JPS6322190A - ヒトリゾチ−ムの遺伝子発現による製法 - Google Patents

ヒトリゾチ−ムの遺伝子発現による製法

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JPS6322190A
JPS6322190A JP16450686A JP16450686A JPS6322190A JP S6322190 A JPS6322190 A JP S6322190A JP 16450686 A JP16450686 A JP 16450686A JP 16450686 A JP16450686 A JP 16450686A JP S6322190 A JPS6322190 A JP S6322190A
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JP
Japan
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human lysozyme
sequence
gene
dna
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JP16450686A
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English (en)
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Hideyuki Gomi
五味　英行
Hideo Yasukui
安喰　英夫
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Sumitomo Chemical Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Chemical Co Ltd
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、合成ヒトリゾチーム遺伝子を用いたヒトリゾ
チームの製造法に関する。
従来技術および問題点 ヒトリゾチームは、ヒトの涙、唾液、鼻粘液、乳、リン
パ腺、白血球等に見出される酵素蛋白質であり、Ｎ−ア
セチルムラミン酸量のβ−１，４結合を加水分解するム
ラミダーゼとしての酵素活性を有している事が知られて
いる。ヒト乳由来のりゾチームは下記の配列で示される
１３０個のアミノ酸からなることが知られている。〔例
えば、船津ら「溶酸酵素」５５〜５８頁、講談社すイエ
ンティフインク（１９７７）参照〕 Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇ
ｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　ＴｈｒＬｅｕ　Ｌｙｓ
　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　
Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙｌｉｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌ
ａ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ
　ＬｙｓＴｒｐ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａ
ｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＡｓｎＴｙｒ
　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　
Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙｌｌｅ　Ｐｈｅ　Ｇｌ
ｎ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ
　Ｃｙｓ　ＡｓｎＡｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐ
ｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｃｙ
ｓＨｉｓ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｃｙｓ　　Ｓｅｒ　
　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｇｉｎ　　Ａｓｐ　
　Ａｓｎ１１ｅ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａ
ｌａ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　ＶａｌＶａｌ
　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　
Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　ＶａｌＡｌａ　　Ｔｒｐ　　
Ａｒｇ　　Ａｓｎ　　Ａｒｇ　　Ｃｙｓ　　Ｇｉｎ　　
Ａｓｎ　　Ａｒｇ　　Ａｓｐ　　ＶａｌＡｒｇ　Ｇｉｎ
　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　
Ｖａ　１ヒトリゾチームは種々の細菌を溶解する作用を
有し、食品等の防腐剤、或いは医薬品としては抗菌剤、
非アレルギー性の抗炎症薬として利用することができる
。
ヒトリゾチームはヒトの乳、尿等から単離する事ができ
るが、医療等を目的とする工業的生産の要求を満たすに
は効率が悪く実用的でない。
合成ヒトリゾチーム遺伝子を用いて組み換えＤＮＡ技術
によりリゾチームを製造する方法はすでにしられている
（特開昭６１−７８３８３　　、特開昭６ｌ−７８３８
７）。
発明が解決した問題点 本発明は組み換えＤＮＡ技術により安価にしかも大量に
純粋なりゾチームを生産することを目的にしたものであ
る。
本発明者らは、翻訳活性を上昇させる目的でメツセンジ
ャーＲＮＡの構造を種々研究し翻訳開始コドン（ＡＴＧ
）及びライボゾーム結合部位（別名シャインーダルガー
ノ領域）が相補する塩基と水素結合を形成しないような
図１に示す二次構造を形成するとき、翻訳活性が著しく
上昇することを見出した。
リゾチーム遺伝子の大腸菌における発現にあたって、リ
ゾチーム遺伝子はりゾチームのＮ未領域においては、相
当するメツセンジャーＲＮＡのＡＵＧが相補的な塩基と
水素結合しない様にコドンを選択しなければならない。
この様な観点から、我々は図１のメツセンジャーＲＮＡ
配列に相当する下記配列の２本鎖ＤＮＡを合成し、ヒト
リゾチーム遺伝子の残りの部分と結合し、λＰＬプロモ
ーター下に発現を試みたところ著しい発現の上昇が見ら
れた。
合成２本鎖ＤＮＡ ライボゾーム結合部位 問題解決の手段 本発明は、転写体ｍＲＮＡの二次構造において、ライボ
ゾーム結合部位（シャインーダルガーノ領域）及び翻訳
開始部位が相補的な塩基と水素結合を形成しない構造を
とるヒトリゾチームｍＲＮＡ配列をコードするＤＮＡフ
ラグメント、５゛端にこのＤ　Ｎ　Ａフラグメントを結
合したヒトリゾチーム遺伝子、このＤＮＡフラグメント
を５゛端に有するヒトリゾチーム遺伝子を保持しヒトリ
ゾチームを宿主細胞内で発現する組み換えプラスミド、
この組み換えプラスミドを保持しヒトリゾチームを生産
する微生物、及びこの微生物を適当な培地で培養するこ
とを特徴とするヒトリゾチームの製造方法を提供する。
本発明により提供される転写体ｍＲＮＡの二次構造にお
いて、ライボゾーム結合部位（シャインーダルガーノ領
域）及び翻訳開始部位が相補的な塩基と水素結合を形成
しない構造をとるｍＲＮＡ配列を与えるＤＮＡフラグメ
ントの具体例として下記の配列のＤＮＡを挙げることが
できる。
５゛端ＣＧＴＡＡＧＴＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧ
ＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡ３’より好ましく
は、 ５゛端ＣＧＴＡＡＧＴＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧ
ＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＧＴＴＴＴＣＧ
ＡＡＣＧＴＴ３’端 を挙げることができる。
この様な配列を有する上記の２本鎖ＤＮＡは、以下の様
に合成することができる。
先ず、以下にしめした様にＣｌ−１〜Ｃｌｌ−４と名付
けたオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学的に合成す
る。
Ｃｌｌ−１：　５’　ＧＡＴＣＣＴＡＡＣＧＴＡＡＧＴ
ＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＣ３’ Ｃｌｌ−２：　３’　　ＧＡＴＴＧＣＡＴＴＣＡＧＴＣ
ＡＣＴＴＴＴＴＧＡＡＴＣＣＴＣ５” ＣＩＴ−３：　５°ＴＴＡＧＧＡＧＧＧＴＴＴＴＴＡＡ
ＡＴＧＡＡＡＧＴＴＴＴ　　３’ Ｃｎ−４：　３”　ＣＣＡＡＡＡＡＴＴＴＡＣＴＴＴＣ
ＡＡＡＡＧＣ５’ 各フラグメントの合成法としてはジエスエル法、トリエ
ステル法、及びホスファイト法があり、固相法、液相法
がある。
Ｃｌｌ−１〜Ｃｌｌ−４と名付けたオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドの合成は、固相法ホスファアミダイド法を
利用したＭｏｄｅｌ　３８０　Ｄ　Ｎ　Ａシンセサイザ
ー〔アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社〕により容易に行うことができ
る。
化学合成したオリゴヌクレオチドは脱保護操作の際、安
定な親油性の保護基を利用して逆層分配カラムによる高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で他の未反応混
合物から分離精製することができる。　次に、その保護
基をはずし精製すれば目的とするオリゴヌクレオチドを
得ることができる。　得られたＣｎ−２、ＣＩ［−３の
フラグメントの５”側をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化し、Ｃｌｌ−１、Ｃｌｌ−４とＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで結合した後再びＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いてリン酸化し、上に示した５゜側に５ａｕ
３ＡＩサイト、３゛側にＴａｑｌサイトを有する二本鎖
フラグメントを合成する。
このようにして得られたＤＮＡフラグメントをヒトリゾ
チーム遺伝子の残りの部分と結合した後、これを発現プ
ラスミドベクターに挿入することにより本発明の組み換
えプラスミドを構築することができる。
ここにおいて用いるヒトリゾチーム遺伝子は、例えば、
特開昭６１−７８３８３、或いは特開昭６１−７８３８
７記載の方法で合成することができる。　また、発現プ
ラスミドベクターとしては、例えば、ｐＭＹｌ２−６Ａ
ｍｐ−１を用いることができる。
ｐＭＹｌ　２−６Ａ２−６ＡはｐＭＹｌ２−６（例えば
Ｔｓｕｒｉｍｏｔｏら、Ｍｏ１．Ｇｅｎ。
Ｇｅｎｅｔ、　１８７　７９〜８６　（１９８２）参照
）とｐＢＶ２３４（例えば０ｈｔｓｕｂｏら、Ｇｅｎｅ
　　２０　２４５〜２５４　（１９８２）参照）とから
以下のようにして造成する事ができる。
ｐＢＶ２３４をＰＳｔｌで切断しアンピシリン耐性遺伝
子の一部を含む約２．６Ｋｂｐの断片を取り出し、ｐＭ
Ｙｌ２−６のＰｓｔｌ切断部位にアンピシリン耐性遺伝
子が再生する様に挿入してｐＭＹｌ２　６Ａｍｐを得る
。ｐＭＹｌ２−６ＡｍｐをＢａｍＨＩで限定分解した後
、その粘着末端をＤＮＡポリメラーゼ（クレノーフラグ
メント）を用いて修復し、ＤＮＡリガーゼで連結して、
ｐＢＶ２３４由来のＤＮＡ断片中に含まれるＢａｍＨ１
切断部位のみが消失したｐＭＹｌ２−６Ａｍｐ−１を得
る。
本発明の組み換えプラスミド構築の具体例として以下の
方法を挙げることができる（図２にその概略を示した）
。
ヒトリゾチーム遺伝子を含む組み換えプラスミドｐＰＬ
ＨＬＹ−１（特開昭６１−７８３８３、特開昭６ｌ−７
８３８７）を制限酵素Ｔａｑｌで消化し、得られたヒト
リゾチーム遺伝子を含む断片を常法により単離し、上に
示した合成りＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、得ら
れたフラグメントを５ａｕ３ＡＩで消化し、ヒトリゾチ
ーム遺伝子の５°側上流に転写により得られるｍＲＮＡ
の二次構造において、翻訳開始部位及び　シャインーダ
ルガーノ領域（ＳＤ領領域が相補的塩基と水素結合をし
ないようにデザインされた合成フラグメントを構築する
。
次に、上記で得られたＤＮＡフラグメントを適当な発現
プラスミド、例えば上述のｐＭＹｌ２−６Ａｍｐ−１に
挿入する。その具体例の概要を図２示した。　ここにお
いては、上述のヒトリゾチーム遺伝子の断片を含む約４
４０塩基の断片を５％ポリアクリアミドゲル電気泳動に
より分離し、ｐＭＹｌ２−６Ａｍｐ−１のＢａｍＨＩサ
イトに挿入する。　この様にして得られたプラスミドを
、例えば、大腸菌（例えば、２９４株）等の適当な宿主
に導入することによりヒトリゾチームを生産する本発明
の微生物を得ることができる。
この様にして得た形質転換体を適当な培地で培養するこ
とにより本発明の目的とするヒトリゾチームを効率よく
生産することができる。
以下に実施例をあげ、本発明をより詳細に説明する。　
本発明は、以下の実施例のみに限定されるものではなく
、本発明の技術分野における通常の変更をすることがで
きる。
実施例 １、ＤＮＡフラグメントの合成 上に示した様に設計したフラグメントＣｌｌ−１〜Ｃｎ
−４のフラグメントを固相法ホスファアミダイド法を利
用したＭｏｄｅｌ　３８０　ＤＮＡシンセサイザー〔ア
プライドバイオシステムズ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ　）社製〕により合成した。
ヌクレオシドを導入したシリカ樹脂および完全に保護し
た４種のジイソプロピルホスホアミダイドは市販のアプ
ライドバイオシステムズ　（ＡｐρｌｉｅｄＢｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ　）社製のものを用いた。
合成法の詳細は下記の通りである。
完全に保護したヌクレオシドを導入したシリカ樹脂（１
）カラムをトリクロロ酢酸を含むジクロロメタン溶液で
室温２分間処理することにより５゛位水酸基のジメトキ
シトリチル（以下Ｄ　Ｍ　Ｔ　ｒ　）保護基を除去し、
ヌクレオシドの導入されたシリカ樹脂（ＩＩ）とした。
　次に、完全に保護したジイソプロピルホスホアミダイ
ド（ＩＩ［）をテトラゾール共存下アセトニトリル中室
温で３分間縮合させた。
（Ｉ）、（Ｉ［）及び（ＩＩＩ）は以下の通りである。
０ＣＯＣＨｚＣＨｚＣＯＮＨＣＨＩＣＨｚＣＨ２ＰＰニ
ジリカ樹月１．Ｂ＝Ａｂｚ、Ｇｉｂｕ、Ｃｂｚ、Ｔ（１
）＝Ｒ１ニジメトキシトリチル基 （ｎ）　＝Ｒ１：　Ｈ （Ｉ［Ｉ３　　　Ｂ＝Ａｂｚ、Ｇｉｂｕ、Ｃｂｚ、Ｔジ
メチルアミノピリジン、ルチジンを含むテトラヒドロフ
ラン中無水酢酸で室温４分間樹脂を処理してシリカ樹脂
（ＩＩ）の５°水酸基をアセチル化し、ルチジン、水を
含むテトラヒドロフラン中ヨウ素で１分間酸化して５価
のリン酸トリエステルとした。　以下４種のジイソプロ
ピルホスホアミダイド（ＩＩＩ）を順次使用し脱ジメト
キシトリチル化、縮合反応、アセチル化、酸化反応を繰
り返すことにより保護したオリゴヌクレオチドフラグメ
ントを合成した。　最後の縮合後樹脂をトリエチルアミ
ンを含むチオフェノールのジオキサン溶液で５０分間処
理し、リンの保護基をはずし、３０９≦アンモニア水で
１時間処理することによりオリゴマーを樹脂より切り離
した。　回収したＡＩＪ　ｌｅｔマーは３０％アンモニ
ア水１０ｍ１で５５〜６０℃５時間処理することにより
塩基のアミノ基を脱保護し、高速液体クロマトグラフィ
ーで逆相系担体（μｍＢｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１Ｂ、ウォ
ーターズ社製）を用い、０．１モル酢酸トリエチルアミ
ン緩衝液（ｐＨ７，０）中アセトニトリルの直線濃度勾
配による溶出でジメトキシトリチル基をもつオリゴマー
を精製した。　次に、８０％酢酸水１ｍＪで室温２０分
間処理することによりジメトキシトリチル基を除去した
。　　脱保護したオリゴマーは高速液体クロマトグラフ
ィーで逆相系担体（ＹＭＣ−ｐａｃｋ　　ＡＭ−３２４
栗田工業社製）を用い０．１モル酢酸トリエチルアミン
緩衝液（ｐＨ７゜０）中アセトニトリルの直線濃度勾配
による溶出、更にイオン交換系担体（ＴＳＫ　　ｇｅｔ
　　ＤＥＡＥ−２３Ｗ、東洋曹達社製）を用い２０％ア
セトニトリルを含むギ酸アンモニウム緩衝液の直線濃度
勾配による溶出およびゲル濾過にて精製し、Ｃｎ−１〜
Ｃ１１−４を各々３．９．４．６．２．４．２．６０　
Ｄ２６０ユニット得た。
■、　　ヒトリゾチーム発現プラスミドｐ　ＰＬＨＬＹ
−２の構築 上記４種の合成オリゴヌクレオチド（ＣＩｆ　−１〜Ｃ
ｎ−４）をアニーリングし、次いでクローニングした。
　まず、Ｃｎ−２、Ｃｎ−３断片各１０、ｌｊｇを６６
ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，５）、１０　ｍＭＭ　ｇ　Ｃ
ＩＩ２．１ｍＭＡＴＰ、、１ｍＭスペルミジン、５５単
位Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）を含む１０
０μ１反応液で３７℃、１時間反応させ、５°末端をリ
ン酸化した。
反応液をフェノール：クロロホルム混液で抽出後、エタ
ノール沈殿でＤＮＡを回収した。　このＣ■−２、Ｃ１
１−３断片５μｇと未処理のＣｌｌ−１、Ｃｍ−４断片
４ｐｇとを６６ｍＭ１−リス塩酸（ｐＨ７，５）　、１
０ｍＭＭｇＣｆ２．１ｍＭＡＴＰ。
１ｍＭスペルミジン、１７Ｂ０単位Ｔ４リガーゼ（宝酒
造）を含む２００μ！反応液中で１６℃、越夜で反応さ
せた。　反応により生じたｃｍ−ｔ〜Ｃｍ−４断片の結
合物をフェノール：クロロホルム混液で抽出後、エタノ
ール沈殿により約１０μｇの精製ＤＮＡ断片として回収
した。
次に、この断片をヒトリゾチーム遺伝子に結合させるた
めに以下のことを行った。
コンセンサスＳＤ？＋ｉ域を有する４１８ｂｐのヒトリ
ゾチーム遺伝子を上述の大腸菌用発現ベクターｐＭＹ１
２−６Ａ２−６Ａに組みこんだｐＰＬＨＬＹ−１（特開
昭６１−’７８３８３、或いは特開昭６１−７８３８７
に記載の方法で製造できる）２２０μｇを１０ｍ　Ｍ　
）リス塩酸（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭ　　ＭｇＣ１，
２，５０ｍＭＮａＣ１，１ｍＭＤＴＴ存在下、６４０単
位の制限酵素Ｔａｑｌを加え８００μｌ中で６５℃、１
時間反応させ生じた６６２ｔｌ）の断片を５％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動で分離し該結合物を含むゲルを
切出し、該結合物を電気泳動的に溶出しブタノールで濃
縮し、フェノール：クロロホルム混液で抽出後、エタノ
ール沈殿により約ｌＯμｇのＤＮＡを回収した。　　こ
のＤＮＡ１μｇと先はどのＣｌｌ−１〜Ｃ１−４結合物
２．５μｇを６６ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）、６．
６ｍＭＭｇＣｊ！、°、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ
、３５０単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼ存在下で、３０μｌの
反応液中１６℃、越夜で反応させた。
この反応で生じた結合物を１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７
，５）　、５０ｍＭＮａＣ１，１０ｍ、ＭＭｇ（１！、
、１ｍＭＤＴＴ、３０単位の制限酵素５ａｕ３ＡＩ存在
下、４Ｏｔｔｌ中、３７℃、２０時間で反応し、切断し
た。反応液をフェノール：クロロホルム混液で抽出後、
エタノール沈殿でＤＮＡを回収した。この断片を２０μ
ｌ中前記の条件で５．５単位のＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼと３７℃、１時間反応させ、５゛末端をすべてリ
ン酸化した。この４３９ｂｐを５％ポリアクリアミドゲ
ル電気泳動により分離回収した。　この断片中には先の
合成オリゴヌクレオチドを含む全ヒトリゾチーム遺伝子
が存在する。　　このＤＮＡ断片を大腸菌用発現ベクタ
ーｆ）ＭＹ１２　６Ａｍｐ−１に組みこみ、大腸菌でヒ
トリゾチームを発現させるプラスミドｐＰＬＨＬＹ−２
を構築した。
先ずｐＭＹｌ　２−６Ａ２−６Ａを５０ｍＭ）リス塩酸
（ｐＨ７，５）　、１００ｍＭＮａＣ１，１０ｍＭＭｇ
ｃＪ２．１ｍＭＤＴＴ、６０単位の制限酵素ＢａｍＨＩ
の存在下、６０ｐｌ！中、３７℃、１２時間反応させた
。　エタノール沈殿でＤＮＡを回収後、６０μｌ中１０
ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，０）　、１ｍＭＥＤＴＡ存在
下２単位のバクテリアアルカリフォスファターゼで６５
°Ｃ１１時間処理し、５゛末端のリン酸基を除去した。
その後、フェノール、フェノール：クロロホルム混合液
で抽出後、エタノール沈殿でＤＮＡを回収した。
このベクター０．１μｇと先はどの４３９Ｍ断片を２０
μｌ中３５０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液で
１６℃、越夜で反応させた。　この反応液を使ってカル
シウム処理した大腸菌２９４株を形質転換した。
アンピシリン耐性菌を５０ｍｇ／ｌアンピシリンを含む
し寒天培地（Ｌｏｇ／ｊ！ポリペプトン、５ｇ／ｌイー
ストエキストラクト、５　ｇ　／　ＩＩ。
ＮａＣ１，１，５％寒天）上で選択した。　得られたコ
ロニーよりプラスミドＤＮＡをアルカリ法（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（１９Ｂ２）　ＣｔｌＳ）
により抽出、精製し、各種制限酵素で切断して切断パタ
ーンを解析しヒトリゾチーム遺伝子が組み込まれたもの
を選び２９４株に導入し、大腸菌２９４（ｐＰＬｌ（Ｌ
Ｙ−２）株を調整した。
この大腸菌２９４　（ｐＰＬＨＬＹ−２）を工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託した（徽工研菌寄第８８４
２号）。
一方、コンセンサスＳＤ領域を有するヒトリゾチーム遺
伝子を同様の操作でｐＭＹ１２−６Ａｍｐ−１の１３量
ｍＨＩサイトに挿入し構築した組み換えプラスミドｐＰ
ＬＨＬＹ−１を同様に大腸菌２９４に導入し大腸菌２９
４　（ｐＰＬＨＬＹ−１）株を調整した。　　これらの
形質転換体を各々培養後、集菌した菌体をウェスタンブ
ロッティングを用いたラジオイムノアンセイ法で＋２Ｊ
−プロティン−Ａにより定量した。
大腸菌２９４　（ｐＰＬＨＬＹ−２）株及び大腸菌２９
４　（ｐＰＬＨＬＹ−１）株を１００ｍ１Ｌ培地（１０
ｇ／Ａポリペプトン、５ｇ／ｌイーストエキストラクト
、５　ｇ　／　ｌ　Ｎ　ａ　Ｃ１，５０ｍｇ／ｌアンピ
シリン）で３０℃で振盪培養し、ＯＤ６゜、　０．２に
達した時点から２時間ごとに１．５　ｍｌ培養液をサン
プリングした。
集めた菌体は以下の方法により定量した。まず培養液１
．５　ｍ１分の菌体を３種の異なる量の標品のリゾチー
ムとともにＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍｌ　　ｉ
、　　Ｎａ　　ｔｕｒｅ２２７．６８０　　（１９７０
））に従ってｌ／１０量を１５％５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により分離した。
次にトランスファーバッファー（２５ｍＭ）リス、１９
２ｍＭグリシン、ｐＨ８，３，１５％Ｍｅ○Ｈ，０，１
％５ＤＳ）中ゲルのタンパク質をニトロセルロース膜（
Ｓ＆５ＢＡ８５）上に電気泳動的に移行させた（４℃、
３０　Ｖ、　　１２Ｌ？間）。ニトロセルロース膜は、
２％ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）を含むＰＢＳバッ
ファー（リン酸緩衝溶液）中３７℃１時間反応し、蛋白
の吸着していない部分をブロックした後、０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０、リゾチーム抗体（ミドリ十字製）を加え
３７℃、３時間反応した。ＰＢＳＴ　（０，０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄後、２％ＢＳＡを含む
ＴＢＳＴ　（５０ｍＭ）リスバンフｙ−ｐＨ８，０，０
，９％ＮａＣ１，０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中、１′
Ｉ−プロティンＡ１０μＣ１（アマ−ジャム社製）と３
７℃、７０分反応した。
ＴＢＳＴで洗浄後、オートラジオグラフィーを行い１４
．７にダルトンに相当するバンドを切取りＴ−カウンタ
ーにより放射能量を測定した。
大腸菌由来のリゾチームは３種の異なる量の標品のリゾ
チームにより作成した検量線を基準にして定量した。こ
の方法により大腸菌中のリゾチームを経時変化をおって
定量したのが図３である。ｐＰＬＨＬＹ−１では６時間
後に３５量ｇ／ｍ１ｃｕｌｔｕｒｅの発現量がみられた
のに対し、　ｐＰＬＨＬＹ−２の場合は８時間後に最高
６８μｇ／ｍ１ｃｕｌｔｕｒｅの発現がみられた。
発明の効果 ｐＰＬＨＬＹ−２とｐＰＬＨＬＹ−１では図５に示した
様にヒトリゾチーム遺伝子のＳＤ配列よりＡＴＧコドン
までの塩基配列のみ異なるためヒトリゾチームの発現は
この合成りＮＡに由来する領域に依存していることが明
らかである。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の合成りＮＡフラグメントを含んだプラ
スミドのヒトリゾチーム遺伝子の転写により得られるヒ
トリゾチームｍＲＮＡのライボゾーム結合部位および翻
訳開始部位を表す図である。 図２は、ヒトリゾチーム遺伝子を含む本発明の組み換え
プラスミドｐＰＬＨＬＹ−２及びその構築の概略を表す
図である。 図３は、大腸菌２９４　（ｐＰＬ’ＨＬＹ−２）株、大
腸菌２９４　（ｐＰＬＨＬＹ−１）株によるヒトリゾチ
ーム発現量を示す図である。 図４は、ｐＰＬＨＬＹ−２とｐＰＬＨＬＹ−１の構造を
比較した図である。 完 図１ Ｕ−Ａ −Ｇ −Ｕ −Ｕ −Ｕ −Ｕ −Ｃ −Ｏ −Ａ −Ａ 　−Ｃ −Ｇ −Ｕ ”’ＵＡ　−ＵＧＵＧＡＡ” 図３ヒトリゾチームの発現 時間

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）転写体ｍＲＮＡの二次構造において、ライボゾー
    ム結合部位及びヒトリゾチームの翻訳開始部位が水素結
    合を形成しない配列のライボゾーム結合部位及びヒトリ
    ゾチーム翻訳開始部位をコードするＤＮＡ断片を５′端
    に有するヒトリゾチーム遺伝子
  2. （２）ライボゾーム結合部位及びヒトリゾチーム翻訳開
    始部位をコードするＤＮＡ断片が下記の塩基配列である
    特許請求の範囲第１項記載のヒトリゾチーム遺伝子： 【遺伝子配列があります】 （上記のＤＮＡ配列中、下線を付したＡＴＧは翻訳開始
    コドンを表し、該コドンより下流はヒトリゾチームをコ
    ードするＤＮＡ配列の一部を表す。 下線を付したＡＧＧＡＧＧはライボゾーム結合部位を表
    す）
  3. （３）該ＤＮＡ断片が下記の塩基配列である特許請求の
    範囲第２項記載のヒトリゾチーム遺伝子： 【遺伝子配列があります】 （上記のＤＮＡ配列中、下線を付したＡＴＧは翻訳開始
    コドンを表し、該コドンより下流はヒトリゾチームをコ
    ードするＤＮＡ配列の一部を表す）
  4. （４） 【遺伝子配列があります】 で表されるＤＮＡ塩基配列
  5. （５） 【遺伝子配列があります】 で表させるＤＮＡ塩基配列
  6. （６）下記のＤＮＡ配列で特定されるＤＮＡ： 【遺伝子配列があります】
  7. （７）転写体ｍＲＮＡの二次構造において、ライボゾー
    ム結合部位及びヒトリゾチームの翻訳開始部位が水素結
    合を形成しない配列のライボゾーム結合部位及びヒトリ
    ゾチーム翻訳開始部位をコードするＤＮＡ断片を５′端
    に有するヒトリゾチーム遺伝子を含み宿主細胞中で増殖
    、ヒトリゾチームを発現する組み換えプラスミド
  8. （８）ライボゾーム結合部位及びヒトリゾチーム翻訳開
    始部位をコードするＤＮＡ断片が下記の塩基配列である
    特許請求の範囲第７項記載のプラスミド： 【遺伝子配列があります】 （上記のＤＮＡ配列中、下線を付したＡＴＧは翻訳開始
    コドンを表し、該コドンより下流はヒトリゾチームをコ
    ードするＤＮＡ配列の一部を表す）
  9. （９）該ＤＮＡ断片が下記の塩基配列である特許請求の
    範囲第８項記載のプラスミド 【遺伝子配列があります】 （上記のＤＮＡ配列中、下線を付したＡＴＧは翻訳開始
    コドンを表し、該コドンより下流はヒトリゾチームをコ
    ードするＤＮＡ配列の一部を表す）
  10. （１０）ｐＰＬＨＬＹ−２である特許請求の範囲第７項
    記載のプラスミド
  11. （１１）転写体ｍＲＮＡの二次構造において、ライボゾ
    ーム結合部位及びヒトリゾチームの翻訳開始部位が水素
    結合を形成しない配列のライボゾーム結合部位及びヒト
    リゾチーム翻訳開始部位をコードするＤＮＡ断片を５′
    端に有するヒトリゾチーム遺伝子を含み宿主細胞中で増
    殖、ヒトリゾチームを発現する組み換えプラスミドによ
    り形質転換されヒトリゾチームを産生する微生物
  12. （１２）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する大腸菌（Ｅ
    ．ｃｏｌｉ）である特許請求の範囲第１１項記載の微生
    物
  13. （１３）ライボゾーム結合部位及びヒトリゾチーム翻訳
    開始部位をコードするＤＮＡ断片が下記の塩基配列であ
    る特許請求の範囲第１１項もしくは第１２項記載の微生
    物 【遺伝子配列があります】 （上記のＤＮＡ配列中、下線を付したＡＴＧは翻訳開始
    コドンを表し、該コドンより下流はヒトリゾチームをコ
    ードするＤＮＡ配列の一部を表す）
  14. （１４）該ＤＮＡ断片が下記の塩基配列である特許請求
    の範囲第１１項もしくは第１２項記載の微生物： 【遺伝子配列があります】 （上記のＤＮＡ配列中、下線を付したＡＴＧは翻訳開始
    コドンを表し、該コドンより下流はヒトリゾチームをコ
    ードするＤＮＡ配列の一部を表す）
  15. （１５）大腸菌２９４（ｐＰＬＨＬＹ−２）株である特
    許請求の範囲第１１項記載の微生物
  16. （１６）転写体ｍＲＮＡの二次構造において、ライボゾ
    ーム結合部位及びヒトリゾチームの翻訳開始部位が水素
    結合を形成しない配列のライボゾーム結合部位及びヒト
    リゾチーム翻訳開始部位をコードするＤＮＡ断片を５′
    端に有するヒトリゾチーム遺伝子を含み宿主細胞中で増
    殖、ヒトリゾチームを発現する組み換えプラスミドによ
    り形質転換されヒトリゾチームを産生する微生物を適当
    な培地で培養することを特徴とするヒトリゾチームの製
    法
  17. （１７）微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する大
    腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である特許請求の範囲第１６項記
    載の製法
  18. （１８）ライボゾーム結合部位及びヒトリゾチーム翻訳
    開始部位をコードするＤＮＡ断片が下記の塩基配列であ
    る特許請求の範囲第１６項もしくは第１７項記載の製法 【遺伝子配列があります】 （上記のＤＮＡ配列中、下線を付したＡＴＧは翻訳開始
    コドンを表し、該コドンより下流はヒトリゾチームをコ
    ードするＤＮＡ配列の一部を表す）
  19. （１９）該ＤＮＡ断片が下記の塩基配列である特許請求
    の範囲第１６項もしくは第１７項記載の製法 【遺伝子配列があります】 （上記のＤＮＡ配列中、下線を付したＡＴＧは翻訳開始
    コドンを表し、該コドンより下流はヒトリゾチームをコ
    ードするＤＮＡ配列の一部を表す）
  20. （２０）微生物が大腸菌２９４（ｐＰＬＨＬＹ−２）株
    である特許請求の範囲第１７項記載の方法
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0266264U (ja) * 1988-11-04 1990-05-18
JPH02108765U (ja) * 1989-02-15 1990-08-29
JPH02108764U (ja) * 1989-02-10 1990-08-29
JPH02108766U (ja) * 1989-02-18 1990-08-29

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0266264U (ja) * 1988-11-04 1990-05-18
JPH02108764U (ja) * 1989-02-10 1990-08-29
JPH02108765U (ja) * 1989-02-15 1990-08-29
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