CN115838745A

CN115838745A - 一种适用于无细胞合成限制性内切酶BsaI的线性DNA模板、体系及其用途

Info

Publication number: CN115838745A
Application number: CN202210262366.0A
Authority: CN
Inventors: 李健; 刘晚秋; 季向阳; 卢屹聪
Original assignee: ShanghaiTech University
Current assignee: ShanghaiTech University
Priority date: 2022-03-16
Filing date: 2022-03-16
Publication date: 2023-03-24

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种适用于无细胞合成限制性内切酶BsaI的线性DNA模板、体系及其用途。一种适于无细胞合成限制性内切酶BsaI的线性DNA模板，所述线性DNA模板依次包括含有启动子的片段、限制性内切酶BsaI的编码基因和含有终止子的片段，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述线性DNA模板不含有限制性内切酶BsaI的酶切位点。本发明的线性DNA模板，能有效防止线性DNA模板被核酸酶降解，其能够适用于任意的体外无细胞蛋白体系且能顺利表达，采用本发明的线性DNA模板进行体外无细胞蛋白合成，获得的限制性内切酶BsaI的纯度高、比活高。

Description

一种适用于无细胞合成限制性内切酶BsaI的线性DNA模板、体系及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种适用于无细胞合成限制性内切酶BsaI的线性DNA模板、体系及其用途。

背景技术

蛋白质合成分为传统的细胞内合成技术和体外无蛋白合成技术。传统的细胞内合成技术是指通过模式生物如细菌、真菌、植物细胞或动物细胞等表达外源基因。而体外无蛋白合成技术是指，以外源的mRNA或DNA为蛋白质合成模板，通过人为控制添加蛋白质合成所需要的底物、能力以及转录和翻译相关蛋白因子等物质，实现目标蛋白质的合成。体外无蛋白质合成无需进行质粒构建、转化、细胞培养、细胞收集和破碎等步骤，是一种相对快速、便捷的蛋白质表达方式。

限制性核酸内切酶是指能识别特定的脱氧核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制性内切酶或限制酶。根据酶的功能特性、大小及反应时所需要的辅因子，限制性内切酶可分为Class I-IV四大类。

Class II类限制性内切酶是四类酶中唯一不需要ATP仅需要Mg²⁺实现切割功能的酶，其识别序列多为较短的回文序列，剪切位点通常即为识别序列，是生物学中应用最为广泛的一类限制性内切酶，目前已有超过630000中Class II限制性内切酶被发现，并有623个被开发成商业化酶制剂。Class II类限制性内切酶又分为Type IIe、Type IIf、Type IIg、Type IIm、Type IIs和Type IIt几个亚类，其中Type IIs类限制性内切酶为单体结构，大小在45-110kDa，识别非回文序列，切割位点位于酶切位点至少两个碱基以外位置。本发明涉及的BsaI即属于Class II Type IIs类限制性内切酶，来源于Bacillusstearothermophilus 6-55，酶切位点如图1，常用于Golden Gate技术。

限制性内切酶作为重组蛋白在异源表达宿主中过表达时，其切割DNA的特性严重抑制宿主正常的生长和重组蛋白的表达，而导致难以获得有生物活性的目的蛋白。国内外对限制性内切酶的表达，通常选择共表达相应甲基化酶或构建含有甲基化酶表达宿主的策略，以相应甲基化酶修饰宿主DNA中的酶切位点保证宿主的正常生长。共表达的策略在一定程度上解决了限制性内切酶BsaI的表达问题，但其步骤相对繁琐蛋白产量相对较低，导致目前商品化BsaI价格偏高。

目前，还未报到采用体外无蛋白合成技术合成限制性内切酶BsaI。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种适用于无细胞合成限制性内切酶BsaI的线性DNA模板、体系及其用途。

本发明的目的之一在于提供，一种适于无细胞合成限制性内切酶BsaI的线性DNA模板，所述线性DNA模板依次包括含有启动子的片段、限制性内切酶BsaI的编码基因和含有终止子的片段，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述线性DNA模板不含有限制性内切酶BsaI的酶切位点。

本发明中，线性DNA模板不含有限制性内切酶BsaI的酶切位点，能有效避免转化时渗漏表达，切割自身质粒所带有的BsaI酶切位点。

本发明中，所述编码基因是根据大肠杆菌密码子优化并去除酶切位点(NNNNN)后获得。经密码子优化的编码基因为本发明经大量人工优化和筛选得到，与经密码子优化软件等常规优化方法得到的序列相比，能够在很好地保证限制性内切酶BsaI的天然活性结构的同时，显著提高BsaI蛋白的表达水平。

根据本发明的技术方案，所述含有启动子的片段中不含有限制性内切酶BsaI的酶切位点。

根据本发明的具体技术方案，所述含有启动子的片段包括启动子和启动子上游序列。具体地，所述含有启动子的基因中的启动子为T7。根据本发明的技术方案，所述含有终止子的片段中不含有限制性内切酶BsaI的酶切位点。

根据本发明的具体技术方案，所述含有终止子的片段包括终止子和终止子下游序列。具体地，所述含有终止子的基因中终止子为T7。

优选地，所述启动子上游序列的长度为2bp-300bp。

优选地，所述终止子下游序列的长度为2bp-300bp。

本发明中的启动子上游序列和终止子下游序列能避免编码基因被核酸酶降解。

根据本发明的技术方案，所述线性DNA模板还含有位于所述编码基因上游或下游的标签，所述标签与所述编码基因可操作性地连接。

根据本发明的具体技术方案，所述标签包括6×His、SUMO、MBP、Strep-tag和Cold-TF factor中的一种或多种。进一步优选地，所述标签为6×His。所述标签位于所述含有启动子的基因和编码基因之间。

根据本发明的具体技术方案，所述线性DNA模板还包括位于所述标签和所述编码基因之间的HRV 3C酶、TEV(Tobacco Etch Virus)蛋白酶和ULP1(Ubl特异性蛋白酶1)，以切除融合标签。

本发明的目的之二在于提供，上文所述的线性DNA模板的构建方法，包括如下步骤：

1-1)合成限制性内切酶编码基因，与非表达载体连接体，扩增获得所述编码基因；

1-2)以含有启动子的质粒为模板，扩增获得所述含有启动子的片段；以含有终止子的质粒为模板，扩增获得所述含有终止子的片段；

1-3)通过融合PCR方法，将步骤1-1)中得到的所述编码基因、步骤1-2)中得到的所述含有启动子的片段和所述含有终止子的片段进行融合，获得所述线性表达模板。

根据本发明的技术方案，步骤1-1)中，所述非表达载体为pUC-GW-Amp。

根据本发明的技术方案，步骤1-1)中，所述扩增时，扩增引物序列包括如SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示序列。

根据本发明的技术方案，步骤1-2)中，所述含有启动子的质粒为pET28a。

根据本发明的技术方案，步骤1-2)中，扩增获得所述含有启动子的基因时，扩增引物序列包括如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示序列。

根据本发明的技术方案，步骤1-2)中，所述含有终止子的质粒为pET28a。

根据本发明的技术方案，步骤1-2)中，扩增获得所述含有终止子的基因时，扩增引物序列包括如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示序列。

根据本发明的技术方案，步骤1-3)中，融合PCR的引物序列包括如SEQ ID No.5和SEQ ID No.8所示序列。

本发明的目的之三在于提供，如上文所述的线性DNA模板在构建适用于无细胞合成限制性内切酶BsaI的体系中的用途。

本发明的目的之四在于提供，一种无细胞合成限制性内切酶BsaI的体系，所述体系包含如上文所述的线性DNA模板。

根据本发明的技术方案，所述体系还包括细胞提取物，所述细胞提取物能够表达所述线性DNA模板。

根据本发明的具体技术方案，所述细胞提取物选自大肠杆菌提取物。

根据本发明的更具体技术方案，所述大肠杆菌选自BL21 Star(DE3)、BL21 Star(DE3)+pG-KJE8、BL21 Star(DE3)+pGro7、BL21 Star(DE3)+pG-Tf2、Rosetta、Rosetta+pG-KJE8、Rosetta+pGro7、Rosetta+pG-Tf2中的一种或多种。在某个优选的实施方式中，所述大肠杆菌为BL21 Star(DE3)。

根据本发明的具体技术方案，以体系的总质量为基准计，所述线性DNA模板的浓度为3～9μM。

根据本发明的具体技术方案，浓度可以为3～6μM，也可以为5～7μM，也可以为6～9μM。在某个优选的实施方式中，为6μM。

本发明的目的之五在于提供，一种限制性内切酶BsaI的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

至少采用如上文所述的线性DNA模板或如上文所述的体系进行合成反应，得到所述的限制性内切酶BsaI。

根据本发明的技术方案，所述反应的温度为15～37℃。

根据本发明的具体技术方案，所述反应的温度可以为15～25℃，也可以为20～35℃，也可以为30～37℃。在某个优选的实施方式中，为30℃。

根据本发明的技术方案，所述反应的时间为2～8h。

根据本发明的具体技术方案，所述反应的时间为2～6h，也可以为3～6h，也可以为5～8h。在某个优选的实施方式中，为6h。

根据本发明的技术方案，所述反应后还包纯化的步骤，所述纯化选自亲和层析纯化、离子交换层析纯化和凝胶色谱层析纯化中的一种或多种。

根据本发明的具体技术方案，所述纯化包括亲和层析纯化和凝胶色谱层析纯化。

Ni-NTA亲和层析纯化是一种依据生物大分子与配体可逆的专一性结合的原理，从而专一的分离特异的生物大分子的层析***。Ni NTA Beads 6FF可以与带6×His(组氨酸)标签的目的蛋白质结合，使用低浓度咪唑除去未与Beads结合的杂蛋白，使用高浓度咪唑洗脱下目的蛋白，达到分离纯化限制性内切酶BsaI的目的。本发明使用50mM低浓度咪唑除去杂蛋白，使用500mM高浓度咪唑洗脱目的蛋白，可更高效地得到初步纯化的限制性内切酶BsaI。

优选地，所述亲和层析纯化使用的用于洗脱杂蛋白的缓冲液包括如下组分：40mMTris，500mM NaCl，50mM咪唑，pH7.5。

优选地，所述亲和层析纯化使用的用于洗脱目的蛋白的缓冲液包括如下组分：40mM Tris，500mM NaCl，500mM咪唑，pH7.5。

优选地，所述凝胶色谱层析纯化使用的洗脱目的蛋白的缓冲液包括如下组分：20mM Tris，500mM NaCl，1mM DTT，pH7.5。

通过上述亲和层析纯化和凝胶色谱层析纯化获得的BsaI蛋白的纯度高，且整个纯化过程仅需5-6h，避免了长时间纯化过程导致的酶活性降低，更有利于酶产量和活性的提高。经上述纯化后，BsaI能够达到分子生物学实验纯度要求。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明提供了一种适用于无细胞合成限制性内切酶BsaI的线性DNA模板，能够适用于任意的体外无细胞蛋白体系，且能顺利表达，并且能有效防止线性DNA模板被核酸酶降解；该线性模板的制备简单快捷，无需常规的质粒构建，因而采用本发明的线性DNA模板进行体外无细胞蛋白合成，获得的限制性内切酶BsaI的纯度高、比活高。

2)本发明还提供了一种适用于无细胞合成限制性内切酶BsaI的体系，能提高无细胞合成限制性内切酶BsaI的产量，同时提升了限制性内切酶BsaI合成的反应速率。

3)本发明还提供了无细胞合成限制性内切酶BsaI的方法，该方法很好地解决了限制性内切酶BsaI对表达宿主毒性抑制的难题，合成反应时间短，效率高，得到的限制性内切酶BsaI的比活与商业酶相似，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1显示为本发明实施例1中限制性内切酶BsaI的酶切位点示意图。

图2显示为本发明实施例1中载体pUC-GW-Amp的谱图。

图3显示为本发明实施例1中质粒pET28a的谱图。

图4显示为本发明实施例2中的可溶表达蛋白和全菌表达蛋白中限制性内切酶His-BsaI的Western Blotting检测结果图。其中，S代表可溶表达蛋白；T代表全菌表达蛋白。

图5显示为本发明实施例2中质粒pJL1_sfGFP的图谱。

图6显示为本发明实施例2中无细胞反应体系中限制性内切酶BsaI的活性检测结果图。其中，BsaI+sfGFP代表实验组，共表达质粒pJL1_sfGFP和线性DNA模板T7promoter-BsaI-T7terminator；sfGFP代表阴性对照组，仅表达质粒pJL1_sfGFP。

图7显示为本发明的实施例3中限制性内切酶His-BsaI经亲和层析柱后的流穿液、洗杂缓冲液和洗脱缓冲液的SDS-PAGE图。其中，FT(Flow through)为流穿液，W(Washedsample)为洗杂缓冲液，Eluate为洗脱缓冲液，M为Marker。

图8为显示为本发明的实施例3中经过凝胶色谱纯化后的BsaI蛋白的SDS-PAGE图。其中，M为Marker；BsaI为经凝胶色谱后的纯化后的BsaI蛋白。

图9为显示为本发明的实施例3中商业BsaI和不同浓度BsaI蛋白进行酶切实验的电泳图。其中，NC代表质粒pJL1_sfGFP，PC代表商业化BsaI，1代表浓度为0.45×10^-1mg/mLBsaI、2代表0.45×10^-2mg/mL BsaI、3代表0.45×10^-3mg/mL BsaI和4代表0.45×10^-4mg/mLBsaI。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

以下通过具体的限制性内切酶BsaI制备的具体实施例对本发明作进一步阐述。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照试剂、仪器商家所建议的条件。所采用的试剂，若无特殊说明，均为市售或公开渠道可以获得的试剂。

本发明的下述实施例中，所用缓冲液的按照如下配制获得：

S30缓冲液：10mM三异丙基乙磺酰(Tris)-醋酸，14mM醋酸镁，60mM醋酸钾，2mM二硫苏糖醇(DDT)，pH＝8.2。

平衡缓冲液：Tris 40mM，NaCl 500mM，咪唑0.5mM，pH7.5。

洗杂缓冲液：Tris 40mM，NaCl 500mM，咪唑50mM，pH7.5。

洗脱缓冲液：Tris 40mM，NaCl 500mM，咪唑500mM，pH7.5。

脱盐缓冲液：Tris 40mM，NaCl 500mM，二硫苏糖醇1MM，pH7.5。

实施例1线性DNA模板T7promoter-BsaI-T7terminator的构建

本实施例中，构建并获得线性DNA模板T7promoter-BsaI-T7terminator，包括如下：

1、BsaI的基因合成

限制性内切酶BsaI的DNA序列如SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，限制性内切酶BsaI的DNA序列是根据大肠杆菌密码子优化并去除酶切位点(NNNN)后获得，酶切位点的示意图见图1所示。

2、适用于无细胞表达制备限制性内切酶Bsal的线性DNA模板

将步骤1获得的限制性内切酶BsaI的DNA序列合成至载体pUC-GW-Amp，得到含有BsaI编码基因的载体pUC-BsaI-Amp，其中载体pUC-GW-Amp的图谱见图2所示；进一步构建适用于无细胞合成限制性内切酶BsaI的线性DNA模板。包括如下步骤：

1)以质粒pUC-BsaI-Amp为模板，引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4进行扩增，扩增获得BsaI编码基因，同时在BsaI编码基因的N端引入6×His纯化标签序列和蛋白酶HRV 3C酶切位点序列，HRV 3C酶切位点序列以便纯化时切除N端的6×His标签，最终获得N端带有6×His标签和HRV 3C酶切位点的BsaI片段；

2)以质粒pET28a为模板，引物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，扩增并得到T7启动子上游序列+T7启动子；其中，质粒pET28a的图谱见图3；上游序列能有效防止线性DNA模板被核酸酶降解，上游序列不限于本实施例中的序列；

3)以质粒pET28a为模板，引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8，扩增并得到T7终止子+T7终止子下游序列；下游序列能有效防止线性DNA模板被核酸酶降解，下游序列不限于本实施例中的序列；

4)以引物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.8，通过融合PCR方法，将步骤1)得到的N端带有标签6×His和HRV 3C酶切位点的BsaI片段、步骤2)得到的T7启动子上游序列+T7启动子以及步骤3)得到的T7终止子+T7终止子下游序列，进行融合获得适用于无细胞合成限制性内切酶BsaI的线性DNA模板，标记为T7promoter-BsaI-T7terminator。

实施例2限制性内切酶BsaI的无细胞表达和活性鉴定

本实施例中，进行限制性内切酶BsaI的无细胞表达和活性鉴定，包括如下：

1、细胞提取物的制备

以大肠杆菌BL21 Star(DE3)菌株为宿主，活化后挑取单菌落于20mL的LB培养基中，于32℃和220rpm过夜培养；以初始OD600≈0.05的接种量转接至1L 2×YPTG培养基中，于34℃和220rpm培养至OD600≈0.8，添加0.5mM IPTG诱导T7 RNA聚合酶，继续培养2.5-3h至OD600>2.5；于4℃和5000g离心15min，收集菌体，用S30缓冲液重悬洗涤菌体3次，得到菌体。

菌体称重，1g菌体加入1mL S30缓冲液，涡旋重悬，得到菌悬液；1.4mL菌悬液置于1.5mL离心管中超声破碎，破碎程序为：50％功率，10s超声10s暂停，至能量达到600-620J；然后于4℃和12000g离心10min，取上清；上清于4℃和10000g离心10min，获得的上清即为细胞提取物。将细胞提取物于-80℃冻存备用。

2、限制性内切酶BsaI的表达

配制15μL的无细胞反应体系：12mM谷氨酸镁，10mM谷氨酸氨，130mM谷氨酸钾，1.2mM三磷酸腺苷(ATP)，0.85mM三磷酸鸟苷(GTP)，0.85mM三磷酸尿苷(UTP)，0.85mM三磷酸胞苷(CTP)，34μg/mL亚叶酸，170μg/mL大肠杆菌tRNA混合物，2mM 20种必需氨基酸(每种氨基酸的浓度均为2mM)，0.33mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，0.27mM辅酶A(CoA)，1.5mM亚精胺，1mM腐胺，4mM草酸钠，33mM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，实施例1构建的5μM线性DNA模板，占无细胞反应体系总体积27％的本实施例步骤1得到的细胞提取物。

将配制好的15μL无细胞反应体系于30℃反应6h，获得反应产物。设立两个平行对照组，标记为实验组1和实验组2。

3、Western Blotting蛋白鉴定

实验组1得到的反应产物作为全菌表达蛋白(T，total)；实验组2得到的反应产物于13000g离心10min取上清，作为可溶表达蛋白(S，soluble)。

在全菌表达蛋白和可溶表达蛋白中，分别加入15μL的2×上样缓冲液(上样缓冲液由10％甘油、2.5％十二烷基硫酸钠SDS、1％巯基乙醇和2％溴酚蓝组成)，于98℃加热10min，取10μL进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，恒压下，以150V电泳50min。对照标准蛋白分子量获得目的蛋白分子量为63.7kDa，切取相应分子量大小位置的SDS-PAGE胶转至PVDF膜，75V转膜80min，转膜完成后在封闭液(5％脱脂奶粉溶于1×TBS/T10 mM Tris，150mM NaCl，1％吐温20，pH7.5)中封闭1h，洗净牛奶后将TNET配制的一抗(6×His-标签鼠单克隆抗体)加入膜中，置于4℃摇床将膜孵育过夜。隔日用1×TNET溶液洗膜3次，每次10min；再加入TNET配制的二抗(HRP-羊抗鼠IgG(H+L)抗体)，室温下置于摇床中孵育1h，用1×TNET溶液洗膜3次，每次10min。最后使用Odyssey成像***进行发色显影。

图4为本实施例中的可溶表达蛋白和全菌表达蛋白中限制性内切酶BsaI的Western Blotting检测结果图。其中，S代表可溶表达蛋白；T代表全菌表达蛋白。

从图4可知，全菌表达蛋白和可溶表达蛋白均有限制性内切酶BsaI的表达。

4、检测限制内切酶BsaI的酶活

质粒pJL1_sfGFP的T7启动子区含有BsaI酶切位点，故以质粒pJL1_sfGFP为限制内切酶BsaI的底物。其中，质粒pJL1_sfGFP的图谱见图5。

以200μL离心管为反应容器，在15μL的无细胞反应体系中共表达pJL1_sfGFP和实施例1得到的线性DNA模板T7promoter-BsaI-T7terminator，作为实验组，标记为BsaI+sfGFP组；在15μL反应体系中单独表达pJL1_sfGFP，作为阴性对照组，标记为sfGFP组。设两组平行实验，在qPCR仪中30℃反应6h，并实时检测sfGFP荧光值的变化。

实验组的15μL无细胞反应体系与本实施例中步骤2中的无细胞反应体系，不同点为再加入5μM本实施例中步骤4构建的质粒pJL1_sfGFP，其他均相同。

阴性对照组的15μL无细胞反应体系与本实施例中步骤2中的无细胞反应体系，不同点为将其中的5μM线性DNA模板替换为步骤4中质粒pJL1_sfGFP，其他均相同。

图6为本实施例中无细胞反应体系中限制性内切酶BsaI的活性检测结果图。其中，BsaI+sfGFP代表实验组，共表达质粒pJL1_sfGFP和线性DNA模板T7promoter-BsaI-T7terminator；sfGFP代表阴性对照组，仅表达pJL1_sfGFP质粒。

从图6可知，实验组的荧光值显著低于阴性对照组，表明无细胞表达的限制性内切酶BsaI有相应底物的酶切活性。

实施例3限制性内切酶BsaI的大量表达、纯化、酶活测定

本实施例中，进行限制性内切酶BsaI的表达、纯化、酶活测定，包括如下：

1、无细胞大量表达限制性内切酶BsaI

按照实施例2中步骤1的方法获得无细胞提取物；按照实施例2中步骤2的方法配制5mL无细胞反应体系。

以50mL无核酸酶离心管作为反应容器，按照实施例2中各成分配比成5mL无细胞反应表达体系，其中细胞提取物仍为为表达体系总体积的27％，不同点在于线性表达模板T7promoter-BsaI-T7terminator的终浓度为7μM，以增加线性DNA模板浓度来提高单位水平表达量，然后在30℃的控温水浴反应仪中反应6h，得到含有标签6×His的限制性内切酶，标记为His-BsaI。

2、限制性内切酶His-BsaI的纯化

(1)亲和层析纯化

将本实施例步骤1得到的限制性内切酶His-BsaI于4℃和21000g离心40min，取5mL上清，加入等体积的平衡缓冲液(40mM Tris，500mM NaCl，0.5mM咪唑，pH8.0)，经0.45μm滤膜除去细胞碎片，滤出液进行Ni-NTA亲和层析(Superflow Agarose，1mL预装柱，GE)，并收集上亲和层析柱后的流穿液；用10mL洗杂缓冲液(40mM Tris，500mM NaCl，50mM咪唑，pH7.5)去除未结合的杂蛋白，并收集洗杂缓冲液；用2mL洗脱缓冲液(40mM Tris，500mMNaCl，500mM咪唑，pH7.5)进行洗脱，并收集洗脱缓冲液；收集得到含有His标签的目标蛋白，标记为目标蛋白His-BsaI。各取10μL的流穿液、洗杂缓冲液和洗脱缓冲液进行SDS-PAGE电泳，结果如图5所示。

图7为本实施例中限制性内切酶His-BsaI经亲和层析柱后的流穿液、洗杂缓冲液和洗脱缓冲液的SDS-PAGE图。其中，FT(Flow through)为流穿液，W(Washed sample)为洗杂缓冲液，Eluate为洗脱缓冲液，M为Marker。

从图7可知，经Ni-NTA亲和层析大量富集了目标蛋白His-BsaI。

收集的目标蛋白His-BsaI经脱盐缓冲液(40mM Tris，500mM NaCl，1mM DTT，pH7.5)进行倍数稀释，经超滤管(分子截留10kDa)脱盐浓缩至1mL，得到脱盐后的目标蛋白His-BsaI，经SDS-PAGE验证并经A280nm吸光值(Nono Drop)测定蛋白浓度。

本实施例中，脱盐后的目标蛋白His-BsaI的浓度为1mg/mL。

(2)切除6×His标签，并进行凝胶色谱层析纯化

2mL离心管中加入本实施例中步骤2中(1)得到的1mL目标蛋白His-BsaI，加入20μL1U/μL蛋白酶HRV 3C，4℃过夜反应，以切除目标蛋白His-BsaI的N端标签6×His，得到切除His标签的目标蛋白，标记为目标蛋白BsaI。

将目标蛋白BsaI经AKTA(GE healthecare)蛋白自动纯化仪用凝胶色谱层析方法进一步纯化(柱型号：Hiload 26/600superdex 75pg)，采用洗脱缓冲液(20mM Tris，500mMNaCl，1mM DTT，pH7.5)进行洗脱，洗脱后的样品经SDS-PAGE验证纯度，浓缩后经A280nm测定吸光值，结合BsaI蛋白的摩尔消光系数(A^1mg/ml _280nm＝1.5)确定最终的蛋白浓度，得到纯化后的BsaI蛋白。纯化后的BsaI蛋白补充甘油至终浓度为10％，于-80℃保存备用。

图8为本实施例中经凝胶色谱层析纯化后的BsaI蛋白的SDS-PAGE图。其中，M为Marker；BsaI为经凝胶色谱层析纯化后的BsaI蛋白。

从图8可知，经凝胶色谱柱层析纯化后获得了高纯度的BsaI蛋白，BsaI蛋白的终浓度为0.45mg/mL。

3、纯化后的限制性内切酶BsaI的酶活测定

通过酶切实验确定本实施例步骤2得到的脱盐浓缩蛋白(纯化蛋白BsaI)的酶活情况。酶切实验包括：以纯化蛋白BsaI为对象，以缓冲液(20mM Tris，500mM NaCl，1mM DTT，pH7.5)为稀释溶液进行稀释，稀释后的浓度分别为0.45×10^-1mg/mL、0.45×10^-2mg/mL、0.45×10^-3mg/mL和0.45×10^-4mg/mL，以1μg质粒pJL1_sfGFP(含有一个BsaI酶切位点)作为底物，20μL反应体系(BsaI 5μL，10×Buffer(NEB)2μL)，于37℃反应1h，然后以1％琼脂糖核酸电泳检测底物的酶切情况。

阳性对照组：把实验组的纯化蛋白BsaI换为商业化BsaI(购买于NEB)，进行酶切和电泳。

阴性对照组：在实验组基础上去除BsaI的反应体系，进行酶切和电泳。

酶活，即比活力的定义为：在37℃下，在总体积为20μL的反应体系中，能够在1h内消化1μg的线性DNA模板(含有1个相应限制性内切酶位点)，所需的酶量。

图9为本实施例中商业化BsaI、质粒pJL1_sfGFP和不同浓度BsaI蛋白进行酶切实验的电泳图。其中，NC代表质粒pJL1_sfGFP，PC代表商业化BsaI，1代表浓度为0.45×10^-1mg/mL BsaI、2代表0.45×10^-2mg/mL BsaI，3代表0.45×10^-3mg/mL BsaI，4代表0.45×10^-4mg/mL BsaI。

从图9可知，本实施例经亲和层析和凝胶色谱层析后得到的纯化蛋白BsaI的比活为2.2×10³～2.2×10⁴U/mg。

本发明提供了一种适用于无细胞合成限制性内切酶BsaI的线性DNA模板，能够适用于任意的体外无细胞蛋白体系，且能顺利表达，并且能有效防止线性DNA模板被核酸酶降解；制备简单快捷，无需常规的质粒构建，因而采用本发明的线性DNA模板进行体外无细胞蛋白合成，获得的限制性内切酶BsaI的纯度高、比活高；本发明还提供了一种适用于无细胞合成限制性内切酶BsaI的体系，能提高无细胞合成限制性内切酶BsaI的产量，同时提升了限制性内切酶BsaI合成的反应速率；本发明还提供了无细胞合成限制性内切酶BsaI的方法，该方法很好地解决了限制性内切酶BsaI对表达宿主毒性抑制的难题，合成反应时间短，效率高，得到的限制性内切酶BsaI的比活与商业酶相似，具有广阔的应用前景。综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

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序列表

<110> 上海科技大学

<120> 一种适用于无细胞合成限制性内切酶BsaI的线性DNA模板、体系及其用途

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1635

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggcaaaa aagcggaata tggccaaggc catccgattt ttctggaata tgcggaacag 60

attattcagc ataaagaata tcaaggcatg ccggacctgc gctacccgga cggccgcatt 120

cagtgggaag cgccgagcaa ccgcaaaagc ggcattttta aagataccaa cattaaacgc 180

cgcaaatggt gggaacagaa agcgatcagc attggcattg atccgagcag caatcagtgg 240

attagcaaaa ccgcgaaact gattcatccg accatgcgca aaccgtgcaa aaaatgcggc 300

cgcattatgg atctgcgcta tagctatccg accaaaaacc tgattaaacg cattcgcaaa 360

ctgccgtatg tggatgaaag ctttgaaatt gatagcctgg aacatattct gaaactgatt 420

aagcgcctgg tgctgcagta tggcgataaa gtgtatgatg atctgccgaa actgctgacc 480

tgcaaagcgg tgaaaaacat tccgcgcctg ggcaacgatc tggatacctg gctgaactgg 540

attgatagcg tgtatattcc gagcgaaccg agcatgctga gcccgggcgc gatggcgaac 600

ccgccggatc gcctggatgg ctttcatagc ctgaacgaat gctgccgcag ccatgcggat 660

cgcggccgct gggaaaaaaa cctgcgcagc tataccaccg atcgccgcgc gtttgaatat 720

tgggtggatg gcgattgggt ggcggcggat aaactgatgg gcctgattcg caccaacgaa 780

cagattaaaa aagaaacctg cctgaacgat aaccatccgg gcccgtgcag cgcggatcat 840

attggcccga ttagcctggg ctttgtgcat cgcccggaat ttcagctgct gtgcaacagc 900

tgcaacagcg cgaaaaacaa ccgcatgacc tttagcgatg tgcagcatct gattaacgcg 960

gaaaacaacg gcgaagaagt ggcgagctgg tattgcaaac atatttggga tctgcgcaaa 1020

catgatgtga aaaacaacga aaacgcgctg cgcctgagca aaattctgcg cgataaccgc 1080

cataccgcga tgtttattct gagcgaactg ctgaaagata accattatct gtttctgagc 1140

acctttctgg gcctgcagta tgcggaacgc agcgtgagct ttagcaacat taaaattgaa 1200

aaccatatta ttaccggtca gatcagcgaa cagccgcgcg ataccaaata taccgaagaa 1260

cagaaagccc gccgcatgcg cattggcttt gaagcgctga aaagctatat tgaaaaagaa 1320

aaccgcaacg cgctgctggt gattaacgat aaaattattg ataaaattaa cgaaattaaa 1380

aacattctgc aagatattcc ggatgaatat aaactgctga acgaaaaaat tagtgagcag 1440

tttaacagcg aagaagtgag cgatgaactg ctgcgcgatc tggtgaccca tctgccgacc 1500

aaagaaagcg aaccggcgaa ctttaaactg gcgcgcaaat atctgcaaga aattatggaa 1560

attgtgggcg atgaactgag caaaatgtgg gaagatgaac gctatgtgcg tcagaccttt 1620

gcggatctgg attaa 1635

<210> 2

<211> 544

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Lys Lys Ala Glu Tyr Gly Gln Gly His Pro Ile Phe Leu Glu

1 5 10 15

Tyr Ala Glu Gln Ile Ile Gln His Lys Glu Tyr Gln Gly Met Pro Asp

20 25 30

Leu Arg Tyr Pro Asp Gly Arg Ile Gln Trp Glu Ala Pro Ser Asn Arg

35 40 45

Lys Ser Gly Ile Phe Lys Asp Thr Asn Ile Lys Arg Arg Lys Trp Trp

50 55 60

Glu Gln Lys Ala Ile Ser Ile Gly Ile Asp Pro Ser Ser Asn Gln Trp

65 70 75 80

Ile Ser Lys Thr Ala Lys Leu Ile His Pro Thr Met Arg Lys Pro Cys

85 90 95

Lys Lys Cys Gly Arg Ile Met Asp Leu Arg Tyr Ser Tyr Pro Thr Lys

100 105 110

Asn Leu Ile Lys Arg Ile Arg Lys Leu Pro Tyr Val Asp Glu Ser Phe

115 120 125

Glu Ile Asp Ser Leu Glu His Ile Leu Lys Leu Ile Lys Arg Leu Val

130 135 140

Leu Gln Tyr Gly Asp Lys Val Tyr Asp Asp Leu Pro Lys Leu Leu Thr

145 150 155 160

Cys Lys Ala Val Lys Asn Ile Pro Arg Leu Gly Asn Asp Leu Asp Thr

165 170 175

Trp Leu Asn Trp Ile Asp Ser Val Tyr Ile Pro Ser Glu Pro Ser Met

180 185 190

Leu Ser Pro Gly Ala Met Ala Asn Pro Pro Asp Arg Leu Asp Gly Phe

195 200 205

His Ser Leu Asn Glu Cys Cys Arg Ser His Ala Asp Arg Gly Arg Trp

210 215 220

Glu Lys Asn Leu Arg Ser Tyr Thr Thr Asp Arg Arg Ala Phe Glu Tyr

225 230 235 240

Trp Val Asp Gly Asp Trp Val Ala Ala Asp Lys Leu Met Gly Leu Ile

245 250 255

Arg Thr Asn Glu Gln Ile Lys Lys Glu Thr Cys Leu Asn Asp Asn His

260 265 270

Pro Gly Pro Cys Ser Ala Asp His Ile Gly Pro Ile Ser Leu Gly Phe

275 280 285

Val His Arg Pro Glu Phe Gln Leu Leu Cys Asn Ser Cys Asn Ser Ala

290 295 300

Lys Asn Asn Arg Met Thr Phe Ser Asp Val Gln His Leu Ile Asn Ala

305 310 315 320

Glu Asn Asn Gly Glu Glu Val Ala Ser Trp Tyr Cys Lys His Ile Trp

325 330 335

Asp Leu Arg Lys His Asp Val Lys Asn Asn Glu Asn Ala Leu Arg Leu

340 345 350

Ser Lys Ile Leu Arg Asp Asn Arg His Thr Ala Met Phe Ile Leu Ser

355 360 365

Glu Leu Leu Lys Asp Asn His Tyr Leu Phe Leu Ser Thr Phe Leu Gly

370 375 380

Leu Gln Tyr Ala Glu Arg Ser Val Ser Phe Ser Asn Ile Lys Ile Glu

385 390 395 400

Asn His Ile Ile Thr Gly Gln Ile Ser Glu Gln Pro Arg Asp Thr Lys

405 410 415

Tyr Thr Glu Glu Gln Lys Ala Arg Arg Met Arg Ile Gly Phe Glu Ala

420 425 430

Leu Lys Ser Tyr Ile Glu Lys Glu Asn Arg Asn Ala Leu Leu Val Ile

435 440 445

Asn Asp Lys Ile Ile Asp Lys Ile Asn Glu Ile Lys Asn Ile Leu Gln

450 455 460

Asp Ile Pro Asp Glu Tyr Lys Leu Leu Asn Glu Lys Ile Ser Glu Gln

465 470 475 480

Phe Asn Ser Glu Glu Val Ser Asp Glu Leu Leu Arg Asp Leu Val Thr

485 490 495

His Leu Pro Thr Lys Glu Ser Glu Pro Ala Asn Phe Lys Leu Ala Arg

500 505 510

Lys Tyr Leu Gln Glu Ile Met Glu Ile Val Gly Asp Glu Leu Ser Lys

515 520 525

Met Trp Glu Asp Glu Arg Tyr Val Arg Gln Thr Phe Ala Asp Leu Asp

530 535 540

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttagaggtcc tgtttcaggg acctatgggc aaaaaagcgg aa 42

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgttagcagc cggtcgactt aatccagatc cgcaaa 36

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccctgaattg actctct 17

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aggtccctga aacaggacct ctaacatatg gtgatgatga tg 42

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcgggctttg ttagcagccg g 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggttgagtgt tgttccagt 19

Claims

1.一种适用于无细胞合成限制性内切酶BsaI的线性DNA模板，其特征在于，所述线性DNA模板依次包括含有启动子的片段、限制性内切酶BsaI的编码基因和含有终止子的片段，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述线性DNA模板不含有限制性内切酶BsaI的酶切位点。

2.如权利要求1所述的线性DNA模板，其特征在于，包括如下技术特征中的至少一项：

A1)所述含有启动子的片段包括启动子和启动子上游序列；优选地，所述含有启动子的片段中的启动子为T7；

A2)所述含有终止子的片段包括终止子和终止子下游序列；优选地，所述含有终止子的片段中的终止子为T7；

A3)所述线性DNA模板还含有位于所述编码基因上游或下游的标签，所述标签与所述编码基因可操作性地连接；优选地，所述标签选自6×His标签、SUMO标签、MBP标签、Strep-tag标签和Cold-TF factor标签中的一种或多种。

3.如权利要求1或2所述的线性DNA模板的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1-3)通过融合PCR方法，将步骤1-1)中得到的所述编码基因、步骤1-2)中得到的含有启动子的片段和所述含有终止子的片段进行融合，获得所述线性DNA模板。

4.如权利要求1或2所述的线性DNA模板在构建适用于无细胞限制性内切酶BsaI合成体系中的用途。

5.一种无细胞合成限制性内切酶BsaI的体系，其特征在于，所述体系包含如权利要求1或2所述的线性DNA模板。

6.如权利要求5所述的体系，其特征在于，所述体系还包括细胞提取物，所述细胞提取物能够表达所述线性DNA模板。

7.如权利要求6所述的体系，其特征在于，所述细胞提取物选自大肠杆菌提取物；优选地，所述大肠杆菌选自BL21 Star(DE3)、BL21 Star(DE3)+pG-KJE8、BL21 Star(DE3)+pGro7、BL21 Star(DE3)+pG-Tf2、Rosetta、Rosetta+pG-KJE8、Rosetta+pGro7、Rosetta+pG-Tf2中的一种或多种。

8.如权利要求1或2所述的线性DNA模板或如权利要求5-7任一项所述的体系在限制性内切酶BsaI合成中的用途。

9.一种限制性内切酶BsaI的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

至少采用如权利要求1或2所述的线性DNA模板或如权利要求5-7任一项所述的体系进行合成反应，得到所述的限制性内切酶。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述反应的温度为15～37℃；

和/或，所述反应的时间为2～8h。