JP2868905B2 - ジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はジアセチルポリアミンア
ミドヒドロラ ーゼに関するものである。本発明による
酵素、ジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼは、医
農薬合成中間体として有用 なモノアセチルポリアミン
の合成や、生体試料中のジアセチルポリアミンの定量等
に使用される。

【０００２】

【従来の技術】ジアセチルポリアミンアミドヒドロラー
ゼはジアセチルポリアミンを加水分解してモノアセチル
ポリアミンを生成する酵素で、例えば次の反応を触媒す
る。 ジアセチルプトレッシン ＋ H₂O → モノアセチルプトレッシン ＋ CH₃COOH 従来、ジアセチルポリアミンに作用するアミドヒドロラ
ーゼに関する知見はほとんどなく、工業的に利用できる
技術が確立されていない。またジアセチルポリアミンか
ら有機化学的にモノアセチルポリアミンを得ようとする
際には、 遊離ポリアミンが大量に副成し、分離精製操
作が煩雑である上、収率が低いという問題点があった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記背景から、ジアセ
チルポリアミンに作用し、モノアセチルポリアミンを生
成する酵素、 ジアセチルポリアミンアミドヒドロラー
ゼを見い出すことが望まれていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段 】本発明者らは、かかる
課題を解決すべく鋭意研究した結果、ジアセチルポリア
ミンに作用しモノアセチルポリアミンを生成する酵素、
ジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを、微生物中
に見出し本発明を完成するに至った。

【０００５】即ち、本発明は以下の理化学的性質を有す
るジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを提供する
ものである。

【０００６】（１）作用ジアセチルポリアミンに作用し
て、アミド結合を加水分解し、モノアセチルポリアミン
を生成する。反応式を例示すると次の通りである。 CH₃CO-NH-(CH₂)₄-NH-COCH₃ ＋ H₂O → シ゛アセチルフ゜トレッシン CH₃CO-NH-(CH₂)₄-NH₂ ＋ CH₃COOH モノアセチルフ゜トレッシン

【０００７】（２）基質特異性ジアセチルプトレッシ
ン、ジアセチルカダベリン、ジアセチル-1,6-ジアミノ
ヘキサン等ジアセチルポリアミンに対して作用する。こ
れらのジアセチルポリアミンに対する作用の強さを、そ
れぞれジアセチルプトレッシンに対する作用を100とし
た相対活性値で表１に示す

【０００８】

【０００９】（３）至適pH ： pH 8.5〜9.5 （図１に示
す） （４）pH安定性 ： 30℃で30分間保存したとき、pH 7.0
〜9.0において90％以上の残存活性を有する。（図２に
示す）

【００１０】（５）至適温度：pH9.0、15分間の反応に
おいて37〜42℃である。（図３に示す） （６）温度安定性：pH7.5、30分間の処理条件下におい
て、53℃までの温度で90％以上の残存活性を有する。ま
た、67℃、30分間の処理で完全に失活する。（図４に示
す。） （７）分子量：135,000±5,000（ゲル濾過法で測定）ま
た、本発明のジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼ
が有するその他の理化学的性質は以下の通りである。 １．サブユニットの分子量：35,000±5,000（SDS-ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法で測定） ２．サブユニットの数：４個 ３．Km値：ジアセチルプトレッシンを基質として、pH9.
0、37℃の条件下で求めたプトレッシンに対するKm値は
4.0mMである。 ４．阻害剤：種々の試薬及び金属イオンの濃度１mMでの
本発明の酵素に対する影響を表２に示す。ヒドロキシル
アミン、α,α-ジピリジル、パラクロルメルクリ安息香
酸、フェニルメタンスルホン酸フロリド、塩化第二銅、
及び硝酸銀により強く阻害される。

【００１１】 ────────────────────

【００１２】本発明におけるジアセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼの酵素活性測定方法及び酵素活性の表示
方法は以下の通りである。20mMのジアセチルプトレッシ
ン1mlと、アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ（特公
昭 59-7435） 6.8ユニット、プトレッシンオキシダーゼ
0.28ユニット、パーオキシダーゼ 0.9ユニット、2,4-ジ
クロロフェノール 0.75mg 、4-アミノアンチピリン 0.0
6mgを含む 0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH 8.0）1.0ml とジ
アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを含有する被検
体 50μl を混合し、30℃で 1時間反応させた後、510nm
における吸光度を測定することによって行われる。

【００１３】酵素活性値は、1分間当り 1μmole のモノ
アセチルプトレッシンを生成させる酵素量を 1ユニット
（μmole／min）として表示する。

【００１４】本発明のジアセチルポリアミンアミドヒド
ロラーゼは、該ジアセチルポリアミンアミドヒドロラー
ゼの生産能のある微生物の培養物から採取することがで
きる。その微生物としては、例えばアルカリゲネス属に
属する菌株であり、好ましくはアリカリゲネス・フェカ
リス（Alcaligenes faeca-lis IFO 14479）が挙げられ
る。

【００１５】生産菌の培養に使用する培地としてはグル
コース、糖蜜、可溶性でんぷん等の炭素源、肉エキス、
酵母エキス、ポリペプトン等の窒素源、及びリン酸第一
カリウム、リン酸第二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸
マグネシウム等の無機塩類を含有するものであれば特に
限定されないが、これらの成分の他にジアセチルプトレ
ッシン、ジアセチルカダベリン等のジアセチルポリアミ
ンを含有させることが該酵素の生産性を高める上におい
て有利である。

【００１６】本発明のジアセチルポリアミンアミドヒド
ロラーゼを生産する生産菌を培養する際の培養条件とし
ては、通気攪拌条件下で培養温度が 15〜40 ℃の範囲、
好ましくは 20〜35 ℃の範囲で培養する方法が好適であ
る。培養時のpH条件は、5.0〜9.0の範囲で、好ましくは
pH6.0〜8.0 の範囲が適当である。培養時間は、特に限
定されないが酵素の生産性等の経済性を考慮すると増殖
の後期に達する時間から休止状態に入ってから30時間以
内の範囲が適当である。

【００１７】培養によって得られた培養物から培養液と
菌体とを分離する方法としては、従来から行われている
遠心分離法や濾過等の方法が使用できるが、遠心分離の
方法が好適である。

【００１８】本発明のジアセチルポリアミンアミドヒド
ロラーゼの分離精製は、次のようにして行うことができ
る。菌体内に蓄積された該酵素を菌体から抽出する方法
としては、従来から行われている超音波による菌体破
砕、あるいはガラス・ビーズと共に回転させるダイノミ
ル細胞破砕機による菌体破砕または、リゾチーム等の酵
素やトルエン等の有機溶媒による細胞膜の破壊等の方法
が挙げられる。これらの中から適当な方法を選択して菌
体から酵素の抽出を行うことにより、酵素を採取するこ
とが出来る。

【００１９】これらの方法で抽出された粗酵素液からジ
アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼをさらに精製す
る必要がある場合には、通常実施されている一般的な酵
素の精製手段である硫酸アンモニウム沈澱法、イオン交
換カラムクロマトグラフィー法、ゲル濾過法、ヒドロキ
シアパタイト・カラムクロマトグラフィー法、アフィニ
ティークロマトグラフィー法、調整用電気泳動法等の方
法を適宜組み合わせるか、あるいは繰り返すことによっ
て精製を行うことが出来る。

【００２０】本発明によるジアセチルポリアミンアミド
ヒドロラーゼの完全に純化された酵素の比活性値は、約
13ユニット／mg-タンハ゜ク を示す。また、ドデシル硫酸ナトリ
ウムの存在、非存在下でのポリアクリルアミドゲル電気
泳動法において両者共に単一のタンパクバンドが観測さ
れる。

【００２１】

【発明の効果】本発明のジアセチルポリアミンアミドヒ
ドロラーゼは、ジアセチルポリアミンに作用してモノア
セチルポリアミンを生成し、モノアセチルポリアミンを
純粋かつ簡便に合成する際に、大変有用である。また、
生体試料中のジアセチルポリアミンの定量を可能にする

【００２２】

【実施例】以下、本発明を実施例によってさらに具体的
に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるもので
はない。

【００２３】0.5％ポリペプトン、0.01％酵母エキス、
0.2％ジアセチルプトレッシン、0.1％食塩、0.05％リン
酸第一カリウム、0.15％リン酸第二カリウム、 0.02％
消泡剤から成る培地（pH 7.0）0.5L を 2Lの三角フラス
コに入れ、120℃で20分間オートクレーブした後、28℃
以下でこの培地にアルカリゲネス・フェカリス（Alcali
genes faecalis IFO 14479）を植菌した。28℃で48
時間振とう培養を行った後この培養液を、予め上記と同
様の組成を有する培地 20Lを仕込み滅菌しておいたジャ
ー・ファーメンターに加えて本培養を行った。培養条件
は28℃、攪拌回転数100rpm、通気20L／minで、48時間培
養の後、培養液を遠心分離にかけて菌体を採取した。得
られた菌体の200g（湿菌体重量）を10mMリン酸緩衝液
（pH 7.5）1Lに懸濁し、その懸濁液を超音波破砕機によ
り菌体破砕を行った。その破砕液を遠心分離機を使用し
て遠心分離し、上清液を得た。この上清液中のジアセチ
ルポリアミンアミドヒドロラーゼの総活性は 1,080ユニッ
ト 、比活性は 0.014ユニット／mg-タンハ゜ク であった。

【００２４】この上清液を、予め 20mM のリン酸緩衝液
（pH 7.5）で平衡化した 600ml のDEAE-セルロースのカ
ラムに通し酵素を吸着させた。カラムを同様のリン酸緩
衝液で洗浄した後、食塩の直線濃度勾配によりジアセチ
ルポリアミンアミドヒドロラーゼを溶出させた。［総酵
素活性 = 950ユニット、 比活性 = 0.074ユニット／mg-タンハ゜ク ］

【００２５】この溶出液を限外濾過により脱塩した後、
硫酸アンモニウムを 20％となるように添加し、次いで
予め 20％の硫酸アンモニウムを含む 20mMリン酸緩衝液
（pH7.5）で平衡化しておいた 100mlのブチルトヨパー
ル 650M （東ソー社製）のカラムに通し、酵素を吸着さ
せた。カラムを同様のリン酸緩衝液で洗浄した後、硫酸
アンモニウムの逆直線濃度勾配によりジアセチルポリア
ミンアミドヒドロラーゼを溶出させた。［ 総酵素活性
= 845ユニット、 比活性 = 1.6ユニット／mg-タンハ゜ク ］得られた
酵素溶液を限外濾過により濃縮した後、1.8Lのセファク
リル S-300 （ファルマシア社製）を充填したカラムに
通し、ゲル濾過を行い活性画分を集めた。 ［総酵素活
性 = 762ユニット、 比活性 = 2.2ユニット／mg-タンハ゜ク ］

【００２６】この溶出液を、予め 20mM リン酸緩衝液
（pH 7.5）で平衡化しておいた 40mlの EAH-セファロ
ース（ファルマシア社製）のカラムに通し吸着させた。
カラムを同様の緩衝液で洗浄した後、食塩の直線濃度勾
配により、ジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを
溶出させた。［総酵素活性 = 670ユニット、 比活性 = 5.1ユ
ニット／mg-タンハ゜ク ］

【００２７】この溶出液を限外濾過により脱塩した後、
予め 20mM リン酸緩衝液（pH 7.5）で平衡化しておいた
70ml の DEAE-トヨパール 650S （東ソー社製）のカラ
ムに通し、酵素を吸着させた。カラムを同様のリン酸緩
衝液で洗浄した後、食塩の直線濃度勾配により、ジアセ
チルポリアミンアミドヒドロラーゼを溶出させた。［総
酵素活性 = 570ユニット、 比活性 = 8.5ユニット／mg-タンハ゜ク ］

【００２８】この溶出液に、硫酸アンモニウムを 15％
となるように添加し、次いで予め 15％の硫酸アンモニ
ウムを含む 20mM リン酸緩衝液（pH 7.5）で平衡化して
おいた100mlのフェニル-セファロース 4B （ファルマ
シア社製）のカラムに通し、酵素を吸着させた。カラム
を同様のリン酸緩衝液で洗浄した後、硫酸アンモニウム
の逆直線濃度勾配により、ジアセチルポリアミンアミド
ヒドロラーゼを溶出させた。［総酵素活性 = 480ユニット、
比活性 = 13ユニット／mg-タンハ゜ク ］

【００２９】こうして得られた酵素の純度をドデシル硫
酸ナトリウム存在下、及び非存在下でのポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって調べた結果、両者共に一本の
バンドのみが観察され、純粋なジアセチルポリアミンア
ミドヒドロラーゼであることが確認された。

【００３０】また、本酵素の分子量をバイオシル TSK-2
50 （東ソー社製）によるゲル濾過法により測定したと
ころ、約135,000と推定された。さらに、サブユニット
の分子量をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法により測定したところ、約35,000と推
定された。該分子量及びサブユニットの分子量から、本
発明の酵素が4個のサブユニットから構成されるオリゴ
マー酵素であることがわかる。

【００３１】次に、こうして得られた精製酵素を 10mM
リン酸緩衝液（pH 7.5）により適当に希釈して調整した
酵素標品を用いて本酵素の基質特異性、至適pH、 pH安
定性、至適温度、温度安定性を調べた。

【００３２】［基質特異性］ 酵素標品 0.05ml（1.3ユニット）を、各種ジアセチルポリア
ミンの100mM溶液 0.1ml、0.1M炭酸緩衝液（pH9.0）0.85
mlから成る反応液に添加し、37゜Ｃで15分間反応させ
た。50％トリクロロ酢酸0.1mlを添加して反応を停止さ
せた後、生成したモノアセチルポリアミンを高速液体ク
ロマトグラフィーにより定量した。また、これらのジア
セチルポリアミンに対する作用の強さを、それぞれジア
セチルプトレッシンに対する作用を100とした相対活性
値も併せて表３に示す。尚、ジアセチル-1,8-ジアミノ
オクタンに対する作用については、反応液中に10％エタ
ノールを含有させた。

【００３３】

【表１】

【００３４】［至適pH］ 10mM ジアセチルプトレッシンを含む 0.1M ブリットン-
ロビンソン広域緩衝液（ pH 4.4，5.7， 7.1，7.6，8.
7，9.4，10.3，11.3，11.8，12.5 ）0.95ml に0.05ml
の酵素標品（0.04 ユニット）を添加混合し、37℃下で 15分
間反応を行った。この反応溶液 1.0ml に 50％トリクロ
ロ酢酸水溶液を 0.1ml 加え、 0℃下で20分間放置し、
次いで、 1M リン酸緩衝液（pH 7.5） 0.9ml を加え
た。この溶液 0.2ml と 10mM リン酸緩衝液（pH 7.5）
0.8ml と、アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ 6.8ユニ
ット、プトレッシンオキシダーゼ 0.28ユニット、パーオキシ
ダーゼ 0.9ユニット、2,4-ジクロロフェノール 0.75mg、及
び 4-アミノンチピリン 0.06mgを含む 0.1M トリス塩
酸緩衝液（pH 8.0）1ml を混合し、37℃で15分間反応さ
せた後、510nm における吸光度を測定し、それぞれの酵
素活性値を算出した。以上の操作の後、最高の酵素活性
値を 100％とした相対活性（Relative activity）を算
出し、グラフ化して図１を得た。図１より、本酵素の至
適 pH は 8.5〜9.5 の範囲にあることがわかる。

【００３５】［pH 安定性］ 0.1M ブリットン-ロビンソン広域緩衝液（ pH 3.7，4.
4，5.7，7.1，7.6，8.7，9.4，10.3, 11.3，11.8，12.5
） 0.95ml と酵素標品 0.05ml（0.4ユニット）を混合し、3
0℃で 30分間放置した後、各溶液 0.1ml と 1M リン酸
緩衝液（pH 7.5）0.9ml を混合した。この酵素溶液0.05
mlと 20mMジアセチルプトレッシン 1.0ml と、アシルポ
リアミンアミドヒドロラーゼ 6.8ユニット、プトレッシンオ
キシダーゼ 0.28ユニット、パーオキシダーゼ 0.9ユニット、2,
4-ジクロロフェーフール 0.75mg、及び4-アミノンチピ
リン 0.06mgを含む 0.1M トリス塩酸緩衝液（pH 8.0）1
ml を混合し、37℃で 15分間反応させた後、直ちに 510
nm における吸光度を測定し、それぞれの酵素活性値を
算出した。以上の操作の後、最高の酵素活性値を 100％
とした相対活性を算出し、グラフ化して図２を得た。図
２から明らかなように、本酵素は pH 7.0〜9.0 の範囲
において 90％以上の残存活性を有している。

【００３６】［至適温度］ 10mMジアセチルプトレッシンを含む 0.1M 炭酸緩衝液
（pH 9.0）0.95ml と 0.05ml の酵素標品 （0.65ユニット）
を混合し、10，20，30，37，40，42，46，50，60℃の各
温度下において 15分間反応させた。各反応溶液に 50％
トリクロロ酢酸溶液 0.1ml を加え、0℃下で 20分間放
置した後、1M リン酸緩衝液（pH 7.5）0.9ml を加え
た。 この溶液0.2ml と 10mM リン酸緩衝液（ pH 7.5
） 0.8mlと、アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ 6.
8ユニット、プトレッシンオキシダーゼ 0.28ユニット、パーオ
キシダーゼ 0.9ユニット、2,4-ジクロロフェノール 0.75m
g、及び4-アミノンチピリン 0.06mgを含む 0.1M トリス
塩酸緩衝液（ pH 8.0 ）1ml を混合し、37℃で 15分間
反応させた後、510nm における吸光度を測定し、それぞ
れの酵素活性値を算出した。以上の操作の後、最高の酵
素活性値を100％とした相対活性（Relative activity）
を算出し、グラフ化して図３を得た。図３より、本酵素
の至適温度は 37〜42℃ の範囲にあることがわかる。

【００３７】［温度安定性］ 10mM リン酸緩衝液（pH 7.5）で希釈した酵素標品（0.8
ユニット）を4，23，30，37，45，53，60，67，75℃ の各温
度で 30分間放置した。この酵素溶液を10mリン酸緩衝液
で10倍に希釈した希釈液 0.05ml と 20mM ジアセチルプ
トレッシン 1mlと、アシルポリアミンアミドヒドロラー
ゼ 6.8ユニット、プトレッシンオキシダーゼ0.28ユニット、パー
オキシダーゼ 0.9ユニット、2,4-ジクロロフェノール 0.
75mg、及び4-アミノンチピリン 0.06mgを含む 0.1Mトリ
ス塩酸緩衝液（pH 8.0）1ml を混合し、37℃で 15分間
反応させた後、510nm における吸光度を測定し、それぞ
れの酵素活性値を算出した。以上の操作の後、最高の酵
素活性値を100％とした相対活性を算出し、グラフ化し
て図４を得た。図４から明らかなように、本酵素は 53
℃までの温度において 90％以上の残存活性を有してい
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本説明のジアセチルポリアミンアミドヒドロラ
ーゼの pH 活性曲線を示す図

【図２】同酵素のpH安定性を示す図

【図３】同酵素の温度活性曲線を示す図

【図４】同酵素の温度安定性を示す図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平２−163086（ＪＰ，Ａ) Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．34 （１）ｐ．269−274（1986) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/80 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するジアセチル
   ポリアミンアミドヒドロラーゼ。 （１）作用：ジアセチルポリアミンのアミド結合を加水
   分解してモノアセチルポリアミンを生成する。 （２）基質特異性：ジアセチルプトレッシン、ジアセチ
   ルカダベリン、ジアセチル-1,6-ジアミノヘキサン等、
   ジアセチルポリアミンに対して作用する。 （３）至適pH：pH8.5〜9.5。 （４）pH安定性：30℃で30分間保存した時、pH7.0〜9.0
   において90％以上の残存活性を有する。 （５）至適温度：pH9.0、15分間の反応において37〜42
   ℃である。 （６）温度安定性：pH7.5、30分間の処理条件下におい
   て、53℃までの温度で90％以上の残存活性を有する。 （７）分子量：135,000±5,000。