JP3133148B2 - ヒト細胞性フィブロネクチン、その製造法及び細胞株 - Google Patents
ヒト細胞性フィブロネクチン、その製造法及び細胞株Info
- Publication number
- JP3133148B2 JP3133148B2 JP04143744A JP14374492A JP3133148B2 JP 3133148 B2 JP3133148 B2 JP 3133148B2 JP 04143744 A JP04143744 A JP 04143744A JP 14374492 A JP14374492 A JP 14374492A JP 3133148 B2 JP3133148 B2 JP 3133148B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fibronectin
- cell line
- huh
- cellular fibronectin
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト細胞性フィブロネ
クチンとその製造法及びこの方法を用いるヒト肝芽腫由
来の細胞株ＨＵＨ−６ＹＭに関する。フィブロネクチン
は、動物細胞培養における培地の添加剤として有用であ
り、さらに診断薬、化粧品及び医薬品原料としての用途
を有する。
クチンとその製造法及びこの方法を用いるヒト肝芽腫由
来の細胞株ＨＵＨ−６ＹＭに関する。フィブロネクチン
は、動物細胞培養における培地の添加剤として有用であ
り、さらに診断薬、化粧品及び医薬品原料としての用途
を有する。
【０００２】
【従来の技術】一般に、フィブロネクチンは、細胞接着
性因子としての作用を有する生理活性タンパク質であ
る。その種類としては、血漿中に存在する血漿性フィブ
ロネクチンと主に線維芽細胞が産生し組織中に存在する
細胞性フィブロネクチンの２種類が知られている。これ
らのフィブロネクチンの作用は、細胞の接着及び伸展作
用だけではなく、細胞の走化性、食作用、分化、細胞形
態調節、細胞運動、ガン化及びガン転移等の現象にも深
く関与していることが報告されている。フィブロネクチ
ンは、このように細胞に対しさまざまな作用を有してい
ることから、組織損傷に対する治療薬のような医薬品へ
の応用や、皮膚組織の状態を良好にする化粧品への応用
が進められている。また、フィブロネクチンのヘパリン
やコラーゲン等のさまざまな物質に特異的に結合する性
質を利用した診断薬への応用や、診断薬マーカーとして
の応用も進められている。
性因子としての作用を有する生理活性タンパク質であ
る。その種類としては、血漿中に存在する血漿性フィブ
ロネクチンと主に線維芽細胞が産生し組織中に存在する
細胞性フィブロネクチンの２種類が知られている。これ
らのフィブロネクチンの作用は、細胞の接着及び伸展作
用だけではなく、細胞の走化性、食作用、分化、細胞形
態調節、細胞運動、ガン化及びガン転移等の現象にも深
く関与していることが報告されている。フィブロネクチ
ンは、このように細胞に対しさまざまな作用を有してい
ることから、組織損傷に対する治療薬のような医薬品へ
の応用や、皮膚組織の状態を良好にする化粧品への応用
が進められている。また、フィブロネクチンのヘパリン
やコラーゲン等のさまざまな物質に特異的に結合する性
質を利用した診断薬への応用や、診断薬マーカーとして
の応用も進められている。
【０００３】しかしながら、フィブロネクチンは動物組
織又はその血漿等に由来するタンパク性の因子で、大量
に調製するためには、その原料の確保の問題及びその精
製品に対する原料由来の不純物、例えば、ウイルス等の
混入などの問題がある。
織又はその血漿等に由来するタンパク性の因子で、大量
に調製するためには、その原料の確保の問題及びその精
製品に対する原料由来の不純物、例えば、ウイルス等の
混入などの問題がある。
【０００４】さらにヒト細胞性フィブロネクチンを得る
ためには、ヒト胎盤から抽出するか線維芽細胞の培養上
清から精製する方法が知られていたが、いずれも微量の
細胞性フィブロネクチンしか得られず、大量に調製する
ことは困難であった。
ためには、ヒト胎盤から抽出するか線維芽細胞の培養上
清から精製する方法が知られていたが、いずれも微量の
細胞性フィブロネクチンしか得られず、大量に調製する
ことは困難であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明はヒト細胞性フ
ィブロネクチンを大量に調製することを目的としてい
る。
ィブロネクチンを大量に調製することを目的としてい
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、先にヒト
肝芽腫から分離されたＨＵＨ−６ｃｌｏｎｅ５（Ｊａｐ
ａｎｅｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓ
ｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ，細胞番号ＪＣＲＢ０４０１）
がタンパク性因子としてインシュリン単独を添加した無
血清培地で培養可能で、その培養上清中に著量の血漿性
フィブロネクチンを産生していることを見いだし、それ
を用いた血漿性フィブロネクチンの製造法を特許出願し
た。（特開平３−１６０９８９）。
肝芽腫から分離されたＨＵＨ−６ｃｌｏｎｅ５（Ｊａｐ
ａｎｅｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓ
ｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ，細胞番号ＪＣＲＢ０４０１）
がタンパク性因子としてインシュリン単独を添加した無
血清培地で培養可能で、その培養上清中に著量の血漿性
フィブロネクチンを産生していることを見いだし、それ
を用いた血漿性フィブロネクチンの製造法を特許出願し
た。（特開平３−１６０９８９）。
【０００７】そこで本発明者らは、更にＨＵＨ−６ｃｌ
ｏｎｅ５からクローニングを繰り返し、検討を行ったと
ころ、タンパク質無添加培地で培養が可能で、且つ限界
なく継代培養できるヒト肝芽腫由来変異株ＨＵＨ−６Ｙ
Ｍ（以下、細胞株ＨＵＨ−６ＹＭとする。）を見いだ
し、これを株化細胞として確立した。
ｏｎｅ５からクローニングを繰り返し、検討を行ったと
ころ、タンパク質無添加培地で培養が可能で、且つ限界
なく継代培養できるヒト肝芽腫由来変異株ＨＵＨ−６Ｙ
Ｍ（以下、細胞株ＨＵＨ−６ＹＭとする。）を見いだ
し、これを株化細胞として確立した。
【０００８】本株化細胞は細胞株ＨＵＨ−６ＹＭとし
て、ＦＥＲＭ Ｐ−１２８９０で微工研に寄託されてい
る。
て、ＦＥＲＭ Ｐ−１２８９０で微工研に寄託されてい
る。
【０００９】更に、意外なことには、本細胞株ＨＵＨ−
６ＹＭが産生するフィブロネクチンは、細胞性フィブロ
ネクチンであることが明らかとなり、またこの細胞性フ
ィブロネクチンがショ糖溶液に対し高溶解性であること
を見いだした。本発明は、上記知見に基づき完成された
ものであり、それは細胞株ＨＵＨ−６ＹＭの生産するヒ
ト細胞性フィブロネクチン及び細胞株ＨＵＨ−６ＹＭを
培養し、得られた培養液から細胞性フィブロネクチンを
分離、精製し、高濃度に調製することを特徴とする細胞
性フィブロネクチンの製造方法とその方法に用いる新規
なヒト肝芽腫由来細胞株である細胞株ＨＵＨ−６ＹＭに
関するものである。
６ＹＭが産生するフィブロネクチンは、細胞性フィブロ
ネクチンであることが明らかとなり、またこの細胞性フ
ィブロネクチンがショ糖溶液に対し高溶解性であること
を見いだした。本発明は、上記知見に基づき完成された
ものであり、それは細胞株ＨＵＨ−６ＹＭの生産するヒ
ト細胞性フィブロネクチン及び細胞株ＨＵＨ−６ＹＭを
培養し、得られた培養液から細胞性フィブロネクチンを
分離、精製し、高濃度に調製することを特徴とする細胞
性フィブロネクチンの製造方法とその方法に用いる新規
なヒト肝芽腫由来細胞株である細胞株ＨＵＨ−６ＹＭに
関するものである。
【００１０】
【発明の効果】本発明により、ヒト細胞性フィブロネク
チンを大量に製造する方法が提供された。本製造方法に
よって得られる細胞性フィブロネクチンは、細胞株ＨＵ
Ｈ−６ＹＭをタンパク質無添加培地で培養した上清から
得ることができるので、異種タンパク質やウイルス等の
混入の危険がない。
チンを大量に製造する方法が提供された。本製造方法に
よって得られる細胞性フィブロネクチンは、細胞株ＨＵ
Ｈ−６ＹＭをタンパク質無添加培地で培養した上清から
得ることができるので、異種タンパク質やウイルス等の
混入の危険がない。
【００１１】また本発明の結果、ヒト細胞性フィブロネ
クチンは、細胞の選択及び形質転換によって得られた細
胞株を用いて大量生産が可能であることが明らかにされ
た。
クチンは、細胞の選択及び形質転換によって得られた細
胞株を用いて大量生産が可能であることが明らかにされ
た。
【００１２】さらに、フィブロネクチンが受精卵の着床
の際に作用することや、（Ｗａｒｔｉｏｖａａｒａ，
Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．，１９７
９；２４７−２５７）細胞性フィブロネクチンは血漿性
フィブロネクチンとは異なり成人組織より胎児組織にお
いてより多く発現していること（Ｏｙａｍａ，Ｆ．ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９；２８，
１４２８）などから、特に細胞性フィブロネクチンは、
細胞の移動及び走化性に関して重要な因子であると考え
られる。
の際に作用することや、（Ｗａｒｔｉｏｖａａｒａ，
Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．，１９７
９；２４７−２５７）細胞性フィブロネクチンは血漿性
フィブロネクチンとは異なり成人組織より胎児組織にお
いてより多く発現していること（Ｏｙａｍａ，Ｆ．ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９；２８，
１４２８）などから、特に細胞性フィブロネクチンは、
細胞の移動及び走化性に関して重要な因子であると考え
られる。
【００１３】つまり組織損傷時の細胞移動を供う修復
剤、あるいは表皮細胞の恒常性を保つ因子などとして特
徴的な医薬品、化粧品及び診断薬としての利用が可能で
ある。また基本的には血漿性フィブロネクチンと同様な
生物学的活性を有する為、同様な用途に利用できる。
剤、あるいは表皮細胞の恒常性を保つ因子などとして特
徴的な医薬品、化粧品及び診断薬としての利用が可能で
ある。また基本的には血漿性フィブロネクチンと同様な
生物学的活性を有する為、同様な用途に利用できる。
【００１４】
【発明の具体的な説明】本発明に用いられる細胞株ＨＵ
Ｈ−６ＹＭは、ＨＵＨ−６ｃｌｏｎｅ５を細胞レベルで
クローニングをした結果得られた変異株であり、ＨＵＨ
−６ｃｌｏｎｅ５とは明らかに相違し、生物学的な変異
が見られる。既に報告されているＨＵＨ−６ｃｌｏｎｅ
５の染色体数は４９本であるが（Ｓａｔｏ，Ｊ．ｅｔ
ａｌ；Ａｃｔａ Ｍｅｄ．Ｏｋａｙａｍａ３４（２），
１２７−１３０（１９８０））、ＨＵＨ−６ＹＭの染色
体数はそれより多く、また細胞株ＨＵＨ−６ＹＭはタン
パク質無添加培地で増殖可能である点で特異的である。
Ｈ−６ＹＭは、ＨＵＨ−６ｃｌｏｎｅ５を細胞レベルで
クローニングをした結果得られた変異株であり、ＨＵＨ
−６ｃｌｏｎｅ５とは明らかに相違し、生物学的な変異
が見られる。既に報告されているＨＵＨ−６ｃｌｏｎｅ
５の染色体数は４９本であるが（Ｓａｔｏ，Ｊ．ｅｔ
ａｌ；Ａｃｔａ Ｍｅｄ．Ｏｋａｙａｍａ３４（２），
１２７−１３０（１９８０））、ＨＵＨ−６ＹＭの染色
体数はそれより多く、また細胞株ＨＵＨ−６ＹＭはタン
パク質無添加培地で増殖可能である点で特異的である。
【００１５】この細胞株ＨＵＨ−６ＹＭは、具体的には
以下に示すクローニング法により得られた。まずインシ
ュリン（０．０４ＩＵ／ｍｌ）を含むｅ−ＲＤＦ培地
（日本農芸化学会誌Ｖｏｌ．５８，ｐ５７５−５８３，
１９８４）を用いてＨＵＨ−６ｃｌｏｎｅ５の段階希釈
液を作製し、直径１００ｍｍのシャーレに播種し、５％
ＣＯ2含有空気、３７℃条件下での２週間から４週間培
養した。
以下に示すクローニング法により得られた。まずインシ
ュリン（０．０４ＩＵ／ｍｌ）を含むｅ−ＲＤＦ培地
（日本農芸化学会誌Ｖｏｌ．５８，ｐ５７５−５８３，
１９８４）を用いてＨＵＨ−６ｃｌｏｎｅ５の段階希釈
液を作製し、直径１００ｍｍのシャーレに播種し、５％
ＣＯ2含有空気、３７℃条件下での２週間から４週間培
養した。
【００１６】形成したコロニーのうち、単一細胞から形
成されたと考えられるコロニーを選択し、２４穴プレー
トに植え継ぎ、その中で細胞性フィブロネクチンの生産
量の多いクローンを先と同様な方法を用いて数次クロー
ニングを行い、細胞株ＨＵＨ−６ＹＭを得ることができ
た。またこの細胞株ＨＵＨ−６ＹＭはｅ−ＲＤＦ培地だ
けでも増殖及び継代が可能であった。
成されたと考えられるコロニーを選択し、２４穴プレー
トに植え継ぎ、その中で細胞性フィブロネクチンの生産
量の多いクローンを先と同様な方法を用いて数次クロー
ニングを行い、細胞株ＨＵＨ−６ＹＭを得ることができ
た。またこの細胞株ＨＵＨ−６ＹＭはｅ−ＲＤＦ培地だ
けでも増殖及び継代が可能であった。
【００１７】また、細胞性フィブロネクチンのみに存在
するＥＤ−Ａ及びＥＤ−Ｂ領域と呼ばれるペプチドに対
するｃＤＮＡプローブを作製し、ＨＵＨ−６ＹＭのｍＲ
ＮＡを調べたところ、ＥＤ−Ａ及びＥＤ−Ｂ領域の存在
が確認された。
するＥＤ−Ａ及びＥＤ−Ｂ領域と呼ばれるペプチドに対
するｃＤＮＡプローブを作製し、ＨＵＨ−６ＹＭのｍＲ
ＮＡを調べたところ、ＥＤ−Ａ及びＥＤ−Ｂ領域の存在
が確認された。
【００１８】このようにして得られた細胞株ＨＵＨ−６
ＹＭの生物学的性質をまとめると以下の通りである。 ヒト肝芽腫由来細胞株ＨＵＨ−６ｃｌｏｎｅ５由来の
変異株である。 アミノ酸、ビタミン類、糖類及び無機塩類から成る基
礎培地で増殖し、限界なく継代培養が可能である。すな
わち増殖因子としてタンパク性因子を必要としない細胞
株である。 ヒト細胞性フィブロネクチンを著量産生する。 ＥＤ−Ａ及びＥＤ−Ｂ領域を含むフィブロネクチンの
ｍＲＮＡが発現されている。
ＹＭの生物学的性質をまとめると以下の通りである。 ヒト肝芽腫由来細胞株ＨＵＨ−６ｃｌｏｎｅ５由来の
変異株である。 アミノ酸、ビタミン類、糖類及び無機塩類から成る基
礎培地で増殖し、限界なく継代培養が可能である。すな
わち増殖因子としてタンパク性因子を必要としない細胞
株である。 ヒト細胞性フィブロネクチンを著量産生する。 ＥＤ−Ａ及びＥＤ−Ｂ領域を含むフィブロネクチンの
ｍＲＮＡが発現されている。
【００１９】次に細胞株ＨＵＨ−６ＹＭを培養し、ヒト
細胞性フィブロネクチンを製造する方法について説明す
る。
細胞性フィブロネクチンを製造する方法について説明す
る。
【００２０】細胞株ＨＵＨ−６ＹＭの培養は、種培養と
してシャーレで培養する。継代を繰り返し、次の連続培
養で必要な細胞数を確保する。使用する培地としては、
市販されているｅ−ＲＤＦ培地が適しているが、これに
限定されるものではなく、その成分に準じて調製される
培地はどのようなものでも使用可能である。また添加成
分としては、タンパク性因子は特に必要ないが、細胞に
悪影響を与えない限り、添加されていてもかまわない。
してシャーレで培養する。継代を繰り返し、次の連続培
養で必要な細胞数を確保する。使用する培地としては、
市販されているｅ−ＲＤＦ培地が適しているが、これに
限定されるものではなく、その成分に準じて調製される
培地はどのようなものでも使用可能である。また添加成
分としては、タンパク性因子は特に必要ないが、細胞に
悪影響を与えない限り、添加されていてもかまわない。
【００２１】培養条件は、特に規定されるものではない
が、培養温度は３６〜３７℃で、気相条件は、シャーレ
等による種培養において５％程度のＣＯ2を含有する空
気が適当である。しかし、連続培養においては特にＣＯ
2等を調製した空気の必要はない。
が、培養温度は３６〜３７℃で、気相条件は、シャーレ
等による種培養において５％程度のＣＯ2を含有する空
気が適当である。しかし、連続培養においては特にＣＯ
2等を調製した空気の必要はない。
【００２２】連続培養の方法は、特に限定されるもので
はないが、一般的な方法であるローラーボトルを用いた
方法で行うことが可能である。この場合、そのローラー
ボトル内の細胞数に応じて培地の交換を適切な時期に行
っていくものである。
はないが、一般的な方法であるローラーボトルを用いた
方法で行うことが可能である。この場合、そのローラー
ボトル内の細胞数に応じて培地の交換を適切な時期に行
っていくものである。
【００２３】このような方法で得られた細胞株ＨＵＨ−
６ＹＭの培養上清が、次の精製の原料となる。
６ＹＭの培養上清が、次の精製の原料となる。
【００２４】細胞性フィブロネクチンの精製には、一般
的なタンパク質精製に用いられる方法を用いることがで
きるが、その１例をあげれば次の通りである。
的なタンパク質精製に用いられる方法を用いることがで
きるが、その１例をあげれば次の通りである。
【００２５】まず培養上清に適当なプロテアーゼインヒ
ビターを添加し、次に遠心分離に付し細胞片等の不純物
を除去した後に、限外ロ過法によって濃縮を行い、培養
上清中の細胞性フィブロネクチンを適当な濃度にまで上
げる。これは次の精製を効率化するためである。濃縮さ
れた上清は、ＰＢＳ（−）（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕ
ｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で平衡化したゼラチンア
フィニティーカラムに負荷する。その後、ＰＢＳ（−）
に６Ｍ尿素を溶解した緩衝液で溶出させ、その溶出画分
を得る。この画分中での細胞性フィブロネクチンの純度
は、電気泳動法による検定によると９５％以上である
が、さらに純度を高めるためには、一般的なイオン交換
法などの他の方法を用いて高純度化することができる
が、細胞性フィブロネクチンは、通常ＰＢＳ（−）のよ
うな緩衝液中では非常に溶解度が低いため、すべて尿素
存在下で分離操作を行う必要がある。
ビターを添加し、次に遠心分離に付し細胞片等の不純物
を除去した後に、限外ロ過法によって濃縮を行い、培養
上清中の細胞性フィブロネクチンを適当な濃度にまで上
げる。これは次の精製を効率化するためである。濃縮さ
れた上清は、ＰＢＳ（−）（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕ
ｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で平衡化したゼラチンア
フィニティーカラムに負荷する。その後、ＰＢＳ（−）
に６Ｍ尿素を溶解した緩衝液で溶出させ、その溶出画分
を得る。この画分中での細胞性フィブロネクチンの純度
は、電気泳動法による検定によると９５％以上である
が、さらに純度を高めるためには、一般的なイオン交換
法などの他の方法を用いて高純度化することができる
が、細胞性フィブロネクチンは、通常ＰＢＳ（−）のよ
うな緩衝液中では非常に溶解度が低いため、すべて尿素
存在下で分離操作を行う必要がある。
【００２６】その後、尿素を除去し、ある濃度以上の細
胞性フィブロネクチン溶液を調製するために５％ショ糖
を含むリン酸緩衝液と緩衝液交換を行う。緩衝液で交換
を行う方法としては、一般的な方法である膜透析法や限
外ロ過を用いてダイアフィルトレーション法によって行
うことができる。
胞性フィブロネクチン溶液を調製するために５％ショ糖
を含むリン酸緩衝液と緩衝液交換を行う。緩衝液で交換
を行う方法としては、一般的な方法である膜透析法や限
外ロ過を用いてダイアフィルトレーション法によって行
うことができる。
【００２７】このようにして得られるヒト細胞性フィブ
ロネクチンは、二量体と単量体の混合物として得られ
る。細胞性フィブロネクチンの構造上の特徴としては、
還元条件下及び非還元条件下のＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル泳動の分析によると、その分子量が血漿性フィブ
ロネクチン標品より大きく、また市販の抗細胞性フィブ
ロネクチン抗体と反応する。
ロネクチンは、二量体と単量体の混合物として得られ
る。細胞性フィブロネクチンの構造上の特徴としては、
還元条件下及び非還元条件下のＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル泳動の分析によると、その分子量が血漿性フィブ
ロネクチン標品より大きく、また市販の抗細胞性フィブ
ロネクチン抗体と反応する。
【００２８】以下に細胞株ＨＵＨ−６ＹＭを用いて製造
したヒト細胞性フィブロネクチンの諸性質を示す。 分子量 還元及び非還元状態におけるＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により二量体が４７０ｋｄ，単量体が２４
５ｋｄと２２５ｋｄを示し、二量体と単量体の比が２：
１である。 等電点：ｐＨ５〜６ 免疫学的特異性 市販の抗細胞性フィブロネクチン抗体（シグマ社製、Ｍ
ＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩ−ＣＥＬＬＵＬＡＲ Ｆ
ＩＢＲＯＮＥＣＴＩＮ，Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ．Ｆ６１
４０）と反応し、抗ヒトフィブロネクチン抗体（宝酒造
製、ｃｌｏｎｅ３０−８）とも反応する。 プロテアーゼによる断片化の結果、本発明のヒト細胞
性フィブロネクチンのプロテアーゼによる断片は、ヒト
血漿性フィブロネクチンのプロテアーゼ断片と明らかに
異なっていた。 また本発明で製造されたヒト細胞性フィブロネクチン
は、既に報告されている細胞接着促進活性、ゼラチンビ
ーズ凝集能及び細胞伸展活性などフィブロネクチンの生
物学的作用を有する。
したヒト細胞性フィブロネクチンの諸性質を示す。 分子量 還元及び非還元状態におけるＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により二量体が４７０ｋｄ，単量体が２４
５ｋｄと２２５ｋｄを示し、二量体と単量体の比が２：
１である。 等電点：ｐＨ５〜６ 免疫学的特異性 市販の抗細胞性フィブロネクチン抗体（シグマ社製、Ｍ
ＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩ−ＣＥＬＬＵＬＡＲ Ｆ
ＩＢＲＯＮＥＣＴＩＮ，Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ．Ｆ６１
４０）と反応し、抗ヒトフィブロネクチン抗体（宝酒造
製、ｃｌｏｎｅ３０−８）とも反応する。 プロテアーゼによる断片化の結果、本発明のヒト細胞
性フィブロネクチンのプロテアーゼによる断片は、ヒト
血漿性フィブロネクチンのプロテアーゼ断片と明らかに
異なっていた。 また本発明で製造されたヒト細胞性フィブロネクチン
は、既に報告されている細胞接着促進活性、ゼラチンビ
ーズ凝集能及び細胞伸展活性などフィブロネクチンの生
物学的作用を有する。
【００２９】以上のように細胞株ＨＵＨ−６ＹＭを用
い、タンパク質無添加培地で、大量の細胞を連続培養す
ることで、非常に有利にヒト細胞性フィブロネクチンを
製造することができる。
い、タンパク質無添加培地で、大量の細胞を連続培養す
ることで、非常に有利にヒト細胞性フィブロネクチンを
製造することができる。
【００３０】
【Ｉ．物質の生産】種培養として、細胞株ＨＵＨ−６Ｙ
Ｍ（ＦＥＲＭ Ｐ−１２８９０）をｅ−ＲＤＦ培地（極
東製薬製）を用いて継代培養した。培養は３７℃、５％
ＣＯ2を含む空気で、１ヶ月間行った。
Ｍ（ＦＥＲＭ Ｐ−１２８９０）をｅ−ＲＤＦ培地（極
東製薬製）を用いて継代培養した。培養は３７℃、５％
ＣＯ2を含む空気で、１ヶ月間行った。
【００３１】培養上清を得るための連続培養は、１７５
０ｃｍ2のローラーボトル（ファルコン社製）１本当た
り１×１０9個の細胞を播種し、３７℃、大気下で培養
した。播種後３週間までは、２〜３日間隔で、その後は
毎日ローラーボトル１本当たり５００ｍｌの培地を全量
交換し、得られた培養上清を回収した。連続培養は約３
ヵ月行った。（図１）
０ｃｍ2のローラーボトル（ファルコン社製）１本当た
り１×１０9個の細胞を播種し、３７℃、大気下で培養
した。播種後３週間までは、２〜３日間隔で、その後は
毎日ローラーボトル１本当たり５００ｍｌの培地を全量
交換し、得られた培養上清を回収した。連続培養は約３
ヵ月行った。（図１）
【００３２】培養上清は、プロテアーゼインヒビターと
して５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴ
Ａ）を添加した後、連続遠心分離し１５００ｇ、流速２
０Ｌ／分、（国産製Ｈ６００−Ｓ）により細胞断片等の
不純物を除去し上澄を回収した。
して５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴ
Ａ）を添加した後、連続遠心分離し１５００ｇ、流速２
０Ｌ／分、（国産製Ｈ６００−Ｓ）により細胞断片等の
不純物を除去し上澄を回収した。
【００３３】次に、分画分子量１００ｋ（フィルトロン
社製、型式ＯＳ１００ＣＯ５）の限外ロ過膜を用いて先
の上澄の１０倍濃縮液を調製した。これを、ＰＢＳ
（−）で平衡化したゼラチンセファロース４Ｂカラム
（ファルマシア社製）負荷し、ＰＢＳ（−）で洗浄し、
平衡化した。続いてＰＢＳ（−）に６Ｍ尿素を溶解させ
た緩衝液で溶出を行った。
社製、型式ＯＳ１００ＣＯ５）の限外ロ過膜を用いて先
の上澄の１０倍濃縮液を調製した。これを、ＰＢＳ
（−）で平衡化したゼラチンセファロース４Ｂカラム
（ファルマシア社製）負荷し、ＰＢＳ（−）で洗浄し、
平衡化した。続いてＰＢＳ（−）に６Ｍ尿素を溶解させ
た緩衝液で溶出を行った。
【００３４】この溶出液中の細胞性フィブロネクチンの
純度は、還元状態下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法による検定の結果９５％以上であった。
純度は、還元状態下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法による検定の結果９５％以上であった。
【００３５】この溶出液を集め、分画分子量１００ｋの
限外ロ過膜（フィルトロン社製、型式ＯＳ−１００ＣＯ
１）を用いて、まず溶出液を濃縮し、続いてダイアフィ
ルトレーション法により、５％ショ糖を含む０．１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液と溶媒交換を行った。
限外ロ過膜（フィルトロン社製、型式ＯＳ−１００ＣＯ
１）を用いて、まず溶出液を濃縮し、続いてダイアフィ
ルトレーション法により、５％ショ糖を含む０．１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液と溶媒交換を行った。
【００３６】以上のような方法で、ヒト細胞性フィブロ
ネクチン標品が得られた。
ネクチン標品が得られた。
【００３７】
（１）分子量
【００３８】上記、ヒト細胞性フィブロネクチン標品の
分子量をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
って、標準タンパク質及びヒト血漿性フィブロネクチン
標品（岩城硝子社製）と還元及び非還元状態下で比較し
た。
分子量をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
って、標準タンパク質及びヒト血漿性フィブロネクチン
標品（岩城硝子社製）と還元及び非還元状態下で比較し
た。
【００３９】その結果、本発明のヒト細胞性フィブロネ
クチン標品の分子量は二量体が４７０ｋｄ、単量体が２
４５ｋｄと２２５ｋｄと推定され、ヒト血漿性フィブロ
ネクチンよりも大きな分子量を有することが明らかにな
かった。（図２） （２）免疫学的反応性
クチン標品の分子量は二量体が４７０ｋｄ、単量体が２
４５ｋｄと２２５ｋｄと推定され、ヒト血漿性フィブロ
ネクチンよりも大きな分子量を有することが明らかにな
かった。（図２） （２）免疫学的反応性
【００４０】血漿性フィブロネクチンには反応せず、細
胞性フィブロネクチンのみに反応する抗細胞性フィブロ
ネクチン（シグマ社製、Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ．Ｆ−６
１４０）を用いてウエスタンブロッティング後の免疫染
色法により反応性の確認を行った。その結果、本標品は
この特異抗体と反応した。またヒトフィブロネクチン抗
体（宝酒造製、ｃｌｏｎｅ３０−８）とも反応した。 （３）プロテアーゼによる断片化
胞性フィブロネクチンのみに反応する抗細胞性フィブロ
ネクチン（シグマ社製、Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ．Ｆ−６
１４０）を用いてウエスタンブロッティング後の免疫染
色法により反応性の確認を行った。その結果、本標品は
この特異抗体と反応した。またヒトフィブロネクチン抗
体（宝酒造製、ｃｌｏｎｅ３０−８）とも反応した。 （３）プロテアーゼによる断片化
【００４１】サーモリシンを用いてヒト血漿性フィブロ
ネクチンと本発明の細胞性フィブロネクチンのプロテア
ーゼによる断片の分子量の差について検討を行った。さ
らに得られた断片物の免疫学的反応性について検討し
た。
ネクチンと本発明の細胞性フィブロネクチンのプロテア
ーゼによる断片の分子量の差について検討を行った。さ
らに得られた断片物の免疫学的反応性について検討し
た。
【００４２】その結果、本発明の細胞性フィブロネクチ
ンはプロテアーゼによる断片の大きさがヒト血漿性フィ
ブロネクチンとは明らかに異なり、さらのモノクローナ
ル抗体による断片の免疫学的反応性によりＥＤ−Ａ及び
ＥＤ−Ｂ領域を含む細胞性フィブロネクチンであると考
えられた。
ンはプロテアーゼによる断片の大きさがヒト血漿性フィ
ブロネクチンとは明らかに異なり、さらのモノクローナ
ル抗体による断片の免疫学的反応性によりＥＤ−Ａ及び
ＥＤ−Ｂ領域を含む細胞性フィブロネクチンであると考
えられた。
【００４３】上記の分子量と免疫学的反応性、プロテア
ーゼによる断片及び細胞のｍＲＮＡの分析の結果、本発
明で得られたフィブロネクチンは、ＥＤ−Ａ及びＥＤ−
Ｂ領域を含むヒト細胞性フィブロネクチンであると判断
された。
ーゼによる断片及び細胞のｍＲＮＡの分析の結果、本発
明で得られたフィブロネクチンは、ＥＤ−Ａ及びＥＤ−
Ｂ領域を含むヒト細胞性フィブロネクチンであると判断
された。
【００４４】（４）水溶性 既報によると、細胞性フィブロネクチンはｐＨ６から８
の緩衝液に対し、非常に溶解性が低いことが報告されて
いる。
の緩衝液に対し、非常に溶解性が低いことが報告されて
いる。
【００４５】本発明においては、細胞性フィブロネクチ
ンが、ショ糖を含む緩衝液に対し易溶性であることが見
いだされた。各ショ糖濃度に対する溶解性は次の表１に
示される。
ンが、ショ糖を含む緩衝液に対し易溶性であることが見
いだされた。各ショ糖濃度に対する溶解性は次の表１に
示される。
【００４６】
【表１】
【図１】連続培養中において細胞株ＨＵＨ−６ＹＭが、
培養上清中に産生するフィブロネクチン濃度の培養期間
に対する変化を示す図。
培養上清中に産生するフィブロネクチン濃度の培養期間
に対する変化を示す図。
【図２】本発明のヒト細胞性フィブロネクチンをＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた結果を示す。
比較対照としては、ヒト血漿性フィブロネクチン標品を
用いている。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた結果を示す。
比較対照としては、ヒト血漿性フィブロネクチン標品を
用いている。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/02 C07K 14/78 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 細胞株ＨＵＨ−６ＹＭ、ＦＥＲＭ Ｐ−
１２８９０を培養し、得られた培養物から下記の性質を
有するヒト細胞性フィブロネクチンを分離することを特
徴とするヒト細胞性フィブロネクチンの製造方法。非
還元状態におけるＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動により二量体が４７０ｋｄを示す。 等電点：ｐＨ５〜６ 免疫学的特異性 市販の抗細胞性フィブロネクチン抗体及び抗フィブロネ
クチン抗体と反応する。現在までに報告されているフ
ィブロネクチンの細胞接着促進活性、ゼラチンビーズ凝
集能及び細胞伸展活性等の種々の生物学的作用を有す
る。細胞株ＨＵＨ−６ＹＭ、ＦＥＲＭ Ｐ−１２８９
０を培養し、得られた培養物から生産することが可能で
ある。 - 【請求項２】 下記の性質を有する細胞株ＨＵＨ−６Ｙ
Ｍ、ＦＥＲＭ Ｐ−１２８９０。ヒト肝芽腫由来細胞
株ＨＵＨ−６ｃｌｏｎｅ５由来の変異株である。アミ
ノ酸、ビタミン類、糖類及び無機塩類から成る基礎培地
で増殖し、限界なく継代培養が可能である。すなわち増
殖因子としてタンパク性因子を必要としない細胞株であ
る。ＨＵＨ−６ＹＭは、ヒト細胞性フィブロネクチン
を著量産生する。ＥＤ−Ａ及びＥＤ−Ｂ領域を含むフ
ィブロネクチンのｍＲＮＡが発現されている。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04143744A JP3133148B2 (ja) | 1992-05-11 | 1992-05-11 | ヒト細胞性フィブロネクチン、その製造法及び細胞株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04143744A JP3133148B2 (ja) | 1992-05-11 | 1992-05-11 | ヒト細胞性フィブロネクチン、その製造法及び細胞株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05310795A JPH05310795A (ja) | 1993-11-22 |
| JP3133148B2 true JP3133148B2 (ja) | 2001-02-05 |
Family
ID=15346009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04143744A Expired - Fee Related JP3133148B2 (ja) | 1992-05-11 | 1992-05-11 | ヒト細胞性フィブロネクチン、その製造法及び細胞株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3133148B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7678570B2 (en) | 2004-03-01 | 2010-03-16 | Kitakyushu Foundation For The Advancement Of Industry, Science And Technology | Human cell strains for protein production, provided by selecting strains with high intracellular protein and mutating with carcinogens |
-
1992
- 1992-05-11 JP JP04143744A patent/JP3133148B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２５９，Ｎｏ．１５，ｐ．９８９９−９９０５（１９８４） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05310795A (ja) | 1993-11-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2721139B2 (ja) | 動物のインターフェロン | |
| JPS62185095A (ja) | 合成ペプチド | |
| JPH10502360A (ja) | ヒトインターロイキン４のアンタゴニストもしくは部分的アゴニストとして用いられる新規ｈＩＬ−４突然変異蛋白質 | |
| JPS62174026A (ja) | 白血球減少症治療剤 | |
| US5417970A (en) | Drugs containing a glycosylated interleukin-2 | |
| JP3133148B2 (ja) | ヒト細胞性フィブロネクチン、その製造法及び細胞株 | |
| JPH02195888A (ja) | ヒトインターロイキン２活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組換えｄｎａ体および該組換えｄｎａ体により形質転換された原核生物細胞 | |
| JPH1080270A (ja) | ポリペプチドをプロセッシングする酵素 | |
| EP0366532A1 (fr) | Médicaments contenant une interleukine-2 glycosylée | |
| US4436816A (en) | Cell growth promoting material | |
| JPH05310592A (ja) | 創傷治療剤及び医薬製剤 | |
| US20020037535A1 (en) | Use of mCRP to slow cell growth and to promote maturation of cells | |
| JPH05310796A (ja) | 新規なヒト細胞性フィブロネクチン | |
| JPH03505732A (ja) | 移動刺激因子 | |
| JPH0731482A (ja) | 組換ヒト単球成長因子、及びこれをコードするｄｎａ配列 | |
| Neumeier et al. | Two different types of granulocyte colony-stimulating factor produced by bovine lung tissue | |
| EP0617122A1 (en) | Dna fragment which codes for tumor cell proliferation inhibiting factor | |
| JPS63150297A (ja) | 新規ｂ細胞分化因子蛋白標品 | |
| JPH0536026B2 (ja) | ||
| JP2004008130A (ja) | 細胞培養用無血清培地 | |
| CN117551185A (zh) | 一种类人源弹性蛋白多肽及其制备方法和应用 | |
| JPH01256390A (ja) | 新規ｄｎａとその生産方法、それを有する新規プラスミド、新規ポリペプチドとその生産方法、及び該ポリペプチドからなる新規抗腫瘍剤 | |
| JPH0473995B2 (ja) | ||
| JPH06336498A (ja) | 新規プロラクチン | |
| JPH02222696A (ja) | 蛋白質の産生方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |