中、Xは未同定アミノ酸を示す) (b)Gly−Phe−Ile−Phe−Thr−As
p−Ala (c)Ala−Val−Asp−Ala−Ala−Al
a−Leu−Ala−Ala−Ala−Gly−Val
−Leu−Asn−Ser−Ala−Ala−Phe (d)Thr−Ser−Ser−Leu−Thr−As
p−Phe−Gly−Thr−Ser−Gln−Ile
−Thr−Ile−Ile−Asp−Phe−Trp−
Arg−Gly−Gly−Ile
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP23867694A JPH0898683A (ja) | 1994-10-03 | 1994-10-03 | 7−アミノセファロスポラン酸エステラーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP23867694A JPH0898683A (ja) | 1994-10-03 | 1994-10-03 | 7−アミノセファロスポラン酸エステラーゼ |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0898683A true JPH0898683A (ja) | 1996-04-16 |
Family
ID=17033659
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP23867694A Withdrawn JPH0898683A (ja) | 1994-10-03 | 1994-10-03 | 7−アミノセファロスポラン酸エステラーゼ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0898683A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110317215A (zh) * | 2019-07-26 | 2019-10-11 | 伊犁川宁生物技术有限公司 | 一种降低d-7-aca中do-7-aca杂质含量的方法 |
CN110964770A (zh) * | 2018-09-29 | 2020-04-07 | 北京科技大学 | 连续制备3-去乙酰-7-氨基头孢烷酸的方法 |
CN114113359A (zh) * | 2021-05-07 | 2022-03-01 | 佛山市南海北沙制药有限公司 | 一种7-aca衍生物的中控检测方法 |
-
1994
- 1994-10-03 JP JP23867694A patent/JPH0898683A/ja not_active Withdrawn
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---|---|---|---|---|
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CN114113359A (zh) * | 2021-05-07 | 2022-03-01 | 佛山市南海北沙制药有限公司 | 一种7-aca衍生物的中控检测方法 |
CN114113359B (zh) * | 2021-05-07 | 2024-02-20 | 佛山市南海北沙制药有限公司 | 一种7-aca衍生物的中控检测方法 |
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