JP2002199898A - 糖加水分解酵素の酵素活性測定法 - Google Patents
糖加水分解酵素の酵素活性測定法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、酸性溶液或いは中性溶液中での生
成物定量が可能な糖加水分解酵素の活性測定用基質と、
該基質を用いた連続測定が可能な糖加水分解酵素活性測
定法を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明は、一般式［１］ 【化１】 （式中、Ｘは糖残基を表し、Ｒは水素原子、アルキル
基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ハロゲン置換アルキ
ル基、アシル基、アシルアミノ基、アミノ基、アミド
基、ホルミル基又はフェニル基を表す。）で示される化
合物からなる、糖加水分解酵素の酵素活性測定用基質、
及び該化合物を基質として含んでなる糖加水分解酵素の
酵素活性測定用試薬、並びに該化合物を基質として用い
ることを特徴とする、糖加水分解酵素の酵素活性測定法
に関する。
成物定量が可能な糖加水分解酵素の活性測定用基質と、
該基質を用いた連続測定が可能な糖加水分解酵素活性測
定法を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明は、一般式［１］ 【化１】 （式中、Ｘは糖残基を表し、Ｒは水素原子、アルキル
基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ハロゲン置換アルキ
ル基、アシル基、アシルアミノ基、アミノ基、アミド
基、ホルミル基又はフェニル基を表す。）で示される化
合物からなる、糖加水分解酵素の酵素活性測定用基質、
及び該化合物を基質として含んでなる糖加水分解酵素の
酵素活性測定用試薬、並びに該化合物を基質として用い
ることを特徴とする、糖加水分解酵素の酵素活性測定法
に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な、糖加水分
解酵素の酵素活性測定用基質と該基質を用いた糖加水分
解酵素の酵素活性測定法に関する。
解酵素の酵素活性測定用基質と該基質を用いた糖加水分
解酵素の酵素活性測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】糖加水分解酵素の阻害剤は、医薬品（例
えば、抗インフルエンザウィルス薬、糖尿病治療薬な
ど）のターゲットとして重要である。この酵素阻害剤の
開発には、糖加水分解酵素活性の測定が必須である。こ
れまで行われている糖加水分解酵素の酵素活性測定法の
代表的なものとしては、ｏ−ニトロフェニルグリコシド
又はｐ−ニトロフェニルグリコシドを基質として用いる
β−グルコシダーゼの酵素活性測定法がある。この方法
は酵素反応を行った後、Ｎａ２ＣＯ３溶液を加えて反応
溶液をアルカリ性とし、加水分解によって生成したｏ−
ニトロフェノール又はｐ−ニトロフェノールをフェノラ
ートに変えて、そのＵＶ吸収を測定することにより定量
する方法であり、それぞれ４２０ｎｍ、４００ｎｍにお
ける吸光度の増加を測定することにより、酵素活性を測
定している。しかしこの方法だと、酵素反応を追跡する
ためには、反応の途中で逐次反応溶液を採取し、その都
度Ｎａ２ＣＯ３溶液を加えて溶液をアルカリ性にし、フ
ェノラートに変えてから吸光度を測定すると言う面倒な
操作が必要であり、連続測定も儘ならなかった。ｏ−ニ
トロフェニルグリコシドやｐ−ニトロフェニルグリコシ
ドを基質として用いる自体公知の糖加水分解酵素の活性
測定法としては、上記以外にもα−アミラーゼ活性測定
法、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性測定法、Ｎ−
アセチルガラクトサミニダーゼ活性測定法等があるが、
何れも上記測定法と同様の問題点が存在し、そのための
種々の対策が検討され、講じられている現状にある。
えば、抗インフルエンザウィルス薬、糖尿病治療薬な
ど）のターゲットとして重要である。この酵素阻害剤の
開発には、糖加水分解酵素活性の測定が必須である。こ
れまで行われている糖加水分解酵素の酵素活性測定法の
代表的なものとしては、ｏ−ニトロフェニルグリコシド
又はｐ−ニトロフェニルグリコシドを基質として用いる
β−グルコシダーゼの酵素活性測定法がある。この方法
は酵素反応を行った後、Ｎａ２ＣＯ３溶液を加えて反応
溶液をアルカリ性とし、加水分解によって生成したｏ−
ニトロフェノール又はｐ−ニトロフェノールをフェノラ
ートに変えて、そのＵＶ吸収を測定することにより定量
する方法であり、それぞれ４２０ｎｍ、４００ｎｍにお
ける吸光度の増加を測定することにより、酵素活性を測
定している。しかしこの方法だと、酵素反応を追跡する
ためには、反応の途中で逐次反応溶液を採取し、その都
度Ｎａ２ＣＯ３溶液を加えて溶液をアルカリ性にし、フ
ェノラートに変えてから吸光度を測定すると言う面倒な
操作が必要であり、連続測定も儘ならなかった。ｏ−ニ
トロフェニルグリコシドやｐ−ニトロフェニルグリコシ
ドを基質として用いる自体公知の糖加水分解酵素の活性
測定法としては、上記以外にもα−アミラーゼ活性測定
法、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性測定法、Ｎ−
アセチルガラクトサミニダーゼ活性測定法等があるが、
何れも上記測定法と同様の問題点が存在し、そのための
種々の対策が検討され、講じられている現状にある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した如
き現状に鑑みなされたもので、酸性溶液或いは中性溶液
中での生成物定量が可能な糖加水分解酵素活性測定用基
質と、該基質を用いた連続測定が可能な糖加水分解酵素
活性測定法を提供することを目的とする。
き現状に鑑みなされたもので、酸性溶液或いは中性溶液
中での生成物定量が可能な糖加水分解酵素活性測定用基
質と、該基質を用いた連続測定が可能な糖加水分解酵素
活性測定法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、一般式［１］
【化４】 （式中、Ｘは糖残基を表し、Ｒは水素原子、アルキル
基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ハロゲン置換アルキ
ル基、アシル基、アシルアミノ基、アミノ基、アミド
基、ホルミル基又はフェニル基を表す。）で示される化
合物からなる、糖加水分解酵素の酵素活性測定用基質、
及び該化合物を基質として含んでなる糖加水分解酵素の
酵素活性測定用試薬、並びに該化合物を基質として用い
ることを特徴とする、糖加水分解酵素の酵素活性測定法
に関する。
基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ハロゲン置換アルキ
ル基、アシル基、アシルアミノ基、アミノ基、アミド
基、ホルミル基又はフェニル基を表す。）で示される化
合物からなる、糖加水分解酵素の酵素活性測定用基質、
及び該化合物を基質として含んでなる糖加水分解酵素の
酵素活性測定用試薬、並びに該化合物を基質として用い
ることを特徴とする、糖加水分解酵素の酵素活性測定法
に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】上記一般式［１］において、Ｒで
示されるアルキル基としては、例えば、炭素数が１〜６
の直鎖状又は分枝状のアルキル基が挙げられ、より具体
的には、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イ
ソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第二級ブチル
基、第三級ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などが挙
げられる。アルコキシ基としては、例えば、炭素数が１
〜６の直鎖状又は分枝状のアルコキシ基が挙げられ、よ
り具体的には、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロ
ポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキ
シ基、第二級ブトキシ基、第三級ブトキシ基、ペンチル
オキシ基、ヘキシルオキシ基などが挙げられる。ハロゲ
ン原子としては、塩素原子、臭素原子、沃素原子、フッ
素原子等が挙げられる。ハロゲン置換アルキル基として
は、上記した如きアルキル基の水素原子の１乃至全てが
上記した如きハロゲン原子で置換されたハロゲン置換ア
ルキル基が挙げられ、より具体的には、例えば、トリク
ロロメチル基、トリブロモメチル基、トリフルオロメチ
ル基、２，２−ジクロロエチル基、２，２−ジフルオロ
エチル基、パーフルオロエチル基、パーフルオロプロピ
ル基等が挙げられる。アシル基としては、例えば、炭素
数が２〜４の直鎖状又は分枝状のアシル基が挙げられ、
より具体的には、例えば、アセチル基、プロピオニル
基、ブチリル基、イソブチリル基等が挙げられる。ま
た、アシルアミノ基としては、アミノ基の水素原子の一
つが上記した如きアシル基で置換されたアシルアミノ基
が挙げられ、より具体的には、アセトアミド基（アセチ
ルアミノ基）、プロピオンアミド基（プロピオニルアミ
ノ基）、ブチリルアミノ基、イソブチリルアミノ基等が
挙げられる。これらＲで示される置換基の置換位置は、
２〜６位の何れの位置でも良く、また、置換基の数も１
〜３個の何れでも良い。
示されるアルキル基としては、例えば、炭素数が１〜６
の直鎖状又は分枝状のアルキル基が挙げられ、より具体
的には、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イ
ソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第二級ブチル
基、第三級ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などが挙
げられる。アルコキシ基としては、例えば、炭素数が１
〜６の直鎖状又は分枝状のアルコキシ基が挙げられ、よ
り具体的には、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロ
ポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキ
シ基、第二級ブトキシ基、第三級ブトキシ基、ペンチル
オキシ基、ヘキシルオキシ基などが挙げられる。ハロゲ
ン原子としては、塩素原子、臭素原子、沃素原子、フッ
素原子等が挙げられる。ハロゲン置換アルキル基として
は、上記した如きアルキル基の水素原子の１乃至全てが
上記した如きハロゲン原子で置換されたハロゲン置換ア
ルキル基が挙げられ、より具体的には、例えば、トリク
ロロメチル基、トリブロモメチル基、トリフルオロメチ
ル基、２，２−ジクロロエチル基、２，２−ジフルオロ
エチル基、パーフルオロエチル基、パーフルオロプロピ
ル基等が挙げられる。アシル基としては、例えば、炭素
数が２〜４の直鎖状又は分枝状のアシル基が挙げられ、
より具体的には、例えば、アセチル基、プロピオニル
基、ブチリル基、イソブチリル基等が挙げられる。ま
た、アシルアミノ基としては、アミノ基の水素原子の一
つが上記した如きアシル基で置換されたアシルアミノ基
が挙げられ、より具体的には、アセトアミド基（アセチ
ルアミノ基）、プロピオンアミド基（プロピオニルアミ
ノ基）、ブチリルアミノ基、イソブチリルアミノ基等が
挙げられる。これらＲで示される置換基の置換位置は、
２〜６位の何れの位置でも良く、また、置換基の数も１
〜３個の何れでも良い。
【０００６】上記一般式［１］において、Ｘで示される
糖残基としては、糖の残基であれば何れでも良いが、特
に、単糖、糖誘導体、二〜七糖からなるオリゴ糖又はオ
リゴ糖誘導体等からグリコシド性ヒドロキシ基を取り去
ってできる、所謂グリコシル基が好ましい。なお、上記
オリゴ糖又はオリゴ糖誘導体は、α結合で繋がっている
ものでもβ結合で繋がっているものでも、α結合とβ結
合が混在しているものでも、何れのものでも良い。糖残
基の好ましい例としては、先ず、例えば、グルコース、
ガラクトース、マンノース、フルクトース、フコース、
アラビノース等の単糖の残基が挙げられる。また、例え
ば、グルクロン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−ア
セチルガラクトサミン、シアル酸等の糖誘導体の残基も
同様に好ましい例として挙げることができる。更に、例
えば、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオ
ース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マル
トヘプタオース、ラクトース、ゲンチオビオース、キシ
ロビオース、プリメベロース、メリビオース、ルチノー
ス、ビシアノース、ラミナリビオース、セロビオース、
セロトリオース、パノース等の二〜七糖からなるオリゴ
糖の残基も同様に好ましい例として挙げることができ
る。なお、糖加水分解酵素がグルコアミラーゼ或いはα
−アミラーゼの場合には、上記糖残基の内の、マルトー
ス、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペ
ンタオース、マルトヘキサオース又はマルトヘプタオー
スが好ましい。更にまた、非還元末端グルコース残基の
２，３，４，６位の水酸基の内の少なくとも一つが修飾
された二〜七糖からなるオリゴ糖誘導体も同様に糖残基
の好ましい例として挙げることができる。そのようなオ
リゴ糖誘導体の修飾基としては、例えば、アセチル基、
マロニル基、リン酸基、メチル基等がより一般的なもの
として挙げられるが、勿論これらに限定されるものでは
ない。なお、糖加水分解酵素がα−アミラーゼの場合に
は、非還元末端グルコース残基の６位、又は４位と６位
が修飾された三〜七糖からなるオリゴ糖誘導体が特に好
ましい。ここで、非還元末端グルコース残基の６位、又
は４位と６位の修飾基としては、例えば、カルボキシメ
チル基、２−ピリジルアミノ基、ベンジル基、ベンジリ
デン基、エチリデン基、イソプロピリデン基等が挙げら
れる。一般式［１］において、Ｘ−Ｏ−基の置換位置
は、２位、３位、４位の何れでもよく、また、ニトロ基
の置換位置も２位、３位、４位の何れでもよい。
糖残基としては、糖の残基であれば何れでも良いが、特
に、単糖、糖誘導体、二〜七糖からなるオリゴ糖又はオ
リゴ糖誘導体等からグリコシド性ヒドロキシ基を取り去
ってできる、所謂グリコシル基が好ましい。なお、上記
オリゴ糖又はオリゴ糖誘導体は、α結合で繋がっている
ものでもβ結合で繋がっているものでも、α結合とβ結
合が混在しているものでも、何れのものでも良い。糖残
基の好ましい例としては、先ず、例えば、グルコース、
ガラクトース、マンノース、フルクトース、フコース、
アラビノース等の単糖の残基が挙げられる。また、例え
ば、グルクロン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−ア
セチルガラクトサミン、シアル酸等の糖誘導体の残基も
同様に好ましい例として挙げることができる。更に、例
えば、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオ
ース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マル
トヘプタオース、ラクトース、ゲンチオビオース、キシ
ロビオース、プリメベロース、メリビオース、ルチノー
ス、ビシアノース、ラミナリビオース、セロビオース、
セロトリオース、パノース等の二〜七糖からなるオリゴ
糖の残基も同様に好ましい例として挙げることができ
る。なお、糖加水分解酵素がグルコアミラーゼ或いはα
−アミラーゼの場合には、上記糖残基の内の、マルトー
ス、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペ
ンタオース、マルトヘキサオース又はマルトヘプタオー
スが好ましい。更にまた、非還元末端グルコース残基の
２，３，４，６位の水酸基の内の少なくとも一つが修飾
された二〜七糖からなるオリゴ糖誘導体も同様に糖残基
の好ましい例として挙げることができる。そのようなオ
リゴ糖誘導体の修飾基としては、例えば、アセチル基、
マロニル基、リン酸基、メチル基等がより一般的なもの
として挙げられるが、勿論これらに限定されるものでは
ない。なお、糖加水分解酵素がα−アミラーゼの場合に
は、非還元末端グルコース残基の６位、又は４位と６位
が修飾された三〜七糖からなるオリゴ糖誘導体が特に好
ましい。ここで、非還元末端グルコース残基の６位、又
は４位と６位の修飾基としては、例えば、カルボキシメ
チル基、２−ピリジルアミノ基、ベンジル基、ベンジリ
デン基、エチリデン基、イソプロピリデン基等が挙げら
れる。一般式［１］において、Ｘ−Ｏ−基の置換位置
は、２位、３位、４位の何れでもよく、また、ニトロ基
の置換位置も２位、３位、４位の何れでもよい。
【０００７】一般式［１］で示される化合物を基質とし
て用いることにより測定可能な糖加水分解酵素の代表的
なものとしては、グリコシダーゼが挙げられる。グリコ
シダーゼの具体例としては、例えば、グルコース、ガラ
クトース、マンノース、フルクトース、フコース、アラ
ビノース等の単糖の加水分解酵素である、α−(β−)グ
ルコシダーゼ、α−(β−)ガラクトシダーゼ、α−(β
−)マンノシダーゼ、β−フルクトシダーゼ、α−Ｌ−
フコシダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ等が挙
げられる。また、例えば、グルクロン酸、Ｎ−アセチル
グルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸
等の糖誘導体の加水分解酵素である、β−グルクロニダ
ーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチル
ガラクトサミニダーゼ、シアリダーゼ等も挙げることが
できる。更に、例えば、マルトース、マルトトリオー
ス、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルト
ヘキサオース、マルトヘプタオース等のオリゴ糖の加水
分解酵素である、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ等
も挙げられる。なお、一般式［１］で示される化合物を
基質として用いることにより測定可能な糖加水分解酵素
は、上記した酵素に限定されるものではなく、上記一般
式［１］において、Ｘで示される糖残基に対応した種々
のグリコシダーゼがそれぞれ測定可能な糖加水分解酵素
として挙げられることは言うまでもない。
て用いることにより測定可能な糖加水分解酵素の代表的
なものとしては、グリコシダーゼが挙げられる。グリコ
シダーゼの具体例としては、例えば、グルコース、ガラ
クトース、マンノース、フルクトース、フコース、アラ
ビノース等の単糖の加水分解酵素である、α−(β−)グ
ルコシダーゼ、α−(β−)ガラクトシダーゼ、α−(β
−)マンノシダーゼ、β−フルクトシダーゼ、α−Ｌ−
フコシダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ等が挙
げられる。また、例えば、グルクロン酸、Ｎ−アセチル
グルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸
等の糖誘導体の加水分解酵素である、β−グルクロニダ
ーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチル
ガラクトサミニダーゼ、シアリダーゼ等も挙げることが
できる。更に、例えば、マルトース、マルトトリオー
ス、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルト
ヘキサオース、マルトヘプタオース等のオリゴ糖の加水
分解酵素である、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ等
も挙げられる。なお、一般式［１］で示される化合物を
基質として用いることにより測定可能な糖加水分解酵素
は、上記した酵素に限定されるものではなく、上記一般
式［１］において、Ｘで示される糖残基に対応した種々
のグリコシダーゼがそれぞれ測定可能な糖加水分解酵素
として挙げられることは言うまでもない。
【０００８】一般式［１］で示される化合物の具体例と
しては、それぞれの糖加水分解酵素に対応して種々のニ
トロピリジルグリコシド類が挙げられるが、代表的なも
のとしては、例えば、３−ニトロ−２−ピリジル β−
Ｄ−グルコピラノシド、２−ニトロ−３−ピリジル β
−Ｄ−グルコピラノシド、４−ニトロ−２−ピリジルβ
−Ｄ−グルコピラノシド、３−ニトロ−２−ピリジル
β−Ｄ−ガラクトピラノシド、３−ニトロ−２−ピリジ
ル β−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−ニトロ−２−ピ
リジル β−Ｄ−ガラクトピラノシド等々が挙げられ
る。
しては、それぞれの糖加水分解酵素に対応して種々のニ
トロピリジルグリコシド類が挙げられるが、代表的なも
のとしては、例えば、３−ニトロ−２−ピリジル β−
Ｄ−グルコピラノシド、２−ニトロ−３−ピリジル β
−Ｄ−グルコピラノシド、４−ニトロ−２−ピリジルβ
−Ｄ−グルコピラノシド、３−ニトロ−２−ピリジル
β−Ｄ−ガラクトピラノシド、３−ニトロ−２−ピリジ
ル β−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−ニトロ−２−ピ
リジル β−Ｄ−ガラクトピラノシド等々が挙げられ
る。
【０００９】本発明の酵素活性測定法は、グリコシダー
ゼの酵素活性を、基質として本発明に係る基質、即ちニ
トロピリジルグリコシドを用いて測定する点に特徴を有
するものであるが、測定法自体は、自体公知のレイトア
ッセイ、エンドポイントアッセイ等の酵素活性測定法の
操作法に準じてこれを行うことで足りる。何れの測定法
で測定を行っても良いが、本発明に係る基質は、特にレ
イトアッセイ用基質として使用可能な点が従来のグリコ
シダーゼ活性測定用の基質と異なる点であり、また大き
な特徴でもあるので、レイトアッセイで行うのがより好
ましい。
ゼの酵素活性を、基質として本発明に係る基質、即ちニ
トロピリジルグリコシドを用いて測定する点に特徴を有
するものであるが、測定法自体は、自体公知のレイトア
ッセイ、エンドポイントアッセイ等の酵素活性測定法の
操作法に準じてこれを行うことで足りる。何れの測定法
で測定を行っても良いが、本発明に係る基質は、特にレ
イトアッセイ用基質として使用可能な点が従来のグリコ
シダーゼ活性測定用の基質と異なる点であり、また大き
な特徴でもあるので、レイトアッセイで行うのがより好
ましい。
【００１０】レイトアッセイ法の概略は、あらためて記
載するほどのことではないが、例えば、酢酸緩衝液、リ
ン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等の適当な緩衝液で希釈し
た酵素サンプル溶液に、同じ緩衝液に溶解した本発明に
係るニトロピリジルグリコシド、例えば３−ニトロ−２
−ピリジル−β−Ｄ−グルコピラノシドを混合して反応
させ、単位時間当たりの加水分解生成物、例えば２−ヒ
ドロキシ−３−ニトロピリジンの生成量をその吸光度、
例えば３９０ｎｍの吸光度を測定することにより求め、
予め濃度（酵素活性値）既知の試料を用いて作成した検
量線に当てはめることによりサンプル中のグリコシダー
ゼの酵素活性を容易に測定することができる。
載するほどのことではないが、例えば、酢酸緩衝液、リ
ン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等の適当な緩衝液で希釈し
た酵素サンプル溶液に、同じ緩衝液に溶解した本発明に
係るニトロピリジルグリコシド、例えば３−ニトロ−２
−ピリジル−β−Ｄ−グルコピラノシドを混合して反応
させ、単位時間当たりの加水分解生成物、例えば２−ヒ
ドロキシ−３−ニトロピリジンの生成量をその吸光度、
例えば３９０ｎｍの吸光度を測定することにより求め、
予め濃度（酵素活性値）既知の試料を用いて作成した検
量線に当てはめることによりサンプル中のグリコシダー
ゼの酵素活性を容易に測定することができる。
【００１１】本発明に係る基質であるニトロピリジルグ
リコシドは、例えばＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔ．４０（１９９９）６５８８等に記載の方法に準じて
容易に合成することができるので、そのようにして合成
したものを用いることで足りる（より具体的には、下記
実施例の項の合成例１及び２参照。）。
リコシドは、例えばＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔ．４０（１９９９）６５８８等に記載の方法に準じて
容易に合成することができるので、そのようにして合成
したものを用いることで足りる（より具体的には、下記
実施例の項の合成例１及び２参照。）。
【００１２】
【実施例】次に、合成例、実施例により本発明をより詳
細に説明するが、本発明はこれら合成例、実施例により
何ら限定されるものではない。
細に説明するが、本発明はこれら合成例、実施例により
何ら限定されるものではない。
【００１３】合成例１ ３−ニトロ−２−ピリジル β
−Ｄ−グルコピラノシド （化合物Ａ）の合成 （１）銀 ３−ニトロ−２−ピリドキシド（化合物１）
の合成 水酸化ナトリウム（０．７０１ｇ，１７．５ｍｍｏｌ）
を水（５００ｍＬ）に溶解させた後、この溶液に ２−
ヒドロキシ−３−ニトロピリジン（２．４８ｇ，１７．
７ｍｍｏｌ）を加えた。これに硝酸銀（２．９９ｇ，１
７．６ｍｍｏｌ）を水（１００ｍＬ）に溶解させて加え
た。室温で１０分間激しく撹拌した後、ろ過して得た固
体をメタノール、エーテルで洗浄して乾燥し、黄色固体
の化合物１を得た。収量：３．９８ｇ（収率：９２．０
％）。
−Ｄ−グルコピラノシド （化合物Ａ）の合成 （１）銀 ３−ニトロ−２−ピリドキシド（化合物１）
の合成 水酸化ナトリウム（０．７０１ｇ，１７．５ｍｍｏｌ）
を水（５００ｍＬ）に溶解させた後、この溶液に ２−
ヒドロキシ−３−ニトロピリジン（２．４８ｇ，１７．
７ｍｍｏｌ）を加えた。これに硝酸銀（２．９９ｇ，１
７．６ｍｍｏｌ）を水（１００ｍＬ）に溶解させて加え
た。室温で１０分間激しく撹拌した後、ろ過して得た固
体をメタノール、エーテルで洗浄して乾燥し、黄色固体
の化合物１を得た。収量：３．９８ｇ（収率：９２．０
％）。
【００１４】（２）３−ニトロ−２−ピリジル −２，
３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコピラノシ
ド（化合物２）の合成 グルコースペンタアセテート（１．８６ｇ，４．７７ｍ
ｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解させ
た後、０℃で撹拌しながら２５％臭化水素−酢酸（４．
５ｍＬ）を滴下した。３０分後に室温に戻した後にさら
に３時間撹拌を続けた。溶液を減圧濃縮して得られた残
査と化合物１（１．３１ｇ，５．２４ｍｍｏｌ）を無水
アセトニトリル（２００ｍＬ）に溶解させて室温で１２
時間激しく撹拌した。セライトを用いて不溶物をろ過し
て除き、ろ液を減圧濃縮して得られた残査を中圧カラム
クロマトグラフィー（トルエン：アセトン＝７：１）で
精製した後、酢酸エチルから結晶化して化合物２を得
た。収量：１．１９ｇ（収率：５３％）。 [α]２５ Ｄ ：+90.7 (c 1.0, CHCl３)。１ H NMR (600MHz, CDCl３) δ= 8.40(1H, dd, J=2.9,
8.0Hz, H-3: 3NO2Pyr), 8.28(1H, dd, J=2.9, 1
3.1Hz, H-4: 3NO2Pyr), 7.19(1H, dd, J=8.1, 13.
1Hz, H-6: 3NO2Pyr), 6.21(1H, d, J=13.1 Hz, H-1:
Glc), 5.42-5.33(2H, m, H-6: Glc), 5.25 (1H,
t, J=16.4Hz, H-2: Glc), 4.30(1H, dd, J=7.3, 1
0.9Hz, H-4: Glc), 4.16(1H, dd, J=4.1, 16.6Hz, H-3:
Glc), 3.99-3.9 7(1H, m,H-5: Glc), 2.11-2.03
(12H, m, Ac)。 FAB-MS (positive, matrix: NBA) m/z 471.1 [(M+
H)＋]。 元素分析（C１９H２２N２O１２として）： 計算値： C, 48.51; H, 4.71 ; N, 5.96%。 実測値： C, 48.31; H，4.681; N, 5.88%。
３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコピラノシ
ド（化合物２）の合成 グルコースペンタアセテート（１．８６ｇ，４．７７ｍ
ｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解させ
た後、０℃で撹拌しながら２５％臭化水素−酢酸（４．
５ｍＬ）を滴下した。３０分後に室温に戻した後にさら
に３時間撹拌を続けた。溶液を減圧濃縮して得られた残
査と化合物１（１．３１ｇ，５．２４ｍｍｏｌ）を無水
アセトニトリル（２００ｍＬ）に溶解させて室温で１２
時間激しく撹拌した。セライトを用いて不溶物をろ過し
て除き、ろ液を減圧濃縮して得られた残査を中圧カラム
クロマトグラフィー（トルエン：アセトン＝７：１）で
精製した後、酢酸エチルから結晶化して化合物２を得
た。収量：１．１９ｇ（収率：５３％）。 [α]２５ Ｄ ：+90.7 (c 1.0, CHCl３)。１ H NMR (600MHz, CDCl３) δ= 8.40(1H, dd, J=2.9,
8.0Hz, H-3: 3NO2Pyr), 8.28(1H, dd, J=2.9, 1
3.1Hz, H-4: 3NO2Pyr), 7.19(1H, dd, J=8.1, 13.
1Hz, H-6: 3NO2Pyr), 6.21(1H, d, J=13.1 Hz, H-1:
Glc), 5.42-5.33(2H, m, H-6: Glc), 5.25 (1H,
t, J=16.4Hz, H-2: Glc), 4.30(1H, dd, J=7.3, 1
0.9Hz, H-4: Glc), 4.16(1H, dd, J=4.1, 16.6Hz, H-3:
Glc), 3.99-3.9 7(1H, m,H-5: Glc), 2.11-2.03
(12H, m, Ac)。 FAB-MS (positive, matrix: NBA) m/z 471.1 [(M+
H)＋]。 元素分析（C１９H２２N２O１２として）： 計算値： C, 48.51; H, 4.71 ; N, 5.96%。 実測値： C, 48.31; H，4.681; N, 5.88%。
【００１５】（３）３−ニトロ−２−ピリジル β−Ｄ
−グルコピラノシド （化合物Ａ）の合成 化合物２（２．４０ｇ，５．１０ｍｍｏｌ）を窒素雰囲
気下、メタノール（３００ｍＬ）に溶解させた。これに
２８％ナトリウムメトキシド（１００μＬ）を加えて室
温で１２時間反応させた後、ドライアイスを加えて反応
を停止させた。溶液を減圧濃縮して得られた残査をＨＰ
２０（２５ｇ，２．３×１７ｃｍ）（水→水：メタノー
ル＝１：１）により精製して化合物Ａを得た。収量：
１．５２ｇ（収率：９８．６％）。 [α]２５ Ｄ ：-35.2 (c 1.0, H２O) 。１ H NMR (600MHz, CD３OD) δ=8.43(1H, dd, J=3.0, 7.
9, H-6: 3NO2Pyr), 8.3 5(1H, dd, J=2.7, 12.9H
z, H-4: 3NO2Pyr), 7.23(1H, dd, J=7.9, 13.1H
z, H-3: 3NO2Pyr), 6.12(1H, d, J=13.4 Hz, H-1: Gl
c), 3.81(1H, t,J =20.1Hz, H-5: Glc), 3.68 (1
H, dd, J = 8.0 Hz, H-4: Glc), 3.61-3.4 1 (2
H, m), 3.39-3.27 (2H, m, H-6: Glc)。 FAB-MS(positive, matrix: Gro) m/z 303.1 [(M+
H)＋]。 元素分析（C１１H１４N２O８として）： 計算値： C, 43.71; H, 4.67; N, 9.27%。 実測値： C, 43.61; H, 4.51; N, 9.33%。
−グルコピラノシド （化合物Ａ）の合成 化合物２（２．４０ｇ，５．１０ｍｍｏｌ）を窒素雰囲
気下、メタノール（３００ｍＬ）に溶解させた。これに
２８％ナトリウムメトキシド（１００μＬ）を加えて室
温で１２時間反応させた後、ドライアイスを加えて反応
を停止させた。溶液を減圧濃縮して得られた残査をＨＰ
２０（２５ｇ，２．３×１７ｃｍ）（水→水：メタノー
ル＝１：１）により精製して化合物Ａを得た。収量：
１．５２ｇ（収率：９８．６％）。 [α]２５ Ｄ ：-35.2 (c 1.0, H２O) 。１ H NMR (600MHz, CD３OD) δ=8.43(1H, dd, J=3.0, 7.
9, H-6: 3NO2Pyr), 8.3 5(1H, dd, J=2.7, 12.9H
z, H-4: 3NO2Pyr), 7.23(1H, dd, J=7.9, 13.1H
z, H-3: 3NO2Pyr), 6.12(1H, d, J=13.4 Hz, H-1: Gl
c), 3.81(1H, t,J =20.1Hz, H-5: Glc), 3.68 (1
H, dd, J = 8.0 Hz, H-4: Glc), 3.61-3.4 1 (2
H, m), 3.39-3.27 (2H, m, H-6: Glc)。 FAB-MS(positive, matrix: Gro) m/z 303.1 [(M+
H)＋]。 元素分析（C１１H１４N２O８として）： 計算値： C, 43.71; H, 4.67; N, 9.27%。 実測値： C, 43.61; H, 4.51; N, 9.33%。
【００１６】合成例２ ３−ニトロ−２−ピリジル β
−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物Ｂ）の合成 （１）３−ニトロ−２−ピリジル−２，３，４，６−テ
トラアセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物
３）の合成 ガラクトースペンタアセテート（１．８６ｇ，４．７７
ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解
させた後、０℃で撹拌しながら２５％臭化水素−酢酸
（４．５ｍＬ）を滴下した。３０分後に室温に戻した後
に、さらに１３時間撹拌を続けた。溶液を減圧濃縮して
得られた残査と実施例１の（１）で得られた化合物１
（１．３１ｇ，５．２４ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリ
ル（２００ｍＬ）に溶解させて室温で１５時間激しく撹
拌した。セライトを用いて不溶物をろ過して除き、ろ液
を減圧濃縮して得られた残査を中圧カラムクロマトグラ
フィー（トルエン：アセトン＝７：１）で精製して化合
物３を得た。収量：１．０８ｇ（収率：４８％）。 [α]２５ Ｄ ：-19.8 (c 1.0, CHCl３)。１ H NMR (400MHz, CDCl３) δ= 8.41(1H, d, J=5.6Hz,
H-6: 3NO2Pyr), 8.28(1 H, d, J=8.28, H-4: 3NO
2Pyr), 7.16(1H, d, J=9.2Hz, H-3: 3NO2Pyr),
6.52(1H, d, J=7.6 Hz, H-1: Gal), 5.45(1H, dd, J=3.
2 Hz, H-4: Gal), 4.96(1H, dd, J=10.3, 3.6Hz,
H-3: Gal), 4.78(1H, d, J=3.2Hz, H-4: Gal),
3.97(2H, m, H-6: Gal), 3.48(1H, m, H-5: Gal), 1.9
6-2.11(12H, m, Ac)。 FAB-MS (positeive, matrix: NBA) m/z 471.1 [(M+
H)]。 元素分析（ C１９H２２N２O１２として）： 計算値： C, 48.51; H, 4.71; N, 5.96%。 実測値： C, 48.43; H, 4.59; N, 5.99%。
−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物Ｂ）の合成 （１）３−ニトロ−２−ピリジル−２，３，４，６−テ
トラアセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物
３）の合成 ガラクトースペンタアセテート（１．８６ｇ，４．７７
ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解
させた後、０℃で撹拌しながら２５％臭化水素−酢酸
（４．５ｍＬ）を滴下した。３０分後に室温に戻した後
に、さらに１３時間撹拌を続けた。溶液を減圧濃縮して
得られた残査と実施例１の（１）で得られた化合物１
（１．３１ｇ，５．２４ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリ
ル（２００ｍＬ）に溶解させて室温で１５時間激しく撹
拌した。セライトを用いて不溶物をろ過して除き、ろ液
を減圧濃縮して得られた残査を中圧カラムクロマトグラ
フィー（トルエン：アセトン＝７：１）で精製して化合
物３を得た。収量：１．０８ｇ（収率：４８％）。 [α]２５ Ｄ ：-19.8 (c 1.0, CHCl３)。１ H NMR (400MHz, CDCl３) δ= 8.41(1H, d, J=5.6Hz,
H-6: 3NO2Pyr), 8.28(1 H, d, J=8.28, H-4: 3NO
2Pyr), 7.16(1H, d, J=9.2Hz, H-3: 3NO2Pyr),
6.52(1H, d, J=7.6 Hz, H-1: Gal), 5.45(1H, dd, J=3.
2 Hz, H-4: Gal), 4.96(1H, dd, J=10.3, 3.6Hz,
H-3: Gal), 4.78(1H, d, J=3.2Hz, H-4: Gal),
3.97(2H, m, H-6: Gal), 3.48(1H, m, H-5: Gal), 1.9
6-2.11(12H, m, Ac)。 FAB-MS (positeive, matrix: NBA) m/z 471.1 [(M+
H)]。 元素分析（ C１９H２２N２O１２として）： 計算値： C, 48.51; H, 4.71; N, 5.96%。 実測値： C, 48.43; H, 4.59; N, 5.99%。
【００１７】（２）３−ニトロ−２−ピリジル β−Ｄ
−ガラクトピラノシド（化合物Ｂ）の合成 化合物３（１．５３ｇ，３．２５ｍｍｏｌ）を窒素雰囲
気下、メタノール（１５０ｍＬ）に溶解させた。これに
２８％ナトリウムメトキシド（５０μＬ）を加えて室温
で１２時間反応させた後にドライアイスを加えて反応を
停止した。溶液を減圧濃縮して得られた残査をＨＰ２０
（２５ｇ，２．３×１７ｃｍ）（水→水：メタノール＝
１：１）により精製して化合物Ｂを得た。収量：６５０
ｍｇ（収率：６６．２％）． [α]２５ Ｄ ：-10.2 (c 1.0, H2O)１ H NMR (600MHz, CD３OD) δ= 8.42(1H, dd, J=2.8,
8.0Hz, H-6: 3NO2Pyr), 8.34(1H, dd, J=3.0, 1
3.1Hz, H-4: 3NO2Pyr), 7.23(1H, dd, J=8.3,13.
1 Hz, H-3: 3NO2Pyr), 6.09(1H, d, 13.4Hz, H-1: Gl
c), 3.91-3.87(2H, m), 3.72-3.60(2H, m), 3.30
-3.29(2H, m)。 FAB-MS(positive, matrix: NBA) m/z 303.0 [(M+
H)＋]。 元素分析（ C１１H１４N２O８として）： 計算値： C, 43.71; H 4.67; N, 9.27%。 実測値： C, 43.75; H, 4.61; N, 9.23%。
−ガラクトピラノシド（化合物Ｂ）の合成 化合物３（１．５３ｇ，３．２５ｍｍｏｌ）を窒素雰囲
気下、メタノール（１５０ｍＬ）に溶解させた。これに
２８％ナトリウムメトキシド（５０μＬ）を加えて室温
で１２時間反応させた後にドライアイスを加えて反応を
停止した。溶液を減圧濃縮して得られた残査をＨＰ２０
（２５ｇ，２．３×１７ｃｍ）（水→水：メタノール＝
１：１）により精製して化合物Ｂを得た。収量：６５０
ｍｇ（収率：６６．２％）． [α]２５ Ｄ ：-10.2 (c 1.0, H2O)１ H NMR (600MHz, CD３OD) δ= 8.42(1H, dd, J=2.8,
8.0Hz, H-6: 3NO2Pyr), 8.34(1H, dd, J=3.0, 1
3.1Hz, H-4: 3NO2Pyr), 7.23(1H, dd, J=8.3,13.
1 Hz, H-3: 3NO2Pyr), 6.09(1H, d, 13.4Hz, H-1: Gl
c), 3.91-3.87(2H, m), 3.72-3.60(2H, m), 3.30
-3.29(2H, m)。 FAB-MS(positive, matrix: NBA) m/z 303.0 [(M+
H)＋]。 元素分析（ C１１H１４N２O８として）： 計算値： C, 43.71; H 4.67; N, 9.27%。 実測値： C, 43.75; H, 4.61; N, 9.23%。
【００１８】実施例１ ニトロピリジルグリコシドの物
理化学的性質 一般式［１］で示される化合物の代表例として、３−ニ
トロ−２−ピリジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以
下、３ＮＰｙ−Ｇｌｃと略す。）及び３−ニトロ−２−
ピリジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下、３ＮＰ
ｙ−Ｇａｌと略す。）を取り上げ、その物理化学的性質
について調べた。結果を以下に示す。
理化学的性質 一般式［１］で示される化合物の代表例として、３−ニ
トロ−２−ピリジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以
下、３ＮＰｙ−Ｇｌｃと略す。）及び３−ニトロ−２−
ピリジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下、３ＮＰ
ｙ−Ｇａｌと略す。）を取り上げ、その物理化学的性質
について調べた。結果を以下に示す。
【００１９】（１）紫外吸収スペクトル ニトロピリジルグリコシド（３ＮＰｙ−Ｇｌｃ，３ＮＰ
ｙ−Ｇａｌ）と、その加水分解生成物である２−ヒドロ
キシ−３−ニトロピリジン（以下、３ＮＰｙ−ＯＨと略
す。）の紫外吸収スペクトルを図１に、また、その吸収
極大とモル吸光係数を表１に示す。
ｙ−Ｇａｌ）と、その加水分解生成物である２−ヒドロ
キシ−３−ニトロピリジン（以下、３ＮＰｙ−ＯＨと略
す。）の紫外吸収スペクトルを図１に、また、その吸収
極大とモル吸光係数を表１に示す。
【００２０】図１において、１は３ＮＰｙ−Ｇｌｃ及び
３ＮＰｙ−ＯＨの吸収スペクトルを、また、２は３ＮＰ
ｙ−Ｇａｌ及び３ＮＰｙ−ＯＨの吸収スペクトルをそれ
ぞれ示している。図１中、Ａ−Ｈ は、ｐＨ３，４，
５，６（２５ｍＭ酢酸緩衝液）、７，８，９（２５ｍＭ
リン酸緩衝液）及び１２（１００ｍＭ炭酸ナトリウム水
溶液）における０．１ｍＭ ３ＮＰｙ−Ｇｌｃの吸収ス
ペクトルを示し、Ｉ−Ｐは、ｐＨ３，４，５，６（２５
ｍＭ酢酸緩衝液）、７，８，９（２５ｍＭリン酸緩衝
液）及び１２（１００ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液）にお
ける０．１ｍＭ ３ＮＰｙ−Ｇａｌの吸収スペクトルを
示す。また、ａ−ｄはｐＨ３，４，５，６（２５ｍＭ酢
酸緩衝液）における、ｅはｐＨ７（２５ｍＭリン酸緩衝
液）における、ｆはｐＨ８（２５ｍＭリン酸緩衝液）に
おける、ｇはｐＨ９（２５ｍＭリン酸緩衝液）におけ
る、ｈはｐＨ１２（１００ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液）
における、０．１ｍＭ ３ＮＰｙ−ＯＨの吸収スペクト
ルをそれぞれ示す。
３ＮＰｙ−ＯＨの吸収スペクトルを、また、２は３ＮＰ
ｙ−Ｇａｌ及び３ＮＰｙ−ＯＨの吸収スペクトルをそれ
ぞれ示している。図１中、Ａ−Ｈ は、ｐＨ３，４，
５，６（２５ｍＭ酢酸緩衝液）、７，８，９（２５ｍＭ
リン酸緩衝液）及び１２（１００ｍＭ炭酸ナトリウム水
溶液）における０．１ｍＭ ３ＮＰｙ−Ｇｌｃの吸収ス
ペクトルを示し、Ｉ−Ｐは、ｐＨ３，４，５，６（２５
ｍＭ酢酸緩衝液）、７，８，９（２５ｍＭリン酸緩衝
液）及び１２（１００ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液）にお
ける０．１ｍＭ ３ＮＰｙ−Ｇａｌの吸収スペクトルを
示す。また、ａ−ｄはｐＨ３，４，５，６（２５ｍＭ酢
酸緩衝液）における、ｅはｐＨ７（２５ｍＭリン酸緩衝
液）における、ｆはｐＨ８（２５ｍＭリン酸緩衝液）に
おける、ｇはｐＨ９（２５ｍＭリン酸緩衝液）におけ
る、ｈはｐＨ１２（１００ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液）
における、０．１ｍＭ ３ＮＰｙ−ＯＨの吸収スペクト
ルをそれぞれ示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】図１及び表１から明らかな如く、３ＮＰｙ
−Ｇｌｃおよび３ＮＰｙ−Ｇａｌは、共に３０３ｎｍ付
近に吸収極大をもち、そのモル吸光係数は約３３００で
あった。一方、３ＮＰｙ−ＯＨの吸収極大はｐＨによっ
て変化し、ｐＨ８以下では３６０ｎｍ付近に吸収極大が
あるが、ｐＨ９以上では３８５ｎｍ以上へとシフトし
た。これは、３ＮＰｙ−ＯＨの酸解離平衡によるもので
ある。但し、そのモル吸光係数については、ｐＨによる
大きな変化は見られなかった。糖加水分解酵素の至適ｐ
Ｈは、通常、弱酸性領域（ｐＨ４−７）にあり、この領
域でアッセイするのが普通であるが、このｐＨ領域での
３ＮＰｙ−ＯＨの吸収極大（３６０ｎｍ）では、基質で
あるグリコシド（３ＮＰｙ−Ｇｌｃ，３ＮＰｙ−Ｇａ
ｌ）の吸収が一部重なる（図 1）。そのため、グリコシ
ドの吸収がほとんどない３９０ｎｍでの吸光度を用いて
３ＮＰｙ−ＯＨの生成を定量するのが適当である。な
お、弱酸性〜中性領域（ｐＨ６，７）において、３９０
ｎｍにおける３ＮＰｙ−ＯＨのモル吸光係数は約３７０
０で、基質であるグリコシド（３ＮＰｙ−Ｇｌｃ，３Ｎ
Ｐｙ−Ｇａｌ）の約１０倍であった。
−Ｇｌｃおよび３ＮＰｙ−Ｇａｌは、共に３０３ｎｍ付
近に吸収極大をもち、そのモル吸光係数は約３３００で
あった。一方、３ＮＰｙ−ＯＨの吸収極大はｐＨによっ
て変化し、ｐＨ８以下では３６０ｎｍ付近に吸収極大が
あるが、ｐＨ９以上では３８５ｎｍ以上へとシフトし
た。これは、３ＮＰｙ−ＯＨの酸解離平衡によるもので
ある。但し、そのモル吸光係数については、ｐＨによる
大きな変化は見られなかった。糖加水分解酵素の至適ｐ
Ｈは、通常、弱酸性領域（ｐＨ４−７）にあり、この領
域でアッセイするのが普通であるが、このｐＨ領域での
３ＮＰｙ−ＯＨの吸収極大（３６０ｎｍ）では、基質で
あるグリコシド（３ＮＰｙ−Ｇｌｃ，３ＮＰｙ−Ｇａ
ｌ）の吸収が一部重なる（図 1）。そのため、グリコシ
ドの吸収がほとんどない３９０ｎｍでの吸光度を用いて
３ＮＰｙ−ＯＨの生成を定量するのが適当である。な
お、弱酸性〜中性領域（ｐＨ６，７）において、３９０
ｎｍにおける３ＮＰｙ−ＯＨのモル吸光係数は約３７０
０で、基質であるグリコシド（３ＮＰｙ−Ｇｌｃ，３Ｎ
Ｐｙ−Ｇａｌ）の約１０倍であった。
【００２３】（２）加水分解に対する安定性 ３ＮＰｙ−Ｇｌｃおよび３ＮＰｙ−Ｇａｌは、酵素が存
在しなくても水溶液中で徐々に加水分解し、対応する糖
と３ＮＰｙ−ＯＨを生じる。その非酵素的なバックグラ
ンドの加水分解速度を種々の条件で測定し、基質の安定
性に及ぼす影響を調べた。
在しなくても水溶液中で徐々に加水分解し、対応する糖
と３ＮＰｙ−ＯＨを生じる。その非酵素的なバックグラ
ンドの加水分解速度を種々の条件で測定し、基質の安定
性に及ぼす影響を調べた。
【００２４】（２−１）ｐＨ依存性 ｐＨ３．０からｐＨ８．０の範囲において、１ｍＭの３
ＮＰｙ−Ｇｌｃおよび３ＮＰｙ−Ｇａｌが３７℃で非酵
素的に加水分解する速度を測定し、その擬１次反応速度
定数ｋ０を 表２にまとめた。
ＮＰｙ−Ｇｌｃおよび３ＮＰｙ−Ｇａｌが３７℃で非酵
素的に加水分解する速度を測定し、その擬１次反応速度
定数ｋ０を 表２にまとめた。
【００２５】
【表２】
【００２６】表２から明らかなように、加水分解の反応
速度はｐＨに大きく依存し、加水分解は酸性側でより顕
著であった。特に、ｐＨ４以下で急激に速度が増大する
ことが判明した。また、すべてのｐＨ領域で３ＮＰｙ−
Ｇａｌの方が３ＮＰｙ−Ｇｌｃよりも不安定で、最大
２．７倍程度加水分解を受けやすいことが判明した。
速度はｐＨに大きく依存し、加水分解は酸性側でより顕
著であった。特に、ｐＨ４以下で急激に速度が増大する
ことが判明した。また、すべてのｐＨ領域で３ＮＰｙ−
Ｇａｌの方が３ＮＰｙ−Ｇｌｃよりも不安定で、最大
２．７倍程度加水分解を受けやすいことが判明した。
【００２７】実際の酵素反応のアッセイ時間は１分程度
であることを考慮すると、各ｐＨにおいて１分間あたり
基質がどのくらい非酵素的に加水分解するかを求めるこ
とは、実際のアッセイにとって便利な目安になる。そこ
で、１ｍＭの基質が、３７℃にて１分間に非酵素的に加
水分解する割合（％）を計算し、それをプロットしたの
が図２である。
であることを考慮すると、各ｐＨにおいて１分間あたり
基質がどのくらい非酵素的に加水分解するかを求めるこ
とは、実際のアッセイにとって便利な目安になる。そこ
で、１ｍＭの基質が、３７℃にて１分間に非酵素的に加
水分解する割合（％）を計算し、それをプロットしたの
が図２である。
【００２８】図２において、−○−は３ＮＰｙ−Ｇｌｃ
の、また、−●−は３ＮＰｙ−Ｇａｌの非酵素的な加水
分解におけるｐＨの影響をそれぞれ示す。非酵素的加水
分解の比率は、１ｍＭ ３ＮＰｙ−Ｇｌｃ又は１ｍＭ ３
ＮＰｙ−Ｇａｌを２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０−
６．０）又は２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５−８．
０）中で３７℃で１分間インキュベートした後に算出し
た。また、３ＮＰｙ−ＯＨの生成量は３９０ｎｍにおけ
る吸光度を基に算出した。
の、また、−●−は３ＮＰｙ−Ｇａｌの非酵素的な加水
分解におけるｐＨの影響をそれぞれ示す。非酵素的加水
分解の比率は、１ｍＭ ３ＮＰｙ−Ｇｌｃ又は１ｍＭ ３
ＮＰｙ−Ｇａｌを２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０−
６．０）又は２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５−８．
０）中で３７℃で１分間インキュベートした後に算出し
た。また、３ＮＰｙ−ＯＨの生成量は３９０ｎｍにおけ
る吸光度を基に算出した。
【００２９】図２から明らかな如く、ｐＨ３．０では、
両基質とも１分間に６％あまりが加水分解したが、ｐＨ
が上がるに従い、非酵素的な加水分解は急激に減少し、
３ＮＰｙ−Ｇｌｃの場合、ｐＨ４．０で１．３％、ｐＨ
４．５で ０．４６％、ｐＨ５．０で ０．１６％、ｐ
Ｈ５．５で０．０５％、ｐＨ６．０で０．０２％、ｐＨ
６．５以上でほぼ一定の０．０１％となった。また、３
ＮＰｙ−Ｇａｌでは、ｐＨ４．０で１．２％、ｐＨ４．
５で ０．９１％、ｐＨ５．０で０．３８％、ｐＨ５．
５で０．１４％、ｐＨ６．０で０．０４％、ｐＨ６．５
以上でほぼ一定の０．０２％となった。これらの結果よ
り、３ＮＰｙ−Ｇｌｃおよび３ＮＰｙ−Ｇａｌともに、
ｐＨ ６．０以上では、実際上、非酵素的な加水分解は
無視できるレベルにまで低下し、このｐＨ以上での酵素
アッセイには何ら問題がないことが示された。一方、す
でにグリコシダーゼのアッセイに汎用されているｐ−ニ
トロフェニルグリコシド（ｐＮＰ−ＧｌｃおよびｐＮＰ
−Ｇａｌ）では、同様の反応条件下（ｐＨ３．０−８．
０）で、加水分解は全く見られなかったことから、３Ｎ
Ｐｙ−Ｇｌｃ及び３ＮＰｙ−Ｇａｌは、対応するｐ−ニ
トロフェニルグリコシドよりも反応性が高いことが判明
した。
両基質とも１分間に６％あまりが加水分解したが、ｐＨ
が上がるに従い、非酵素的な加水分解は急激に減少し、
３ＮＰｙ−Ｇｌｃの場合、ｐＨ４．０で１．３％、ｐＨ
４．５で ０．４６％、ｐＨ５．０で ０．１６％、ｐ
Ｈ５．５で０．０５％、ｐＨ６．０で０．０２％、ｐＨ
６．５以上でほぼ一定の０．０１％となった。また、３
ＮＰｙ−Ｇａｌでは、ｐＨ４．０で１．２％、ｐＨ４．
５で ０．９１％、ｐＨ５．０で０．３８％、ｐＨ５．
５で０．１４％、ｐＨ６．０で０．０４％、ｐＨ６．５
以上でほぼ一定の０．０２％となった。これらの結果よ
り、３ＮＰｙ−Ｇｌｃおよび３ＮＰｙ−Ｇａｌともに、
ｐＨ ６．０以上では、実際上、非酵素的な加水分解は
無視できるレベルにまで低下し、このｐＨ以上での酵素
アッセイには何ら問題がないことが示された。一方、す
でにグリコシダーゼのアッセイに汎用されているｐ−ニ
トロフェニルグリコシド（ｐＮＰ−ＧｌｃおよびｐＮＰ
−Ｇａｌ）では、同様の反応条件下（ｐＨ３．０−８．
０）で、加水分解は全く見られなかったことから、３Ｎ
Ｐｙ−Ｇｌｃ及び３ＮＰｙ−Ｇａｌは、対応するｐ−ニ
トロフェニルグリコシドよりも反応性が高いことが判明
した。
【００３０】（２−２）緩衝液の種類による影響 ｐＨ５．５、３７℃において、グリコシダーゼのアッセ
イによく用いる種々の緩衝液中で、１ｍＭの３ＮＰｙ−
Ｇｌｃ及び３ＮＰｙ−Ｇａｌが非酵素的に加水分解する
速度を測定し、その擬１次反応速度定数ｋ０を 表３に
まとめた。
イによく用いる種々の緩衝液中で、１ｍＭの３ＮＰｙ−
Ｇｌｃ及び３ＮＰｙ−Ｇａｌが非酵素的に加水分解する
速度を測定し、その擬１次反応速度定数ｋ０を 表３に
まとめた。
【００３１】
【表３】
【００３２】表３から明らかな如く、いずれの基質も、
加水分解の反応速度は、緩衝液の成分あるいは濃度にほ
とんど影響されず、グリコシダーゼのアッセイに通常用
いる緩衝液成分の種類、濃度では、基質の非酵素的な加
水分解は全く問題がないことが判った。
加水分解の反応速度は、緩衝液の成分あるいは濃度にほ
とんど影響されず、グリコシダーゼのアッセイに通常用
いる緩衝液成分の種類、濃度では、基質の非酵素的な加
水分解は全く問題がないことが判った。
【００３３】（２−３）温度依存性 ２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中において、１ｍＭ
の３ＮＰｙ−Ｇｌｃおよび３ＮＰｙ−Ｇａｌが自発的に
加水分解する速度を、２５，３０，３７および４５℃に
て測定し、その擬１次反応速度定数ｋ０を 表４にまと
めた。
の３ＮＰｙ−Ｇｌｃおよび３ＮＰｙ−Ｇａｌが自発的に
加水分解する速度を、２５，３０，３７および４５℃に
て測定し、その擬１次反応速度定数ｋ０を 表４にまと
めた。
【００３４】
【表４】
【００３５】また、そのアレニウスプロットを 図３に
示す。図３において、−○−は２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．０）中における３ＮＰｙ−Ｇｌｃの、また、−●
−は同３ＮＰｙ−Ｇａｌのアレニウスプロットをそれぞ
れ示す。 Ｅａ（３ＮＰｙ−Ｇｌｃ）＝１７．１ ｋｃａｌ ｍｏｌ
−１ Ｅａ（３ＮＰｙ−Ｇａｌ）＝１７．０ ｋｃａｌ ｍｏｌ
−１
示す。図３において、−○−は２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．０）中における３ＮＰｙ−Ｇｌｃの、また、−●
−は同３ＮＰｙ−Ｇａｌのアレニウスプロットをそれぞ
れ示す。 Ｅａ（３ＮＰｙ−Ｇｌｃ）＝１７．１ ｋｃａｌ ｍｏｌ
−１ Ｅａ（３ＮＰｙ−Ｇａｌ）＝１７．０ ｋｃａｌ ｍｏｌ
−１
【００３６】加水分解反応の温度依存性は、両基質とも
ほぼ同じで、アレニウスプロットより求めた活性化エネ
ルギーは約１７ｋｃａｌ ｍｏｌ−１であった。実際の
酵素アッセイは３７℃以下で行うことが殆どであるが、
たとえば２５℃では、非酵素的な加水分解を３７℃での
１／３以下に抑えられることが判った。
ほぼ同じで、アレニウスプロットより求めた活性化エネ
ルギーは約１７ｋｃａｌ ｍｏｌ−１であった。実際の
酵素アッセイは３７℃以下で行うことが殆どであるが、
たとえば２５℃では、非酵素的な加水分解を３７℃での
１／３以下に抑えられることが判った。
【００３７】実施例２ ３ＮＰｙ−Ｇｌｃを用いたβ−
グルコシダーゼの連続アッセイ 市販のβ−グルコシダーゼ（Aspergillus niger由来）
を用いて、３ＮＰｙ−Ｇｌｃによる酵素の連続アッセイ
を行った。アッセイ条件を表５に示す。本酵素の至適ｐ
Ｈは５．０付近であるが、基質３ＮＰｙ−Ｇｌｃの安定
性を考慮し、２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用い
た。
グルコシダーゼの連続アッセイ 市販のβ−グルコシダーゼ（Aspergillus niger由来）
を用いて、３ＮＰｙ−Ｇｌｃによる酵素の連続アッセイ
を行った。アッセイ条件を表５に示す。本酵素の至適ｐ
Ｈは５．０付近であるが、基質３ＮＰｙ−Ｇｌｃの安定
性を考慮し、２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用い
た。
【００３８】
【表５】
【００３９】［操作法］市販のβ−グルコシダーゼ
（１．５２Ｕ，２０ｍｇ／ｍＬ）０．０５ｍＬを２５ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．８５ｍＬに加え、２分
間３７℃でインキュベートしたのち、基質３ＮＰｙ−Ｇ
ｌｃの水溶液（１０ｍＭ）０．１ｍＬを加えて反応を開
始した（最終濃度：酵素０．０７６Ｕ，１ｍｇ／ｍＬ，
３ＮＰｙ−Ｇｌｃ１ｍＭ，総容量１ｍＬ）。生成物３Ｎ
Ｐｙ−ＯＨの生成を３９０ｎｍにおける吸光度の変化で
３０秒間にわたり追跡した。生成物の濃度は、３ＮＰｙ
−ＯＨのｐＨ６．０におけるモル吸光係数３７４３μＭ
−１ｃｍ−１を用いて計算した。３ＮＰｙ−Ｇｌｃを基
質としてｐＨ６．０で連続アッセイした結果を図４に示
す。
（１．５２Ｕ，２０ｍｇ／ｍＬ）０．０５ｍＬを２５ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．８５ｍＬに加え、２分
間３７℃でインキュベートしたのち、基質３ＮＰｙ−Ｇ
ｌｃの水溶液（１０ｍＭ）０．１ｍＬを加えて反応を開
始した（最終濃度：酵素０．０７６Ｕ，１ｍｇ／ｍＬ，
３ＮＰｙ−Ｇｌｃ１ｍＭ，総容量１ｍＬ）。生成物３Ｎ
Ｐｙ−ＯＨの生成を３９０ｎｍにおける吸光度の変化で
３０秒間にわたり追跡した。生成物の濃度は、３ＮＰｙ
−ＯＨのｐＨ６．０におけるモル吸光係数３７４３μＭ
−１ｃｍ−１を用いて計算した。３ＮＰｙ−Ｇｌｃを基
質としてｐＨ６．０で連続アッセイした結果を図４に示
す。
【００４０】酵素反応の進行にともなって３９０ｎｍに
おける吸光度は直線的に上昇し、一定時間ごとに反応を
停止させることなく、連続的に生成物の濃度を追跡でき
ることが確かめられた。アッセイ曲線は、反応開始から
３０秒間はもちろんのこと、基質の消費が約１０％に達
するまで直線性を保ち、それぞれの直線の傾きから初速
度ｖｏを求めることができた。
おける吸光度は直線的に上昇し、一定時間ごとに反応を
停止させることなく、連続的に生成物の濃度を追跡でき
ることが確かめられた。アッセイ曲線は、反応開始から
３０秒間はもちろんのこと、基質の消費が約１０％に達
するまで直線性を保ち、それぞれの直線の傾きから初速
度ｖｏを求めることができた。
【００４１】次に、酵素濃度に対して初速度ｖｏが比例
関係にあることを確かめるために、初速度ｖｏを酵素濃
度に対してプロットしたところ、ほぼ原点を通る直線が
得られた（図５）。即ち、初速度ｖｏは酵素量と良好な
比例関係にあり、この基質を用いた連続アッセイで求め
た初速度より、酵素活性を定量できることを確かめた。
また、ほぼ原点を通る直線が得られたことから、このア
ッセイ条件における基質の非酵素的加水分解は無視でき
ることも確かめられた。
関係にあることを確かめるために、初速度ｖｏを酵素濃
度に対してプロットしたところ、ほぼ原点を通る直線が
得られた（図５）。即ち、初速度ｖｏは酵素量と良好な
比例関係にあり、この基質を用いた連続アッセイで求め
た初速度より、酵素活性を定量できることを確かめた。
また、ほぼ原点を通る直線が得られたことから、このア
ッセイ条件における基質の非酵素的加水分解は無視でき
ることも確かめられた。
【００４２】最後に、基質３ＮＰｙ−Ｇｌｃの加水分解
における速度論的パラメーターを求めた。基質である３
ＮＰｙ−Ｇｌｃを、３７℃で２分間プレインキュベート
した２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に最終濃度が
０．５〜３ｍＭとなるように溶解した後、２０ｍｇ／ｍ
Ｌの濃度に調製したβ−グルコシダーゼ（Aspergillusn
iger由来）の酵素液を０．０５ｍＬ添加し反応を開始し
た（総容量１ｍＬ、酵素の最終濃度１ｍｇ／ｍＬ，０．
０７６Ｕ）。反応溶液の入った１ｍＬ用ＵＶセルを３７
℃でインキュベートしながら、３９０ｎｍにおける吸光
度変化を３０秒間にわたって連続的に記録した。最小二
乗法により各基質濃度での３ＮＰｙ−ＯＨの生成速度ｖ
ｏを算出し（３ＮＰｙ−ＯＨ；ε＝３７４３ｃｍ２／ｍ
ｏｌ）、ミカエリス−メンテンの速度式から速度論的パ
ラメーター（ＫｍおよびＶｍａｘ）を求めた（図６）。
その結果、基質のＫｍは４．１２ｍＭ、Ｖｍａｘは３．
４６ｍＭｓｅｃ−１であった。
における速度論的パラメーターを求めた。基質である３
ＮＰｙ−Ｇｌｃを、３７℃で２分間プレインキュベート
した２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に最終濃度が
０．５〜３ｍＭとなるように溶解した後、２０ｍｇ／ｍ
Ｌの濃度に調製したβ−グルコシダーゼ（Aspergillusn
iger由来）の酵素液を０．０５ｍＬ添加し反応を開始し
た（総容量１ｍＬ、酵素の最終濃度１ｍｇ／ｍＬ，０．
０７６Ｕ）。反応溶液の入った１ｍＬ用ＵＶセルを３７
℃でインキュベートしながら、３９０ｎｍにおける吸光
度変化を３０秒間にわたって連続的に記録した。最小二
乗法により各基質濃度での３ＮＰｙ−ＯＨの生成速度ｖ
ｏを算出し（３ＮＰｙ−ＯＨ；ε＝３７４３ｃｍ２／ｍ
ｏｌ）、ミカエリス−メンテンの速度式から速度論的パ
ラメーター（ＫｍおよびＶｍａｘ）を求めた（図６）。
その結果、基質のＫｍは４．１２ｍＭ、Ｖｍａｘは３．
４６ｍＭｓｅｃ−１であった。
【００４３】
【発明の効果】本発明の測定法によれば、従来法では必
要とされていた、反応後にＮａ２ＣＯ ３溶液を加えて反
応溶液をアルカリ性にするという操作が必要とされない
ために、酸性あるいは中性溶液中における経時的な連続
測定が可能となるので、従来法に取って代わり新しい標
準的な方法に成り得るものである。糖加水分解酵素の酵
素活性の測定は、先に述べたように酵素阻害剤の開発に
必須である。例えばグルコシダーゼの阻害剤は糖尿病治
療薬としても注目されており、糖加水分解酵素阻害剤は
医薬品のターゲットとして重要である。本方法は酵素活
性測定のための手間を大きく減少させ、糖加水分解酵素
阻害剤探索のための処理量アップを可能にするものでも
ある。
要とされていた、反応後にＮａ２ＣＯ ３溶液を加えて反
応溶液をアルカリ性にするという操作が必要とされない
ために、酸性あるいは中性溶液中における経時的な連続
測定が可能となるので、従来法に取って代わり新しい標
準的な方法に成り得るものである。糖加水分解酵素の酵
素活性の測定は、先に述べたように酵素阻害剤の開発に
必須である。例えばグルコシダーゼの阻害剤は糖尿病治
療薬としても注目されており、糖加水分解酵素阻害剤は
医薬品のターゲットとして重要である。本方法は酵素活
性測定のための手間を大きく減少させ、糖加水分解酵素
阻害剤探索のための処理量アップを可能にするものでも
ある。
【図１】図１は、３−ニトロ−２−ピリジル−β−Ｄ−
グルコピラノシド（以下、３ＮＰｙ−Ｇｌｃと略す。）
［図１の１］及び３−ニトロ−２−ピリジル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド（以下、３ＮＰｙ−Ｇａｌと略
す。）［図２の２］と、その加水分解生成物である２−
ヒドロキシ−３−ニトロピリジンの紫外吸収スペクトル
を示す。
グルコピラノシド（以下、３ＮＰｙ−Ｇｌｃと略す。）
［図１の１］及び３−ニトロ−２−ピリジル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド（以下、３ＮＰｙ−Ｇａｌと略
す。）［図２の２］と、その加水分解生成物である２−
ヒドロキシ−３−ニトロピリジンの紫外吸収スペクトル
を示す。
【図２】図２は、３ＮＰｙ−Ｇｌｃ（○）及び３ＮＰｙ
−Ｇａｌ（●）の非酵素的加水分解におけるｐＨの影響
を調べたグラフである。
−Ｇａｌ（●）の非酵素的加水分解におけるｐＨの影響
を調べたグラフである。
【図３】図３は、３ＮＰｙ−Ｇｌｃ（○）及び３ＮＰｙ
−Ｇａｌ（●）の非酵素的加水分解のアレニウスプロッ
トを示す。
−Ｇａｌ（●）の非酵素的加水分解のアレニウスプロッ
トを示す。
【図４】図４は、実施例２において、３ＮＰｙ−Ｇｌｃ
を基質としてβ−グルコシダーゼを連続アッセイした結
果を示す。
を基質としてβ−グルコシダーゼを連続アッセイした結
果を示す。
【図５】図５は、実施例２において、３ＮＰｙ−Ｇｌｃ
を基質としてβ−グルコシダーゼを連続アッセイした場
合における酵素反応の初速度ｖｏを酵素濃度に対してプ
ロットしたグラフである。
を基質としてβ−グルコシダーゼを連続アッセイした場
合における酵素反応の初速度ｖｏを酵素濃度に対してプ
ロットしたグラフである。
【図６】図６は、３ＮＰｙ−Ｇｌｃを基質としたβ−グ
ルコシダーゼの連続アッセイにおける反応速度論的分析
結果を示す。
ルコシダーゼの連続アッセイにおける反応速度論的分析
結果を示す。
Claims (14)
- 【請求項１】 一般式［１］ 【化１】 （式中、Ｘは糖残基を表し、Ｒは水素原子、アルキル
基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ハロゲン置換アルキ
ル基、アシル基、アシルアミノ基、アミノ基、アミド
基、ホルミル基又はフェニル基を表す。）で示される化
合物を基質として用いることを特徴とする、糖加水分解
酵素の酵素活性測定法。 - 【請求項２】 糖残基がグリコシル基で、糖加水分解酵
素がグリコシダーゼである、請求項１に記載の酵素活性
測定法。 - 【請求項３】 糖残基がグルコース、ガラクトース、マ
ンノース、フルクトース、フコース又はアラビノースの
残基であり、糖加水分解酵素がα−(β−)グルコシダー
ゼ、α−(β−)ガラクトシダーゼ、α−(β−)マンノシ
ダーゼ、β−フルクトシダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ
又はα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼである、請求項１
に記載の酵素活性測定法。 - 【請求項４】 糖残基がグルクロン酸、Ｎ−アセチルグ
ルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンまたはシアル
酸の残基であり、糖加水分解酵素がβ−グルクロニダー
ゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルガ
ラクトサミニダーゼ又はシアリダーゼである、請求項１
に記載の酵素活性測定法。 - 【請求項５】 糖残基がマルトース、マルトトリオー
ス、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルト
ヘキサオース又はマルトヘプタオースであり、糖加水分
解酵素がグルコアミラーゼ又はα−アミラーゼである請
求項１に記載の酵素活性測定法。 - 【請求項６】 糖残基が、非還元末端グルコース残基の
６位、又は４位と６位が修飾された三〜七糖からなるオ
リゴ糖誘導体であり、糖加水分解酵素がα−アミラーゼ
である請求項１に記載の酵素活性測定法。 - 【請求項７】 一般式［１］ 【化２】 （式中、Ｘは糖残基を表し、Ｒは水素原子、アルキル
基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ハロゲン置換アルキ
ル基、アシル基、アシルアミノ基、アミノ基、アミド
基、ホルミル基又はフェニル基を表す。）で示される化
合物を基質として含んでなる、糖加水分解酵素の酵素活
性測定用試薬。 - 【請求項８】 糖残基がグリコシル基で、糖加水分解酵
素がグリコシダーゼである、請求項７に記載の酵素活性
測定用試薬。 - 【請求項９】 糖残基がグルコース、ガラクトース、マ
ンノース、フルクトース、フコース又はアラビノースの
残基であり、糖加水分解酵素がα−(β−)グルコシダー
ゼ、α−(β−)ガラクトシダーゼ、α−(β−)マンノシ
ダーゼ、β−フルクトシダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ
又はα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼである、請求項７
に記載の酵素活性測定用試薬。 - 【請求項１０】 糖残基がグルクロン酸、Ｎ−アセチル
グルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン又はシアル
酸の残基であり、糖加水分解酵素がβ−グルクロニダー
ゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルガ
ラクトサミニダーゼ又はシアリダーゼである、請求項７
に記載の酵素活性測定用試薬 - 【請求項１１】 糖残基がマルトース、マルトトリオー
ス、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルト
ヘキサオース又はマルトヘプタオースであり、糖加水分
解酵素がグルコアミラーゼ又はα−アミラーゼである請
求項７に記載の酵素活性測定用試薬。 - 【請求項１２】 糖残基が、非還元末端グルコース残基
の６位、又は４位と６位が修飾された三〜七糖からなる
オリゴ糖誘導体であり、糖加水分解酵素がα−アミラー
ゼである請求項７に記載の酵素活性測定用試薬。 - 【請求項１３】 一般式［１］ 【化３】 （式中、Ｘは糖残基を表し、Ｒは水素原子、アルキル
基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ハロゲン置換アルキ
ル基、アシル基、アシルアミノ基、アミノ基、アミド
基、ホルミル基又はフェニル基を表す。）で示される化
合物からなる、糖加水分解酵素の酵素活性測定用基質。 - 【請求項１４】 糖残基がグリコシル基で、糖加水分解
酵素がグリコシダーゼである、請求項１３に記載の酵素
活性測定用基質。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000401665A JP2002199898A (ja) | 2000-12-28 | 2000-12-28 | 糖加水分解酵素の酵素活性測定法 |
| PCT/JP2001/011276 WO2002053766A1 (fr) | 2000-12-28 | 2001-12-21 | Procede permettant de determiner l'activite enzymatique des hydrolases du sucre |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000401665A JP2002199898A (ja) | 2000-12-28 | 2000-12-28 | 糖加水分解酵素の酵素活性測定法 |
Publications (2)
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|---|---|
| JP2002199898A true JP2002199898A (ja) | 2002-07-16 |
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ID=18866065
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000401665A Withdrawn JP2002199898A (ja) | 2000-12-28 | 2000-12-28 | 糖加水分解酵素の酵素活性測定法 |
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|---|---|
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| WO (1) | WO2002053766A1 (ja) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPS60237998A (ja) * | 1983-12-22 | 1985-11-26 | Toyobo Co Ltd | α−アミラ−ゼ活性測定法 |
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