JPH0141654B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は多孔性球状セルロース粒子の製造法に
関するものである。生化学分野の進歩にともなつ
て物質を分離、精製する手段は種々開発され、現
在はイオン交換クロマトグラフイー、ゲル過、
アフイーテイクロマトグラフイー等の方法が用い
られている。これらの方法に用いられる素材とし
て、デキストラン、アガロース、ポリアクリルア
ミド、セルロース等が知られている。ゲル過
材、イオン交換体として性能を十分に発揮させる
ために今までこれらの素材を用いて種々の試みが
なさてきた。ゲル過材として望ましい形態は分
離性能、流速等の面から球である。 現在セルロースをゲル過材として応用されて
いる実際例はまだ少ないが、球状セルロース粒子
を製造する試みは今までもなされてきた。例え
ば、特開昭48−60753、特開昭48−60754、特開昭
51−5361、特公昭52−11237などにはセルロース
粒子をそのビスコース、あるいは銅アンモニア溶
液から製造する方法を開示している。一方、酢酸
セルロースを原料とするセルロース球状粒子の製
造方法が特開昭53−7759に記載されている。 この特開昭53−7759による製造法はすぐれたも
のであり、ゲル過材として性能の良い真球状の
セルロース粒子を得ることができる。この方法は
三酢酸セルロースの塩素化炭化水素溶液又はこれ
を主体とする混合溶媒中の溶液を原液として、こ
の原液を水性媒体中に撹拌しながら滴下し、生成
した懸濁粒子を含む水性媒体を加熱して有機溶媒
を蒸発させることにより、セルロース有機酸エス
テルの球状粒子を形成し、ついでこれをけん化す
るものである。ところでゲル過材は例えば、蛋
白質などの高分子物質と食塩、尿素、硫安などの
塩と分離するいわゆる脱塩にはよく使用される。
脱塩は工業的規模でおこなわれていて、もちいら
れるゲル過材として望まれる性能は多量の試料
を迅速に純度良く分離できることである。これら
の性能を満足させるには、蛋白質と塩の溶出位置
がある程度はなれている必要がある。蛋白質と塩
の溶出位置が近いゲルでは多量の試料を処理する
場合、分離能力が低下し、純度が悪くなり工業的
には利用しにくい。 本発明の目的は前記特開昭53−7759の方法を改
良して蛋白質と塩の溶出位置が離れていて分離能
力のすぐれたゲル過材として用いうる多孔性セ
ルロース球状粒子の製造法を提供することであ
る。 本発明は、塩素化炭化水素を主とする溶媒に溶
解されたセルロース有機酸エステル溶液を水性媒
体中に懸濁させて前記溶液の液滴を形成し、前記
液滴中の塩素化炭化水素溶媒を蒸発させてセルロ
ース有機酸エステル球状粒子を形成し、次いでこ
れをけん化することにより多孔性球状セルロース
粒子を製造する方法において、前記セルロース有
機酸エステル溶液にそれを水性媒体中に懸濁させ
る前に酸又はアルカリを添加し混合させておくこ
とを要旨とするものである。 本発明に用いるセルロース有機酸エステルは特
に限定されないが、例えば、リンター、ウツドバ
ルブ、結晶性セルロース等をアシル化して得られ
る酢酸セルロース（通常酢化度45〜62.5％）、酢
酸酪酸セルロース（通常アシル化度50〜70％）、
酪酸セルロース（通常酪化度50〜70.5％）、酢酸
プロピオン酸セルロース（通常アシル化度48〜65
％）を使用することができる。 本発明において使用しうるセルロース有機酸エ
ステルの溶媒は、該セルロース有機酸エステルを
均一に溶解し得るものであれば良く、たとえば二
塩化メタン、三塩化メタン、四塩化炭素、四塩化
エタン、三塩化エタン、三塩化エチレン、四塩化
エチレン等の１種又は２種以上の混合物のような
塩素化炭化水素溶媒又はこれらを主成分として他
の有機溶媒たとえばメタノール、エタノール、ア
セトン、ニトロメタン等の少なくとも一種を添加
した混合溶媒をあげることができる。 本発明方法における酸又はアルカリの添加は、
セルロース有機酸エステルを前記溶媒に溶解後の
溶液に行つても、溶解中もしは溶解前の溶媒に行
つてもよいが、再現性等の面からはセルロース有
機酸エステルを溶解後の溶液に行うのが好まし
い。 本発明に用いうる酸としては、塩酸、臭化水素
酸、弗酸、硫酸、硝酸、りん酸、亜硫酸、及びス
ルホン酸例えばパラトルエンスルホン酸を例示す
ることができる。好ましいものは無機酸である。 本発明に用いうるアルカリとしては、アルカリ
金属又はアルカリ土類金属の水酸化物及びアルコ
ラートが例示できる。 前記酸又はアルカリは水、有機溶媒又は両者の
混合溶媒の溶液としては、又は無溶媒の形で用い
ることができる。酸又はアルカリの添加量は、純
分として、セルロース有機酸エステルに対して、
0.01〜15重量％、好ましくは0.05〜10重量％であ
る。 本発明における、セルロース有機酸エステル溶
液におけるセルロース有機酸エステル濃度は前記
溶媒に対するセルロース有機酸エステルの溶解度
の範囲内であれば良いが好ましくは溶媒100容量
部に対し１〜15重量部（容量部対重量部＝：Kg
又はml：ｇ）である。 本発明の方法においては、セルロース有機酸エ
ステル溶液に酸又はアルカリを添加した後０〜45
℃、好ましくは15〜40℃の液温において0.2〜30
時間、好ましくは0.5〜20時間撹拌混合後、該溶
液を水性媒体中に添加する。 水性媒体中には、液滴の分散、形状の保持等の
ためポリビニルアルコール、ゼラチン、CMC等
の分散剤もしくは界面活性剤（アニオン系、カチ
オン系、ノニオン系、両性及びポリマー型が使用
できる）又はこれらの両者を添加しておくことが
好ましい。分散剤の添加量は水に対して0.05〜10
重量％、界面活性剤の添加量は0.005〜１％が適
当である。また前記水性媒体中に、セルロース有
機酸エステル溶液に添加した酸又アルカリと当量
程度のアルカリ又は酸を添加しておくこともでき
る。 前記セルロース有機酸エステル溶液を水性媒体
中に添加して懸濁させ、液滴化し、ついで溶媒を
蒸発させるが、この時の温度は前記水性媒体の氷
点以上、好ましくは15℃以上で前記塩素化炭化水
素溶媒の沸点以下が適当である。ただし溶媒の蒸
発が進み、セルロース有機酸エステルが固化した
後では該溶媒の沸点以上に昇温してもよい。 以上のようにして得られるセルロース有機酸エ
ステルの球状粒子は、たとえば水、アルコール又
は両者の混合物中に分散して５〜40重量％濃度水
酸化ナトリウム水溶液を加え、室温〜50℃の温度
で撹拌することによりケン化して多孔性の球粒子
とすることができる。 本発明方法によれば蛋白質の脱塩における分離
能力のすぐれた多孔性セルロース球状粒子を得る
ことができる。また、本発明は添加する酸又はア
ルカリの量を変えることによつて排除限界分子量
及び多孔性を自由に変えることができるのも大き
な特徴である。すなわち分離する物質によつて使
い分けできるよう種々異なる排除限界分子量のゲ
ル過材を製造することも可能である。 本発明によつて得られる多孔性セルロース球状
粒子は、有効な細孔の容量が大きくかつ機械的強
度が大きいためにゲル過用のみならず、イオン
交換体やアフイニテイクロマト用の基材として使
用できるのはもちろんである。 以下、実施例により本発明を具体的に説明する
が、本発明の範囲はこれによつて限定されるもの
ではない。 以下の例においては特にことわらない限り
「部」とは重量部のことを示し、「容量部」は重量
部に対し、ｌ：Kg又はml：ｇに対応する量を示
す。 以下の例において得られたセルロース球状粒子
の性質は次のようにして求めたものである。 Kav：直径1.6cmのカラムに、水で膨潤したセ
ルロース球状粒子（以下ゲルということがある）
を高さ50cmにつめ、既知分子量のポリエチレング
リコール及び分子量200万のブルーデキストラン
を添加し、溶出液として水を使用し流速27ml／hr
でゲル過を行ない、溶出位置（ml）を示差屈折
計で求める。 Kavは次式で求められる： Kav＝Ve−Vo／Vt−Vo ここに、Ve＝ポリエチレングリコールの溶出
位置（ml）；Vo＝ゲルの保持容量であり、分子量
200万のブルーデキストランの溶出位置（ml）と
して求める；Vt＝ゲルの全容量（ml）であり、
カラムの横断面積とゲル床の高さの積として求め
る。 排除限界分子量：種々の既知分子量のポリエチ
レングリコールを用いて、目的とするゲルのKav
を求め、該ポリエチレングリコールの分子量に対
してKavをプロツトし得られた曲線点のポリエチ
レングリコールの分子量として求める。 多孔性度：多孔性の目安として下記の数値を求
めた。 （分子量62のポリエチレングリコール
のVe）−Vo／Vt この値が大きい程多孔性大であるといえる。 実施例 １ 酢酸セルロース（酢化度60〜61％；セラニーズ
社製；商品名＝セルローズトリアセテート
KB175）160部を二塩化メタン2000容量部に溶解
し、15℃に保つて36重量％の塩酸２容量部を加え
10時間撹拌する。ついでこれを35℃に保たれた水
2700部、ポリビニルアルコール27部及びドデシル
ベンゼンスルホン酸ナトリウム2.7部からな水性
媒体中に添加する。しばらく撹拌をつづけた後液
上面の気相に窒素ガスを送気し、塩化メチレンを
蒸発させる。 二塩化メタンが全量蒸発したら、生成した粒子
（酢酸セルロースの粒子）を過水洗する。吸引
ロート上で充分吸引した湿つた粒子を75容量％の
含水メタノール1600容量部に加えて懸濁させ、50
℃で30分間撹拌後、30℃以下に冷却して20重量％
の水酸化ナトリウム水溶液398部を加え、20〜30
℃で１日撹拌しけん化する。このようにして得ら
れる系を酢酸で中和し、過してセルロース球状
粒子を得る。これを充分に水洗し分級して直径50
〜100ミクロンのものを取出し製品とする。 この製品について測定した種々のポリエチレン
グリコールの分子量に対するKavを、該分子量に
対してプロツトしたものを図１の曲線E₁として
示す。この曲線E₁より、この製品の排除限界分
子量は約2000であることがわかる。またこの曲線
E₁より分子量2000以上の分子量の化合物と分子
量1000の化合物のKavに大きな差があること、即
ち溶出位置に大きな差があることがわかる。この
ことは両化合物を分離する性能がすぐれているこ
とすなわち蛋白質と低分子の塩とを分離するいわ
ゆる脱塩が性能よくおこなわれることを示してい
る。 またこの製品の多孔性度は0.47であつた。 参考例 １ 実施例１の製品を用いて分子量17000のミオグ
ロビンと分子量58の食塩との分離を次の様にして
おこない、分離度Ｒを測定した。内径1.5cmのカ
ラムに高さ49mmにゲル（実施例１の製品）を充填
し、２mlの0.05Mギ酸アンモニウム水溶液に50mg
のミオグロビンと250mgの食塩を溶解して前記カ
ラムに添加し、0.05Mギ酸アンモニウムを溶出液
として28ml／hrの流速でゲル過をおこなつた。
溶出液は10mlずつフラクシヨンコレクターで分取
した。ミオグロビンは280nｍの紫外吸収スペク
トルで、食塩は硝酸銀滴定法によるCl^-の定量で
各各測定した。各フラクシヨンの溶質の量を溶出
液量に対してプロツトしたものを図２に示す。 この図より分離度Ｒは次のようにして求められ
る。 Ｒ＝２（V₂−V₁）／W₁＋W₂ ここに、V₁とV₂は各々溶質１（食塩）と溶質２
（ミオグロビン）の溶出量（ml）、W₁，W₂は各々
溶質１，２のピークのベースライン上での巾
（ml）である。 Ｒが大きい程分離性能がすぐれている。 これよりＲ＝3.6である。 参考例 ２ 実施例１の製品につき水溶液中の牛血清アルブ
ミンと食塩の分離を次の様にしておこなつた。内
径2.6cmのカラムに高さ55.5cmにまでゲル過材
（実施例１の製品）をつめ、アルブミン濃度５％
（重量／容量）食塩濃度15％の水溶液80mlを添加
し、溶出液として水を使用して、流速95ml／hrで
ゲル過をおこなつた。溶出液は10mlずつフラク
シヨンコレクターで分取した。アルブミンは
280nmの紫外吸収スペクトルで、食塩はCl^-を硝
酸銀適定法で定量した。各フラクシヨンの溶質の
量を溶出液量に対してプロツトしたものを図３に
示す。この図から判断して第11〜20フラクシヨン
の溶出液を集めた。集めた溶出液は100mlとなり、
アルブミン濃度3.9％、食塩濃度0.14％であつた。
アルブミン回収率は98％で食塩濃度は15％から
0.14％へと低下し、非常によく脱塩されているこ
とがわかる。 比較例 １ 実施例１の方法において、酢酸セルロースの塩
化メチレン溶液に、塩酸を添加しない以外は同じ
方で製造したセルロース球状粒子の性能は次の様
であつた。 Kavとポリエチレングリコールの分子量との関
係を図１の曲線CE１に示す。排除限界分子：
1000。多孔性度：0.29。 この結果と実施例１の結果とを比較すれば、実
施例１の製品の方が、排除限界分子量が大きく、
多孔性に富み、Ｅ１とCE１における分子量2000
以上のKavと分子量200〜300のKavとの差の比較
から、分離性能がよいことが明らかである。 次に本比較例の製品をを用いて参考例１と同様
にしてミオグロビンと食塩の分離テストをおこな
つた。この結果を図４に示す。これよりＲ＝2.0
である。これと参考例２のＲ（＝3.6）とを比較す
れば本発明の製品の方が分離性能がよいことがわ
かる。 次に本比較例の製品を用いて参考例２と同様に
して牛血清アルブミンと食塩の分離を行なつた。
この結果を図５に示す。アルブミンと食塩の分離
がうまくいつていないことがわかる。この第11〜
20フラクシヨンの溶出液を集めたところアルブミ
ン回率は98％、食塩濃度５％であつた。これを参
考例の結果と比較すれば本発明の製品の方がはる
かに脱塩性能がよく分離性能がよいことがわか
る。 実施例 ２ 酢酸セルロースの塩化メチレン溶液に添加する
塩酸の量を変化させて実施例１と同様にして製造
したゲル粒子（多孔性セルロース球状粒子）の排
除限界分子量と多孔性度とを表１に示す。

【表】 表１より塩酸の添加量を変化させることによ
り、排除限界分子量と多孔性度を自由に変えるこ
とを出来ることが明らかである。 表１のNo.１のゲル粒子のKavと分子量の関係を
図１の曲線Ｅ２として示す。Ｅ２をCR１と比較
すれば本例のNo.１のゲル粒子の分離性能がすぐれ
ていることが明らかである。 実施例 ３ 硫酸を使用する以外は実施例１と同様にして製
造したセルロース粒子の性質を次の表２に示す。

【表】 表２のNo.１のゲル粒子のKavと分子量の関係を
図１の曲線Ｅ３として示す。表２より硫酸の添加
量を変化させることにより、排除限界分子量と多
孔性度を自由に変えうること、Ｅ３とCE１の比
較から本例No.１のゲル粒子の分離性能がすぐれて
いることが明らかである。 実施例 ４ 酢酸セルロースの二塩化メタン溶液へ、塩酸を
添加することに代えて40重量％水酸化ナトリウム
水溶液２容量部を酢酸セルロース溶液へ添加し、
水性媒体への添加迄の撹拌を30℃で20時間おこな
う以外は実施例１と同様にして得られたセルロー
ス粒子の排除限界分子量は2000、多孔性は0.38で
あつた。Kavと分子量との関係はほぼ図１の曲線
Ｅ１と同じであつた。 実施例 ５ 20重量％水酸化ナトリウム水溶液２容量部を使
用する以外は実施例４と同様にして製造したセル
ロース粒子の排除限界分子量は1500、多孔性は
0.36であつた。 実施例 ６ 酢酸セルロース（酢化度55％）100部を二塩化
メタン700容量部、アセトン300容量部の混合溶媒
に溶解し、18℃に保つて35重量％の塩酸１容量部
を加え、10時間撹拌する。ついで35℃に保たれた
水3000部及びゼラチン150部からなる水性媒体中
に添加する。しばらく撹拌をつづけた後液上面の
気相に窒素ガスを送気する。35℃で塩化メチレン
を除去し、ついで55℃に液温をあげアセトンの除
去をおこなう。生成した粒子を過水洗する。こ
の粒子を吸引ロート上で充分吸引し75容量％の含
水メタノール1000容量部に加えてけんだくさせ、
50℃で30分間撹拌後30℃以下に冷却して20重量％
の水酸化ナトリウム水溶液250部を加え20〜30℃
で１日撹拌し、けん化する。このようにして得ら
れる系を酢酸で中和し、過してセルロース球状
粒子を得る。これを充分に水洗し分級して直径50
〜100ミクロンのものを取出し製品とする。この
製品の性能は次の様であつた。 排除限界分子量は約2000。Kavと分子量の関係
は図１の曲線Ｅ１とほぼ同じであつた。多孔性は
0.47であつた。 実施例 ７ 酢酸酪酸セルロース（アセチル基13％、ブチル
基37％）160部を二塩化メタン1400容量部、メチ
ルエチルケトン600容量部の混合溶媒に溶解し、
15℃に保つて36重量％の塩酸２容量部を加え、10
時間撹拌する。ついで35℃に保たれた水2700部、
ポリビニルアルコール27部及びドデシルベンゼン
スルホン酸2.7部の水性媒体中に添加する。しば
らく撹拌をつづけた後液上面の気相に窒素ガスを
送気し、二塩化メタンを蒸発させる。ついで液温
を80℃にあげメチルエチルケトンの除去をおこな
い酢酸酪酸セルロースの球状粒子を得る。以後実
施例１と同様にして球状セルロースを得る。この
粒子の性質は次のようであつた。 排除限界分子量：2000。Kavと分子量の関係は
図１の曲線Ｅ１とほぼ同様であつた。 多孔性度は0.47であつた。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明方法及び従来法で得られたセルロ
ース球状粒子のKavを、用いたポリエチレングリ
コールの分子量に対してプロツトしたものであ
る。図２，３は本発明方法で得られたセルロース
球状粒子を用いてそれぞれミオグロビン（図中の
Ａ）と食塩（図中のＢ）と、及び牛血清アルブミ
ン（図中のＣ）と食塩（図中のＤ）ととを分離し
た例の結果を示す分画図、図４，５は従来法で得
られたセルロース球状粒子を用いて、それぞれ、
ミオグロビン（図中のA′）と食塩（図中のB′）
と、及び牛血清アルブミン（図中のC′）と食塩
（図中のD′）とを分離した例の結果を示す分画図
である。図２〜５において、OD₂₈₀は280nmの紫
外吸収スペクトル（吸光度）を表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 塩素化炭化水素を主とする溶媒に溶解された
   セルロース有機酸エステル溶液を水性媒体中に懸
   濁させて前記溶液の液滴を形成し、前記液滴中の
   塩素化炭化水素溶媒を蒸発させてセルロース有機
   酸エステル球状粒子を形成し、ついでこれをけん
   化することにより多孔性球状セルロース粒子を製
   造する方法において、前記セルロース有機酸エス
   テル溶液にそれを水性媒体中に懸濁させる前に酸
   又はアルカリを添加し混合させておくことを特徴
   とする多孔性球状セルロース粒子の製造方法。 ２ 第１項記載の方法において、前記セルロース
   有機酸エステルが酢酸セルロース、酢酸酪酸セル
   ロース、酪酸セルロース、プロピオン酸セルロー
   ス、酢酸プロピオン酸セルロースの内から選ばれ
   た少なくとも１種であることを特徴とする前記方
   法。 ３ 第１又は第２項記載の方法において、前記セ
   ルロース有機酸エステルの塩素化炭化水素を主と
   する溶媒の溶液における、前記懸濁前の濃度が１
   〜15重量％であることを特徴とする前記方法。 ４ 第１ないし第３項のいずれかに記載の方法に
   おいて、前記塩素化炭化水素を主とする溶媒が二
   塩化メタン、三塩化メタン、四塩化炭化素、三塩
   化エタン、四塩化エタン、三塩化エチレン、四塩
   化エチレンから選ばれる少なくとも１種を主とす
   る溶媒であることを特徴とする前記方法。 ５ 第４項記載の方法において、前記塩素化炭化
   水素を主とする溶媒が前記塩素化炭化水素を主成
   分としてメタノール酸、エタノール、アセトン及
   びニトロメタンの内の少なくとも一種を添加した
   混合溶媒であることを特徴とする前記方法。 ６ 第１ないし第５項のいずれかに記載の方法に
   おいて、前記酸又はアルカリの内、酸を用いるこ
   とを特徴とする前記方法。 ７ 第６項記載の方法において、前記酸が無機酸
   であることを特徴とする前記方法。 ８ 第７項記載の方法において、前記無機酸が塩
   酸、臭化水素酸、弗酸、硫酸、亜硫酸、りん酸及
   び硝酸の内から選ばれた少なくとも１種であるこ
   とを特徴とする前記方法。 ９ 第６項記載の方法において、前記酸がスルホ
   ン酸であることを特徴とする前記方法。 １０ 第１ないし第５項のいずれかに記載の方法
   において、前記酸又はアルカリの内、アルカリを
   用いることを特徴とする前記方法。 １１ 第１０項記載の方法において、前記アルカ
   リがアルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化
   物であることを特徴とする前記方法。 １２ 第１ないし第１１項のいずれかに記載の方
   法において、前記酸又はアルカリの添加量が前記
   セルロース有機酸エステルに対し0.01〜15重量％
   であることを特徴とする前記方法。 １３ 第１２項記載の方法において、前記酸又は
   アリカリの添加量が前記セルロース有機酸エステ
   ルに対し0.05〜10重量％であることを特徴とする
   前記方法。 １４ 第１ないし第１３項のいずれかに記載の方
   法において、前記セルロース有機酸エステル溶液
   に酸又はアルカリを添加し混合しておく方法が、
   前記塩素化炭化水素溶媒にセルロース有機酸エス
   テルを溶解後酸又はアルカリを添加し混合するこ
   とであることを特徴とする前記方法。 １５ 第１４項記載の方法において、前記セルロ
   ース有機酸エステルの溶液に酸又はエステルを溶
   解した後０〜45℃の液温に0.2〜30時間撹拌混合
   後、該溶液を水性媒体中に添加し懸濁することを
   特徴とする前記方法。