JPS6322190A - ヒトリゾチ−ムの遺伝子発現による製法 - Google Patents
ヒトリゾチ−ムの遺伝子発現による製法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、合成ヒトリゾチーム遺伝子を用いたヒトリゾ
チームの製造法に関する。
チームの製造法に関する。
従来技術および問題点
ヒトリゾチームは、ヒトの涙、唾液、鼻粘液、乳、リン
パ腺、白血球等に見出される酵素蛋白質であり、N−ア
セチルムラミン酸量のβ−1,4結合を加水分解するム
ラミダーゼとしての酵素活性を有している事が知られて
いる。ヒト乳由来のりゾチームは下記の配列で示される
130個のアミノ酸からなることが知られている。〔例
えば、船津ら「溶酸酵素」55〜58頁、講談社すイエ
ンティフインク(1977)参照〕 Lys Val Phe Glu Arg Cys G
lu Leu Ala Arg ThrLeu Lys
Arg Leu Gly Met Asp Gly
Tyr Arg Glylie Ser Leu Al
a Asn Trp Met Cys Leu Ala
LysTrp Glu Ser Gly Tyr A
sn Thr Arg Ala Thr AsnTyr
Asn Ala Gly Asp Arg Ser
Thr Asp Tyr Glylle Phe Gl
n Ile Asn Ser Arg Tyr Trp
Cys AsnAsp Gly Lys Thr P
ro Gly Ala Val Asn Ala Cy
sHis Leu Ser Cys Ser
Ala Leu Leu Gin Asp
Asn11e Ala Asp Ala Val A
la Cys Ala Lys Arg ValVal
Arg Asp Pro Gln Gly Ile
Arg Ala Trp ValAla Trp
Arg Asn Arg Cys Gin
Asn Arg Asp ValArg Gin
Tyr Val Gin Gly Cys Gly
Va 1ヒトリゾチームは種々の細菌を溶解する作用を
有し、食品等の防腐剤、或いは医薬品としては抗菌剤、
非アレルギー性の抗炎症薬として利用することができる
。
パ腺、白血球等に見出される酵素蛋白質であり、N−ア
セチルムラミン酸量のβ−1,4結合を加水分解するム
ラミダーゼとしての酵素活性を有している事が知られて
いる。ヒト乳由来のりゾチームは下記の配列で示される
130個のアミノ酸からなることが知られている。〔例
えば、船津ら「溶酸酵素」55〜58頁、講談社すイエ
ンティフインク(1977)参照〕 Lys Val Phe Glu Arg Cys G
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Asn Ala Gly Asp Arg Ser
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Ala Leu Leu Gin Asp
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Arg Ala Trp ValAla Trp
Arg Asn Arg Cys Gin
Asn Arg Asp ValArg Gin
Tyr Val Gin Gly Cys Gly
Va 1ヒトリゾチームは種々の細菌を溶解する作用を
有し、食品等の防腐剤、或いは医薬品としては抗菌剤、
非アレルギー性の抗炎症薬として利用することができる
。
ヒトリゾチームはヒトの乳、尿等から単離する事ができ
るが、医療等を目的とする工業的生産の要求を満たすに
は効率が悪く実用的でない。
るが、医療等を目的とする工業的生産の要求を満たすに
は効率が悪く実用的でない。
合成ヒトリゾチーム遺伝子を用いて組み換えDNA技術
によりリゾチームを製造する方法はすでにしられている
(特開昭61−78383 、特開昭6l−7838
7)。
によりリゾチームを製造する方法はすでにしられている
(特開昭61−78383 、特開昭6l−7838
7)。
発明が解決した問題点
本発明は組み換えDNA技術により安価にしかも大量に
純粋なりゾチームを生産することを目的にしたものであ
る。
純粋なりゾチームを生産することを目的にしたものであ
る。
本発明者らは、翻訳活性を上昇させる目的でメツセンジ
ャーRNAの構造を種々研究し翻訳開始コドン(ATG
)及びライボゾーム結合部位(別名シャインーダルガー
ノ領域)が相補する塩基と水素結合を形成しないような
図1に示す二次構造を形成するとき、翻訳活性が著しく
上昇することを見出した。
ャーRNAの構造を種々研究し翻訳開始コドン(ATG
)及びライボゾーム結合部位(別名シャインーダルガー
ノ領域)が相補する塩基と水素結合を形成しないような
図1に示す二次構造を形成するとき、翻訳活性が著しく
上昇することを見出した。
リゾチーム遺伝子の大腸菌における発現にあたって、リ
ゾチーム遺伝子はりゾチームのN未領域においては、相
当するメツセンジャーRNAのAUGが相補的な塩基と
水素結合しない様にコドンを選択しなければならない。
ゾチーム遺伝子はりゾチームのN未領域においては、相
当するメツセンジャーRNAのAUGが相補的な塩基と
水素結合しない様にコドンを選択しなければならない。
この様な観点から、我々は図1のメツセンジャーRNA
配列に相当する下記配列の2本鎖DNAを合成し、ヒト
リゾチーム遺伝子の残りの部分と結合し、λPLプロモ
ーター下に発現を試みたところ著しい発現の上昇が見ら
れた。
配列に相当する下記配列の2本鎖DNAを合成し、ヒト
リゾチーム遺伝子の残りの部分と結合し、λPLプロモ
ーター下に発現を試みたところ著しい発現の上昇が見ら
れた。
合成2本鎖DNA
ライボゾーム結合部位
問題解決の手段
本発明は、転写体mRNAの二次構造において、ライボ
ゾーム結合部位(シャインーダルガーノ領域)及び翻訳
開始部位が相補的な塩基と水素結合を形成しない構造を
とるヒトリゾチームmRNA配列をコードするDNAフ
ラグメント、5゛端にこのD N Aフラグメントを結
合したヒトリゾチーム遺伝子、このDNAフラグメント
を5゛端に有するヒトリゾチーム遺伝子を保持しヒトリ
ゾチームを宿主細胞内で発現する組み換えプラスミド、
この組み換えプラスミドを保持しヒトリゾチームを生産
する微生物、及びこの微生物を適当な培地で培養するこ
とを特徴とするヒトリゾチームの製造方法を提供する。
ゾーム結合部位(シャインーダルガーノ領域)及び翻訳
開始部位が相補的な塩基と水素結合を形成しない構造を
とるヒトリゾチームmRNA配列をコードするDNAフ
ラグメント、5゛端にこのD N Aフラグメントを結
合したヒトリゾチーム遺伝子、このDNAフラグメント
を5゛端に有するヒトリゾチーム遺伝子を保持しヒトリ
ゾチームを宿主細胞内で発現する組み換えプラスミド、
この組み換えプラスミドを保持しヒトリゾチームを生産
する微生物、及びこの微生物を適当な培地で培養するこ
とを特徴とするヒトリゾチームの製造方法を提供する。
本発明により提供される転写体mRNAの二次構造にお
いて、ライボゾーム結合部位(シャインーダルガーノ領
域)及び翻訳開始部位が相補的な塩基と水素結合を形成
しない構造をとるmRNA配列を与えるDNAフラグメ
ントの具体例として下記の配列のDNAを挙げることが
できる。
いて、ライボゾーム結合部位(シャインーダルガーノ領
域)及び翻訳開始部位が相補的な塩基と水素結合を形成
しない構造をとるmRNA配列を与えるDNAフラグメ
ントの具体例として下記の配列のDNAを挙げることが
できる。
5゛端CGTAAGTCAGTGAAAAACTTAG
GAGGGTTTTTAAATGAA3’より好ましく
は、 5゛端CGTAAGTCAGTGAAAAACTTAG
GAGGGTTTTTAAATGAAAGTTTTCG
AACGTT3’端 を挙げることができる。
GAGGGTTTTTAAATGAA3’より好ましく
は、 5゛端CGTAAGTCAGTGAAAAACTTAG
GAGGGTTTTTAAATGAAAGTTTTCG
AACGTT3’端 を挙げることができる。
この様な配列を有する上記の2本鎖DNAは、以下の様
に合成することができる。
に合成することができる。
先ず、以下にしめした様にCl−1〜Cll−4と名付
けたオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学的に合成す
る。
けたオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学的に合成す
る。
Cll−1: 5’ GATCCTAACGTAAGT
CAGTGAAAAAC3’ Cll−2: 3’ GATTGCATTCAGTC
ACTTTTTGAATCCTC5” CIT−3: 5°TTAGGAGGGTTTTTAA
ATGAAAGTTTT 3’ Cn−4: 3” CCAAAAATTTACTTTC
AAAAGC5’ 各フラグメントの合成法としてはジエスエル法、トリエ
ステル法、及びホスファイト法があり、固相法、液相法
がある。
CAGTGAAAAAC3’ Cll−2: 3’ GATTGCATTCAGTC
ACTTTTTGAATCCTC5” CIT−3: 5°TTAGGAGGGTTTTTAA
ATGAAAGTTTT 3’ Cn−4: 3” CCAAAAATTTACTTTC
AAAAGC5’ 各フラグメントの合成法としてはジエスエル法、トリエ
ステル法、及びホスファイト法があり、固相法、液相法
がある。
Cll−1〜Cll−4と名付けたオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドの合成は、固相法ホスファアミダイド法を
利用したModel 380 D N Aシンセサイザ
ー〔アプライドバイオシステムズ(Applied B
iosystems)社〕により容易に行うことができ
る。
ヌクレオチドの合成は、固相法ホスファアミダイド法を
利用したModel 380 D N Aシンセサイザ
ー〔アプライドバイオシステムズ(Applied B
iosystems)社〕により容易に行うことができ
る。
化学合成したオリゴヌクレオチドは脱保護操作の際、安
定な親油性の保護基を利用して逆層分配カラムによる高
速液体クロマトグラフィー(HPLC)で他の未反応混
合物から分離精製することができる。 次に、その保護
基をはずし精製すれば目的とするオリゴヌクレオチドを
得ることができる。 得られたCn−2、CI[−3の
フラグメントの5”側をT4ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化し、Cll−1、Cll−4とT4D
NAリガーゼで結合した後再びT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いてリン酸化し、上に示した5゜側に5au
3AIサイト、3゛側にTaqlサイトを有する二本鎖
フラグメントを合成する。
定な親油性の保護基を利用して逆層分配カラムによる高
速液体クロマトグラフィー(HPLC)で他の未反応混
合物から分離精製することができる。 次に、その保護
基をはずし精製すれば目的とするオリゴヌクレオチドを
得ることができる。 得られたCn−2、CI[−3の
フラグメントの5”側をT4ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化し、Cll−1、Cll−4とT4D
NAリガーゼで結合した後再びT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いてリン酸化し、上に示した5゜側に5au
3AIサイト、3゛側にTaqlサイトを有する二本鎖
フラグメントを合成する。
このようにして得られたDNAフラグメントをヒトリゾ
チーム遺伝子の残りの部分と結合した後、これを発現プ
ラスミドベクターに挿入することにより本発明の組み換
えプラスミドを構築することができる。
チーム遺伝子の残りの部分と結合した後、これを発現プ
ラスミドベクターに挿入することにより本発明の組み換
えプラスミドを構築することができる。
ここにおいて用いるヒトリゾチーム遺伝子は、例えば、
特開昭61−78383、或いは特開昭61−7838
7記載の方法で合成することができる。 また、発現プ
ラスミドベクターとしては、例えば、pMYl2−6A
mp−1を用いることができる。
特開昭61−78383、或いは特開昭61−7838
7記載の方法で合成することができる。 また、発現プ
ラスミドベクターとしては、例えば、pMYl2−6A
mp−1を用いることができる。
pMYl 2−6A2−6AはpMYl2−6(例えば
Tsurimotoら、Mo1.Gen。
Tsurimotoら、Mo1.Gen。
Genet、 187 79〜86 (1982)参照
)とpBV234(例えば0htsuboら、Gene
20 245〜254 (1982)参照)とから
以下のようにして造成する事ができる。
)とpBV234(例えば0htsuboら、Gene
20 245〜254 (1982)参照)とから
以下のようにして造成する事ができる。
pBV234をPStlで切断しアンピシリン耐性遺伝
子の一部を含む約2.6Kbpの断片を取り出し、pM
Yl2−6のPstl切断部位にアンピシリン耐性遺伝
子が再生する様に挿入してpMYl2 6Ampを得る
。pMYl2−6AmpをBamHIで限定分解した後
、その粘着末端をDNAポリメラーゼ(クレノーフラグ
メント)を用いて修復し、DNAリガーゼで連結して、
pBV234由来のDNA断片中に含まれるBamH1
切断部位のみが消失したpMYl2−6Amp−1を得
る。
子の一部を含む約2.6Kbpの断片を取り出し、pM
Yl2−6のPstl切断部位にアンピシリン耐性遺伝
子が再生する様に挿入してpMYl2 6Ampを得る
。pMYl2−6AmpをBamHIで限定分解した後
、その粘着末端をDNAポリメラーゼ(クレノーフラグ
メント)を用いて修復し、DNAリガーゼで連結して、
pBV234由来のDNA断片中に含まれるBamH1
切断部位のみが消失したpMYl2−6Amp−1を得
る。
本発明の組み換えプラスミド構築の具体例として以下の
方法を挙げることができる(図2にその概略を示した)
。
方法を挙げることができる(図2にその概略を示した)
。
ヒトリゾチーム遺伝子を含む組み換えプラスミドpPL
HLY−1(特開昭61−78383、特開昭6l−7
8387)を制限酵素Taqlで消化し、得られたヒト
リゾチーム遺伝子を含む断片を常法により単離し、上に
示した合成りNAをT4DNAリガーゼで結合し、得ら
れたフラグメントを5au3AIで消化し、ヒトリゾチ
ーム遺伝子の5°側上流に転写により得られるmRNA
の二次構造において、翻訳開始部位及び シャインーダ
ルガーノ領域(SD領領域が相補的塩基と水素結合をし
ないようにデザインされた合成フラグメントを構築する
。
HLY−1(特開昭61−78383、特開昭6l−7
8387)を制限酵素Taqlで消化し、得られたヒト
リゾチーム遺伝子を含む断片を常法により単離し、上に
示した合成りNAをT4DNAリガーゼで結合し、得ら
れたフラグメントを5au3AIで消化し、ヒトリゾチ
ーム遺伝子の5°側上流に転写により得られるmRNA
の二次構造において、翻訳開始部位及び シャインーダ
ルガーノ領域(SD領領域が相補的塩基と水素結合をし
ないようにデザインされた合成フラグメントを構築する
。
次に、上記で得られたDNAフラグメントを適当な発現
プラスミド、例えば上述のpMYl2−6Amp−1に
挿入する。その具体例の概要を図2示した。 ここにお
いては、上述のヒトリゾチーム遺伝子の断片を含む約4
40塩基の断片を5%ポリアクリアミドゲル電気泳動に
より分離し、pMYl2−6Amp−1のBamHIサ
イトに挿入する。 この様にして得られたプラスミドを
、例えば、大腸菌(例えば、294株)等の適当な宿主
に導入することによりヒトリゾチームを生産する本発明
の微生物を得ることができる。
プラスミド、例えば上述のpMYl2−6Amp−1に
挿入する。その具体例の概要を図2示した。 ここにお
いては、上述のヒトリゾチーム遺伝子の断片を含む約4
40塩基の断片を5%ポリアクリアミドゲル電気泳動に
より分離し、pMYl2−6Amp−1のBamHIサ
イトに挿入する。 この様にして得られたプラスミドを
、例えば、大腸菌(例えば、294株)等の適当な宿主
に導入することによりヒトリゾチームを生産する本発明
の微生物を得ることができる。
この様にして得た形質転換体を適当な培地で培養するこ
とにより本発明の目的とするヒトリゾチームを効率よく
生産することができる。
とにより本発明の目的とするヒトリゾチームを効率よく
生産することができる。
以下に実施例をあげ、本発明をより詳細に説明する。
本発明は、以下の実施例のみに限定されるものではなく
、本発明の技術分野における通常の変更をすることがで
きる。
本発明は、以下の実施例のみに限定されるものではなく
、本発明の技術分野における通常の変更をすることがで
きる。
実施例
1、DNAフラグメントの合成
上に示した様に設計したフラグメントCll−1〜Cn
−4のフラグメントを固相法ホスファアミダイド法を利
用したModel 380 DNAシンセサイザー〔ア
プライドバイオシステムズ (Applied Bio
systems )社製〕により合成した。
−4のフラグメントを固相法ホスファアミダイド法を利
用したModel 380 DNAシンセサイザー〔ア
プライドバイオシステムズ (Applied Bio
systems )社製〕により合成した。
ヌクレオシドを導入したシリカ樹脂および完全に保護し
た4種のジイソプロピルホスホアミダイドは市販のアプ
ライドバイオシステムズ (ApρliedBiosy
stems )社製のものを用いた。
た4種のジイソプロピルホスホアミダイドは市販のアプ
ライドバイオシステムズ (ApρliedBiosy
stems )社製のものを用いた。
合成法の詳細は下記の通りである。
完全に保護したヌクレオシドを導入したシリカ樹脂(1
)カラムをトリクロロ酢酸を含むジクロロメタン溶液で
室温2分間処理することにより5゛位水酸基のジメトキ
シトリチル(以下D M T r )保護基を除去し、
ヌクレオシドの導入されたシリカ樹脂(II)とした。
)カラムをトリクロロ酢酸を含むジクロロメタン溶液で
室温2分間処理することにより5゛位水酸基のジメトキ
シトリチル(以下D M T r )保護基を除去し、
ヌクレオシドの導入されたシリカ樹脂(II)とした。
次に、完全に保護したジイソプロピルホスホアミダイ
ド(II[)をテトラゾール共存下アセトニトリル中室
温で3分間縮合させた。
ド(II[)をテトラゾール共存下アセトニトリル中室
温で3分間縮合させた。
(I)、(I[)及び(III)は以下の通りである。
0COCHzCHzCONHCHICHzCH2PPニ
ジリカ樹月1.B=Abz、Gibu、Cbz、T(1
)=R1ニジメトキシトリチル基 (n) =R1: H (I[I3 B=Abz、Gibu、Cbz、Tジ
メチルアミノピリジン、ルチジンを含むテトラヒドロフ
ラン中無水酢酸で室温4分間樹脂を処理してシリカ樹脂
(II)の5°水酸基をアセチル化し、ルチジン、水を
含むテトラヒドロフラン中ヨウ素で1分間酸化して5価
のリン酸トリエステルとした。 以下4種のジイソプロ
ピルホスホアミダイド(III)を順次使用し脱ジメト
キシトリチル化、縮合反応、アセチル化、酸化反応を繰
り返すことにより保護したオリゴヌクレオチドフラグメ
ントを合成した。 最後の縮合後樹脂をトリエチルアミ
ンを含むチオフェノールのジオキサン溶液で50分間処
理し、リンの保護基をはずし、309≦アンモニア水で
1時間処理することによりオリゴマーを樹脂より切り離
した。 回収したAIJ letマーは30%アンモニ
ア水10m1で55〜60℃5時間処理することにより
塩基のアミノ基を脱保護し、高速液体クロマトグラフィ
ーで逆相系担体(μmBondapak C1B、ウォ
ーターズ社製)を用い、0.1モル酢酸トリエチルアミ
ン緩衝液(pH7,0)中アセトニトリルの直線濃度勾
配による溶出でジメトキシトリチル基をもつオリゴマー
を精製した。 次に、80%酢酸水1mJで室温20分
間処理することによりジメトキシトリチル基を除去した
。 脱保護したオリゴマーは高速液体クロマトグラフ
ィーで逆相系担体(YMC−pack AM−324
栗田工業社製)を用い0.1モル酢酸トリエチルアミン
緩衝液(pH7゜0)中アセトニトリルの直線濃度勾配
による溶出、更にイオン交換系担体(TSK get
DEAE−23W、東洋曹達社製)を用い20%ア
セトニトリルを含むギ酸アンモニウム緩衝液の直線濃度
勾配による溶出およびゲル濾過にて精製し、Cn−1〜
C11−4を各々3.9.4.6.2.4.2.60
D260ユニット得た。
ジリカ樹月1.B=Abz、Gibu、Cbz、T(1
)=R1ニジメトキシトリチル基 (n) =R1: H (I[I3 B=Abz、Gibu、Cbz、Tジ
メチルアミノピリジン、ルチジンを含むテトラヒドロフ
ラン中無水酢酸で室温4分間樹脂を処理してシリカ樹脂
(II)の5°水酸基をアセチル化し、ルチジン、水を
含むテトラヒドロフラン中ヨウ素で1分間酸化して5価
のリン酸トリエステルとした。 以下4種のジイソプロ
ピルホスホアミダイド(III)を順次使用し脱ジメト
キシトリチル化、縮合反応、アセチル化、酸化反応を繰
り返すことにより保護したオリゴヌクレオチドフラグメ
ントを合成した。 最後の縮合後樹脂をトリエチルアミ
ンを含むチオフェノールのジオキサン溶液で50分間処
理し、リンの保護基をはずし、309≦アンモニア水で
1時間処理することによりオリゴマーを樹脂より切り離
した。 回収したAIJ letマーは30%アンモニ
ア水10m1で55〜60℃5時間処理することにより
塩基のアミノ基を脱保護し、高速液体クロマトグラフィ
ーで逆相系担体(μmBondapak C1B、ウォ
ーターズ社製)を用い、0.1モル酢酸トリエチルアミ
ン緩衝液(pH7,0)中アセトニトリルの直線濃度勾
配による溶出でジメトキシトリチル基をもつオリゴマー
を精製した。 次に、80%酢酸水1mJで室温20分
間処理することによりジメトキシトリチル基を除去した
。 脱保護したオリゴマーは高速液体クロマトグラフ
ィーで逆相系担体(YMC−pack AM−324
栗田工業社製)を用い0.1モル酢酸トリエチルアミン
緩衝液(pH7゜0)中アセトニトリルの直線濃度勾配
による溶出、更にイオン交換系担体(TSK get
DEAE−23W、東洋曹達社製)を用い20%ア
セトニトリルを含むギ酸アンモニウム緩衝液の直線濃度
勾配による溶出およびゲル濾過にて精製し、Cn−1〜
C11−4を各々3.9.4.6.2.4.2.60
D260ユニット得た。
■、 ヒトリゾチーム発現プラスミドp PLHLY
−2の構築 上記4種の合成オリゴヌクレオチド(CIf −1〜C
n−4)をアニーリングし、次いでクローニングした。
−2の構築 上記4種の合成オリゴヌクレオチド(CIf −1〜C
n−4)をアニーリングし、次いでクローニングした。
まず、Cn−2、Cn−3断片各10、ljgを66
mMトリス塩酸(pH7,5)、10 mMM g C
II2.1mMATP、、1mMスペルミジン、55単
位T4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造)を含む10
0μ1反応液で37℃、1時間反応させ、5°末端をリ
ン酸化した。
mMトリス塩酸(pH7,5)、10 mMM g C
II2.1mMATP、、1mMスペルミジン、55単
位T4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造)を含む10
0μ1反応液で37℃、1時間反応させ、5°末端をリ
ン酸化した。
反応液をフェノール:クロロホルム混液で抽出後、エタ
ノール沈殿でDNAを回収した。 このC■−2、C1
1−3断片5μgと未処理のCll−1、Cm−4断片
4pgとを66mM1−リス塩酸(pH7,5) 、1
0mMMgCf2.1mMATP。
ノール沈殿でDNAを回収した。 このC■−2、C1
1−3断片5μgと未処理のCll−1、Cm−4断片
4pgとを66mM1−リス塩酸(pH7,5) 、1
0mMMgCf2.1mMATP。
1mMスペルミジン、17B0単位T4リガーゼ(宝酒
造)を含む200μ!反応液中で16℃、越夜で反応さ
せた。 反応により生じたcm−t〜Cm−4断片の結
合物をフェノール:クロロホルム混液で抽出後、エタノ
ール沈殿により約10μgの精製DNA断片として回収
した。
造)を含む200μ!反応液中で16℃、越夜で反応さ
せた。 反応により生じたcm−t〜Cm−4断片の結
合物をフェノール:クロロホルム混液で抽出後、エタノ
ール沈殿により約10μgの精製DNA断片として回収
した。
次に、この断片をヒトリゾチーム遺伝子に結合させるた
めに以下のことを行った。
めに以下のことを行った。
コンセンサスSD?+i域を有する418bpのヒトリ
ゾチーム遺伝子を上述の大腸菌用発現ベクターpMY1
2−6A2−6Aに組みこんだpPLHLY−1(特開
昭61−’78383、或いは特開昭61−78387
に記載の方法で製造できる)220μgを10m M
)リス塩酸(pH7,5) 、10mM MgC1,
2,50mMNaC1,1mMDTT存在下、640単
位の制限酵素Taqlを加え800μl中で65℃、1
時間反応させ生じた662tl)の断片を5%ポリアク
リルアミドゲル電気泳動で分離し該結合物を含むゲルを
切出し、該結合物を電気泳動的に溶出しブタノールで濃
縮し、フェノール:クロロホルム混液で抽出後、エタノ
ール沈殿により約lOμgのDNAを回収した。 こ
のDNA1μgと先はどのCll−1〜C1−4結合物
2.5μgを66mM)リス塩酸(pH7,5)、6.
6mMMgCj!、°、10mMDTT、1mMATP
、350単位T4DNAリガーゼ存在下で、30μlの
反応液中16℃、越夜で反応させた。
ゾチーム遺伝子を上述の大腸菌用発現ベクターpMY1
2−6A2−6Aに組みこんだpPLHLY−1(特開
昭61−’78383、或いは特開昭61−78387
に記載の方法で製造できる)220μgを10m M
)リス塩酸(pH7,5) 、10mM MgC1,
2,50mMNaC1,1mMDTT存在下、640単
位の制限酵素Taqlを加え800μl中で65℃、1
時間反応させ生じた662tl)の断片を5%ポリアク
リルアミドゲル電気泳動で分離し該結合物を含むゲルを
切出し、該結合物を電気泳動的に溶出しブタノールで濃
縮し、フェノール:クロロホルム混液で抽出後、エタノ
ール沈殿により約lOμgのDNAを回収した。 こ
のDNA1μgと先はどのCll−1〜C1−4結合物
2.5μgを66mM)リス塩酸(pH7,5)、6.
6mMMgCj!、°、10mMDTT、1mMATP
、350単位T4DNAリガーゼ存在下で、30μlの
反応液中16℃、越夜で反応させた。
この反応で生じた結合物を10mMトリス塩酸(pH7
,5) 、50mMNaC1,10m、MMg(1!、
、1mMDTT、30単位の制限酵素5au3AI存在
下、4Ottl中、37℃、20時間で反応し、切断し
た。反応液をフェノール:クロロホルム混液で抽出後、
エタノール沈殿でDNAを回収した。この断片を20μ
l中前記の条件で5.5単位のT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼと37℃、1時間反応させ、5゛末端をすべてリ
ン酸化した。この439bpを5%ポリアクリアミドゲ
ル電気泳動により分離回収した。 この断片中には先の
合成オリゴヌクレオチドを含む全ヒトリゾチーム遺伝子
が存在する。 このDNA断片を大腸菌用発現ベクタ
ーf)MY12 6Amp−1に組みこみ、大腸菌でヒ
トリゾチームを発現させるプラスミドpPLHLY−2
を構築した。
,5) 、50mMNaC1,10m、MMg(1!、
、1mMDTT、30単位の制限酵素5au3AI存在
下、4Ottl中、37℃、20時間で反応し、切断し
た。反応液をフェノール:クロロホルム混液で抽出後、
エタノール沈殿でDNAを回収した。この断片を20μ
l中前記の条件で5.5単位のT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼと37℃、1時間反応させ、5゛末端をすべてリ
ン酸化した。この439bpを5%ポリアクリアミドゲ
ル電気泳動により分離回収した。 この断片中には先の
合成オリゴヌクレオチドを含む全ヒトリゾチーム遺伝子
が存在する。 このDNA断片を大腸菌用発現ベクタ
ーf)MY12 6Amp−1に組みこみ、大腸菌でヒ
トリゾチームを発現させるプラスミドpPLHLY−2
を構築した。
先ずpMYl 2−6A2−6Aを50mM)リス塩酸
(pH7,5) 、100mMNaC1,10mMMg
cJ2.1mMDTT、60単位の制限酵素BamHI
の存在下、60pl!中、37℃、12時間反応させた
。 エタノール沈殿でDNAを回収後、60μl中10
mM)リス塩酸(pH8,0) 、1mMEDTA存在
下2単位のバクテリアアルカリフォスファターゼで65
°C11時間処理し、5゛末端のリン酸基を除去した。
(pH7,5) 、100mMNaC1,10mMMg
cJ2.1mMDTT、60単位の制限酵素BamHI
の存在下、60pl!中、37℃、12時間反応させた
。 エタノール沈殿でDNAを回収後、60μl中10
mM)リス塩酸(pH8,0) 、1mMEDTA存在
下2単位のバクテリアアルカリフォスファターゼで65
°C11時間処理し、5゛末端のリン酸基を除去した。
その後、フェノール、フェノール:クロロホルム混合液
で抽出後、エタノール沈殿でDNAを回収した。
で抽出後、エタノール沈殿でDNAを回収した。
このベクター0.1μgと先はどの439M断片を20
μl中350単位のT4DNAリガーゼを含む反応液で
16℃、越夜で反応させた。 この反応液を使ってカル
シウム処理した大腸菌294株を形質転換した。
μl中350単位のT4DNAリガーゼを含む反応液で
16℃、越夜で反応させた。 この反応液を使ってカル
シウム処理した大腸菌294株を形質転換した。
アンピシリン耐性菌を50mg/lアンピシリンを含む
し寒天培地(Log/j!ポリペプトン、5g/lイー
ストエキストラクト、5 g / II。
し寒天培地(Log/j!ポリペプトン、5g/lイー
ストエキストラクト、5 g / II。
NaC1,1,5%寒天)上で選択した。 得られたコ
ロニーよりプラスミドDNAをアルカリ法(Molec
ular Cloning (19B2) CtlS)
により抽出、精製し、各種制限酵素で切断して切断パタ
ーンを解析しヒトリゾチーム遺伝子が組み込まれたもの
を選び294株に導入し、大腸菌294(pPLl(L
Y−2)株を調整した。
ロニーよりプラスミドDNAをアルカリ法(Molec
ular Cloning (19B2) CtlS)
により抽出、精製し、各種制限酵素で切断して切断パタ
ーンを解析しヒトリゾチーム遺伝子が組み込まれたもの
を選び294株に導入し、大腸菌294(pPLl(L
Y−2)株を調整した。
この大腸菌294 (pPLHLY−2)を工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託した(徽工研菌寄第884
2号)。
微生物工業技術研究所に寄託した(徽工研菌寄第884
2号)。
一方、コンセンサスSD領域を有するヒトリゾチーム遺
伝子を同様の操作でpMY12−6Amp−1の13量
mHIサイトに挿入し構築した組み換えプラスミドpP
LHLY−1を同様に大腸菌294に導入し大腸菌29
4 (pPLHLY−1)株を調整した。 これらの
形質転換体を各々培養後、集菌した菌体をウェスタンブ
ロッティングを用いたラジオイムノアンセイ法で+2J
−プロティン−Aにより定量した。
伝子を同様の操作でpMY12−6Amp−1の13量
mHIサイトに挿入し構築した組み換えプラスミドpP
LHLY−1を同様に大腸菌294に導入し大腸菌29
4 (pPLHLY−1)株を調整した。 これらの
形質転換体を各々培養後、集菌した菌体をウェスタンブ
ロッティングを用いたラジオイムノアンセイ法で+2J
−プロティン−Aにより定量した。
大腸菌294 (pPLHLY−2)株及び大腸菌29
4 (pPLHLY−1)株を100m1L培地(10
g/Aポリペプトン、5g/lイーストエキストラクト
、5 g / l N a C1,50mg/lアンピ
シリン)で30℃で振盪培養し、OD6゜、 0.2に
達した時点から2時間ごとに1.5 ml培養液をサン
プリングした。
4 (pPLHLY−1)株を100m1L培地(10
g/Aポリペプトン、5g/lイーストエキストラクト
、5 g / l N a C1,50mg/lアンピ
シリン)で30℃で振盪培養し、OD6゜、 0.2に
達した時点から2時間ごとに1.5 ml培養液をサン
プリングした。
集めた菌体は以下の方法により定量した。まず培養液1
.5 m1分の菌体を3種の異なる量の標品のリゾチー
ムとともにLaemmliの方法(Laemml i
、 Na ture227.680 (1970
))に従ってl/10量を15%5DS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により分離した。
.5 m1分の菌体を3種の異なる量の標品のリゾチー
ムとともにLaemmliの方法(Laemml i
、 Na ture227.680 (1970
))に従ってl/10量を15%5DS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により分離した。
次にトランスファーバッファー(25mM)リス、19
2mMグリシン、pH8,3,15%Me○H,0,1
%5DS)中ゲルのタンパク質をニトロセルロース膜(
S&5BA85)上に電気泳動的に移行させた(4℃、
30 V、 12L?間)。ニトロセルロース膜は、
2%BSA (ウシ血清アルブミン)を含むPBSバッ
ファー(リン酸緩衝溶液)中37℃1時間反応し、蛋白
の吸着していない部分をブロックした後、0.05%T
ween20、リゾチーム抗体(ミドリ十字製)を加え
37℃、3時間反応した。PBST (0,05%Tw
een20を含むPBS)で洗浄後、2%BSAを含む
TBST (50mM)リスバンフy−pH8,0,0
,9%NaC1,0,05%Tween20)中、1′
I−プロティンA10μC1(アマ−ジャム社製)と3
7℃、70分反応した。
2mMグリシン、pH8,3,15%Me○H,0,1
%5DS)中ゲルのタンパク質をニトロセルロース膜(
S&5BA85)上に電気泳動的に移行させた(4℃、
30 V、 12L?間)。ニトロセルロース膜は、
2%BSA (ウシ血清アルブミン)を含むPBSバッ
ファー(リン酸緩衝溶液)中37℃1時間反応し、蛋白
の吸着していない部分をブロックした後、0.05%T
ween20、リゾチーム抗体(ミドリ十字製)を加え
37℃、3時間反応した。PBST (0,05%Tw
een20を含むPBS)で洗浄後、2%BSAを含む
TBST (50mM)リスバンフy−pH8,0,0
,9%NaC1,0,05%Tween20)中、1′
I−プロティンA10μC1(アマ−ジャム社製)と3
7℃、70分反応した。
TBSTで洗浄後、オートラジオグラフィーを行い14
.7にダルトンに相当するバンドを切取りT−カウンタ
ーにより放射能量を測定した。
.7にダルトンに相当するバンドを切取りT−カウンタ
ーにより放射能量を測定した。
大腸菌由来のリゾチームは3種の異なる量の標品のリゾ
チームにより作成した検量線を基準にして定量した。こ
の方法により大腸菌中のリゾチームを経時変化をおって
定量したのが図3である。pPLHLY−1では6時間
後に35量g/m1cultureの発現量がみられた
のに対し、 pPLHLY−2の場合は8時間後に最高
68μg/m1cultureの発現がみられた。
チームにより作成した検量線を基準にして定量した。こ
の方法により大腸菌中のリゾチームを経時変化をおって
定量したのが図3である。pPLHLY−1では6時間
後に35量g/m1cultureの発現量がみられた
のに対し、 pPLHLY−2の場合は8時間後に最高
68μg/m1cultureの発現がみられた。
発明の効果
pPLHLY−2とpPLHLY−1では図5に示した
様にヒトリゾチーム遺伝子のSD配列よりATGコドン
までの塩基配列のみ異なるためヒトリゾチームの発現は
この合成りNAに由来する領域に依存していることが明
らかである。
様にヒトリゾチーム遺伝子のSD配列よりATGコドン
までの塩基配列のみ異なるためヒトリゾチームの発現は
この合成りNAに由来する領域に依存していることが明
らかである。
図1は、本発明の合成りNAフラグメントを含んだプラ
スミドのヒトリゾチーム遺伝子の転写により得られるヒ
トリゾチームmRNAのライボゾーム結合部位および翻
訳開始部位を表す図である。 図2は、ヒトリゾチーム遺伝子を含む本発明の組み換え
プラスミドpPLHLY−2及びその構築の概略を表す
図である。 図3は、大腸菌294 (pPL’HLY−2)株、大
腸菌294 (pPLHLY−1)株によるヒトリゾチ
ーム発現量を示す図である。 図4は、pPLHLY−2とpPLHLY−1の構造を
比較した図である。 完 図1 U−A −G −U −U −U −U −C −O −A −A −C −G −U ”’UA −UGUGAA” 図3ヒトリゾチームの発現 時間
スミドのヒトリゾチーム遺伝子の転写により得られるヒ
トリゾチームmRNAのライボゾーム結合部位および翻
訳開始部位を表す図である。 図2は、ヒトリゾチーム遺伝子を含む本発明の組み換え
プラスミドpPLHLY−2及びその構築の概略を表す
図である。 図3は、大腸菌294 (pPL’HLY−2)株、大
腸菌294 (pPLHLY−1)株によるヒトリゾチ
ーム発現量を示す図である。 図4は、pPLHLY−2とpPLHLY−1の構造を
比較した図である。 完 図1 U−A −G −U −U −U −U −C −O −A −A −C −G −U ”’UA −UGUGAA” 図3ヒトリゾチームの発現 時間
Claims (20)
- (1)転写体mRNAの二次構造において、ライボゾー
ム結合部位及びヒトリゾチームの翻訳開始部位が水素結
合を形成しない配列のライボゾーム結合部位及びヒトリ
ゾチーム翻訳開始部位をコードするDNA断片を5′端
に有するヒトリゾチーム遺伝子 - (2)ライボゾーム結合部位及びヒトリゾチーム翻訳開
始部位をコードするDNA断片が下記の塩基配列である
特許請求の範囲第1項記載のヒトリゾチーム遺伝子: 【遺伝子配列があります】 (上記のDNA配列中、下線を付したATGは翻訳開始
コドンを表し、該コドンより下流はヒトリゾチームをコ
ードするDNA配列の一部を表す。 下線を付したAGGAGGはライボゾーム結合部位を表
す) - (3)該DNA断片が下記の塩基配列である特許請求の
範囲第2項記載のヒトリゾチーム遺伝子: 【遺伝子配列があります】 (上記のDNA配列中、下線を付したATGは翻訳開始
コドンを表し、該コドンより下流はヒトリゾチームをコ
ードするDNA配列の一部を表す) - (4) 【遺伝子配列があります】 で表されるDNA塩基配列
- (5) 【遺伝子配列があります】 で表させるDNA塩基配列
- (6)下記のDNA配列で特定されるDNA: 【遺伝子配列があります】
- (7)転写体mRNAの二次構造において、ライボゾー
ム結合部位及びヒトリゾチームの翻訳開始部位が水素結
合を形成しない配列のライボゾーム結合部位及びヒトリ
ゾチーム翻訳開始部位をコードするDNA断片を5′端
に有するヒトリゾチーム遺伝子を含み宿主細胞中で増殖
、ヒトリゾチームを発現する組み換えプラスミド - (8)ライボゾーム結合部位及びヒトリゾチーム翻訳開
始部位をコードするDNA断片が下記の塩基配列である
特許請求の範囲第7項記載のプラスミド: 【遺伝子配列があります】 (上記のDNA配列中、下線を付したATGは翻訳開始
コドンを表し、該コドンより下流はヒトリゾチームをコ
ードするDNA配列の一部を表す) - (9)該DNA断片が下記の塩基配列である特許請求の
範囲第8項記載のプラスミド 【遺伝子配列があります】 (上記のDNA配列中、下線を付したATGは翻訳開始
コドンを表し、該コドンより下流はヒトリゾチームをコ
ードするDNA配列の一部を表す) - (10)pPLHLY−2である特許請求の範囲第7項
記載のプラスミド - (11)転写体mRNAの二次構造において、ライボゾ
ーム結合部位及びヒトリゾチームの翻訳開始部位が水素
結合を形成しない配列のライボゾーム結合部位及びヒト
リゾチーム翻訳開始部位をコードするDNA断片を5′
端に有するヒトリゾチーム遺伝子を含み宿主細胞中で増
殖、ヒトリゾチームを発現する組み換えプラスミドによ
り形質転換されヒトリゾチームを産生する微生物 - (12)Escherichia属に属する大腸菌(E
.coli)である特許請求の範囲第11項記載の微生
物 - (13)ライボゾーム結合部位及びヒトリゾチーム翻訳
開始部位をコードするDNA断片が下記の塩基配列であ
る特許請求の範囲第11項もしくは第12項記載の微生
物 【遺伝子配列があります】 (上記のDNA配列中、下線を付したATGは翻訳開始
コドンを表し、該コドンより下流はヒトリゾチームをコ
ードするDNA配列の一部を表す) - (14)該DNA断片が下記の塩基配列である特許請求
の範囲第11項もしくは第12項記載の微生物: 【遺伝子配列があります】 (上記のDNA配列中、下線を付したATGは翻訳開始
コドンを表し、該コドンより下流はヒトリゾチームをコ
ードするDNA配列の一部を表す) - (15)大腸菌294(pPLHLY−2)株である特
許請求の範囲第11項記載の微生物 - (16)転写体mRNAの二次構造において、ライボゾ
ーム結合部位及びヒトリゾチームの翻訳開始部位が水素
結合を形成しない配列のライボゾーム結合部位及びヒト
リゾチーム翻訳開始部位をコードするDNA断片を5′
端に有するヒトリゾチーム遺伝子を含み宿主細胞中で増
殖、ヒトリゾチームを発現する組み換えプラスミドによ
り形質転換されヒトリゾチームを産生する微生物を適当
な培地で培養することを特徴とするヒトリゾチームの製
法 - (17)微生物がEscherichia属に属する大
腸菌(E.coli)である特許請求の範囲第16項記
載の製法 - (18)ライボゾーム結合部位及びヒトリゾチーム翻訳
開始部位をコードするDNA断片が下記の塩基配列であ
る特許請求の範囲第16項もしくは第17項記載の製法 【遺伝子配列があります】 (上記のDNA配列中、下線を付したATGは翻訳開始
コドンを表し、該コドンより下流はヒトリゾチームをコ
ードするDNA配列の一部を表す) - (19)該DNA断片が下記の塩基配列である特許請求
の範囲第16項もしくは第17項記載の製法 【遺伝子配列があります】 (上記のDNA配列中、下線を付したATGは翻訳開始
コドンを表し、該コドンより下流はヒトリゾチームをコ
ードするDNA配列の一部を表す) - (20)微生物が大腸菌294(pPLHLY−2)株
である特許請求の範囲第17項記載の方法
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16450686A JPS6322190A (ja) | 1986-07-11 | 1986-07-11 | ヒトリゾチ−ムの遺伝子発現による製法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16450686A JPS6322190A (ja) | 1986-07-11 | 1986-07-11 | ヒトリゾチ−ムの遺伝子発現による製法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6322190A true JPS6322190A (ja) | 1988-01-29 |
Family
ID=15794455
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP16450686A Pending JPS6322190A (ja) | 1986-07-11 | 1986-07-11 | ヒトリゾチ−ムの遺伝子発現による製法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6322190A (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0266264U (ja) * | 1988-11-04 | 1990-05-18 | ||
JPH02108765U (ja) * | 1989-02-15 | 1990-08-29 | ||
JPH02108764U (ja) * | 1989-02-10 | 1990-08-29 | ||
JPH02108766U (ja) * | 1989-02-18 | 1990-08-29 |
-
1986
- 1986-07-11 JP JP16450686A patent/JPS6322190A/ja active Pending
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0266264U (ja) * | 1988-11-04 | 1990-05-18 | ||
JPH02108764U (ja) * | 1989-02-10 | 1990-08-29 | ||
JPH02108765U (ja) * | 1989-02-15 | 1990-08-29 | ||
JPH02108766U (ja) * | 1989-02-18 | 1990-08-29 |
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