JPH02446A - ヒト成長ホルモンの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 長ホルモン（ｈＧＩ（）の製法に係る。

さらに詳述すれば、本発明は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）において天然形ヒト成長ホルモン
の発現及び分泌を誘発し得るハイブリッドプラスミド及
び該ハイブリッドプラスミドによって形質転換させた枯
草菌を適切な培養環境で生育させることによる天然形ヒ
ト成長ホルモンの製法に係る。

ｈＧＩｌはアミノ酸１９１個、分子１　２２０００ドル
トンのタンパク質であり、各個人の生存中を通して下垂
体（腺下垂体）の前葉で生産される（ただし、成人萌の
期間では、より多量生産される）。

成長ホルモンは前駆体の形で合成され、変化を受けた後
、細胞から分泌される。

その作用機序は未だ不明であるが、ｈＧＨは骨格の成長
、窒素の固定及びタンパク質の合成を促進し、脂質及び
炭水化物の代謝に影響を及ぼす。

ｈＧＨは、該ホルモンの欠乏に関連する小人症の治療に
使用され、肥満症の処置及びやけど及び創傷の治療にら
使用される。

数年前までは、該ホルモンの利用できる源は死体の下垂
体であり、複雑かつ高価な方法によって抽出されていた
。

最近になって、組換えＤＮＡ法によって形質転換した宿
主微生物を使用する発酵によってｈＧＥを製造する方法
が開発されてきた。

特に、英国特許第２，０５５．９８２号及びヨーロッパ
特許第２０．　１４７号には、転写及び翻訳の過程で必
要なプロモーター及び認識部位の下流に位置し、ＡＴＧ
　トリブレブト　（すべてのタンパク質の翻訳の開始シ
グナルであることから必要とされるメチオニンをコード
づけする）に並置された成熟ｈＧＨをコードづけするＤ
ＮＡの構造配列を含有するハイブリッドプラスミドによ
って形質転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
ｃｏ口）を生育することからなる成長ホルモンの製法が
記載されている。

しかしながら、これらの公知の方法を使用する場合、合
成されたホルモンの分離及び精製が困難であり、一方、
不正確なアミノ酸配列を有するｈＧＥウ（生産される。

実際、ｈＧＨのアミン末端におけるメチオニンの存在は
分子の立体配置を変化させ、これにより、その活性及び
免疫特性が影響を受ける。

さらに、大腸菌（ヒトに対して病原性であり、発現生成
物を外部環境に分泌する細菌である）の使用は方法自体
を煩わしいものとし、特にｈＧＨの分離及び回収を複雑
なものとしている。

このため、当分野では、ｈＧＨの製造にあたり枯草菌（
ヒトに対して非病原性であり、培養基内にタンパク質を
分泌し得る細菌である）の使用を必須要件とする他の方
法が提案されている。

これに関連して、Ａ．　Ｎａｋａｙａｍａらの文献「ジ
ャーナル・オブ・バイオテクノロジー（Ｊ．　ｏｆ　Ｂ
ｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌ．）Ｊ　５、１７１−　１７９　
（１９８７）を参照する。該文献は、枯草菌のクローニ
ングベクターを、タンパク質の分泌をコードづけするパ
ンラス・アミロリキファンエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ａＢｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のニュートラルプ
ロテアーゼ遺伝子のプレプロペプチド（ｐｒｅｐｒｏｐ
ｅｐｔ　ｉｄｅ）のイニシャル配列に結合した天然形ｈ
Ｇ）Ｉをコードづけする配列と結合させて得られたハイ
ブリッドプラスミドによって形質転換させた枯草菌細胞
からヒト成長ホルモンを発現及び分泌させる方法に係る
。

しかしながら、この方法によれば、ヒト成長ホルモンは
融合タンパク質（すなわち、成熟　ｈＧＨ及びアミノ酸
配列で構成される）の形で分泌される。これは、プレプ
ロペプチドをコードづけする領域とｈＧＨの構造遺伝子
との結合による。

この結果、該方法は工業的規模での利用にはあまり魅力
的ではない。

新たに、従来法の問題点を解消できるハイブリッドプラ
スミドを構成できた。

従って、本発明の目的は、天然形ヒト成長ホルモンを発
現及び分泌し得るハイブリッドプラスミドにある。

本発明の他の目的は、該ハイブリッドプラスミドによっ
て形質転換させた枯草菌の発酵による天然形ヒト成長ホ
ルモンの製法にある。

本発明のさらに他の目的は、このようにして得られたホ
ルモンを治療及び診断の分野で使用することにある。

さらに本発明の他の目的は、該ホルモンを治療上有効な
量で含有してなる医薬組成物にある。

本発明の他の目的は、以下の記載及び実施例から明らか
になるであろう。

本発明によるハイブリッドプラスミドは、枯草菌のクロ
ーニングベクターを、セリンプロテアーゼの分泌シグナ
ルをコードづけする配列に５′末端で融合した成熟ｈＧ
Ｈをコードづけする遺伝子と結合させることによって得
られる。

特に、かかるプラスミドは、 ａ）枯草菌クローニングベクターを適当な制限酵素で消
化し； ｂ）ハイブリッドプラスミドｐＳＭ　２０９を制限酵素
ＦｎｕＤＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化して、５３０　
ｂｐフラグメントを単離し： Ｃ）セリンプロテアーゼの分泌及びｈＧＨの１−１６ア
ミノ酸配列に応答するシグナル配列をコードづけする人
工オリゴヌクレオチドを合成し；ｄ）前記工程ａ）、ｂ
）及びＣ）で得られたＤＮＡフラグメントをＴ４　ＤＮ
Ａリガーゼの存在下で結合させ、最後に、 ｅ）所望の特性を有するハイブリッドプラスミドを単離
する、 ことからなる方法によって構成される。

本発明の目的に好適なベクターは当分野で公知のものの
中から選ばれる。

好ましくは、＾ＴＣＣ６７３２０ｐＳＭ　２１４ベクタ
ーを使用できる。このベクターは、枯草菌において良好
な安定性を示すことを特徴とし、異種タンパク質の充分
な発現を誘発し得る。このベクター（イタリー国特許出
願第１９５５１　Ａ／８７に記載された方法により調製
される）は、枯草菌及び大腸菌において、カナマイシン
、アンピシリン及びクロラムフェニコールに対する耐性
をコードづけする各Ｋｍ１Ｂｌａ及びＣａｔ遺伝子の複
製を可能にするｐ［ｌ１３　ｔｔｏ及びｐＢＲ３２２の
複製開始点、Ｂｌａ及びＣａｔ遺伝子配列を包含するノ
シストロン性メツセンツヤ−ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）の転
写を指示する強力な人工プロモーター及びＣａｔ遺伝子
の下流に位置する大腸菌のλファージのターミネータ−
を含有する。

制限酵素ＥｃｏＲＩ　　及びＨｉｎｄＩＩ［によるベク
ターからのＢｌａ遺伝子の取り出し、つづく異種遺伝子
の該部位への導入により、遺伝子の転写がクロラムフェ
ニコールに基く選択を介して保証される（単一のプロモ
ーターの存在による）ハイブリッドプラスミドの構成が
可能となる。

従って、本発明によれば、異種遺伝子は、セリンプロテ
アーゼの分泌に応答するシグナル配列をコードづけする
ＤＮＡに５′末端で融合された成熟ｈＧＩ＋タンパク質
をコードづけするものである。

特に、プロテアーゼは、枯草菌によって生産される細胞
外タンパク分解酵素であるサブチリシンである（Ｍｉｌ
ｌｅｔ　Ｊ、　ｒジャーナル・オブ・アプライド・バク
テリオロジー　（Ｊ、＾ｐｐ１．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、）ｌ３３．２０７−２１９　（１９７０）＋　Ｍａｒ
ｋｌａｎｄ　Ｐ、Ｓ、　　ら　「ジ・エンサイムズ（Ｔ
ｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ月Ｂａｙｅｒ　Ｐ、Ｄ、編、Ｖｏ
ｌ、　３．５６１−６０８　（１９７１）、Ａｃａｄｅ
＋ｗｉｃ　Ｐｒｅｓｓ社発行）ａ サブチリシン（枯草菌によってプレプロエンザイム（ｐ
ｒｅｐｒｏｅｎｚｙｍｅ）として生産される）は、Ｎ末
端に、膜を通してのタンパク質の移動の活性化に応答す
るアミノ酸２９個でなるシグナル配列（リーダーペプチ
ド）を含有する。

このシグナル配列は、切断部位としてＡｌａ−Ｇｉｎ〜
Ａｌａ↓アミノ酸配列を認識する特殊なエンドペプチダ
ーゼの活性によって取り出される。

従って、本発明によるハイブリッドプラスミドを構成す
るに必要なサブチリシンのリーダーペプチドをコードづ
けするＤＮＡを複製するオリゴヌクレオチドを合成でき
る。

異種タンパク質を分泌させるハイブリッドプラスミドの
調製にあたり、リーダーペプチドを使用することは当分
野において公知であるが（［ヌクレイツク・アシッズ・
リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃ
ｈ）Ｊ　Ｖｏｌ、　　９．１１．２５７７　（１９８１
）　　：　ｒジーン（Ｇｅｎｅ）Ｊ　１５．４３　（１
９８１））、これら配列が異種遺伝子に結合された際に
分泌を誘発することは予測さ机ない。

本発明に従って、ノヂオニンイニシェークーからＡｌａ
−Ｇｌｎ　−ＡＬａエンドベプヂダーゼ用の切断部位（
直後にｈＧＨの１−１６アミノ酸をコードづけする配列
が続く）までのサブチリシンのリーダーペプチドをコー
ドづけする配列を複製する人工のオリゴヌクレオチドを
形成する。

自動合成装置を使用し、公知の方法に従ってオリゴヌク
レオチドを合成する。合成オリゴヌクレオチドは下記の
配列を存する。

ついで、特願昭８２−１０９９１６号に記載されている
ようにして、ｈＧＨの１７−１９１アミノ酸をコードづ
けする５３０　ｂρフラグメントをプラスミドｐＳＭ　
２０９から取り出す。

実際には、このプラスミドを、制限酵素ＦｎｕＤ　１及
び旧ｎｄｌＩＩ　（ＢＩＯＬＡＢＳ）により、これら酵
素の供給者が推奨する条件下で操作して処理し、ポリア
クリルアミド上での電気泳動によって分離する。

次に、本発明に従い、ｐＳＭ　２１４のＥｃｏＲｆ　／
旧ｎｄｌ［Ｉ　６５００塩基対フラグメント、ＦｎｕＤ
ＩＩ　／　ｌ１ｉｎｄｌｌ１５３０塩基対フラグメント
及び人工オリゴヌクレオチドの間でのりゲーション（ｌ
ｉｇａｔｉｏｎ）を行う。

Ｔ４　ＤＮＡリガーゼの存在下、フラグメントの比＝ｌ
：３：３で反応を行う。反応終了後、全混合物を使用し
、Ｃｏｎｔｅｎｔｅ及びＤｕｂｒａｕの方法（ｒＭｏｌ
、　ＧｅｎＧｅｎｅｔ、ｊ　１６７．２５１−２５８　
（１９７９）によってコンピテントとじた枯草菌細胞を
形質転換させる。

この目的には、枯草菌の各種の菌株を使用できる。

特に、ニコートラルプロテアーゼ（−）及びセリンブロ
テアーゼ（−）　（ｌｅｕ、　ｐｙｒ　Ｄｉ、　ｎｐｒ
−、ａｐｒ−）の枯草菌ＳＭＳ　ｔｔｇを使用できる。

ついで、クロラムフェニコールを添加したｖＹ培地（選
択的）で形質転換された細胞を培養する。

このようにして操作することにより、得られた（＋）の
クローンの１つから、電気泳動及び配列の分析において
所望の特性を示すハイブリッドプラスミドｐＳＭ　２６
０を単離できた。

このプラスミド（枯草菌ＳＭＳ　１１８　（＋）ＳＭ　
２６０））については、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・センターにＡＴＣＣ６７４７３として寄託している
（１９８７年７月２４日）。

次に、天然形ｈＧＨを発現及び分泌する該ハイブリッド
プラスミドの能力をチエツクするため、ｐＳＭ　２６０
で形質転換させた枯草菌ＳＭＳ１１ｇを、炭素源及びク
ロラムフェニコール（インデューサー）の存在下、好適
な液状培地で生育する。

好ましくは、枯草菌ＳＭＳ　１１ｇ　（ＰＳＭ　２６０
）細胞を、グルコースの存在下、ｖＹ培地（Ｖｅａｌ　
ＩｎｆｕｓｉｏｎＢｒｏｔｈ　（ＤＩＦＣＯ）、Ｙｅａ
ｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　（ＤＩＦＣＯ）において温度的
３７℃で生育させる。

細胞抽出物及び培地の上澄み液中に存在するタンパク質
を、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分
析する　（Ｌａｅｍｍｌｉ　ｒネーチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）ｊ　２７７．６８０　（１９７０））。ｈＧｌ（は
、クマシーブルーによる発色（「ゲル・エレクトロホレ
シス・オブ・プロテインズ：ア・プラクティカル・アプ
ローチ（Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏ
ｆＰｒｏｔｅｉｎｓ　；ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐ
ｐｒｏａｃｈ）Ｊ　Ｂ、　Ｄ、　Ｈａｍｅｓ及びり。

Ｒｉｃｋｗｏｏｄ編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｌｔ
ｅｄ発行）、及びニトロセルロースフィルターへの移動
及びつづく該フィルターの抗−ｈＧＨ抗体による処理の
両方で存在が示される。

得られた結果は、上澄み液中に、標準ｈＧＨ（Ｃａｌｂ
ｉｏｃｈｅｍ）と共に移動し、抗−ｈＧＨ抗体との反応
で（＋）を示すタンパク質が存在することを示した。

しかしながら、細胞溶解質中？こは、成熟ｈＧＨよりも
わずかに大きい分子量を有し、ｈＧＨ前駆体（サブチリ
シンリーダーペプチド＋成熟ｈＧ）ｌ）の部分消化によ
るものと考えられるタンパク質が見られる。

分泌された前駆体及びｈＧＨの量の比（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにおける２種類のタンパク質の強度を評価することに
より決定）は、分泌活性が８０ないし９０％であること
を示した。

このようにして分泌されたｈＧＨのアミノ末端配列（自
動アミノシークエンサー　モデルＢ９０Ａ（Ｂｅｃｋｍ
ａｎ）を使用し、Ｅｄｍａｎ　Ｐ、　らの方法（［ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ
Ｉ＋＋、）Ｊ８０−９１　（１９６７））によって決定
）は、天然ホルモンについて期待される配列を示し、こ
れにより、本発明によるプラスミドを用いて形質転換さ
せた枯草菌から合成された前駆体が正確に変化されるこ
とが確認された。

以下の実施例は本発明を説明するためのらのであり、限
定するものではない。

実施例１ ハイブリッドプラスミドｐＳＭ　２６０の構成（第１図
参照） ａ）　ｈＧＨ遺伝子の構成及びプラスミドｐＳＭ　２１
４への挿入 プラスミド＾ＴＣＣ６７３２０ｐＳＭ　２１４２μ９を
、５ＯＮＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ　（ｐＨ７，５）、６ｍＭ
　ＭｇＣｌ２を及び５Ｑｄ　ＮａＣ（１を含有する緩衝
液５０ＪＩＱ中、３７℃において制限酵素ＥｃｏＲＴ及
びＨｉｎｄｌＩ［２単位（Ｕ）により１時間消化した。

反応混合物をフェノール−クロロホルム（１：ＬＶ／　
Ｙ）及びクロロホルム−イソアミル（２４：ｌＳＶ／Ｖ
）で抽出することによって酵素反応を停止させ、−２０
℃においてＤＮＡをエタノールで沈殿させ、Ｅｐｐｅｎ
ｄｒｏｆ遠心分離機において１２００Ｏｒｐｍで２０分
間遠沈して分離した。ついで、プラスミドＤＮＡをＴＥ
緩衝液（５０＋＋＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（４，１ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ　；ｐＨ８，０）　１０μＱに懸濁させ、０．６
％アーガロースゲル上に負荷し、１００ｖで１時間泳動
させた。

６５００ｂｐ　ＤＮＡフラグメントに相当するバンドを
、１２５Ｖ、　９０分間でエレクトロ溶出した。

並行して、ｈＧＨ１７−１９１をコードづけする配列を
含有する５３０ｂｐフラグメントを、ハイブリッドブラ
スミドｐａｎ　２０９から単離した（特願昭６２−１０
９９１６号参照）。

この目的のため、ｐＳＭ　２０９５Ｏｕ９を、６ｍＭ　
ＴｒｉｓＨＣＱ　（ｐＨ７，４）、６ｎＭ　ＮａＣ（！
、　６ｍＭ　ＭｇＣｌ２を及び６ｏ＋Ｍメルカプトエタ
ノールを含有する反応混合物２００ｕ（ｌ中、３７℃に
おいてＦｎｕＤ　ＩＩ　　（ＤＮＡをアミノ酸配列１６
及び１７の間で切断する）（ＢＩＯＬＡＢＳ）　５００
により１時間消化した。

酵素を７０℃、１０分間で脱活性化した後、溶液を５０
ｄ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ（ｐＨ８，０）、ｌＯｏ＋Ｍ　Ｍ
ｇＣｆ！を及び５０ｄＮａＣＱの濃度とし、ＨｉｎｄＩ
ＩＩ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）　５００の存在下、３
７℃で１時間インキュベートした。酵素を脱活性化した
後、６％アクリルアミドゲル上、１３０Ｖ、３時間でＤ
ＮＡを分離した。

ついで、約５３０塩基対のバンドを、Ｍａｘａｍ及びＧ
１１ｂｅｒｔによって開示された如くして（［メソッズ
・イン・エンサイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＥｎ
ｚｙａ＋ｏｌｏｇｙ）ｊ　Ｖｏｌ、　６５、ｐ　４９９
−５６０　（１９８０））溶出した。

最後に、下記に示すＤＮＡフラグメントを、Ｓｙｓｔｅ
ｍ　　Ｏｎｅ　　ＤＮＡ 成した。

合成装置 （Ｂｅｃｋｍａｎ） によって合 ０　　　　　　ロユ　　　υ　　　Ｑ Ａ　　′：　９　　？　　貸 １嘴 このフラグメントは、サブチリノンのベプヂドリーダー
のアミノ酸２９個でなる配列及びｈＧＨの１−１６アミ
ノ酸をコードづけする。ついで、この人工のフラグメン
ト　１ｌ１９を、６６ｏ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＣ（ｐＨ
７，６）、１ｍＭｍパスへシン、ｌＯｄ　ＭｇＣ０ｚ、
１５ｄ　ＤＴＴ。

０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ及びＴ４キナーゼ（Ｂｉｏｌｏａ
ｂｓ）　２１Ｊを含有する緩衝液２０μσ中、３７℃に
おいて１時間加リン酸処理した。６５℃、１０分間で酵
素を脱活性化した。

５３０ｂｐ　Ｆｒ＋ｕＤＩＩ−旧ｎｄｌｌＩフラグメン
ト４００ｎ９、上述の如く加リン酸処理した人工のフラ
グメント１００ｎ９及びｐＳＭ　２１４の６５００ｂｐ
　ＥｃｏＲＩ　−１１ｉｎｄｌｌＩフラグメント　１．
５μｇを、６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ！　（ｐＨ７，
６）、ｌｄ　ＡＴＰ、　１０ｄ　ＭｇＣム及びｌ１０ｆ
ｆ１ジチ第１・レイトール（ＤＴＴ）を含有する緩衝液
ｌｏμｇ中で混合し、Ｔ４　ＤＮ＾リガーゼ２Ｕの存在
下、１４℃において１８時間結合させた。

このようにして得られたりガーゼ混合物を、Ｃｏｎｔｅ
ｎｔｅ　′ＦｉびＤｕｂｒａｕの方法（ｒＭｏｌ、Ｇｅ
ｎ、Ｇｅｎｅｔ、ｊ１６７．２５１−２５８　（１９７
９））によってコ〉ビテントとした枯草菌ＳＭＳ　１１
８の形質転換に使用した。

ついで、形質転換した細胞を、クロラムフェニコール（
Ｃｍ）　５　ｕ　９／　ｘＱを含有するＴＢＡＢ（Ｔｒ
ｙｐｔｏｓｅＢｌｏｏｄ　Ａｇａｒ　Ｂａ５ｅ）プレー
トにおいて３７℃で１８時間生育して選別した。

（＋）のクローンの１つから所望のハイブリッドプラス
ミド（制限地図を第２図に示す）　（ｐｓＭ　２６０）
を単離した。

実施例２ 枯草菌ＳＭＳ　１１８におけるｈＧｌｌの発現及び分泌
ハイブリッドプラスミドｐＳＭ　２６０で形質転換させ
た枯草菌ＳＭＳ　１１８　（枯草菌ＳＭＳ　１１８　（
ｐｓｎ２６０））の細胞を、クロラムフェニコール５μ
９７１（１及びグルコース３％を添加したｖＹ培地（Ｊ
ｅａｌＩｎｆｕｓｉｏｎ　Ｂｒｏｔｈ　（ＤＩＦＣＯ）
　２５９／Ｑ、Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣ
Ｏ）　５ｇ／ｆ２）　１０ｘＱにおいて、３７℃で１８
時間生育させた。

ついで、培養基１Ｒ１２をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離
機で遠沈しく１０分間、１００００　ｒｐｍ）、細胞を
３０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ（ｐＨ７，５）、５０ｒａＭ
　ＮａＣＱ緩衝液ｌ析液で２回洗浄し、再度遠沈し、Ｓ
ＥＴ緩衝液（２０％スクロース、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＱ　（ｐＨ７，６）、５０ｍＭ　ＥＤＴ＾）１００
μσ中に懸濁化させ、リゾチーム（ＳＩＧＭ＾）５０Ｒ
９ＩＲＱを含有する水溶液２０μＱを添加して３７℃で
５分間溶解させた。この混合物に、緩衝液Ａ（１２５ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　（ｐＨ６，９）、３％ＳＤＳ、
　３％β−メルカプトエタノール及び２０％グリセリン
）１３０μＱを添加し、得られた混合物を９０℃で５分
間インキュベートした。

並行して、枯草菌ＳＭＳ１１８　（ｐＳＭ　２６０）の
上澄み液に含有されるタンパク質を４℃、６０分間で沈
殿させ、培養基０．８ｘＱ、２０％ＴＣＡ（）リクロロ
酢酸）０．３１ｇに添加した。

沈殿物をアセトンで２−３回洗浄し、遠心分離した後、
ＳＥＴ緩衝液３０μＱに再度懸濁させ、緩衝液Ａ　５０
μＱを添加した後、９０℃で５分間インキュベートした
。

細胞溶解物２５μＱ及び上澄み液のタンパク質溶液２０
μＱを１２．５％５ＤＳ−アクリルアミドゲル（Ｌａｅ
ＩＩｌｌｌｌｌｌ［ネーチャーＪ２７７．６８０　（１
９７０））に負荷し、２５ｍＡで３時間電気泳動した後
、クマシーブルー（「ゲル・エレクトロホレシス・オブ
・プロテインズ：ア・プラクティカル・アプローチ」Ｂ
、Ｄ、Ｈａｍｅｓ及びり、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ編、ＩＲＬ
　ＰｒｅｓｓＬｉｍｉｔｅｄ発行）、及びニトロセルロ
ースフィルタ（Ｓｈｌｅｉｈｅｒ　＆　５ｈｕ１１孔サ
イズ４５ｃｚｉ＋　Ｔｏｖｂｉｎ）への移動及びウサギ
抗−ｈＧＨ抗体（Ｍｉｌｅｓ）及びペルオキシダーゼと
結合したヤギ抗−ウサギＩｇＧ抗体（Ｍｉｌｅｓ）によ
る該フィルターの処理によってタンパク質の存在が明ら
かになった。

クマシーブルーで発色させた後、枯草菌５Ｍ５１１８　
（ｐＳＭ　２６０）の培養基の上澄み液中に、標準ｈＧ
Ｈ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と共に移動するタンパク質
が存在することが明らかになった。

このタンパク質は、抗−ｈＧＨ抗体との免疫反応（＋）
である（第３図参照）。なお、第３図は枯草菌から抽出
した全タンパク質及び培養基に分泌されたフラクション
のウェスタンプロットを示す図である。図中、Ａは３Ｍ
３１１ｇ　（ｐｓＭ２１４）の全タンパク質に係り、Ｂ
はＳＭＳ　１１ｇ　（ｐＳＭ　２１４）の細胞外タンパ
ク質フラクション、ＣはＳＭＳ　１１８　（ｐＳＭ２６
０）の全タンパク質、Ｄは３Ｍ３１１ｇ　ＣｐＳＭ　２
６０）の細胞外タンパク質フラクション及びＥはｍｅｔ
ｈＧＩＩに係る。

溶菌後得られたタンパク質の分析では、抗−ｈＧＨ抗体
に対して反応性であり、その分子量が部分的に変化され
たサブチリシンＬＳ＋ｈＧＨ前駆体に相当する残留タン
パク質の存在を示した。

分泌されたｈＧＨ前駆体とｈＧｌ（タンパク質との間の
比（抗体と接触させた際の２つの（＋）のバンドの強度
を評価することによって決定）は、枯草菌ＳＭＳ１１８
　（ｐＳＭ　２６０）によって発現されたホルモンの８
０％に相当する分泌率を示した。

実施例３ 分泌されたｈＧＨの精製 グリセリン処理しかつ一８０℃で保存した枯草菌ＳＭＳ
１１ｇ　（ｐＳＭ　２６０）培養物を使用して、クロラ
ムフェニコール５μｇ／ｘ（ｌを含有するし寒天培地上
で各コロニーを得た。

ついで、Ｃｌ１１耐性コロニーを使用し、クロラムフェ
ニコール５μ９／ＩＱ及び３％グルコースを補足したｖ
Ｙ培地　ＩＣに接種した。

ゆるやかに撹拌しながら、３７℃で１８時間生育させた
。

５ｏｒｖａｌｌ　Ｃ７−ター内で遠沈（１０分間、７０
００　ｒｐ＋ｎ）して、培養物の上澄み液を分離した。

４℃で上澄み液に硫酸アンモニウム（６０％飽和）（Ｍ
ＥＲＣＫ）　０Ｊ９９／ｚσを添加することによってタ
ンパク質を沈殿させ、２４時間後、５０００　ｒｐｍで
１ｏ分間遠沈して沈殿物を集めた。

ついで、沈殿物を２０ｗＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（（ｐＨ８
，０）３５肩ρ中に溶解し、同じ緩衝液に対して広範囲
にわたって透析した。２０％Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ２　
（ｐＨ８，０）（流Ｍ　１０ｘＱ／時間）で平衡化しり
ＤＥＡＥ　ＣＬ−６８Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）のカラム（２０ｘ　２．６ｃｘ　；総容量
１０６肩１２）にタンパク質溶液を負荷した。

カラムを平衡化緩衝液で３回洗浄した後、２０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣＱ（ｐＨ８，０）、０．ＩＭ　ＮａＣＱ　Ｅ
ｌ衝析液タンパク質を溶出した。

ｈＧＨを含有するフラクションを集め、上述の如く硫酸
アンモニウムを添加することによってホルモンを濃縮し
た。

電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）での分析では、ｈＧＩ＋
は純度９５％以上であり、収率（負荷したｈＧｌ＋と溶
出されたｈＧＩ＋との間の比率として算定）は８０％で
あった。

疎水性及びアフィニティークロマトグラフィ及びゲル濾
過によって、さらに精製を行うこともできる。

このようにして精製したｈＧＨを、アミノ酸配列の決定
に使用した。自動シークエンサーモデル８９０Ｍ　（Ｂ
ｅｃｋｍａｎ）を使用し、Ｅｄｍａｎ法により自動的に
減成させることによってアミノ酸配列の決定を行った。

得られた結果は、ｈＧ）ｌに関して予想しだらのと同一
のアミノ酸配列を有するタンパク質であることを示した
。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＳＭ　２６０の構成法を概略的に
示す図、第２図はプラスミドｐＳＭ　２６０の制限地図
を表す図、第３図はウェスタンプロットの結果を示す図
である。 図面の浄書 ＦＩｏ、２ ＡＢＣＤＥ ＦＩＧ、３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　枯草菌のクローニングベクターを、セリンプロテア
   ーゼの分泌に応答するシグナル配列をコードづけするＤ
   ＮＡと５′末端で融合したヒト成長ホルモンをコードづ
   けする構造遺伝子と結合させることによって得られた、
   枯草菌において天然形ヒト成長ホルモンの発現及び分泌
   を誘発するハイブリッドプラスミド。 ２　請求項１記載のものにおいて、前記クローニングベ
   クターがＡＴＣＣ６７３２０ｐＳＭ２１４である、ハイ
   ブリッドプラスミド。 ３　請求項１記載のものにおいて、前記セリンプロテア
   ーゼがサブチリシンである、ハイブリッドプラスミド。 ４　アメリカン・タイプ・カルチャー・センターに枯草
   菌ＳＭＳ１１８（ｐＳＭ２６０）ＡＴＣＣ６７４７３と
   して寄託されたものである請求項１−３記載のハイブリ
   ッドプラスミド。 ５　ａ）クローニングベクターｐＳＭ２１４を制限酵素
   ＥｃｏＲ I 及びＨｉｎｄIIIで消化して、６５００塩基
   対のＥｃｏＲ I ／ＨｉｎｄIIIフラグメントを分離し、
   ｂ）プラスミドｐＳＭ２０９を制限酵素ＦｎｕＤII及び
   ＨｉｎｄIIIで消化して、ヒト成長ホルモンの１７−１
   ９１アミノ酸配列をコードづけする５３０塩基対Ｆｎｕ
   ＤII／ＨｉｎｄIIIフラグメントを分離し、ｃ）セリン
   プロテアーゼの分泌及びヒト成長ホルモンの１−１６ア
   ミノ酸配列に応答するシグナル配列をコードづけするオ
   リゴヌクレオチドを合成し、ｄ）前記工程ａ）、ｂ）及
   びｃ）で得られたＤＮＡフラグメントを酵素Ｔ４ＤＮＡ
   リガーゼの存在下で結合させ、最後にｅ）所望のハイブ
   リッドプラスミドを単離することからなる方法によって
   得られた、請求項１記載のハイブリッドプラスミド。 ６　請求項５記載のものにおいて、前記工程ｃ）のオリ
   ゴヌクレオチドが１４３塩基対で構成されるものであり
   、シグナル配列がサブチリシンのものである、ハイブリ
   ッドプラスミド。 ７　枯草菌の中から選ばれ、請求項１記載のハイブリッ
   ドプラスミドによって形質転換された微生物。 ８　請求項７記載のものにおいて、枯草菌が、ニュート
   ラルプロテアーゼ（−）及びセリンプロテアーゼ（−）
   の菌株ＳＭＳ１１８である、形質転換微生物。 ９　炭素源及びインデューサーとしてのクロラムフェニ
   コールの存在下、適切な環境において請求項１記載のハ
   イブリッドプラスミドによって形質転換させた枯草菌を
   生育させ、分泌されたホルモンを培養基の上澄み液から
   分離することを特徴とする、天然形ヒト成長ホルモンの
   製法。 １０　請求項９記載の製法に従って得られたヒト成長ホ
   ルモンの治療及び診断の分野での使用法。 １１　請求項９記載の製法に従って得られたヒト成長ホ
   ルモンを治療上の有効量で含有してなる医薬組成物。