JP3133148B2 - ヒト細胞性フィブロネクチン、その製造法及び細胞株 - Google Patents
ヒト細胞性フィブロネクチン、その製造法及び細胞株Info
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト細胞性フィブロネ
クチンとその製造法及びこの方法を用いるヒト肝芽腫由
来の細胞株HUH−6YMに関する。フィブロネクチン
は、動物細胞培養における培地の添加剤として有用であ
り、さらに診断薬、化粧品及び医薬品原料としての用途
を有する。
クチンとその製造法及びこの方法を用いるヒト肝芽腫由
来の細胞株HUH−6YMに関する。フィブロネクチン
は、動物細胞培養における培地の添加剤として有用であ
り、さらに診断薬、化粧品及び医薬品原料としての用途
を有する。
【0002】
【従来の技術】一般に、フィブロネクチンは、細胞接着
性因子としての作用を有する生理活性タンパク質であ
る。その種類としては、血漿中に存在する血漿性フィブ
ロネクチンと主に線維芽細胞が産生し組織中に存在する
細胞性フィブロネクチンの2種類が知られている。これ
らのフィブロネクチンの作用は、細胞の接着及び伸展作
用だけではなく、細胞の走化性、食作用、分化、細胞形
態調節、細胞運動、ガン化及びガン転移等の現象にも深
く関与していることが報告されている。フィブロネクチ
ンは、このように細胞に対しさまざまな作用を有してい
ることから、組織損傷に対する治療薬のような医薬品へ
の応用や、皮膚組織の状態を良好にする化粧品への応用
が進められている。また、フィブロネクチンのヘパリン
やコラーゲン等のさまざまな物質に特異的に結合する性
質を利用した診断薬への応用や、診断薬マーカーとして
の応用も進められている。
性因子としての作用を有する生理活性タンパク質であ
る。その種類としては、血漿中に存在する血漿性フィブ
ロネクチンと主に線維芽細胞が産生し組織中に存在する
細胞性フィブロネクチンの2種類が知られている。これ
らのフィブロネクチンの作用は、細胞の接着及び伸展作
用だけではなく、細胞の走化性、食作用、分化、細胞形
態調節、細胞運動、ガン化及びガン転移等の現象にも深
く関与していることが報告されている。フィブロネクチ
ンは、このように細胞に対しさまざまな作用を有してい
ることから、組織損傷に対する治療薬のような医薬品へ
の応用や、皮膚組織の状態を良好にする化粧品への応用
が進められている。また、フィブロネクチンのヘパリン
やコラーゲン等のさまざまな物質に特異的に結合する性
質を利用した診断薬への応用や、診断薬マーカーとして
の応用も進められている。
【0003】しかしながら、フィブロネクチンは動物組
織又はその血漿等に由来するタンパク性の因子で、大量
に調製するためには、その原料の確保の問題及びその精
製品に対する原料由来の不純物、例えば、ウイルス等の
混入などの問題がある。
織又はその血漿等に由来するタンパク性の因子で、大量
に調製するためには、その原料の確保の問題及びその精
製品に対する原料由来の不純物、例えば、ウイルス等の
混入などの問題がある。
【0004】さらにヒト細胞性フィブロネクチンを得る
ためには、ヒト胎盤から抽出するか線維芽細胞の培養上
清から精製する方法が知られていたが、いずれも微量の
細胞性フィブロネクチンしか得られず、大量に調製する
ことは困難であった。
ためには、ヒト胎盤から抽出するか線維芽細胞の培養上
清から精製する方法が知られていたが、いずれも微量の
細胞性フィブロネクチンしか得られず、大量に調製する
ことは困難であった。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】本発明はヒト細胞性フ
ィブロネクチンを大量に調製することを目的としてい
る。
ィブロネクチンを大量に調製することを目的としてい
る。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、先にヒト
肝芽腫から分離されたHUH−6clone5(Jap
anese Cancer Research Res
ources Bank,細胞番号JCRB0401)
がタンパク性因子としてインシュリン単独を添加した無
血清培地で培養可能で、その培養上清中に著量の血漿性
フィブロネクチンを産生していることを見いだし、それ
を用いた血漿性フィブロネクチンの製造法を特許出願し
た。(特開平3−160989)。
肝芽腫から分離されたHUH−6clone5(Jap
anese Cancer Research Res
ources Bank,細胞番号JCRB0401)
がタンパク性因子としてインシュリン単独を添加した無
血清培地で培養可能で、その培養上清中に著量の血漿性
フィブロネクチンを産生していることを見いだし、それ
を用いた血漿性フィブロネクチンの製造法を特許出願し
た。(特開平3−160989)。
【0007】そこで本発明者らは、更にHUH−6cl
one5からクローニングを繰り返し、検討を行ったと
ころ、タンパク質無添加培地で培養が可能で、且つ限界
なく継代培養できるヒト肝芽腫由来変異株HUH−6Y
M(以下、細胞株HUH−6YMとする。)を見いだ
し、これを株化細胞として確立した。
one5からクローニングを繰り返し、検討を行ったと
ころ、タンパク質無添加培地で培養が可能で、且つ限界
なく継代培養できるヒト肝芽腫由来変異株HUH−6Y
M(以下、細胞株HUH−6YMとする。)を見いだ
し、これを株化細胞として確立した。
【0008】本株化細胞は細胞株HUH−6YMとし
て、FERM P−12890で微工研に寄託されてい
る。
て、FERM P−12890で微工研に寄託されてい
る。
【0009】更に、意外なことには、本細胞株HUH−
6YMが産生するフィブロネクチンは、細胞性フィブロ
ネクチンであることが明らかとなり、またこの細胞性フ
ィブロネクチンがショ糖溶液に対し高溶解性であること
を見いだした。本発明は、上記知見に基づき完成された
ものであり、それは細胞株HUH−6YMの生産するヒ
ト細胞性フィブロネクチン及び細胞株HUH−6YMを
培養し、得られた培養液から細胞性フィブロネクチンを
分離、精製し、高濃度に調製することを特徴とする細胞
性フィブロネクチンの製造方法とその方法に用いる新規
なヒト肝芽腫由来細胞株である細胞株HUH−6YMに
関するものである。
6YMが産生するフィブロネクチンは、細胞性フィブロ
ネクチンであることが明らかとなり、またこの細胞性フ
ィブロネクチンがショ糖溶液に対し高溶解性であること
を見いだした。本発明は、上記知見に基づき完成された
ものであり、それは細胞株HUH−6YMの生産するヒ
ト細胞性フィブロネクチン及び細胞株HUH−6YMを
培養し、得られた培養液から細胞性フィブロネクチンを
分離、精製し、高濃度に調製することを特徴とする細胞
性フィブロネクチンの製造方法とその方法に用いる新規
なヒト肝芽腫由来細胞株である細胞株HUH−6YMに
関するものである。
【0010】
【発明の効果】本発明により、ヒト細胞性フィブロネク
チンを大量に製造する方法が提供された。本製造方法に
よって得られる細胞性フィブロネクチンは、細胞株HU
H−6YMをタンパク質無添加培地で培養した上清から
得ることができるので、異種タンパク質やウイルス等の
混入の危険がない。
チンを大量に製造する方法が提供された。本製造方法に
よって得られる細胞性フィブロネクチンは、細胞株HU
H−6YMをタンパク質無添加培地で培養した上清から
得ることができるので、異種タンパク質やウイルス等の
混入の危険がない。
【0011】また本発明の結果、ヒト細胞性フィブロネ
クチンは、細胞の選択及び形質転換によって得られた細
胞株を用いて大量生産が可能であることが明らかにされ
た。
クチンは、細胞の選択及び形質転換によって得られた細
胞株を用いて大量生産が可能であることが明らかにされ
た。
【0012】さらに、フィブロネクチンが受精卵の着床
の際に作用することや、(Wartiovaara,
J.etal.,Develop.Biol.,197
9;247−257)細胞性フィブロネクチンは血漿性
フィブロネクチンとは異なり成人組織より胎児組織にお
いてより多く発現していること(Oyama,F.et
al.,Biochemistry,1989;28,
1428)などから、特に細胞性フィブロネクチンは、
細胞の移動及び走化性に関して重要な因子であると考え
られる。
の際に作用することや、(Wartiovaara,
J.etal.,Develop.Biol.,197
9;247−257)細胞性フィブロネクチンは血漿性
フィブロネクチンとは異なり成人組織より胎児組織にお
いてより多く発現していること(Oyama,F.et
al.,Biochemistry,1989;28,
1428)などから、特に細胞性フィブロネクチンは、
細胞の移動及び走化性に関して重要な因子であると考え
られる。
【0013】つまり組織損傷時の細胞移動を供う修復
剤、あるいは表皮細胞の恒常性を保つ因子などとして特
徴的な医薬品、化粧品及び診断薬としての利用が可能で
ある。また基本的には血漿性フィブロネクチンと同様な
生物学的活性を有する為、同様な用途に利用できる。
剤、あるいは表皮細胞の恒常性を保つ因子などとして特
徴的な医薬品、化粧品及び診断薬としての利用が可能で
ある。また基本的には血漿性フィブロネクチンと同様な
生物学的活性を有する為、同様な用途に利用できる。
【0014】
【発明の具体的な説明】本発明に用いられる細胞株HU
H−6YMは、HUH−6clone5を細胞レベルで
クローニングをした結果得られた変異株であり、HUH
−6clone5とは明らかに相違し、生物学的な変異
が見られる。既に報告されているHUH−6clone
5の染色体数は49本であるが(Sato,J.et
al;Acta Med.Okayama34(2),
127−130(1980))、HUH−6YMの染色
体数はそれより多く、また細胞株HUH−6YMはタン
パク質無添加培地で増殖可能である点で特異的である。
H−6YMは、HUH−6clone5を細胞レベルで
クローニングをした結果得られた変異株であり、HUH
−6clone5とは明らかに相違し、生物学的な変異
が見られる。既に報告されているHUH−6clone
5の染色体数は49本であるが(Sato,J.et
al;Acta Med.Okayama34(2),
127−130(1980))、HUH−6YMの染色
体数はそれより多く、また細胞株HUH−6YMはタン
パク質無添加培地で増殖可能である点で特異的である。
【0015】この細胞株HUH−6YMは、具体的には
以下に示すクローニング法により得られた。まずインシ
ュリン(0.04IU/ml)を含むe−RDF培地
(日本農芸化学会誌Vol.58,p575−583,
1984)を用いてHUH−6clone5の段階希釈
液を作製し、直径100mmのシャーレに播種し、5%
CO2含有空気、37℃条件下での2週間から4週間培
養した。
以下に示すクローニング法により得られた。まずインシ
ュリン(0.04IU/ml)を含むe−RDF培地
(日本農芸化学会誌Vol.58,p575−583,
1984)を用いてHUH−6clone5の段階希釈
液を作製し、直径100mmのシャーレに播種し、5%
CO2含有空気、37℃条件下での2週間から4週間培
養した。
【0016】形成したコロニーのうち、単一細胞から形
成されたと考えられるコロニーを選択し、24穴プレー
トに植え継ぎ、その中で細胞性フィブロネクチンの生産
量の多いクローンを先と同様な方法を用いて数次クロー
ニングを行い、細胞株HUH−6YMを得ることができ
た。またこの細胞株HUH−6YMはe−RDF培地だ
けでも増殖及び継代が可能であった。
成されたと考えられるコロニーを選択し、24穴プレー
トに植え継ぎ、その中で細胞性フィブロネクチンの生産
量の多いクローンを先と同様な方法を用いて数次クロー
ニングを行い、細胞株HUH−6YMを得ることができ
た。またこの細胞株HUH−6YMはe−RDF培地だ
けでも増殖及び継代が可能であった。
【0017】また、細胞性フィブロネクチンのみに存在
するED−A及びED−B領域と呼ばれるペプチドに対
するcDNAプローブを作製し、HUH−6YMのmR
NAを調べたところ、ED−A及びED−B領域の存在
が確認された。
するED−A及びED−B領域と呼ばれるペプチドに対
するcDNAプローブを作製し、HUH−6YMのmR
NAを調べたところ、ED−A及びED−B領域の存在
が確認された。
【0018】このようにして得られた細胞株HUH−6
YMの生物学的性質をまとめると以下の通りである。 ヒト肝芽腫由来細胞株HUH−6clone5由来の
変異株である。 アミノ酸、ビタミン類、糖類及び無機塩類から成る基
礎培地で増殖し、限界なく継代培養が可能である。すな
わち増殖因子としてタンパク性因子を必要としない細胞
株である。 ヒト細胞性フィブロネクチンを著量産生する。 ED−A及びED−B領域を含むフィブロネクチンの
mRNAが発現されている。
YMの生物学的性質をまとめると以下の通りである。 ヒト肝芽腫由来細胞株HUH−6clone5由来の
変異株である。 アミノ酸、ビタミン類、糖類及び無機塩類から成る基
礎培地で増殖し、限界なく継代培養が可能である。すな
わち増殖因子としてタンパク性因子を必要としない細胞
株である。 ヒト細胞性フィブロネクチンを著量産生する。 ED−A及びED−B領域を含むフィブロネクチンの
mRNAが発現されている。
【0019】次に細胞株HUH−6YMを培養し、ヒト
細胞性フィブロネクチンを製造する方法について説明す
る。
細胞性フィブロネクチンを製造する方法について説明す
る。
【0020】細胞株HUH−6YMの培養は、種培養と
してシャーレで培養する。継代を繰り返し、次の連続培
養で必要な細胞数を確保する。使用する培地としては、
市販されているe−RDF培地が適しているが、これに
限定されるものではなく、その成分に準じて調製される
培地はどのようなものでも使用可能である。また添加成
分としては、タンパク性因子は特に必要ないが、細胞に
悪影響を与えない限り、添加されていてもかまわない。
してシャーレで培養する。継代を繰り返し、次の連続培
養で必要な細胞数を確保する。使用する培地としては、
市販されているe−RDF培地が適しているが、これに
限定されるものではなく、その成分に準じて調製される
培地はどのようなものでも使用可能である。また添加成
分としては、タンパク性因子は特に必要ないが、細胞に
悪影響を与えない限り、添加されていてもかまわない。
【0021】培養条件は、特に規定されるものではない
が、培養温度は36〜37℃で、気相条件は、シャーレ
等による種培養において5%程度のCO2を含有する空
気が適当である。しかし、連続培養においては特にCO
2等を調製した空気の必要はない。
が、培養温度は36〜37℃で、気相条件は、シャーレ
等による種培養において5%程度のCO2を含有する空
気が適当である。しかし、連続培養においては特にCO
2等を調製した空気の必要はない。
【0022】連続培養の方法は、特に限定されるもので
はないが、一般的な方法であるローラーボトルを用いた
方法で行うことが可能である。この場合、そのローラー
ボトル内の細胞数に応じて培地の交換を適切な時期に行
っていくものである。
はないが、一般的な方法であるローラーボトルを用いた
方法で行うことが可能である。この場合、そのローラー
ボトル内の細胞数に応じて培地の交換を適切な時期に行
っていくものである。
【0023】このような方法で得られた細胞株HUH−
6YMの培養上清が、次の精製の原料となる。
6YMの培養上清が、次の精製の原料となる。
【0024】細胞性フィブロネクチンの精製には、一般
的なタンパク質精製に用いられる方法を用いることがで
きるが、その1例をあげれば次の通りである。
的なタンパク質精製に用いられる方法を用いることがで
きるが、その1例をあげれば次の通りである。
【0025】まず培養上清に適当なプロテアーゼインヒ
ビターを添加し、次に遠心分離に付し細胞片等の不純物
を除去した後に、限外ロ過法によって濃縮を行い、培養
上清中の細胞性フィブロネクチンを適当な濃度にまで上
げる。これは次の精製を効率化するためである。濃縮さ
れた上清は、PBS(−)(Phosphate Bu
ffered Saline)で平衡化したゼラチンア
フィニティーカラムに負荷する。その後、PBS(−)
に6M尿素を溶解した緩衝液で溶出させ、その溶出画分
を得る。この画分中での細胞性フィブロネクチンの純度
は、電気泳動法による検定によると95%以上である
が、さらに純度を高めるためには、一般的なイオン交換
法などの他の方法を用いて高純度化することができる
が、細胞性フィブロネクチンは、通常PBS(−)のよ
うな緩衝液中では非常に溶解度が低いため、すべて尿素
存在下で分離操作を行う必要がある。
ビターを添加し、次に遠心分離に付し細胞片等の不純物
を除去した後に、限外ロ過法によって濃縮を行い、培養
上清中の細胞性フィブロネクチンを適当な濃度にまで上
げる。これは次の精製を効率化するためである。濃縮さ
れた上清は、PBS(−)(Phosphate Bu
ffered Saline)で平衡化したゼラチンア
フィニティーカラムに負荷する。その後、PBS(−)
に6M尿素を溶解した緩衝液で溶出させ、その溶出画分
を得る。この画分中での細胞性フィブロネクチンの純度
は、電気泳動法による検定によると95%以上である
が、さらに純度を高めるためには、一般的なイオン交換
法などの他の方法を用いて高純度化することができる
が、細胞性フィブロネクチンは、通常PBS(−)のよ
うな緩衝液中では非常に溶解度が低いため、すべて尿素
存在下で分離操作を行う必要がある。
【0026】その後、尿素を除去し、ある濃度以上の細
胞性フィブロネクチン溶液を調製するために5%ショ糖
を含むリン酸緩衝液と緩衝液交換を行う。緩衝液で交換
を行う方法としては、一般的な方法である膜透析法や限
外ロ過を用いてダイアフィルトレーション法によって行
うことができる。
胞性フィブロネクチン溶液を調製するために5%ショ糖
を含むリン酸緩衝液と緩衝液交換を行う。緩衝液で交換
を行う方法としては、一般的な方法である膜透析法や限
外ロ過を用いてダイアフィルトレーション法によって行
うことができる。
【0027】このようにして得られるヒト細胞性フィブ
ロネクチンは、二量体と単量体の混合物として得られ
る。細胞性フィブロネクチンの構造上の特徴としては、
還元条件下及び非還元条件下のSDSポリアクリルアミ
ドゲル泳動の分析によると、その分子量が血漿性フィブ
ロネクチン標品より大きく、また市販の抗細胞性フィブ
ロネクチン抗体と反応する。
ロネクチンは、二量体と単量体の混合物として得られ
る。細胞性フィブロネクチンの構造上の特徴としては、
還元条件下及び非還元条件下のSDSポリアクリルアミ
ドゲル泳動の分析によると、その分子量が血漿性フィブ
ロネクチン標品より大きく、また市販の抗細胞性フィブ
ロネクチン抗体と反応する。
【0028】以下に細胞株HUH−6YMを用いて製造
したヒト細胞性フィブロネクチンの諸性質を示す。 分子量 還元及び非還元状態におけるSDSポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により二量体が470kd,単量体が24
5kdと225kdを示し、二量体と単量体の比が2:
1である。 等電点:pH5〜6 免疫学的特異性 市販の抗細胞性フィブロネクチン抗体(シグマ社製、M
ONOCLONAL ANTI−CELLULAR F
IBRONECTIN,Product No.F61
40)と反応し、抗ヒトフィブロネクチン抗体(宝酒造
製、clone30−8)とも反応する。 プロテアーゼによる断片化の結果、本発明のヒト細胞
性フィブロネクチンのプロテアーゼによる断片は、ヒト
血漿性フィブロネクチンのプロテアーゼ断片と明らかに
異なっていた。 また本発明で製造されたヒト細胞性フィブロネクチン
は、既に報告されている細胞接着促進活性、ゼラチンビ
ーズ凝集能及び細胞伸展活性などフィブロネクチンの生
物学的作用を有する。
したヒト細胞性フィブロネクチンの諸性質を示す。 分子量 還元及び非還元状態におけるSDSポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により二量体が470kd,単量体が24
5kdと225kdを示し、二量体と単量体の比が2:
1である。 等電点:pH5〜6 免疫学的特異性 市販の抗細胞性フィブロネクチン抗体(シグマ社製、M
ONOCLONAL ANTI−CELLULAR F
IBRONECTIN,Product No.F61
40)と反応し、抗ヒトフィブロネクチン抗体(宝酒造
製、clone30−8)とも反応する。 プロテアーゼによる断片化の結果、本発明のヒト細胞
性フィブロネクチンのプロテアーゼによる断片は、ヒト
血漿性フィブロネクチンのプロテアーゼ断片と明らかに
異なっていた。 また本発明で製造されたヒト細胞性フィブロネクチン
は、既に報告されている細胞接着促進活性、ゼラチンビ
ーズ凝集能及び細胞伸展活性などフィブロネクチンの生
物学的作用を有する。
【0029】以上のように細胞株HUH−6YMを用
い、タンパク質無添加培地で、大量の細胞を連続培養す
ることで、非常に有利にヒト細胞性フィブロネクチンを
製造することができる。
い、タンパク質無添加培地で、大量の細胞を連続培養す
ることで、非常に有利にヒト細胞性フィブロネクチンを
製造することができる。
【0030】
【I.物質の生産】種培養として、細胞株HUH−6Y
M(FERM P−12890)をe−RDF培地(極
東製薬製)を用いて継代培養した。培養は37℃、5%
CO2を含む空気で、1ヶ月間行った。
M(FERM P−12890)をe−RDF培地(極
東製薬製)を用いて継代培養した。培養は37℃、5%
CO2を含む空気で、1ヶ月間行った。
【0031】培養上清を得るための連続培養は、175
0cm2のローラーボトル(ファルコン社製)1本当た
り1×109個の細胞を播種し、37℃、大気下で培養
した。播種後3週間までは、2〜3日間隔で、その後は
毎日ローラーボトル1本当たり500mlの培地を全量
交換し、得られた培養上清を回収した。連続培養は約3
ヵ月行った。(図1)
0cm2のローラーボトル(ファルコン社製)1本当た
り1×109個の細胞を播種し、37℃、大気下で培養
した。播種後3週間までは、2〜3日間隔で、その後は
毎日ローラーボトル1本当たり500mlの培地を全量
交換し、得られた培養上清を回収した。連続培養は約3
ヵ月行った。(図1)
【0032】培養上清は、プロテアーゼインヒビターと
して5mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウム(EDT
A)を添加した後、連続遠心分離し1500g、流速2
0L/分、(国産製H600−S)により細胞断片等の
不純物を除去し上澄を回収した。
して5mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウム(EDT
A)を添加した後、連続遠心分離し1500g、流速2
0L/分、(国産製H600−S)により細胞断片等の
不純物を除去し上澄を回収した。
【0033】次に、分画分子量100k(フィルトロン
社製、型式OS100CO5)の限外ロ過膜を用いて先
の上澄の10倍濃縮液を調製した。これを、PBS
(−)で平衡化したゼラチンセファロース4Bカラム
(ファルマシア社製)負荷し、PBS(−)で洗浄し、
平衡化した。続いてPBS(−)に6M尿素を溶解させ
た緩衝液で溶出を行った。
社製、型式OS100CO5)の限外ロ過膜を用いて先
の上澄の10倍濃縮液を調製した。これを、PBS
(−)で平衡化したゼラチンセファロース4Bカラム
(ファルマシア社製)負荷し、PBS(−)で洗浄し、
平衡化した。続いてPBS(−)に6M尿素を溶解させ
た緩衝液で溶出を行った。
【0034】この溶出液中の細胞性フィブロネクチンの
純度は、還元状態下でのSDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法による検定の結果95%以上であった。
純度は、還元状態下でのSDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法による検定の結果95%以上であった。
【0035】この溶出液を集め、分画分子量100kの
限外ロ過膜(フィルトロン社製、型式OS−100CO
1)を用いて、まず溶出液を濃縮し、続いてダイアフィ
ルトレーション法により、5%ショ糖を含む0.1Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液と溶媒交換を行った。
限外ロ過膜(フィルトロン社製、型式OS−100CO
1)を用いて、まず溶出液を濃縮し、続いてダイアフィ
ルトレーション法により、5%ショ糖を含む0.1Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液と溶媒交換を行った。
【0036】以上のような方法で、ヒト細胞性フィブロ
ネクチン標品が得られた。
ネクチン標品が得られた。
【0037】
(1)分子量
【0038】上記、ヒト細胞性フィブロネクチン標品の
分子量をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
って、標準タンパク質及びヒト血漿性フィブロネクチン
標品(岩城硝子社製)と還元及び非還元状態下で比較し
た。
分子量をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
って、標準タンパク質及びヒト血漿性フィブロネクチン
標品(岩城硝子社製)と還元及び非還元状態下で比較し
た。
【0039】その結果、本発明のヒト細胞性フィブロネ
クチン標品の分子量は二量体が470kd、単量体が2
45kdと225kdと推定され、ヒト血漿性フィブロ
ネクチンよりも大きな分子量を有することが明らかにな
かった。(図2) (2)免疫学的反応性
クチン標品の分子量は二量体が470kd、単量体が2
45kdと225kdと推定され、ヒト血漿性フィブロ
ネクチンよりも大きな分子量を有することが明らかにな
かった。(図2) (2)免疫学的反応性
【0040】血漿性フィブロネクチンには反応せず、細
胞性フィブロネクチンのみに反応する抗細胞性フィブロ
ネクチン(シグマ社製、Product No.F−6
140)を用いてウエスタンブロッティング後の免疫染
色法により反応性の確認を行った。その結果、本標品は
この特異抗体と反応した。またヒトフィブロネクチン抗
体(宝酒造製、clone30−8)とも反応した。 (3)プロテアーゼによる断片化
胞性フィブロネクチンのみに反応する抗細胞性フィブロ
ネクチン(シグマ社製、Product No.F−6
140)を用いてウエスタンブロッティング後の免疫染
色法により反応性の確認を行った。その結果、本標品は
この特異抗体と反応した。またヒトフィブロネクチン抗
体(宝酒造製、clone30−8)とも反応した。 (3)プロテアーゼによる断片化
【0041】サーモリシンを用いてヒト血漿性フィブロ
ネクチンと本発明の細胞性フィブロネクチンのプロテア
ーゼによる断片の分子量の差について検討を行った。さ
らに得られた断片物の免疫学的反応性について検討し
た。
ネクチンと本発明の細胞性フィブロネクチンのプロテア
ーゼによる断片の分子量の差について検討を行った。さ
らに得られた断片物の免疫学的反応性について検討し
た。
【0042】その結果、本発明の細胞性フィブロネクチ
ンはプロテアーゼによる断片の大きさがヒト血漿性フィ
ブロネクチンとは明らかに異なり、さらのモノクローナ
ル抗体による断片の免疫学的反応性によりED−A及び
ED−B領域を含む細胞性フィブロネクチンであると考
えられた。
ンはプロテアーゼによる断片の大きさがヒト血漿性フィ
ブロネクチンとは明らかに異なり、さらのモノクローナ
ル抗体による断片の免疫学的反応性によりED−A及び
ED−B領域を含む細胞性フィブロネクチンであると考
えられた。
【0043】上記の分子量と免疫学的反応性、プロテア
ーゼによる断片及び細胞のmRNAの分析の結果、本発
明で得られたフィブロネクチンは、ED−A及びED−
B領域を含むヒト細胞性フィブロネクチンであると判断
された。
ーゼによる断片及び細胞のmRNAの分析の結果、本発
明で得られたフィブロネクチンは、ED−A及びED−
B領域を含むヒト細胞性フィブロネクチンであると判断
された。
【0044】(4)水溶性 既報によると、細胞性フィブロネクチンはpH6から8
の緩衝液に対し、非常に溶解性が低いことが報告されて
いる。
の緩衝液に対し、非常に溶解性が低いことが報告されて
いる。
【0045】本発明においては、細胞性フィブロネクチ
ンが、ショ糖を含む緩衝液に対し易溶性であることが見
いだされた。各ショ糖濃度に対する溶解性は次の表1に
示される。
ンが、ショ糖を含む緩衝液に対し易溶性であることが見
いだされた。各ショ糖濃度に対する溶解性は次の表1に
示される。
【0046】
【表1】
【図1】連続培養中において細胞株HUH−6YMが、
培養上清中に産生するフィブロネクチン濃度の培養期間
に対する変化を示す図。
培養上清中に産生するフィブロネクチン濃度の培養期間
に対する変化を示す図。
【図2】本発明のヒト細胞性フィブロネクチンをSDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた結果を示す。
比較対照としては、ヒト血漿性フィブロネクチン標品を
用いている。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた結果を示す。
比較対照としては、ヒト血漿性フィブロネクチン標品を
用いている。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12P 21/00 - 21/02 C07K 14/78 BIOSIS(DIALOG) WPI(DIALOG)
Claims (2)
- 【請求項1】 細胞株HUH−6YM、FERM P−
12890を培養し、得られた培養物から下記の性質を
有するヒト細胞性フィブロネクチンを分離することを特
徴とするヒト細胞性フィブロネクチンの製造方法。非
還元状態におけるSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動により二量体が470kdを示す。 等電点:pH5〜6 免疫学的特異性 市販の抗細胞性フィブロネクチン抗体及び抗フィブロネ
クチン抗体と反応する。現在までに報告されているフ
ィブロネクチンの細胞接着促進活性、ゼラチンビーズ凝
集能及び細胞伸展活性等の種々の生物学的作用を有す
る。細胞株HUH−6YM、FERM P−1289
0を培養し、得られた培養物から生産することが可能で
ある。 - 【請求項2】 下記の性質を有する細胞株HUH−6Y
M、FERM P−12890。ヒト肝芽腫由来細胞
株HUH−6clone5由来の変異株である。アミ
ノ酸、ビタミン類、糖類及び無機塩類から成る基礎培地
で増殖し、限界なく継代培養が可能である。すなわち増
殖因子としてタンパク性因子を必要としない細胞株であ
る。HUH−6YMは、ヒト細胞性フィブロネクチン
を著量産生する。ED−A及びED−B領域を含むフ
ィブロネクチンのmRNAが発現されている。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP04143744A JP3133148B2 (ja) | 1992-05-11 | 1992-05-11 | ヒト細胞性フィブロネクチン、その製造法及び細胞株 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP04143744A JP3133148B2 (ja) | 1992-05-11 | 1992-05-11 | ヒト細胞性フィブロネクチン、その製造法及び細胞株 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH05310795A JPH05310795A (ja) | 1993-11-22 |
JP3133148B2 true JP3133148B2 (ja) | 2001-02-05 |
Family
ID=15346009
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP04143744A Expired - Fee Related JP3133148B2 (ja) | 1992-05-11 | 1992-05-11 | ヒト細胞性フィブロネクチン、その製造法及び細胞株 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3133148B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7678570B2 (en) | 2004-03-01 | 2010-03-16 | Kitakyushu Foundation For The Advancement Of Industry, Science And Technology | Human cell strains for protein production, provided by selecting strains with high intracellular protein and mutating with carcinogens |
-
1992
- 1992-05-11 JP JP04143744A patent/JP3133148B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
J.Biol.Chem.,Vol.259,No.15,p.9899−9905(1984) |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH05310795A (ja) | 1993-11-22 |
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---|---|---|---|
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