JPS5951800A - α−アミラ−ゼの活性測定方法 - Google Patents
α−アミラ−ゼの活性測定方法Info
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- JPS5951800A JPS5951800A JP16145782A JP16145782A JPS5951800A JP S5951800 A JPS5951800 A JP S5951800A JP 16145782 A JP16145782 A JP 16145782A JP 16145782 A JP16145782 A JP 16145782A JP S5951800 A JPS5951800 A JP S5951800A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は航規な基質、すなわちオリコサツカライド誘導
体を基質として使用することを%徴とするα−アミラー
ゼ活性の測定方法に関するものである。
体を基質として使用することを%徴とするα−アミラー
ゼ活性の測定方法に関するものである。
試料、特にヒト生体内の唾液、胚敵、血故、尿中のα−
アミラーゼ活性は医学上のお断において重要である。例
えば、膵炎、膵臓癌、耳下腺炎においては、血液、尿中
のα−アミラーゼ活性は通常の値に比べて著しい上昇を
示す。
アミラーゼ活性は医学上のお断において重要である。例
えば、膵炎、膵臓癌、耳下腺炎においては、血液、尿中
のα−アミラーゼ活性は通常の値に比べて著しい上昇を
示す。
α−アミラーゼ活性の測定方法については、これまでに
種々の方法が発表されているが、主に、アミロクラスチ
ック法、クロモゲニック法、サッカロケニック法の3群
に分類することができる。
種々の方法が発表されているが、主に、アミロクラスチ
ック法、クロモゲニック法、サッカロケニック法の3群
に分類することができる。
アミロクラスチック法のうちではキャラウェイ法が最も
広く使用されてきたが、共存タンパクがデンプンとヨー
ドの呈色を阻害するため、又反応時間が短いため再現性
が悪い等の問題点がある。
広く使用されてきたが、共存タンパクがデンプンとヨー
ドの呈色を阻害するため、又反応時間が短いため再現性
が悪い等の問題点がある。
クロモゲニック法は一般にブルースターチ法と呼ばれ、
デンプン又はアミロースに色素を結合した不溶性基質を
用い鋳巣反応で生成する可溶性色素を測定する方法であ
る。この方法は、最近広く使用されているが、基質とし
ての活性が弱いこと、不溶性であるため反応系が不均一
であること、緊雑な操作が必要であり自動分析る。
デンプン又はアミロースに色素を結合した不溶性基質を
用い鋳巣反応で生成する可溶性色素を測定する方法であ
る。この方法は、最近広く使用されているが、基質とし
ての活性が弱いこと、不溶性であるため反応系が不均一
であること、緊雑な操作が必要であり自動分析る。
サッカロケニック法では“メモジー法が代表的であるが
、試料中のクルコースにより高埴を示す、操作が累雑で
ある等の問題かある。
、試料中のクルコースにより高埴を示す、操作が累雑で
ある等の問題かある。
このように従来のα−アミラーゼ活性の測定方法(こは
各々に個有の欠点があるか、さらに共通して、基質に使
用しているデンプンの品質により測定値にバラツキか生
じる、又α−アミラーセ反応を具に化学量論的反応とし
て測定できないという欠点がある。
各々に個有の欠点があるか、さらに共通して、基質に使
用しているデンプンの品質により測定値にバラツキか生
じる、又α−アミラーセ反応を具に化学量論的反応とし
て測定できないという欠点がある。
デンプンは広く知られるようにアミロースと呼ばれるα
−1,4結合による直鎖状のクルカンとアミロペクチン
と呼ばれるα−1,6結合による分岐を有するグルカン
の混合物である。
−1,4結合による直鎖状のクルカンとアミロペクチン
と呼ばれるα−1,6結合による分岐を有するグルカン
の混合物である。
アミロースとアミロペクチンの混合比率、分子量、分岐
度、分岐構造は原料他物の種類、収捜時期、産地音によ
り異なり、不均一な混合物である。
度、分岐構造は原料他物の種類、収捜時期、産地音によ
り異なり、不均一な混合物である。
不均一なデンプンを基質に使用する場合は、化学量論的
反応とはならす、α−アミラーゼの動力学を検知するこ
とはできない。
反応とはならす、α−アミラーゼの動力学を検知するこ
とはできない。
α−アミラーゼの動力学的横細はグルコース鎖が41固
から71固までのオリコサツカライトの使用によってな
される。
から71固までのオリコサツカライトの使用によってな
される。
最近、デンプンの代わりに、マルトテトラオース、マル
トペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオ
ース等のオリゴサツカライドを基質に用いる方法(特開
昭50−56998号公報、特開昭53−37096号
公報)、又はP−ニトロフェノール等の色原体を還元末
端に結合したオリゴサツカライドを用いる方法(特開昭
54−!51892号公報)等、均一で構造の明確な基
質を用いる方法が発表されている。
トペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオ
ース等のオリゴサツカライドを基質に用いる方法(特開
昭50−56998号公報、特開昭53−37096号
公報)、又はP−ニトロフェノール等の色原体を還元末
端に結合したオリゴサツカライドを用いる方法(特開昭
54−!51892号公報)等、均一で構造の明確な基
質を用いる方法が発表されている。
これらの方法では通常、測定用共役酵素としてα−クル
コシダーゼ(E、0.3.2.1゜20、α−D−グル
コシドグルコヒドロラーゼ)又はグルコアミラーゼ(g
、0.3.2.1゜3.1.4−α−D −クルカング
ルコヒドロラーセ)を必要とする。
コシダーゼ(E、0.3.2.1゜20、α−D−グル
コシドグルコヒドロラーゼ)又はグルコアミラーゼ(g
、0.3.2.1゜3.1.4−α−D −クルカング
ルコヒドロラーセ)を必要とする。
これらの共役e!+;J、・C〜1,4−クリコンド帖
8を巾−する°糖鎖の非還元性木端からα−1゜4−ク
リコシド結合を加水分p%するエキソタイプの耐糸であ
り、α−アミラーセ反応ζこ関係なく4:質を分層して
しまう欠点を肩°する。この結果、測定用試液が不安定
であり、試楽旨恢埴ん)極めて商く測定確度を者しく悲
くしていた。さらに測定に充分なりルコアミラーセ、あ
るいはα−クルコシダーゼを1更用できす、正am 1
.を測定法の組立が困難であった。
8を巾−する°糖鎖の非還元性木端からα−1゜4−ク
リコシド結合を加水分p%するエキソタイプの耐糸であ
り、α−アミラーセ反応ζこ関係なく4:質を分層して
しまう欠点を肩°する。この結果、測定用試液が不安定
であり、試楽旨恢埴ん)極めて商く測定確度を者しく悲
くしていた。さらに測定に充分なりルコアミラーセ、あ
るいはα−クルコシダーゼを1更用できす、正am 1
.を測定法の組立が困難であった。
本発明者らはかかる欠点な有するクルコース鎖が4〜7
個のオリコサツカライトに対し、これらのオリゴ糖の非
還元末端クルコースの6位の一級アルコールーCHyO
Hを−011z’NH1口こ1醒 :喚し
た基質を合成した。この基を尋人すること
:により、不希買)II2ひに、α−アミラーセ作
用の結果生成する、−0H,NH[(基を有する生成物
を分光尤度的に構出することが可能であり、また本牽賀
(以下修飾オリコ糖という。修11j基とは−Cl−1
2N HIN又は−N 1−1− R1をいい、従って
・1じ触オリゴ糖は一〇H2NHR又は−NH−Rで1
じ飾されていて必要な場合は11□N−R修飾オリゴ糖
(例えはアミノピリジン1i飾オリコ糖)という。)が
α−アミラーゼの親和性に凌れで8つ艮好な4%となる
こと、グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼの基質
とならないことを見見し本発明を光取するに至った。
個のオリコサツカライトに対し、これらのオリゴ糖の非
還元末端クルコースの6位の一級アルコールーCHyO
Hを−011z’NH1口こ1醒 :喚し
た基質を合成した。この基を尋人すること
:により、不希買)II2ひに、α−アミラーセ作
用の結果生成する、−0H,NH[(基を有する生成物
を分光尤度的に構出することが可能であり、また本牽賀
(以下修飾オリコ糖という。修11j基とは−Cl−1
2N HIN又は−N 1−1− R1をいい、従って
・1じ触オリゴ糖は一〇H2NHR又は−NH−Rで1
じ飾されていて必要な場合は11□N−R修飾オリゴ糖
(例えはアミノピリジン1i飾オリコ糖)という。)が
α−アミラーゼの親和性に凌れで8つ艮好な4%となる
こと、グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼの基質
とならないことを見見し本発明を光取するに至った。
すなわち本発明は、α−アミラーゼ゛油1牛を1111
111定するに際し、クルコースが4〜7個からなる直
鎖状オリゴサツカライドの非還元末端クルコースの6位
の一級アルコール(CH20H) が一般式−CR2N
HR,で表わされる基で置侯された。下記構造式U+
V有するオリゴサツカライド誘導体を基質として使用す
ることを特徴とするα−アミラーゼ活性の測定方法であ
る。
111定するに際し、クルコースが4〜7個からなる直
鎖状オリゴサツカライドの非還元末端クルコースの6位
の一級アルコール(CH20H) が一般式−CR2N
HR,で表わされる基で置侯された。下記構造式U+
V有するオリゴサツカライド誘導体を基質として使用す
ることを特徴とするα−アミラーゼ活性の測定方法であ
る。
(式中、右端のグルコース単位は還元性基、nは2〜5
の整数であり、Rは、クルコースか4〜7個からなる直
鎖状オリコサツカライドの非還元末端グルコースの6位
に一級アルコール(OHz OH)を有していてこれが
一般式−CiH2NHI(で表わされる基で置決される
と構造式(1)を有するオリゴサツカライド誘導体とな
るアルコール(OHhOH)が酸化されて相当するアル
デヒド(−〇HO)となった酸化多糖体のアルデヒド(
−0HO)と反応してシッフ塩基を形成するアミン基を
有する有機残基な表わす。)以下、本発明について例を
挙げて詳細に説明する。
の整数であり、Rは、クルコースか4〜7個からなる直
鎖状オリコサツカライドの非還元末端グルコースの6位
に一級アルコール(OHz OH)を有していてこれが
一般式−CiH2NHI(で表わされる基で置決される
と構造式(1)を有するオリゴサツカライド誘導体とな
るアルコール(OHhOH)が酸化されて相当するアル
デヒド(−〇HO)となった酸化多糖体のアルデヒド(
−0HO)と反応してシッフ塩基を形成するアミン基を
有する有機残基な表わす。)以下、本発明について例を
挙げて詳細に説明する。
先ず、本発明に使用する修飾オリゴ糖について述べると
、デキストリンを原料とし、ジメチルスルホキシドとN
、N’−ジシクロへキシルカルボジイミドでデキストリ
ンのグルコース単位の第1級アルコールを部分的に酸化
する。例えば、グルコース基約30個に1個の割合で酸
化する。本反応はJones、 G、l−1らの方法(
Mejhnd in Carbohydrate C
hemistry Vol。
、デキストリンを原料とし、ジメチルスルホキシドとN
、N’−ジシクロへキシルカルボジイミドでデキストリ
ンのグルコース単位の第1級アルコールを部分的に酸化
する。例えば、グルコース基約30個に1個の割合で酸
化する。本反応はJones、 G、l−1らの方法(
Mejhnd in Carbohydrate C
hemistry Vol。
V1315−322頁(1972) Academic
Press 、 New York :]による。
Press 、 New York :]による。
酸酸反応はシュウ酸を加えて停止させ、次いで2−アミ
ノピリジンなどの本発明に係る有機アミン、シアン水素
化ホウ素ナトリウムを加え95℃に加熱し約20分反応
させる、反応混合物に水を加え、生じる沈澱を炉別して
除き、この−F5液に塩酸を加えpHをいったん約1.
0とじシアン水素化ホウ素ナトリウムを分解した後、p
Hを中性にし、この液をBiogel p −2を充
填したカラムを使用しゲル涙過し高分子(修飾デキスl
−IJン)画分を集める。
ノピリジンなどの本発明に係る有機アミン、シアン水素
化ホウ素ナトリウムを加え95℃に加熱し約20分反応
させる、反応混合物に水を加え、生じる沈澱を炉別して
除き、この−F5液に塩酸を加えpHをいったん約1.
0とじシアン水素化ホウ素ナトリウムを分解した後、p
Hを中性にし、この液をBiogel p −2を充
填したカラムを使用しゲル涙過し高分子(修飾デキスl
−IJン)画分を集める。
この修飾デキストリンにBacillussubjil
is由来の級化タイプのα−アミラーゼを約p H5,
5の緩衝敵中、37℃で約30分反応援、反応敵な70
℃以上の温度で、20〜60分加熱し、α−アミラーゼ
を失活させる。
is由来の級化タイプのα−アミラーゼを約p H5,
5の緩衝敵中、37℃で約30分反応援、反応敵な70
℃以上の温度で、20〜60分加熱し、α−アミラーゼ
を失活させる。
加熱処理後、反応液を約20℃程度まで冷却させ、故の
pHを6〜8の中性に調整後、α−グルコシダーゼ又は
グルコアミラーゼを加え37℃で20〜50時間作用さ
せ、α−アミラーゼの作用により生成した修飾オリゴ糖
をうる。
pHを6〜8の中性に調整後、α−グルコシダーゼ又は
グルコアミラーゼを加え37℃で20〜50時間作用さ
せ、α−アミラーゼの作用により生成した修飾オリゴ糖
をうる。
この反応を一般化し一般式を次に示す。
Gn −G −Gm(Gtを含有する混合物)■
n−G十G−0m(+t−G)
(式中、Gはグルコース単位を示し、Xはされる基を表
わす。また、l、m、nはOあるいは正の整数を表わす
。) 次に、この混合物を濃縮し、Biogel P−4を充
填したカラムを用い、カラムクロマトグラフィーで修飾
オリゴ糖、即ちピリシールアミノ基なとの−N HR基
が非還元末端に入ったマルトテトラオース、マルトペン
タオース、マルトヘキサオース、!ルトヘブタオースの
各分画を得ることができる。
わす。また、l、m、nはOあるいは正の整数を表わす
。) 次に、この混合物を濃縮し、Biogel P−4を充
填したカラムを用い、カラムクロマトグラフィーで修飾
オリゴ糖、即ちピリシールアミノ基なとの−N HR基
が非還元末端に入ったマルトテトラオース、マルトペン
タオース、マルトヘキサオース、!ルトヘブタオースの
各分画を得ることができる。
即ち、本製法を要約すれば、デキストリンの第1級アル
コール(OHgOH基)を酸化してアルデヒド基(−0
HO)とした後、2−アミノピリジンなどの本発明に係
る有機アミンを作用させシップの塩基とし、還元して修
飾デキストリンを得る。次いで酵素的加水分解により、
目的とする修飾オリゴ糖を得る。
コール(OHgOH基)を酸化してアルデヒド基(−0
HO)とした後、2−アミノピリジンなどの本発明に係
る有機アミンを作用させシップの塩基とし、還元して修
飾デキストリンを得る。次いで酵素的加水分解により、
目的とする修飾オリゴ糖を得る。
本製法に於いて、原料の多糖体としてはα−1,4−グ
リコシド結合を有する長鎖の糖ならばいずれも使用でき
、デキストリンの他、デンプン、アミロース等も同様に
原料とじつる。
リコシド結合を有する長鎖の糖ならばいずれも使用でき
、デキストリンの他、デンプン、アミロース等も同様に
原料とじつる。
また、酸化多糖体から修飾多糖体を得る工程に於いては
、2−アミノピリジンの他にも酸化多糖体中のアルデヒ
ドとシッフ塩基を形成するアミン基を有する化合物(本
発明に係る有機アミン)ならいずれも有効に使用できる
が、2−アミンピリジンのほかに例えば3−アミノピリ
ジン、アニリン、2−ヒドロキシアニリン、アミノ安息
香酸、メチルアニリン等が挙げられる。
、2−アミノピリジンの他にも酸化多糖体中のアルデヒ
ドとシッフ塩基を形成するアミン基を有する化合物(本
発明に係る有機アミン)ならいずれも有効に使用できる
が、2−アミンピリジンのほかに例えば3−アミノピリ
ジン、アニリン、2−ヒドロキシアニリン、アミノ安息
香酸、メチルアニリン等が挙げられる。
ぞれに対応する基で修飾されたオリゴ糖となる。
即ち、本発明に係る修飾オリゴ糖の例を挙げると、2−
アミンピリジン又は3−アミノピリジンなどのアミノピ
リジン修飾オリコ糖、アニリン修飾オリゴ糖、2−ヒド
ロキシアニリンなどのヒドロキシアニリン修飾オリコ糖
、アミノ安息香酸修飾オリゴ糖、メチルアニリンなどの
アーアミラーセを使用するが、種類は特に限定されず、
例えば動物の肝臓、微生物由来のアミラーゼを使用する
ことができる。前述のBacillussubti I
is由来の教化タイプのアミラーゼはグルコース鎖1
0個程度のオリゴ糖の状態で反応が停止するかあるいは
遅くなるため、生成物をコントロールするのが容易であ
り有効に使用することができる。
アミンピリジン又は3−アミノピリジンなどのアミノピ
リジン修飾オリコ糖、アニリン修飾オリゴ糖、2−ヒド
ロキシアニリンなどのヒドロキシアニリン修飾オリコ糖
、アミノ安息香酸修飾オリゴ糖、メチルアニリンなどの
アーアミラーセを使用するが、種類は特に限定されず、
例えば動物の肝臓、微生物由来のアミラーゼを使用する
ことができる。前述のBacillussubti I
is由来の教化タイプのアミラーゼはグルコース鎖1
0個程度のオリゴ糖の状態で反応が停止するかあるいは
遅くなるため、生成物をコントロールするのが容易であ
り有効に使用することができる。
本修飾オリゴ糖を使用、したα−アミラーゼの測定例と
して、開運液体クロマトグラフィー(HPLO)法、分
元尤度法を挙げ、その測定原理と特徴を示すが、本1じ
飾基質の使用範囲を限定するものではない。
して、開運液体クロマトグラフィー(HPLO)法、分
元尤度法を挙げ、その測定原理と特徴を示すが、本1じ
飾基質の使用範囲を限定するものではない。
〔1〕 高速液体クロマトグラフィー(HPLC)法
ピリシールアミノ基が螢光を有する(励起波長320n
m、螢光波長400 nm)ことに右目、これを利用し
、本4v6飾基ノ貫を用いα−アミラーゼ反応させた後
、生成した非還元末端グルコースにピリシールアミノ基
が入った短鎖(クルコース基が2または3個)の修飾オ
リゴ糖を含む液をHPLOにかけ、その流出ピークを同
様に操作した活性値既知の標準検体の流出ピークと比較
することによりα−アミラーゼ活性を求めることができ
る。
m、螢光波長400 nm)ことに右目、これを利用し
、本4v6飾基ノ貫を用いα−アミラーゼ反応させた後
、生成した非還元末端グルコースにピリシールアミノ基
が入った短鎖(クルコース基が2または3個)の修飾オ
リゴ糖を含む液をHPLOにかけ、その流出ピークを同
様に操作した活性値既知の標準検体の流出ピークと比較
することによりα−アミラーゼ活性を求めることができ
る。
HP L Cに於いて、カラム、溶出液は特に限定され
ないが、カラムはTSK−GelLS 410,5μ
m 、 C18(ToyosodaCo )、溶出敵は
0.1% n−ブタノールを含む0.1M酢酸が効果的
に使用することができる。
ないが、カラムはTSK−GelLS 410,5μ
m 、 C18(ToyosodaCo )、溶出敵は
0.1% n−ブタノールを含む0.1M酢酸が効果的
に使用することができる。
不発明の診飾オリゴ抛を)I P L O法によるα−
アミラーゼ活性測定用基質として用いることにより以下
の(イ)〜(ホ)の利点を有する測定法の組立てが可能
になる。
アミラーゼ活性測定用基質として用いることにより以下
の(イ)〜(ホ)の利点を有する測定法の組立てが可能
になる。
(イ)値篩オリコ糖は水に易浴で、α−アミラーゼとの
反応性か高い。
反応性か高い。
(ロ)本発明の方法では、単一の化合$21を請負とす
ることから、反応の化学量−が成立し、α−アミラーゼ
の動力学を恨知することかできる。
ることから、反応の化学量−が成立し、α−アミラーゼ
の動力学を恨知することかできる。
ぐ→ 不法ではα−アミラーゼ反応に就く共役酵素系を
1更用しない為、α−アミラーゼの動力学を倹ナロする
ことが容易である。
1更用しない為、α−アミラーゼの動力学を倹ナロする
ことが容易である。
に)不法ではα−アミラーゼ4文応′C生成するピリシ
ールアミノ基又はその1也の修罰1基を竹するクルコー
ス単位2または31固のオリコ糖を分離した上測定する
ため、血中に既存のグルコース弄の影響を受けない。
ールアミノ基又はその1也の修罰1基を竹するクルコー
ス単位2または31固のオリコ糖を分離した上測定する
ため、血中に既存のグルコース弄の影響を受けない。
(ホ)ケイ元尤度法で検知を行うため尚感度測足が可能
であり、敬重検体で測定できる。
であり、敬重検体で測定できる。
〔2〕 分光光度法
グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼはエキソタイ
プの酵素であるため本修飾基質を基質とできない。これ
に対しα−アミラーゼはオリゴサツカライドの任意のα
−1,4グリコシド結合を加水分解するエンド型酵素で
あり、本修飾基質を基質とできるため、α−アミラーゼ
の酵素作用によって修飾基質が刀■水分解されて非還元
末端が新たに生成する。
プの酵素であるため本修飾基質を基質とできない。これ
に対しα−アミラーゼはオリゴサツカライドの任意のα
−1,4グリコシド結合を加水分解するエンド型酵素で
あり、本修飾基質を基質とできるため、α−アミラーゼ
の酵素作用によって修飾基質が刀■水分解されて非還元
末端が新たに生成する。
この新たに生成した非還元末端に対してα−タルコシダ
ーゼ又はグルコアミラーゼが作用してグルコースが生成
し、生成したグルコース量を測定することによりα−ア
ミラーゼ活性を知ることが出来る。
ーゼ又はグルコアミラーゼが作用してグルコースが生成
し、生成したグルコース量を測定することによりα−ア
ミラーゼ活性を知ることが出来る。
グルコースの定量方法は多数知られており、これらの方
法のいずれも使用できることは言うまでもない。
法のいずれも使用できることは言うまでもない。
主なりルコースの定量方法を示す。
まずグルコースにグルコースオキシダーゼを作用させる
と酸化され、同時に過酸化水累が生じる。生成した過暇
化水系は共存するペルオキシダーゼを介して色原体τ定
量的に酸化し、生成した酸化型色原体の呈色を比色する
ことにより反応孜中のクルコース量を測定することがで
きる。以下に反応式を示す。
と酸化され、同時に過酸化水累が生じる。生成した過暇
化水系は共存するペルオキシダーゼを介して色原体τ定
量的に酸化し、生成した酸化型色原体の呈色を比色する
ことにより反応孜中のクルコース量を測定することがで
きる。以下に反応式を示す。
グルコースオキシダーゼ
フ゛ドウ糖+02 +H20
H202+グルコン酸
ペルオキシダーゼ゛
H2O2+色原体
酸化型色原体+HzO
また、グルコースはATP存在下へキソキナーゼによっ
てグルコース−6−リン酸となる。生成したクルコース
−6−リン敵はNAD共存下、グルコース−6−リン酸
脱水素酵素によって6−ホスホグルコノラクトンとなり
、一方NADは還元されNADHとなるのでこのNAD
Hの340 nm付近に於ける吸光度の増加を測定する
ことにより、反応欣中のグルコース量を測定することが
出来る。以下に反応式を示す。
てグルコース−6−リン酸となる。生成したクルコース
−6−リン敵はNAD共存下、グルコース−6−リン酸
脱水素酵素によって6−ホスホグルコノラクトンとなり
、一方NADは還元されNADHとなるのでこのNAD
Hの340 nm付近に於ける吸光度の増加を測定する
ことにより、反応欣中のグルコース量を測定することが
出来る。以下に反応式を示す。
グルコース
グルコース−6−リン酸+NAD−
−6−リン酸脱水酵素
6−ホスホタルコノ
ラクトン十N A D H
A T P、 、アデノシン−5′−トリリン酸塩入D
P;アテノシン−5′−シリン酸塩NAD;β−ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド NADH,還元型−β−ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド 本修飾オリゴ糖を用いた分光光度法によるα−アミラー
セ活性測是法に於いて、α−アミラーゼと同時に又はこ
れに次いで共役酵素のグルコアミラーゼ、又はα−タル
コシダーゼを作用させ生成するグルコースを測定するが
、この方法では検体時に血清、尿などの生体砥料に共存
するグルコースの影響を受は正確な測定魁か青られない
可能性があり、α−アミラーゼの反応に先行して、既存
グルコースな消去することは本測定法を実施する上で有
効な手段となる。
P;アテノシン−5′−シリン酸塩NAD;β−ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド NADH,還元型−β−ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド 本修飾オリゴ糖を用いた分光光度法によるα−アミラー
セ活性測是法に於いて、α−アミラーゼと同時に又はこ
れに次いで共役酵素のグルコアミラーゼ、又はα−タル
コシダーゼを作用させ生成するグルコースを測定するが
、この方法では検体時に血清、尿などの生体砥料に共存
するグルコースの影響を受は正確な測定魁か青られない
可能性があり、α−アミラーゼの反応に先行して、既存
グルコースな消去することは本測定法を実施する上で有
効な手段となる。
消去の方法としてはグルコースオキシダーセーカタラー
ゼによる方法、ヘキソキナーゼによる方法(特開昭57
−47495号公報)、グルコースペルオキシダーゼO
こよる方法等、種々の方法があり、いずれの方法も自由
に組合せることが可能である。
ゼによる方法、ヘキソキナーゼによる方法(特開昭57
−47495号公報)、グルコースペルオキシダーゼO
こよる方法等、種々の方法があり、いずれの方法も自由
に組合せることが可能である。
また本修飾オリゴ糖を基質とし、α−アミラーゼを作用
させ生成するマルト−スを測定することによりα−アミ
ラーゼ活性を測定することができる。マルトースの測定
は、例えば特開昭52−119296に記載の測定糸に
よる。
させ生成するマルト−スを測定することによりα−アミ
ラーゼ活性を測定することができる。マルトースの測定
は、例えば特開昭52−119296に記載の測定糸に
よる。
本発明の修触オリゴ楯を分光光度法によるα−アミラー
ゼ活性測定用基質として用いることにより以下の利点を
有する測定法の組立てができる。
ゼ活性測定用基質として用いることにより以下の利点を
有する測定法の組立てができる。
げJ 本修飾オリゴ糖は水に湯浴で、α−アミラーゼと
の反応性が萬い。
の反応性が萬い。
(ロ)本発明の方法では、単一の化合物を基質とするこ
とから、反応の化学量論が成立し、α−アミラーゼの動
力学を検知することができる。
とから、反応の化学量論が成立し、α−アミラーゼの動
力学を検知することができる。
(/1 本発明に使用する修飾オリゴ糖はグルコアミ
ラーゼ(またはα−クルコシダーゼ)の基質とはならず
α−アミラーゼの特異基質である為、副反応が起らす、
試薬旨検値は極めて小さい。
ラーゼ(またはα−クルコシダーゼ)の基質とはならず
α−アミラーゼの特異基質である為、副反応が起らす、
試薬旨検値は極めて小さい。
に) グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼの充分量
が使用可能なため、α−アミラーゼ反応以降の反応が速
く、正確なレイトアッセイができる。
が使用可能なため、α−アミラーゼ反応以降の反応が速
く、正確なレイトアッセイができる。
(ホ)測定用試液が安定である。
(へ) 自動分析装置への適応性が良い。
次に実施例を示し、さらに詳しく説明する。
実施例 1 修飾オリゴ糖の調製
ジメチルスルホキシド25ONにデキストリフ10gと
N、N’−ジシクロへキシルカルボジイミド15gを俗
解し、これにジクロル酢酸l’mlとジメチルスルホキ
シ1−12.5 miの混合dりを〃口え、よく混合し
20〜25℃で40分間反応させる。メタノール25m
gにシュウ酸(2水塩)6.3gを溶解した敵を加え、
反応を停止する。この反応混合級(こ2−アミノピリジ
ン浴数(2−アミノピリジン60g、水9 Q ml
、酢酸24m1そしてシアン水系化ホウ素ナトリウム2
4gを混合した孜)を加え95℃で20分間加熱する。
N、N’−ジシクロへキシルカルボジイミド15gを俗
解し、これにジクロル酢酸l’mlとジメチルスルホキ
シ1−12.5 miの混合dりを〃口え、よく混合し
20〜25℃で40分間反応させる。メタノール25m
gにシュウ酸(2水塩)6.3gを溶解した敵を加え、
反応を停止する。この反応混合級(こ2−アミノピリジ
ン浴数(2−アミノピリジン60g、水9 Q ml
、酢酸24m1そしてシアン水系化ホウ素ナトリウム2
4gを混合した孜)を加え95℃で20分間加熱する。
力ロ熱反応援水1tを加え、沈滞を生じさせ、戸別する
。このろ液を6規定塩酸でpH1,0とし、過剰のシア
ン水素化ホウ素すI・リウムを分解後、6規定アンモニ
ア、水でpH7,0に調整し、真空で濃縮する。この濃
縮物の一部35(Ilfをとり、水に溶解し、ゲル瀘過
する。カラムは10mM重炭敵アンモニウムで平衡化し
たBioge I P 2 (Bio R’ad
社製)を充填した直径2,60、高さ113cmの
ものを使用し、このカラムを2度通した。このカラム操
作を3回行い(濃縮物のチャージ量は各3so+v)高
分子1分を集め偉績乾燥した。ここでの収量は約700
■であり、0.1 M酢酸中での310 nmの吸光度
から堡飾はグルコース単位で3.1%であった。1じ飾
化11の測定はHase。
。このろ液を6規定塩酸でpH1,0とし、過剰のシア
ン水素化ホウ素すI・リウムを分解後、6規定アンモニ
ア、水でpH7,0に調整し、真空で濃縮する。この濃
縮物の一部35(Ilfをとり、水に溶解し、ゲル瀘過
する。カラムは10mM重炭敵アンモニウムで平衡化し
たBioge I P 2 (Bio R’ad
社製)を充填した直径2,60、高さ113cmの
ものを使用し、このカラムを2度通した。このカラム操
作を3回行い(濃縮物のチャージ量は各3so+v)高
分子1分を集め偉績乾燥した。ここでの収量は約700
■であり、0.1 M酢酸中での310 nmの吸光度
から堡飾はグルコース単位で3.1%であった。1じ飾
化11の測定はHase。
S、らの方a(J 、 Biochem、 85 、
217 。
217 。
(1979))によった。
この修飾デキストリン470■を水15mAに溶解し、
33mM酢酸−酢酸カルシウム緩衝1(pH5,5,)
90mlと混合し、これにBacillus 5u
btilis 由来の液化タイプアミラーゼ50単位
を加え37℃で25分間インキュベートする。その後、
100℃で15分間加熱しアミラーゼを不活化した後、
グルコアミラーゼ150単位を加え37℃で24時間イ
ンキュベートし、さらにグルコアミラーゼ150単位を
追加し、24時間インキュベー1・を行・)。
33mM酢酸−酢酸カルシウム緩衝1(pH5,5,)
90mlと混合し、これにBacillus 5u
btilis 由来の液化タイプアミラーゼ50単位
を加え37℃で25分間インキュベートする。その後、
100℃で15分間加熱しアミラーゼを不活化した後、
グルコアミラーゼ150単位を加え37℃で24時間イ
ンキュベートし、さらにグルコアミラーゼ150単位を
追加し、24時間インキュベー1・を行・)。
この加水分解物を濃縮り1.20 mM酢酸で平倶工化
したBio getP 4 (Bio Rad社
J#りを充填したカラムを用いクロマトを行う。
したBio getP 4 (Bio Rad社
J#りを充填したカラムを用いクロマトを行う。
カラムは自゛径1.9cIn簡さ2 ] 2 cmのも
のを1更川した。
のを1更川した。
・1し飾オリゴ糖のグルコース順4〜7個の各分画を東
め沫結乾慄した。
め沫結乾慄した。
−)i:質の梢製はHP LCにT S K−(J’e
t L 54105μm018を充填したラージカラ
ム(7X 300 is )を使用し、浴出版に0.0
45%n−ブタノールを含む0.1M1i[アンモニウ
ム坂衝赦(pH3,9)を使用し、 3.0 ml /
m i n の流速で行った。
t L 54105μm018を充填したラージカラ
ム(7X 300 is )を使用し、浴出版に0.0
45%n−ブタノールを含む0.1M1i[アンモニウ
ム坂衝赦(pH3,9)を使用し、 3.0 ml /
m i n の流速で行った。
構造の確認
修飾オリゴ糖は水素化ホウ素改ナトリウムで還元したの
ち1.5N塩酸含有メタノール溶孜中で90℃、4時間
加熱分解した後、次いでピリジン中でトリメチルシリル
化する。そしてツ7スクロマトグラフィーにより測だし
た。カラムはOhromosorb W ItC2%0
V−17を0−1゜ティングした80〜100メツシユ
(0,5X300α)を1更用し、120℃から185
℃までの昇@(4℃/m1n)クロマトグラフィーで測
定した。同様に操作したマルトースを標準として、グル
コースとグルシトールの割合より各画分のクルコースの
個数り、2,3.4そして5を求め、これよりオリゴ糖
のグルコース鎖長3,4,5.6そして7を決めた。(
それぞれドG3、II”G4、F’G5.FG6、FG
7と略号をつけた。) また各修飾オリゴ糖はグルコアミラーゼで加水分解され
ないところから非還元末端に修飾基(ピリシールアミン
基寺。)が入っていることが考えられる。そこで。
ち1.5N塩酸含有メタノール溶孜中で90℃、4時間
加熱分解した後、次いでピリジン中でトリメチルシリル
化する。そしてツ7スクロマトグラフィーにより測だし
た。カラムはOhromosorb W ItC2%0
V−17を0−1゜ティングした80〜100メツシユ
(0,5X300α)を1更用し、120℃から185
℃までの昇@(4℃/m1n)クロマトグラフィーで測
定した。同様に操作したマルトースを標準として、グル
コースとグルシトールの割合より各画分のクルコースの
個数り、2,3.4そして5を求め、これよりオリゴ糖
のグルコース鎖長3,4,5.6そして7を決めた。(
それぞれドG3、II”G4、F’G5.FG6、FG
7と略号をつけた。) また各修飾オリゴ糖はグルコアミラーゼで加水分解され
ないところから非還元末端に修飾基(ピリシールアミン
基寺。)が入っていることが考えられる。そこで。
1” 03〜7の各自分について、箱守法による光合メ
チル化〔生化学実験講座4、糖質の化学(下巻)P、5
06、東京化学同人〕を行った後、酸で加水分解し、ガ
スクロマトグラフィーによりメチル−2,3,4,6−
チトラー〇−メチルグルコシドが全く生成していないこ
とを確認した。
チル化〔生化学実験講座4、糖質の化学(下巻)P、5
06、東京化学同人〕を行った後、酸で加水分解し、ガ
スクロマトグラフィーによりメチル−2,3,4,6−
チトラー〇−メチルグルコシドが全く生成していないこ
とを確認した。
さらにFG3とF G 5の画分をとり、0.1M酢酸
ナトリウム−10mM酢酸カルシウム緩衝g!Lp H
5,5に浴解し、タカアミラーゼを〃口え37℃で3時
間力ロ熱して加水分解した。そしてこの水解物をHP
L O及びT L Oで調べfこ結果FG5からはI”
G 3とマルト−スを生成したか、F’G3はタカア
ミラーゼで加水分解を受けなかった。またFG3を0.
3N堰酸に加え100℃で30分間加水分解したところ
、生成物(まマルトース、グルコースと2棟のケイ元を
有する化合物を得、マルトトリオースは生成しなかった
。
ナトリウム−10mM酢酸カルシウム緩衝g!Lp H
5,5に浴解し、タカアミラーゼを〃口え37℃で3時
間力ロ熱して加水分解した。そしてこの水解物をHP
L O及びT L Oで調べfこ結果FG5からはI”
G 3とマルト−スを生成したか、F’G3はタカア
ミラーゼで加水分解を受けなかった。またFG3を0.
3N堰酸に加え100℃で30分間加水分解したところ
、生成物(まマルトース、グルコースと2棟のケイ元を
有する化合物を得、マルトトリオースは生成しなかった
。
芙峡例 2
試薬
[11試dダ1
酢酸ナトリウムl (10m mot %酢酸カルシ
ウム 10mmot、実施例1で調製した非還元末端に
ピリシールアミ7基が入ったマルトペンタオース0.3
6 m motをとり精製水に溶かして水酸化ナトリウ
ムでp H5,5とし全量を1zとする。
ウム 10mmot、実施例1で調製した非還元末端に
ピリシールアミ7基が入ったマルトペンタオース0.3
6 m motをとり精製水に溶かして水酸化ナトリウ
ムでp H5,5とし全量を1zとする。
測定操作
試敵1500μtに検体血液5μtを加え、37℃で1
5分間加温する。この反応液を尚速赦体クロマトグラフ
ィーにかけ、非還元末端グルコースにピリシールアミノ
基か入りグルコース3個の修飾オリゴ糖の生成量をピー
ク面積から求める。別にα−アミラーセ活性既知の標準
検体を用い上記と同様に操作し、検量関係を求め、この
検量線から検体のα−アミラーゼ活性を求める。
5分間加温する。この反応液を尚速赦体クロマトグラフ
ィーにかけ、非還元末端グルコースにピリシールアミノ
基か入りグルコース3個の修飾オリゴ糖の生成量をピー
ク面積から求める。別にα−アミラーセ活性既知の標準
検体を用い上記と同様に操作し、検量関係を求め、この
検量線から検体のα−アミラーゼ活性を求める。
このときの標準検体の谷希釈段階に於けるα−アミラー
ゼ活性(somogy*単位/dz)と遊離したFG3
の量(μM)との関係を第1図に示す。標準検体のα−
アミラーゼ活性は200Somogyi単位である。
ゼ活性(somogy*単位/dz)と遊離したFG3
の量(μM)との関係を第1図に示す。標準検体のα−
アミラーゼ活性は200Somogyi単位である。
液体クロマトグラフィーのカラムはTSK−Gel
LS410.5μm%018’(4X300關、Toy
osoda Co、)、流出液は01%n−ブタノー
ルを含有の0.1M酢酸水溶液を使用、流出速度はl、
7ml/minで室温で行った。
LS410.5μm%018’(4X300關、Toy
osoda Co、)、流出液は01%n−ブタノー
ルを含有の0.1M酢酸水溶液を使用、流出速度はl、
7ml/minで室温で行った。
実施例 3
舐楽
ill 試牧2
グツ ド#r#1(t(P I P 8 S ) 4
LJ m mol。
LJ m mol。
グルコアミラーゼ5万単位、クルコースオキシダーゼ1
0万単位、ムタロターゼ200単位、カタラーゼ50万
単位、4−アミノアンチピリンQ、 7 m mot、
塩化ナトリウム15mmol、塩化カルシウム5mmo
tをとり、悄製氷に溶かして水酸化ナトリウムでp I
−16,9とし全量を1tとする。
0万単位、ムタロターゼ200単位、カタラーゼ50万
単位、4−アミノアンチピリンQ、 7 m mot、
塩化ナトリウム15mmol、塩化カルシウム5mmo
tをとり、悄製氷に溶かして水酸化ナトリウムでp I
−16,9とし全量を1tとする。
(2)試赦3
グツド緩衝液(PIPES)40mmot。
ペルオキシダーゼ15.000単位、塩化ナトリウム1
5mmot、塩化カルシウム5mmo4実施例1で調製
した非還元末端にピリシールアミン基が入ったマルトペ
ンタオース3g1窒化ナトリウム15 m mol 、
フェノール10m m o tをとり精製水に浴かして
水酸化すl−IJウムでp H6,9とし全量を1tと
する。
5mmot、塩化カルシウム5mmo4実施例1で調製
した非還元末端にピリシールアミン基が入ったマルトペ
ンタオース3g1窒化ナトリウム15 m mol 、
フェノール10m m o tをとり精製水に浴かして
水酸化すl−IJウムでp H6,9とし全量を1tと
する。
測定方法
試液2の2mlに検体血清20μtを加え、37℃で5
分間加温する。これに試液3の1Mを加え、37℃で反
応させ505 nmに於ける2分後から5分後までの3
分間の吸光度変化△ (B/分)を測定する。
分間加温する。これに試液3の1Mを加え、37℃で反
応させ505 nmに於ける2分後から5分後までの3
分間の吸光度変化△ (B/分)を測定する。
別にα−アミラーゼ活性既知の標準検体を用い上記と同
様に操作して検量線を作製し、この検量線から検体のα
−アミラーゼ活性を求める。
様に操作して検量線を作製し、この検量線から検体のα
−アミラーゼ活性を求める。
この時の検量線を第2図に示す。標準検体のα−アミラ
ーゼ活性は500 Somogy i 単位である。
ーゼ活性は500 Somogy i 単位である。
試薬1検の3分間当りの吸光度変化を、基質にピリシー
ルアミノ基が入ったマルトヘキサオースを使用した場合
とマルトヘキサオースを使用した場合とで比較し以下に
比較例として示す。
ルアミノ基が入ったマルトヘキサオースを使用した場合
とマルトヘキサオースを使用した場合とで比較し以下に
比較例として示す。
比較例 1
(1) 試液 4
実施例3の試WL2に同じ
(2)試液 5
実施例3の試液3に2ける非還元末端にピリシールアミ
ノ基が入ったマルトペンタオースの代わりに非還元末端
にピリシールアミ7基が入ったマルトヘキサオースを用
い、以下試液3に同じ。
ノ基が入ったマルトペンタオースの代わりに非還元末端
にピリシールアミ7基が入ったマルトヘキサオースを用
い、以下試液3に同じ。
t31 試g6
実施例3の試′g!i、3における非還元末端にピリシ
ールアミノ基が入ったマルトペンタオースの代わりにマ
ルトヘキサオースを用い、以下状g!L3に同じ。
ールアミノ基が入ったマルトペンタオースの代わりにマ
ルトヘキサオースを用い、以下状g!L3に同じ。
測定方法
試液4の2rnlに精製水20μtを加え、37℃で5
分間加温する。これに試液5のl mlを加え、37℃
で反応させ505 nmに於ける2分後から5分後まで
の3分間の吸光度変化(6E/分)を測定する。
分間加温する。これに試液5のl mlを加え、37℃
で反応させ505 nmに於ける2分後から5分後まで
の3分間の吸光度変化(6E/分)を測定する。
又、試液5の代わりに試g6を用い上記と同様に測定す
る。
る。
結果を表1に表わす。
表 1
第1図は、実施例2における検量線、第2図は実施例3
における検量線である。 手続補正書 特許庁長官 殿 2、 発明の名称 a−アミラーゼの活性測定方法 3、 補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 541 連絡先 特許線(東京) 置 03−270−857
15 補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄および図面の第1図。 6 補正の内容 (1)明細書6頁18行目に記載のl −OH□N H
R基を有する生成物」をl” CH2N HR基を有
する生成物」と補正する。 (2)明細也7頁4そ」目に記載の「(例えばアミノピ
リジン修飾オリゴ糖)という。)」を1−(例えばアミ
ノピリジン修飾オリゴ糖という。)」と補正する。 (3)明細書11頁4行目に記載の1アルデヒド基(−
CHo)とした後、」を1アルデヒド(−CHo)とし
た後、」と補正する。 (4)明細書21頁6行目に記載のl” CJ 、Bi
ochem。 85.217.Jを「[J’、Biochem、85.
217、」と補正する。 (5)図面の第1図を別紙の通り補正する。 以上 手続補正書(方却 1.事件の表示 昭和57年特許願第161457号 2 発明の名称 α−アミラーゼの活性測定方法 3、 補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 541 連絡先 特許課(東京) 置 03−270−857
15 補正の対象 願書の特許出願人の欄。明細書の発明の詳細な説明の欄
及び図面の簡単な説明の欄。 6、 補正の内容 (11願書について、特許出願人の記名のあとに鮮明に
捺印致します。 別紙のとおシ。 (2)明細書29頁11行目から12行目にかけて記載
の文章を削除し、削除した箇所に図面の簡単な説明とし
て次の文章を加入する。 「第1図は、冥施例2におけるα−アミラーゼ活性(S
omogyi単位/ミ)と遊離したFe2の妬(8M
/ min )との関係を表わす。 第2図は、実施例3におけるα−アミラーゼ活性(SO
mOgyi単位/血)と505nmにおける吸光度変化
(ΔRi / fllln)との関係を表わす。 (8)明細書24頁10行目に記載の1実験例 2」を
「実施例 2」と補正する。 手続補正書 1、事件の表示 2、 発明の名称 0(−7ミラー(=二′′σ)挿ノを望うy(す3)ニ
一方法3、 補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 541 連絡先特許HJA (東京) 置 03−270−1
15715 補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 6 補正の内容 (1)明細書6頁20行目から7頁4行目にかけて記載
の[(以下修飾オリゴ糖という。・・曲1ミノピリジン
修飾オリゴ糖という。)]を1(以下、修飾オリゴ糖と
いう。)」と補正する。 (2) 明細書12頁4行目から同頁9行目にかけて
記載の「2−アミノピリジン又は・・・・・・アルキル
アニリン修飾オリゴ糖」を[2−ビリンルアミノ基又は
3−ピリジルアミノ基などのピリジルアミノ基修飾オリ
ゴ糖、アニリノ基修飾オリゴ糖、2−ヒドロキシアニリ
ノ基などのヒドロキシアニリノ基修飾オリゴ糖、カルボ
キシフェニルアミノ基修飾オリゴ糖、メチルアニリノ基
などのアルキルアニリノ基修飾オリゴ糖」と補正する。 (3) 明細書233頁2行目記載の「グルソトール
」を1−クリシトール」と補正する。 以上
における検量線である。 手続補正書 特許庁長官 殿 2、 発明の名称 a−アミラーゼの活性測定方法 3、 補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 541 連絡先 特許線(東京) 置 03−270−857
15 補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄および図面の第1図。 6 補正の内容 (1)明細書6頁18行目に記載のl −OH□N H
R基を有する生成物」をl” CH2N HR基を有
する生成物」と補正する。 (2)明細也7頁4そ」目に記載の「(例えばアミノピ
リジン修飾オリゴ糖)という。)」を1−(例えばアミ
ノピリジン修飾オリゴ糖という。)」と補正する。 (3)明細書11頁4行目に記載の1アルデヒド基(−
CHo)とした後、」を1アルデヒド(−CHo)とし
た後、」と補正する。 (4)明細書21頁6行目に記載のl” CJ 、Bi
ochem。 85.217.Jを「[J’、Biochem、85.
217、」と補正する。 (5)図面の第1図を別紙の通り補正する。 以上 手続補正書(方却 1.事件の表示 昭和57年特許願第161457号 2 発明の名称 α−アミラーゼの活性測定方法 3、 補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 541 連絡先 特許課(東京) 置 03−270−857
15 補正の対象 願書の特許出願人の欄。明細書の発明の詳細な説明の欄
及び図面の簡単な説明の欄。 6、 補正の内容 (11願書について、特許出願人の記名のあとに鮮明に
捺印致します。 別紙のとおシ。 (2)明細書29頁11行目から12行目にかけて記載
の文章を削除し、削除した箇所に図面の簡単な説明とし
て次の文章を加入する。 「第1図は、冥施例2におけるα−アミラーゼ活性(S
omogyi単位/ミ)と遊離したFe2の妬(8M
/ min )との関係を表わす。 第2図は、実施例3におけるα−アミラーゼ活性(SO
mOgyi単位/血)と505nmにおける吸光度変化
(ΔRi / fllln)との関係を表わす。 (8)明細書24頁10行目に記載の1実験例 2」を
「実施例 2」と補正する。 手続補正書 1、事件の表示 2、 発明の名称 0(−7ミラー(=二′′σ)挿ノを望うy(す3)ニ
一方法3、 補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 541 連絡先特許HJA (東京) 置 03−270−1
15715 補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 6 補正の内容 (1)明細書6頁20行目から7頁4行目にかけて記載
の[(以下修飾オリゴ糖という。・・曲1ミノピリジン
修飾オリゴ糖という。)]を1(以下、修飾オリゴ糖と
いう。)」と補正する。 (2) 明細書12頁4行目から同頁9行目にかけて
記載の「2−アミノピリジン又は・・・・・・アルキル
アニリン修飾オリゴ糖」を[2−ビリンルアミノ基又は
3−ピリジルアミノ基などのピリジルアミノ基修飾オリ
ゴ糖、アニリノ基修飾オリゴ糖、2−ヒドロキシアニリ
ノ基などのヒドロキシアニリノ基修飾オリゴ糖、カルボ
キシフェニルアミノ基修飾オリゴ糖、メチルアニリノ基
などのアルキルアニリノ基修飾オリゴ糖」と補正する。 (3) 明細書233頁2行目記載の「グルソトール
」を1−クリシトール」と補正する。 以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (II α−アミラーゼ活性を測定するに際し、グル
コースが4〜7個からなる直鎖状オリゴサツカライドの
非還元末端グルコースの6位の一級アルコール(−0H
zOH) が一般式−0H2NHRで表わされる基で
置換された下記構造式(1)を有するオリコサツカライ
ド誘導体を1.f’Jtとして使用することを特徴とす
るα−アミラーゼ活性の測定方法。 (式中、右端のクルコース単位は還元性基、nは2〜5
の整数、であり、Rは、グルコースが4〜7個からなる
直鎖状オリゴサツカライドの非還元末端グルコースの6
位に一級アルコール(OHh OH) を有していて
これが一般式−OH2N Hl(で表わされる基でit
侯されると構造式il+を有ちるオリゴサツカライド訪
導体となるアルコール(−0H20H)が酸化されて相
当するアルデヒド(−CHO)となった酸化多糖体のア
ルデヒド(−0f−10)と反応してシッフ塩基を形成
するアミン基を有する有機残基を表わす。) (2) 構造式(1)を有するオリゴサツカライド訪
纏体の、一般式−OH2N HE%で表わされる基の1
(の測定方法。
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16145782A JPS5951800A (ja) | 1982-09-16 | 1982-09-16 | α−アミラ−ゼの活性測定方法 |
US06/532,099 US4622295A (en) | 1982-09-16 | 1983-09-14 | Modified oligosaccharides used as substrate for measuring α-amylase activity |
DE8383305378T DE3372774D1 (en) | 1982-09-16 | 1983-09-14 | Modified oligosaccharides used as substrate for measuring alpha-amylase activity |
AT83305378T ATE28650T1 (de) | 1982-09-16 | 1983-09-14 | Modifizierte oligosaccharide als substrate zur messung der alpha-amylaseaktivitaet. |
EP83305378A EP0104047B1 (en) | 1982-09-16 | 1983-09-14 | Modified oligosaccharides used as substrate for measuring alpha-amylase activity |
US06/907,358 US4697006A (en) | 1982-09-16 | 1986-09-15 | Modified oligosaccharides used as substrate for measuring α-amylase activity |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16145782A JPS5951800A (ja) | 1982-09-16 | 1982-09-16 | α−アミラ−ゼの活性測定方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5951800A true JPS5951800A (ja) | 1984-03-26 |
JPH0218079B2 JPH0218079B2 (ja) | 1990-04-24 |
Family
ID=15735467
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP16145782A Granted JPS5951800A (ja) | 1982-09-16 | 1982-09-16 | α−アミラ−ゼの活性測定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5951800A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6163299A (ja) * | 1984-07-26 | 1986-04-01 | ジエンジム・コ−ポレ−シヨン | アルフア・アミラ−ゼの検出法 |
-
1982
- 1982-09-16 JP JP16145782A patent/JPS5951800A/ja active Granted
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6163299A (ja) * | 1984-07-26 | 1986-04-01 | ジエンジム・コ−ポレ−シヨン | アルフア・アミラ−ゼの検出法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0218079B2 (ja) | 1990-04-24 |
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