JPH0424999B2

JPH0424999B2 -

Info

Publication number: JPH0424999B2
Application number: JP24289083A
Authority: JP
Inventors: Shinichi Tejima; Noboru Mitsuhida; Hiroshi Inoe; Tokuji Ikenaka; Kaoru Oomichi
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1983-12-22
Filing date: 1983-12-22
Publication date: 1992-04-28
Also published as: JPS60237998A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は新規なα−アミラーゼ基質を用いたα
−アミラーゼ活性測定法に関するものである。〔従来の技術及びその問題点〕最近、ヒト体液中のアミラーゼ活性の測定用基
質として、構造の明確なマルトオリゴ糖、例えば
マルトテトラオース、マルトペンタオース、マル
トヘキサオースなどが使用される様になりつつあ
る。これらのうち代表例としてマルトペンタオー
スを基質として使用する場合をとりあげて説明す
ると、測定様式は次の様に表わすことができる。 (1) マルトペンタオースアミラーゼ ――――――→ マルトース＋マルトトリオース (2) マルトース＋マルトトリオース α−グルコシダーゼ（EC3.4.1.20、以下同
じ。） α−グルコシダーゼ（EC3.4.1.20、以下同
じ。） ―――――――――――――――――――――――――
―――――――→ グルコースここに生成したグルコースは、公知の方法、例
えばグルコースオキシダーゼ／パーオキシダー
ゼ／色素系、もしくはヘキソキナーゼ／ホスフオ
グルコムターゼ／グルコース−６−ホスフエート
デヒドロゲナーゼ／NADH系等で測定される。ところがこの測定系には、基質（マルトオリゴ
糖）に対しわずかではあるが、α−グルコシダー
ゼが作用するという欠点があり、ブランク値が上
昇する。他方、マルトオリゴ糖の還元末端にフエニル
基、ナフチル基或はそれらの類似体を結合した基
質が合成され、次の様なものを基質とするアミラ
ーゼ測定試薬が提案されている。ｐ−ニトロフエニルマルトペンタオシド（特公
昭57−53079号公報）ｐ−ニトロフエニルマルトヘキサオシド（特公
昭57−53079号公報）ｐ−ニトロフエニルマルトヘプタオシド（特公
昭54−51892号公報）２，４−ジクロロフエニルマルトペンタオシド
（特開昭56−35998号公報）これらの化合物を基質とするアミラーゼ活性の
測定様式を例示すると、次の様になる。ｐ−ニトロフエニルα−マルトペンタオシドの場
合 (1) ｐ−ニトロフエニルα−マルトペンタオシドアミラーゼ ―――――→ ｐ−ニトロフエニル α−マルトシド＋マルトトリオース (2) ｐ−ニトロフエニルα−マルトシド＋マルト
トリオース α−グルコシダーゼ ――――――――――→ ｐ−ニトロフエノール＋グルコースこの系においても、基質のｐ−ニトロフエニル
α−マルトペンタオシドにα−グリコシダーゼが
作用してブランク値が上昇する。２，４−ジクロロフエニルβ−マルトペンタオシ
ドの場合 (1) ２，４−ジクロロフエニルβ−マルトペンタ
オシドアミラーゼ ―――――→ ２，４−ジクロロフエニル β−マルトシド＋マルトトリオース（２−ａ）２，４−ジクロロフエニルβ−マル
トシド＋マルトトリオース α−グルコシダーゼ ――――――――――→ ２，４−ジクロロフエニル β−グルコシド＋グルコース（２−ｂ）２，４−ジクロロフエニルβ−グル
コシド β−グルコシダーゼ（EC3.4.1.21、以下同じ。） β−グルコシダーゼ（EC3.4.1.21、以下同じ。） ―――――――――――――――――――――――――
―――→ ２，４−ジクロロフエノール＋グルコース（２−ｂ−１）２，４−ジクロロフエノール＋
４−アミノアンチピリン酸化剤 ――――→ キノン色素この系においても、基質である２，４−ジクロ
ロフエニルβ−マルトペンタオシドにα−グルコ
シダーゼとβ−グルコシダーゼが作用してブラン
クが上昇する。結局、従来提供されてきた基質を使用する測定
系では、α−グルコシダーゼが基質に作用するこ
とから、試薬ブランク値の上昇が著しいという問
題点がある。さらにα−グルコシダーゼ液と基質
液の一液化は、α−グルコシダーゼの基質分解に
より、試薬の安定性を著しく損うという共通の問
題点があつた。〔問題点を解決するための手段〕そこで、本発明者等は種々研究した結果、非還
元末端に置換基を導入することにより、これらの
問題点が解決できることを知り、本発明を完成す
るに至つた。すなわち本発明は、一般式（）：［式中、R¹はハロゲン原子、

【式】−Ｏ−R³（但し、R³ は炭素数１〜６のアルキル基を示す。）又は−
NH−R⁴（但し、R⁴は炭素数１〜６のアルキル
基、フエニル基又はピリジル基を示す。）を示し、
R²は、ハロゲン原子又は／及びニトロ基を置換
基として有していてもよいフエニル基を示し、ｎ
は１〜６の整数を示す。］で表わされる非還元末
端を修飾したオリゴサツカライド誘導体を基質と
して、α−グリコシダーゼ及び／又はグルコアミ
ラーゼ（EC3.2.1.3、以下同じ。）及び必要により
β−グルコシダーゼの共存下に、試料を接触さ
せ、遊離するフエノール系化合物を測定すること
により、試料中のα−アミラーゼ活性を測定する
ことを特徴とするα−アミラーゼ活性測定法であ
る。本発明の基質はオリゴサツカライド誘導体の非
還元性末端がハロゲン原子、

〔実施例〕

実施例１４−ニトロフエニルＯ−６−デオキシ−６−
〔（２−ピリジル）アミノ〕−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラ
ノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノ
シル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシド（ピ
リジルアミノ４−ニトロフエニルα−マルトペ
ンタオシド）の合成ジメチルスルホキシド200mlに４−ニトロフエ
ニルα−マルトペンタオシド10ｇとＮ，N′−ジ
シクロヘキシルカルボジイミド15ｇを溶解し、こ
れにジクロロ酢酸2.0mlとジメチルスルホキシド
20mlの混合物を加え、よく混合し、20〜25℃で50
分間反応させた。これに、メタノール30mlにシユ
ウ酸（２水塩）７ｇを溶解した液を加え、反応を
停止し、この反応混合液に２−アミノピリジン溶
液（２−アミノピリジン45ｇ、水60ml、酢酸15ml
及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム16ｇを混合し
た液）を加え、30℃で12時間反応した。水素化反
応後、水1.5を加え、生じた沈澱を別し、こ
の液を６規定塩酸でPH1.0とした。過剰のシア
ノ水素化ホウ素ナトリウムを分解後、１規定水酸
化ナトリウムでPH４〜５とした。これにリゾプス
デレマー由来のグルコアミラーゼ30mgを加え40℃
で10時間インキユベートした後減圧濃縮した。こ
の濃縮物を水に溶解し、ゲル過した。カラムは
10ｍＭ重炭酸アンモニウムで平衡化したBiogel
Ｐ−２（Bio Rad社製）を充填した直径3.0cm、高
さ180cmのものを使用し、高分子画分を集め凍結
乾燥した。精製は高速液体クロマトグラフイーを
用い、Cosmosil5C₁₈（半井化学、C₁₈逆相）を充
填したカラム（10×250mm）を使用し、溶出液に
0.8％１−ブタノールを含む0.1M酢酸を使用し、
3.5ml／minの流速で行ない、目的物83mgを得た。〔構造の確認〕得られたピリジルアミノ４−ニトロフエニルα
−マルトペンタオシド中のｐ−ニトロフエニル基
に対するグルコース残基の数を次のようにして測
定した。ピリジルアミノ４−ニトロフエニルα−
マルトペンタオシドを1.4規定塩酸−メタノール
で90℃、２時間メタノリシスした。濃縮後、トリ
メチルシリル化し、２％OV−17（0.4×200cm）の
カラムを用い、110℃から250℃まで４℃／minの
昇温プログラムを用いて、グルコース量を定量し
た。また、ｐ−ニトロフエニル基は0.1M酢酸中
での305nｍの吸光度から定量した。その結果、
ピリジルアミノ４−ニトロフエニルα−マルトペ
ンタオシドのグルコース／ｐ−ニトロフエノール
の比は3.6であつた。上で得た結果と、ピリジルアミノ４−ニトロフ
エニルα−マルトペンタオシドのグルコアミラー
ゼの作用を受けないことから、この構造は次のも
のであると考えられる。第１図にピリジルアミノ
４−ニトロフエニルα−マルトペンタオシドの
D₂O中の¹H−NMRスペクトルを示す。実施例２下記の試薬を用い、下記方法によりブランク値
を測定した。試薬：50ｍＭグツドバツフアー（PH7.0） α−グルコシダーゼ 80U／ml β−グルコシダーゼ 10U／ml 第１表に示される基質２ｍＭ

【表】測定法：上記試薬３mlを取り、試薬ブランクの経時変化
を見た。（測定波長400nｍ、温度37℃）その結果を第２表に示す。

【表】本発明の試薬Ａ、Ｂ、Ｃは試薬Ｄ、Ｅ、Ｆと比
較して、試薬ブランクの上昇が小さい。実施例３試料中のα−アミラーゼ活性を、下記の試薬を
用い、下記方法により測定した。試薬Ａ：50ｍＭグツドバツフアー（PH7.0） α−グルコシダーゼ 80U／ml ピリジルアミノ２−クロロ−４−ニトロフエニ
ルα−マルトペンタオシド２ｍＭ試薬Ｂ：50ｍＭグツドバツフアー（PH7.0） α−グルコシダーゼ 80U／ml ２−クロロ−４−ニトロフエニルα−マルトペ
ンタオシド２ｍＭ測定法：試薬Ａ又はＢ各３mlを取り、37℃での試薬ブラ
ンク経時変化を400nｍで測定した。試料（血清）50μに、試薬Ａ又はＢ各３mlを
添加し、添加後５〜６分後の吸光度変化（α−ア
ミラーゼ活性）を測定した。（測定波長400nｍ、
反応温度37℃）試薬ブランクの経時変化を第３表に、血清の吸
光度測定を第４表に示す。

【表】

【表】本発明の試薬Ａは試薬Ｂに比較して、試薬ブラ
ンクの上昇は小さく、α−アミラーゼ活性値は試
薬Ａ、Ｂともに差はない。実施例４試料中のα−アミラーゼ活性を、下記の試薬を
用い、下記方法により測定した。試薬Ａ：50ｍＭグツドバツフアー（PH7.0） α−グルコシダーゼ 80U／ml グルコシダーゼ 10U／ml トシルオキシ４−ニトロフエニルα−マルトヘ
プタオシド２ｍＭ試薬Ｂ：50ｍＭグツドバツフアー（PH7.0） α−グルコシダーゼ 80U／ml トシルオキシ４−ニトロフエニルα−マルトヘ
プタオシド２ｍＭ試薬Ｃ：50ｍＭグツドバツフアー（PH7.0） α−グルコシダーゼ 80U／ml グルコシダーゼ 10U／ml ４−ニトロフエニルα−マルトヘプタオシド
２ｍＭ測定法：試薬Ａ、Ｂ又はＣ各３mlを取り、37℃での試薬
ブランク経時変化を400nｍで測定した。試料血
清50μに試薬Ａ、Ｂ又はＣ各３mlを添加し、添
加後５〜６分後の吸光度変化（アミラーゼ活性）
を測定した。（測定波長400nｍ、反応温度37℃）試薬ブランクの経時変化を第５表に血清の吸光
度変化を第６表に示す。

【表】

〔試液の調製〕

２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸を50
ｍＭ、塩化ナトリウムを20ｍＭ含むように調製し
た水溶液に、水酸化ナトリウムを加えてPH6.9に
した。この溶液に実施例１で合成したピリジルア
ミノ４−ニトロフエニルα−マルトペンタオシド
を１ｍＭ、α−グルコシダーゼを10U／ml、グル
コアミラーゼを20U／mlになるように添加し、溶
解した。〔測定操作〕試液２mlに検体血清50μを加えて混合し、37
℃に加温して405nｍにおける１分後から２分間
の吸光度変化を測定した。別に、α−アミラーゼ活性既知の標準検体を用
い、上記と同様に操作し、検量関係を求め、この
検量線から検体のα−アミラーゼ活性を求めた。
このときの標準検体の各希釈段階に於けるα−ア
ミラーゼ活性（Somogyi単位／dl）と波長405n
ｍに於ける吸光度増加量（OD／min）との関係
を第２図に示す。実施例６４−ニトロフエニルＯ−６−アニリノ−６−デ
オキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）
−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−
Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ
−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−
α−Ｄ−グルコピラノシド（アニリノ４−ニト
ロフエニルα−マルトペンタオシド）の合成実施例１において、２−アミノピリジン45ｇの
代りにアニリン45ｇを用いた以外は、実施例１と
同じ試薬を用い、同様の操作を行つて、目的物
170mgを得た。［構造の確認］得られたアニリノ４−ニトロフエニルα−マル
トペンタオシド中のｐ−ニトロフエニル基に対す
るグルコース残基の数を、実施例１と同様の操作
法により測定した。その結果、アニリノ４−ニト
ロフエニルα−マルトペンタオシドのグルコー
ス／４−ニトロフエノールの比は3.8であつた。実施例７４−ニトロフエニルＯ−６−デオキシ−６−ｎ
−プロピルアミノ−α−Ｄ−グルコピラノシル
−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−
（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−
（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−
（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド（ｎ
−プロピルアミノ４−ニトロフエニルα−マル
トペンタオシド）の合成実施例１において、２−アミノピリジン45ｇの
代りにｎ−プロピルアミン29ｇを用いた以外は、
実施例１と同じ試薬を用い、同様の操作を行つ
て、目的物75mgを得た。［構造の確認］得られたｎ−プロピルアミノ４−ニトロフエニ
ルα−マルトペンタオシド中のｐ−ニトロフエニ
ル基に対するグルコース残基の数を、実施例１と
同様の操作法により測定した。その結果、ｎ−プ
ロピルアミノ４−ニトロフエニルα−マルトペン
タオシドのグルコース／４−ニトロフエノールの
比は3.8であつた。実施例８試薬中のα−アミラーゼ活性を、下記の試薬を
用い、下記の方法により測定した。試薬Ａ：50ｍ
Ｍグツドバツフアー（PH7.0） α−グルコシダーゼ 80U／ml グルコアミラーゼ 10U／ml アニリノ４−ニトロフエニルα−マルトヘプタ
オシド２ｍＭ試薬Ｂ：50ｍＭグツドバツフアー（PH7.0） α−グルコシダーゼ 80U／ml グルコアミラーゼ 10U／ml ｎ−プロピルアミノ４−ニトロフエニルα−マ
ルトペンタオシド２ｍＭ測定法：試薬Ａ又はＢ各３mlを取り、37℃での試薬ブラ
ンク経時変化を400nｍで測定した。試料（血清）50μに、試薬Ａ又はＢ各３mlを
添加し、添加後５〜６分後の吸光度変化（α−ア
ミラーゼ活性）を測定した。（測定波長400nｍ、
反応温度37℃）試薬ブランクの経時変化を第７表に、血清の吸
光度測定を第８表に示す。

【表】

〔発明の効果〕

以上述べた如く、本発明は、新規な基質を用い
たα−アミラーゼ活性の新規な測定法を提供する
ものであり、本発明の方法によれば、基質がα−
グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼの作用を全
く受けないので、試薬ブランクの上昇が著しく抑
制され、共役酵素液、基質液の一液化が可能とな
る点及びグルコアミラーゼの併用が可能な為、測
定感度が上昇する点等に顕著な効果を奏する発明
である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、４−ニトロフエニルＯ−６−デオキ
シ−６−〔（２−ピリジル）アミノ〕−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコ
ピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラ
ノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシド（ピリ
ジルアミノ４−ニトロフエニルα−マルトペンタ
オシド）のD₂O中の¹H−NMRスペクトルを示し
たものである。第２図は、実施例５に於て得られ
た検量線を示し、横軸の各α−アミラーゼ活性
（Somogyi単位／dl）について得られた吸光度増
加量（OD／min）を縦軸に沿つてプロツトした
点を結んだものである。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式（）：［式中、R¹はハロゲン原子、【式】−Ｏ−R³（但し、R³ は炭素数１〜６のアルキル基を示す。）又は−
NH−R⁴（但し、R⁴は炭素数１〜６のアルキル
基、フエニル基又はピリジル基を示す。）を示し、
R²は、ハロゲン原子又は／及びニトロ基を置換
基として有していてもよいフエニル基を示し、ｎ
は１〜６の整数を示す。］で表わされる非還元末
端を修飾したオリゴサツカライド誘導体を基質と
して、α−グリコシダーゼ及び／又はグルコアミ
ラーゼ及び必要によりβ−グルコシダーゼの共存
下に、試料を接触させ、遊離するフエノール系化
合物を測定することにより、試料中のα−アミラ
ーゼ活性を測定することを特徴とするα−アミラ
ーゼ活性測定法。２式（式中、ｎは２〜４の整数を示す。）で表わされる非還元末端を修飾したオリゴサツカ
ライド誘導体。