JPH0355108B2 - - Google Patents
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Description
産業上の利用分野
本発明は、モルヒネ様鎮痛作用を示すペプチド
であるロイシンエンケフアリン(チロシンTyr−
グリシンGly−グリシンGly−フエニルアラニン
Phe−ロイシンLeuの5個のアミン酸配列よりな
るペプチド、以下、LEKと略す。)を含む融合タ
ンパク質を大量に生産可能とする新規組換えプラ
スミドpLEK1、pLEK1を含有する大腸菌、LEK
を酵素のカルボキシ末端側に有するジヒドロ葉酸
還元酵素−LEK融合タンパク質(以下、DHFR
−LEKと略す。)、DHFR−LEKの分離精製方法、
およびLEKの製造方法に関するものである。本
発明の新規組換えプラスミドpLEK1は、第1図
において示されるDNA配列を有する。本発明は、
発酵工業、医薬品工業等の分野に好適である。
従来の技術
LEKは、モルヒネ様鎮痛作用を示す内因性ペ
プチドとして知られ、習慣性のない鎮痛剤または
麻酔薬としての利用が期待される興味深い生理活
性ペプチドである。
本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子
操作技術がある。遺伝子操作を利用した効率のよ
いLEKの製造方法としては、本発明者らが開発
した枯草菌のジヒドロ葉酸還元酵素(以下、
DHFRと略す。)遺伝子を利用する方法(特開昭
63−102698号公報)があるだけで、他には知られ
ていない。枯草菌のDHFR遺伝子を利用した方
法は、枯草菌由来のDHFR遺伝子の大腸菌での
発現効率を高め、DHFR遺伝子中のEcoRI切断部
位に化学合成LEK遺伝子を導入し、枯草菌由来
のDHFR(以下、DHFRbsと略す。)のカルボキシ
末端側にLEKが融合した融合タンパク質として、
大腸菌に生産させ(特開昭63−87981号公報、特
開昭63−102696号公報)、融合タンパク質を分離
精製した後、カルボキシ末端側のLEKを特異的
に切断し、高速液体クロマトグフイー(以下、
HPLCと略す。)を用いて分離精製することを骨
子とする方法である。この方法の問題点は、大腸
菌で作られるDHFRbs−LEKの菌体内蓄積量が、
菌体タンパク質のせいぜい数パーセントであり、
生産効率上改善すべき点があることである。
一方、既に、本発明者らは、大腸菌由来の
DHFR遺伝子に関しては、その遺伝子の改変の
結果、異種遺伝子発現用プラスミドベクター
pTP70−1(特開昭63−46193号公報)及び
pTP104−4(特願昭62−302157)と、それら発
現ベクターを利用した融合遺伝子の作成方法(特
開平1−144992号公報)を開発している。これら
の方法を利用した場合、融合遺伝子の発現の結果
得られる融合タンパク質の大腸菌菌体の蓄積量
は、全菌体タンパク質の約20%が期待される。し
かしながら、LEKの生産に上記発現ベクターを
用いた例はない。
発明の目的
本発明の目的は、生産効率の面で問題のあつた
DHFRbs遺伝子を用いたLEKの生産方法を改善
し、遺伝子操作を利用した効率のよいLEKの生
産方法を開発することにある。
既に、本発明者らは(1)大腸菌のDHFRのカル
ボキシ末端側の配列を変化させても、枯草菌の
DHFRと同様に酵素活性が失われないこと、(2)
大腸菌のDHFRのカルボキシ末端側に異種ペプ
チドを融合させることを可能とするプラスミドベ
クターpTP104−4(特開平1−144979号公報)
を構築していること、(4)pTP104上の改変DHFR
遺伝子は大腸菌で効率良く発現すること、を明ら
かにしている。
本発明者らは、上記の知見を利用し、鋭意研究
の結果、pTP104−4を用いて、LEK遺伝子を
DHFRと融合させて発現することにより、効率
のよいDHFR−LEKの生産を行うことができる
ことを明らかにし、その結果に従つて、本発明を
完成させた。
発明の構成
本発明は、(1)DHFR−LEKの大量発現を可能
にする新規組換えプラスミドpLEK1、(2)pLEK1
を含有する大腸菌菌体、(3)pLEK1を含有する大
腸菌が生産するDHFR−LEK、(4)pLEK1を含有
する大腸菌からのDHFR−LEK分離精製、およ
び(5)DHFR−LEKを用いたLEKの製造方法、の
発明により構成される。
(1) 新規組換えプラスミドpLEK1
第1図は、本発明のpLEK1の全塩基配列を
示している。図は、2本鎖環状DNAのうち片
方のDNA鎖配列だけを、プラスミド中に唯一
存在する制限酵素ClaIの切断認識部位、5′−
ATCGAT−3′の最初の”A”を1番として数
えて、5′末端から3′末端の方向に記述してい
る。本発明のpLEK1は、新規な組換えプラス
ミドである。pLEK1は、4207塩基対の大きさ
であり、宿主である大腸菌にトリメトプリムお
よびアンピシリン耐性を付与することができ
る。pLEK1は、pTP104−4のBamHI及び
SalI切断によつて得られる大きい方の4173塩基
対のDNA断片と、LEKを暗号化する配列を含
む34塩基対の化学合成DNAが結合した構造を
していてる。第1図において、533番目から566
番目迄の配列が化学合成DNA由来の配列であ。
それ以外の配列がpTP104−4由来の配列であ
る。
化学合成したDNAの配列には、制限酵素
MluIの認識切断部位、5′−ACGCGT−3′(第1
図の560番目から565番目までの配列)、を含ま
せてある。pTP104−4由来の部分には、MluI
部位が存在しない。pLEK1のBamHI部位(第
1図の532番目から537番目までの配列)から
MluI部位までの配列を他の配列に置き換える
ことにより、方向を定めて異種DNAの導入を
行い、DHFR遺伝子との融合遺伝子を容易に
作成することができる。
第1図の57番目から557番目まで配列は、
DHFRのカルボキシ末端側にLEKがメチオニ
ンを介して結合したDHFR−LEKを暗号化し
ている。
DHFR−LEKを暗号化する配列の上流には、
DHFR−LEK遺伝子の発現を効率良く行わせ
る配列が存在する(特開昭63−46193号公報)。
即ち、43番目から50番目までの配列がSD配列
と呼ばれるもので、効率の良い翻訳に、また、
4165番目から4193番目までが、コンセンサス転
写プロモーターであり、効率の良い転写に貢献
する。このことから、pLEK1は、大腸菌に導
入された場合、多量のDHFR−LEKを作る。
作られたDHFR−LEKは、菌体内に可溶性の
状態で、菌体タンパク質の約20%程度蓄積す
る。このことによつて、pLEK1を有する大腸
菌はトリメトプリム耐性を示すようになる。ま
た、pLEK1は、pTP104−4由来の、アンプシ
リンに対して耐性を付与する遺伝子を有してい
る。このことから、pLEK1が導入された大腸
菌は、アンピシリン耐性をも示す。pLEK1は、
大腸菌に導入されて安定状態に保たれ、
pLEK1を含有する大腸菌は、微工研に
FERMBP−1818として寄託されている。
このような特長を有するpLEK1は、実施例
1に従つて作成することができるが、組換えプ
ラスミドの作成方法によつて本発明が制限され
るものではない。
(2) pLEK1を含有する大腸菌
pLEK1を含有する大腸菌は、トリメトプリ
ム及びアンピシリンに対して耐性を示す。
pLEK1を含有する大腸菌は、pLEK上の
DHFR−LEK遺伝子の効率のよい発現の結果、
DHFR−LEKを菌体内に可溶性の状態で大量
に蓄積する。pLEK1を含有する大腸菌をYT+
Ap倍地(倍地1l中に、5gのNaCl、8gのト
リプトン、5gのイーストエキス、及び50mgの
オリピシリンナトリウムを含む液体倍地)を用
いて、37℃で定常期まで培養した場合、蓄積す
るDHFR−LEKは、菌体タンパク質の約20%
に達する。培養菌体は、リン酸緩衝液などの適
当な緩衝液に懸濁し、フレンチプレス法もしく
は音波破砕法で破砕し、これを遠心分離法によ
り上清と沈澱に分離した場合、ほとんど全ての
DHFR−LEKは上清中に回収される。pLEK1
を含有する大腸菌は、微工研にFERMBP−
1818として寄託されている。
(3) DHFR−LEK
第2図は、DHFR−LEKを暗号化する部分
のDNA配列とそれから作られると予想される
タンパク質のアミノ酸配列を示している。
DHFR−LEKは、167アミノ酸よりなる新規な
タンパク質である。アミノ末端側から数えて、
1から159番目までの配列が、大腸菌の野生型
DHFRに1箇所アミノ酸置換置換が起こつた
(Cys−152(wild type)→Glu−152)配列であ
り、162番目から167番目までがLEKの配列で
ある。LEKの配列の直前のアミノ酸はメチオ
ニン(Met)である。このことにより、DHFR
−LEKをブロムシアン処理することにより、
LEKを特異的に切り出すことができる。160番
目のイソロイシンlleと161番目のアルギニン
Argは、pTP140−4のBamHI部位にLEKを
暗号化するDNAを導入する際に、遺伝暗号の
読み取り枠を合わせるために生じた配列であ
る。pTP104−4が作るDHFRは、162個のア
ミノ酸よりなり、第2図のDHFR−LEKのア
ミノ酸配列のうち、アミノ末端側から数えて、
1から160番目までの配列に、Gln−lleの2個
のアミノ酸配列が結合した配列をしている。
DHFR−LEKの分子量は、18963である。
DHFR−LEKは、DHFRのカルボキシ末端
側に、LEKが融合した構造をしているにもか
かわらず、DHFR酸素活性を有する。このた
め、大腸菌がDHFR−LEKを多量につくると、
DHFRの阻害剤であり、抗細菌剤であるトリ
メトプリムに対して、耐性を示すようになる。
(4) DHFR−LEKの分離精製
本発明のDHFR−LEKの分離精製法は、
菌体の培養、菌体の破砕、DEAE−トヨパ
ールカラム処理、メソトリキセート
(MTX)結合アフイニテイクロマトグラフイ
ー、およびDEAE−トヨパールカラムクロマ
トグラフイーの過程より成り立つている。
菌体の培養
pLEK1を含有する大腸菌の培養は、YT+
Ap倍地(倍地1中に、5gのNaCl、8g
のトリプトン、5g、イーストエキスおよび
50mgアンピシリンナトリウムを含む液体倍
地。)で培養することができる。倍地として
は、この地にST+Ap倍地(倍地1中に、
2gのグルコース、1gのリン酸2カリウ
ム、5gのポリペプトン、5gのイーストエ
キスおよび50mgのアンピシリンナトリウムを
含む液体倍地。)など、菌体が成長する倍地
であれば、どの様な倍地でも用いることがで
きるが、調べた限りでは、DHFR−LEKの
生産にはYT+Ap倍地が最適であつた。
pLEK1を含有する大腸菌を、倍地に接触
し、37℃で対数成長期の後期もしくは定常期
まで培養する。培養温度により菌体中の
DHFR−LEKの蓄積量が変動し、調べた限
りでは、培養温度が高いほど蓄積量が大であ
つた。培養した菌体は、5000回転/分の遠心
分離により集める。倍地1より湿重量2か
ら4gの菌体が得られる。
集菌およびこれ以後の操作は、特に断わら
ない限り低温(0から10℃の間、4℃が望ま
しい)で行う。
菌体の破砕
培養して得られた菌体を、湿重量の3倍の
緩衝液1(0.1mM エチレンジアミン4酢酸
ナトリウム(EDTA)を含む10mMリン酸
カリウム緩衝液、PH7.0)に懸濁し、フレン
チプレスを用いて菌体を破砕する。菌体破砕
液を5000回転、10分間遠心分離し、上清を得
る。さらに、上清を、35000回転、1時間超
遠心分離し、上清を得る(無細胞抽出液)。
DEAE−トヨパールカラム処理
この操作は、次の精製過程の前処理の目的
で行う。無細胞抽出液を、あらかじめ0.1M
のKClを含む緩衝液1で平衡化したDEAEト
ヨパールカラムにかけ、0.1MのKClを含む
緩衝液1でカラムを洗う。酵素の溶出は、
0.3MのKClを含む緩衝液1を用いて行う。
溶出液を一定量ずつフラクシヨンコレクター
を用いて分画する。分画した溶出液について
DHFR活性を測定し、酵素活性が含まれる
画分を集める。
MTX結合アフイニテイクロマトグラフイ
ー
上記の操作により得られた酵素液を、あら
かじめ緩衝液1で平衡化したMTX結合
Sepharoseアフイニテイカラムに吸着させ
る。吸着後、1MのKClを含む緩衝液2(0.1
mM EDTAを含む10mMリン酸カリウム
緩衝液、PH8.5)で洗う。洗いは、カラムか
らの溶出液の280nmの吸光度を測定し、吸
光度が0.1以下になるまで同緩衝液を流し続
ける。酵素の溶出は、1MのKClと3mMの
葉酸を含む緩衝液2を用いて行い、溶出液を
一定量ずつフラクシヨンコレクターを用いて
分画する。分画した溶出液についてDHFR
活性を測定し、酵素活性が含まれる画分を集
める。得られた酵素液を、緩衝液1に対し
て、3回透析する。この段階で、純度90%以
上のDHFR−LEKが得られる。
DEAE−トヨパールカラムクロマトグラフ
イー
透析した酵素液を、あらかじめ緩衝液1で
平衡化したDEAE−トヨパールカラムに吸着
させる。吸着後、0.1KClを含む緩衝液1で
洗う。洗いは、カラムからの溶出液の280n
mの吸光度を測定し、吸光度が0.01以下にな
るまで同緩衝液を流し続ける。酵素の溶出
は、緩衝液1を用いて0.1Mから0.3MのKCl
の直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を一定
量ずつフラクシヨンコレクターを用いて分画
する。分画した溶出液について280nmの吸
光度とDHFR活性を測定する。酵素活性/
280nmの吸光度の値が、一定な画分を集め
る。
以上の操作により、DHFR−LEKの高度
精製均一化を、再現性良く行うことができ
る。
本発明に従うと、DHFR−LEKの精製は、
培養を含めて一週間以内に行うことができ、
回収率50%以上で、均一な酵素標品を得るこ
とができる。
DHFR酵素活性は、反応液(0.05mMのジ
ヒドロ葉酸、0.06mMのNADPH、12mMの
2−メルカプトエタノール、50mMのリン酸
緩衝液(PH7.0))を、1mlのキユベツトと
り、これに酵素液を加え、340nmの吸光度
の時間変化を測定することにより行う。酵素
1ユニツトは、上記反応条件において、1分
間に1マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元す
るのに必要な酵素量として定義する。この測
定は、分光光度計を用いて容易に行うことが
できる。
(5) DHFR−LEKを用いたLEKの製造
精製したDHFR−LEKを凍結乾燥し、これ
に1から10mgタンパク質/mlとなるように7%
蟻酸を加え、溶かした後、タンパク質量の約20
倍量の結晶ブロムシアンを加え密栓し、窒素雰
囲気下、室温で撹拌しながら24時間反応させ
る。反応液を10倍の水で希釈した後、凍結乾燥
し過剰の試薬を除く。乾燥試料を1から10mgタ
ンパク質/mlとなるように30%酢酸に溶かす。
溶かした試料をHPLC装置(島津LC−4A、
inertsil−ODSカラム)を用いて、0.1%トリフ
ルオロ酢酸中、15%から50%のアセトニトリル
の濃度勾配を用いて溶出・分離することができ
る。溶出物は、220nmにおける吸光度を測定
することにより検出することができる。第3図
は、ブロムシアン処理したDHFR−LEK試料
の高速液体クロマトグラムを示している。試料
注入後17分のピークがLEKである。このピー
ク画分を分離する。分離した溶出液をエバホレ
ーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し溶
媒を除き、LEKを得ることができる。また、
得られたペプチドを酸加水分解後、アミノ酸分
析することによりアミノ酸組成を確かめること
ができる。
本発明の実施例においては、3の倍地から
湿重量約8gの菌体が得られ、この菌体(計算
上、約87.3mgのDHFR−LEK、約2.6mgのLEK
を含む。)から、約43mgのDHFR−LEK(収率、
50.6%、計算上約1.26mgのLEKを含む。)を精
製して得ることができ、10mgのDHFR−LEK
をブロムシアン分解後、HPLCで分離・精製す
ることにより、約0.16mgのLEKを得ることがで
きた。
次に本発明の実施例および参考例を示す。
実施例 1
pLEK1の作成
LEKを暗号化するDNAとしては、
1 5′−
GATCCGTATGTACGGTGGTTTCCTGTA
ACGCGTG−3′
2 5−
TCGACACGCGTTACAGGAAACCACCGT
ACATACG−3′
の2本の34ヌクレオチドからなるDNAをホスホ
アミダイト法に従つて化学合成し、精製後、ポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いて、各DNAの5′末
端をリン酸化した。リン酸化したDNAを約0.1ml
(約0.01μgのDNAを含んでいる。)ずつ取り、こ
れを60℃でインキユベートすることによつて両
DNAをアニールさせた(これをDNA1と呼ぶ)。
約1μgのpTP104−4を、BamHI及びSalIで切
断した後、アルカリホスフアターゼ処理をした。
アルカリホスフアターゼ処理したDNAをフエノ
ール処理することにより、共存する酵素タンパク
質を変性除去し、その後エタノールでDNAを沈
澱させた。沈澱したDNAを70%エタノールで洗
つた後、エタノールを除き、減圧下に沈澱を乾燥
させた。BamHI及びSalIによるDNAの切断、ア
ルカリホスフアターゼ処理、フエノール処理、お
よびエタノール沈澱の各操作は、いずれも、
“Molecular Cloning A Loboratory Manual”
(T.Maniatis.E.Fritsch、J.SambrooK、eds.Cold
Spring Harbor Laboratory(1982)、以下、文献
1と呼ぶ。)に記載している方法に従つて行つた。
乾燥させたDNAを50μのリガーゼ用反応液
(10mM Tris−HCl、PH7.4、5mM MgCl2、
10mMジチオトレイトール、5mM ATP)に
溶解後、5μのDNA1を加え、これに1ユニツ
トのT4−DNAリガーゼを加えて、10℃で、14時
間DNAの連結反応を行わせた。この反応物を、
形質転換法(transformation method、上記文献
1に記載)に従つて、大腸菌に取り込ませた。こ
の処理をした菌体を、50mg/mlのアンピシリンナ
トリウムおよび10mg/mlのトリメトプリムを含む
栄養寒天倍地(倍地1中に、2gのグルコー
ス、1gのリン酸2カリウム、5gのイーストエ
キス、5gのボリペプトン、15gの寒天を含む。)
上に塗布し、37℃で24時間培養することにより、
約15個のコロニーを得ることができた。これらの
コロニーから適当に8個選び、1.5mlのYT+Ap
倍地(倍地1中に、5gのNaCl、5gのイー
ストエキス、8gのトリプトン、50mgのアンピシ
リンナトリウムを含む。)で、37℃、1晩、菌体
を培養した。培養液を、各々エツペンドルフ遠心
管にとり、12000回転/分で10分間遠心分離し、
菌体を沈澱として集めた。これに、0.1mlの電流
泳動用サンプル調製液(0.0625MのTris−HCl、
PH6.8、2%のラウリル硫酸ナトリウム(SDS)、
10%のグリセリン、5%の2−メルカプトエタノ
ール、0.001%のブロムフエーノルプルーを含
む。)を加え、菌体を懸濁し、これを沸騰水中に
5分間保ち、菌体を溶かした。この処理をしたサ
ンプルをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法(U.K.Lammli;Nature、Vol.227、p680
(1970))に従つて分析した。標準サンプルとして
pTP104−4を含有する大腸菌に同様の処理をし
たもの、および分子量マーカーとしてラクトアル
ブミン(分子量14200)、トリプシンインヒビター
(分子量20100)、トリプシノーゲン(分子量
24000)、カルボニツクアンヒドラーゼ(分子量
29000)、グリセロアルデヒド3−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ(分子量36000)、卵アルブミン(分子量
45000)および牛血清アルブミン(分子量66000)
を含むサンプルをポリアクリルアミド濃度の10か
ら20%濃度勾配ゲルで泳動した。その結果、8個
のコロニーのうち、7個ではpTP104−4の
DHFRのバンドが消失し、それより明らかに分
子量が大きくなつたタンパク質(分子量約22000
と推定される。)を新たに生産していること、残
りの1個のコロニーは、pTP104−4のDHFRと
ほぼ同じ大きさのタンパク質を生産すること、
pT104−4のDHFR(分子量18379)は、この条件
で分子量約21000のタンパク質として泳動するこ
とが明らかになつた。分子量の大きい新たなタン
パク質を生産するコロニーのうちから適当に一つ
選び、これをYT+Ap倍地で培養し、Tanakaと
Weisblumの方法(T.Tanaka、B.Wejsblum;J.
Bacteriogy、vol.121、p.354(1975))に従つて、
プラスミドを調製した。得られたプラスミドを
pLEK1と名づけた。pLEK1は、pTP104−4の
BamHIとSalI部位の間の配列が合成DNAと置き
換わつた構造をしているはずである。合成DNA
には、制限酵素MluIで切断認識される配列、
5′−ACGCGT−3′が含まれているので、MluIで
pLEK1の切断を試みたところ、確かに切断され
た。また、pLEK1のEcoRI(第1図の471−476番
目の配列)とPvu(第1図の1563−1568番目の
配列)による切断によつて得られる約11100ヌク
レオチド長のDNAについて、M13フアージを用
いたジデオキシ法(J.Messing;Mehtods in
Enzymology、vol.101、p、20(1983)に従つて、
EcoRからPvuの方向に塩基配列を決定した。
その結果、第1図の示すpLEK1の全塩基配列の
471番目から約850番目迄の配列が確かめられた。
pTP104−4の塩基配列は、本発明者らによつ
て明らかにされている(特開平1−144979号公
報)。pLEK1のBamH−Salの配列は、
pTP104−4のBamH−Salの間の294ヌクレ
オチド長の配列が、LEKを暗号化する配列とし
て設計・合成した34ヌクレオチド長の配列に置き
換わつた配列であつた。
また、pLEK1のBamH−SalI切断によつて
得られる約4.2キロ塩基対のDNAは、EcoR、
Pst、Hind、Hpa、Aat、Pvu、Bgl
、およびClaを用いた制限酵素による切断実
験の結果、pTP104−4のBamH−SalI切断に
よつて得られる約4.2キロ塩基対のDNAと全く同
一であることが示された。
以上の結果からpLEK1の全塩基配列が第1図
に示した配列であることが決められた。
実施例 2
pLEK1を含有する大腸菌が作るDHFR−LEK
pLEK1を含有する大腸菌が作るDHFR−LEK
のアミノ酸配列は、DHFR−LEK遺伝子の塩基
配列から予想することができる。第1図の57番目
から557番目の配列がDHFR−LEKを暗号化して
いることから、トリプレツト暗号表を用いて、ア
ミノ酸配列を推定した。その結果第2図に示すア
ミノ酸配列が得られた。pLEK1を含有する大腸
菌から、DHFR−LEKを分離精製し、精製した
タンパク質を用いて、以下のように確認した。
DHFR−LEKの精製
A 用いた菌体量:湿重量 8g
B 酵素精製表(表における精製過程は無細胞
抽出液、DEAE−トヨパールカラム処理、
メソトリキセート結合アフイニテイクロマトグ
ラフイー、およびDEAE−トヨパールカラム
クロマトグラフイーを表わす。
Industrial Application Field The present invention relates to leucine enkephalin (tyrosine Tyr-
Glycine Gly - Glycine Gly - Phenylalanine
A peptide consisting of a 5-amino acid sequence of Phe-leucine and Leu, hereinafter abbreviated as LEK. ), a novel recombinant plasmid pLEK1 that enables large-scale production of fusion proteins containing pLEK1, E. coli containing pLEK1, and LEK
Dihydrofolate reductase-LEK fusion protein (hereinafter referred to as DHFR) has
-Abbreviated as LEK. ), DHFR-LEK separation and purification method,
and a method for manufacturing LEK. The novel recombinant plasmid pLEK1 of the present invention has the DNA sequence shown in FIG. The present invention
Suitable for fields such as fermentation industry and pharmaceutical industry. Prior Art LEK is known as an endogenous peptide that exhibits morphine-like analgesic effects, and is an interesting bioactive peptide that is expected to be used as a non-addictive analgesic or anesthetic. The technical background of the present invention is so-called genetic manipulation technology. As an efficient method for producing LEK using genetic manipulation, the present inventors developed Bacillus subtilis dihydrofolate reductase (hereinafter referred to as
Abbreviated as DHFR. ) Method of using genes (JP-A-Sho
No. 63-102698), but nothing else is known. The method using the DHFR gene of Bacillus subtilis increases the expression efficiency of the DHFR gene derived from Bacillus subtilis in E. coli, introduces a chemically synthesized LEK gene into the EcoRI cleavage site of the DHFR gene, and generates the DHFR gene derived from Bacillus subtilis (hereinafter referred to as As a fusion protein in which LEK is fused to the carboxy terminal side of DHFR bs ),
After separating and purifying the fusion protein by producing it in Escherichia coli (Japanese Unexamined Patent Publication Nos. 63-87981 and 1988-102696), LEK on the carboxy-terminal side was specifically cleaved, and high-performance liquid chromatography (hereinafter referred to as ,
Abbreviated as HPLC. ) is used for separation and purification. The problem with this method is that the amount of DHFR bs -LEK produced by E. coli accumulated in the bacteria is
It accounts for at most a few percent of the bacterial protein,
There are some points that need to be improved in terms of production efficiency. On the other hand, the present inventors have already discovered that E. coli-derived
Regarding the DHFR gene, modification of the gene results in a plasmid vector for heterologous gene expression.
pTP70-1 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 63-46193) and
We are developing pTP104-4 (Japanese Patent Application No. 302157/1982) and a method for creating fusion genes using these expression vectors (Japanese Patent Application Laid-Open No. 144992/1999). When these methods are used, the amount of the fusion protein obtained as a result of the expression of the fusion gene accumulated in E. coli cells is expected to be approximately 20% of the total cell protein. However, there is no example of using the above expression vector for the production of LEK. Purpose of the invention The purpose of the present invention is to solve problems in terms of production efficiency.
The purpose of this project is to improve the method for producing LEK using the DHFR bs gene and develop an efficient method for producing LEK using genetic manipulation. The present inventors have already demonstrated that (1) even if the carboxy-terminal sequence of E. coli DHFR is changed, Bacillus subtilis
Similar to DHFR, enzyme activity is not lost, (2)
Plasmid vector pTP104-4 that makes it possible to fuse a heterologous peptide to the carboxy-terminal side of E. coli DHFR (Japanese Patent Application Laid-Open No. 144979/1999)
(4) modified DHFR on pTP104
It has been revealed that the gene is efficiently expressed in E. coli. The present inventors took advantage of the above knowledge and, as a result of intensive research, used pTP104-4 to express the LEK gene.
It was revealed that DHFR-LEK could be efficiently produced by expressing it in fusion with DHFR, and the present invention was completed based on the results. Structure of the Invention The present invention provides (1) a novel recombinant plasmid pLEK1 that enables large-scale expression of DHFR-LEK;
(3) DHFR-LEK produced by E. coli containing pLEK1, (4) Isolation and purification of DHFR-LEK from E. coli containing pLEK1, and (5) LEK using DHFR-LEK. The manufacturing method is constituted by the invention. (1) Novel recombinant plasmid pLEK1 Figure 1 shows the entire base sequence of pLEK1 of the present invention. The figure shows that only one DNA strand sequence of the double-stranded circular DNA is cut by the restriction enzyme ClaI, which is the only one in the plasmid.
The first "A" of ATCGAT-3' is counted as number 1 and is written in the direction from the 5' end to the 3' end. pLEK1 of the present invention is a novel recombinant plasmid. pLEK1 has a size of 4207 base pairs and can confer trimethoprim and ampicillin resistance to the host E. coli. pLEK1 is pTP104-4 BamHI and
It has a structure in which the larger 4173 base pair DNA fragment obtained by SalI cleavage is joined to a 34 base pair chemically synthesized DNA containing the sequence encoding LEK. In Figure 1, 533rd to 566th
The sequence up to No. 1 is a sequence derived from chemically synthesized DNA.
The other sequences are derived from pTP104-4. Restriction enzymes are used to sequence chemically synthesized DNA.
MluI recognition cleavage site, 5′-ACGCGT-3′ (first
The arrays from 560th to 565th in the figure) are included. The part derived from pTP104-4 contains MluI
Part does not exist. From the BamHI site of pLEK1 (sequence from 532nd to 537th in Figure 1)
By replacing the sequence up to the MluI site with another sequence, heterologous DNA can be introduced in a defined direction, and a fusion gene with the DHFR gene can be easily created. The array from 57th to 557th in Figure 1 is as follows:
It encodes DHFR-LEK, in which LEK is bound to the carboxy-terminal side of DHFR via methionine. Upstream of the sequence encoding DHFR-LEK,
There is a sequence that allows efficient expression of the DHFR-LEK gene (Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-46193).
In other words, the sequence from 43rd to 50th is called the SD sequence, which is useful for efficient translation and
Positions 4165 to 4193 are the consensus transcription promoter and contribute to efficient transcription. From this, pLEK1 produces a large amount of DHFR-LEK when introduced into E. coli.
The produced DHFR-LEK accumulates in a soluble state within the bacterial body, accounting for approximately 20% of the bacterial protein. As a result, E. coli harboring pLEK1 becomes resistant to trimethoprim. Furthermore, pLEK1 has a gene derived from pTP104-4 that confers resistance to ampcillin. From this, E. coli into which pLEK1 has been introduced also exhibits resistance to ampicillin. pLEK1 is
introduced into E. coli and kept in a stable state,
E. coli containing pLEK1 was sent to the Microtech Institute.
It has been deposited as FERMBP-1818. pLEK1 having such features can be constructed according to Example 1, but the present invention is not limited by the method for constructing the recombinant plasmid. (2) E. coli containing pLEK1 E. coli containing pLEK1 shows resistance to trimethoprim and ampicillin.
E. coli containing pLEK1 is
As a result of efficient expression of the DHFR-LEK gene,
DHFR-LEK accumulates in large amounts in a soluble state within the bacterial body. YT+ E. coli containing pLEK1
When cultured to stationary phase at 37°C using Ap medium (a liquid medium containing 5 g of NaCl, 8 g of tryptone, 5 g of yeast extract, and 50 mg of oripicillin sodium in 1 liter of medium), The accumulated DHFR-LEK accounts for approximately 20% of the bacterial protein.
reach. When cultured bacterial cells are suspended in an appropriate buffer such as phosphate buffer, disrupted using the French press method or sonication method, and separated into supernatant and precipitate using centrifugation, almost all of the
DHFR-LEK is recovered in the supernatant. pLEK1
Escherichia coli containing FERMBP-
Deposited as 1818. (3) DHFR-LEK Figure 2 shows the DNA sequence encoding DHFR-LEK and the amino acid sequence of the protein predicted to be made from it.
DHFR-LEK is a novel protein consisting of 167 amino acids. Counting from the amino terminal side,
The sequence from positions 1 to 159 is the wild type of E. coli.
This is a sequence in which one amino acid substitution has occurred in DHFR (Cys-152 (wild type) → Glu-152), and the sequence from positions 162 to 167 is LEK. The amino acid immediately preceding the LEK sequence is methionine (Met). This allows DHFR
−By processing LEK with Bromsian,
LEK can be specifically excised. Isoleucine at position 160 and arginine at position 161
Arg is a sequence generated to match the reading frame of the genetic code when introducing DNA encoding LEK into the BamHI site of pTP140-4. DHFR produced by pTP104-4 consists of 162 amino acids, counting from the amino terminal side of the amino acid sequence of DHFR-LEK in Figure 2.
The sequence from positions 1 to 160 is a combination of two amino acid sequences of Gln-lle.
The molecular weight of DHFR-LEK is 18,963. DHFR-LEK has DHFR oxygen activity even though it has a structure in which LEK is fused to the carboxy terminal side of DHFR. Therefore, when E. coli produces large amounts of DHFR-LEK,
They become resistant to trimethoprim, a DHFR inhibitor and antibacterial agent. (4) Separation and purification of DHFR-LEK The method for separating and purifying DHFR-LEK of the present invention is as follows:
It consists of the following steps: culture of bacterial cells, disruption of bacterial cells, DEAE-Toyopearl column treatment, mesotrixate (MTX)-conjugated affinity chromatography, and DEAE-Toyopearl column chromatography. Cultivation of bacterial cells Culture of E. coli containing pLEK1 is carried out using YT+
Ap medium (in medium 1, 5g NaCl, 8g
of tryptone, 5g, yeast extract and
Liquid medium containing 50mg ampicillin sodium. ) can be cultured. As a double land, ST+Ap double land (in double land 1,
Liquid medium containing 2g glucose, 1g dipotassium phosphate, 5g polypeptone, 5g yeast extract and 50mg ampicillin sodium. ), any medium can be used as long as it allows bacterial growth, but as far as we have investigated, YT+Ap medium is optimal for producing DHFR-LEK. E. coli containing pLEK1 is brought into contact with the medium and cultured at 37°C until the late logarithmic growth phase or stationary phase. Depending on the culture temperature,
The amount of DHFR-LEK accumulated varied, and as far as we investigated, the higher the culture temperature, the greater the amount accumulated. The cultured bacterial cells are collected by centrifugation at 5000 rpm. Bacterial cells with a wet weight of 2 to 4 g are obtained from the double base 1. Bacterial collection and subsequent operations are performed at low temperatures (between 0 and 10°C, preferably 4°C) unless otherwise specified. Disruption of bacterial cells The bacterial cells obtained by culturing were suspended in buffer solution 1 (10 mM potassium phosphate buffer containing 0.1 mM sodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA), PH 7.0) at 3 times the wet weight, Crush the bacterial cells using a French press. Centrifuge the cell suspension at 5000 rpm for 10 minutes to obtain a supernatant. Furthermore, the supernatant is subjected to ultracentrifugation at 35,000 rpm for 1 hour to obtain a supernatant (cell-free extract). DEAE-Toyopearl column treatment This operation is performed for the purpose of pretreatment for the next purification process. Prepare cell-free extract at 0.1M in advance.
Apply to a DEAE Toyopearl column equilibrated with Buffer 1 containing 0.1M KCl, and wash the column with Buffer 1 containing 0.1M KCl. Enzyme elution is
Perform using buffer 1 containing 0.3M KCl.
Fractionate a certain amount of the eluate using a fraction collector. About the fractionated eluate
Measure DHFR activity and collect fractions containing enzyme activity. MTX-bound affinity chromatography The enzyme solution obtained by the above procedure was pre-equilibrated with buffer 1 and then MTX-bound
Adsorb onto Sepharose affinity column. After adsorption, buffer 2 (0.1
Wash with 10 mM potassium phosphate buffer containing mM EDTA, pH 8.5). For washing, measure the absorbance of the eluate from the column at 280 nm, and continue to flow the same buffer until the absorbance becomes 0.1 or less. Elution of the enzyme is performed using Buffer 2 containing 1M KCl and 3mM folic acid, and the eluate is fractionated in fixed amounts using a fraction collector. DHFR for fractionated eluate
Measure the activity and collect fractions containing enzyme activity. The obtained enzyme solution is dialyzed against buffer solution 1 three times. At this stage, DHFR-LEK with a purity of 90% or more is obtained. DEAE-Toyopearl column chromatography The dialyzed enzyme solution is adsorbed onto a DEAE-Toyopearl column equilibrated with buffer solution 1 in advance. After adsorption, wash with buffer 1 containing 0.1KCl. Wash the eluate from the column at 280n
Measure the absorbance of m and continue to flow the same buffer until the absorbance becomes 0.01 or less. Enzyme elution was performed using buffer 1 with 0.1M to 0.3M KCl.
The eluate is fractionated into fixed amounts using a fraction collector. The absorbance at 280 nm and DHFR activity of the fractionated eluate are measured. Enzyme activity/
Collect fractions with constant absorbance value at 280 nm. Through the above operations, DHFR-LEK can be highly purified and homogenized with good reproducibility. According to the invention, the purification of DHFR-LEK consists of
It can be done within a week including culturing,
Uniform enzyme preparations can be obtained with a recovery rate of 50% or more. To measure DHFR enzyme activity, take the reaction solution (0.05mM dihydrofolic acid, 0.06mM NADPH, 12mM 2-mercaptoethanol, 50mM phosphate buffer (PH7.0)) into a 1ml cuvette, and add the enzyme solution to it. In addition, this is done by measuring the change in absorbance over time at 340 nm. One unit of enzyme is defined as the amount of enzyme required to reduce 1 micromole of dihydrofolate per minute under the above reaction conditions. This measurement can be easily performed using a spectrophotometer. (5) Production of LEK using DHFR-LEK The purified DHFR-LEK was freeze-dried, and 7% was added to it to give a concentration of 1 to 10 mg protein/ml.
After adding and dissolving formic acid, approximately 20% of the protein amount
Add twice the amount of crystalline bromic cyanide, cap tightly, and react for 24 hours with stirring at room temperature under a nitrogen atmosphere. After diluting the reaction solution 10 times with water, lyophilize to remove excess reagent. Dissolve the dried sample in 30% acetic acid to give 1 to 10 mg protein/ml.
The dissolved sample was transferred to an HPLC device (Shimadzu LC-4A,
inertsil-ODS column) using a concentration gradient of 15% to 50% acetonitrile in 0.1% trifluoroacetic acid. Eluates can be detected by measuring absorbance at 220 nm. FIG. 3 shows a high performance liquid chromatogram of a DHFR-LEK sample treated with bromocyanide. The peak 17 minutes after sample injection is LEK. Separate this peak fraction. After drying the separated eluate using an evaporator, LEK can be obtained by adding a small amount of water and freeze-drying to remove the solvent. Also,
The amino acid composition of the obtained peptide can be confirmed by acid hydrolysis and amino acid analysis. In the example of the present invention, bacterial cells with a wet weight of about 8 g were obtained from the medium No.
including. ), approximately 43 mg of DHFR-LEK (yield,
50.6%, calculated to contain approximately 1.26 mg of LEK. ) can be obtained by purifying 10 mg of DHFR−LEK.
About 0.16 mg of LEK could be obtained by separating and purifying it by HPLC after decomposing it with bromocyanide. Next, examples and reference examples of the present invention will be shown. Example 1 Creation of pLEK1 The DNA encoding LEK is 1 5'-
GATCCGTATGTACGGTGGTTTCCTGTA
ACGCGTG-3' 2 5-
TCGACACGCGTTACAGGAAACCACCGT
DNA consisting of two 34 nucleotides of ACATACG-3' was chemically synthesized according to the phosphoramidite method, and after purification, the 5' end of each DNA was phosphorylated using polynucleotide kinase. Approximately 0.1ml of phosphorylated DNA
(contains about 0.01 μg of DNA) and incubating it at 60°C.
The DNA was annealed (this is called DNA1). Approximately 1 μg of pTP104-4 was digested with BamHI and SalI and then treated with alkaline phosphatase.
The alkaline phosphatase-treated DNA was treated with phenol to denature and remove coexisting enzyme proteins, and then the DNA was precipitated with ethanol. After washing the precipitated DNA with 70% ethanol, the ethanol was removed and the precipitate was dried under reduced pressure. The operations of DNA cleavage with BamHI and SalI, alkaline phosphatase treatment, phenol treatment, and ethanol precipitation are all
“Molecular Cloning A Loboratory Manual”
(T.Maniatis.E.Fritsch, J.SambrooK, eds.Cold
Spring Harbor Laboratory (1982), hereinafter referred to as Document 1. ).
The dried DNA was mixed with 50μ of ligase reaction solution (10mM Tris-HCl, PH7.4, 5mM MgCl2,
After dissolving in 10mM dithiothreitol, 5mM ATP), 5μ of DNA1 was added, 1 unit of T4-DNA ligase was added thereto, and the DNA ligation reaction was carried out at 10°C for 14 hours. This reactant,
It was introduced into E. coli according to the transformation method (described in Document 1 above). The treated cells were transferred to a nutrient agar medium containing 50 mg/ml ampicillin sodium and 10 mg/ml trimethoprim (in medium 1, 2 g glucose, 1 g dipotassium phosphate, 5 g yeast extract, 5 g of voripeptone and 15g of agar).
By coating on the top and culturing at 37℃ for 24 hours,
Approximately 15 colonies were obtained. Select 8 colonies from these colonies and add 1.5ml of YT+Ap.
The bacterial cells were cultured overnight at 37°C in a medium (medium medium 1 contains 5 g of NaCl, 5 g of yeast extract, 8 g of tryptone, and 50 mg of ampicillin sodium). Transfer each culture solution to an Etzpendorf centrifuge tube, centrifuge at 12,000 rpm for 10 minutes,
The bacterial cells were collected as a precipitate. Add 0.1 ml of electrophoresis sample preparation solution (0.0625 M Tris-HCl,
PH6.8, 2% sodium lauryl sulfate (SDS),
Contains 10% glycerin, 5% 2-mercaptoethanol, 0.001% bromophenol blue. ) was added to suspend the bacterial cells, and this was kept in boiling water for 5 minutes to dissolve the bacterial cells. This treated sample was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (UK Lammli; Nature, Vol. 227, p680).
(1970)). as standard sample
Escherichia coli containing pTP104-4 was treated in the same way, and the molecular weight markers were lactalbumin (molecular weight 14200), trypsin inhibitor (molecular weight 20100), trypsinogen (molecular weight
24000), carbonic anhydrase (molecular weight
29000), glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (molecular weight 36000), egg albumin (molecular weight
45,000) and bovine serum albumin (molecular weight 66,000)
The samples were run on a 10 to 20% polyacrylamide gradient gel. As a result, 7 out of 8 colonies had pTP104-4.
The DHFR band disappeared and a protein with a molecular weight clearly larger than that (molecular weight approximately 22,000
It is estimated to be. ), and the remaining colony produces a protein approximately the same size as DHFR of pTP104-4.
It was revealed that DHFR of pT104-4 (molecular weight 18379) migrates as a protein with a molecular weight of about 21000 under these conditions. Select one of the colonies that produce a new protein with a large molecular weight, culture it in YT+Ap medium, and mix it with Tanaka.
Weisblum's method (T.Tanaka, B.Wejsblum; J.
Bacteriology, vol.121, p.354 (1975)),
A plasmid was prepared. The obtained plasmid
It was named pLEK1. pLEK1 is pTP104-4
It should have a structure in which the sequence between the BamHI and SalI sites has been replaced with synthetic DNA. synthetic dna
contains a sequence recognized by restriction enzyme MluI,
Since it contains 5′−ACGCGT−3′, use MluI to
When we tried to cleave pLEK1, it was indeed cleaved. In addition, M13 phage was used for approximately 11,100 nucleotides of DNA obtained by cleaving pLEK1 with EcoRI (sequences 471-476 in Figure 1) and Pvu (sequences 1563-1568 in Figure 1). dideoxy method (J.Messing;Mehtods in
According to Enzymology, vol.101, p. 20 (1983),
The nucleotide sequence was determined in the direction from EcoR to Pvu.
As a result, the entire base sequence of pLEK1 shown in Figure 1 was determined.
The sequence from position 471 to approximately 850 was confirmed. The nucleotide sequence of pTP104-4 has been revealed by the present inventors (Japanese Unexamined Patent Publication No. 144979/1999). The sequence of BamH−Sal in pLEK1 is
The 294 nucleotide long sequence between BamH and Sal of pTP104-4 was replaced with a 34 nucleotide long sequence designed and synthesized as a sequence encoding LEK. In addition, approximately 4.2 kilobase pair DNA obtained by BamH-SalI digestion of pLEK1 contains EcoR,
Pst, Hind, Hpa, Aat, Pvu, Bgl
The results of restriction enzyme cleavage experiments using , and Cla showed that the DNA was completely identical to the approximately 4.2 kilobase pair DNA obtained by BamH-SalI digestion of pTP104-4. From the above results, it was determined that the entire base sequence of pLEK1 was the sequence shown in FIG. Example 2 DHFR-LEK produced by E. coli containing pLEK1 DHFR-LEK produced by E. coli containing pLEK1
The amino acid sequence of can be predicted from the base sequence of the DHFR-LEK gene. Since the sequence from 57th to 557th in FIG. 1 encodes DHFR-LEK, the amino acid sequence was deduced using a triplet code table. As a result, the amino acid sequence shown in FIG. 2 was obtained. DHFR-LEK was isolated and purified from E. coli containing pLEK1, and the purified protein was used to confirm as follows. Purification of DHFR-LEK A Amount of bacterial cells used: Wet weight 8 g B Enzyme purification table (The purification process in the table is cell-free extract, DEAE-Toyopearl column treatment,
Represents mesotrixate-linked affinity chromatography, and DEAE-Toyopearl column chromatography.
【表】
DHFR酵素活性は、反応液(0.05mMのジヒド
ロ葉酸、0.06mMのNADPH、12mMの2−メル
カプトエタノール、50mMのリン酸緩衝液(PH
7.0))を、1mlのキユベツトとり、これに酵素液
を加え、340nmの吸光度の時間変化を測定する
ことにより行つた。酵素1ユニツトは、上記反応
条件において、1分間に1マイクロモルのジヒド
ロ葉酸を還元するのに必要な酵素量として定義し
た。
得られた酵素タンパク質をSDS電気泳動法(上
記実施例に記載の方法)により分析したところ、
約22000の単一なタンパク質バンドが示され、得
られた酵素標品が均一であることが示された。
分離精製したDHFR−LEKの性質
精製したDHFR活性を示すタンパク質をエン
ザイムイムノアツセイにより検討したところ、
LEKに対する抗体と反応することが示された。
即ち、精製して得られたタンパク質は免疫学的に
LEKと同等の構造を有することが明らかとなつ
た。
精製して得られたタンパク質のカルボキシ末端
側のアミノ酸配列を明らかにするために、カルボ
キシベプチダーゼYを、精製タンパク質に時間を
変化させて作用させ、遊離してくるアミノ酸を定
量した(カルボキシペプチダーゼ法によるカルボ
キシ末端側のアミノ酸配列の決定法)。その結果、
−Gly−Gly−Leu(カルボキシ末端)であること
が予想された。また、精製して得られたタンパク
質を酸加水分解した後、アミノ酸分析したとこ
ろ、塩基配列の結果予想されるアミノ酸組成と一
致した結果が得られた。
実施例 3
精製分離したDHFE−LEKからのLEKの分離
実施例2で得られた精製タンパク質(約10mg、
約530nmolesのDHFR−LEK)を、凍結乾燥し、
これを2mlの70%蟻酸に溶かし、これに約200mg
のブロムシアンを加え溶かし、窒素雰囲気下、密
栓した後、室温で24時間撹拌しながら反応させ
た。反応後、20mlの水を加え、その後凍結乾燥し
た。凍結乾燥して得られた標品を、、10mlの30%
酢酸に溶かした。そのうちの、0.5ml(約26nm
oleのDHFR−LEKを含むはず)をとり、高速液
体クロマトグフイー装置(島津LC−4A)を用い
lnertsil−ODS5μmカラムで分離した。溶出は0.1
%トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルの濃度勾
配(15%から50%)をかけることにより行つた。
0から2分までは、15%のアセニトリルを用い、
2分から32分までは、15%から50%のアセトニト
リルの直線濃度勾配をかけた。その結果、第3図
に示すような溶出曲線が得られた。試料注入後17
分のピーク画分を分離し、分離した溶出液をエバ
ホレーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し
溶楳を除き、ペプチドを得た。得られたペプチド
を酸加水分解後、その1/2の容をアミノ酸分析に
用いた。その結果、チロシン、グリシン、フエニ
ルアラニン、およびロイシンがそれぞれ、7.2、
14.6、7.1および7.6nmoleずつ検出された。アミ
ノ酸組成は、LEKのそれと一致した値であり、
また分析したヘプチドは、約7.4nmole(約4.1μg)
のLEKを含んでいることが明らかとなつた。こ
の結果を用いると、プロムシアン処理して得られ
たサンプル0.5mlをHPLCを用いて分離すること
により、収率約5.7%(7.4x2nmole/26nmole)
でLEKを回収できること、またこの操作を20回
繰り返得すことにより、10mgのDHFR−LEKか
ら約164μg(4.1x2μgx20)のLEKが得られるこ
とが示される。
また、DHFR−LEKの精製の収率が約50%で
あり、DHFR−LEKからLEKの分離の収率が約
57%であることから、大腸菌がつくるLEKペプ
チド部分の単離収率が、約29%程度であることが
算出される。
発明の効果
上記のように、新規組換えプラスミドpLEK1
は、DHFR−LEKを暗号化しており、かつ
pLEK1を有する大腸菌は、DHFR−LEKを可溶
性の状態で大量に蓄積生産する。さらに、生成し
たDHFR−LEKは、DHFR酵素活性を保持して
おり、精製を容易に行うことができる。本発明の
精製法に従うことにより、DHFR−LEKの精製
を迅速に効率よく行うことができる。また、
DHFR−LEKをブロムシアン処理後、HPLCで
分離することにより、LEKを容易に単離するこ
とができる。このような性質を有することから、
本発明は、DHFR−LEKとそれを利用したLEK
の生産に有益である。
また、pLEK1には、Mlu部位が新たに付け
加えられており、異種遺伝子の発現用ベクターと
して有用であると、考えられる。[Table] DHFR enzyme activity was measured using the reaction solution (0.05mM dihydrofolic acid, 0.06mM NADPH, 12mM 2-mercaptoethanol, 50mM phosphate buffer (PH).
7.0)) was carried out by taking a 1 ml cuvette, adding the enzyme solution thereto, and measuring the change in absorbance at 340 nm over time. One unit of enzyme was defined as the amount of enzyme required to reduce 1 micromole of dihydrofolate per minute under the above reaction conditions. When the obtained enzyme protein was analyzed by SDS electrophoresis (method described in the above example),
Approximately 22,000 single protein bands were shown, indicating that the obtained enzyme preparation was homogeneous. Properties of isolated and purified DHFR-LEK When the purified protein exhibiting DHFR activity was examined by enzyme immunoassay,
It was shown to react with antibodies against LEK.
In other words, the purified protein is immunologically
It was revealed that it has a structure equivalent to that of LEK. In order to clarify the amino acid sequence of the carboxy-terminal side of the purified protein, carboxypeptidase Y was applied to the purified protein at varying times, and the released amino acids were quantified (carboxypeptidase method). method for determining the carboxy-terminal amino acid sequence). the result,
-Gly-Gly-Leu (carboxy terminal) was expected. Furthermore, when the purified protein was subjected to acid hydrolysis and then subjected to amino acid analysis, results were obtained that matched the amino acid composition expected from the base sequence. Example 3 Separation of LEK from purified and separated DHFE-LEK The purified protein obtained in Example 2 (approximately 10 mg,
About 530 nmoles of DHFR-LEK) was freeze-dried,
Dissolve this in 2ml of 70% formic acid and add about 200mg
Bromsyanide was added and dissolved, the mixture was sealed tightly under a nitrogen atmosphere, and the mixture was reacted with stirring at room temperature for 24 hours. After the reaction, 20 ml of water was added and then freeze-dried. 30% of 10ml of the specimen obtained by freeze-drying
Dissolved in acetic acid. Of that, 0.5ml (approximately 26nm
ole (which should contain DHFR-LEK) and using a high-performance liquid chromatograph (Shimadzu LC-4A)
Separation was performed using a lnertsil-ODS 5 μm column. Elution is 0.1
This was done by applying a concentration gradient (15% to 50%) of acetonitrile in % trifluoroacetic acid.
From 0 to 2 minutes, use 15% acenitrile,
From 2 minutes to 32 minutes, a linear concentration gradient of 15% to 50% acetonitrile was applied. As a result, an elution curve as shown in FIG. 3 was obtained. 17 after sample injection
The separated eluate was dried in an evaporator, and then a small amount of water was added and lyophilized to remove the solution to obtain the peptide. After acid hydrolysis of the obtained peptide, 1/2 the volume was used for amino acid analysis. As a result, tyrosine, glycine, phenylalanine, and leucine are respectively 7.2 and
14.6, 7.1 and 7.6 nmole were detected. The amino acid composition is consistent with that of LEK,
The heptide analyzed was approximately 7.4 nmole (approximately 4.1 μg).
It has become clear that it contains LEK. Using this result, the yield is approximately 5.7% (7.4x2nmole/26nmole) by separating 0.5ml of the sample obtained by Promsyan treatment using HPLC.
It is shown that LEK can be recovered with 10 mg of DHFR-LEK by repeating this operation 20 times. In addition, the yield of purification of DHFR-LEK is approximately 50%, and the yield of separation of LEK from DHFR-LEK is approximately
57%, it is calculated that the isolation yield of the LEK peptide moiety produced by E. coli is approximately 29%. Effects of the invention As mentioned above, the novel recombinant plasmid pLEK1
is encrypting DHFR-LEK, and
E. coli carrying pLEK1 accumulates and produces large amounts of DHFR-LEK in a soluble state. Furthermore, the produced DHFR-LEK retains DHFR enzyme activity and can be easily purified. By following the purification method of the present invention, DHFR-LEK can be purified quickly and efficiently. Also,
LEK can be easily isolated by treating DHFR-LEK with bromic cyanide and then separating it by HPLC. Because of these properties,
The present invention is based on DHFR-LEK and LEK using it.
It is beneficial for the production of Furthermore, pLEK1 has a newly added Mlu site, and is considered to be useful as a vector for expression of a heterologous gene.
第1図は、pLEK1の全塩基配列を示した図で
あり、2本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だけ
を、5′末端から3′末端の方向に記述している。図
中符号は、核酸塩基を表し、Aはアデニンを、C
はシトシンを、Gはグアニンを、Tはチミンを示
している。図中番号は、pLEK1に1箇所存在す
る制限酵素Cla切断認識部位、5′−ATCGAT
−3′、の最初の”A”を1番として数えた番号を
示している。
第2図は、pLEK1中に存在するDHFR−LEK
を暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質の
アミノ酸配列を示す図である。図中符号は、核酸
塩基およびアミノ酸を表し、Aはアデニンを、C
はシトシンを、Gはグアニンを、Tはチミンを、
Alaはアラニンを、Argはアルギニンを、Asnは
アスパラギンを、Aspはアスパラギン酸を、Cys
はシステインを、Glnはグルタミンを、Gluはグ
ルタミン酸を、Glyはグリシンを、Hisはヒスチ
ジンを、Ileはイソロイシンを、Leuはロイシン
を、Lysはリジンを、Metはメチオニンを、Phe
はフエニルアラニンを、Proはプロリンを、Ser
はセリンを、Thrはトレオニンを、Trpはトリプ
トフアンを、Tyrはチロシンを、Valはバリンを
示している。図中番号は、1番目のアミノ酸であ
るメチオニンを暗号化するATGコドンの”A”
を1番として数えた番号を示している。
第3図は、ブロムシアン処理したDHFR−
LEK試料の高速液体クロマトグラムを示してい
る。横軸は、試料注入後の時間を分単位で、縦軸
は、220nmの吸光度を任意単位で表現している。
矢印で示したピークがLEKの溶出ピークである。
Figure 1 shows the entire base sequence of pLEK1, with only one DNA strand sequence of the double-stranded DNA described in the direction from the 5' end to the 3' end. The symbols in the figure represent nucleic acid bases, A is adenine, C
indicates cytosine, G indicates guanine, and T indicates thymine. The number in the figure indicates the restriction enzyme Cla cleavage recognition site that exists in pLEK1, 5′-ATCGAT.
-3', the first "A" is counted as number 1. Figure 2 shows DHFR-LEK present in pLEK1.
FIG. 2 is a diagram showing the base sequence of the portion encoding the protein and the amino acid sequence of the protein. The symbols in the figure represent nucleobases and amino acids, A represents adenine, C
stands for cytosine, G stands for guanine, T stands for thymine,
Ala is alanine, Arg is arginine, Asn is asparagine, Asp is aspartic acid, Cys
is cysteine, Gln is glutamine, Glu is glutamic acid, Gly is glycine, His is histidine, Ile is isoleucine, Leu is leucine, Lys is lysine, Met is methionine, Phe
is phenylalanine, Pro is proline, Ser
represents serine, Thr represents threonine, Trp represents tryptophan, Tyr represents tyrosine, and Val represents valine. The number in the diagram is “A” of the ATG codon that encodes the first amino acid, methionine.
It shows the number counted starting from 1. Figure 3 shows DHFR-
High performance liquid chromatogram of LEK sample is shown. The horizontal axis represents the time after sample injection in minutes, and the vertical axis represents the absorbance at 220 nm in arbitrary units.
The peak indicated by the arrow is the LEK elution peak.
Claims (1)
大腸菌にトリメトプリム耐性およびアンピシリン
耐性を与えることができ、4207塩基対の大きさを
有し、下記に示すDNA配列を有する新規組換え
プラスミドpLEK1。 【表】 【表】 【表】 【表】 2 pLEK1を含有する大腸菌。 3 pLEK1を含有する大腸菌が生産し、下記に
示すアミノ酸配列を有するジヒドロ葉酸還元酵素
−ロイシンエンケフアリン融合タンパク質。 【表】 4 pLEK1を含有する大腸菌を培養し、ジヒド
ロ葉酸還元酵素活性を目安に、ジヒドロ葉酸還元
酵素−ロイシンエンケフアリン融合タンパク質
を、培養菌体の無細胞抽出液から、イオン交換カ
ラム処理、メソトリキセート結合アフイニテイカ
ラムクロマトグラフイー、および陰イオン交換カ
ラムクロマトグラフイーを用いて精製することを
特徴とするジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエン
ケフアリン融合タンパク質の分離精製方法。 5 pLEK1を含有する大腸菌の生産するジヒド
ロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケフアリン融合タ
ンパク質をブロムシアン分解法により分離した
後、ロイシンエンケフアリンを分離精製すること
を特徴とするロイシンエンケフアリンの製造方
法。[Claims] 1. A novel recombinant product that is stably replicated in E. coli, can confer trimethoprim resistance and ampicillin resistance to the host E. coli, has a size of 4207 base pairs, and has the DNA sequence shown below. Plasmid pLEK1. [Table] [Table] [Table] [Table] 2 E. coli containing pLEK1. 3. A dihydrofolate reductase-leucine enkephalin fusion protein produced by E. coli containing pLEK1 and having the amino acid sequence shown below. [Table] 4 E. coli containing pLEK1 was cultured, and dihydrofolate reductase-leucine enkephalin fusion protein was extracted from the cell-free extract of the cultured cells using an ion-exchange column, using dihydrofolate reductase activity as a guideline. 1. A method for separating and purifying a dihydrofolate reductase-leucine enkephalin fusion protein, the method comprising purifying it using mesotrixate-coupled affinity column chromatography and anion exchange column chromatography. 5. A method for producing leucine enkephalin, which comprises separating and purifying leucine enkephalin after separating a dihydrofolate reductase-leucine enkephalin fusion protein produced by Escherichia coli containing pLEK1 by a bromcyanic degradation method.
Priority Applications (1)
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---|---|---|---|
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-
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