JPH0630602B2 - 非還元末端修飾オリゴサッカライド誘導体の新規な製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、α−アミラーゼ活性測定用基質として有用な
非還元末端修飾オリゴサッカライド誘導体の新規な製造
法に関する。

〔発明の背景〕 試料、特にヒト生体内の唾液、膵液、血液、尿中のα−
アミラーゼ活性の測定は医学上の診断において重要であ
る。例えば、膵炎、膵臓癌、耳下腺炎においては、血液
や尿中のα−アミラーゼ活性は通常の値に比べて著しい
上昇を示す。

α−アミラーゼ活性の測定方法については、これまで種
々の方法が発表されているが、大別すると、でんぷん、
アミロース、アミロペクチン等の長鎖の天然物及びその
修飾物を使用する方法と、グルコース残基数が４〜７個
のオリゴサッカライド及びその誘導体を使用する方法の
２種に分けられる。

しかしながら、最近では、例えばマルトテトラオース、
マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプ
タオース等のオリゴサッカライドを基質に用いる方法
（特開昭50-56998号公報、特開昭53-37096号公報）やｐ
−ニトロフェノール等の原色体を還元末端に結合したオ
リゴサッカライドを用いる方法（特開昭54-51892号公
報）等、均一で構造の明確な基質を用いる方法がこれま
で多く使用されてきたデンプンを用いる方法に代わって
アミラーゼ測定法の主流となりつつある。

これらの方法では通常、測定用共役酵素としてα−グル
コシダーゼ（E.C.3.2.1.20；α−Ｄ−グルコシドグルコ
ヒドロラーゼ）又はグルコアミラーゼ（E.C.3.2.1.3；
1,4−α−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ）、又はβ
−グルコシダーゼ（E.C.3.2.1.21；β−Ｄ−グルコシド
グルコヒドロラーゼ）を必要とする。

こらの共役酵素は、α−1,4−グルコシド結合を有する
糖鎖の非還元性末端からα−1,4−グルコシド結合を加
水分解するエキソタイプの酵素であり、α−アミラーゼ
反応に関係なく基質を分解してしまう欠点を有する。こ
の為これら共役酵素を用いる上記測定法に於ては、測定
用試液が不安定で、試薬盲検値が極めて高くそれにより
測定精度を著しく悪くしていた。さらに測定に充分な量
のグルコアミラーゼ、あるいはα−グルコシダーゼを使
用できず、正確で且つ精度の高い測定法の組立が困難で
あった。

かかる問題点を解決すべく、本発明者らは、これまで数
種の新規な修飾オリゴサッカライドを合成し、これらを
用いるα−アミラーゼ活性の測定法について特許出願し
ている。

例えば、α−アミラーゼ活性を測定するに際し、グルコ
ースが４〜７個からなる直鎖状オリゴサッカライドの非
還元末端グルコースの６位の一級アルコール(-CH₂OH)が
一般式-CH₂Rで表わされる基で置換された下記構造式を
有するオリゴサッカライド誘導体を基質として使用する
α−アミラーゼ活性の測定法がある（特開昭59-51800
号）。

（式中、右端のグルコース単位は還元性基、ｋは２〜５
の整数であり、Ｒは、例えば２−ピリジルアミノ基を表
わす。） これらの基質は、均一で構造が明確でありα−グルコシ
ダーゼ、β−グルコシダーゼ又はグルコアミラーゼの基
質とならない点に特徴を有している。しかしながら、こ
れらの基質を用いてα−アミラーゼ活性を測定するに
は、高速液体クロマトグラフィー法によるか、或はα−
グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ又はグルコアミラ
ーゼを共役酵素に用いて生成するグルコースを測定する
方法によらねばならず、前者は特殊な機器を必要とする
点、後者は検体中に含まれるグルコースにより影響を受
ける点等に問題があった。

そこで、本発明者らは更に研究を重ね、このような問題
のないα−アミラーゼ活性測定法を見出し、これを特許
出願している（特開昭61-83195号）。

即ち、グルコースが４〜７個からなる直鎖状オリゴサッ
カライドの非還元末端グルコースの６位の一級アルコー
ル(-CH₂OH)が-CH₂R₀ ¹で示される基で置換され、更に、
還元末端グルコースの１位水酸基がフェノキシ基若しく
は置換フェノキシ基又はウンベリフェリル基で置換され
た、下記構造式〔１〕、 〔式中、n₀は２〜５の整数であり、R₀ ¹は有機残基を表
わし、R₀ ²は を表わす。（但し、R₀ ³〜R₀ ⁶は水素、低級アルキル基、
低級アルコキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、スルホ
ン酸基又はハロゲンを表わし、夫夫同じであっても異な
っていても良く、R₀ ⁷は水素、低級アルコキシ基、ハロ
ゲン又はニトロ基を表わす。また、R₀ ⁸は水素、メチル
基又はトリフルオロメチル基を表わす。）〕 で示されるオリゴサッカライド誘導体を基質として用い
るα−アミラーゼ活性測定法がそれである。この測定法
は従来のα−アミラーゼ活性測定法が有する種々の問題
点を全て解決した優れた測定法ではあるが、基質として
用いる非還元末端修飾オリゴサッカライドが、デキスト
リンやアミロースを出発原料とする従来の製法によって
では極めて低収率でしか得ることができず、その製法が
反応工程が長く、煩雑な製法であることと相俟って実用
化（企業化）に際し問題が残る。一方、シクロマルトデ
キストリングルカノトランスフェラーゼ(E.C.2.4.1.19)
が、シクロデキストリンとアクセプターに作用し、還元
末端にアクセプターが結合した直鎖状オリゴサッカライ
ドを生成することは以前から知られていた（J.Am.Chem.
Soc.72巻，1202〜1205頁，1949年）。しかしながら修飾
したシクロデキストリンとアクセプターにこれを作用さ
せた場合に同様に還元末端にアクセプターが結合した直
鎖状オリゴサッカライドが得られるか否かについては詳
らかではなく、特開昭60-237998号公報にはこれの可能
性を示唆する記載があるが、同公報に開示されている方
法に従ってこれを行っても実際には目的物は得られな
い。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、α−アミラーゼ活性測定用基質として
有用な非還元末端修飾オリゴサッカライドが容易に且つ
収率よく得られる製造方法を提供することにある。

〔発明の構成〕

本発明は、１分子当たり１個の修飾グルコース（即ち、
６位の水酸基が修飾されたグルコース又は６位がカルボ
キシル基に置き換ったグルコース）を含む修飾シクロデ
キストリンに、アクセプターとしてのグルコース、マル
トース、マルトトリオース若しくはこれらの還元末端グ
ルコースの１位の水酸基が置換された誘導体の存在下、
シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ
を作用させ、然る後、グルコアミラーゼ又はα−グルコ
シダーゼを作用させることを特徴とする、非還元末端グ
ルコースの６位が置換され、且つ還元末端にアクセプタ
ーが結合した非還元末端修飾オリゴサッカライド誘導体
の製造法の発明である。

本発明の製造法で用いられる修飾シクロデキストリンと
しては１分子当たり１個の修飾グルコースを含むものが
挙げられる。

修飾グルコースとしては、６位の水酸基が、例えば、２
−ピリジルアミノ基，３−ピリジルアミノ基等の如く蛍
光性を有する置換基、アニリノ基，メチルアニリノ基，
ヒドロキシアニリノ基，カルボキシフェニルアミノ基の
如くＵＶ吸収を有する置換基、メトキシ基，エトキシ基
等のアルコキシ基、カルボキシメトキシ基，ヒドロキシ
エトキシ基，ベンジルオキシ基，フェネチルオキシ基，
ピリジルメチルオキシ基等の置換アルコキシ基、塩素，
臭素等のハロゲン原子、ヒドラゾノ基、フェニルヒドラ
ゾノ基又はアミノ基等で置換されたグルコース、若しく
はグルコースの６位の-CH₂OH基が-COOH基で置き換った
グルクロン酸等が挙げられる。

本発明の製造法で用いられるアクセプターとしては、グ
ルコース、マルトース、マルトトリオース若しくはこれ
らの還元末端グルコースの１位の水酸基が置換された誘
導体が挙げられる。マルトテトラオース以上のオリゴサ
ッカライドでは反応が遅く、且つ副反応が起るので好ま
しくない。一方、グルコース鎖が長くなると、反応初期
の主生成物のグルコース鎖も長くなる。従って、目的物
のグルコース鎖長に従って、上記グルコース鎖長１〜３
のアクセプターを適宜選択して用いればよい。

アクセプターとして用いられるグルコース、マルトース
又はマルトトリオースの誘導体の還元末端グルコースの
１位の水酸基の置換基としては、例えば （但し、Ｒ³〜Ｒ⁶は水素、低級アルキル基、低級アルコ
キシ基、ニトロ基、カルボキシル基、スルホン酸基又は
ハロゲンを表わし、夫々同じであっても異なっていても
良く、また、Ｒ³とＲ⁵又はＲ⁴とＲ⁶とが結合して芳香環
を形成していてもよい。Ｒ⁷は水素、低級アルコキシ
基、ハロゲン又はニトロ基を表わす。また、Ｒ⁸は水
素、メチル基又はトリフルオロメチル基を表わし、Ｒ⁹
は水素又はハロゲンを表わす。）で示される、置換基を
有していてもよいフェノキシ基、置換基を有していても
よいナフトキシ基、置換基を有していてもよいウンベリ
フェリル基又は置換基を有していてもよいインドキシル
基等が挙げられる。また、これら１位水酸基の置換基の
具体例としては、例えば、ｐ−ニトロフェノキシ基、ｍ
−ニトロフェノキシ基、ｏ−クロロフェノキシ基、ｐ−
クロロフェノキシ基、2,6−ジクロロフェノキシ基、ｏ
−メトキシフェノキシ基、ｐ−メトキシフェノキシ基、
ｏ−メチルフェノキシ基、ｏ−カルボキシフェノキシ
基、ｏ−スルホフェノキシ基、１−ナフトキシ基、２−
スルホ−１−ナフトキシ基、２−カルボキシ−１−ナフ
トキシ基、ウンベリフェリル基、４−メチルウンベリフ
ェリル基、インドキシル基等が挙げられるが、これらに
限定されるものではない。

本発明の製造法で用いられるシクロマルトデキストリン
グルカノトランスフェラーゼ（以下、CGTaseと略す。）
の起源、由来に特に限定はなく、例えば、バチルス マ
セランス由来のもの、バチルス メガテリウム由来のも
の、クレプシェラ ニューモニエ由来のもの、アルカリ
細菌由来のもの等、いずれの由来のものにてもよい。

また、本発明の製造法で用いられるグルコアミラーゼ又
はα−グルコシダーゼの起源、由来についても特に限定
はない。

本発明の製造法で用いられる修飾シクロデキストリン
は、α，β又はγ−シクロデキストリンを原料とし、例
えば、メソッド イン カーボハイドレイトケミストリ
ーＩ(1962)〜Ｖ(1965)アカデミック プレス 等に記載
の各種修飾グルコースの製法に準じて、これを目的とす
る修飾基を導入するための各種反応試剤と反応させるこ
とにより容易に得られる。α，β，γ−いずれのシクロ
デキストリンを選ぶかは任意であり目的とする修飾オリ
ゴサッカライド誘導体のグルコース鎖長に応じてそれら
が最も収率よく得られるものを適宜選択すればよい。

アクセプターの存在下修飾シクロデキストリンにCGTase
を作用させて反応させる際の反応時のpHは用いるCGTase
の由来により若干異なるが、通常６〜８である。同pHに
保つために用いられる緩衝剤は酵素反応を阻害しないも
のであればいずれにてもよく、例えば、グッドの緩衝
剤、酢酸アンモニウム、炭酸塩、リン酸塩等が挙げられ
る。

本発明の製造法で用いられる修飾シクロデキストリンの
濃度は通常１〜５０ｍmol／、またアクセプターの濃
度は通常５ｍmol／以上、溶解度限界までであるが、
修飾シクロデキストリンとアクセプターのモル比は前者
１に対し後者が５以上であることが望ましい。また、本
発明の製造法で用いられるCGTaseの使用量は通常50〜50
00Ｕ／ｍであり、反応は通常２０〜５０℃で行われ
る。CGTaseによる酵素反応終了後は加熱によりこれを失
活させる（例えば９０℃以上で１０分間以上）か、pHを
変動させて（例えばpH4.0以下）その作用を失わしめ
る。

グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼによる反応
は、通常その至適pH（通常４〜６）で行われ、その使用
量は、いずれも通常５〜１００Ｕ／ｍである。

本発明の製造法によれば、α−アミラーゼ活性測定用基
質として、或はヒトα−アミラーゼの各アイソザイム活
性の分別測定用基質として有用な非還元末端修飾オリゴ
サッカライドを簡単な反応操作で、収率よく得ることが
できる。

本発明に係る非還元末端修飾オリゴサッカライド誘導体
を基質として用いるα−アミラーゼ活性測定法の測定原
理は概略次の通りである。

（式中、Ｇはグルコース単位を表わし、Ｒ¹は非還元末
端グルコースの６位の置換基を表わし、ｍ¹とｍ²はその
和が２から５である１以上の整数を表わし、OR²は還元
末端グルコースの１位に置換された置換基を有していて
もよいフェノキシ基、置換基を有していても良いナフト
キシ基、置換基を有していてもよいウンベリフェリル基
又は置換基を有していてもよいインドキシル基を表わ
す。） 即ち、先ず始めに、本発明に係る非還元末端修飾オリゴ
サッカライド誘導体に試料中のα−アミラーゼが作用し
て、非還元末端グルコースの６位の一級アルコール(-CH
₂OH)がＲ¹なる基で置換された と、還元末端グルコースの１位に置換基を有していても
よいフェノキシ基、置換基を有していても良いナフトキ
シ基、置換基を有していてもよいウンベリフェリル基又
は置換基を有していてもよいインドキシル基がついたG_m
²-G-OR²が生成し、次いで、このG_m ²-G-OR²にグルコアミ
ラーゼ、α−グルコシダーゼ又はβ−グルコシダーゼ等
の共役酵素が作用して、(m²+1)GとR²-OHが生成する。こ
のR²-OHを、例えばR²-OHがｐ−ニトロフェノールの如き
ニトロフェノール類の場合には、直接その吸収スペクト
ルを（例えば405nmに於ける吸光度を）測定することに
より、また、R²-OHが、例えばフェノール、ｏ−クロロ
フェノール、2,6−ジクロロフェノール、ｐ−メトキシ
フェノール等の如きニトロ基をもたない（ニトロ基をも
っていても良いが）フェノール類或はナフトール類の場
合には、カテコールオキシダーゼ、ラッカーゼ、チロシ
ナーゼ又はモノフェノールオキシダーゼの如き酸化酵素
類又はヨウ素酸、過ヨウ素酸の如き酸化剤を作用させて
或はまた、パーオキシダーゼと過酸化水素とを作用させ
て、４−アミノアンチピリン、３−メチル−２−ベンゾ
チアゾリノンヒドラゾン(MBTH)等のカプラーとカップリ
ング（酸化縮合）させ、生成する色素の吸収スペクトル
を測定することにより、或はR²-OHがウンベリフェロ
ン、４−メチルウンベリフェロンの如く蛍光を有する化
合物の場合には、その蛍光強度を測定することにより、
更にはR²-OHがインドキシルの場合には、酸化されて生
成するインジゴ色素の吸収スペクトルを測定することに
より、夫々試料中のα−アミラーゼ活性を求めることが
できる。

本発明に係る非還元末端修飾オリゴサッカライド誘導体
を基質として用いるα−アミラーゼ活性測定法に於て、
基質として用いる本発明に係る非還元末端修飾オリゴサ
ッカライド誘導体の濃度は特に限定されるものではない
が、通常約0.1〜10mMが好ましく用いられる。

本発明に係る非還元末端修飾オリゴサッカライド誘導体
を基質として用いるα−アミラーゼ活性測定法に於て測
定対象となる試料は、α−アミラーゼを含有する検体な
ら何れを用いてもよく、例えば生体成分として血液、血
清、尿等があげられる。

共役酵素のグルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ又は
β−グルコシダーゼとしては、特に限定されないが例え
ば動物、植物、微生物由来のものが利用出来、夫々単独
で、或は組み合せて用いられる。これら共役酵素の使用
量は通常0.5〜50単位／ｍ、好ましくは２〜２０単位
／ｍである。

また、本発明を実施する測定条件として、反応温度は特
に限定されないが、好ましくは約２５〜４０℃であり、
反応時間は目的により自由に選択できる。

至適pHとしては特に限定されないが、pH約６〜８が好ま
しい例である。至適pHを維持する緩衝剤は自由に選択で
き、例えば、リン酸塩、トリスハイドロキシメチルアミ
ノメタン−塩酸、グッドの緩衝剤などが任意に選ばれ
る。

さらにα−アミラーゼの賦活剤として、例えば塩化ナト
リウム、塩化カルシウム、塩化カリウム等が使用され
る。

共役酵素の作用により遊離したフェノール類又はナフト
ール類とカップリング（酸化縮合）させるカプラーとし
ては、４−アミノアンチピリン、３−メチル−２−ベン
ゾチアゾリノンヒドラゾン(MBTH)、ｐ−アミノ−N,N−
ジエチルアニリン等が挙げられるが、これらに限定され
るものではない。フェノール類又はナフトール類とカプ
ラーとをカップリング（酸化縮合）させる為の酸化酵素
としては、ラッカーゼ、カテコールオキシダーゼ、チロ
シナーゼ又はモノフェノールオキシダーゼ等が挙げられ
るが、これらは例えば、動物、植物、微生物由来のもの
が、いずれも利用でき、通常0.2〜１０単位／ｍ、好
ましくは0.5〜４単位／ｍの範囲で使用される。ま
た、カップリング（酸化縮合）させる為の酸化剤として
は、ヨウ素酸又は／及びその塩、過ヨウ素酸又は／及び
その塩等が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明に係る非還元末端修飾オリゴサッカライド誘導体
は、その非還元末端グルコースの６位の一級アルコール
(-CH₂OH)が各種置換基に置換されている為、そのままで
はグルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ又はβ−グル
コシダーゼの基質とはならず、しかも水に易溶で、α−
アミラーゼとの親和性に優れているので、α−アミラー
ゼの良好な特異基質となる。従って、本発明に係る非還
元末端修飾オリゴサッカライド誘導体を基質として用い
る測定法に於ては、副反応が起らず試薬盲検値は極めて
小さく、測定用試液が極めて安定である。また、単一の
化合物を基質とすることから、反応の化学量論が成立
し、α−アミラーゼの動力学的検知が可能となる。

また、本発明に係る非還元末端修飾オリゴサッカライド
誘導体を基質として用いるα−アミラーゼ活性測定法に
於ては、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソ
マルターゼ又はβ−グルコシダーゼ等の共役酵素を充分
に使用することができるので、α−アミラーゼ反応以降
の反応速度が速く、より正確で精度のよいα−アミラー
ゼ活性の測定を行うことができる。

更に、本発明に係る測定法に於ては、検出を遊離してく
るニトロフェノール類若しくはインジゴ色素類の吸収ス
ペクトルを測定するか、若しくは遊離してくるフェノー
ル類又はナフトール類を４−アミノアンチピリン、MBTH
等と酸化カップリングし、その色素の吸収スペクトルを
測定するか、又は遊離してくるウンベリフェロン類の蛍
光強度を測定することにより行なうので、検体中に共存
するグルコース、マルトース等の糖類や、アスコルビン
酸、ビリルビン等の還元性物質の影響を殆んど受けな
い。

本発明に係るアミラーゼ活性の測定方法は、一定条件で
の反応速度を測定するレイトアッセイでも、あるいは反
応停止剤を使用するエンドポイントアッセイとしてもよ
く、いずれの測定方法も実施可能である。

また、本発明に係る測定法は自動分析装置への適応性も
良く、必要に応じて用手法、自動分析のいずれにて行な
うも可である。

更にまた、本発明の基質を用いた場合には、色素の呈色
を測定する、所謂比色法で測定を行なうことができるの
で、簡便な試験紙法や反応試薬を含有させた多層分析シ
ート（多層一体型定量分析フィルム）を使用する所謂乾
式定量法にも応用することができる。

本発明に係る非還元末端修飾オリゴサッカライド誘導体
は、また、本発明者らが別に特許出願した特願昭６１−
181564号に記載の唾液腺由来のα−アミラーゼと膵由来
のα−アミラーゼの分別測定法、即ち、α−アミラーゼ
の加水分解作用を受けて生じる分解生成物に、基質特異
性の異なる２種以上の共役酵素を作用させ、生じる成績
体を測定することによって、ヒト膵由来のα−アミラー
ゼとヒト唾液腺由来のα−アミラーゼの分別測定を行
う、α−アミラーゼアイソザイムの分別測定法にも効果
的な基質として充分使用可能である。

以下に実施例及び参考例を示すが本発明はこれら実施
例、参考例により何ら限定されるものではない。

〔実施例〕

実施例１．ｐ−ニトロフェニル Ｏ−６−デオキシ−６
−〔（２−ピリジル）アミノ〕−α−Ｄ−グルコピラノ
シル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−
（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α
−Ｄ−グルコピラノシド（以下、FG5Pと略す。）の合成 (1)モノ−６−デオキシ−６〔（２−ピリジル）アミ
ノ〕−β−シクロデキストリン（以下、Ｆ−β−CDと略
す。） の合成 β−シクロデキストリン２０ｇ，DCC（ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド）30.4ｇをDMSO（ジメチルスルホキシ
ド）１２０ｍに溶解し、ジクロル酢酸2.6ｍを加え
て室温で３０分撹拌した。シュウ酸12.8ｇをメタノール
５０ｍに溶解したものをこれに加え、２Ｍ炭酸ナトリ
ウム水溶液でpH９とした。２−アミノピリジン1.6ｇを
水２００ｍに溶解したものをこれに加え、更にピリジ
ンボラン3.6ｇを加えて６５〜７０℃で２時間反応させ
た。水７００ｍを加えて不溶物を去し、塩酸でpH７
とした後水素化ホウ素ナトリウム2.4ｇを加え室温で１
時間反応させた。塩酸を加えpH３として過剰の水素化ホ
ウ素ナトリウムを分解し、後アンモニア水を加えてpH7.
0とした。アセトン２を加え析出した沈澱を取して
Ｆ−β−CD3.0ｇを得た。

元素分析 C₄₇H₇₄O₃₄N₂ (2)FG5Pの合成 Ｆ−β−CD１０ｇ，ｐ−ニトロフェニル α−グルコシ
ド１０ｇを１０mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH6.5）１
に溶解しCGTase1000kUを添加して３７℃で５時間反応
させた。次いで酢酸でpH4.0とした後、グルコアミラー
ゼ（リゾプス ニベウス由来）を２０kU添加し、３７℃
で１０時間反応させた。反応液を凍結乾燥後、５０mM酢
酸で平衡化したBio-GelP-2(Bio-Rad社）を充填したカラ
ム（30×1500mm）で精製を行ない、FG5P1.1ｇを得た。

ｐ−ニトロフェニル α−グルコシド１０ｇの代りにｐ
−ニトロフェニル β−グルコシド１０ｇを用い、同様
に反応、後処理を行ってFG5Pのβ体2.5ｇを得た。

尚、構造の確認は特開昭61-83195号公報に記載の同化合
物の確認方法に従って行った。

実施例２．ｐ−ニトロフェニル Ｏ−（２−Ｏ−カルボ
キシメチル）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）
−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α
−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシ
ド（以下、CMG5Pと略す。）の合成 (1)モノ−Ｏ−カルボキシメチル−β−シクロデキスト
リン（以下、CM−β−CDと略す。）の合成 β−シクロデキストリン15.0ｇ，水酸化ナトリウム13.5
ｇを水１２０ｍに溶解し、１０％モノクロル酢酸水溶
液９０ｍを加えて２５℃で５時間撹拌した。６Ｎ塩酸
でpH7.0としたのちアセトン６００ｍを加えて析出し
た結晶を取し、CM−β−CD１２ｇを得た。

元素分析 C₄₄H₇₅O₃₇N MW1210(NH₄塩） (2)CMG5Pの合成 CM−β−CD１０ｇ，ｐ−ニトロフェニルグルコシド１０
ｇを１０mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH6.5）１に溶
解し、CGTase1000kUを添加して３７℃で５時間反応させ
た。次いで酢酸でpH4.0とした後、グルコアミラーゼを
２０kU添加し、３７℃で１０時間反応させた。反応液を
凍結乾燥後、５０mM酢酸で平衡化したBio-GelP-2(Bio-R
ad社）を充填したカラム（30×1500mm）で精製を行な
い、CMG5P３ｇを得た。

実施例３．フェニル Ｏ−（α−Ｄ−グルコピラノシル
ウロニック酸）−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラ
ノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−
（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
４）−α−Ｄ−グルコピラノシド（以下、カルボキシル
G5Pと略す。）の合成 (1)モノカルボキシル−β−シクロデキストリン（以
下、カルボキシル−β−CDと略す。）の合成 β−シクロデキストリン５０ｇを水１に溶解し、プラ
チナ−カーボン（１０％）５ｇ，イソプロパノール2.5
ｍを加えて、撹拌下、７０℃で空気を５０ｍ／min
の流速で通じた。１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液を滴下し
てpHを中性に保ちながら2.5時間反応させた後、過
し、液をイオン交換クロマトグラフィー（DowexＩ）
に付し、カルボキシル−β−CD10.5ｇを得た。

元素分析 C₄₂H₇₁O₃₆N MW1165(NH₄塩） (2)カルボキシルG5Pの合成 カルボキシル−β−CD１０ｇ，フェニル α−グルコシ
ド１０ｇを１０mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH6.5）１
に溶解し、CGTase1000kUを添加して３７℃で１時間反
応させた。次いで酢酸でpH4.0とした後グルコアミラー
ゼを２０kU添加し、３７℃で１０時間反応させた。反応
液を凍結乾燥後２０mM酢酸で平衡化したBio-GelP-2(Bio
-Rad社）を充填したカラム（30×2400mm）で精製を行な
い、カルボキシルG5P1.2ｇを得た。

得られたカルボキシルG5P中のフェニル基に対するグル
コース残基の数を次のようにして測定した。カルボキシ
ルG5Pを1.4Ｎ塩酸−メタノールで９０℃，２時間メタノ
リシスした。濃縮後、トリメチルシリル化し、２％OV-1
7(0.4×２００cm）のカラムを用い、１１０℃から250℃
まで４℃／分の昇温プログラムを用いて、グルコース量
を定量した。また、フェニル基は、0.1Ｍ酢酸中での２
６５nmの吸光度から定量した。その結果カルボキシルG5
Pのグルコース／フェノールの比は3.9であった。

上で得た結果と、カルボキシルG5Pがグルコアミラーゼ
の作用を受けないことから、カルボキシルG5Pの構造
は、次のものであると考えられる。

本化合物のマススペクトルを第１図に示す。

実施例４．Ｏ−６−デオキシ−６−〔（２−ピリジル）
アミノ〕−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ
−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ
−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコ
ピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル−（１→４）−Ｄ−グルシトール（以下、FG6Rと略
す。）の合成 実施例１の(1)と同様にして得たＦ−β−CD１０ｇ及び
マルトトリイトール５０ｇを１０mM酢酸アンモニウム緩
衝液（pH6.5）１に溶解し、CGTase1000kUを添加して
３７℃で５時間反応させた。次いで酢酸でpH4.0とした
後グルコアミラーゼを２０kU添加し、３７℃で１０時間
反応させた。反応液を凍結乾燥後、５０mM酢酸で平衡化
したBio-GelP-2(Bio-Rad社）を充填したカラム（30×15
00mm）で精製を行ない、FG6R1.2ｇを得た。

実施例５．フェニル Ｏ−（６−アミノ−６−デオキ
シ）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α
−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラ
ノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシド（以
下、アミノG5Pと略す。）の合成 (1)モノ−６−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル β−シク
ロデキストリンの合成 β−シクロデキストリン5.0ｇをピリジン100ｍに溶解
し、ｐ−トルエンスルホニルクロリド0.8ｇを加えて４
℃で１５時間撹拌した。減圧濃縮後、活性炭を充填した
カラム（５×60cm）にチャージし、水，３０％エタノー
ル，２５％ｎ−プロパノール、各々３で溶出させた。
２５％ｎ−プロパノール画分を集め減圧濃縮し６−Ｏ−
ｐ−トルエンスルホニル−シクロデキストリン0.7ｇを
得た。

(2)モノ−６−アジド−６−デオキシ−β−シクロデキ
ストリンの合成 ６−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル β−シクロデキスト
リン1.0ｇを８０ｍの水に溶解し、窒化ナトリウム１
ｇを加えて９５℃，９０分反応させた。反応後反応液を
減圧濃縮しゲル過（Bio-GelP-2）により分離精製して
モノ−６−アジド−６−デオキシ−β−シクロデキスト
リン0.7ｇを得た。

(3)アミノG5Pの合成 モノ−６−アジド−６−デオキシ−β−シクロデキスト
リン0.5ｇ，フェニル α−Ｄ−グルコピラノシド0.5ｇ
を１０mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH6.5）５０ｍに
溶解し、CGTase50kUを添加して３７℃で２時間反応させ
た。次いで酢酸でpH4.0とした後グルコアミラーゼ１kU
を添加し、３７℃で１０時間反応させた。反応液に１０
％−パラジウム−カーボン0.1ｇを加え２５℃で撹拌下
水素ガスを８時間吹き込んだ。反応液を凍結乾燥後、ゲ
ル過(Bio-GelP-2)により分離精製してアミノG5P８０m
gを得た。

得られたアミノG5P中のフェニル基に対するグルコース
残基の数を次のようにして測定した。アミノG5Pを1.4Ｎ
塩酸−メタノールで９０℃，２時間メタノリシスした。
濃縮後、トリメチルシリル化し、２％OV-17(0.4×２０
０cm)のカラムを用い、１１０℃から２５０℃まで４℃
／分の昇温プログラムを用いて、グルコース量を定量し
た。また、フェニル基は0.1Ｍ酢酸中での２６５nmの吸
光度から定量した。その結果、アミノG5Pのグルコース
／フェノールの比は3.6であった。

上で得た結果と、アミノG5Pがグルコアミラーゼの作用
を受けないこと及びTLC板上でニンヒドリンによる発色
が観察されたことより、アミノG5Pの構造は次のもので
あると考えられる。

本化合物のマススペクトルを第２図に示す。

実施例６．ｐ−ニロトフェニル Ｏ−（６−Ｏ−ベンジ
ル）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α
−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラ
ノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシド（以
下、BG5Pと略す。）の合成 (1)モノ−Ｏ−ベンジル−β−シクロデキストリン（以
下、ベンジル−β−CDと略す。）の合成 β−シクロデキストリン１５ｇ，水酸化ナトリウム13.5
ｇを水１２０ｍに溶解し、塩化ベンジル１５ｍを加
えて１０℃で２時間撹拌反応させた。反応後６Ｎ塩酸で
pH7.0としたのちアセトン１を加えて析出した沈澱を
取し、ベンジル−β−CD５ｇを得た（２位，３位，６
位置換体の混合物）。

(2)BG5Pの合成 ベンジル−β−CD１０ｇ，ｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−
グルコピラノシド１０ｇを１０mM酢酸アンモニウム緩衝
液（pH6.5）１に溶解し、CGTase1000kUを添加して３
７℃で５時間撹拌反応させた。次いで酢酸でpH4.0とし
た後、グルコアミラーゼを２０kU添加し、３７℃で１０
時間反応させた。反応液を凍結乾燥後、５０mM酢酸で平
衡化したBio-GelP-2(Bio-Rad社）を充填したカラム（30
×1500mm）で精製を行ない粗BG5P（２位，３位，６位置
換体の混合物）1.6ｇを得た。これを、逆相の高速液体
クロマトグラフィーで分離精製し、６位置換体１８０mg
を得た。（２位置換体７００mg，３位置換体６５０mg） HPLC：含量９６％〔カラム：充填剤シリカゲルＺ−OD
S，5C₁₈（和光純薬工業（株）商品名，１０×３００m
m），溶出液１０％CH₃CN−0.1％AcOHと９０％CH₃CN-0.1
％AcOHとの直線的グラジェント，流速３ｍ／min，305
nmで測定〕 IR：第３図の通り。¹ H-NMR：第４図の通り。

また、実施例３，実施例５と同様にして求めたBG5Pのグ
ルコース／ｐ−ニトロフェノールの比は3.8であった。

上で得た結果と、BG5Pがグルコアミラーゼの作用を受け
ないことから、BG5Pの構造は、次のものであると考えら
れる。

実施例７．ｐ−ニトロフェニル Ｏ−（６−Ｏ−メチ
ル）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α
−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラ
ノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシド（以
下、MG5Pと略す。）の合成 (1)モノ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン（以
下、メチル−β−CDと略す。）の合成 β−シクロデキストリン１０ｇ，水酸化ナトリウム13.5
ｇを水１２０ｍに溶解し、ジメチル硫酸2.7ｇを加え
て１０℃で２時間撹拌反応させた。反応後６Ｎ塩酸でpH
7.0としたのちアセトン１を加えて析出した沈澱を
取し、メチル−β−CD２ｇを得た。

(2)MG5Pの合成 メチル−β−CD１０ｇ，ｐ−ニトロフェニル α−Ｄ−
グルコピラノシド１０ｇを１０mM酢酸アンモニウム緩衝
液（pH6.5）１に溶解し、CGTase1000kUを添加して３
７℃で５時間撹拌反応させた。次いで酢酸でpH4.0とし
た後、グルコアミラーゼを２０kU添加し、３７℃で１０
時間反応させた。反応液を凍結乾燥後、５０mM酢酸で平
衡化したBio-GelP-2(Bio-Rad社）を充填したカラム（30
×1500mm）で精製を行ない粗MG5P（２位，３位，６位置
換体の混合物）1.5ｇを得た。これを逆相の高速液体ク
ロマトグラフィーで分離精製し、６位置換体１６０mgを
得た。（２位置換体６８０mg，３位置換体５６０mg）。

HPLC：含量９３％（測定条件は実施例６と同じ。）。

また、実施例３，実施例５と同様にして求めたMG5Pのグ
ルコース／ｐ−ニトロフェノールの比は3.9であった。

上で得た結果と、MG5Pがグルコアミラーゼの作用を受け
ないことから、MG5Pの構造は、次のものであると考えら
れる。

実施例８．ｐ−ニトロフェニル Ｏ−（６−ブロモ−６
−デオキシ）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）
−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α
−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシ
ド（以下、BrG5Pと略す。）の合成 (1)モノ−６−ブロモ−６−デオキシ−β−シクロデキ
ストリン（以下、Br−β−CDと略す。）の合成 実施例５の(1)の方法に準じて合成したモノ−６−Ｏ−
ｐ−トルエンスルホニル β−シクロデキストリン５ｇ
をDMF２５０ｍに溶解しリチウムブロマイド１５ｇを
加えて２時間還流反応させた。反応液を減圧濃縮後アセ
トン５００ｍを加えて析出した沈澱を取しモノ−６
−ブロモ−６−デオキシ−β−シクロデキストリン2.3
ｇを得た。

(2)BrG5Pの合成 Br−β−CD １ｇ、ｐ−ニトロフェニル α−Ｄ−グル
コピラノシド１ｇを１０mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH
6.5）１００ｍに溶解しCGTase100kUを添加して３７℃
で５時間撹拌反応させた。次いで酢酸を加えてpH4.0と
した後、グルコアミラーゼを2000Ｕ加えて３７℃で１０
時間撹拌反応させた。反応液を濃縮し５０mM酢酸で平衡
化したBio-GelP-2(Bio-Rad社）を充填したカラム（30×
1500mm）で精製をおこないBrG5P0.16ｇを得た。

HPLC：含量９７％（測定条件は実施例６と同じ。）。¹ H-NMR：第５図の通り。

また、実施例３，実施例５と同様にして求めたBrG5Pの
グルコース／ｐ−ニトロフェノールの比は3.6であっ
た。

上で得た結果と、BrG5Pがグルコアミラーゼの作用を受
けないことから、BrG5Pの構造は、次のものであると考
えられる。

参考例１．α−アミラーゼ活性の測定 〔測定試液〕 実施例６で得たBG5P３０mgをグルコアミラーゼ４００単
位、α−グルコシダーゼ３００単位及び２０ｍmol／
塩化カルシウムを含む５０ｍmol／２−（Ｎ−モルホ
リノ）エタンスルホン酸(MES)-NaOH緩衝液（pH6.9）３
０ｍに溶解し、測定試液とした。

〔測定操作〕

測定試液２ｍに検体血清１００μを加え、３７℃に
加温し、この反応液の波長４０５nmに於ける吸光度変化
を測定した。

別に、α−アミラーゼ活性既知の標準検体を用い、上記
と同様に操作し、検量関係を求め、この検量線から検体
のα−アミラーゼ活性を求めた。このときの標準検体の
各希釈段階に於けるα−アミラーゼ活性（Somogyi単位
／ｄ）と波長４０５nmに於ける１分間当りの吸光度増
加量（ΔＡ）との関係を第６図に示す。

第６図より明らかな如く、α−アミラーゼ活性（Somogy
i単位／ｄ）に対してプロットした吸光度増加量（Δ
Ａ／min）を結ぶ検量線は原点を通る直線となり、検量
線は良好な定量性を示している。

参考例２．α−アミラーゼ活性の測定 〔測定試液〕 実施例６と同様にして得たBG6P３６mgをグルコアミラー
ゼ４００単位、α−グルコシダーゼ300単位及び２０ｍm
ol／塩化カルシウムを含む５０ｍmol／MES-NaOH緩
衝液（pH6.9）３０ｍに溶解し、測定試液とした。

〔測定操作〕

測定試液２ｍに検体血清１００μを加え、３７℃に
加温し、この反応液の波長４０５nmに於ける吸光度変化
を測定した。

別に、α−アミラーゼ活性既知の標準検体を用い、上記
と同様に操作し、検量関係を求め、この検量線から検体
のα−アミラーゼ活性を求めた。このときの標準検体の
各希釈段階に於けるα−アミラーゼ活性（Somogyi単位
／ｄ）と波長４０５nmに於ける１分間当りの吸光度増
加量（ΔＡ）との関係を第７図に示す。

第７図より明らかな如く、α−アミラーゼ活性（Somogy
i単位／ｄ）に対してプロットした吸光度増加量（Δ
Ａ／min）を結ぶ検量線は原点を通る直線となり、検量
線は良好な定量性を示している。

参考例３．α−アミラーゼ活性の測定 〔測定試液〕 実施例８で得たBrG5P３０mgをグルコアミラーゼ４００
単位、α−グルコシダーゼ３００単位及び２０ｍmol／
塩化カルシウムを含む５０ｍmol／MES-NaOH緩衝液
（pH6.9）３０ｍに溶解し、測定試液とした。

〔測定操作〕

測定試液２ｍに検体血清１００μを加え、３７℃に
加温し、この反応液の波長４０５nmにおける吸光度変化
を測定した。

別に、α−アミラーゼ活性既知の標準検体を用い、上記
と同様に操作し、検量関係を求め、この検量線から検体
のα−アミラーゼ活性を求めた。このときの標準検体の
各希釈段階に於けるα−アミラーゼ活性（Somogyi単位
／ｄ）と波長４０５nmに於ける１分間当りの吸光度増
加量（ΔＡ）との関係を第８図に示す。

第８図より明らかな如く、α−アミラーゼ活性（Somogy
i単位／ｄ）に対してプロットした吸光度増加量（Δ
Ａ）を結ぶ検量線は原点を通る直線となり、検量線は良
好な定量性を示している。

〔発明の効果〕

本発明は、α−アミラーゼ活性測定用基質として、或は
ヒトα−アミラーゼの各アイソザイム活性の分別測定用
基質として有用な非還元末端修飾オリゴサッカライドの
新規で且つ効果的な製造法を提供するものであり、本発
明の方法によれば、 非還元末端修飾オリゴサッカライドが簡単な反応操作
で、収率よく得ることもできるので、これらを基質とし
て用いるα−アミラーゼ活性測定法或は同アイソザイム
の分別測定法の実用化（企業化）に寄与するところ甚だ
大なる点。及び 本発明に係る非還元末端修飾オリゴサッカライド誘導
体は従来のα−アミラーゼ活性測定用基質が有する問題
点を一切有さず、しかも合成が容易で収率よくこれを得
ることができるので、実用化（企業化）が可能な優れた
α−アミラーゼ活性測定法を提供し得るものである点。

に顕著な効果を奏するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は夫々実施例３及び実施例４で得られ
た本発明に係る非還元末端修飾オリゴサッカライド誘導
体のFAB−マススペクトルを示す（装置JeolHX-100）。 第３図は実施例６で得られた本発明に係る非還元末端修
飾オリゴサッカライド誘導体のIRチャートを示す。 第４図及び第５図は、夫々実施例６及び実施例８で得ら
れた本発明に係る非還元末端修飾オリゴサッカライド誘
導体の¹H-NMRチャートを示す。 第６図，第７図及び第８図は、夫々参考例１，参考例２
及び参考例３に於て得られた検量線を示し、横軸の各α
−アミラーゼ活性（Somogyi単位／ｄ）について得ら
れた吸光度増加量（ΔＡ／min）を縦軸に沿ってプロッ
トした点を結んだものである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】１分子当たり１個の修飾グルコース（即
   ち、６位の水酸基が修飾されたグルコース又は６位がカ
   ルボキシル基に置き換ったグルコース）を含む修飾シク
   ロデキストリンに、アクセプターとしてのグルコース、
   マルトース、マルトトリオース若しくはこれらの還元末
   端グルコースの１位の水酸基が置換された誘導体の存在
   下、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラ
   ーゼを作用させ、然る後、グルコアミラーゼ又はα−グ
   ルコシダーゼを作用させることを特徴とする、非還元末
   端グルコースの６位が置換され、且つ還元末端にアクセ
   プターが結合した非還元末端修飾オリゴサッカライド誘
   導体の製造法。
2. 【請求項２】修飾グルコースが、６位の水酸基が２−ピ
   リジルアミノ基、３−ピリジルアミノ基の如く蛍光性を
   有する置換基、アニリノ基，メチルアニリノ基，ヒドロ
   キシアニリノ基，カルボキシフェニルアミノ基の如くＵ
   Ｖ吸収を有する置換基、メトキシ基，エトキシ基等のア
   ルコキシ基、カルボキシメトキシ基，ヒドロキシエトキ
   シ基，ベンジルオキシ基，フェネチルオキシ基，ピリジ
   ルメチルオキシ基等の置換アルコキシ基、塩素，臭素等
   のハロゲン原子、ヒドラゾノ基、フェニルヒドラゾノ基
   又はアミノ基で置換されたグルコース、若しくはグルク
   ロン酸である特許請求の範囲第１項に記載の製造法。