KR970000185B1

KR970000185B1 - 아실아미노산 라세마제, 그의 제조방법 및 용도

Info

Publication number: KR970000185B1
Application number: KR1019880010620A
Authority: KR
Inventors: 다께시 다까하시; 가즈노리 하따노
Original assignee: 다께다야꾸힝 고오교 가부시끼가이샤; 우메모또 요시마사
Priority date: 1987-08-21
Filing date: 1988-08-20
Publication date: 1997-01-06
Also published as: EP0304021A2; HUT47317A; CN1034183C; HU204558B; KR890003948A; ATE88753T1; US4981799A; DK462488A; DE3880585D1; EP0304021A3; EP0304021B1; DK462488D0; CN1035320A; DE3880585T2

Abstract

내용 없슴.

Description

아실아미노산 라세마제, 그의 제조방법 및 용도

제1도는 아실아미노산 라세마제의 pH 의존도를 나타낸다.

제2도는 각종 pH에서 아실아미노산 라세마제에 의해 생산된 메티오닌의 양을 2시간 반응에서의 양(□)을 1로 기준하여 계산된 4시간 반응에서의 양(

)을 상대값으로 표현하여 나타낸다.

제3도는 반응온도와 아실아미노산 라세마제 효소 활성간의 관계를 나타낸다.

제4도는 아실아미노산 라세마제의 열안정성을 나타낸다.

본 발명은 아실아미노산 라세마제 효소, 그이 제조방법 및 용도에 관한 것이다.

광학적 활성 N-아실-α-아미노카르복실산(이하 N^α-아실아미노산으로 언급함)이 광학적 불활성 DL-N-아실아미노산으로 라세미화 되는 반응은 광학적 활성 아미노산을 제조하는데 사용되는 중요한 반응이다.

광학성 활성 N^α-아실아미노산을 라세미화시켜 DL-N^α-아실아미노산을 제조하는 공지된 방법은 극한 조건하에서 물리적 또는 화학적 방법에 국한되는데, 예를들면, 출발물질을 동량 미만의 아세트산 무수물과 함께 아세트산내에서 가열하는 방법[Bio-chem. Z., 203, 280 (1929)], 출발물질을 다량의 아세트산 무수물과 함께 실온에서 처리하는 방법[J.Am.Chem. Soc., 54, 1630 (1932)], 출발물질을 인산 트리에스테르 또는 저급 지방산과 같은 용매내에서 가열하는 방법[일본국 특허공고 제18402/1976호], 광학적 활성 N^α-아실아미노산을 질소 기체 흐름내에서 약 160℃로 직접 가열하는 방법[일본국 특허공개 제126058/1986호] 및 출발물질을 촉매량의 탈수제와 함께 방향족 탄화수소의 존재하에서 130℃ 이상으로 가열하는 방법[일본국 특허공개 제165354/1986호]이 있다.

D-N^α-아실아미산 라세미화는 아미노아실라제와 조합 사용하여 광학적 활성 L-α-아미노산을 제조한다. 그러므로, 아미노아실라제의 촉매작용으로, 값싼 출발물질 DL-N^α-아실아미노산을 L-α-아미노산 및 D-N^α-아실아미노산으로 전환시키고, 물리적 특성 차이에 기초하여 분리하고 각각 단리한다. 그런후 어느 한가지의 물리적 또는 화학적 라세미화 방법을 D-N^α-아실아미노산에 적용하여 그것을 출발물질 DL-N^α-아실아미노산으로 전환시키고, 다시 아미노아실라제로 처리한다.

이 과정을 반복하여, 출발물질 DL-N^α-아실아미노산을 광학적 활성 L-α-아미노산으로 완전히 전환할 수 있다. 그러나, 이 방법은 중요한 결점을 갖는다. 아미노아실라제와의 반응후 L-α-아미노산 및 L-아실아미노산 서로 분리하기 위해 분리과정이 필요하다. 또한, D-N^α-아실아미노산의 라세미화 과정은 단리후 고형으로 화학적 또는 물리적 극한 조건하에서 수행해야만 한다.

이 라세미화를 아미노아실라제가 불활성화된 조건하(정상압, 실온, 거의 중성 수용액내), 광학적 활성 아미노산의 존재하에서 D-N^α-아실아미노산만에 대해 선택적으로 행할 수 있다면, 아미노아실라제와 배합된 이러한 선택적 라세미화는 어떤 분리과정없이 출발물질 DL-N^α-아실아미노산을 목적 생성물 L-α-아미노산으로 한 단계에서 100% 전환시킬 수 있다. 당 분야에 필수적인 분리 및 라세미화 과정을 나누면, 광학적 활성 아미노산의 제조방법에서의 효율이 크게 증가될 것이다.

그러나, 당 분야의 어떤 조건하에서도 선택적인 라세미화를 행할 수 없다. 이것을 수행할 수 있는 한가지 가능한 방법은 광학적 활성 N^α-아실아미노산의 라세미화에는 작용하지만 대응하는 광학적 활성 α-아미노산에는 작용하지 않는 것과 같은 선택성을 갖는 효소 또는 라세미화제를 수득하는 것이다. 그러나, 이러한 촉매작용을 나타내는 효소 또는 라세미화제는 아직까지 발견되지 않았다. N^α-아실아미노산에는 작용하지 않지만 광학적 활성 α-아미노산의 라세미화에는 작용하는 효소, 소위 아미노산 라세마제는 존재한다고 잘 공지되어 있다[예를 들면, Biochem. Biophys. Res. Comm., 35, 363(1969)]. 그러나, 이 아미노산 라세마제는 이 목적으로 사용될 수 없다.

본 발명가들은 연구하여 처음으로 광학적 활성 아미노산에는 작용하지 않지만 N^α-아실아미노산이 대응하는 거울상 이성질체로의 전환에는 작용하는 자연-발생의 효소가 있음을 증명하고 이 효소를 아실아미노산 라세마제로 명명하였다. 본 발명가들은 더 연구하여 아실아미노산 라세마제를 사용하여 DL-N^α-아실아미노산에서 광학적 활성 α-아미노산을 제조하는 방법을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 하기 성질을 갖는 효소 아실아미노산 라세마제 :

(1) D-N^α-아실아미노산을 대응하는 L-N^α-아실아미노산으로 전환시키고,

(2) L-N^α-아실아미노산을 대응하는 D-N^α-아실아미노산으로 전환시키며,

(3) D-α-아미노산을 대응하는 L-α-아미노산으로 전환시키지 않고,

(4) L-α-아미노산을 대응하는 D-α-아미노산으로 전환시키지 않음 :

배양 배지에서 상기 효소를 생산할 수 있는 미생물을 배양하여 브로쓰내에 효소를 축적시키고 효소를 수확함을 특징으로 하는 아실아미노산 라세마제의 제조방법; 및 DL-N^α-아실아미노산을 D- 또는 L-아미노아실라제의 존재하에서 아실아미노산 라세마제와 접촉시킴을 특징으로 하는 광학적 활성 D-또는 L-아미노산의 제조방법에 관한 것이다.

상기 N^α-아실아미노산 및 α-아미노산에 대해, α-아미노산은 자연형태 또는 비자연형태중 어느것일 수 있다. 또한, α-아미노산이 중성, 염기성 또는 산성이냐도 문제가 되지 않는다.

예를 들면, 상기 N^α-아실아미노산은 하기 일반식(Ⅰ)로 제시될 수 있다 ;

(식중, X는 치환될 수 있는 카르복실산 유래된 아실이고, R은 치환될 수 있는 C_1-20알킬이다).

Nα-아실아미노산(X)에 대한 아실기에는 알카노일, 벤조일 및 아르알키노일과 같은 카르복실산 아실류가 포함된다.

이 아실기는 적어도 하나의 치환제(예. 할로겐, C_1-3알킬, C_1-3알콕시, 니트로)를 갖을 수 있다. 알키노일의 예로는 포르밀, 아세틸, 프로피오닐 및 클로로아세틸과 같은 C_1-3알카노일류가 포함된다. 벤조일의 예에는 벤조일 및 p-클로로벤조일이 포함된다. 아르알카노일의 예에는 페닐아세틸 및 페닐프로피오닐과 같은 페닐 C_1-3알카노일류가 포함된다.

일반식(Ⅰ)에 대해, 또한 R은 직쇄 또는 측쇄인 C_1-6알킬, 히드록시, C_1-3알킬티오, 티올, 페닐, 히드록시페닐, 또는 인돌릴로 치환된 C_1-3알킬, 또는 아미노, 카르복실, 구아니딜 또는 이미자졸릴로 치환된 C_1-4알킬일 수 있다.

아실아미노산 라세마제-생산 미생물은 예를들면, 하기 과정에 의해 발견될 수 있다. 천연원에서 분리된 미생물 또는 기탁기관에서 구한 미생물을 표준방법(예를들면, 상기 효소에 대한 기질 또는 금속염과 같이 효소를 유도하거나 또는 효소 생산을 촉진시키는 화합물을 필요하다면 배지에 가한다)으로 배양하고; 세포를 각각의 수득된 배양액에서 수확하고; 완충액 등으로 세척한 후, 필요하다면, 세포를 적당량의 N-아세틸-D-메티오닌 및 황산마그네슘을 함유하는 인산염-완충액(pH 7)에 현탁시키고: 현탁액을 하룻밤 동안 30℃에서 진탕하여 반응시킨다. 반응 브로쓰에서 세포를 제거한 후, 다량의 L-아미노아실라제를 수득하고, 필요하다면, 염화 코발트를 상층액에 가하고, 반응을 37℃에서 수시간 동안 행한 후, 반응 혼합물을 TLC(n-부탄올 : 아세트산 : 물=3 : 1 : 1)에 적용시킨다. 닌히드린 반응으로 메티오닌 반점을 나타내는 반응 브로쓰를 선택한 후, 닌히드린 반응 및/또는 고성능 액체 크로마토그래피로 메티오닌의 양을 분석한다. 메티오닌-양성반응 브로쓰에, D-아미노산 옥시다제 용액을 가하고, 반응을 30℃에서 20시간 동안 행하여 D-메티오닌을 분해시킨 후, 각 반응 혼합물을 다시 닌히드린 반응, 고성능 액체 크로마토그래피 및/또는 페이오코쿠스 아시딜락티(Pediococcus acidilacti) ATOC 8042를 사용한 생분석(J. Biol. Chem., 177, 533(1949)]에 다시 적용시켜서 잔류 메티오닌, 즉 반응 혼합물내의 L-메티오닌을 결정한다.

반응 브로쓰에 L-메티오닌을 생산한 균주는 N-아세틸-D-메티오닌에서 L-메티오닌을 생산할 수 있고; 이 균주는 아실아미노산 라세마제 및/또는 아미노산 라세마제를 생산해야만 한다.

그런후 L-메티오닌-양성 균주를 다시 상기한 동일한 조건을 사용하여 배양하고 세포 현탁액을 제조한다. 각 현탁액에, N-아세틸-D-메티오닌 대신에 L-메티오닌을 가하고, 반응을 상기와 동일한 방법으로 수행한다. 세포를 제거한 후, 반응 혼합물을 D-아미노산 옥시다제, 퍼옥시다제, 페놀 및 4-아미노안티피린[Clin. Chem., 20, 470 (1974)]을 사용하여 비색법으로 분석하여 D-메티오닌의 양을 결정하고, D-메티오닌-음성 균주를 선택한다.

여기에서 사용한대로 N-아세틸-D-메티오닌 대신에 또다른 D-N^α-아실아미노산을 사용할 수 있다. 아미노산 라세마제 활성을 나타내지 않고 D-N^α-아실아미노산에서 대응하는 L-α-아미노산을 생산하는 균주를 선택함으로써 아실아미노산 라세마제-생상 미생물을 수득할 수 있다.

이방법으로 발견된 N-아실아미노산 라세마제-생산 미생물을 표 1에 기재한다.

표 1에 기재된 아실아미노산 라세마제-생산 미생물이 의외로 액티노미세트(Actinomycetes)에 속할지라도, 임의의 미생물(액티노미세트, 세균, 진균, 효모 또는 버섯에 속하든지 속하지 않든지간에)이 상기 방법으로 결정된대로 아실아미노산 라세마제-생산 미생물로 인한 본 발명에서 사용할 수 있다.

일본국 교오또 아라시야마의 흙에서 분리된 어떤 아실아미노산 라세마제-생산 미생물의 미생물학적 특성(표 1에서 스트렙토미세스 sp. Y-53로 기재됨)은 하기 제시된 것과 같다.

(a)형태학

포자-함유 군사는 한 방향으로만 가지를 치고, 후크, 루프, 또는 드물게 단순 나선(2 또는 3회전)을 형성한다[Retinaculum Apertum(RA)]. 성숙 포자 사슬은 사슬당 10 포자 이상을 갖고 포자는 매끄러운 표면을 갖는 원통형(0.7~0.9×1.1~1.5㎛)이다. 운동원, 특별한 기관 또는 구조가 발견되지는 않는다. 이 균주는 세포벽 성분으로 LL-디아미노피메르산을 갖고 특징적인 당은 갖지 않는다(세포벽 형태 Ⅰ).

(b) 배양 특징

각종 배지에서의 Y-53 균주의 배양 특징은 표 2에 제시된다. 표 2에 나타낸 색깔은 문헌[Color Harmony Manual, 4판, Container Corporation of America]의 색깔 칩과 비교하여 결정한다.

(c) 생리학적 특징

① 효모 추출액-맥아 추출액 한천에서의 성장 온도범위 : 14~37℃(성장 최적 온도 : 20~30℃)

② 젤라틴 액화 : 양성

③ 녹말 가수분해 : 양성

④ 탈지 우유 응고 : 음성

탈지 우유 펩톤화 : 양성

⑤ 멜라노이드 형성 : 음성

(d) 탄소원의 이용

양성 : 글루코오스, 크실로오스, 람노오스

가양성 : 프락토오스

음성 : 아라비노오스, 슈크로오스, 라피노오스, 만니톨, 이노시톨.

상기 미생물학적 특징으로부터, Y-53 균주는 스트렙토미세스속에 속하는 균주임을 확인하였는데; 본 발명가들은 이 균주를 스트렙토미세스 sp. Y-53으로 명명하였다. 균주 Y-53은 오오사까에 있는 재단법인 발효 연구소에 수탁번호 IFO-14596으로 기탁되어 있고, 또한 일본국 통상 산업성 공업기술원 미생물 공업 기술연구소에 1987년 8월13일 이후로 수탁번호 FERM-P9518로 기탁되어 있는데, 이 기탁은 부다페스트 조약하에서 FRI에 수탁번호 FERM BP-1889로 전환되었다. 본 발명에서, 아실아미노산 라세마제를 생산하는 한, 어떤 돌연변이체 및 세포융합 기술로 상기 Y-53또는 표 1에 기재된 다른 아실아미노산 라세마제-생산 미생물에서 유래된 접합체 또는 이 균주의 유전자 일부(아실아미노산 라세마제-코딩 영역을 함유하는)를 적당한 숙주 미생물에 삽입시킴으로써 수득된 형질 전환체를 사용할 수 있다.

상술한 미생물의 배양 배지는, 관련 균주가 이용할 수 있는 영양원을 함유하고 아실아미노산 라세마제 생산을 촉진시킬 수 있는 한 액체 또는 고체일 수 있다. 대량 배양을 위해, 액체 배지가 편리하다.

배지에서, 이용될 수 있는 물질은 탄소원, 질소원 및 무기 영양소와 같이 미생물 배양에 일반적으로 사용되는 것이다.

예를들면, 글루코오스, 글리세린, 덱스트린, 녹말, 당밀 및 동물 및 식물유를 탄소원으로 사용할 수 있다. 예를들면, 콩가루, 옥수수 침지액, 면실가루, 육즙, 펩톤, 효모 추출액, 황산암모늄, 질산나트륨 및 우레아를 질소원으로 사용할 수 있다. 필요하다면, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염, 망간염, 철염, 코발트염, 아연염, 인산염 및 다른 염을 더 첨가할 수 있다.

배양은 정치 배양, 진탕 배양 또는 호기성 액침 배양으로 행한다. 대량 처리에는 호기성 액침 배양이 바람직하다. 배양 온도는 15~37℃, 바람직하게는 20~37℃의 범위일 수 있다. 배지는 pH 5~9의 범위로 유지하는 것이 바람직하다. 배양을 18시간~4일 동안 행하고 축적된 아실아미노산 라세마제의 양이 최대에 달하면 멈춘다.

배양액에서 아실아미노산 라세마제를 수확할때는, 배양액을 원심분리 또는 다른 방법으로 세포 및 배양여액으로 우선 부분 분리하고, 효소가 세포내에 존재할때에는, 세포를 용해 효소처리, 초음파, 프렌치 압축처리 및 디노-밀(Dyno-Mill)처리와 같은 각종 세포 파열 방법을 한가지로 또는 조합 사용하여 세포를 파열시켜 효소를 용해시킨다. 효소가 배양 여액에 존재할 때에는, 배양 여액을 다음 정제 과정에 직접 적용시킬 수 있다.

용해된 또는 배양 여액에 존재하는 효소의 정제에서, 예를 들면, 황산암모늄 등을 사용하는 염석방법, 디에틸아미노에틸 셀룰로오스 등을 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피, 카르복시메틸 셀룰로오스 등을 사용하는 양이온 크로마토그래피, 덱스트란겔 등을 사용하는 겔 여과, 소수성 수지를 사용하는 소수성 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피와 같은 공지된 효소 정제 방법을 적당히 조합하여 사용하여서, 목적에 적당한 정제 정도의 아실아미노산 라세마제 표준 시료를 수득한다.

본 발명에서 수득된 아실아미노산 라세마제는 하기의 물리화학적 특징을 갖는다.

① 작용

상기 효소는 L-N-아실아미노산을 대응하는 D-N-아실아미노산으로 전환시키는데 작용하고, D-N-아실아미노산을 대응하는 L-N-아실아미노산으로 전환시키는데에도 적용한다. 즉 효소는 하기 식의 기역 반응을 촉매한다 :

② 기질 특이성

하기 표 3에 제시된대로, 효소는 광학적 활성 N^α-아실아미노산에는 작용하지만 대응하는 광학적 활성 α-아미노산에는 작용하지 않는다.

N^α-아실아미노산이 기질로 사용되는 표 3에서의 상대활성은 ③에서 기술된 효소 활성 결정법으로 결정하고, 생산된 α-아미노산의 실측량(mM)을 나타내는 값은 생성된 메티오닌의 양을 100으로 기준하였을 때의 각각의 기질에 해당된다. 기질이 L-N^α-아실아미노산일 때, Y-53 균주에 의해 생성된 D-아미노산아실라제를 L-아미노아실라제 대신에 사용한다. 기질이 광학적 활성 아미노산일 때, D- 또는 L-아미노산 옥시다제(모두 Sigma Co. 제품) 처리후 반응 브로쓰를 고성능 액체 크로마토그래피시켜 기질의 광학적 거울상 이성질체가 형성되었는지의 여부를 확인한다.

ND : 결정되지 않음

③ 효소 활성의 결정법

아실아미노산 라세마제는 가역 반응을 촉매한다. 즉, D-N-아실아미노산을 기질로 사용하면, 생산된, 반응이 진행되어가면서 축적된 L-N-아실아미노산이 상기 효소에 대한 또다른 기질로 되고, 또한 효소작용을 받아 기질인 D-N-아실아미노산으로 전환된다. 진(true) 반응속도의 결정에서, 반응 생산물을 즉시 다른 화합물로 전환시키고 반응계에서 제거할 필요가 있다.

이 목적으로, 본 발명가들은 생성물이 L- 또는 D-N-아실아미노산, 과량의 L- 또는 D-아미노아실라제를 효소 활성을 결정하기 위해 반응계에 가하여 생성물을 동시에 탈아실화 반응시키고, 최종적으로 축적된 L-또는 D-아미노산의 양을 결정하여, 이 값(μM)을 생산된 L-또는 D-N-아실아미노산의 양과 동일한 것으로 간주한다.

50㎕의 효소 용액, 40㎕의 기질 용액, 10㎕의 L-아미노아실라제 용액 및 400㎕의 50mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)을 함유하는 혼합 반응계를 사용하여 효소 활성을 결정한다. 효소 용약으로는, 트리스-HCI완충약(pH 7.5)에 아실아미노산 라세마제 표준 시료를 1~0.2 단위/ml로 용해시켜 제조된 용액을 사용하고; L-아미노아실라제 용액으로는, 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)에 L-아미노아실라제 표준 시료(Sigma Co.에서 생산되는 것과 같은 시판물을 사용할 수 있지만, Y-53 균주에서 추출 및 정제된 L-아미노아실라제를 본 발명에서 사용한다)을 40~8 단위/ml로 용해시켜 제조된 용액을 사용한다.

상기 용액을 트리스-HCl 완충액, 기질 용액, L-아미노아실라제 용액 및 효소 용액의 순으로 연속 가함으로써 함께 혼합하고, 30℃에서 효소 용액을 가하면 반응이 동시에 개시된다.

효소 용액의 활성이 낮으면 120분 동안 계속 반응시키거나, 또는 활성이 높으면 10분 동안 반응시킨 후, 100℃에서 3분 동안 열처리하여 반응을 종결시킨다.

효소 활성을 결정하는데, 반응계내에서 생산된 메티오닌의 양은 고성능 액체 크로마토그래피로 결정하고, 1μ mol/분 메티오닌의 생산에 해당되는 효소 활성을 1 단위로 표시한다. y 밀리몰 농도의 메티오닌의 x분의 반응시간 동안에 반응계에서 생산될 때, 50㎕ 용액내의 효소 활성(a 단위)을 하기 식으로 계산한다:

④ 효소 활성 최적 pH 및 효소 안정성 pH 범위

상술한 효소 활성 결정법으로 2 또는 4시간동안 반응을 행하지만, 아세트나트륨-HCl 완충액(pH 4.0, 5.0), 일차 인산칼륨-이차 인산나트륨 완충액(pH 6.0, 7.0, 8.0), 일차 인산칼륨-붕산나트륨(pH 6.3, 7.8, 8.3, 9.0) 및 탄산나트륨-붕산나트륨(pH 9.2, 10.0, 10.9)을 트리스-HCl 완충액 (pH 7.5) 대신에 각각 사용하고 각 용액에서의 상대 활성을 생산된 메티오닌 양의 비에서 계산한다.

제1도는 2시간동안 반응시킬 때 각 pH 값의 용액중 상대 효소 활성을 나타내는데; 제1도에서, 최적 pH는 약 8임을 알 수 있다.

제2도는 2시간에서 4시간으로 반응시간을 연장했을 때 생산되는 메티오닌 양의 증가 정도를 나타낸다. 효소는 4시간 반응에서 수득된 메티오닌 양이 2시간 반응에서 수득된 메티오닌 양의 거의 2배가 되는 조건하에서 안정하다고 할 수 있다.

제2도에서, 아실아미노산 라세마제가 pH 6~9에서 안정함을 알 수 있다.

⑤ 작용에 적당한 온도범위

25, 30, 35, 40, 50, 60 또는 70℃로 변환되는 반응온도에서 N-아실-D-메틸오닌으로부터 제조된 L-메티오닌의 양을 표준 효소 활성 결정법(③에서 기술됨)으로 결정한다.

사용되는 효소의 양을 증가시키는데, 반응시간은 5분이다.

얻어진 결과는 제3도에 제시된다. 제3도에서 보듯이, 작용에 적당한 온도범위는 30~50℃이다.

⑥ 효소 활성에 대한 각 온도의 영향

30, 35, 40, 50, 60 또는 70℃에서 30분 동안 열처리한 후, 효소 용액의 잔류 활성을 표준 활성 결정법으로 분석한다. 결과는 표 4에 검은 점의 곡선으로 나타낸다.

이 곡선에서 보듯이, 효소는 40℃ 이하에서는 안정하지만 50℃ 이상에서는 불활성화 된다. 한편, 상기와 동일한 조건을 사용하지만 효소 용액에 1mM 코발트 이온을 가하여 열처리하고, 잔류 활성을 결정하는데 : 얻어진 결과는 Co⁺⁺-제거 조건하에서 얻어진 결과와 다르다. 가해진 Co⁺⁺존재하에서 얻어진 결과를 제4도에서 하얀 점 곡선으로 나타내는데; Co⁺⁺존재하에서 효소는 50℃이하에서 안정하고 60℃이상에서 불활성화 됨을 알 수 있다.

⑦ 금속 이온의 영향

대조로 금속염-제거 용액을 사용하여, ③에서 기술된 효소 활성 결정법으로 반응을 행하지만, 기질 용액에 가한 12.5mM(반응 혼합물에서 최종 농도 : 1mM) 염화 코발트를 제거하고, 그 대신에 12.5mM 또는 125mM(반응 혼합물에서 최종 농도는 각각 1mM 또는 10mM이다)의 각종 금속염 또는 EDTA를 가하고, 효소활성에 금속 이온이 미치는 영향을 조사한다. 이 실험에서 사용된 L-아미노아실라제의 활성은 이 첨가물로 영향을 받지 않는다. 결과는 표 4에 제시된다. 표 4에서, 효소 활성은 첨가하지 않는 경우에 얻어진 값을 100으로 기준한 상대활성으로 나타낸다.

표 4에서 보듯이, 상기 효소는 몇 종류의 금속 이온의 특정 농도 범위에서 우수하게 활성화 된다. 즉, 코발트 이온은 저농도(1mM 부근)에서 우수한 활성 효과를 갖지만 10mM에서는 효소가 거의 활성화 되지 않는다. 아연 이온 및 니켈 이온도 유사한 경향을 갖는다. 마그네슘 이온의 경우에, 활성 효과는 1mM 보다 10mM에서 더 크다. 망간 이온 및 이가 철 이온은 유사한 경향을 갖는다. 조사된 종류의 금속 이온중에서, 구리 이온은 우수한 억제 효과를 나타낸다. 알루미늄 이온 및 몰리브드 이온 역시 10mM에서 효소 활성을 억제한다. EDTA는 10mM에서 우수한 억제 효과를 갖는다.

⑧ 분자량

실시예 2의 표 5중 단계 5에서 얻은 효소의 분자량은 하기 조건하에서 데이비스[Davis, Ann. N.Y. Acad. Sci., 121, 404(1964)]의 방법에 따라서 폴라아크릴아미드 겔 전기 영동으로 측정하는데 약 200,000이다 : 폴리아크릴아미드 구배 겔, PAG 플레이트 4/15(Daiichi-Pure Chemicals, Co., Japan): 30mA(일정 전류), 2시간. 효소의 분자량을 시료 효소 및 표준 단백질간의 이동률을 비교하여 평가한다.

이 효소의 서브 유닛의 분자량을 동일 조건하 소듐 도데실 설페이트(SDS) 존재내에서 SDS-PAG 플레이 4/20(Daiichi Pure Chemicals, CO., Japan)를 사용하여 동일한 방법으로 측정한다. 서브 유닛의 분자량은 약 40,000으로 평가된다.

⑨ 등전점

4.8(담체 앰폴라이트와 함께 아가로오스 전기 영동으로 결정함)이다. 전기 영동 유니트(모델 2117 Multiphor Ⅱ, LKB) 및 파말라이트(Pharmalyte), pH 3~10(Pharmacia, Sweden)를 사용하여 일정 전압(2W)에서 2.5시간 동안 전기영동을 행하여 결정한다.

L-아미노아실라제 또는 D-아미노아실라제를 조합하여 사용하면, 본 발명의 아실아미노산 라세마제는 값싼 DL-N-아실아미노산으로부터 광학적 활성 L-α-아미노산 또는 광학적 활성 D-α-아미노산을 한단계에서 생산할 수 있다.

L-아미노아실라제는 공지된 방법으로 쉽게 수득될 수 있지만, 시판물을 사용할 수도 있다. D-아미노아실라제는 스트렙토미세스속[일본국 특허공고 제126969/1987호 및 제126976/1987호], 슈도모나스속[genus Pseudomonas, Nature, 170, 888(1952), 일본국 특허공고 제31477/1985] 및 알칼리 게네스속 [genus Alcaligenes, Proceedings of the annual meeting of the Agricultural Chemical Society of Japan, 1987, p. 659]의 세균에 의해 생산된다고 보고되어 있다. 또한 본 발명에서 아실아미노산 라세마제-생산 미생물로 분리된 대부분의 균주는 아실아미노산 라세마제 뿐만 아니라 D-아미노아실라제 및/또는 L-아미노아실라제를 생산한다.

그러므로, 출발물질인 DL-N-아실아미노산으로부터 광학적 활성 α-아미노산의 제조를 위해, 목적 및 사용방법에 적절한 표준 시료를 본 발명의 방법으로 제조된 것 같은 각종 정제 정도의 아실아미노산 라세마제 표준 시료에서 선택한다. 예를 들어, L-α-아미노산을 생산하려면, 선택된 표준 효소 시료 및 구입하거나 또는 적절한 L-아미노아실라제-생산 미생물에서 분리된 L-아미노아실라제를 조합하여 또는 번갈아가면서 DL-N-아실아미노산과 반응시킨다. 출발물질이 100% L-α-아미노산으로 전환되었을 때, 반응을 중단시키고 목적 L-α-아미노산을 반응 혼합물에서 회수한다.

여기에서, 그 용도의 목적이 L-아미노산의 생산이라면, 적절한 표준 시료는 D-아미노아실라제를 함유해서는 안된다. 효소를 생반응기로 사용하기 위해 고정시키는 경우에, 인트랩핑(entrapping) 고정화법에서 표준 시료를 효소 자체를 함유하는 세포이거나 세포-제거 추출액이어도 되는 반면에, 이온 교환 수지 흡착법 또는 불용성 담체 공유 결합법에서의 표준 효소 시료의 정제 정도는 약간 더 높아야만 한다.

본 발명에 따른 광학적 활성 아미노산의 제조방법에서 사용될 수 있는 아실아미노산 라세마제 표준 시료에는, 아실아미노산 라세마제-생산 미생물이 L-아미노아실라제 및 D-아미노아실라제 모두 생산하지 않는 경우에, 미생물의 배양 세포, 세포에서 다양한 정도로 추출 및 정제된 그의 생성물 및 표준 시료가 포함된다.

또한 L-아미노아실라제 또는 D-아미노아실라제를 생산할 때, 아실아미노산 라세마제-생산 미생물을 상술한 미생물에서와 동일한 방법으로 L-α-아미노산 또는 D-α-아미노산응 생산하기 위해 사용할 수 있다. 이 경우에, 함께 생산된 L-아미노아실라제 또는 D-아미노아실라제의 활성이 아실아미노산 라세마제의 활성보다 훨씬 강한 경우에는 별도로 L-아미노아실라제 또는 D-아미노아실라제를 가할 필요가 없다.

아실아미노산 라세마제-생산 미생물이 L-아미노아실라제 및 D-아미노아실라제를 모두 생산할때에는, D-아미노아실라제 및 L-아미노아실라제 결핍 균주가 통상적인 방법으로 돌연변이적으로 유도되어 각각 L-아미노산 및 D-아미노산을 생산할 수 있다. 또한 배양 세포 내지 표준 효소 시료 범위의 각 정제 수준인 생성물을 적당히 사용할 수 있다.

생성물이, 배양 세포 또는 세포-제거 추출액의 수준이면, 목적 아미노산을 분해하는 효소를 함유할 수 있는데; 이 경우에, 아미노산 분해 활성은 결핍 또는 감소되어야만 한다. 미생물이 아미노아실라제-결핍 균주이면, 세포 수준에서 광학적 활성 α-아미노산을 생산하기 위해 직접 사용하기는 곤란하지만, 열처리 또는 억제제 첨가등의 방법으로 아실아미노산 라세마제에 영향을 미치지 않고 하나의 또는 두가지 모두의 아미노아실라제를 불활성시킨 후에는 미생물을 사용할 수 있다. L- 및 D-아미노아실라제 모두를 같이 생산하는 균주에서 아실아미노산 라세마제의 표준시료를 제조하기 위해, 우선 아실아미노산 라세마제를 배양세포에서 추출하고, 목적 아미노산의 생산을 방해하는 아미노아실라제를 분리 및 제거하고, 필요하다면, 적절한 정제 방법을 더 사용하여 표준 시료를 제조한다.

L-또는 D-α-아미노산이 아실아미노산 라세마제 및 L-또는 D-아미노아실라제에 의해 생산될 때, 일반적으로 (1) 아실아미노산 라세마제 및 L- 또는 D-아미노아실라제이 표준 시료를 적당량의 출발물질 DL-N-아실아미노산 및 Co또는 다른 종류의 금속 이온을 함유하는 pH 6~9의 완충액에 용해시키고, 이 용액을 반응이 완결될 때까지 적당한 온도를 유지시키는 방법; (2) 아실아미노산 라세마제 및 L-또는 D-아미노아실라제의 표준 시료를 공지된 방법으로 함께 또는 따로 공정시킨 후, 반응 용기를 하나 이상의 단계로 채워 생반응기를 제조하고, DL-N-아실아미노산 및 Co또는 다른 종류의 금속 이온을 함유하는 pH 6~9의 완충액을 이 반응기에 통과시켜 반응시키는 방법; 및 (3) 두가지 효소 모두를 한외 여과막을 이용하여 두 구획으로 나눈 반응 용기의 한 구획에 용해시키고, 반응을 위해 출발물질 용액을 가하고, 한외 여과막을 통과하는 생성물을 회수하는 방법과 같은 방법을 사용한다. 어떤 경우이든지, 반응 혼합물을 샬균시키고 가능한 무균 처리하는 것이 바람직하다.

이렇게 수득된 최종 반응 혼합물이 목적하는 광학적 활성 아미노산 및 아실기의 가수분해로 생산된 유기산만을 함유하므로, 목적 아미노산은 통상적인 방법으로 쉽게 회수할 수 있다.

[실시예 1]

BBL 트립티카제 소이 브로쓰(BBL Trypticase soy broth, Becton Dickinson Co.에서 시판됨) 및 0.1% N-아세틸-D-메티오닌을 함유하는 배지(pH 7.0)을 200ml-삼각 플라스크에 20ml의 분획으로 담고 120℃에서 20분간 동안 멸균시킨다. 한편, 액체 배양으로 배양한 후 스트렙토미세스(Streptomyces)sp. Y-53 균주를 동결 조건(-80℃)하에서 저장하고, 필요할 때 종 접종물로서 용액에 사용한다.

상기 배지의 플라스크 30개에 동결 미생물을 플라스크당 0.7ml의 양으로 용액에 무균 접종하고, 28℃에서 2일 동안 진탕 배양하여 종 배양액을 얻는다. 그런후 각각의 종 배양액을 동일 배지의 플라스크 500개에 플라스크당 1ml의 양으로 옮기고, 28℃에서 42시간 동안 진탕 배양한다. 플라스크의 내용물을 수집하고, 세포를 원심분리(4℃, 1000rpm, 15분 동안)로 수집한다. 세포를 생리 식염수로 세척하여, 216g의 습윤 세포를 수득한다. 하기 방법은 모두 4℃ 이하의 저온에서 행한다.

216g의 습윤 세포를 1ℓ의 50mM 인산염 완충액(pH 7.0)에 현탁시키고 디노-밀(Willy A. Bachofen AG에서 생산된 세포 파열기)에 적용하여 세포를 파열시킨다. 사용되는 유리 비이드는 직경이 0.1~0.2mm이고, 유속은 60ml/분이다. 이 과정의 액체를 4℃, 10000rpm에서 20분동안 원심분리하여 1700ml의 세포-제거추출액을 수득한다. 이 추출액의 아실아미노산 라세마제 활성은 4.9 단위이고, 특이 활성은 0.52밀리 단위/mg 단백질이다. 단백질 총량은 바이오-래드 단백질 분석법으로 결정한다.

[실시예 2]

실시예 1에서 수득한 1700ml의 세포-제거 추출액에, 추출액을 냉각 교반하면서 300g의 황산암모늄을 천천히 가한다. 전체량을 가한 후, 다시 30분 동안 더 교반하고, 혼합물을 4℃, 10000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 1660㎖의 맑은 상층액을 수득한다.

1660의 상층액을 50mM 인산염 완충액(pH 7.0, 30% 포화 황산암모늄을 함유)으로 평형화된 TSKHW 65C(Tosoh Co., Japan) 컬럼(4.8cm×30cm)에 흡착시키고, 컬럼을 1000ml이 상기 인산염 완충액으로 세척한 후, 단백질 성분을 황산암모늄이 함유되지 않은 인산염 완충액으로 용출시키고, 목적 효소의 활성을 나타내는 용출 분획을 수집한다. 이렇게 수득된 330ml의 활성 분획에 분획을 냉각 교반하면서 128g의 황산암모늄을 천천히 가한다. 생성된 침전을 원심분리(10000rpm, 30분 동안)로 수집한다. 이 침전물을 50ml의 50mM 인산염 완충액(pH 7.0)에 용해시키고 세파덱스 G25 컬럼(Pharmacia, Sweden)을 통하여 탈염시킨다. 이렇게 수득된 조 효소 용액을 50mM 인산염 완충액으로 평형화된 DEAE 도요펄 650M(DEAE Toyopearl 650M, Tosoh Co., Japan) 컬럼(4.8cm×30cm)에 흡착시킨다. 컬럼을 1000ml의 동일한 완충액으로 세척하고, 0.2M NaCl을 함유하는 동일한 완충액으로 용출시켜 340ml의 활성 분획을 수득한다. 이 활성 분획에, 133g의 황산암모늄을 통상적인 방법으로 가한다. 생성된 침전을 원심분리(4℃, 10000rpm, 30분 동안)로 수집하고 30ml의 동일한 완충액에 용해시킨다. 이용액을 세파덱스 G5 컬럼을 통하여 탈염시켜, 59ml의 조효소 용액을 수득한다. 이 조 효소 용액을 동일한 완충액으로 평형화된 DEAE-5PW 컬럼(Tosoh Co., Japan, 2.15cm 직경×15cm)에 흡착시키고, 고성능 액체 크로마토 그래피(모델 HLC-837, Tosoh Co., Japan)에 적용시키고, 0에서 0.5M의 NaCl 직선 증가 농도로 용출시킨다. 용출속도는 4ml/분이다. 32~36분에 용출된 분획을 회수하여 16ml의 활성 분획을 수득한다. 이 분획에서의 아실아미노산 라세마제 활성은 약 7.2 단위이고 특이 활성은 약 63밀리 단위/mg 단백질이다. 이 특이 활성은 세포-제거 추출물의 특이 활성보다 약 122배 증가되었다.

이 활성 분획을 50mM 인산염 완충액으로 평형화된 TSK-G3000 SW 칼럼(Tosho Co., Japan, 5.5cm 직경×60cm)에 더 적용시키고, 유속 1ml/분으로 겔 여과하고 활성 분획을 분리해낸다. 이 분획이 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에서 단일 밴드를 나타내므로 아실아미노산 라세마제는 거의 정제된 것으로 판단한다. 이 분획은 1.2단위의 아실아미노산 라세마제 활성 및 2.8 단위/mg 단백질의 특이 활성을 갖는다.

각 분획 과정에서의 각 시료 용액의 부피뿐만 아니라 아실아미노산 라세마제의 총 활성, 총 단백질 합량 및 특이 활성은 표 5에 제시된다.

[실시예 3]

실시예 1과 동일한 방법으로, 스트렙토미세스 sp. Y-53 균주를 10l의 배양액에서 배양한다. 42-시간 배양으로 수득된 세포를 수집하고 0.8% NaCl 용액으로 한번 세척하여 300g의 습윤 세포를 수득한다.

습윤 세포를 실시예 1과 동일한 방법으로 디노-밀(세포 파열기)을 사용하여 파열시키고, 원심분리(10000rpm, 20분 동안)하여 1680ml의 상층액을 수득한다. 이 상층액은 21 단위의 아실아미노산 라세마제, 315 단위의 L-아미노아실라제 및 75단위의 D-아미노아실라제를 함유한다. 이 상층액에, 황산암모늄을 더 가하여 30% 포화시키고, 생성된 침전을 원심분리로 제거한다. 원심분리 상층액 분획에 황산암모늄을 더 가하여 60% 포화시키고, 생성된 침전을 원심분리로 회수한다. 수득된 침전을 50mM 인산염 완충액(pH 7.0)에 용해시키고 동일한 완충액으로 평형화된 세파덱스 G25를 사용하여 겔 여과로 탈염시킨다. 수득된 용액을 이온교환 크로마토그래피시킨다.

50mM 인산염 완충액(pH 7.0)으로 평형화된 DEAE 도요펄 650M 컬럼(수지 부피 : 700ml)을 상기 탈염용액(490ml)으로 채우고, 2ℓ의 동일한 인산염 완충액으로 세척하여 비흡착 성분을 세척해낸다. 이 세척액에서, 114 단위의 D-아미노아실라제를 회수한다. 이 DEAE 도요펄 650M 컬럼은 상대적으로 강하게 흡착된 아실아미노산 라세마제(약 20 단위) 및 L-아미노아실라제 (약 900 단위)를 갖는데, 0.2몰 이상의 염을 함유하는 용액을 컬럼에 통과시키지 않는 한 용출되지 않느다.

상기 컬럼을 30℃로 유지하면서, 0.5% N-아세틸-DL-메티오닌 및 1mM 염화 코발트를 함유하는 20mM 인산염 완충액을 30ml/시간의 유속으로 컬럼에 통과시킨다. 3ℓ의 유출액을 수집하고 1R 120 양이온 교환수지를 통과시킨 후, 건조되고 고체로 될 때까지 감압하에서 농축시킨다. 10ml의 냉무수 알콜로 2회 세척한 후, 수득된 잔류물을 약 100ml의 온수에 용해시키고, 냉각동안 분리된 결정을 여과로 수집한다. 또한, 알콜을 여액에 적가하고, 이 혼합물을 밤새도록 방치한다. 분리된 결정을 수집하고 건조시켜 9.6g의 L-메티오닌을 수득한다. 융점은 280~281℃이고, [α]

-8.20(c=1%)이다. 이 생성물을 고성능 액체 크로마토그래피 및 박막 크로마토그래피하면 L-메티오닌의 표준 시료의 것과 모두 동일하다.

또한, 이 생성물을 표준 시료와 함께 용융시키면서 융점의 감소를 보이지 않는다.

[실시예 4]

200ml-삼각플라스크내 1.5% 글리세린, 1.0% 펩톤, 1.0% 효모 추출액, 0.5% NaCl, 0.25% K₂HPO₄, 0.25% MgSO₄및 0.05% N-아세틸-DL-메티오닌(pH 7.0)으로 이루어진 200ml-종 배양 배지에, 실시예 1에서 제조된 0.7ml-원 배양액을 접종시키고 회전 교반기(200rpm)로 28℃에서 18시간 동안 배양한다. 1ml의 생성 배양액을 0.5% 글리세린, 1.0% 펩톤, 0.5% NaCl, 0.25% K₂HPO₄및 0.05% N-아세틸-DL-메티오닌(pH 7.0)으로 이루어진 25ml의 생성 배지를 함유하는 200ml-삼각플라스크에 옮긴다. 상기와 동일한 조건하에서 배양시킨다. 하기 방법은 0~4℃에서 행한다.

5ℓ의 배양 브로쓰에서 세포를 원심분리(10000rpm, 15분 동안)로 수확하고 0.85% NaCl 수용액으로 세척한다. 세척 세포(385g, 습윤 중량)를 1ℓ의 50mM 인산염 완충액(pH 7.0)에 현탁시키고 디노-밀(Willy A.Bachofen AG)로 하기 조건하에서 파열시킨다 : 유리 비이드의 직경, 0.1~0.2mm; 세포 현탁액의 유속, 60ml/분; 회전수, 3000rpm, 파열 세포를 원심분리(10000rpm, 20분 동안)로 제거한다. 수득된 상층액(1280ml)은 75단위의 아실아미노산 라세마제 활성 및 1500 단위의 L-아미노아실라제 활성을 갖는다. 세포-제거 추출액(1280ml)에, 500g의 (NH₄)₂SO₄를 가하여 실시예 2와 동일한 방법으로 60% 포화시킨다.

생성된 침전을 원심분리(10000rpm, 30분 동안)로 수집하고 600ml의 50mM 인산염 완충액(pH 7.0)에 용해시킨다. 효소 용액을 동일한 완충액에 대하여 18시간 동안 셀룰로오스 백을 사용하여 투석시킨다. 탈염 효소 용액을 50mM 인산염 완충액(pH 7.0)으로 평형화된 DEAE-도요펄 650M(Tosoh Co., Japan) 컬럼(3cm×30cm)에 채운다. 컬럼을 1000ml의 동일한 완충액으로 세척하고 1mM CoCl₂를 함유하는 1000ml의 20mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)로 더 세척한다.

이 컬럼에 흡착된 아실아미노산 라세마제 및 L-아미노아실라제의 총 활성은 각각 43 및 800 단위이다. 상기 컬럼을 28℃로 유지하면서, 0.5% N-클로로아세틸-D-발린, 1mM CoCl₂및 1㎍/㎖ 디히드로 스트렙토마이신 설페이트를 함유하는 2000ml의 20mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)을 60ml/시간의 유속으로 컬럼에 통과시킨다. 반응 종결후, 컬럼을 1mM CoCl₂를 함유하는 500ml의 20mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)으로 세척한다. 용출액을 수집하고 고성능 액체 크로마토그래피로 분석한다. 이 용액에서는 N-클로로아세틸-D-발린이 전혀 검출되지 않는다. 용출액을 진공으로 농축시키고, 냉에탄올을 가한다. 수득된 백색 침전 고체를 여과로 수집하고, 냉에탄올로 세척하고 소량의 물-에탄올에 용해시킨다. 4℃에서 방치하여, 무색 엽상 결정을 수득한다. 결정을 여과로 수집하고 건조시킨다. 수득된 량은 4.5g이다. 융점은 315℃(분해)이다.

[α]

+6.4°(c=1,H₂O) 이 결정의 시료용액은 고성능 액체 크로마토그래피 및 박막 크로마토그래피에서 각각 L-발린의 표준 시료와 동일한 머무름시간 및 Rf 값을 갖는다.

Claims

하기 특성을 갖는 효소 아실아미노산 라세마제: (1) D-N-아실-α-아미노카르복실산을 대응하는 L-N-아실-α-아미노카르복실산으로 전환시킨다 ; (2) L-N-아실-α-아미노카르복실산을 대응하는 D-N-아실-α-아미노카르복실산으로 전환시킨다 ; (3) D-α-아미노산을 대응하는 L-α-아미노산으로 전환시키지 않는다 ; (4) L-α-아미노산을 대응하는 D-α-아미노산으로 전환시키지 않는다 ; (5) 효소 활성을 위한 최적 pH : 8 ; (6) 효소 안정성을 pH 범위 : 6~9 ; (7) 효소 활성을 위한 최적 온도: 30~50℃ ; 및 (8) 분자량: 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의한 측정시 40,000.
아실아미노산 라세마제를 생산할 수 있는 미생물을 배양 배지에서 배양하여 브로쓰에 상기 효소를 축적시키고 효소를 수확하는 것으로 구성되며, 상기 아실아미노산 라세마제를 생산할 수 있는 미생물이 다음중에서 선택됨을 특징으로 하는, 제1항에 따른 아실아미노산 라세마제의 제조방법 : 스트렙토마이세스 sp. Y-53(FERM BP-1889: FERM P-9518), 액티노마두라 로세오비올라세아(IFO 14098), 액티노마이세스 아우레오모노포디알레스(IFO 13020), 젠세니아 카니크루리아(IFO 13914), 아미콜라톱시스 오리엔탈리스(IFO 12806), 세베키아 베니하나(IFO 14309), 스트렙토마이세스 코엘레스센스(IFO 13378), 스트렙토마이세스 셀룰로플라부스(IFO 13780), 스트렙토마이세스 알보플라부스(IFO 13196), 스트렙토마이세스 아우레오서쿨라투스(IFO 13018), 스트렙토마이세스 디아스타토크로모겐스(IFO 13389), 스트렙토마이세스 스펙타빌리스(IFO 13424), 스트렙토마이세스 투이루스(IFO 13418) 및 스트렙토마이세스 그리세오아우란티아쿠스(IFO 13381).
D-또는 L-아미노아실라제의 존재하에서 제1항에 따른 아실아미노산 라세마제를 DL-N-아실-α-아미노카르복실산과 접촉시킴을 특징으로 하는 광학적 활성 D-또는 L-아미노산의 제조방법.