JPH062066B2 - 新規なシグナルアミノ酸配列をコ−ドするｄｎａを有するプラスミド - Google Patents
新規なシグナルアミノ酸配列をコ−ドするｄｎａを有するプラスミドInfo
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- JPH062066B2 JPH062066B2 JP60122675A JP12267585A JPH062066B2 JP H062066 B2 JPH062066 B2 JP H062066B2 JP 60122675 A JP60122675 A JP 60122675A JP 12267585 A JP12267585 A JP 12267585A JP H062066 B2 JPH062066 B2 JP H062066B2
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- amino acid
- acid sequence
- serratia
- protease
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は遺伝子産物の細胞外へ分泌を促進する新規なプ
ラスミドに関する。
ラスミドに関する。
（従来の技術） 近年、遺伝子操作の研究が進み、インシュリン、インタ
ーフェロン、インターロイキン−２などの有用物質を微
生物で生産することが可能になってきた。かかる遺伝子
操作の場合、宿主として一般に大腸菌が用いられている
が、グラム陰性菌に属する大腸菌は内膜、外膜の二重の
膜構造を有するため、産生した有用物質が菌体外に分泌
せず、その分離精製が困難になるという問題があった。
ーフェロン、インターロイキン−２などの有用物質を微
生物で生産することが可能になってきた。かかる遺伝子
操作の場合、宿主として一般に大腸菌が用いられている
が、グラム陰性菌に属する大腸菌は内膜、外膜の二重の
膜構造を有するため、産生した有用物質が菌体外に分泌
せず、その分離精製が困難になるという問題があった。
この問題点を解決する方法として、大腸菌のペリプラズ
ム酵素であるアルカリ性フォスファファターゼ遺伝子の
シグナル配列を利用してペリプラズムに生成、蓄積せし
める方法（例えば、特開昭58-69897号、同59-39899号）
や大腸菌の外膜タンパクである。ompＦ遺伝子を利用し
て外膜を通して分泌せしめる方法（特開昭59-88092号）
などが提案されている。
ム酵素であるアルカリ性フォスファファターゼ遺伝子の
シグナル配列を利用してペリプラズムに生成、蓄積せし
める方法（例えば、特開昭58-69897号、同59-39899号）
や大腸菌の外膜タンパクである。ompＦ遺伝子を利用し
て外膜を通して分泌せしめる方法（特開昭59-88092号）
などが提案されている。
しかしながらこのような手法は未だ数が少なく、また前
者の方法ではペリプラズムへの分泌にとどまるといった
問題があり、より優れた方法の開発が望まれていた。
者の方法ではペリプラズムへの分泌にとどまるといった
問題があり、より優れた方法の開発が望まれていた。
（発明が解決しようとする問題点） そこで本発明者らは、大腸菌に菌体外産生能を付与する
手法を開発すべく鋭意検討の結果、大腸菌と同じグラム
陰性菌でありながらタクパク質を分泌する性質を有する
セラチア属細菌の菌体外タンパクのシグナルアミノ酸配
列を利用すると、意外なことに大腸菌に菌体外酸生能を
付与しうることを見い出し、本発明を完成するに到っ
た。
手法を開発すべく鋭意検討の結果、大腸菌と同じグラム
陰性菌でありながらタクパク質を分泌する性質を有する
セラチア属細菌の菌体外タンパクのシグナルアミノ酸配
列を利用すると、意外なことに大腸菌に菌体外酸生能を
付与しうることを見い出し、本発明を完成するに到っ
た。
（問題点を解決するための手段） かくして本発明によれば、セラチア属の菌体外タンパク
のシグナルアミノ酸配列をコードするDNAを含有するハ
イブリッドプラスミドが提供される。
のシグナルアミノ酸配列をコードするDNAを含有するハ
イブリッドプラスミドが提供される。
本発明のハイブリッドプラスミドは、宿主中で複製可能
なプラスミドにセラチア属細菌の菌体外タンパクのシグ
ナルアミノ酸配列をコードするDNAを組み込んだもので
ある。セラチア属細菌の菌体外タンパクとは、セラチア
属細菌（例えばセラチア・マルセッセンスＩＦＯ3046）
が細胞外に分泌するタンパクを意味し、その具体例とし
て、例えばメタルプロテアーゼ、セリンプロテアーゼSS
P-1、チオールプロテアーゼ、デオキシリボ核酸分解酵
素などが例示される。
なプラスミドにセラチア属細菌の菌体外タンパクのシグ
ナルアミノ酸配列をコードするDNAを組み込んだもので
ある。セラチア属細菌の菌体外タンパクとは、セラチア
属細菌（例えばセラチア・マルセッセンスＩＦＯ3046）
が細胞外に分泌するタンパクを意味し、その具体例とし
て、例えばメタルプロテアーゼ、セリンプロテアーゼSS
P-1、チオールプロテアーゼ、デオキシリボ核酸分解酵
素などが例示される。
このうちセリンプロテアーゼSSP-1は本発明者らが発見
した新規な酵素であり、以下のごとき理化学的性質を有
するものである。
した新規な酵素であり、以下のごとき理化学的性質を有
するものである。
1. 作用：カゼイン等のタンパク質を基質とし、これを
加水分解する。
加水分解する。
2. 至適pH：pH 9.0付近でカゼインに対する作用が至適
である。
である。
3. pH安定性：37℃30分処理した場合、pH5.5〜pH11.0
においてカゼインを基質とした場合90％以上の残存活性
を示す。
においてカゼインを基質とした場合90％以上の残存活性
を示す。
4. 至適温度：pH7.5において、カゼインを基質とした
場合45℃付近にある。
場合45℃付近にある。
5. 温度安定性：pH7.5において、40℃10分処理で95％
以上 安定であり、45℃10分処理で約90％の残存活性が
ある。
以上 安定であり、45℃10分処理で約90％の残存活性が
ある。
6. 阻害剤の影響：１mM PMSF（フエニルメタンスルホ
ニルフルオリド）と37℃30分前処理することにより完全
に失活する。10mMのEDTAと37℃30前処理しても活性に変
化はみられない。
ニルフルオリド）と37℃30分前処理することにより完全
に失活する。10mMのEDTAと37℃30前処理しても活性に変
化はみられない。
7. 分子量：約65,000(SDSポリアクリルアミドゲル電気
動泳法） 8. 活性中心：活性中心にセリンをもつセリンプロテア
ーゼに属する。
動泳法） 8. 活性中心：活性中心にセリンをもつセリンプロテア
ーゼに属する。
また本発明のシグナルアミノ酸配列は、かかる菌体外タ
ンパクを産生する能力を有するセラチア属細菌の染色体
DNAから該菌体外タンパクをコードする遺伝子部分をプ
ラスミドベクターに連結し、得られたハイブリッドプラ
スミドをエシエリヒア・コリに形質転換し、該菌体外タ
ンパク産生株を選択し、その菌体中に存在するハイブリ
ッドプラスミドのDNA配列と菌体外タンパクのＮ末端ア
ミノ酸配列を対比することによって決定することができ
る。
ンパクを産生する能力を有するセラチア属細菌の染色体
DNAから該菌体外タンパクをコードする遺伝子部分をプ
ラスミドベクターに連結し、得られたハイブリッドプラ
スミドをエシエリヒア・コリに形質転換し、該菌体外タ
ンパク産生株を選択し、その菌体中に存在するハイブリ
ッドプラスミドのDNA配列と菌体外タンパクのＮ末端ア
ミノ酸配列を対比することによって決定することができ
る。
本発明のハイブリッドプラスミドの調製に用いられる原
料プラスミドは、遺伝子操作の分野で一般に用いられて
いるものであればいずれでもよく、その具体例としてpB
R322、pBR325、PACYC184、pYEJ001などが挙げられる。
料プラスミドは、遺伝子操作の分野で一般に用いられて
いるものであればいずれでもよく、その具体例としてpB
R322、pBR325、PACYC184、pYEJ001などが挙げられる。
本発明のハイブリッドプラスミドは、常法に従って原料
プラスミドの適当な制限サイトに前記のごときシグナル
配列を含むDNA断片を挿入することによって得ることが
できる。
プラスミドの適当な制限サイトに前記のごときシグナル
配列を含むDNA断片を挿入することによって得ることが
できる。
この際、シグナルアミノ酸配列をコードするDNAの上流
には、リポゾーム結合部位（SD配列）及びプロモーター
が存在するように配慮する必要がある。
には、リポゾーム結合部位（SD配列）及びプロモーター
が存在するように配慮する必要がある。
挿入されるDNA断片は化学的に合成したものであっても
よく、またセラチア属細菌（例えばセラチア・マルセッ
センスＩＦＯ 3046）の染色体様DNAを切断して得たも
のであってもよい。
よく、またセラチア属細菌（例えばセラチア・マルセッ
センスＩＦＯ 3046）の染色体様DNAを切断して得たも
のであってもよい。
このようなハイブリッドプラスミドを創製する方法の一
例を以下に示す。
例を以下に示す。
（セラチアプロテアーゼSSP-1のシグナル配列を有する
ハイブリッドプラスミドの創製） ラチアプロテアーゼSSP-1生産能を有するセラチア属
菌、例えばセラチア・マルセッセンスIFO3046の染色体D
NAからセラチアプロテアーゼSSP-1生産性DNA断片を分離
し、これを常法に従って原料プラスミド（例えばpBR32
2）に挿入することによって目的とするハイブリッドプ
ラスミドを創製することができる。
ハイブリッドプラスミドの創製） ラチアプロテアーゼSSP-1生産能を有するセラチア属
菌、例えばセラチア・マルセッセンスIFO3046の染色体D
NAからセラチアプロテアーゼSSP-1生産性DNA断片を分離
し、これを常法に従って原料プラスミド（例えばpBR32
2）に挿入することによって目的とするハイブリッドプ
ラスミドを創製することができる。
まずセラチア・マルセッセンスIFO 3046は大量の菌体を
得るために適宜培養し集菌し、得られた菌体から染色体
DNAを抽出分離する。得られた染色体DNAはSau 3AIによ
って部分的に分解し、分解物をアガロース電気泳動にか
け、分子量1Kb以上のDNA断片を取得する。
得るために適宜培養し集菌し、得られた菌体から染色体
DNAを抽出分離する。得られた染色体DNAはSau 3AIによ
って部分的に分解し、分解物をアガロース電気泳動にか
け、分子量1Kb以上のDNA断片を取得する。
一方、市販のプラスミドpBR 322をBam HIで分解し、分
解物をBAPase（バクテリアルアルカリンホスファター
ゼ）で処理した後、これに前記DNA断片を加え、T4 DNA
ガーゼを添加して、連結反応を行なわせる。
解物をBAPase（バクテリアルアルカリンホスファター
ゼ）で処理した後、これに前記DNA断片を加え、T4 DNA
ガーゼを添加して、連結反応を行なわせる。
得られた連結反応物を常法に従ってエシエリヒア・コリ
C600(r-,m-)（プロシーデイング・オブ・ナチュラル・
アカデミイ・オブ・サイエンス）(Proceeding of Natur
al Academy of Science)71, 4579〜4588, 1974年）に対
して形質転換処理を行う。
C600(r-,m-)（プロシーデイング・オブ・ナチュラル・
アカデミイ・オブ・サイエンス）(Proceeding of Natur
al Academy of Science)71, 4579〜4588, 1974年）に対
して形質転換処理を行う。
形質転換処理菌体はスキムミルクを含有する平板培地で
培養し、白濁環（タービット・ゾーン）を生成した菌株
を単離することによって、セラチアプロテアーゼSSP-1
を菌体外に分泌生産する菌株を得ることができる。
培養し、白濁環（タービット・ゾーン）を生成した菌株
を単離することによって、セラチアプロテアーゼSSP-1
を菌体外に分泌生産する菌株を得ることができる。
ここに得られる一例示形質転換体をエシエリヒア・コリ
C600(pSP11)と命名した。また、エシエリヒア・コリC60
0(pSP11)の培養菌体から単離されるハイブリッドプラス
ミドをプラスミドpSP11と命名した。pSP11の制限酵素開
裂地図は第１図に示される。
C600(pSP11)と命名した。また、エシエリヒア・コリC60
0(pSP11)の培養菌体から単離されるハイブリッドプラス
ミドをプラスミドpSP11と命名した。pSP11の制限酵素開
裂地図は第１図に示される。
このようにして得られたpSP11の塩基配列を後記のメッ
シング(Messing)らの方法に従って分析したところ、pSP
11の一部に第２図に示すごとき配列を有することが確認
された。
シング(Messing)らの方法に従って分析したところ、pSP
11の一部に第２図に示すごとき配列を有することが確認
された。
この配列のうちシグナルアミノ酸配列に相当する部分は
第２図中の１〜81にあたる81塩基対であると判定した。
その根拠は以下のとうりである。
第２図中の１〜81にあたる81塩基対であると判定した。
その根拠は以下のとうりである。
1. 開始コドン(ATG)の６塩基対上流にSD配列に相当す
る部分が存在する。
る部分が存在する。
2. 疎水性アミノ酸に富む典型的なシグナル配列の傾向
を有する。
を有する。
3. セラチアプロテアーゼSSP-1のN末端アミノ酸配列８
個と82〜105のDNA配列が完全に一致する。
個と82〜105のDNA配列が完全に一致する。
かくして得られる本発明のハイブリッドプラスミドは、
大腸菌に対して目的とする有用なタンパク質やペプチド
の菌体外産生能を付与することができる。例えばシグナ
ル配列の下流に読み取り枠を合わせてタンパク質やペプ
チドの構造遺伝子が位置するように挿入構築することに
よって、融合タンパクまたは成熟タンパクの形で目的の
有用物質を菌体外に分泌させることができる。
大腸菌に対して目的とする有用なタンパク質やペプチド
の菌体外産生能を付与することができる。例えばシグナ
ル配列の下流に読み取り枠を合わせてタンパク質やペプ
チドの構造遺伝子が位置するように挿入構築することに
よって、融合タンパクまたは成熟タンパクの形で目的の
有用物質を菌体外に分泌させることができる。
次に本発明の実施例を示す。
実施例１ （pSP11及び形質転換の創製） セラチア・マルセッセンスIFO 3046をLB培地〔(g/)バ
クトトリプトン10.0、イーストイクストラクト5.0、NaC
l 5.0、グルコース1.0をHclでpH7.2に調製したもの〕中
26.5℃で７時間振盪培養を行ない、対数増殖後期の菌体
を集菌後、フェノール法（バイオケム・バイオフィズ・
アクタ）(Biochem. Biophys. Acta) 72, 619〜, 1963
年）により染色体DNAを抽出し精製した。
クトトリプトン10.0、イーストイクストラクト5.0、NaC
l 5.0、グルコース1.0をHclでpH7.2に調製したもの〕中
26.5℃で７時間振盪培養を行ない、対数増殖後期の菌体
を集菌後、フェノール法（バイオケム・バイオフィズ・
アクタ）(Biochem. Biophys. Acta) 72, 619〜, 1963
年）により染色体DNAを抽出し精製した。
得られた染色体DNA10μgをとり、制限エンドヌクレアー
ゼSau 3AIを加え、37℃、25分間反応させて部分分解
し、次いで反応物をアガロースゲル電気泳動にかけ、1K
bから30KbのDNA断片を回収した。
ゼSau 3AIを加え、37℃、25分間反応させて部分分解
し、次いで反応物をアガロースゲル電気泳動にかけ、1K
bから30KbのDNA断片を回収した。
一方、市販プラスミドpBR322（宝酒造製）を制限エンド
ヌクレアーゼBamHuで完全分解後BAPase（バクテリアル
アルカリンホスファターゼ）で処理した。これを先のDN
A断片とを混合し、T4 DNAリガーゼにより、16℃、14時
間DNA鎖の連結反応を行なった。
ヌクレアーゼBamHuで完全分解後BAPase（バクテリアル
アルカリンホスファターゼ）で処理した。これを先のDN
A断片とを混合し、T4 DNAリガーゼにより、16℃、14時
間DNA鎖の連結反応を行なった。
別に、エシエリヒア・コリC600(r-,m-)の培養菌を許容
（コンピテント）細胞とし、これに上記T4DNAガーゼに
より連結反応物を加え、形質転換し、LB培地中で１時間
培養したの、アンピシリン(Ap)50μg/ml、スキムミルク
1％を含むLB寒天培地でアンピシリン抵抗性(Apr)株を選
択した。形質転換はマンデル(Mandel)とヒガ(Higa)の方
法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
(J. Mol. Biol.), 53, 159(1970)〕に準じて行なった。
得られたApr株25,000のうち、コロニーの回りに白濁環
（タービットゾーン）を形成する株を２株得た。これら
２株の所有するプラスミドを常法に従って単離し、制限
酵素による切断パターンを比較したところ、全く同一の
パターンを有していた。このプラスミドをpSP11と命名
し、その制限地図を第１図に示した。またpSP11を含有
する菌をエシエリヒア・コリC600(pSP11)と命名する。
（コンピテント）細胞とし、これに上記T4DNAガーゼに
より連結反応物を加え、形質転換し、LB培地中で１時間
培養したの、アンピシリン(Ap)50μg/ml、スキムミルク
1％を含むLB寒天培地でアンピシリン抵抗性(Apr)株を選
択した。形質転換はマンデル(Mandel)とヒガ(Higa)の方
法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
(J. Mol. Biol.), 53, 159(1970)〕に準じて行なった。
得られたApr株25,000のうち、コロニーの回りに白濁環
（タービットゾーン）を形成する株を２株得た。これら
２株の所有するプラスミドを常法に従って単離し、制限
酵素による切断パターンを比較したところ、全く同一の
パターンを有していた。このプラスミドをpSP11と命名
し、その制限地図を第１図に示した。またpSP11を含有
する菌をエシエリヒア・コリC600(pSP11)と命名する。
（DNA塩基列の決定） pSP11を２種の制限酵素(HindIII、EcorI)で二重消化
し、セラチアプロテアーゼSSP-1遺伝子のシグナル配列
を含む790塩基対(bp)の大きさの断片（第１図中の に相当する部分）を単離し、M13ファージを用いたメッ
シング(Messing)らの方法（メッシング・エトアル(Mess
ing J. et al)ジーン(Gene)19 269-276(1982)、サンガ
ー，エフ，サイエンス(Science)214, 1205-1210(1981)
によりEcoRI切断サイト側から塩基配列を決定した。こ
のDNA断片には、シャイン・ダルガノ(SD)配列の直後に
開始コドンATGで始まる読み取り枠が存在し、Ｎ末端近
傍には２つのリジンと１つのアルギニンが存在し、その
後に疎水性マミノ酸が続く、いわゆるシグナル配列が存
在していた。第２図には、SD配列より下流の塩基配列を
示してある。
し、セラチアプロテアーゼSSP-1遺伝子のシグナル配列
を含む790塩基対(bp)の大きさの断片（第１図中の に相当する部分）を単離し、M13ファージを用いたメッ
シング(Messing)らの方法（メッシング・エトアル(Mess
ing J. et al)ジーン(Gene)19 269-276(1982)、サンガ
ー，エフ，サイエンス(Science)214, 1205-1210(1981)
によりEcoRI切断サイト側から塩基配列を決定した。こ
のDNA断片には、シャイン・ダルガノ(SD)配列の直後に
開始コドンATGで始まる読み取り枠が存在し、Ｎ末端近
傍には２つのリジンと１つのアルギニンが存在し、その
後に疎水性マミノ酸が続く、いわゆるシグナル配列が存
在していた。第２図には、SD配列より下流の塩基配列を
示してある。
また、後記の方法で得たセラチアプロテアーゼSSP-1に
ついて、エドマン分解法により、そのＮ末端アミノ酸配
列を決定したところ、塩基配列から予想されるアミノ酸
配列の28番目のアラニンから35番目のロイシンまでの８
マミノ酸が双方で一致した。
ついて、エドマン分解法により、そのＮ末端アミノ酸配
列を決定したところ、塩基配列から予想されるアミノ酸
配列の28番目のアラニンから35番目のロイシンまでの８
マミノ酸が双方で一致した。
（セラチアプロテアーゼSSP-1の発現） 上記のpSP11を保有する形質転換株、エシエリヒア・コ
リC600(pSP11)をLB培地に植菌し、37℃８時間培養し、
遠心により上清を集めた。この上清に硫酸アンモニウム
を60％飽和となるよう加え、４℃で12時間撹拌後、遠心
により沈澱を得た。この沈澱を10mMトリスヒドロキシメ
チルアミンpH7.9に溶解し、同液に対して３回透析し
た。この透析物を、同一の緩衝液で平衡化したアルギニ
ンセファーロース4B（ファルマシア社製）に通じて精製
セラチアプロテアーゼSSP-1を得た。
リC600(pSP11)をLB培地に植菌し、37℃８時間培養し、
遠心により上清を集めた。この上清に硫酸アンモニウム
を60％飽和となるよう加え、４℃で12時間撹拌後、遠心
により沈澱を得た。この沈澱を10mMトリスヒドロキシメ
チルアミンpH7.9に溶解し、同液に対して３回透析し
た。この透析物を、同一の緩衝液で平衡化したアルギニ
ンセファーロース4B（ファルマシア社製）に通じて精製
セラチアプロテアーゼSSP-1を得た。
実施例２ 実施例１で得たエシエリヒア・コリC 600(pSP11)を、50
μg/mlのアンピシリンを含むLB培地に接種し、６時間培
養後、遠心により集菌し、上清（菌体外画分）と菌体を
分離した。菌体は生理食塩水で２回洗浄後、高張液（20
％シュークロス、30mMトリスpH8.0）に懸濁後、終濃度1
mMのEDTAを加え、室温で10分間撹拌した。集菌後、菌体
を氷冷水中に加えて懸濁し、０℃で10分間撹拌した。遠
心により上清（ペリプラズム画分）と沈澱に分離した。
次いで、沈澱を10mMトリス・バッハーpH7.5に懸濁し、
音波処理により菌体を破砕し、遠心して上清（細胞質画
分）を得た。
μg/mlのアンピシリンを含むLB培地に接種し、６時間培
養後、遠心により集菌し、上清（菌体外画分）と菌体を
分離した。菌体は生理食塩水で２回洗浄後、高張液（20
％シュークロス、30mMトリスpH8.0）に懸濁後、終濃度1
mMのEDTAを加え、室温で10分間撹拌した。集菌後、菌体
を氷冷水中に加えて懸濁し、０℃で10分間撹拌した。遠
心により上清（ペリプラズム画分）と沈澱に分離した。
次いで、沈澱を10mMトリス・バッハーpH7.5に懸濁し、
音波処理により菌体を破砕し、遠心して上清（細胞質画
分）を得た。
このようにして得られた菌体外画分ペリプラズム画分及
び細胞質画分の各々におけるプロテアーゼ活性を測定
し、その結果を第１表に示した。また比較のため、pSP1
1の代りにpBR322を形質転換した転換株エシエリヒア・
コリC600(pB322)についても同様にして実験を行い、そ
の結果を第１表に併記した。
び細胞質画分の各々におけるプロテアーゼ活性を測定
し、その結果を第１表に示した。また比較のため、pSP1
1の代りにpBR322を形質転換した転換株エシエリヒア・
コリC600(pB322)についても同様にして実験を行い、そ
の結果を第１表に併記した。
まず5mlの0.6％カゼイン溶液（50mMリン酸バッファーpH
7.5）を10分間、37℃で放置後、粗酵素液1mlを加え37
℃、30分間反応させ、5mlのTCA溶液（0.11Mトリクロル
酢酸、0.22M酢酸、0.33M酢酸ナトリウム）を加え反応を
停止する。30分間静置後、沈澱を濾過分別し、上清の波
長280nmにおける吸光度を測定する。活性はこの吸光度
と対照の吸光度の差（ΔＡ２８０）で示される。
7.5）を10分間、37℃で放置後、粗酵素液1mlを加え37
℃、30分間反応させ、5mlのTCA溶液（0.11Mトリクロル
酢酸、0.22M酢酸、0.33M酢酸ナトリウム）を加え反応を
停止する。30分間静置後、沈澱を濾過分別し、上清の波
長280nmにおける吸光度を測定する。活性はこの吸光度
と対照の吸光度の差（ΔＡ２８０）で示される。
なお対照としては、粗酵素液1mlにTCA溶液５mlを加えた
のち、0.6％カゼイン溶液を加え、同様に処理したもの
を用いる。
のち、0.6％カゼイン溶液を加え、同様に処理したもの
を用いる。
この結果から、エシエリヒア・コリC600(pBR322)は菌体
外へプロテアーゼを分泌しないのに対し、エシエリヒア
・コリC600(pSP11)は多量のプロテアーゼを菌体外に分
泌していることがわかる。なお、菌体外のプロテアーゼ
活性は単一のプロテアーゼに起因するものであり、その
Ｎ末端配列の測定によりセラチアプロテアーゼSSP-1で
あることが確認された。
外へプロテアーゼを分泌しないのに対し、エシエリヒア
・コリC600(pSP11)は多量のプロテアーゼを菌体外に分
泌していることがわかる。なお、菌体外のプロテアーゼ
活性は単一のプロテアーゼに起因するものであり、その
Ｎ末端配列の測定によりセラチアプロテアーゼSSP-1で
あることが確認された。
また培養開始後から経時的に集菌し、プロテアーゼの分
泌の状況を観察したところ、対数増殖期の初期から菌体
外へと分泌が認められ、ペリプラズムへの滞留は観察さ
れなかった。
泌の状況を観察したところ、対数増殖期の初期から菌体
外へと分泌が認められ、ペリプラズムへの滞留は観察さ
れなかった。
これに対し大腸菌のペリプラズム酵素であるβ−ラクタ
マーゼの活性をマクロヨード法（メソッド・イン・エン
チモロジイ(Method in Enzymology)P. 69〜85、1975
年）に従がって測定したところ、エシエリヒア・コリC6
00(pSP11)、エシエリヒア・コリC600(pBR322)ともにそ
の殆どがペリプラズムに蓄積されていることが確認され
た。
マーゼの活性をマクロヨード法（メソッド・イン・エン
チモロジイ(Method in Enzymology)P. 69〜85、1975
年）に従がって測定したところ、エシエリヒア・コリC6
00(pSP11)、エシエリヒア・コリC600(pBR322)ともにそ
の殆どがペリプラズムに蓄積されていることが確認され
た。
第１図はハイブリッドプラスミドpS11の制限酵素開裂地
図を示し、第２図は第１図上部に示すpSP11の に相当するDNA断片中、SD配列、シグナル配列及びセラ
チアプロテアーゼSSP-1の遺伝子の一部から成る部分の
塩基配列を示す。
図を示し、第２図は第１図上部に示すpSP11の に相当するDNA断片中、SD配列、シグナル配列及びセラ
チアプロテアーゼSSP-1の遺伝子の一部から成る部分の
塩基配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (1)
- 【請求項１】下記のマミノ酸配列をコードするＤＮＡか
らなるセラチア属細菌の菌体外タンパクのシグナルアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するハイブリッドプ
ラスミド。 Met-Ile-Leu-Asn-Lys-Arg-Leu-Lys- Leu-Ala-Tyr-Cys-Val-Phe- Leu-Gly-Cys-Tyr-Gly-Leu-Ser- Ile-His-Ser-Leu-Ala 【請求孔２】菌体外タンパクがセラチアプロテアーゼで
ある特許請求の範囲第１項記載のプラスミド。 【請求孔３】セラチアプロテアーゼがセラチアプロテア
ーゼSSP-1である特許請求の範囲第２項記載のプラスミ
ド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60122675A JPH062066B2 (ja) | 1985-06-07 | 1985-06-07 | 新規なシグナルアミノ酸配列をコ−ドするｄｎａを有するプラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60122675A JPH062066B2 (ja) | 1985-06-07 | 1985-06-07 | 新規なシグナルアミノ酸配列をコ−ドするｄｎａを有するプラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61282080A JPS61282080A (ja) | 1986-12-12 |
| JPH062066B2 true JPH062066B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=14841848
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60122675A Expired - Lifetime JPH062066B2 (ja) | 1985-06-07 | 1985-06-07 | 新規なシグナルアミノ酸配列をコ−ドするｄｎａを有するプラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH062066B2 (ja) |
-
1985
- 1985-06-07 JP JP60122675A patent/JPH062066B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61282080A (ja) | 1986-12-12 |
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