JPH0364111B2 - - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
- C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ペプチドホルモンの一種であるロイ
シンエンケフアリン(Tyr−Gly−Gly−Phe−
Leuの5個のアミノ酸配列よりなるペンタペプタ
イド)を生産可能な新規組換えプラスミドに関す
るものである。本発明の新規組換えプラスミド
pBSFOLEK1は、第1図において示されるDNA
配列を有する。この新規組換えプラスミドの産業
上の利用分野としては、微生物工業、発酵工業、
医薬品工業等の分野に好適である。
シンエンケフアリン(Tyr−Gly−Gly−Phe−
Leuの5個のアミノ酸配列よりなるペンタペプタ
イド)を生産可能な新規組換えプラスミドに関す
るものである。本発明の新規組換えプラスミド
pBSFOLEK1は、第1図において示されるDNA
配列を有する。この新規組換えプラスミドの産業
上の利用分野としては、微生物工業、発酵工業、
医薬品工業等の分野に好適である。
従来の技術
ロイシンエンケフアリンは、モルヒネ様鎮痛作
用を示す内因性ペプチドとして知られ、習慣性の
ない鎮痛剤または麻酔薬としての利用が期待され
る興味深いポリペプチドである。本発明の技術的
背景としては、いわゆる遺伝子操作技術がある。
ロイシンエンケフアリンを組込んだプラスミドと
しては、既に本発明者らが開発したプラスミド
pLEG1(特開昭61−260885号公報)が公知であ
る。pLEG1は、制限酵素EcoRIによる切断によ
つてロイシンエンケフアリンを暗号化する遺伝子
配列を切り出し利用することができるという特徴
を有している。
用を示す内因性ペプチドとして知られ、習慣性の
ない鎮痛剤または麻酔薬としての利用が期待され
る興味深いポリペプチドである。本発明の技術的
背景としては、いわゆる遺伝子操作技術がある。
ロイシンエンケフアリンを組込んだプラスミドと
しては、既に本発明者らが開発したプラスミド
pLEG1(特開昭61−260885号公報)が公知であ
る。pLEG1は、制限酵素EcoRIによる切断によ
つてロイシンエンケフアリンを暗号化する遺伝子
配列を切り出し利用することができるという特徴
を有している。
問題点
しかしながら、pLEG1においてはE.coliのジヒ
ドロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケフアリンの融
合タンパク遺伝子が組込まれており、かつ、プロ
モーター等の遺伝子発現効率としては優れている
にもかかわらず、pLEG1をE.coliに導入し、その
発現を試みたところ、その生産量が予想される量
には到底及ばないことが判明した。さらに、融合
タンパクはジヒドロ葉酸還元酵素の活性が消失し
ていた。このため、E.coliで作られた融合タンパ
クの検出方法としては抗体を用いた免疫化学的手
法が唯一であり、かつ、この方法が繁雑であるこ
とから、分離精製の点に関して改良すべき問題が
ある。
ドロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケフアリンの融
合タンパク遺伝子が組込まれており、かつ、プロ
モーター等の遺伝子発現効率としては優れている
にもかかわらず、pLEG1をE.coliに導入し、その
発現を試みたところ、その生産量が予想される量
には到底及ばないことが判明した。さらに、融合
タンパクはジヒドロ葉酸還元酵素の活性が消失し
ていた。このため、E.coliで作られた融合タンパ
クの検出方法としては抗体を用いた免疫化学的手
法が唯一であり、かつ、この方法が繁雑であるこ
とから、分離精製の点に関して改良すべき問題が
ある。
発明の目的
本発明者は、上記問題点を解決すべく鋭意研究
を行ない、B.subtilisのジヒドロ葉酸還元酵素遺
伝子の塩基配列を明らかにその解析を行なつた。
その結果、(1)B.subtilisのジヒドロ葉酸還元酵素
が、168個のアミノ酸より成り立つていること、
(2)遺伝子中に存在するEcoRI部位の下流の配列に
よつて暗号化されるC−末端側の6アミノ酸より
成るアミノ酸配列を、他のアミノ酸配列と置き換
えてもジヒドロ葉酸還元酵素の生産性及び活性に
関係がないことを明らかにした。この結果を利用
すると、目的ペプチド遺伝子を、遺伝子の読み取
り枠をあわせてB.subtilisジヒドロ葉酸還元酵素
遺伝子のEcoRI部位下流に組込み、酵素活性を保
有するジヒドロ葉酸還元酵素−目的ペプチド融合
タンパクの合成が可能である。このことにより、
従来宿主内で安定に生産されないペプチド等の遺
伝子産物の生産及びその分離精製が非常に容易に
なることが考えられる。以上のことから、前述の
問題点を解消できる可能性が示唆され、ロイシン
エンケフアリンを暗号化するDNAを分子設計及
び化学合成し、これをB.subtilisのジヒドロ葉酸
還元酵素遺伝子のEcoRI部位下流に組込んだ新規
組換えプラスミドpBSFOLEK1を作成し、発明
を完成させるに至つた。
を行ない、B.subtilisのジヒドロ葉酸還元酵素遺
伝子の塩基配列を明らかにその解析を行なつた。
その結果、(1)B.subtilisのジヒドロ葉酸還元酵素
が、168個のアミノ酸より成り立つていること、
(2)遺伝子中に存在するEcoRI部位の下流の配列に
よつて暗号化されるC−末端側の6アミノ酸より
成るアミノ酸配列を、他のアミノ酸配列と置き換
えてもジヒドロ葉酸還元酵素の生産性及び活性に
関係がないことを明らかにした。この結果を利用
すると、目的ペプチド遺伝子を、遺伝子の読み取
り枠をあわせてB.subtilisジヒドロ葉酸還元酵素
遺伝子のEcoRI部位下流に組込み、酵素活性を保
有するジヒドロ葉酸還元酵素−目的ペプチド融合
タンパクの合成が可能である。このことにより、
従来宿主内で安定に生産されないペプチド等の遺
伝子産物の生産及びその分離精製が非常に容易に
なることが考えられる。以上のことから、前述の
問題点を解消できる可能性が示唆され、ロイシン
エンケフアリンを暗号化するDNAを分子設計及
び化学合成し、これをB.subtilisのジヒドロ葉酸
還元酵素遺伝子のEcoRI部位下流に組込んだ新規
組換えプラスミドpBSFOLEK1を作成し、発明
を完成させるに至つた。
発明の構成
本発明のプラスミドpBSFOLEK1は、4762塩
基対の大きさを有し、宿主であるE.coliをトリメ
トプリムおよびアンピシリン耐性に形質転換する
ことができ、第1図に示される塩基配列によつて
確定される新規組換えプラスミドである。プラス
ミドpBSFOLEK1は、制限酵素EcoRI、BamHI、
BglII、BstEII、PstI、PvuII、SalIによつて、
各々1箇所切断され、AatII、ClaI、HindIII、
HpaIによつて各々2箇所切断される。
基対の大きさを有し、宿主であるE.coliをトリメ
トプリムおよびアンピシリン耐性に形質転換する
ことができ、第1図に示される塩基配列によつて
確定される新規組換えプラスミドである。プラス
ミドpBSFOLEK1は、制限酵素EcoRI、BamHI、
BglII、BstEII、PstI、PvuII、SalIによつて、
各々1箇所切断され、AatII、ClaI、HindIII、
HpaIによつて各々2箇所切断される。
第1図は、pBSFOLEK1の全塩基配列を示す
図であり2本鎖DNAのうち片方の配列だけを示
している。第2図は、pBSFOLEK1中に存在す
るジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケフアリ
ン融合タンパクを暗号化する部分の塩基配列及び
タンパクのアミノ酸配列を示す図である。制限酵
素EcoRIの認識切断部位は、第1図においては、
675〜681塩基の所に、第2図においては、480〜
485塩基の所に存在する。
図であり2本鎖DNAのうち片方の配列だけを示
している。第2図は、pBSFOLEK1中に存在す
るジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケフアリ
ン融合タンパクを暗号化する部分の塩基配列及び
タンパクのアミノ酸配列を示す図である。制限酵
素EcoRIの認識切断部位は、第1図においては、
675〜681塩基の所に、第2図においては、480〜
485塩基の所に存在する。
ジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケフアリ
ン融合タンパクは、第2図に示されるように168
個のアミノ酸より構成される。融合タンパクのア
ミノ末端側から162番目までは、B.subtilisのジヒ
ドロ葉酸還元酵素のアミノ酸配列と同一であり、
164〜168番目の配列がロイシンエンケフアリンの
配列である。163番目のアミノ酸はメチオニン
(Met)であり、ブロムシアンで融合タンパクを
処理することによりロイシンエンケフアリンを切
り出すことが可能な構造である。融合タンパクの
分子量は19296である。
ン融合タンパクは、第2図に示されるように168
個のアミノ酸より構成される。融合タンパクのア
ミノ末端側から162番目までは、B.subtilisのジヒ
ドロ葉酸還元酵素のアミノ酸配列と同一であり、
164〜168番目の配列がロイシンエンケフアリンの
配列である。163番目のアミノ酸はメチオニン
(Met)であり、ブロムシアンで融合タンパクを
処理することによりロイシンエンケフアリンを切
り出すことが可能な構造である。融合タンパクの
分子量は19296である。
pBSFOLEK1を含有するE.coliは、ジヒドロ葉
酸還元酵素−ロイシンエンケフアリン融合タンパ
クを細胞内で作ることができる。すなわち、
pBSFOLEK1を含有するE.coliを培養し、菌体を
集め、これを破砕した上清中には、ジヒドロ葉酸
還元酵素−ロイシンエンケフアリン融合タンパク
が存在し、この上清から、ジヒドロ葉酸還元酵素
活性を目安にジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエ
ンケフアリン融合タンパクを精製することができ
るのである。さらに、精製したジヒドロ葉酸還元
酵素−ロイシンエンケフアリン融合タンパクは、
ロイシンエンケフアリンに対する抗体と反応する
ことができるのである。
酸還元酵素−ロイシンエンケフアリン融合タンパ
クを細胞内で作ることができる。すなわち、
pBSFOLEK1を含有するE.coliを培養し、菌体を
集め、これを破砕した上清中には、ジヒドロ葉酸
還元酵素−ロイシンエンケフアリン融合タンパク
が存在し、この上清から、ジヒドロ葉酸還元酵素
活性を目安にジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエ
ンケフアリン融合タンパクを精製することができ
るのである。さらに、精製したジヒドロ葉酸還元
酵素−ロイシンエンケフアリン融合タンパクは、
ロイシンエンケフアリンに対する抗体と反応する
ことができるのである。
プラスミドpBSFOLEK1は、pBSDHFR1(特
開昭63−28394号公報)、pBR322(J.G.Sutcliffe,
(1978)Cold Spring Harbor Symp.Quant.
Biol.,vol.43,p.77)及び化学合成したDNAを
もちいて、実施例1に記す方法に従つて作成する
ことができるが、プラスミドの作成方法によつて
本発明が制限されるものではない。
開昭63−28394号公報)、pBR322(J.G.Sutcliffe,
(1978)Cold Spring Harbor Symp.Quant.
Biol.,vol.43,p.77)及び化学合成したDNAを
もちいて、実施例1に記す方法に従つて作成する
ことができるが、プラスミドの作成方法によつて
本発明が制限されるものではない。
本発明のプラスミドpBSFOLEK1は、E.
coliC600株に導入されて安定状態に保たれ、
pBSFOLEK1を含有するE.coliC600株は微工研に
FERM P−8969のして寄託されている。
coliC600株に導入されて安定状態に保たれ、
pBSFOLEK1を含有するE.coliC600株は微工研に
FERM P−8969のして寄託されている。
次に本発明の実施例を示す。
実施例 1
pBSFOLEK1の作成
0.001mgのプラスミドpBSDHFR1を制限酵素
EcoRI及びPstIを用いて切断後、1%アロガース
ゲル電気泳動法により分離した。大小2本の
DNA断片が得られた。小さい断片を切り出し透
析チユーブに入れ1mlの50mM Tris−HCl、PH
8.0を加えシールし、電気溶出法(electroelution
法、T.Maniatisら、Molecular ClonigA
Loboratory Manual,p.164,Cold Spring
Harbor Laboratory(1982)、文献1)により、
ゲルからDNAを回収し、エタノールでDNAを沈
殿後、減圧下に沈殿を乾燥した(DNA−1と呼
ぶ)。
EcoRI及びPstIを用いて切断後、1%アロガース
ゲル電気泳動法により分離した。大小2本の
DNA断片が得られた。小さい断片を切り出し透
析チユーブに入れ1mlの50mM Tris−HCl、PH
8.0を加えシールし、電気溶出法(electroelution
法、T.Maniatisら、Molecular ClonigA
Loboratory Manual,p.164,Cold Spring
Harbor Laboratory(1982)、文献1)により、
ゲルからDNAを回収し、エタノールでDNAを沈
殿後、減圧下に沈殿を乾燥した(DNA−1と呼
ぶ)。
次に、0.001mgのプラスミドpBR322を制限酵素
BamHI及びPstIを用いて切断後、1%アルガロ
ースゲル電気泳動法により分離した。大小2本の
DNA断片が得られた。大きい断片を切り出し透
析チユーブに入れ1mlの50mM Tris−HCl、PH
8.0を加えシールし、電気溶出法により、ゲルか
らDNAを回収し、エタノールでDNAを沈殿後、
減圧下に沈殿を乾燥した(DNA−2と呼ぶ)。
BamHI及びPstIを用いて切断後、1%アルガロ
ースゲル電気泳動法により分離した。大小2本の
DNA断片が得られた。大きい断片を切り出し透
析チユーブに入れ1mlの50mM Tris−HCl、PH
8.0を加えシールし、電気溶出法により、ゲルか
らDNAを回収し、エタノールでDNAを沈殿後、
減圧下に沈殿を乾燥した(DNA−2と呼ぶ)。
ロイシンエンケフアリンを暗号化するDNAと
して、 1 5′−
AATTCTATGTACGGTGGTTTCCTGTA
AG−3′ 2 5′−
GATCCTTACAGGAAACCACCGTACATA
G−3′ の2本の28ヌクレオチドからなるDNAをホスホ
アミダイト法に従つて化学合成し、精製後、ポリ
ヌクレオチドキナーゼで5′−末端をリン酸化した
後、両者を約0.1ml(約0.0001mgのDNAを含んで
いる)ずつ取り、これを60℃でインキユベートす
ることによりアニールさせた(これをDNA−3
と呼ぶ)。
して、 1 5′−
AATTCTATGTACGGTGGTTTCCTGTA
AG−3′ 2 5′−
GATCCTTACAGGAAACCACCGTACATA
G−3′ の2本の28ヌクレオチドからなるDNAをホスホ
アミダイト法に従つて化学合成し、精製後、ポリ
ヌクレオチドキナーゼで5′−末端をリン酸化した
後、両者を約0.1ml(約0.0001mgのDNAを含んで
いる)ずつ取り、これを60℃でインキユベートす
ることによりアニールさせた(これをDNA−3
と呼ぶ)。
DNA−1とDNA−2を0.05mlのリガーゼ用反
応液(10mM Tris−HCl、PH7.4、5m
MMgCl2、10mMジチオトレイトール、0.5m
MATP)に溶解・混合した後、0.001mlのDNA
−3及び5.0ユニツトのT4−DNAリガーゼを加
え、37℃、1時間、DNAの連結反応を行なわせ
た。この反応物を、形質転換法
(transformationmethod、上記文献1、pp.250)
に従つて、E.coliC600株に取り込ませた。この処
理をした菌体を、50mg/のアンピシリナトリウ
ム及び10mg/のトリメトプリムを含む栄養寒天
培地(1中に、1gのグルコース、1gのリン
酸2カリウム、5gのイーストエキス、5gのポ
リペプトン、及び15gの寒天を含む寒天培地)上
に塗布し、37℃で24時間培養することにより、
105個のコロニーを得ることができた。これらの
コロニーから、適当に1個選び、菌体を培養し、
TanakaとWeisblumの方法(T.Tanaka,B.
Weisblum;J.Bacteriology,vol121,pp.354
(1975))にしたがつてプラスミドを調製した。得
られたプラスミドを制限酵素EcoRI、BamHAI、
BglII、BstEII、PstI、PvuII、SalI、AatII、
ClaI、HindIII、HpaIによつて切断を試みたとこ
ろ、各々1、1、1、1、1、1、1、2、2、
2、2箇所切断されることが明らかとなつた。得
られたプラスミドをpBSFOLEK1と称した。
pBSFOLEK1の全塩基配列を、ジデオキシ法に
従つて決定した。その結果、第1図に示す塩基配
列が明らかとなり、プラスミドpBSFOLEK1は
4762塩基対より成り立つていることが明らかとな
つた。
応液(10mM Tris−HCl、PH7.4、5m
MMgCl2、10mMジチオトレイトール、0.5m
MATP)に溶解・混合した後、0.001mlのDNA
−3及び5.0ユニツトのT4−DNAリガーゼを加
え、37℃、1時間、DNAの連結反応を行なわせ
た。この反応物を、形質転換法
(transformationmethod、上記文献1、pp.250)
に従つて、E.coliC600株に取り込ませた。この処
理をした菌体を、50mg/のアンピシリナトリウ
ム及び10mg/のトリメトプリムを含む栄養寒天
培地(1中に、1gのグルコース、1gのリン
酸2カリウム、5gのイーストエキス、5gのポ
リペプトン、及び15gの寒天を含む寒天培地)上
に塗布し、37℃で24時間培養することにより、
105個のコロニーを得ることができた。これらの
コロニーから、適当に1個選び、菌体を培養し、
TanakaとWeisblumの方法(T.Tanaka,B.
Weisblum;J.Bacteriology,vol121,pp.354
(1975))にしたがつてプラスミドを調製した。得
られたプラスミドを制限酵素EcoRI、BamHAI、
BglII、BstEII、PstI、PvuII、SalI、AatII、
ClaI、HindIII、HpaIによつて切断を試みたとこ
ろ、各々1、1、1、1、1、1、1、2、2、
2、2箇所切断されることが明らかとなつた。得
られたプラスミドをpBSFOLEK1と称した。
pBSFOLEK1の全塩基配列を、ジデオキシ法に
従つて決定した。その結果、第1図に示す塩基配
列が明らかとなり、プラスミドpBSFOLEK1は
4762塩基対より成り立つていることが明らかとな
つた。
実施例 2
プラスミドpBSFOLEK1を含有するE.coliC600
株からのジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエン
ケフアリン融合タンパクの精製。
株からのジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエン
ケフアリン融合タンパクの精製。
プラスミドpBSFOLEK1を含有するE.coliC600
株を3の50mg/のアンピシリンナトリウムを
含む栄養培地(1中に、5gのNaCl、8gの
バクトペプトン、5gのイーストエキスを含む液
体培地、PH7.4)3中で37℃で一晩培養後、菌
体を遠心分離により集めた。湿重量約13gの菌体
が得られた。菌体を20mlの0.1mMのジチオトレ
イトール(DTT)及び0.1mMのエチレンジアミ
ン4酢酸2ナトリウム(EDTA)を含む10mM
リン酸カリウム緩衝液PH7.0に懸濁し、超音波破
砕により細胞を破砕した後、20000回転/分、1
時間の遠心分離により上清25mlを得た。得られた
上清のジヒドロ葉酸還元酵素活性を測定したとこ
ろ、144ユニツト/mlという値であつた。上清を、
DEAE−トヨパール650Mカラム(25cmx150cm、
約75cm3)に吸着させ、0から100mMのKCl濃度
勾配をかけ溶出した。約1mlずつフラクシヨンを
集め、ジヒドロ葉酸還元酵素活性を測定し、酵素
活性を有する画分を集めた。25mlの酵素液が得ら
れた。これをアミコン限外ろか装置を用いて約1
mlにまで濃縮し、これをトヨパールHW55カラム
クロマトグラフイーにより分画した。約1mlずつ
フラクシヨンを集め、ジヒドロ葉酸還元酵素活性
を測定し、酵素活性のピーク画分を集めた(約
3.7ml、48mg)。得られた酵素タンパクをSDS電気
泳動法により分析したところ、均一であり、ラク
トアルブミン、トリプシンインヒビター、トリプ
シノーゲン、カーボニツクアンヒドラーゼ、グリ
セロアルデヒド−3リン酸デヒドロゲナーゼ、卵
アルブミン、及び牛血清アルブミンを分子量マー
カーとして精製ジヒドロ葉酸還元酵素の分子量を
推定したところ19000であり、塩基配列から予想
される分子量19296と一致した値であつた。
株を3の50mg/のアンピシリンナトリウムを
含む栄養培地(1中に、5gのNaCl、8gの
バクトペプトン、5gのイーストエキスを含む液
体培地、PH7.4)3中で37℃で一晩培養後、菌
体を遠心分離により集めた。湿重量約13gの菌体
が得られた。菌体を20mlの0.1mMのジチオトレ
イトール(DTT)及び0.1mMのエチレンジアミ
ン4酢酸2ナトリウム(EDTA)を含む10mM
リン酸カリウム緩衝液PH7.0に懸濁し、超音波破
砕により細胞を破砕した後、20000回転/分、1
時間の遠心分離により上清25mlを得た。得られた
上清のジヒドロ葉酸還元酵素活性を測定したとこ
ろ、144ユニツト/mlという値であつた。上清を、
DEAE−トヨパール650Mカラム(25cmx150cm、
約75cm3)に吸着させ、0から100mMのKCl濃度
勾配をかけ溶出した。約1mlずつフラクシヨンを
集め、ジヒドロ葉酸還元酵素活性を測定し、酵素
活性を有する画分を集めた。25mlの酵素液が得ら
れた。これをアミコン限外ろか装置を用いて約1
mlにまで濃縮し、これをトヨパールHW55カラム
クロマトグラフイーにより分画した。約1mlずつ
フラクシヨンを集め、ジヒドロ葉酸還元酵素活性
を測定し、酵素活性のピーク画分を集めた(約
3.7ml、48mg)。得られた酵素タンパクをSDS電気
泳動法により分析したところ、均一であり、ラク
トアルブミン、トリプシンインヒビター、トリプ
シノーゲン、カーボニツクアンヒドラーゼ、グリ
セロアルデヒド−3リン酸デヒドロゲナーゼ、卵
アルブミン、及び牛血清アルブミンを分子量マー
カーとして精製ジヒドロ葉酸還元酵素の分子量を
推定したところ19000であり、塩基配列から予想
される分子量19296と一致した値であつた。
精製したジヒドロ葉酸還元酵素をエンザイムイ
ムノアツセイにより測定したところ、ロイシンエ
ンケフアリンに対する抗体と反応し、化学合成し
たロイシンエンケフアリンによつて抗原−抗体反
応が競争的に阻害されることが明らかとなつた。
さらに、精製したジヒドロ葉酸還元酵素約1.2mg
を0.5mlの70%ぎ酸中、ブロムシアンで37℃、24
時間処理した後、凍結乾燥しこれを0.2mlの70%
ぎ酸に溶かし、高速液体クロマトグラフイーによ
り分析したところ約0.013mgのロイシンエンケフ
アリンが検出された。この結果は、
pBSFOLEK1を有するE.coliC600株のジヒドロ葉
酸還元酵素がロイシンエンケフアリンとの融合タ
ンパクとして存在することを示している。
ムノアツセイにより測定したところ、ロイシンエ
ンケフアリンに対する抗体と反応し、化学合成し
たロイシンエンケフアリンによつて抗原−抗体反
応が競争的に阻害されることが明らかとなつた。
さらに、精製したジヒドロ葉酸還元酵素約1.2mg
を0.5mlの70%ぎ酸中、ブロムシアンで37℃、24
時間処理した後、凍結乾燥しこれを0.2mlの70%
ぎ酸に溶かし、高速液体クロマトグラフイーによ
り分析したところ約0.013mgのロイシンエンケフ
アリンが検出された。この結果は、
pBSFOLEK1を有するE.coliC600株のジヒドロ葉
酸還元酵素がロイシンエンケフアリンとの融合タ
ンパクとして存在することを示している。
第1図は、pBSFOLEK1の全塩基配列を示し
た図であり、2本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配
列だけを、5′末端から3′末端の方向に記述してい
る。図中符号は、核酸塩基を表わし、Aはアデニ
ンを、Cはシトシンを、Gはグアニンを、Tはチ
ミンを示している。図中番号はpBSFOLEK1に
2箇所存在する制限酵素ClaI切断認識部位のうち
制限酵素HindIII切断部位に近い方のClaI切断認
識部位の、ATCGATの最初の“A”を1番とし
て数えた番号を示している。第2図は、
pBSFOLEK1中に存在するDHFR−ロイシンエ
ンケフアリン融合タンパクを暗号化する部分の塩
基配列及びタンパクのアミノ酸配列を示す図であ
る。図中符号は、核酸塩基及びアミノ酸を表わ
し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン
を、Tはチミンを、Alaはアラニンを、Argはア
ルギニンを、Asnはアスパラギンを、Aspはアス
パラギン酸を、Cysはシステインを、Glnはグル
タミンを、Gluはグルタミン酸を、Glyはグリシ
ンを、Hisはヒスチジンを、Ileはイソロイシン
を、Leuはロイシンを、Lysはリジンを、Metは
メチオニンを、Pheはフエニルアラニンを、Pro
はプロリンを、Serはセリンを、Thrはトレオニ
ンを、Trpはトリプトフアンを、Tyrはチロシン
を、Valはバリンを示している。図中番号は、一
番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化する
ATGコドンの“A”を1番として数えた番号を
示している。
た図であり、2本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配
列だけを、5′末端から3′末端の方向に記述してい
る。図中符号は、核酸塩基を表わし、Aはアデニ
ンを、Cはシトシンを、Gはグアニンを、Tはチ
ミンを示している。図中番号はpBSFOLEK1に
2箇所存在する制限酵素ClaI切断認識部位のうち
制限酵素HindIII切断部位に近い方のClaI切断認
識部位の、ATCGATの最初の“A”を1番とし
て数えた番号を示している。第2図は、
pBSFOLEK1中に存在するDHFR−ロイシンエ
ンケフアリン融合タンパクを暗号化する部分の塩
基配列及びタンパクのアミノ酸配列を示す図であ
る。図中符号は、核酸塩基及びアミノ酸を表わ
し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン
を、Tはチミンを、Alaはアラニンを、Argはア
ルギニンを、Asnはアスパラギンを、Aspはアス
パラギン酸を、Cysはシステインを、Glnはグル
タミンを、Gluはグルタミン酸を、Glyはグリシ
ンを、Hisはヒスチジンを、Ileはイソロイシン
を、Leuはロイシンを、Lysはリジンを、Metは
メチオニンを、Pheはフエニルアラニンを、Pro
はプロリンを、Serはセリンを、Thrはトレオニ
ンを、Trpはトリプトフアンを、Tyrはチロシン
を、Valはバリンを示している。図中番号は、一
番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化する
ATGコドンの“A”を1番として数えた番号を
示している。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 E.coliにおいて安定に複製され、宿主である
E.coliにトリメトプリム耐性及びアンピシリン耐
性を与えることができ、トリメトプリム耐性を付
与する遺伝子がBacillus subtilisのジヒドロ葉酸
還元酵素遺伝子の3′末端側が一部改変されたこと
によりジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケフ
アリン融合タンパクを暗号化し、4762塩基対の大
きさを有し、下記に示されるDNA配列を有する
新規組換えプラスミドpBSFOLEK1。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 2 E.coliにおいて安定に複製され、宿主である
E.coliにトリメトプリム耐性及びアンピシリン耐
性を与えることができ、トリメトプリム耐性を付
与する遺伝子がBacillus subtilisのジヒドロ葉酸
還元酵素遺伝子の3′末端側が一部改変されたこと
によりジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケフ
アリン融合タンパクを暗号化し、4762塩基対の大
きさを有し、下記に示されるDNA配列を有する
新規組換えプラスミドpBSFOLEK1を含有するE.
coliC600株。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP23400386A JPS6387981A (ja) | 1986-09-30 | 1986-09-30 | 新規組換えプラスミドpBSFOLEK1およびそれを含有する菌株 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP23400386A JPS6387981A (ja) | 1986-09-30 | 1986-09-30 | 新規組換えプラスミドpBSFOLEK1およびそれを含有する菌株 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6387981A JPS6387981A (ja) | 1988-04-19 |
JPH0364111B2 true JPH0364111B2 (ja) | 1991-10-03 |
Family
ID=16964031
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP23400386A Granted JPS6387981A (ja) | 1986-09-30 | 1986-09-30 | 新規組換えプラスミドpBSFOLEK1およびそれを含有する菌株 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6387981A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20180047369A (ko) * | 2016-10-31 | 2018-05-10 | 창원대학교 산학협력단 | 복합 형상 측정기 |
EP4016747A1 (en) | 2020-12-15 | 2022-06-22 | Japan Aviation Electronics Industry, Limited | Connector |
-
1986
- 1986-09-30 JP JP23400386A patent/JPS6387981A/ja active Granted
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20180047369A (ko) * | 2016-10-31 | 2018-05-10 | 창원대학교 산학협력단 | 복합 형상 측정기 |
EP4016747A1 (en) | 2020-12-15 | 2022-06-22 | Japan Aviation Electronics Industry, Limited | Connector |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6387981A (ja) | 1988-04-19 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EXPY | Cancellation because of completion of term |